Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Технология получения и характеристика моноклональных антител к иммуноглобулинам классов G и М свиньи

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Технология получения и характеристика моноклональных антител к иммуноглобулинам классов G и М свиньи"

всесоюзный -ордена ленина научно-исследовательскии институт экспериментальной ветеринарии им.Я.Р.Коваленко (виэв) всесоюзная ордена ленина и ордена трудового красного

знамени академия сельскохозяйственных наук

им.В.И.Ленина (ВАСХНИЛ)

На правах рукописи ■

еерховскии олег анатольевич

ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ИММУНОГЛОБУЛИНАМ КЛАССОВ в и М СВИНЬИ 03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата Апологических наук

Москва - 1991 г.

Работа выполнена в лаборатории иммунологии и биотехнологии ВИЭВ ВАСХНИЛ, лаборатории иммунохимии НИИЭК ВКЩ АШ СССР и в лаборатории генной инженерии вирусов ВНИИСБ ВАСХНИЛ.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Ю.Н.Федоров

Официальные оппоненты:

1. Засл. деятель науки. РСФСР, доктор биологических наук, про(|ессор Л.П.Дьяконоя (ВИЭВ).

2. Доктор биологических наук И.И.Бенедиктов (ВИГИС). '

Ведущее учреждение: Московская ордена Трудового Красного Знамени ветеринарная академия им.К.И.Скрябина

Защита диссертации состоится Г991 г.

ШФ /

з П_часов на заседании Специализированного Совета К 020.28.01

по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при Всесоюзном ордена Ленина научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им.Я.Р.Коваленко по адресу: X09472, г.Москва,- Кузьминки. ВИЭВ.

С диссертацией мошо ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Автореферат разослан "/У" ^¿«У^-*/-Г1991 г

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат ветеринарных наук

Ф.Г.Терешков

I1

эл

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

■ ЛА-ЗЛ

;с:.ртгд,/Л 5

------ -'-Актуальность_темы± Гибридомная технология, разработанная

сравнительно недавно, представляет на сегодняшний день наряду с генной инженерией одно из наиболее перспективных направлений современной биотехнологии.

Разработанный Келлером и Мильштейном (1975) метод получения гибридом, продуцирующих моноклональные антитела заданной специфичности, открыл новую эру в биологической науке. С тех пор моноклональные антитела завоевали прочные позиции в качестве мощного инструмента,- исследований в молекулярной биологии, генетике, медицине и ветеринарии.

Интенсивное развитие иммунохимии белков плазмы подтвердило важную роль иммуноглобулинов в инфекционной и неинфокционной патологии животных.

Для проведения исследований, связанных с изучением основных иммунных механизмов и роли различных классов иммуноглобулинов при вирусных и бактериальных инфекциях животных, с определением уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови и других биологических жидкостях организма, ^-содержащих клеток в тканях, для оценки характера иммунного ответа и иммунологического статуса, необходимо наличие высокоспецифических реагентов к отдельным классам иммуноглобулинов.

Целью_настоящей_работы_явилось получение гибридомных линий клеток, продуцирующих моноклональные антитела к иммуноглобулинам сим свиньи, определение иммунохимической характеристики полученных моноклонвльных антител, а также апробация этих препаратов и оценка возможности их использования для качественной и количественной характеристики иммуноглобулинов свиньи методами иммунохимического анализа.

В^§5°те_бы™_поставлеш_сл9^»щв_за2ачи^_

1. Отработать методы очистки и выделения иммуноглобулинов классов сим из сыворотки крови свиньи, определить иммунохимическую чистоту полученных препаратов.

2. Отработать оптимальные способы иммунизации мышей линии ваъв/о полученными антигенами.

3.Отработать тест-систему на основе ИФА и РИД для тестирования

гиоридом, продуцирующих моноклональные антитела к 1§с и СВИНЬИ.

4. Получить гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела заданной специфичности (гибридизация клеток, тестирование, клонирование, перевод в массовую культуру, получение асцита).

5. Дать иммунохимическую характеристику полученным моноклональным антителам и испытать их в качестве иммунодиагностических реагентов в ИФА и РИД для выявления и в различных биологических жидкостях организма свиньи.

Научная_новкзн9_и_практическая_знач™ос Получены стабильные линии гибридом, продуцирующие моноклональные антитела к иммуноглобулинам сим свиньи. Изучены основные свойства полученных клонов гибридом и секретируемых ими моноклональных антител. Определена локализация и характер антигенных детерминант и 1ёМ, с которыми реагируют антитела полученных клонов. Отработаны условия очистки моноклональных антител методами ионообменной и афинной хроматографии. На основе моноклональных антител получены иммунопероксидазнне конъюгаты для выявления и в биологических жидкостях свиньи твердофазным ИФА. Полученные моноклональные антитела испыташ в качестве диагностических реагентов в твердофазном "сэндвич" ИФА и РВД по выявлению и в сыворотках крови свиней. По материалам исследований разработаны "Методические рекомендации по количественному определению иммуноглобулинов с- и м- классов в биологических жидкостях методом иммунофэрментного анализа (1ЭЭ0)

Апробация_работы. Основные результаты работы доложены на:

- конференции молодых ученых ВМЭВ, 1991 г.

- пленарном заседании секции "Биохимия сельскохозяйственных животных" Московского отделения Всесоюзного Биохимического общества АН СССР, 1991 г.

- межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ, 1991 г.

Публикации.;. По теме диссертации опубликовано четыре научные работы.

