Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новые иммунодиагностические и иммунотерапевтические препараты на основе моноклональных антител

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Новые иммунодиагностические и иммунотерапевтические препараты на основе моноклональных антител"

РГ6 од

2 О С СII ^-^ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ

На правах рукописи

УДК 577.4; 57.083.3; 57.086.82; 615.357.37

СВЕШНИКОВ Петр Георгиевич

НОВЫЕ ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКИЕ И ИММУНОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ НА ОСНОВЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

03.00.04 — Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Москва — 1993

Работа выполнена во Всероссийском научном центре молекулярной диагностики и лечения (ВНЦМДЛ).

Научный консультант: член-корр. РАН, доктор химических наук, профессор Е. С. Северин.

доктор химических наук, профессор С. Н. Кочетков доктор биологических наук, профессор А. М. Егоров доктор биологических наук, профессор О. И. Киселев

Ведущая организация: Институт иммунологии МЗ РФ.

Защита состоится « 5~ » ¿^ТСГ^гУ^ 1993 г. в /У"часоа на заседании специализированного Ученого Совета Д.074.51.01 при Всероссийском научном центре молекулярной диагностики и лечения (ВНЦМДЛ) по адресу: 113149, г. Москва, Симферопольский бульвар, д. 8.

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в научной библиотеке Всероссийского научного центра молекулярной диагностики и лечения (ВНЦМДЛ) по адресу: 113149, г. Москва, Симферопольский бульвар, д. 8.

Диссертация в виде научного доклада разослана

Официальные оппоненты:

Ученый секретарь

Специализированного Совета ^^ Отраднова В. В.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В последние годы монолональные антитела обеспечили огромные успехи во многих областях биомедицинских исследований, тем не менее до сих пор их применение в иммунодиагностике остается ограниченным. В определенной степени это объясняется тем, что получение антител, отвечающих высоким требованиям по аффинитету и специфичности, требует значительных усилий. Безусловно, момоклональность является неоспоримым преимуществом с точки зрения стандартности и доступности препаратов, однако это не является достаточным основанием для тривиальной замены поликлональных антител на моноклональиые в уже существующих тест-системах. Для решения этого вопроса требуется получение большего числа моноклональных. антител к данному антигену с целью идентификации одного-двух клонов, обладающих действительно уникальными свойствами с точки зрения использования в конкретном типе иммуноанализа.

Существует много вариантов иммуноанализа с использованием моноклональных антител, которые различаются по принципу проведения, типу метки, виду твердой фазы, применяемой для разделения реагентов, и другим параметрам. Наибольшее распространение в последние годы получил твердофазный мммуноферментный анализ (ИФА), и в особенности одна из его модификаций - двухсайтный сэндвич,

Моноклональиые антитела оказались наиболее мощными реагентами именно в иммуиометрическом анализе при использовании в качестве меченых реагентов. Любой иммуноанализ, за исключением гомогенного, является многостадийным процессом, когда на каждом этапе используют специфические нммунореагенты и условия проведения реакций. Таким образом, при создании иммуно диагностических тест-систем приходится проводить многопараметрическую оптимизацию, принимая во внимание качество иммуносорбентов, иммуноконъюгатов и других компонентов тест-систем. В ряде случаев, в особенности при определении вирусных антигенов, гормонов, цитокинов, экотоксикантоа, требуется чувствительность в нанограммоаом диапазоне концентраций аналита. Повышение чувствительности и специфичности иммуноанализа может быть достигнуто либо заменой метки или системы усиления реакции антиген-антитело, либо изменением свойств собственно антител. В последние годы первый подход реализуется с использованием флуоресцентных и хемнлюминесцентных маркеров, а второй базируется на применении методов белковой и генетической инженерии моноклональных антител.

В качестве иммуиотерапевтических препаратов моноклональиые антитела могут быть использованы по крайней мере в трех важнейших направлениях:

иммуносорбция, пассивная серопрофилактика инфекционных болезней и направленный транспорт лекарственных препаратов.

В настоящее время разработка принципов направленного транспорта лекарств или физиологически активных веществ является одной из ключевых задач современной медицинской науки. Совершенно очевидно, что лекарственные препараты будут действовать гораздо эффективнее и в значительно меньших количествах, а кроме того, не будут оказывать побочного действия на организм, если они будут взаимодействовать только с патологическими органами или клетками. Такой принцип исключительно важен, например, для терапии онкологических заболеваний, где для лечения часто применяют токсичные препараты.

Наиболее перспективным направлением в этой области исследования является создание соединений, которые имеют направляющий элемент, специфичный к определенному типу клеток, и компонент, обладающий той или иной физиологической активностью. Среди таких соединении наибольшее распространение получили иммунотоксины (ИТ)- гибридные молекулы, у которых в качестве вектора-носителя используются антитела, а действующим Началом являются бактериальные или растительные токсины. Несмотря на положительные * результаты, достигнутые при исследовании ИТ in vitro • и in vivo, их широкое клиническое применение сдерживается рядом причин. Это связано прежде всего с неспецифической токсичностью ИТ. Кроме того, действие ИТ может быта не эффективным в тех случайх, когда поверхностные антигены не подвергаются интеркалиэации и, следовательно, не будет осуществляться антиген-зависимая транслокация ИТ внутрь клетки.

ЦЕЛЬЮ РАБОТЫ являлось создание новых генетически стабильных штаммов мышиных гибридом-продуцентов моноклональных антител к нескольким группам антигенов: вирусам, бактериям, гормонам, сывороточным белкам и ферментам человека, характеристика полученных антител и разработка на их Пскове современных высокочувствительных и специфических иммуиодиагностических тест-систем. Одной из' задач было изучение возможности создания новых иммунотерапевтических препаратов с использованием моноклональных антител для подавления вирусных инфекций и направленной доставки лекарственных препаратов. НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Получены мышиные моноклональные антитела протиа вирусов простого герпеса второго типа, гриппа тип А, бешенства, гепатита В, аукуба мозаики картофеля; хапсульного антигена Y.pestis, полисахарида Fr.tularensis, энтеротоксина В St. aureus, мембранного белка L. pneumophila; а также инсулина, гормона роста, дофамина, трансферрина.

лактоферрина, регуляторной субъединицы сАМР-зависимой протеинкиназы II типа, алкогольдегидрогеназы и иейрослецифической енолазы человека. Оптимизированы методы скрининга, клонирования, крупномасштабного культивирования и криоконсервирования мышиных гибридом, а также препаративной наработки мышиных моноклональных антител в асцитических жидкостях. Моноклональные антитела охарактеризованы по субизотипам, аффинитету и эпитопной специфичности с учетом их применения в качестве иммуиодиагностических препаратов.

Для целей медицинской практики созданы новые иммуноферментные тест-системы для определения антигенов вируса простого герпеса, возбудителей особо опасных инфекций - чумы и туляремии. Наборы прошли клиническую апробацию, и • начат их серийный выпуск. На основе моноклональных антител разработаны иммунодиагностикумы на ряд соматических антигенов человека: трансферрин, гормон роста, нейроспецифическая енолаза, которые ло своим характеристикам превосходят зарубежные аналоги.

Изучение закономерностей ограниченного протеолиза моноклональных антител дало возможность повысить чувствительность и специфичность иммуноанализа вирусных антигеиов с использованием Ffab'j^ и Fab' фрагментов антител и векторного присоединения ферментативной клетки.

Синтезированы хелатообразователь и компоненты усиливающего раствора для проведения диссоциативно-усиленного лантаноидного иммуноанализа с временным разрешением. На примере д&ухсайтното сэндвич-метода для определения инсулина изучены условия введения европиевой метки и осуществления иммунофлуоресцентного анализа с временным разрешением. Продемонстрировано увеличение чувствительности детекции антигена в 10-20 раз по сравнению с иммумоферментным определением.

Исследование вирус-нейтрализующего и лечебного действия моноклональных антител к гликолротеидному структурному белку вируса бешенства показало их высокую активность по сравнению с коммерческим антирабическим гамма-глобулином и возможность создания на их основе более эффективных препаратов.

Показано, что гидрофобизация антител приводит к усилению их способности встраиваться в модельные яипидные мембраны и мембраны клеток. Получены результаты, подтверждающие усиление антивирусного действия гидрофобичованных антител к поверхностным антигенам вируса гриппа (гемагглютинину). Впервые получены данные по усилению антивирусной активности антител к внутренним белкам вируса гриппа (Ml и NP-белкам). Полученные результаты позволяют

предложить механизмы усиления антивирусного действия гидрофобизованных антител как к внутренним, так и к поверхностным белкам вируса гриппа.

Предложен новый принцип конструирования соединений направленного транспорта. В составе предложенной конструкции, названной рес пекрином (рецептор-специфический,экранированный) физиологически активный компонент, в состав которого введен эпитоп-содержащий фрагмент антигена-мишени, экранирован антителом, специфичным к этому антигену. При взаимодействии респекрина с клеткой-мишенью происходит диссоциация комплекса, сопровождающаяся активацией физиологически активного компонента. С помощью цитофлуориметрического анализа изучена кинетика активации респекрина при взаимодействии с клеткой. Показана возможность экранирования и антиген-зависимой активации митогенной активности энтеротоксина A St. aureus в составе респекрина.

1. ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ЦЕЛЕЙ

Последние годы характеризуются стремительным развитием и внедрением в практику современных иммунохимических методов, основанных на применении моноклональных антител. Моноклональные антитела обладают рядом преимуществ по сравнению с полигональными антителами и являются перспективной основой для создания иммуноферментных, иммунофлуоресцентных, латексных.иммуносенсорных и других диагностических иммуноглобулиНовых препаратов. Главное преимущество гибридомной технологии состоит в том, что появляется возможность полумать практически неограниченые количества однородных по физико-химическим свойствам антител, обладающих не только заданной специфичностью, .но и аффинитетом по отношению к исследуемому антигену. Специфичность и аффинитет являются ключевыми характеристиками моноклональных антител при их использовании как компонентов диагностических тест-систем. В связи с этим при выполнении данной работы особое внимание мы уделяли получению высокоаффинных антител и детальному описанию их специфичности.

Для создания различных иммуноди агностических препаратов на протяжении последних десяти лет нами был получен ряд гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к следующим группам антигенов: вирусам, микробам, гормонам, сывороточным белкам, ферментам и низкомолекулярным соединениям. Перечень моноклональных антител и их характеристики приведены в таблице 1. Прежде чем перейти к более детальному рассмотрению свойств щнгител.

представляется целесообразным вкратце описать основные методические приемы, использованные нами при получении генетически стабильных штаммов мышиных гибридом.

1.1. МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИ СТАБИЛЬНЫХ ШТАММОВ МЫШИНЫХ ГИ5РИДОМ - ПРОДУЦЕНТОВ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

В большинстве случаев мы использовали практически один и тот же набор методических приемов при получении различных гибридом. В качестве партнеров для гибридизации выступали мышиные несекретирующие миеломные линии Sp 2/0-Ag14-1 и x63-Ag8-653. Отличия в истории получении гибридом в основном были • связаны с использованием разных схем иммунизации и методов тестирования культуральных жидкостей на предмет наличия специфических антител. Подробное изложение процедуры создания нескольких из приведеных в таблице 1 гибридом содержится в работах [12,17.18,20,21]. Рассмотрим основные этапы использованной нами технологии на примере моноклональных антител к полисахариду туляремийного микроба.

Мышей линии BALB/c иммунизируют однократно путем внутрибрюшного введения 10 млн.микробных клеток туляремийного вакцинного штамма без адьюванта, затем дважды с интервалом в 4 недели после введения микробных клеток внутрибрюшинно вводят по 50 мкг ультразвукового дезинтеграта туляремийного микроба в физиологическом растворе. Селезеночные клетки иммунной мыши используют через 3 дня после повторной иммунизации.

Для гибридизации используют клетки мышиной миеломы линии Sp 2/0 - Ag-14-1.

Для слияния селезеночные и миеломные клетки смешивают в соотношении 10:1 (3x10* и 3x10' клеток соответственно). В качестве гибридизирующего агента используют 50 %-ный раствор полиэтил^нгликоля в ОМЕМ с 10 % диметилсульфоксида, время экспозиции при слиянии 5 минут.

