Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биотехнология получения и применение противовирсных моноклональных иммуноглобулиновых препаратов

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Биотехнология получения и применение противовирсных моноклональных иммуноглобулиновых препаратов"

На правах рукописи УДК 573.6:619:576.8.097:615.281

ГЛОБЕНКО Людмила Алексеевна

БИОТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ ПРОТИВОВИРУСНЫХ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВЫХ ПРЕПАРАТОВ

03.00.06 -"Вирусология"

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Владимир-1998

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных (ВНИИЗЖ) МСХиП Российской Федерации

Официальные оппоненты:

Дымин Михаил Арвидович - доктор биологических наук, профессор

(ВНИИВВиМ, г.Покров); Орлянкин Борис Григорьевич - доктор ветеринарных наук, профессор

(ВИЭВ, г.Москва); Макаров Владимир Владимирович - доктор биологических наук,

профессор (Российский университет дружбы народов, г.Москва)

Ведущая организация:

Московская Академия ветеринарной медицины и биотехнологии им.К.Скрябина (МВА, г.Москва)

часов на заседании диссертационного совета Д 120.60.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных МСХиП по адресу: 600900, г.Владимир, пос.Юрьевец, ВНИИЗЖ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИЗЖ.

Защита диссертации состоится (Л-И>Н$

Автореферат разослан ¿Л 1998

года.

Ученый секретарь

диссертационного совета - Ю.А.Черняев

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Традиционная биотехнология изготовления иммунных сывороток, иммуноглобулинов сводится к гипериммунизации животных-продуцентов (лошадей, баранов, кроликов и т.д.) соответствующими специфическими антигенами, получению от животных антителосодержащих сывороток и выделению из них специфических иммуноглобулинов.

Значительные успехи биотехнологии за последние 15-20 лет были достигнуты благодаря созданному в 1975 г. Келлером и Мильштейном методу получения гибридом, продуцирующих моноклональные антитела. С его помощью получены моно-клональные антитела ко многим возбудителям вирусной природы.

Эти антитела нашли применение в создании диагностических препаратов, в технологии получения чистых антигенов и белков с помощью иммуносорбентов. а также при исследовании антигенных детерминант, расположенных на поверхности и внутри вирусной частицы. Решение указанной проблемы может быть достигнуто с использованием новых методов, которые основаны на достижениях молекулярной биологии, генной и клеточной инженерии, биоорганической химии, иммунологии.

Принципиально важной отличительной стороной указанных методов является то, что они основаны на использовании высокоспецифических моноклональных антител, а с их помощью осуществляется изучение особенностей структуры генома, физико-химических свойств компонентов вириона. Наиболее перспективным моле-кулярно-биологическим методом идентификации штаммов, фрагментов вириона является иммуноферментный анализ с использованием моноклональных антител.

Биотехнология моноклональных антител включает в себя технологическую и методическую цепочку, начиная от получения антигенов, затем моноклональных антител до создания на их основе методов идентификации антигенных сайтов на товерхности вирионов и диагностики заболеваний вирусной этиологии.

При диагностике инфекционных заболеваний оптимальным является применение моноклональных антител - специфического компонента иммуноферментного анализа. При этом обосновано применение моноклональных антител при диагности-се таких заболеваний как ящур и другие болезни с везикулярным синдромом, бо-пезнь Ауески, репродуктивно-респираторный синдром свиней, которые имеют либо широкое распространение, либо имеются затруднения при диагностике заболевания или характеристике возбудителя. В литературе представлены данные по изуче-

нию моноклональных антител, полученных к возбудителям болезней наиболее часто встречающихся в различных странах. Однако исследований по получении: моноклональных антител к возбудителям вирусных болезней, которые возникли е СССР и в России, и по разработке диагностических методов с использованием эти> антител в нашей стране до восьмидесятых годов не проводились. Хотя эта проблема быль и остается актуальной для создания специфических и точных методов диагностики заболеваний и дифференциации штаммов вирусов, выделенных на территории СССР и России.