Объем_и_стр^т^а_диссертации. Диссертационная работа изложена на 160 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований,обсуждения результатов исследований, выводов, практических предложений, списка литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 20

рисунками и 11 таблицами. Список литературы включает 244 источника ( 29 отечественных и 215 зарубежных авторов).

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Антигенные_препараты^ Исходным материалом для выделения иммуноглобулинов класса g и м служила нормальная сыворотка крови свиньи.В нашей работе мы отрабатывали два способа выделения и очистки иммуноглобулинов. Первый способ основан на осаждении глобулинов с помощью добавления 6-12% полиэтиленгликоля (м.м.6000) и дальнейшей очистки методами ионообменной хроматографии и гель-фильтрации. За основу второго, был взят метод выделения igM, предложенный J.Cambier and J.Butler (1974).

Получение_антисыворотокл Иммунизацию кроликов проводили по схеме, предложенной М.А.Мисниковой и А.Ю.Самострельскпм (1976) для получения антисывороток к растворимым антигенам. Активность антисывороток определяли в реакции двойней иммунодиффузии в агаре по Оухтерлони (1965). Контроль специфичности осуществляли в иммуноэлектрофорезе.

Иммунизация мышей линии ВА1В/с проводилась по разработанной нами схеме на основе методики Holmdahl R. et ai.(i965).

Культивщюваше_мэтотаых_лин^^1_сжяше__клеток проводили

по стандартным методикам (Kohler G. et al.,1976; Kennet R.et al., 1981) с модификациями, отработанными в лаборатории иммунохимии НИИЭК ВКНЦ АМН СССР.

Специфические j^oro^ выявляли в непрямом

твердофазном ИФА и РИЛ.

Клонирование___гибридом проводили методом предельных

разведений по стандартным методикам (Oi et al.,1980; Kennet R. et al.,1981).

Для__получения асцитных__использовали методику

Tucker Е.М.(1986).

И?А_в_точках__на__нитроцеллшозных__фильтрах проводили по

методу, описанному Тарасишшым (1986).

Диск=____электрофорез_____белков проводили в пластинах

полиакриламидаого геля в буферной системе Лэммли (1970).

Блот-____и^^ноаетекцию_бвлков_____после______эл9ктрофореза_

в полиакриламидном____геле осуществляли с помощью метода

Kyhse-Andersen J.(1984).

Иммуноэлектрофорез,__РДП__и__РИД проводили по методикам,

отработанным в лаборатории иммунологии и биотехнологии ВИЭВ.

Очистку___моноклональных____антител проводили методами

ионообменной и аффинной хроматографии на DEAE-Toyo Pearl 650 (S) И Protein-A-Sepharose CL-4B.

!?й§нтифшацию_класса_и_подкласса_получешшх моноклональных антител проводили методом двойной иммунодиффузии по Оухтерлони.

Приготовление__1^унопероксидазных__конъюгатов_ на основе

моноклональных антител проводшш по методу, описанному P.Tijssen and Е.Kurstak (1934).

Для___детекции___Ige___и___lgM_B__биологических____жидкостях

использовали твердофазный "сэндвич" ИФА.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Выделеше ^_очистка_тмуноглоб _0пределею1е_ишунохимэтеской_чистота

Для получения моноклональных антител заданной специфичности необходимо наличие антигенов- иммунохимически чистых препаратов, которыми иммунизируют животных продуцентов и используют для исследований в различных серологических тест-системах. Поэтому первой задачей в нашей работе было выделение и очистка иммуноглобулинов классов G и м свиньи и определение их иммунохимической чистоты.

С этой целью отрабатывали два способа выделения и очистки иммуноглобулинов, используя комбинации различных методов. При этом важную роль играли применяемые сорбенты для гель-фильтрации и ионообменной хроматографии.

Для ионообменной хроматографии мы использовали слабый анионообменник DEAE-Toyo Pearl 650(S) (фирма "Т030Н", Япония), для гель-фильтрации- Toyo Pearl HW-65 этой же фирмы и Sephaoryl s-300 фирмы "Pharmacia", Швеция. Это очень жесткие гели, обладающие химической стойкостью, термостабильностью, стабильностью слоя геля и высокой разрешающей способностью. При

высокой скорости элюции они обеспечивали эффективное разделение смеси белков без их денатурации.

При иммуноэлектрофоретическом анализе полученных фракций отбирали только те, которые давали одну линию преципитации с антисывороткой к сывороточным белкам крови свиньи в области миграции 18М и одну линию преципитации с этой не антисывороткой, соответствующую или его подклассам.

Электрофорез в ПААГ-ДСН с полученными фракциями ставили в "плюс-минус" варианте, т.е.: в I треке- образец прогревали при ЮО°С в присутствии ДТТ или р-меркаптоэтанола, разрушающих нативную молекулу белка и восстанавливающих дисульфидные связи. Это позволило идентифицировать тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов. Во 2 треке образец был без восстанавливающего агента и без прогревания, что сохраняло нативную форму иммуноглобулина. Для дальнейшей работы отбирали фракции, не содержащие примеси других белков.

Полученные препараты концентрировали полиэтиленгликолем, определяли содержание белка по Лоури и проводили повторный анализ. При необходимости проводили повторную очистку на одном из вышеперечисленных сорбентов. Полученные иммуноглобулины до использования хранили при температуре -20°С.

_Пол^чв™о_антисывороток_к_вщвле}

Для дальнейшей работы, в частности, для различных серологических исследований нам были необходимы поликлональные антисыворотки к полученным иммуноглобулинам.