Первичное тестирование клонов осуществляют через 2 недели после слияния. Для первичного тестирования используют дезинтеграт клеток вакцинного штамма туляремийного микроба, очищенный от белковых примесей, соответствующий по данным реакции двойной иммунодиффузии в геле по Оухтерлони А-антигеиу туляремийного микроба, имеющему полисахаридную природу, с молекулярной массой около 100 кДа, коэффициент седиментации 1,164 S. Использование А-антигена для тестирования культуральных жидкостей в непрямом иммуноферментиом анализе позволяет выявить первичные клоны-продуценты моноклональных антител к

специфическому для вирулентных и вакцинных штаммов возбудителя туляремии полисахариду.

Гибридные клоны отбирают на селективной среде, содержащий гипоксантин (0,1 шМ), аминоптерин (0,4 ткМ) и тимидин (16 тКМ). Первичные позитивные клоны, продуцирующие специфические антитела, выявляют непрямым иммуиоферментным методом. Для этого на планшеты из полистирола сорбируют дезинтеграт туляремийного микроба в концентрации 10 мкг/мл, затем вносят культуральные жидкости и выявляют специфические антитела при помощи конъюгата аффинно-очищенных антител овцы против 1дв мыши с пероксидазой. При микроскопическом наблюдении гибридомы выявляют практически всех лунках, из них 25 % обладают способностью продуцировать антитела необходимой специфичности. На 14-й день после слияния позитивные клоны переносят на 24-луночные плашеты, после чего проводят клонирование в полужидком агаре. В результате клонирования (из 17 отбирают 6 клонов) получают клоны, которые стабильно продуцируют антитела к' полисахариду туляремийного микроба с высокими титрами. Путем серийных пассажей клетки клонов выводят в массовую культуру.

При перевивании мышам линии ВА1В/с, предварительно сенсибилизированным внутрибрюшинкым введением минерального масла (2,4,10,14-тетраметилпентадекан), клетки клонов индуцируют образование солидных и асцитных опухолей. Через 2-3 пассажа на мышах линии ВА1_В/с клетки клонов при внутрибрюшинном введении индуцируют образование преимущественно асцитных опухолей. Полученный после ре клонирования клеток из асцитной опухоли, наиболее активно продуцирующий. моноклональные антитела,гнбрндный клон переводят в массовую культуру и обозначают Т4Е10.14.

Штамм Т4Е10.14 депонирован под номером ВСКК(П) N 133Э и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки-Состав питательной среды: среда Игла в модификации " Дульбекко (ОМЕМ) с 15 % сыворотки эмбриона крупного рогатого скота, 1 мМ пируаата натрия, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Клетки культивируют в атмосфере воздуха с 7,5 %.СОг при температуре 37°С. ' I

Культура состоит из слабоприкрепляющихся к субстрату клеток. Характер роста -стационарная суспензия. Время удвоения популяции - 48 часов, частота пассирования - через 2-3 суток, кратность рассева 1:2 - 1:3, посевная концентрация клеток (1-2)х10^ в 1 мл среды.

Введение клеток штамма в брюшную полость мышей линии ВЛ1В/с вызывает образование асцитной опухоли. Доза клеток для введения животным (2- 10)х 10 ^ . За 7 дней до введения клеток мышей сенсибилизируют внутрмбрюшинной инъекцией 0,5 мл минерального масла (2,4,10,14-тетраметилпентадекан).

Время образования асцита 10-16 суток, объем асцита 4-6 мл. На протяжении 10 пассажей на животных наблюдают 100% - ное образование асцитов без изменения титра специфических антител.

Некоторые штаммы-продуценты моноклональных антител депонированы в коллекции Института цитологии РАН (г.Санкт-Петербург), остальные хранятся в жидком азоте в ВНЦМДЛ. Все гибридомы подвергаются регулярным проверкам на • жизнеспособность и специфичность продуцируемых ими антител и используются для наработки антител при производстве диагностических тест-систем и в научных исследованиях.

Таким образом, на протяжении ряда последних лет нами оптимизированы все этапы гибридомной технологии, что позволило с высокой эффективностью и в сжатые сроки создать большое количество штаммов-продуцентов моноклональных антител к разнообразным антигенам, представляющим определенный интерес при диагностике многих заболеваний. Позвольте теперь перейти к характеристике полученных моноклональных антител.

1.2. ХАРАКТЕРИСТИКА МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

Как мы отметили выше, ключевыми характеристиками моноклональных антител как компонентов диагностических тест-систем являются их аффинитет и специфичность. Аффинитет антител в конечном итоге определяет чувствительность анализа, а эпитопная специфичность важна как для правильного распознавания уникальных антигенных детерминант аналита, так и для конструирования "даухсайтных" методов иммуноанализа, когда реализуется одновременное связывание двух различных моноклональных антител с выявляемой молекулой. Для Производственных штаммов гибридом большое значение имеет также субклассовая принадлежность секретируемых антител, так как этот параметр определяет устойчивость препаратов к протеолитическому расщеплению и стратегию их, очистки из исходного сырья..

Принимая во внимание эти обстоятельства, при создании моноклональных антител К конкретному антигену, мы основывали свой выбор на панели, представленной, как правило, 15-20 различными исходными клонами. После определения субклассовой принадлежности, аффинитета и специфичности в конкурентном анализе отбирали

Таблица 1

ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

¡NN Антиген Клон Под- Kd.N Титр| Специфич- (¡сыпки [

класс . ность . J > 1

! 1 2 3 4 5 6 ! 7 :

i ВИРУСНЫЕ АНТИГЕНЫ i

! 1. Вирус прос- HSV.A33 G2a 600 тыс . ГЛИКО- 'J 8, 11, !

того герпе- протеид D | 18,22, |

са, тип 2 . j 23,36 J

: 2. Вирус IV.C102 Gl 200 тыс , гемагглю- ) 16,25, J

гриппа , тинин H1N1 ; 31,37,

тип А IV.F8 01 ' 1 млн. нуилеопро- |

теид.тило- )

спец>1фнческ1)П )

! ь< Вирус Крив-1-С5 G2a 5-16 млн. Гликопроте-!20,21, |

бешенства идиый струи+29.30 J

турный 6ело1(

KpMB-F7 Ol 40 тыс , Нуклеопроте .... i

идный струк ^

турный бело))

i 4. Вирус HB. 6 01 2-3 млн. Поверхност-j

гепатита В ный антиген¡HBsAg, |

детерминант^ a !

! б. Вирус ауку- POAMV,E4 Gl 200 тыс . Структурный i 3.4 j

ба мозацики картофеля белок ,2ОкДа,'

J МИКРОБНЫЕ АНТИГЕНЫ !

! 6. Yersinia YP.F19 Ol 6-7 млн, Капсульный i 1.2.6, i

p«stis . антиген, 9.10 J

• ■ Фракция I J

I 7. Francesella T-reio.14 G3 200 тыс , Полисах«-. ; 7,17 j

tularensis ■ ■ ■ ридный •

■ ■ А-ант»ген •

! 8. Staphylo- S5 G2a 10 млн. Энтеро- [ 32 i

coccus ! токсин В, J

aureus аминокислотные остатки 8-16 !

! 9. Legionella LP.174 G2b 400 тыс . ¡Мембранный J

pneumophila ■ белок, !

45 кДа i

Продолжение таблицы 1

+—;----------------------------------------------------......♦

I 1 ,' 2 ¡3:4:51 6 ¡71

ГОРМОНЫ, СЫВОРОТОЧНЫЕ БЕЛКИ И ФЕРМЕНТЫ ЧЕЛОВЕКА

10. Инсулин 1пэ.С7С9 С1 1x10"' И С-ионцевоЛ пентапептид 27,28

11. Гормон рост? ОН. 29 01 1x10"3 М 14 !

12. Дофамин ЬА.2В11 1x10"« И

13. Трзнсферрин ТЯ.2А2 01 ЗхЮ'Л'М Ы-концевой 24 1

гхю'^и домен

тге. 1сю в1 С-концевой Д0М9Н

14. Лактоферрин ЬР.2В8 01 200 тыс .

15. Регулятор- Ж.6 01 1 млн , 34 !

ная с/бъедИ1)ица

сАМР-зависимо

протеинкина4

эы II типа КБ. 30 02а 2-4 млн.

16. Алкогольде-гидрогенаэа АСН.1Е5 01 4 или.

17. Нейроспеци- 5Е2 02а 500 тыс ,

фическая 1С1 02а 1 млн .

енолаэа 5А4 5в10 02 а 02Ь 1 млн, 500 тыс .

ПРИМЕЧАНИЙ; Кй - константа диссоциации комплекса антиген-антитело, определяли непрямым иммуноферментиым методом согласно

В.еЪ а1., .1 Лпаипо!. МеШ. ( 1985, V,77, рр,305-319, Титр - разбавление асцитическоП жидкости, соответствующее конечной точке кривой титрования в непрямом., иммуноферментном методе .

Таблица 2

Аффинные характеристики моиохлональных антител к трвнсферрину человека

Клоп | Подкласс 1 * ■ 1 1 1 * - 1 1 Константа нативный трансферрин диссоциации, М . денатурированный траисферрнк

ТР.1С10 : 01 : 1 6,8+1,7x10"'

ТР.1012 ТК.А2А 1 01 01 : 1 : г ,2Ю,Зх10~* ,9+0,5x10"" 1,3+0,7x10"* 1,6+0,7x10"*

клоны, продуцирующие антитела к различным элитопам и обладающие наилучшими параметрами. Основные характеристики полученых нами антител приведены в таблице 1.

Как следует из приведенных данных, все гибридомы продуцируют мышиные иммуноглобулины класса G. Подавляющее большинство моноклональных антител обладают высоким сродством к антигенам, на что указывают величины титров антител в асцитических жидкостях {более 100 тыс.), а также величины констант диссоциации комплексов антиген-антитело, измеренные для антигенов белковой природы. Что касается элитолной специфичности моноклональных антител, то в случае ряда антигенов-белков, например, инсулина и энтеротоксина В St.aureus, с использованием синтетических пептидов нам удалось локализовать антигенные детерминанты с точностью до одного аминокислотного остатка. Для трансферрина и регуляторной субьединицы сАМР-зависимой лротеинкиназы эпитопы установлены по данным ограниченного протеолиза этих белков. В случае сложных вирусных и микробных' антигенов мы определяли специфичность антител, основываясь на результатах иммуноблоттинга.

В качестве иллюстрации рассмотрим определение аффинных характеристик трех моноклональных антител, напрааленых против различных антигенных детерминант трансферрина человека. На рисунках 1 и 2 приведены кривые связывания антител с трансферрином в координатах Клотца и Скэтчарда, соответственно. Линейность изотерм адсорбции свидетельствует о присутствии антител только с одной константой диссоциации, что является подтверждением моноклональности анти-трансферриновых гибридом. В таблице 2 представлены величины констант диссоциации с нативным и денатурированным антигеном. Сродство моноклональных антител TF. 1С10 и TF.2A2 по отношению к нативному трансферрину на 1-2 порядка выше, чем к денатурированному белку. Это обстоятельство позволяет сделать предположение, что конформационная составляющая антигенных детерминант для этих антител играет существенную роль в создании пространственной структуры эпитопов, в свяли с чем денатурация антигена приводит к значительному возрастанию константы диссоциации. Секвенционная составляющая также присутствует в антигенных детерминантах моноклональных антител TF. 1С10 и TF.2A2, что позволяет им связываться с денатурированным антигеном, хотя и не так прочно, как с нативным. В отношении клона TF.1G12 можно предположить чисто секвенционный характер антигенной детерминанты: пространственная укладка белковой цепи иативного трасферрина несколько маскирует последовательность аминокислот, с

1 2 3 4 1/ГФГх10^

Рис.1 Кривая связывания моноклональных антител

ТР.Ю12 с нативным трансферрином ло данным непрямого ИФА и координатах Клотца. Концентрация моноклональных антител ТР.1012 равна 3x10-" М. г - степень заполнения. ТФГ - концентрация свободного траксферрина .