Отработанный способ иммунизации позволил получить высокоактивные антисыворотки к иммуноглобулинам, при этом сокращались сроки иммунизации и расход антигенов. В ходе иммунизации было установлено, что индивидуальные животные отличаются по антителопродуцирующей способности. Поэтому проводилось пробное кровопускание на 15-20 день после введения антигена в лимфоузлы и определение активности антисывороток. Кроликов с тигром преципитирующих антител 1:8 и выше обескровливали, а при титре ниже 1:8 антиген вводили через 30 дней после первой иммунизации внутривенно в дозе 0,5 мл (концентрация белка I мг/мл) через сутки инъекцию повторяли,

к

увеличивая дозу в два раза. Через 10 суток проводили пробное кровопускание с определением титра антисывороток и последующим обескровливанием кроликов.

В результате были получены антисыворотки к иммуноглобулинам о и м свиньи с титром 1:32-1:64. Их испытывали на специфичность, подвергали стерилизующей фильтрации и лиофильному высушиванию.

Отработка_тест-систеш

Одним из необходимых этапов в получении моноклональных антител является разработка тест-системы для быстрого, достаточно чувствительного и специфичного скрининга антител в процессе получения и клонирования гибридом. Поэтому второй задачей в нашей работе была отработка метода непрямого твердофазного ИФА и РИД применительно к мышиным антителам к иммуноглобулинам сим свиньи. Был выбран наиболее стандартный вариант ИФА антител на полистероловых микропанелях, где лунки вначале сенсибилизируют очищенным антигеном, далее инкубируют в них разведения тестируемых антител, а затем, ферментативный конъюгат соответствующих антивидовых антител.

Для разработки метода использовали линейных мышей ваьв/с, гкяериммунизированных очищенными препаратами иммуноглобулинов с и м свиньи.

На следующем этапе работы подбирали условия для сорбции иммуноглобулинов на твердой фазе. Выбор оптимальной концентрации антигенов для иммобилизации на полистероловые микропланшеты имеет большое значение для постановки ИФА. Избыточная концентрация антигена ведет к образованию неспецифического комплекса белок-белок, причем этот комплекс легко диссоциирует при следующих промывках, что приводит к потере чувствительности метода. Избыточная концентрация ведет также к перерасходу реагентов, возникает опасность появления неспецифических реакций. Недостаточная концентрация антител однозначно ведет к снижению чувствительности метода.

Поэтому для определения оптимальной концентрации сенсибилизирующего антигена, очищенные препараты иммуноглобулинов с и к в подлонке были протитрованы с соответствующими

гипериммунными мышиными сыворотками против этих иммуноглобулинов и с контрольными (кеиммунными) сывороткам.

Одновременно проводили подбор блокирующего белка, испытывая для этих целей такие реагенты, как: бычий сывороточный альбумин, желатина, сыворотка лошади, овальбумин в различных концентрациях. Это имело важное значение для предотвращения неспецифической реакции, возникающей вследствие наличия у иммуноглобулинов разных классов и видов животных общих антигенных детерминант.

Определение сенсибилизирующей дозы иммуноглобулинов о и м дало близкие результаты: 1-10 мкг/мл. В качестве блокирующего белка был выбран бычий сывороточный альбумин в 2% концентрации на ФБ, при этом анти-1^ мыши конъюгат, синтезированный в лаборатории генной инженерии вирусов ВНШСБ, разводили в фб, содержащем 1055 нормальной свиной или бычьей сыворотки. В это?л случае неспецифическая реакция полностью исключалась или была минимальной.

Тест-система по выявлению антител к и на основе РИД была отработана следующим образом. В пробирки с расплавленной агарозой , охлажденной до +50-56°С, вносили нормальную свиную сыворотку или очищенные препараты иммуноглобулинов в различных концентрациях (от 0,1 до ъ%) и разливали в чашки Петри слоем 2-3 мм. После полимеризации геля, пробивали лунки и вносили в каждую по 30-50 мкл гкпериммунной мышиной сыворотки против или 1£м и помещали ео влажную камеру. Учет реакции проводили через 24-48 часов, при этом особое внимание уделяли величине колец преципитации и зависимости их размера от процентного содержания антигена в агаро. Чрезмерное его количество приводило к образованию очень небольших колец, минимальное- вело к потере чувствительности метода.

Определение оптимальной концентрации антигенов в агарозе ' дало следующие результаты: содержание нормальной свиной • сыворотки должно быть 0,5-1% от общего объема агарозы, а концентрация и должна составлять 20-40 мкг/мл геля.

Таким образом, отработанный метод иммуноферментного анализа позволяет быстро и надежно обнаруживать, количественно оценивать и характеризовать специфичность антител к иммуноглобулинам, полученным от кроликов и мышей. Реакция иммунодиффузии и диффузионной преципитации необходимы для выявления и

характеристики преципитирующих поли- и моноклональных антител.

На . основе разработанной методики постановки иммунофермонтного анализа проводили также ИФА в точках на нитроцеллюлозных фильтрах (антигены наносили на фильтры в виде точек) и иммуноблотинг (антигены наносили на нитроцеллюлозные фильтры после электрофореза в пластинах полиакриламидного геля). Затем фильтры также инкубировали с антителами, конъюгатом и субстратом.

Разработанные нами иммуноферментный анализ и метод радиальной иммунодиффузии применяли в дальнейшей работе для котроля процесса иммунизации животных, скрининга гибридом и определения специфичности продуцируемых ими моноклональных антител.

Получение гибридом, продуцирующих моноклоналыше §нтитела^_1муноглобу^

Для иммунизации животных- продуцентов использовали две группы 30-50-дневных самок мышей линии вахв/о. Первую группу иммунизировали очищенным препаратом вторую - очищенным

препаратом свиньи. Мышей иммунизировали по отработанной нами схеме.