0.4 0.8 ¿-

Рис. 2 Кривая связывания моноклональных антител

ТР.2Л2 с денатурированным траисферрином по' данным непрямого ИФЛ в координатах Скзтчардв. Концентрация моноклональных антител ТР.2А2 равна 5х10""'0М.

которой связываются антитела данного клона, что приводит к увеличению константы диссоциации с нативным трансферрином по сравнению с денатурированным.

В качестве другого примера рассмотрим характеристику гибридом, продуцирующих момоклональные антитела к гликопротеидному структурному белку и нуклеокапсидному комплексу вируса бешенства.

Нами было получено 76 первичных клонов гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к гликопротеиду. Из них по признаку вируснейтрализующей активности отобраны 4 стабильные линии, специфичные к различным эпитопам гликопротеидного структурного белка вируса бешенства, штамм Внуково-32; ICS, Еб, Bit к Сб. Из таблицы 3 видно, что 1) все моноклональные антитела перечисленных выше клонов s реакции непрямой иммунофлюоресценции окрашивают цитоплазматическую мембрану живых инфицированых клеток ВНК в титрах не менее 1:1000 (недотитровано) и окрашивают фиксированные ацетоном клетки; 2) все эти клоны клеток при введении под кожу мышам линии BALB/с за 6-7 дней до их'заражения в мозг в дозе > 1000 ЛД50 вирусом CVS или Внуково-32 защищают 100 % животных; 3) моноклональные антитела, продуцируемые клонами клеток (асциты в разведении 1:50) 1С5, Е6, В11 и С6, оказывают 100 % лечебный эффект при их введении мышам СВА, зараженным предварительно внутримышечно уличным вирусом бешенства, штамм Як, в дозе 4-6 ЛД50/0.1 мл; 4) все Моноклональные антитела (асциты) нейтрализуют in vivo гомологичный штамм Внуково-32 или стандартный вирус бешенства, штамм CVS, > разведениях 1:10 000 -1:1 259 ООО; 5) очень высокая степень вируснейтрализующей активности моноклональных антител in vivo установлена и в реакции нейтрализации с разведениями гомологичного вируса. Так, клом 1С5 нейтрализовал 2,2x10* ЛД50 вируса, клоны £6 и В11 нейтрализовали 1,0x10' ЛД50, а С6 - 2,1x10* ЛД50; 6) высокая реактивность моноклональных антител 1С5, Еб, В11 и С6 установлена в Непрямом имумоферментыом анализе как при использовании на подложке Очищенных цельных вирионов, так и очищенного гликопротеида; 7) моноклональные антитела всех 4 гибридом обладали высокой терапевтической активностью (100 % защита) в опытах на мышах линии СВА, предварительно заражены* уличным вирусом бешенства. Для сравнения коммерческий антирабический гамма-глобулин, применяемый для лечения человека в разведении 1:50, защищал только 16 % кивотных, а в реакции нейтрализации на мышах имел титр 6,6x10* .

Указанные выше моноклональные антитела не вступали во взаимодействие в реакции нейтрализации с антигенами вирусов везикулярного стоматита и клещевого

Таблица 3'

Характеристика моиоклональны* антител к структурным белкам ч- _|_вируса бешенства, штамм Внухово-32_

Титр антител. выявлен. метолом:

Клон Класс ИФА, ИФА, МФА, МФА, МФА, РН PfdHCTPtfT- Лечеб-

подкласс цельный * ГЛ11КО- жише фиксиров фИКСИрОН на мышах носгъ к вирусу ыышгй. ИНОК}"ЛНрО- шшных гибрндоин. клетками % ный

шгтнтел. вирус протенд клетки BHK ацетоном клетки ВНК отпечатки мозга МЫШИ эффект, %

IC5 Е6 ви G2a G2a G2a 15.0*10® Z2xl0* 1,8x10* >10* >103 >1,0x10* >1,0x10* >1,0x10' 0 0 0 0 0 0 >1,3x10' >2.2х1СГ >2,2x10* 100 100 100 100 100 100

G6 ' M >5,0х10г >103 >1.0x10-* 0 0 >1,0x10* 100 100

С1 С2Ь >5,0x10* 0 0 >3,1x10^ 1.Ы0' 0 0 0

Е11 G2b >5,0x10* 0' 0 >3,1x10*" 1.6x10 й 0 0 0

A4 GZa >5.0x10* 0 ' 0 >3,1x10"^ 1.6x10* 0 0 0

Н5 Gl >2,4*10* 0 0 6,2x10 ♦ 2,6x10*" 0 0 0

Н2 G2a >2,4x10* 0 0 6,2x10* 2,4x10*" 0 0 0

А2 M <1,2x10® 0 0 2,5x10 х 2.5x10* 0 0 0

F7 M >1,0x10* 0 0 2,5x10* 2,5x10а 0 0 0

А7 M <1,2x10* 0 1. 0 2,5x10 4 <1,2x103 0 0 0

Гамма. - . - ■ - 6,6x10 4 - 16

глобу- •

лин

энцефалита. Это доказывает строгую специфичность антител к гликопротеидному белку вируса бешенства.

Важно подчеркнуть, что получены гибридомы, секретирующие моноклональные антитела в асцитической жидкости с исключительно высокими. титрами вируснейтрализующей активности (1:1 259 ООО). У описанных ранее моноклональных антител вируснейтрализующая активность варьировала от 500 до 600 ООО.

В результате слияний и скрининга с использованием непрямого ИФА и непрямого метода флуоресцирующих антител (МФА) были получены и проанализированы около 400 клонов гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к иуклекапсидйдму комплексу вируса бешенства, штамм Внукоао-32. На первом этапе скрининпроводнпи методом непрямого ИФА на планшетах с адсорбированным очищенным цельным вирусом. Положительные культуры на втором этапе тестировали методом непрямого МФА. Отобраны 7 клонов гибридом: А7, С1, Е11, A4, Н2, Н5, F7 и А2. Из таблицы 3 видно, что 1) все эти моноклональные антитела в реакции непрямого МФА окрашиваю» внутриклеточные - цитоплазматические включения на фиксированы)« ацетоном препаратах отпечатков ткани мозга инфицированных мышей или клеточных культур и не окрашивают живые, не фиксированные ацетоном клетки. Титры моноклональных антител в непрямом МФА достигали 1,6x10* ; 2) введение клеток под кожу мышам за 6-7 дней до заражения вирусом бешенства не защищает Животных; 3) моноклональные антитела не оказывают лечебного эффекта при их введении инфицированным животным и не обладают вируснейтрализующей активностью; 5) в непрямом ИФА моноклональные антитела реагировали с цельным вирионом, адсорбированным на планшетах, но не реагировали с очищенным гликопротеидом. Титры антител в непрямом ИФА достигали 5,0x10* (недотитрованы); б) моноклональные антитела не реагировали с нуклеокапсидными антигенами в отпечатках мозга мышей, зараженных неродственным рабдовирусоч (вирус везикулярного стоматита) и флавирусом (вирусом клещевого энцефалита). -

Приведенные данные свидетельствуют о строгой специфичности моноклональных антител С1, Е11, A4, Н2, Н5, F7, А2 и А7 к нуклеокапсидному комплексу вируса бешенства. . . j

Таким образом, нами получены и охарактеризованы мышинные гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к 17 различных антигенам. Характеристика антител вкючает определение субклассовой принадлежности, аффинитета и специфичности. Полученные данные указывают на возможность использования моноклональных антител в качестве компонентов диагностических тест-систем.

2. СОЗДАНИЕ ИММУНОДИАГНОСТИКУМОВ НА ОСНОВЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУСНЫХ И МИКРОБНЫХ АНТИГЕНОВ В настоящее время моноклональиые антитела широко применяют в качестве иммуноспецифическнх компонентов в разных типах тест-систем: иммуноферметных, иммунофлуоресцентных, лагекс^ых, иммуносенсорных и других. 8 данной работе основное внимание было сосредоточено на создании иммунодиатностикумов, базирующихся на использовании твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Наиболее важными областями применения ИФА в медицине являются диагностика инфекционных заболеваний различней этиологии, контроль банков крови и лекарственных, в частности вакцинных, препаратов. Возрастает роль ИФА также в диагностике неинфекционных заболеваний человека, прежде всего в онкологии, аллергологии и эндокринологии. .

Для определения вирусных и микробных- антигенов мы использовали один из варйантов ИТ)А, так называемый "сэндвич"-метод, суть которого сводится к следующему. На первом этапе моноклональиые антитела иммобилизуют на твердой фазе (96-луночные полистирояовые планшеты), затем вносят тестируемшй материал. Если в пробе содержится антиген, то он связывается с антителами и остается фиксированным на твердой фазе при последующих отмывках планшета. На втором этапе проводят инкубацию с антителами, ковалентно связанными с ферментом, например, пероксидазой, что приводит к образованию на твердой фазе тройного комплекса антитело-антиген-конъюгат. Наличие антигена в пробе определяют на последнем этапе анализа визуально или фотометрически при помощи хромогенного субстрата фермента.

Рассмотрим оптимизацию условий проведения в сэндвич-варианта ИФА на примере тест-системы для определения вируса аукуба мозаики картофеля (РоАМУ).

Чувствительность сэндвич-метода зависит от большого числа факторов, поскольку в ходе анализа используют различные специфические реагенты и проводят несколько инкубации и отмывок. Результаты ИФА обычно выражают в виде зависимостей величины сигнала - оптической плотности окрашеного продукта ферментативной реакции - от концентрации антигена в пробах. Чувствительность метода мы определяли как концентрацию вирусного антигена - РоАМУ, при которой величина сигнала составляет половину от разности максимального и фонового сигналов. Таким образом, увеличение чувствительности может быть достигнуто как за счет Повышения уровня сигнала при наличии вируса, так и за счет уменьшения фона при отсутствии антигена. Очевидно, что чувствительность ИФА зависит в

основном от аффинитета и специфичности моноклональных антител к данному антигену. Поэтому в первую очередь мы выяснили вопрос о взаимном влиянии моноклональных антител РоАМУ.Е4. и РоАМУ.06. при связывании с РоАМУ. С этой целью исследовали связывание меченных пероксидазой хрена (ПХ) 1дО одного клона при фиксированной концентрации (5 мкг 1дО/мл) с адсорбированным на платах РоАМУ (3 мкг/мл) в присутствии различных концентраций не меченных ферментом антител другого клона (рис.1,А). Нами было показано, что конкуренция между моноклональными антителами Ро,\М\ЛЕ4. и РоАМУ.Об. за связывание с иммобилизованным вирусом отсутствует, то есть моноклональные антитела двух клонов имеют различную эпитопную специфичность. Напротив, не меченные ферментом антитела конкурируют с конъюгатом антител того же клона с ПХ за связывающие центры на вирусных частицах. Причем как следует из кривых концентрационной зависимости, конъюгирование 1дб с ферментом не влияет на аффинитет моноклональных антител.

Известно,» что при использовании моноклональных антител в сэндвич-методе связывание антигена с иммобилизоваными антителами зачастую создает стерические препятствия для присоединения меченных ферментом антител, и наоборот, если используется так называемая "двухсайтная" модификация сэндвич-метода, связывание конъюгата с антигеном в ходе одноступенчатой инкубации может препятствовать связыванию с антителами иммуносорбента. Особенно сильно этот эффект выражен для моновалентных антигенов белковой природы (то есть когда каждый эпнтоп представлен в единственном экземпляре на антигене), но может сказываться и на чувствительности детектирования таких поливалентных антигенов как вирусы растений. Для выбора оптимальной пары моноклональных антител мы определили чувствительность сэндаич-метода для четырех возможных комбинаций антител двух клонов. Наивысшая чувствительность достигалась для двух сочетаний антител: 1) PoAMV.De. -.иммуносорбент, РоАМУ.Е4. - конъюгат; 2). РоАМУ.Е4. "-иммуносорбент, PoAMV.E4.Sp - конъюгат. В дальнейшем использовали в основном первую комбинацию моноклональных антител (гетерогенный сэндвич).