Антигены в дозе 40-80 мкг тщательно смешивали до сметанообразной консистенции с равным объемом полного адъюванта Фрейнда и вводили мышам по 30-40 мкл в подушечки задних лапок. На 9-ый день вводили 50-100 мкг каждого антигена в подушечки задних лапок, но уже без адъюванта. Через 3 дня мышей убивали методом церебральной дислокации, асептически извлекали периферические лимфатические узлы (паховые и подколенные) и готовили суспензию лимфоцитов для слияния.

Для получения гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к иммуноглобулинам Сим свиньи, лимфоциты мышей, иммунизированных препаратами данных антигенов, сливали с клетками мышиной миеломы линии Р3-Х63-А,§а-653. Слияние проводили по стандартной методике с внесенными модификациями с использованием ПЭГ 1500.

Основные этапы получения гибридом представлены на рисунке I.

мономональше_антитела^^

1^щше_лимфоциты_. / клетки_мкеломы

ШШ!. \ / РЗ-Хб31Лв8=653__2х10^

слшянив_клеток_в_ПЭГ

рассев_на_Эв=Л2но^^9_м1^опане™_+_сре5^

^гй_5еньг_контрастная_ш^оскопия_и замена половины среды ПАТ средой НТ

1

замена_сре£ы_НТ !"~~

13-14-й день- вторичный скрининг культур отОор_положигельных лунок

/ X

клонирование методом предельных пвренос_на_24гх_

разведений луночные планшеты,

| накопление^

реклонирование_ заморозка

_____ _______

накопление клеток из положительных лунок

7 \

субкультивирование асщ?тная_Ш5Кость

Эффективность слияния (оценивается как доля или % лунок с гибридными клетками от общего числа лунок на микропанелях) и специфическая эффективность слияния (оценивается как доля или % лунок с гибридомами-продуцентами специфических моноклональных антител от общего числа лунок с гибридными клетками) представлены в таблице I.

1§5^л1л_§Ф^ттность_ги(^идазацт_1уето

и_§Ф±»кттность^бразо1ад

52§1йФЩвскм_моноклонащнщ_антите.лл

к Иммуноген опита

Общее число ячеек в опыте

Число ячеек с гибр. клонами

Эффект. Число гибрид, ячеек (%)

Специфич. эффект, с гибр.- гибрид, продуц. (%) специфич. МКА

1вМ

288

267

92.7

19

7.1

192

173

90,1

14

8.1

I

2

Как видно из таблица I, эффективность слияния составила 9092 %, эффективность специфического слияния или образования гибридом-нродуцентов специфических моноклональных антител -7-8%.

Ю

Клонирование гибридом.

Через 11-14 дней после слияния и появления в лунках колоний гибридных клеток, супернатанты из всех лунок были дважды тестированы на продукцию специфических антител. Скрининг проводили методом непрямого твердофазного ИФА на полистероловых микропланшетах, лунки которых сенсибилизировали очищенными препаратами иммуноглобулинов. Наличие прещшитирующих антител определяли в реакции иммунодиффузии. Культуры, давшие позитивный ответ в двух скринингах (19 - на igM и 14 - на igG), были немедленно расклонированы.

В этом разделе работы приведены результаты клонирования и реклонирования гибридом методом предельных разведений в 9в-луночных микпропанелях "Costar", "Linbro", "Huno" на макрофагальном фидерном слое.

Раннее клонирование является важнейшей предпосылкой получения стабильных и активно секретирующих моноклональные антитела гибридом. Необходимость в раннем и, в дальнейшем, периодическом клонировании гибридом, обусловлена тем, что в каждой лунке обязательно присутствует смесь генетически неотождествленных клеток. Даже в том случае, если визуально наблюдается одна колония, она не является клоном. Это объясняется тем, что юные гибридные клетки активно теряют отдельные хромосомы причем разные клетки - разные хромосомы. Клетки, утратившие способность продуцировать антитела, начинают делиться быстрее, чем клетки сохранившие эту способность. В силу этого непродуценты в считаннные дни или часы перерастут продуцентов. Процесс активной потери хромосом продолжается в течение нескольких первых недель или месяцев жизни гибридных клеток. Вот почему в течете всего этого времени их надо постоянно реклонировать. Затем хромосомный набор стабилизируется и реклонирование проводится в случае необходимости (после разморозки или по результатам контроля уровня антителопродукции в культуре).

В таблице 2 представлены данные по результатам клонирования и определению секретирущей активности гибридом до и после клонирования, а также влияния этой процедуры на изменение титров специфических антител в культуральных жидкостях. .

Табл.2. Эффективность клонообразования и секретирукщая способность гибридом, продуцирующих монокдональше

антит9ла_к_1^_и_1^А_щонир0ваннт_мет020М предельных_разведений.