Другим важным фактором, оказывающим влияние на чувствительность ИФА, является качество иммуноферментного конъюгата, которое может быть охарактеризовано величинами иммунологической и ферментативной активностей. Для синтеза конъюгатов 1дв-ПХ мы использовали метод периодатного окисления ИаКапе и Качуаю, который, согласно данным авторов, при оптимальных условиях про»едения реакции сохраняет 68% энзиматической активности и 99% иммунологической активности. Анализ экспериментальных данных по введению

пероксидазной метки в иммуноглобулины при помощи этого метода показывает, что реальный выход иммунореактивных конъюгатов существенно ниже и не превосходит 30-40%. В связи с этим мы исследовали влияние условий окисления ПХ при помощи т-периодата натрия, остановки реакции, степени очистки иммуиоглобулиновой фракции, молярного соотношения ПХ/1дО в реакционной смеси, стабилизации конъюгата ЫаВН^ и фракционирования продуктов реакции конъюгирования на чувствительность сэндвич-метода. Вкратце результаты можно суммировать следующим образом. Оптимальными условиями окисления

дииитрофторбензолмодифнцироваиной лероксидазы хрена было использование 0,04 М раствора периодата натрия №10у при длительности реакции 30 мин. и комнатной • температуре. Остановку реакции этиленгликолем можно не проводить, а удалять избыток периодата путем обессоливания на колонке с Ультрагелем АсА 202 (15x1 см), уравновешенной 1 шМ Ма-ацетатным буфером, рН 4,4. Окисление немодифицированной ПХ в дистиллированной воде с последующим диализом против 1 тМ №а-ацотатного буфера, рН 4,4, как правило, приводило к несколько худшим результатам. Для конъюгирования лучше использовать высокоочищенную фракцию 1дО: это повышало выход ферментмеченых иммунореактивных продуктов. Восстановление оснований Шиффа путем обработки конъюгатов ИаВН ^ (1 мг ЫаВНр /1 мг ПХ) позволило хранить их при минус 20 С в лиофилизованном состоянии в течение года без потери активности. При кратковременном хранении 8 стерильных условиях эту стадию можно исключить. Изучение влияния молярного соотношения ПХ/моноклональные антитела в реакционной смеси на активность конъюгата показало, что наивысшая ' чувствительность обеспечивалась при молярном соотношении ПХ/1дО=2. При избытке ПХ ингибировалась иммунологическая активность конъюгата, при избытке 1дО выход ферментмеченых антител резко падал и чувствительность снижалась в результате конкуренции меченных ПХ и немеченых антител за связывающие центры.

При разделении продуктов реакции конъюгирования на колонке с Ультрагелем АсА - 34. Профиль ¿люции характеризовался тремя пиками. Включение пероксидазы в высокомолекулярный материал составляло 80% и для него было характерно значение Я2 ~0,6, что свидетельствует о средней стехиометрии конъюгатов. 2 моль ПХ на 1 моль 1дЭ. Третий пик представлял собой не связавшуюся с пероксидазу. Анализ чувствительности различных фракций пиков I и II показал, что конъюгаты не одинаковы по иммунореактивности. Более высокомолекулярные конъюгаты характеризовались повышенным уровнем иеслецифической адсорбции, в то время как ряд фракций пика II содержал коньюгат с оптимальными свойствами,

обеспечивающими высокий сигнал и практически полное отсутствие фона. Эти фракции были объединены и использовались для дальнейшей работы.

Чувствительность сэндвич-метода для детектирования РоАМУ зависит от концентрации моноклональных антител, которые используются для адсорбции на платах. Платы с различными конценграциямн раствора в лунках инкубировали в течение 16 часов при 4 «С. поскольку известно, что такие условия обеспечивают практически полное насыщение поверхности пластмассы сорбируемыми белками. Исследование зависимости чувствительности сэндвич-метода от концентрации Ц)С, использовавшихся для получения иммуносорбента показало, что оптимальная концентрация антител составляла 2-5 мкг/мл. Сравнение результатов, полученных при использовании для сорбции на платы высокоочищенной фракции 1дв после гель-фильтрации, сульфатаммониной фракции и неочищенных асцитических

жидкостей показало, что чувствительность определения РоАМУ повышается с увеличением степени очистки антител. Тем не менее, изменения эти были не столь значительны (различия не более,чем в 1,5-2 раза). Поэтому оптимальным можно считать использование 1д0, полученных из асцитической жидкости двукратным переосаждением сульфатом аммония без дальнейшей очистки.

л

вторым важным параметром, оказывающим влияние на чувствительность сэндвич-метода, является концентрация конъюгата. Увеличение концентрации конъюгата приводило как к усилению сигнала, так и к усилению неспецифической сорбции, в особенности если используются нефракционироаанные меченные ферментом

'антитела или высокомолекулярные фракции пика I. Оптимальное соотношение между величиной сигнала и уровнем фона достигалось при концентрациях конъюгата 1-5 мкг 1дй/мл. Кривые титрования показывают, что при оптимальных концентрациях антител в иммуносорбенте и конъюгата обеспечивается надежное подавление неспецифичских реакций и определение РоАМУ было возможно вплоть до концентраций 30-50 нг/млл растительном материале.

Поскольку моноклональные антитела клонов РоАМУ.Е4. и РоАМУ.Об., взаимодействуя с разными эпитопами, не влияют на связывание друг друга с антигеном, появляется- возможность применения двухсайтной схемы детектирования РоАМУ с одновременной инкубацией тестируемого материала с конъюгатом и иммуиосорбентом. При использовании этого варианта определения очищенный вирус титровали в конъюгате и инкубировали 1 час при температуре 37 С. Полученные Эти" результаты показывают, что двухсайтная схема с одной инкубацией обеспечивала примерно такую же чувствительность, что и две последовательные инкубации с тестируемым материалом и конъюгатом. Обращает на себя внимание тот

факт, что при схеме с одной инкубацией оптимальное разведение конъюгата было в 3-5 раз выше, чем для обычной схемы. Это объясняется, по-видимому тем, что связывание конъюгата с антигеном происходит более эффективно, если антиген находится в растворе, а не в сорбированном на плате состоянии, когда для присоединения конъюгата могут иметься стерические препятствия.

Двухсайтную схему с одной инкубацией критиковали из-за ее неприменимости при высоких концентрациях антигена в тестируемых образцах. Действительно, если концентрация антигена превышает в несколько раз концентрацию конъюгата, уровень сигнала снижается из-за конкуренции между связанным и несвязанным с конъюгатом антигеном. В нашем случае концентрация вируса в растворе, при ■ которой происходит снижение сигнала по этой причине, в одноступенчатой схеме составляла около 50 мгк/мл. Это существенно превышает реальные концентрации вируса в тестируемом материале.

Исходя из приведенных данных, двухсайтную схему с одной инкубацией можно считать весьма перспективной, так как ее применение позволяет, с одной стороны, сократить время анализа, а с другой - дает возможность расходовать меньше конъюгата и других реактивов на один анализ, что имеет важное значение при массовом тестировании.

Итак, моноклональные антитела могут быть использованы для определения вируса картофеля а растительном материале иммуноферментным методом, причем применение моноклональных антител обеспечивает высокую специфичность и чувствительность индикации. Использование асцитических жидкостей для получения моноклональных антител позволяет максимально упростить процедуру выделения иммуноглобулинов для приготовления иммносорбента и иммуноферментных конъюгатов при сохранении удовлетворительного качества анализа. Наличие клонов гибридом, продуцирующих антитела с различной эпитопной специфичностью, создает необходимые условия для применения двухсайтного метода. Сокращающего время проведения анализа. Эти обстоятельства, а также возможность получения моноклональных антител в больших количествах из асцитических жидкостей, делает весьма перспективным применение моноклональных антител в производстве диагностических наборов.

Аналогичный подход был использован нами при создании иммуноферментных тест-систем для определений антигенов вируса простого герпеса 2 типа, НВхАд вируса гепатита В, чумного и гуляремийного микробов. Основные характеристики разработанных иммунодиагностикумов приведены в таблице 4.

Таблица 4

Характеристика иммуноферментных тест-систем для выявления возбудителен инфекционных заболевания

| Название ¡тест-системы Принцип анализа Чу ест- 1 НТД ! Предприятие- | вительн, ! £ изготовитель |

¡11ФТС для определения антигенов ¡вируса простого ¡герпеса 2 типа ДАС' ИФА 5-10 ¡проекты I Бионммуноген, ] нг/мл 1 вфс,рп,; внцмдл | ! Инст- ; ] 1 рукция | I

¡ИФТС дли выявле-ПШнАя ДАС ИФА 0,5-1 ФС 42- ¡Бноиммуноген ] нг/мл 291ВС-9Р, ВНЦМДЛ 1 ! РП.Инст^ | ! рукция ' ]

¡ИФТС для определения капсульно-¡го антигена чум-¡мого микроба ДАС ИФА 1-3 ¡ФС 42-371 Среднеазиат- ! нг/мл ¡ВС-91 ,РП; ский НИПЧИ, ' I Инст- ¡г .Алма-Ата ' ! рукция ; !

¡Тест-система для ¡определения возбудителя туляре-¡мии твердофазным ; и мму н о фе р ме н т н ым ¡методом ДАС ИФА 6-30x10^ | ВФС42-5 микр.хлето!) ВС-86,РГ /мл | Инст-{ рукция 1 1 НИПЧИ КиЗ 1 , г.Ставрополь !

Примечание: ДАС - двойной антительный сандвич

Помимо иммунодиагностикумов для инфекционных заболеваний в последние годы нами были созданы иимуноферментные наборы на основе моноклональных антител для определения соматических антигенов, например, нейроспецифической енолазы, трансферрина и ферритина. Практически для всех тест-систем разработана и утверждена нормативно-техническая документация и начато их производство.

3. УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУСНЫХ АНТИГЕНОВ. И ГОРМОНОВ В ряде случаев чувствительность и специфичность традиционного сэндвич-варианта ИФА оказывается недостаточной для выявления антигена в биологическом материале. Наиболее часто эта проблема возникает при диагностике вирусных заболеваний, а также при определении концентрации гормонов. Мы использовали несколько подходов для повышения чувствительности и специфичности иммунохимических тест-систем на основе моноклональных антител.

3.1. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ и Fab'ФРАГМЕНТОВ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ

АНТИТЕЛ В ДИАГНОСТИКЕ ГЕРПЕТИЧЕСКИХ АНТИГЕНОВ Ранее нами была показана принципиальная возможность применения моноклональных антител, продуцируемых мышиной гибридомой HSV.A33 для иммуноферментного определения очищенного вируса простого герпеса сэндвич-методом. При использовании для сорбции на планшеты и приготовления пероксидазных конъюгатов интактных моноклональных антител чувствительность анализа соответствовала инфекционному титру ВПГ-1, равному 5,0 lg ТЦЦ 50/мл; при этом неспецифические реакции характеризовались относительно высоким уровнем оптической плотности (около 0,2 ед.). Для индикации герпесвирусных антигенов в материале от больных (содержимое пузырьков, соскобы, слизь, слюна) требуется . повышение чувствительности и специфичности анализа. С этой целью мы оптимизировали условия получения F^b'^ и Fab'-фрагментов из моноклональных антител клона HSV.A33 и приготовления на их основе пероксидазных конъюгатоа периодатным и малеимидным методами для использования в ИФА.

Пепсинолиз широко используется для получения бивалентных F(ab')^ -фрагментов IgG, в которых отсутствует Fe-участок. В случае мышиных моноклональных антител скорость протеолитической деградации IgG и величина выхода F (аЬ')А-фрагмента определяются в первую очередь подклассовой принадлежностью антител, но даже в рамках одного подкласса они в большой степени зависят от рН реакционного буфера, соотношения фермент/белковый субстрат и длительности инкубации. Для

нахождения оптимальных условий получения Р(аЬ')д, из антител HSV.A33 мы исследовали кинетику протеолиза при весовых соотношениях пепсин/lgG 1:50 и 1:100 при рН 3,5 и 4,5 (37°С).

Для 0,2 М Na-цитратного буфера (рН 3,5) нам удалось найти оптимальные условия проведения протеолиза при соотношении пепсин/lgG, равном 1:100, и длительности протеолиза 1,5 чиса. Этот вариант оказался более удобным, поскольку исключаются длительные стадии диализа или гель-фильтрации для перегода в ацетатный буфер. При рН 3,5 протеолиз заканчивается за 1-1,5 часа с большим выходом (25%) F(ab'),j -фрагмента, чем при рН 4,2 в ацетатном буфере. Сохранение антигенсвязывающей активности в ходе протеолиза контролировали при помощи непрямого ИФА и оно оказалось равным 80%.

Для приготовления пероксидазных конъюгатов на основе интактных IgG, Ffab'j^ и Fab'с помощью периодатного метода использовали условия окисления лероксидазы, приведенные в разделе 2. Молярное соотношение фермент/белок в реакционной смеси состейляло для IgG 2,0, а для Ffab')^ и Fab' - 1,0.

Для приготовления конъюгатов ПХ с Fab' малеимидным методом использовали гетеробифункциональный агент М-сукцинимидил-4 (N-малеимидометил) циклогексан-1-карбоксилат и двух-стадийный метод конъюгирования. На первом этапе реакции N-гидрокг.исукцинимидный эфир взаимодействует со свободными аминогруппами ПХ, затем проводится реакция между SH-группами Fab1 и малеимидными группами, введенными в ПХ на первом этапе. Разделение продуктов реакции конъюгирования проводили на колонке с ультрагелем АсА-44. В результате были получены высокоактивные эквимолярные конъгогвты Fab' - ПХ, в которых присоединение фермента происходило в С-концевой области иммунореактивного компонента, существенно удаленной от антигенсвязывающего сайта. Сравнение активности IgG, р(аЬ')л и Fab'-фрагментов при иммобилизации на полистироле проводили в сэндвич-варианте ИФА при фиксированной концентрации вируса ВПГ-2 (штамм ВН) 'с использованием коньюгата lgG-пероксидаза хрена. Характер сорбции IgG и F(ab')^-фрагмента одинаков, насыщение сорбента достигается при концентрации 0,3-0,5 мгк/мл. Для Fab' -фрагмента концентрационная зависимость выходит на плато при больших концентрациях (1 мгк/мл), чем для IgG и F(ab')^.

Как было упомянуто, мы использовали пероксидазные конъюгаты четырех типов, приготовленные периодатным методом на основе IgG , Р(аЬ')41 Fab' и малеимидным методом на основе Fab' . Для каждого типа конъюгатов определяли рабочее разведение, при котором соотношение сигналов в присутствии (1000 мкг/мл) и в отсутствие антигена составляло не менее 20. Концентрация IgG в рабочем

разведении конъюгата составляла 8-10 мкг/мл, a F(ab')^ и Fab'-фрэгментов - 2,0 и 1,2 мкг/мл соответственно. Сравнение чувствительности тест-систем для выявления ' вируса простого герпеса с использованием различных конъюгатов проводили в. сэндвич-варианте ИФА с применением в качестве сорбентов IgG, F(ab')j и Fab' в концентрациях 0,5-1 мкг/мл. Полученные данные указывают на го, что чувствительность тест-системы для конъюгатов на основе F(ab )j_ и Fab' превышает таковую для конъюгата на целых IgG в 2-3 раза.

При сопоставлении различных конъюгатов и сорбентов по соотношению сигнал/фон наилучшие результаты получены при сорбции Ffab']^ и использовании конъюгатов на их основе. Чувствительность конъюгатов на основе Fab'-фрагментов, приготовленных пероксидазным и малеимидным методами оказалась одинаковой, однако в процессе хранения пероксидазный конъюгат быстрее теряет свою активность, чем малеимидный. Чувствительность определения вируса простого герпеса-2 (штамм ВН) для этих тест-систем составляла 1-10 мкг вирус-специфического белка в 1 мл в зависимости от применяемого сорбента и конъюгата.

Усовершенствование иммуноферментной тест-системы. для выявления герпетических антигенов позволило провести апробацию этого метода на клиническом материале. Известно, что наряду с клинически выраженной герпес-вирусной инфекцией человека с характерными для данного органа или ткани проявлениями, инфекция может протекать и бессимптомно, что. составляет особые трудности для диагностики.

Тяжесть симптоматики в острой фазе заболевания, частота и' длительность рецидивирования при хронических формах герпеса, а также высокий процент бессимптомного вирусоносительства обуславливает настоятельную необходимость разработки адекватных экспресс-методов диагностики инфекции.

На первом этапе клинических исследований сопоставление результатов анализа биоматериала проводили с ' использованием методов ИФА и непрямой иммунофлюоресценции (НИФ) см.таблицу 5.

В группе А обследовано 133 человека с генитальным герпесом, из них с клинически установленной хронической герпетической инфекцией - 67 человек. При сопоставлении результатов анализов, проведенных с использованием методов ИФА и НИФ, отмечено 72,8 % совпадений. В группе больных гинекологическими заболеваниями предположительно вирусной этиологии (66 человек) отмечено 80,5% совпадений результатов анализа методами ИФА и НИФ.

Результаты клинической апробации иммуио<5>ермспттж тест-спстсмы на основе могюклопальнмх аппп к »прусу простого герпеса для иьш11лс|шя антш-епо» того вируса

ТЛПЛШ1А 5

Опытные Организация- . Клинический ЛИ'ИНОЗ Кол-по Випматернал % отпадений

1р\ппг.: по соисполнитель <)(>.1Ы!ЫХ рс;*ульти гон

учету В гр\ппе ИФА и НИФ

материала

А ВНИИЦ охра,™ хронический герпес гениталий; 67 слизь 72,8

злоронья матера и гинекологические габплсшы дан 66 слизь ■ 80,5

ребенка МЗ СССР неясной (предположительно

(Москна) вирусной этиологии)

Б Институт глазных Кератит предположительно 25 Сле:я [а я 100

болезней нм.Гсльмгольуа герпетическом агиологии жидкость .

МЗ РСФСР (Москва)

В Институт охраны хронические гинекологические 73 слизь 37

злоронья матеря и :чабалс«.ишя неясной

ребенка МЗ СССР агиологии

(Хабароиск) Здортме 98 слизь 100

О^альмогерпес 33 слсзн.;кил-тъ 73

Г Мединститут МЗ гсшггальный герпес 102 слизь 81

БССР (Витебск)..

I

ГО 1Й.

I

В.группе учета "Б" проанализировано 25 образцов слезной жидкости от больных с клиникой кератита предположительно герпетической этиологии. Наличие вирусного антигена выявлено в 100 % случаев.

Совместно с Хабаровским институтом охраны материанства и детсва (ХИОМиД) МЗ СССР обследовано 78 человек с хроническими гинекологическими заболеваниями предположительно вирусной этиологии ¡группа "В"). Отмечено 87 % совпадений результатов анализа методами ИФА и НИ®,, тогда как у больных с офтальмогерпесом эта величина составила 73 %.

В группе учета "Г" обследовано 102 человека с клинической симптоматикой герпеса гениталий. Совпадение положительных результатов при исследовании биоматериала методами ИФА и НИФ отмечено в 81 % случаев. 4

Всего на 1-м этапе клинической апробации метода ИФА на основе моноклональных антител к ВПГ было обследовано- 370 биопроб клинического материала от больных с различными, формами и степенью выраженности герпетической инфекции и 130 биологических проб от клинически здоровых людей. Процент совпадений данных ИФА с результатами анализа методом НИФ состг?.ил соответственно 80 % и 71 %.

Использование набора методов значительно повышает объективность полученой информации, вследствии чего, как нам представляется, в дальнейшем следует ориентироваться именно на сопоставление данных анализа набором современных экспрес-методоа диагностики герпеса. Наиболее высокий процент выявления положительных результатов в ИФА, по-видимому, обусловлен тем, что этот метод является наиболее специфичным.

3.2. ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ С ВРЕМЕННЫМ РАЗРЕШЕНИЕМ (ИФА ВР) ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА Один из путей повышения чувствительности иммуноанализа на основе моноклональных антител заключается в 'использовании вместо ферментов других меток, выявление которых возможно при более низких концентрациях. К таким меткам относятся ионы европия, для которых разработаны методы измерения их концентрации вплоть до с использованием флуоресценции с временным

разрешением. Идея применения европиевой метки в мммуноанализе сформулирована в 1979 году 8о1ш и НештНа и получила название диссоциативно-усиленного лантаноидного иммуноанализа (0Е1_Р1А). Суть метода состоит в том, что* ионы европия вводятся в антитела или антигены в виде нефлуоресцируюцего хелатного комплекса и иммуноамалнз проводится в соответствии с традиционными схемйми

Рнс.З Калибровочный график для определения концентрации инсулина человека сэндвич-методом с использованием диссоциативно-усиленного лантаноидного иммуноаналиэа (ИФА ВР).

ИФА. На заключительном этапе анализа вносят так называемый усиливающий раствор, в котором происходит диссоциация ионов европия с образованием новых комплексов, характеризующихся высокой интенсивностью флуоресценции. Регистрацию сигнала осуществляют в режиме измерения флуоресценции с временным разрешением.

Нами были синтезированы необходимые реагенты для проведения ИФА ВР, в том числе хелатообразователь изотиоцианатофенил-ЕОТА для введения европиевой метки 8 моноклональные антитела, а также компоненты усиливающего раствора - 2-нафтоилтрифторацетон и три(п-октил)фосфиноксид (авторское свидетельство N 282924). Мм оптимизировали условия количественного определения инсулина человека методом ИФА ВР, используя схему двухсайтного сэндвича с моноклональными антителами 1пэ.С7С9 в качестве сорбента ц 04В8, любезно предоставление д-ром В.Л.Юриным (ВНИИ Генетика), в качестве меченного реагента. Наилучшие результаты были получены при введении 3-5 ионов европия на одну молекулу 1дв и концентрации антител Р4В8 равной 0,5-1,0 мкг/мл. Калибровочный график в этих условиях (см.рисунок 3) имеет линейный вид в диапазоне концентраций инсулина от 50 до 1000 пг/мл, что полностью перекрывает диапазон физиологически значимых концентраций этого гормона.

Сопоставление иммуиоферментного и иммнофлуоресцентного с верменным разрешением методов с использованием одних и тех же антительных реагентов показывает, что использование европиевой метки обеспечивает выигрыш в чувствительности приблизительно в 20 раз по сравнению с ферментативной меткой. Разработанная нами реагентная и методическая база для ИФА ВР позволяет без особых затрат модифицировать существующие иммуиоферментные тест-системы ■ тех случаях, когда требуется существенное повышение чувствительности анализа, например, при определении гормонов, цитокинов и вирусных антигенов.

4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ПОДАВЛЕНИЯ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИФИЙ

Успехи современной иммунобиотехнологии стимулируют интерес к пассивной серопрофилактике и серотерапии инфекционных болезней. В то же время антивирусные антитела практически не используются для лечения инфекционных заболеваний, подавления репродукции вируса. Исключая несколько случаев успешного применения антител для подавления вирусных инфекций, описанных в литературе, во многих случаях терапевтическая эффективность препаратов антивирусных антител является низкой.

Мы исследовали влияние моноклональных антител к вирусам бешенства и гриппа на подавление их репродукции.

4.1. ИЗУЧЕНИЕ ВИРУСНЕЙТРАЛИЗУЮЩЕЙ И ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ГЛИКОПРОТЕИДНОМУ СТРУКТУРНОМУ БЕЛКУ ВИРУСА БЕШЕНСТВА Для определения индекса нейтрализации (ИН) проводили преинкубацию в течение 1 часа 10-кратных разведений вирусов с асцитическими жидкостями разных анти-рабическнх клоноа. В качестве контроля брали .те же разведения вирусов с ' нормальной мышиной сывороткой. Вируссодержащую суспензию вводили интрацеребралмк» нелинейным белым мышам массой 7-8 г. ИН определяли по разнице между * опытом и контролем. Из таблицы б видно, что асцитические жидкости, содержащие моноклональные антитела 1С5, Е6 и В11 обладают высокой вируснейтралиэующей активностью по отношению к вирусам бешенства штамм Внуково-32 и CVS в разведениях 1:20 - 1:2000. В особенности ярко этот эффект проявляется в случае моноклональных антител 1С5, которые в реакции с гомологичным (Внуково-32) и гетерологичным (CVS) вирусами имели ИН, равный 7,34 и 5,0, соответственно. Сравнительно меньшей вируснейтрализующей активностью обладали антитела G6, продукты клонов Е6, В11 и 66 не нейтрализовали гетере логичный вирус CVS.