Назв. Число Число % положит. Титр специфич.антител

клона одиночных положит. клонов в культуральной жид-

клонов клонов кости, .выявляемые в ИФА

исход- после

ный клонирования

1С4 6 1 16,67 1:20 1 :80-1:160

2РЗ 21 4 19,04 1 :40 1 :640-1 :1280

2F.4 16 1 6,25 1:2 1:20-1:40

1Е4 29 6 20,69 1:10 1:320-1:б40

1G2 18 5 27,78 1 :2 1 :10-1:20

2Р2 10 3 30 1:10 1:160

2Н4 14 7 50 1:20 1 :160-1 :320

1F12 17 4 23,53 1 :2 1:20

А4(1 ) 21 11 52,33 1:80 1 :640-1 :1280

А4(2) 27 9 33,33 1:80 1 :640

Г8(1 ) 6 2 33,33 1:2 1:20-1:40

F8 (2) 5 1 20 1 :10 1:320-1:640

Г8(3) 9 5 55,56 1:20 1:640

2G1 (1 ) 10 2 20 1:2 1 :10

2G1 (3) 8 4 50 1 :2 1:20-1:40

Е12 17 3 17,65 1 :10 1:40-1:80

Анализируя таблицу 2, можно отметить, что первичное клонирование во всех случаях дало существенное повышение титров антител в культуральных жидкостях, но следует подчеркнуть тот

факт, что после реклонирования все ЮОЖ тестированных клонов были положительными, тогда как после первичного клонирования

положительными были только 6,25-65,56% клонов. В тоже время, реклонирование не оказывало заметного влияния на продуктивность гибридомных культур, поэтому увеличения (и снижения) титров антител не наблюдалось.

П§2евод_гифидом_в_массов^ю_к^льтуру_

Для препаративного получения моноклональных антител необходимы массовые культуры гибридомных клеток. Известны два способа выращивания гибридом в больших количествах: in vitro- в стационарных и суспензионных культурах и in vivo- путем индукции асцитных опухолей у сингенных животных.

В нашей работе мы применяли оба способа получения моноклональных антител.

При суспензионном культивировании гибридные клетки, по мере их роста, были последовательно переведены на 24-х луночные планшеты, а затем в матрасы общим объемом 25 и 75 см3. При этом концентрация антител составляла 1-10 мкг на I мл ростовой среды.

Для получения асцитов, содержащих антитела с высокой концентрацией (порядка 2-5 мг/мл жидкости), мы прививали мышам линии balb/o гибридные клетки, выращенные в суспензионной культуре. Предварительно, за 3-7 суток до инъекции клеток, мышей обрабатывали приставом, вводя его внутрибрюпшнно по 0,3-0,5 мл каждой мыши. За сутки до введения гибридные клетки пассировали в культуре с кратностью пересева 1:2 для поддержания их в фазе логарифмического роста. Обработанным пристанем мышам, внутрибршинно инъецировали суспензию клеток в количестве 3-8 млн каждой, в объеме 0,5 мл. Результаты опыта приведены в табл.3.

Анализ полученных данных показывает, что асциты у мышей образовались в течение 7-13 суток после инъекции клеток. При этом количество асцитной жидкости составляло в среднем 5 мл от одной мыши (минимальное количество- 1,5 мл, максимальное- 10 мл).

Все клоны гибридом обладали способностью перевиваться от мыши к мыши. Однако, в некоторых случаях, введение клеток вызывал^ у мышей образование солидных или солидно- асцитных

опухолей. Это явление наблюдалось в Ъ% случаях и было как при первом введении клеток, так и при вторичном пассаже. При

дальнейших паооажах этот эффект исчезал.

Табл.3. Характеристика асцитных препаратов гибридомных клонов.

Назв. Кол-во Время образ. Кол-во Титр антител

клона мышей взя- асцита, асцит. В ИФА

тых для сутки жидкости,

прививки мл

2F3 (1 ) 5 10-12 4,5-6,5 5x105

2РЗ(2) 5 8-13 5-ю 5x105

1С4 5 10-12 5-6 6,4-12,8x103

А4(1 ) 5 7-12 1,5-6,5 5x105

£8(1 ) 5 7-10 5-7 12,8x103

Р8(3) 5 7-10 5-7 25,6x1О3

Е12 5 9-12 4-5 25,6x103

Примечание: титры антител представлены в виде максимальных разведений асцитных жидкостей, дающих положительную реакцию (превышение оптической плотности на 0,1 опт.ед. по сравнению с контролем).

0превелеше_изотша_моно^онзльнга_а^

Как известно, гибридомы могут сокретировать антитела различных изотипов. Для определения изотипической принадлежности антител, секретируемых гибридомами, мы использовали кроличьи антисыворотки к различным подклассам иммуноглобулинов мыши фирмы "Sigma" и пластинки с агаром фирмы "Calbioohem". Идентификацию проводили с помощью реакции двойной иммунодиффузии по Оухтерлони по методике, рекомендованной фирмой.

Полученные результаты показали, что из 6 моноклональных антител, секретируемых гибридомами, полученными к иммуноглобулину класса М свиньи,три принадлежат к подклассу т2Ъ иммуноглобулина С (1^2Ь), два к подклассу 72а(1^2а) и один - к подклассу 71 иммуноглобулина 0(1^). Из 7 моноклональных антител, секретируемых гибридомами, полученными к иммуноглобулину класса с свиньи, два принадлежат к подклассу 72ь иммуноглобулина с (1^2Ь), четыре к подклассу 71 иммуноглобулина й (1^), а одно относится к 101- классу.

Определе™е_специ$ичности__моноклональных__антител__в

отноше1^_антоте1™х_2ет^__и__м__свиньи

мэтодом_и^уноблотинга^

Основной характерной чертой моноклональных антител являотся их способность реагировать только с одним типом антигенных детерминант, входящих в состав антигена. Известно, что существует два типа антигенных детерминант: линейная и конформационная. Линейные детерминанты представлены определенными аминокислотными последовательностями в первичной структуре бежа, а конформационные детерминанты, напротив, представлены определенными областями нативных белковых молекул.

В данном опыте мы поставили задачу выяснения специфичности полученных нами моноклональных антител к иммуноглобулинам а и М свиньи и определения антигенных детерминант, реагирующих с моноклональными антителами.