Для определения терапевтической активности моноклональных антител мышей . инии СВА предварительно заражали внутримышечно заведомо смертельной дозой (8-10 ЛД50) уличного вируса бешенства штамм ЯК, а спустя 2-3, 24 и 48 часов вводили в' место заражения различные - разведения моноклональных антител илй коммерческий антирабический гаммаглобулин (АГГ) в объеме 0.1 .мл. Результаты

определения активности моноклональных антител 1С5 в сопоставлении с АГГ

/

приведены в таблице 7. Из представленных данных следует, 4to полученные нами моноклональные . антитела 1С5 оказывают значительно более высокий терапевтический эффект, чем АГГ. Введение АГГ через 24 и 43 часов-, после заражения только увеличивают срок инкубационного периода, но не защищает животных, тогда как моноклональные антитела ICS в эти сроки оказывают выраженный лечебный эффект. . Полученные нам>< данные указывают на перспективность использования моноклональных антител 1С5 как компонентов нов"* антирабических препаратов.

. Таблица .6

Вируснейтрализусхцая активность моноклональных антител к гликопротеиду вируса бешенства, штамм Внуково-32 в реакции нейтрализации на мышах массой 7-8 г

J Разведение 1 моноклон. антител ИН(в Ig ЛД50/0,03мл )с 0>1уково-32 тест-вирусами J cvs • !

! 1С5 1:20 >6,75 6 62 ;

1:100 >6,3 > 5 э :

1:200 7, 34 5 о !

1:1000 6,8 ,5, 13 !

1:2000 5,0 4 з 1

: Еб 1:20 7,0 0 31 !

1:200 5,17 0

: в 11 1:20 >6,0 1 63 i

1;200 4,17 . 0

;сб 1:20 4,33 1 31 i

1:200 2,8 ' 0

Таблица 7

Результат лечебного действия моноклональных антител 1С5 к гликопротеидному белку вируса бешенства у мышей линии СВА с массой 14-16 г зараженных в мышцу уличным вирусом штамм Як

¡Время введения j Коммерческий АГГ, МКА 1C5 ,• асцити -

¡после заражения ! титр 924 ME ческая жидкость

j (час ) , ¡разведение л /в - раз ведение п/в

! ME /мг

! 2-3 1:26 13/25 1! 26 0/25

! (200)

! 1:52 20/25 1: 80 0/25

! (100)

1 1:104 23/25 Is 160 0/25

! (50) - 1: 480 6/25

j - ■ Is 1440 16/25

! 24 ' ! 1:26 9/12 Is 40 2/11

! (200) «

1 48 ! 1:26 13/13 Is 40 4/12

! (200)

Примечание :

В контроле вируса пали все 25 животных, п/п - в числителе: число павших животных , в знаменателе - число вьт-ннших .

4.2. ВЛИЯНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ГИДРОФОбИЗАЦИИ АНТИВИРУСНЫХ АНТИТЕЛ НА РЕПРОДУКЦИЮ ВИРУСА ГРИППА В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК Ключевые стадии репродукции вируса происходят внутри клетки, в то время, как антивируные антитела не способны проникать внутрь клетки. Нативные ммуноглсобулины, будучи неспособными преодолевать мембранный барьер и проникать в цитоплазму клетки, не в состоянии блокировать репродукцию вируса.

В качестве одного из подходов для решения этой проблемы недавно был предложен метод искусственной гидрофобизации белков путем ацилирования остатками жирных кислот в системе обращенных мицелл. Такая модификация ведет к усилению мембранной активности белка и, в частности, обеспечивает его транслокацию через модельные бислойные мембраны. В экспериментах на клетках было показано^ что модификация остатками жирных кислот приводит к существенному усилению связывания белков (в том числе иммуноглобулинов) с клеточной мембраной, а также их эффективному эндоцитозному захвату внутрь клеток.

В работе мы использовали моноклональные антитела IУ.С 102 к гемагглютинину, а также моноклональные антитела 1У.Н12 и Г/.Р8 к нуклеопротеидному белку вируса гриппа штамм А /чайка/Казахстан /470/79 (Н1№). Нами также были получены поликлональнме кроличьи антитела к гемагглютинину того же штамма. Полученные иммуноглобулины модифицировали И-сукцинимидным эфиром или хлорангидридом стеариновой кислоты, используя в качестве среды для модификации систему с Сращенных мицелл аэрозоля ОТ в октане.

Модификация антител остатками жирных кислот приводит к тому, что антитела становятся бифункциональными. С одной стороны сохраняется их основное свойствб - блокировать антиген, с другой - они приобретают способность взаимодейстьовать с клеткой;" С увеличением числа включенных в молекулу антитела жирнокислотных остатков повышается ее гидрофобность, и следовательно, способность связываться с мембраной клетки. Однако, при этом снижается антигенспецифическая активность иммуноглобулинов, так как остатки жирных кислот могут присоединиться-, и в области активного центра. В работе мы использовали антитела,. модифицированные 1-2-мя остатками жирных кислот.

Основной системой для изучения репродукции вируса гриппа служила культура клеток МРСК, зараженная определенными штаммами вируса гриппа и подвергнутая в различные периоды репродукционного цикла воздействию изучаемых гидрофобизованных антител. Влияние модифицированных антивирусных антител на репродукцию вируса гриппа оценивали по двум параметрам:

1. В зараженных клетке« через определенные периоды времени определяли скорость синтеза вирусспецифических белков;

2. Через определенные промежутки времени определяли инфекционность вирусного. потомства, полученного в среде культивирования зараженных клеток. Исследование динамики накопления вирусных белков в зараженных клетках показало, что модифицированные антитела к внутренним белкам вируса гриппа (1\/.Н12), добавленные до и во время заражения, в отличие от ^модифицированных подавляют синтез вирусных белков на ранних стадиях инфекции (до 4-х ч после заражения). На поздних стадиях инфекционного процесса уровень синтеза вирусных белков в образцах, обработанных как нативными, так и модифицированными антителами, выравнивается во всех пробах. " V

На следующем этапе исследовали влияние модифицированных антител к внутренним белкам вируса гриппа на инфекционность вирусного потомства. Для этого монослой клеток МОСК инкубировали с нативными, контрольными и гидрофобизованными иммуноглобулинами в различные периоды репродукционного цикла. Обработка монослоя клеток модифицированными антителеами к М1-белку (клон 2Е5С1) до заражения (4 ч) и на ранних стадиях после заражения (0-6 ч) приводит к снижению титра инфекционности вирусного потомства приблизительно в 20 раз. Нативные и контрольные антитела к этому белку не оказывают влияния на инфекционность вирусного потомства.

Для сравнения способности ' нативных и гндрофобизованных антител к поверхностным антигенам вируса гриппа влиять на процесс заражения использовали метод бляшек.

При таком подходе модифицированные поликлональные антитела к гемагглютинину, добавленные к клеткам до заражения, снижают заражающую дозу приблизительно в 15 раз. Нативные антитела также снижают заражающую дозу вируса при добавлении к клеткам до заражения, но значительно менее эффективно.

Добавление нативных и модифицированных поликлональных антител против гемагтлютинина к клеткам сразу после заражения также вызывает незначительно« снижение множественности заражения. Это может быть связано с тем, что процесс заражения клеток вирусом продолжается во времени.

Предполагается, что гидрофобизованные антитела к гемагглютинину вируса гриппа, ассоциируются с мембраной клетки. При заражении вирион, адсорбируясь на мембрану клетки, встречается с включенным а нее антителом. Гаким образом, вирион теряет свои инфекционные свойства. Нативные иммуноглобулины плохо взаимодействуют с мембраной клетки. Поэтому после удаления среды, содержащей

нативные антитела, вирус не встречает препятствий на мембране в процессе заражения.

Таким образом нами показано, что гидрофобиэация антител приводит к усилению их способности встраиваться в модельные липидные мембраны и мембраны коеток. Получены результаты, подтверждающие усиление антивирусного действия гидрофобизованных антител к поверхностным антигенам вируса гриппа (гемагглютинину). Впервые получены данные по усилению антивирусной активности антител к внутренним белкам вируса гриппа (М1 и ^-белкам). Полученные результаты позволяют предложить механизмы усиления антивирусного действия гидрофобизованных антител как к внутренним, так и к поверхностным белкам вируса гриппа.

5. СОЗДАНИЕ НОВЫХ ПРЕПАРАТОВ НАПРАВЛЕННОГО ДЕЙСТВИЯ НА ОСНОЗЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

Принцип направленной доставки лекарстенных. препаратов к очагу заболевания впервые был предложен более ста лет назад Эрлихом, и в настоящее время широко известен. Не вызывает сомнений то, что наиболее эффективное действие лекарства, дающее при этом минимальный побочный эффект, может быть обеспечено в том случае, когда активность препарата проявляется только при контакте с пораженными органами или клетками. Особенно это важно при лечении заболеваний опухолевой природы, требующих введения цитотоксических и высокоантигенных белковых факторов.

Наибольших успехов в згой области удалось добиться, используя лекарственные препараты; снабженные векторным элементом, обеспечивающим неспецифическому фактору сродство к определенному типу клеток. Так, в частности, весьма эффективны в этом отношении иммунотоксины - гибридные молекулы, представляющие собой бактериальный или растительный токсин; либо его фрагмент, соединенный с антителом, специфичным по отношению к поверхностному антигенному маркеру клеток, пораженных заболеванием, которые обеспечивают направленный транспорт препарата к очагу заболевания и последующее удаление пораженных "клеток.

В настоящее время существует большое число работ, посвященных создания и применению иммунотоксинов, специфичных к различным антигенам, однако, имеется целый ряд проблем, затрудняющих широкое применение таких препаратов. Прежде всего, эти проблемы связаны с неспецифической Токсичностью иммунотоксинов, поскольку даже после удаления рецептор-узнающей части токсического компонента

в большинстве случаев не удается уменьшить эту величину до необходимого уровня. Другим важным недостатком иммунотоксинов является то, что далеко не все ' поверхностные антигены сопряжены с клеточными системами, обеспечивающими, эндоцитоз гибридной молекулы. Эффективность этого процесса может. значительно снижаться при конъюгации антител с токсином. В связи с этим часто сталкиваются с низкой активностью иммунотоксинов и, наконец, концентрация антигена на поверхности клеток, требующих удаления, в ряде случаев оказывается слишком низкой, что также делает иммунотоксин неэффективным.

Мы предлагаем принцип создания нового типа соединений направленного транспорта, названных нами респекринами. В составе респекрннов физиологически активный фактор находится в экранированном состоянии, что позволяет устранить проблему его неспецифичском активности. Взаимодействие с антигеном-мишенью вызывает активацию указанного фактора и специфическое его действие.

На рисунке 4 приведена схема и механизм действия респекрина, который представляет собой физиологически активный фактор, обратимо экранированный рецептор-специфическими макромолекулами. Указанный фактор с помощью метода химической модификации конъюгируется с эпитоп-содержащим фрагментом маркерного антигена клетки-мишени. Модификация проводится таким образом, чтобы фактор сохранил свою активность в составе конъюгата, однако «нактивировался при взаимодействии с антителами, специфичными к антигену. В данном случае аитатела совмещают в себе функции узнавания мишени и компонента, экранирующего фактор в составе респекрина. Важно также, чтобы сродство антител к антигенной детерминанте, введенной в состав фактора, не превышало их сродство к интактному антигену. При контакте респекрина . с антигеном происходит диссоциация иммунокомплекса, сопровождающаяся активацией физиологически активного фактора.

Функционирование респекрина не зависит от эндоцитирующей способности антгена, поскольку эффект реализуется а результате взаимодействия £нологмчеаЫ активного фактора с его собственным рецептором. Более юго, в качестве ' активатора комплекса может быть использован не только поверхностный, но также и растворимый антиген, например, секретируемый патологическими клетками белок. В этом случае респекрин может быть сконструирован таким образом, чтобы его активация происходила только при такой концентрации антигена, которая создается вблизи антигеи-секретирующих клеток. *

Кинетика активации респекрина была изучена нами на клеточной модели, включающей в себя три линии пимфобластоидных клеток человека, а именно, В-

ч*

со

Рис*4 Строение и механизм действия респекркна (1-клетка, содержащая антиген-мишень 11-клетка , не содержавшая антиген-мишени; Р - экранированный, неактивный фактор} р* -активированный фактор, АВ - экранирующее антитело).

клетки, иммортализованные вирусом Эпштейн-Барр (линия G¡), В-клеточная линия на Namalva и Т-^леточная линия Jurkat. В качестве поверхностного антигена были • использованы мембранные IgM, а в качестве эпитол-содержащего фрагмента -изолированные у - цепи. За диссоциацией респекрина на поверхности клеток следили с помощью метода проточной цитофлуориметрии по связыванию входящих в его состав антител, специфичных к J> -цели и меченных ФИТЦ.

Клетки линиу G¡ содержат наиболее высокую концентрацию мембранно-сзязанных IgM. В меньшей степени антиген представлен на поверхности клеток Namalva. Клетки линии Jurkat вовсе не содержат мембранных IgM, о чем свидетельствует отсутствие флуоресцентной метки на их поверхности. Таким образом, выбранная клеточная модель позволяет оценить эффективность диссоциации изучаемого иммунокомплекса, в зависимости от концентрации поверхностногр антигена-мишени. Как оказалось, в начальный момент времени после добавления иммунокомплекса к клеткам во всех трех случая;; изменения интенсивности флуоресценции не наблюдалось. Это свидетельствует о том, чю иммунокомплекс инертен как по отношению к антиген-содержащим, так и к антиген-несодержащим клеткам. Однако, с течением времени в зависимости от концентрации мембранных IgM, то есть для клеток линии Gi в большей степени, а для клеток линии Namalva - в меньшей, наблюдалось смещение пика распределения клеток в сторону большей интенсивности флуоресценции, носящее насыщаемый характер. При этом интенсивность флуоресценции в области насыщения практически соответствовала той величине, которая наблюдалась при добавлении к клеткам антител, не обработанных у-цепями. В то же время клетки линии Jurkat сохраняли начальный уровень флуоресценции. Полученные данные свидетельствуют, о том, что при контакте иммунокомплекса с клеточной мембраной происходит его антиген-зависимая диссоциация.

Энтеротоксим A St.aureus (SEA) является одним из наиболее высокоэффективных митогенов по отношению к нервным и лимфоидным клеткам. Эта его активность сопровождается чрезвычайно высоким уровнем индукции интерлейкина-2 и гамма -интерферона в клетках- мишенях. Высокая иммуномодуляторная активность SEA на наш взгляд делает его или его фрагменты перспективными для использования в качестве физиологически активного компонента ресгекринов. В данной работе мы изучили возможность получения респекрина, обладающего антиген-зависимой митогениой активностью по отношению к нормальным лимфоцитвм из периферической крови человека (ЛПК).

Таблица 8

Влияние SEA и SEA-cодержащих респекринов на скорость включения (ЗН 1-тимидина в ДНК человеческих ЛПК

(Концентрация ! SEA или ¡ конъюгата< SEA -IgG + IgG Конъюгат -IgG +IgG Респекрин ¡ -Igü + IgG !

Í lxlO"/¿ . 2832 ¡ 3198 (211)! (114) 2926 J 2611 (132) ! (195) 3186 ! 3228 ! (291) i (186) ¡

! 1x10* " ! 1x10-'P ' ! lxlO"J 4103 ! 3924 (381)! (262) 42421! 49821 (1121)¡(2126 ) 89624' J87724 (1422)¡(4831) 4137 ¡ 3729 (308) ! (362) 34244 ! 91228 (4627) j(3981) 83948 ! 85767 (6891) 1(2483) 2726 3949 ! (213) ! (221) ¡ 2220 ¡ 28428 i (199) ! (2621) ! 3427 ¡ 83682 ¡ (342) ¡ (1124) !

Примечание; В таблице приведены усредненные'данные пяти

измерений, в скобках - стандартные отклонения.

С помощью SPDP SEA был ковалентно присоединен к поликлональным IgG мыши. Полученный конъюгат был очищен до гомогенного состояния с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на носителе TSK-G-3000 SW и по. данным SDS-электрофореза в ПААГ содержал две молекулы SEA на одну молекулу антител. Функцию мишени-активатора в данном случае выполнял растворимый антиген, добавленный в среду культивирования клеток, в качестве которого были использованы еоликлональные IgG мыши, взятые в концентрации 1 мкМ. В качестве экранирующего элемента респекрина использованы видоспецифические кроличьи антитела против IgG мышей.

В таблице 8 приведены результаты определения скорости, включения /Зн/тимидина в ДНК ЛПК при действии на клетки SEA, конъюгированного с мышиными IgG, в присутствии и отсутствии 10-кратного избытка экранирующих антител. В отсутствие экранирующего компонента митогенная активность коньюгата практически полностью совпадает с митогенной активностью SEA и не зависит от присутствия или отсутствия а среде'культивирования активирующего антигена. В то же время после лреинкубации конъюгата с 10-кратным избытком антимыши; :ых антител при 37°С а течение 1 часа респекрин не проявлял митогенных свойств по отношению к ЛПК, в среде культивирования которых не содержалось мышиных IgG. При действии респекрина на клетки, культивируемые в присутствии 1 мкМ мышиных антител, наблюдалась активация пролиферации клеток.

Полученные данные, по нашему мнению,, дают основание полагать, что предлагаемая конструкция может содержать в своем составе достаточно надежно экранированный физиологически активный фактор белковой природы и способна к антиген-зависимой • активации при взаимодействии с мишенью. Таким образом, предполагаемый принцип дает возможность создавать соединения направленного транспорта, значительно более эффективными по сравнению с иммунотоксинами и гормонотоксинйми; Высокая специфичность действия респекринов обеспечивается экранированием действующего начала, при этом его физиологическая активность реализуется через рецептор фактора, входящего в состав респекрина. '

В качестве антигена, активирующего респекрин, может быть использован не только антиген, экспонированный на. поверхности мембраны клетки-мишени, а также и любой растворимый антиген, локализованный в районе очага заболевания.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Возможность получения практически неограниченных количеств стандартных моноклональных антител, обладающих заданным аффинитетом и специфичностью, открывает новые перспективы в создании иммунодиагностических и иммунотерапевтических препаратов.

Основным итогом проведенного исследования является создание методологии получения и характеристики моноклональных антител к разным антителам, включая вирусы, бактерии, сывороточные белки, гормоны, ферменты и гаптены. Оптимизация всех стадий проведения иммуноферментного анализа позволила нам разработать несколько иммунодиашостикумов на основе моноклональных антител, а также предложить пути' повышения их чувствительности и специфичности.

Наибольший интерес вызывает использование моноклональных антител как терапевтических агентов. В данной работе мы продемонстрировали возможность использования искусственной гидрофобизации моноклональных антител для усиления подавления вирусной инфекции. Нами предложен новый принцип конструирования систем направленной доставки лекарств и экспериментально продемонстрирована возможность его реализации. Безусловно, большинство результатов этой части работы получены на модельных системах, тем не менее продолжение исследований представляется нам крайне перспективным.

ВЫВОДЫ '

1. Получены генетически стабильные штаммы мышиных гибридом, продуцирующие моноклонаЛьные антитела к 17 различным антигенам:

- вирусам простого герпеса 2 типа, грипп типа А, бешенства, гепатита В, аукуба мозаики-картофеля;

- капсульному антигену Y.pestis, полисахариду Fr.tularensis, энтеротоксину В SLaureus, мембранному белку 45 кДа Lpneumophila;

- инсулину, гормону роста, дофамину, трансферрику, лактоферрину, регуляторной субъединице сАМР-зависимой протеинкиказы II типа, алкогольдегидрогеназе и нейроспецифической енолаэе человека.

2. Изучены аффинные характеристики, специфичность и субклассовая принадлежность полученных моноклональных антител с учетом их применения в качестве компонентов новых иммунодиагностических тест-систем.

3. На основе полученных моноклональных антител созданы новые высокочувствительные иммунодиагностические препараты для индикации

возбудителей особо опасных инфекций - чумы и туляремии, выявления вирусных антигенов простого герпеса и гепатита В, количественного определения трансферрина, соматотропного гормона и нейроспецифической енолазы Человека. 4; Разработаны методы получения Р(аЬ >2 и раЬ' фрагментов моиоклональных

антител и ферментативных конъюгатов на их основе с целью повышения чувствительности и специфичности иммуноаналиэа вирусных антигенов.

5. Синтезированы хелатообразователь и компоненты усиливающего раствора для проведения диссоциативно-усиленного лантаноидного флуоресцентного иммуноаналиэа. Оптимизированы условия определения инсулина человека с чувствительностью 50 нг/мл с использованием ИФА ВР.

6. Изучен механизм усиления антивирусного действия гидрофобизованных моиоклональных антител к внутренним и поверхностным антигенам .вируса гриппа, основанный на модификации иммуноглобулинов остатками стеариновой кислоты.

7. Предложен новый принцип конструирования соединений направленного транспорта. В составе предлагаемой конструкции, названной респекрином (рецептор-специфический, экранированный) физиологически активный компонент, в состав которого введен эпитоп-содержащий фрагмент антигена-мишени, экранирован антителом, специфичным к этому антигену. При взаимодействии респекрина с клеткой-мишенью происходит диссоциация комплекса, сопровождающаяся активацией физиологически активного компонента

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

1. В.П.Топорков, Ю.Ю.Венгеров, Д.В.Волков, П.Г.Свешников, Ю.М.Федоров, М.И.Леви, Ш.П.Зарипов, И.А.Воротников. Временные методические указания по применению иммуноферментного метода на основе моиоклональных антител при эпизоотологическом обследовании энзоотичной по чуме территории // ВНИПЧИ "Микроб" МЗ СССР, г.Саратов, 1984, с.19.

2. М.И.Леви, Ю.Ю.Венгеров, Д.В.Волков, М.М.Лившиц, Л.Н.Апановский, С.Н.Курочкин, П.Г.Свешников. Использование моиоклональных антител в иммуноферментном анализе дло доказательства одновалентности антигена // Ж.Микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 1984, N 11, с.84-88.

3. В.А.Энгельгардт, Ю.Ю.Венгеров,Д.В.Волков, П.Г.Свешников, Л.В.Мемелова, Т.ЕСеменов, В.Я.Нисаноа, А.б.Попова, Л.Н.Тоофимец. Применение монок/юн.тльных антител для иммуноферментной диагностики вируса аукуба мозаики картофеля // Доклады ВАСХНИЛ, 1984, N 7, с.11-13.

4. Д.В.Волков, Ю.Ю.Венгеров, П.Г.Свешников, Л.В.Мемелова, А.Б.Попова, В.Я.Нисанов, Т.В.Соломина, Л.Н.Трофимец, В.А.Энгельгардт. Методические аспекты иммуноферментной диагностики вирусов растений с использованием моноклональных антител на примере вируса аукуба мозаики картофеля // Сельскохозяйственная биология, 1984, N11, с.49-55.

5. Д.В.Волков, Ю.Ю.Венгеров, П.Г.Свешников, Т.В.Булартина, В.А.Фуралев, Э.Э.Егти, И.П.Гаврипюк.В.Г.Конарев, С.Е.Северин. Иммуноферментное определение легумина бобовых с применением моноклональных антител // Доклады ВАСХНИЛ, 1985, N 4, с. 5-8.

6. С.М.Воробьев, Ю.Ю.Венгеров, В.Я.Нисанов, М.И.Леви, П.Г.Свешников, Е.С.Северин. Возможности иммуноферментного анализа с использованием ферментов пероксидазы и бета-лактамазы // В сб.: "Актуальные вопросы иммунодиагностики особо опасных инфекций", НИПЧИ КиЗ МЗ СССР, Ставрополь,

1986, 4.1, с.56-59.

7. Е.Г.Чернявсхая, П.Г.Свешников, Н.Ф.Василенко, О.Н.Лопаткин, Иммуноферментиая тест-система для определения антигенов и антител в диагностике туляремии /J В сб.:"Актуальные вопросы иммунодиагностики особо опасных инфекций", НИПЧИ КиЗ МЗ СССР, Ставрополь, 1986, ч.Н, с.166-168.