Для этого мы применяли метод блотиммунодетекции моноклональными антителам иммуноглобулинов с и М после электрофореза. Для одновременного разделения и анализа нативной формы (мономер пентамер 1^), тяжелых и легких цепей

иммуноглобулинов был использован, так называемый "плюс-минус" вариант электрофореза в ПААГ с ДСН. После электрофоретического разделения белки переносили из пластины полиакриламидного геля на нитроцеллюлозные фильтры.

В двух параллельных гелях разделяли иммуноглобулины о и М и выявляли зоны белков в одном случае путем прямого окрашивания белков в геле серебром, а в другом - за счет взаимодействия с моноклональными антителами.

При сравнении электрофореграмм между собой выявлено следуидее. Каждый из исследуемых иммуноглобулинов в "плюс"-дорожке (после термоденатурации при 100°С в присутствии ДТТ или р-меркаптоэтанола) мигрирует как легкая и тяжелая цепи, а в "минус"-дорожке - как нативная молекула, представляя собой зону с замедленной электрофоретической подвижностью. Такие нативные молекулы иммуноглобулинов сохраняют свою конформацию и иммунореактивность. На иммунорепликах с идентичных гелей выявляются только зоны взаимодействия моноклональных антител со специфическими антигенными детерминантами. Полученные результаты представлены в таблице 4.

антителашх_методом_^луноблозтшгал

Назв. IgM Igo Тип

клона пента- |i,- L- моно- 7- I- антигенной

мер цепь цепь мер цепь цепь детерминанты

1С4 + _ _ конформационный

253(1 ) + - - - конформационный

2F3 (2) + - - - конформационный

А4(1 ) - - + + линейный

Р8(1 ) - + + линейный

РВ(З) - - 4- + линейный

1Е4 + - - - конформационный

2Н4 + - - - конформационный

Е12 + - + + биспецифические

антитела

Анализ полученных данных позволил сделать следующие вывода:

1. Антитела КЛОНОВ 1С4. 2F3(1). 2РЭ(2), 2Н4. 1Е4 взаимодействуют только с нативной молекулой iglí, что однозначно свидетельствует о конформационном характере эпитопов в молекуле иммуноглобулина м, распознаваемых этими моноклональными антителами. Эти эпитопы содержатся только в нативных, пентамерных. молекулах igM и необратимо разрушаются при денатурации иммуноглобулина.

2. Антитела клонов Л4(1), ?8(1), РО(3) взаимодействуют не только с нативной молекулой IgG, но и 7-цепями, что однозначно свидетельствует о линейном характере- эпитопов в молекуле иммуноглобулина G, распознаваемых этими моноклональными антителами. Эти эпитопы устойчивы к ДСН, мочоЕине, ДТТ, р-меркаптоэтанолу и нэ разрушаются при тэрмоденатуращш I, присутствии этих агентов.

3. Антитела клона Е12 являются по своей природе биспецифическими, поскольку одновременно реагируют с нативными молекулами иммуноглобулинов а и м , 7-цепями и таким образом распознают как конформационный эпитоп в молекуле igM, так и линейный- в молекуле IgG.

Определеще_вадсвой_специфэтности моноклональшх_антител.

Одной из основных задач данной работы было определение перекрестной реактивности полученных моноклональных антител к иммуноглобулинам различных видов животных и человека. Для этого, использовали метод ИФА в точках на нитронеллюлозшх фильтрах и реакцию диффузионной преципитации с использованием широкого набора иммуноглобулинов и сывороток различных видов животных и человека.

Для проведения точечного ИФА, препараты иммуноглобулинов различных видов животных, а также соответствующие контрольные образцы, наносили в виде точек на нитроцеллюлозные фильтры, затем фильтры инкубировали с моноклональными антителам! и конъюгатно -субстратной системой. В местах нанесения препаратов, содержащих антигенные детерминанты, специфичные исследуемым моноклоналышм антителам, появлялись окрашенные пятна.

Реакция диффузионной преципитации основана на способности

антител образовывать преципитат с антигеном. Эта способность является уникальной особенностью кавдого конкретного

моноклонального антитела. Это объясняется тем, что моноклоналыше антитела направлены к единственной антигенной детерминанте, которая может быть представлена на клетке или в белковой молекуле в небольшом числе повторов.

В результате проведенной работы мы установили, что антитела всех шести клонов гибридом обладают преципитирующей активностью в отношении иммуноглобулинов с или ы.

Из них, антитела четырех клонов давали линию преципитации только при добавлении полиэтиленгликоля в гель агарозы, антитела двух клонов 2РЭ (1) и 2РЗ(2) обладали преципитирующей активностью независимо от его присутствия.

Анализ полученных данных позволяет сделать следующие выводы:

-практически все исследованные клоны продуцируют видоспецифические моноклональные антитела, не дающие перекрестных реакций с иммуноглобулинами или сыворотками различных видов животных и человека. Следовательно, они могут быть использованы в различных системах для анализа только сывороток и иммуноглобулинов свиньи;

-антитела клона ,2РЗ(2) в реакции диффузионной преципитации перекрестно реагируют с очищенным свиньи и дают двойную полосу преципитации с нормальной свиной сывороткой. Этот результат интересен тем, что в твердофазном непрямом ИФА, ИФА в точках на нитроцеллюлозных фильтрах и иммуноблотинге такого перекреста не наблюдалось;

-преципитируюцие антитела могут быть использованы в простых серологических тестах для выявления и количественного определения иммуноглобулинов свиньи.