8. Н.Д. Львов, И.Л. Дегтярев, П.Г.Свешников, Г.А.Посевая, Е.С.Северин, И.Ф.Баринский. Разработка иммуноферментного теста' для определения вируса простого герпеса типа I с использованием моноклональных антител J/ Вопросы вирусологии, 1986, N 6, с.709-712. -

9. М.И.Леви, С.М.Воробьев, П.Г.Свешников, Ю.Ю.Венгеров. Использование бета-лактамазы в качестве метки для иммуноферментного определения калсульного антигена.чумного микроба // Антибиотики и медицинская биотехнология, 1S86, N11, с.885-890. . • .

10. КХЮ.Венгеров, М.И.Леви, ДВ.Волков, П.Г.Свешникоа, Е-ССеверин. Системы серологических реакций с использованием иммуноспецифических реагентов, печенных ферментом // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии,

1987, N 3, с.56-61.

11. Н.Д.Львов, ' А.А.Никитина, . П.Г.Свешников, Т.А.Посевая, Т.Б.Семенова, Е-О.Самойлович, ЕХ.Северин, Р.М.Бик6улатов, И.Ф.Баринский. Усовершенствование экспресс-метода иммуноферментного анализа (ИФА) для определения герпетических антигенов. // В сб.: "Методы исследования в молекулярной, общей и медицинской вирусологии", Институт вирусологии им.Д-И.Ивановского АМН СССР, Москва, 1987, с. 176-180.

12. С.Е.Северин, Т.В.Буларгина, В.А.Фуралев, П.Г.Свешников, Ю.Ю-Венгерое, . Е.С.Северин. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, используемый для получения моноклональных антител к легумину бобовых. //• Авторское свидетельство N1458384, 1988.

13. Е.А.Воронцов, В.Н.Злобин, А.Г.Ишков, Л.Н.Кркжов, П.Г.Свешников, Е.С.Северин, Д-Н.Сидорин. Без названия. // Авторское свидетельство N 282324, 1988.

14. П.Г.Свешников, Н.В.Громова, П.М.Рубцов, Г.А.Погжова, И.А.Прудовский, ДС.Бассалык. Диагностиками для определения гормона роста человека на основе иммуноферментного анализа.// Сб.:"Гормон роста человека" Научный центр биологических исследований АН СССР, Пущино, 1988, с.60-64.

15. В.Ю.Алахов, С.А.Аржаков, О.В.Василенко, С.Г.Волощук, И.С.Глазкова-Степаненко, И.В.Дувакин, А-Г.Ишков, А.В.Кабанов, Е.Ю.Клинский, Т.П.Кравцова, Р.В.Петров, П.Г.Свешников, Е. С.Северин. Новый принцип создания иммунотерапевтических соединений направленного действия. Физиологически активные вещества, обратимо экранированные . «ишень-узнающими макромолекулами.// Доклады Академии наук СССР, f 93£, пЗОЗ, Ai 6, с.1494-149/.

16. A.V.Kabanov, A.V.Ovcharenko, N.S.Melik-Nubarov, AJ.Barmikov, V.I.Kisselev, O.I.Kisselev, P,G.Sveshnikov, A.V.Levashov, E.S.Severin. Fatty acid acylâted antibodies against virus suppress its reproduction in cells.// FEBS Letters, 1989, v.250, N 2, pp.238-240.

17. Е.Г.Чернявская, П.Г.Свешников, О.Я.Ажипа, О.Н.Лопаткин, Е.С.Северин. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, используемый для получения моноклональных антител к полисахариду туляремийного микроба.// Авторское свидетельство N 1554364, 1989.

18. И.Ф.Баринский, Е.С.Северин, С.Н.Курочкин, Т.А.Посевая, С.С.Ямникова, Н.Д.Львов, П.Г.Свешников, А.А.Никитина. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, продуцирующий моноклональные антитела к вирус/ простого герпеса II типа.// Авторское свидетельство N 1489178, 1989.

19. В.Ю.Алахов. СА.Аржаков, А.Г.Ишков, В.А.Кабанов, Р.В.Петров, П.Г.Свешников, Е-С.Северин. Без названия.// Авторское свидетельство N 303068, 1989.

20. С.В.Грибеича, В.А.Фуралев, С.Ю.Клюшник, П.Г.Свешников, И.Ф.Баринский, Е-С.Северин. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L, используемый для получения моноклональных антител к гликопротевдному структурному белку вируса бешенства.// Авторское свидетельство N 1631072, 1990.

21. С.В.Грибенча, О.В.Василенко, С.Ю.Клюшник, П.Г.Свешников, И.Ф.&аринский, Е.С.Северин. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L, используемый для получения моноклональных антител к нуклеопротеидному структурному белку вируса бешенства.// Авторское свидетельство N 1631073, 1990.

22. А.А.Никитина, Н.Д.Львоа, П.Г.Свешников, Е.С.Северин, И.Ф.Баринский. Усовершенствование иммуноферментной тест-системы на основе моноклональных антител для определения герпесвирусных антигенов.// Вопросы вирусологии, 1990, т.35, N 1, с.52-5 7. {

23. П.Г.Свешников, Н. Д. Львов, А.А.Никитина, Е.С.Сеаерии, И.Ф.Баринский. Иммунохимнческие подходы к диагностике герпесвирусных инфекций с использованием моноклональных антител.// В сб.: "Герпесвирусные инфекции" (диагностика и .лечение). Институт вирусологии им.Д.И.Ивановского АМН СССР, Москва, 1990, с. 41-43.

24. С.Б.Городецкая, В.А.Фуралев, П.Г.Свешников, Н.В.Махлин, Е.С.Северин. Использование Моноклональных антител для определения содержания трансферрина в моче.// Урология и нефрология, 1990, N 3, с.35-36.

25. A.V.Kabanov, A.V.Ovcharenko, N.S.Melik-Nubarov, A.I.Bannikov, T.P.Lisok, E.V.KIushnenkova, N.G.Cherchenko, V.Yu.Alakhov, P.G.Sveshnikov, A.V.Levashov, V.I.Kisselev, O.I.Kisselev, E.S.Severin. Effective inhibition of viral reproduction by hydrophobised antiviral antibodies.// Biomédical science, 1990, v.1, pp.63-68.

26. y.Yu.Alakhov, S.A.Arzhakov, O.V.Vasilenko, S.G.Voloschuk, I.S.Glazkova-Stepanenko, I.A.Duvakin, A.V.Kabanov, V.A.Kabanov, E.Yu.KUnskij, T.N.Kravtsova, K.V.Petrov, P.G.Sveshnikov, E.S.Severin. Respecrin - a new type of compound with targeted action.//Biomédical Science, 1990, v.1, pp.155-159.

27. Н.В.Ермаков, А.Г.Ишков, Е.В.Мирошниченко, О. П. Плющ, Э.Н.Ремизоза, П.Г.Свешников, Е.Ю.Ченчикова, Н.Г.Черченхо. Исследование аффччных характеристик моноклональных антител в методе твердофазного м«муноферментиого анализа.// Биохимия, 1990, т.55, вып. 12, с.2163-2170.

2G. Н.В.Ермаков, Б.В.Крехнов, Е.Ю.Ченчиков&, Н.Г.Черченко, А.Г.Ишков, Э.Н.Ремизооа, П.Г.Саешников, Е.В.Мирошниченко, Ю.В.Назаров, А.П.Морозоа, Г.Д.Ковальская, Е.В.Артемов,О.П.Плющ, Кинетика транспорта иммуноглобулина G через многослойный эпителиально-тематический барьер дыхательных путей.// Биохимия, 1991, т.56, вып.5, с.883-891.

23. С.В.ГрнбенЧа, О.В.Василенко, Т.М.Кузьмицкая, В.А.Фуралев, П.Г.Свешников, А.Г.Татаров, П.В.Кологвина, И.Ф.Баринский. Взаимодействие моноклональных антител к структурным белкам вакционного вируса "Внуково-32" с вирусами группы бешенства.// Вопросы вирусологии, 1991, N 5, с 399-402.

30. С.В.Грибенча, О.В.Василенко, В.А.Оуралев. С.Ю.Клюшник, Т.М.Кузьмицкая, . П.Г.Свешников, И.Ф.Баринский. Получение и характеристика гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к структурым белкам вируса бешенства-штамм Внуково-32.// Вопросы вирусологии, 1991, N 4, с.318-321.

31. А.В.Овчаренко, А.В.Кабанов, Н.С.Мелик-Нубаров, В.Ю.Алахов, А.И.Банников, Т.П.Лисок, В.И.Киселев, А.И.Левашов, Н.Г.Черченко, Е.В.Юиошненкова, П.Г.Свешников,'О.И.Киселев, Е.С.Северин, Р.В.Петров, В.А.Кабанов, С.А.Аржаков, Е.В.Батракова. Способ подавления репродукции вируса.// Авторское свидетельство N1730144, 1992.

32. V.Yu.Alakhov, E.Yu.Klinsky, M.t.Kolosov, . I.Maurer-Fogy, E.Yu.Moskaleva, P.G.Sveshnikov, L.P.Pozdnyakova, O.B.Shemchukova, E.S.Severin. Identification of functionally active fragments of staphylococcal enterotoxin B.// Eur.J.Biochem. 1992, v.209, p.823-828.

33. A.V.Kabanov, V.I.SIepnev, LEKuznetsova, EV.Batrakova, V.Yu.Alakhov, N.B.Melik-Nubarov, P.G.Sveshnikov, V.A.Kabariov. Pluronic micelles as a tool for low-molecular compound vector delivery into a cell: effect of St.aureus enterotoxin В on cell loading with micelle incorporated fluorescent dye.// Biochemistry International, 1992, v.26, N 6, p. 1035-1042.

34. f.D.Grosdova, O.O.Kofesnikova, LN.Koroljova, O.B.Shemchukova, E.V.Sveshnikova, P.G.Sveshnikov. Antibodies to the regulatory subunit of cAMP-dependent protein kinase type II from bovine brain inhibit the holoenzyme formation.// Biochemistry International, 1992, v.27, N 5, p.811-822.

35. М.Л.Симонова, П.Г.Свешников, И.Н.Беспалова, К.Г.Скрябин. Доказательство экспрессии предполагаемого мембраносвязывающего 12К-белка Х-вируса картофеля в клетках Echerichia coli.// Доклады Академии наук, 1992, т.322| N 5, р.985-988.

36. Н.Д.Львоо, А.А.Никитина, П.Г.Свешников, А.И.Банаг, О.Д.Видута, А.Г.Бресскмй, Л.А.Марченко, М.В.Соколова, М.А.Власова, В.В.близнюк, Ю.Ф.Майчук, Г.В.Банченко, Л.П.баэукина, И.М.Рабинович, М.М.Гараев, И.Г.Харитоненков, О.В.Островская, Е.С.Северин, И.Ф.Баринский. ■ Сопоставление результатов анализа клинических материалов гинекологического, офтальмологического и стоматологического профилей набором экспресс-методов диагностики герпесвирусной инфекции.// Вопросы вирусологии, 1991, N 5, с.315-318.

37. N. S. Melik-N u barov, Yu.G.Suzdaltseva, E.L.Priss, V.I.SIepnev, A.V.Kabanov, O.P.Zhirnov, R.G.Sveshnikov, ES.Severin. Interaction of hydrophobized a«iiviral antibodies with influenza virus infected MDCK cells.// Biochemistry and Molecular Biology International, 1993, Vol.29, N 5, pp.939-947.

Результаты диссертационной работы были представлены на 8 симпозиуме Биохимических обществ СССР-ГДР "Проблемы современной биохимии и биотехнологии" (Рига, 1985); на 10 объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР-ГДР "Механизмы регуляции клеточной активности" (Ташкент, 1989); на I Всесоюзном съезде иммунологов (Сочи, 1989); на Международной конференции "Перспективы иммунотерапии при инфекционных заболеваниях" (Берлин, 1990); на II Роса&ко-Израильском симпозиуме по пептидам и белкам (Москва, 1992).

. Подписано в печать /У. 190.3 г.

Зак. Тир. /¿><3

МАЛОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ «ПЕТИТ»