0тастка^оно1«ональшх_антател мето,да!т_ионодбменной^

В процессе работе мы отрабатывали два метода выделения иммуноглобулинов из асцитных жидкостей с применением трех сорбентов. Основными критериями для анализа и характеристики того шш иного метода являлись: чистота получаемых препаратов, сохранение биологической активности и высокий выход активных

антител. Предварительно определяли изотип мышиных антител, так как способы очистки различаются для антител разных классов.

Для г.онообменной хроматографии использовали колонку со слабым анионообменником DEAE-Toyo Pearl 650(S), для аффинной-колонки с Protein-A-Sepharose CL-4B и Вгсн-активированным Тоуо Pearl HW-65 с ковалентно связанным igG свиньи. Иммуноглобулины, высаленные из асцитных жидкостей, наносили по 15 мг на каждую колонку в стартовом буфере.

Фракции, полученные в процессе очистки и не содержащие примеси других белков, были сконцентрированы и заморожены при -20°С. Специфическую активность полученных препаратов проверяли методом непрямого твердофазного ИФА и в реакции диффузионной преципитации. Выход активных антител в процессе очистки определяли как соотношение их специфической активности (титр х объем) до и после очистки.

Полученные нами данные позволяют сделать следующие выводы: -применение ионообменной и аффинной хроматографии на указанных выше сорбентах позволяет получить электрофоретически гомогенные препараты моноклонэльных антител;

-ионообменная хроматография дает высокий выход электрофоретически чистых антител: IgG- 95% и ig!i- 100%, сохраняющих на 85-93% свою биологическую активность;

-аффинная хроматография является также эффективным средством получения гомогенных препаратов моноклонэльных антител, но дает менее высокий выход электрофоретически чистых IgG- 72-84%, с антигенсвязывающей активностью 45-49%. Потеря активности в этом случае, очевидно, связана с низким значением pH элюирувщего буфера, несмотря на то, что нейтрализация раствора проводилась сразу же после выхода белка из колонки.

в качестве иммунодиагностических реагентов

Одной из главных задач, стоящих перед наш, была апробация полученных моноклонэльных антител в качестве, иммунодиагностических реагентов для выявления и количественного определения иммуноглобулинов о- и м- классов в сыворотке крови свиней. Для этого, мы отрабатывали метод твердофазного "сэндвич"

ИФА и метод радиальной иммунодиффузии.

При отработке "сэндвич" ИФА мы основывались на том, что мскоклональные антитела разных клонов имеют сродство к различным антигенным детерминантам и не будут препятствовать связыванию друг друга с антигеном. Таким образом, сущность метода постановки реакции заключается в одновременном связывании антигена как с иммуноферментным конъюгатом, находящимся в жидкой фазе, так и с антителами, иммобилизированными на твердой фазе. При этом, специфическое связывание происходит по разным антигенным детерминантам, вследствие чего отсутствует конкуренция между конъюгатом и иммуносорбентом за общие центры связывания. Чувствительность метода ИФА, в данном случае, зависит от аффинности и специфичности моноклональных антител к иммуноглобулинам Сим. Поэтому, для детекции иммуноглобулинов мы испытывали все возможные комбинации моноклональных антител в системе иымуносорбент-конъюгат.

Концентрация сорбирующих антител была подобрана предварительным титрованием и составляла 10-20 мкг/мл. Для детекции использовали очищенные препараты иммуноглобулинов сим свиньи и нормальные свиные сыворотки. Начальная концентрация иммуноглобулинов оим составляла 10 мкг/мл, начальные разведения сывороток- 1:100. Пробы вносили в лунки и титровали с коэффициентом разведения 2. Специфические конъюгаты на основе моноклональных антител, брали е определенном ранее рабочем титре.

Результаты исследований показали, что наивысшая чувствительность по выявлению igM- антител достигалась для двух сочетаний: 2РЭ(1)- иммуносорбент, 1С4- конъюгат и 1С4-иммуносорбент, 2F3(1)- конъюгат. Из восьми комбинаций, наивысшая чувствительность по выявлению ige антител достигалась также для двух сочетаний: га(з)- иммуносорбент, А40)- конъюгат и Е12-иммуносорбент, А4(1)- конъюгат.

Минимальные концентрации иммуноглобулинов м и о, детектируемые в первых парах "сэндвич" ИФА, составляли 10 нг/мл, во вторых парах- 100 нг/мл.

Кроме "сэндвич" ИФА, для количественного определения уровня иммуноглобулинов в сыворотках крови свиней отрабатывали метод радиальной иммунодиффузии. Сущность метода заключается в том, что иммуноглобулины испытуемых проб рэдиально диффундируют в агар,

содержащий моноклональные антитела к исследуемому иммуноглобулину, образуя кольцо преципитации, диаметр которого прямо пропорционален концентрации иммуноглобулина.

Определение количества иммуноглобулинов проводили относительно стандартной сыворотки с известным содержанием (мг/мл) каждого класса иммуноглобулинов.

Наивысшая чувствительность метода для выявления и количественного определения да и т^ антител достигалась при добавлении в агар 20-40 мкг/мл антител клонов А4(1) и 2РЭ(1) -соотве тственно.

Как было отмечено ранее, метод радиальной иммунодиффузии применим только к преципитирующим моноклональным антителам, он более прост и удобен в постановке, чем ИФА, но по чувствительности и специфичности заметно ему уступает (примерно в 100 раз).

Таким образом,Еысокая чувствительность и специфичность твердофазного "сэндвич" ИФА позволяет определить нанограммовые количества иммуноглобулинов в сыворотках крови и биологических жидкостях организма свиньи с низким их содержанием, диагностировать иммунодефицитное состояние, определять характер иммунного ответа и иммунологический статус животного.

ВЫВО®

1. Отработаны оптимальные режимы выделения и очистки иммуноглобулинов сим свиньи с использованием комплекса методов практической иммунохимии.

2. Предложен эффективный способ иммунизации мышей линии ВАЬВ/с полученными антигенами, который заключается в двукратном введении антигенов в подушечки задних лапок и последующим извлечением периферических лимфоузлов, как источников иммунных лимфоцитов. Продолжительность иммунизации составляет всего 12 дней, начиная от первичного введения препарата до слияния клеток.

3. Разработана тест-система на основе непрямого твердофазного ИФА и РИД для тестирования гибридомпродуцирующих моноклональные антитела заданной специфичности.

4. Получены гибридные линии клеток, стабильно продуцирующие моноклональные антитела к иммуноглобулинам сим свиньи.

5. Методами непрямого твердофазного ИФА на полистероловых микропанелях и на' нитроцеллюлозных фильтрах, а также методами

иммуноОлотинга, иммуноолвктрофореза и РДП, определена аффинность, видовая и классовая специфичность полученных моноклональных антител.

6. Методом иммуноОлотинга определена локализация и характер антигенных детерминант, узнаваемых моноклональными антителами полученных клонов. Установлено,-что антитела клонов 1С4, 2F30). 2F3(2), 2Н4, 1Е4 взаимодействуют только с натквной молекулой igM, что однозначно свидетельствует о конформационном характере эпитопов в молекуле иммуноглобулина м, распознаваемых этими моноклональными антитэлами. Эти эпитопы содержатся только в нативных, пентамерных молекулах IgM и необратимо разрушаются при денатурации иммуноглобулина. Антитела клонов А4(1), F8(1), F8(3) взаимодействуют не только с нативной молекулой igG, но и 7-цепями, что однозначно свидетельствует о линейном характере эпитопов в молекуле иммуноглобулина о, распознаваемых этими моноклональными антителами. Эти эпитопы устойчивы к ДСН, мочевине, ДТТ, p-меркаптоэтанолу к не разрушаются при термоденатурации в присутствии этих агентов. Антитела клона Е12 являются по своей природе биспецифическими, поскольку одновременно реагируют с нативнши молекулами иммуноглобулинов с и ы , 7-цепями и таким образом распознают как конформационный эпитоп в молекуле IgM, так и линейный- в молекуле igo.

7. Определен изотип моноклональных антител. Полученные нами данные показали, что из 6 моноклональных антител, секретируемых гибридомами, полученными к иммуноглобулину класса М свиньи,три принадлежат к подклассу 72b иммуноглобулина G (lgG2b), два к подклассу 72a(IgG2a) и один - к подклассу 7I иммуноглобулина G(lgG1). Из 7 моноклональных антител, секретируемых гибридомами, полученными к иммуноглобулину класса G свиньи, два принадлежат к подклассу 72b иммуноглобулина G (lgG2b), четыре к подклассу 71 иммуноглобулина G (igo1), а одно относится к IgM- классу.

8.Получен набор из семи асцитных жидкостей, отработаны методы очистки антител из асцитной жидкости с помощью ионообменной и аффанной хроматографии. Установлено, что ионообменная хроматография дает высокий выход электрофоретически чистых антител: IgG- 95% и IgM- 100%, сохраняющих на 85-93% свою

биологическую активность. Аффинная хроматография является также эффективным средством получения гомогенных препаратов

моноклональных антител, но дает менее высокий выход электрофоретичеаси чистых 72-84%, с антигенсвязывающей

активностью 45-49%.

9. На основе моноклональных антител синтезированы иммунопероксидазные конъюгаты, определены клоны, антитела которых имеют высокую аффинность и наиболее пригодны для иммуноферментной тест-системы и тест-системы на основе РИД, по выявлению 120-антител в сыворотках крови и других биологических жидкостях организма свиньи.

10. Антитела полученных клонов использованы для отработки тест-систем на основе ИФА и РИД по выявлению и количественной характеристике иммуноглобулинов о- и м- классов. При этом, минимальные концентрации 1еМ и 1§а, детектируемые в иммуноферментном "сэндвич" методе, составляют 10 нг/мл.

Высокая специфичность и чувствительность этого метода позволяет определять нанограммовые количества иммуноглобулинов в биологических жидкостях с низким их содержанием, диагностировать иммунодефицитное состояние организма животных и выявлять антитела определенных классов к различным антигенам.

Сшсок^аботг_опублжованных Цо_теме_дассертации

1.Верховский O.A. Моноклональные антитела в ветеринарии.// Труды ин- та/ Всесоюз. н.-и. ин-т эксперимент. вет. им.Я.Р. Коваленко. Вып.67, Иммунитет сельскохозяйственных животных., 1989, 11-21.

2.Верховский O.A. Иммупоферментный метод тестирования гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к igM свиньи // Бюлл.ВИЭВ. Вып.69, 1989, 3-6.

3.Федоров Ю.Н., Верхсвский O.k., Феоктистова Т.А. Моноклональные антитела - новый путь в иммунодиагностике и иммунопрофилактике инфекционных болезней жиеотных. // Сельскохозяйственная биология, 1990, 2, 22- 38.

4.Федоров Ю.Н., Феоктистова Т.А., Верховский O.A. Моноклональные антитела в ветеринарной иммунологии. // Тезисы научной конференции "Проблемы научного обеспечения животноводства

Молдавии". Кишинев, 25 мая 1990 г.,с.134.

Подписано к печати 9.07.91 г. формат 60x84/16 объем 1,0 п.л. тираж НО ззказ 698

Типография ГОСНИИ