Представляют наибольший интерес моноклональные антитела, полученные на антигены вирусов, выделенных ранее и используемых в настоящее время в качестве производственных и применяемых при изготовлении вакцин и диагностику-мов. Работа в этом направлении не проводилась. Хотя известно, что в процессе пассажей при культивировании вирусов могут происходить изменения свойств вирусов, а поэтому необходимо постоянно следить за изменениями антигенной структуры вирионов, что возможно при применении моноклональных антител, полученных на цельные вирионы и их фрагменты. Кроме того, несмотря на имеющиеся публикации, которые касаются гибридомной биотехнологии получения иммуноглобулино-вых препаратов , они часто носят противоречивый харктер, так как результаты получены при использовании различных методик и других штаммов вирусов.

Перечисленные обстоятельства показывают, что исследования по получению моноклональных антител к вирусам, выделенным на территории России, разработке методов диагностики с использованием МАТ и использование МАТ в молекулярно-биологических исследованиях являются актуальными задачами как в научно-исследовательском, так и в практическом отношении.

Цели и задачи исследований. Основной целью данной работы явилась разработка биотехнологии получения моноклональных антител к возбудителям болезней вирусной этиологии (ящур, другие везикулярные заболевания, болезнь Ауе-ски, репродуктивно-респираторный синдром свиней), выделенных на территории Российской Федерации для разработки и усовершенствования средств диагностики и дифференциации возбудителей, а также для эпитопного картирования вирусных геномов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

-разработать и подобрать наиболее эффективные методы получения очищенных и концентрированных антигенов вирусов и их фрагментов, относящихся к разным таксономическим группам, пригодных для получения моноклональных антител;

-получить гибридомы-продуценты моноклональных антител и отобрать наиболее перспективные для использования в биотехнологии;

-получить моноклональные антитела к возбудителям ящура и его фрагментам, а также других везикулярных болезней (ВБС, ВЭС), болезни Ауески и репро-дуктивно-респираторного синдрома свиней;

-разработать наиболее технологичные методы выделения специфических иммуноглобулинов и подготовить на их основе гомогенные по биологическим и физико-химическим свойствам препараты;

-изучить биологические свойства полученных моноклональных антител в различных иммунохимических реакциях с гомо- и гетерологичными антигенами, их фрагментами и синтетическими пептидами;

-провести идентификацию антигенных сайтов на поверхности вирусных частиц с использованием моноклональных антител и различных вариантов иммуно-ферментного анализа;

-провести оценку пригодности препаратов моноклональных антител для диагностики некоторых вирусных заболеваний;

-подготовить коллекции моноклональных антител для использования в дифференциальной диагностике болезней вирусной этиологии;

-сконструировать и испытать диагностические наборы на основе моноклональных антител для обнаружения вируса ящура и противоящурных антител в ИФА;

Научная новизна. В результате проведенных исследований впервые, -разработаны эффективные методы получения очищенных и концентриро ванных антигенов вирусов для получения и характеристики моноклональных ан тител;

-получены гибридомы-продуценты моноклональных антител и отобраны наи более перспективные для использования в биотехнологии;

- получены моноклональные антитела к возбудителям ящура и его фрагмен там (123 субъединицам и синтетическим пептидам), а также других везикулярны; болезней (ВВС, ВЭС), болезни Ауески и репродуктивно-респираторного синдромг свиней;

-изучены биологические свойства полученных моноклональных антител е различных реакциях с гомо- и гетерологичными антигенами, их фрагментами и син тетическими пептидами;

-осуществлена идентификация антигенных сайтов на поверхности вирусны> частиц с использованием полученных моноклональных антител и различных вариантов иммуноферментного анализа;

-показана возможность использования моноклональных антител для диагностики ящура и других везикулярных болезней (ВВС, ВЭС), болезни Ауески и репродуктивно-респираторного синдрома свиней;

Новизна научных исследований подтверждена 5 авторскими свидетельствами. 2 патентами и 1 положительным решением ВНИИГПЭ на выдачу патента Российской Федерации.

Практическое значение работы. На основании проведенных исследований разработан комплект методических и нормативно-технических документов, регламентирующих основные этапы гибридомной биотехнологии получения и применения моноклональных антител к производственным штаммам вируса ящура, которые утверждены ГУВ МСХ СССР и директором ВНИИЗЖ (ВНИЯИ). Создана коллекция штаммов гибридом, секретирующих моноклональные антитела к вирусам ящура А5, Агг. О,, С,, Азия-1, САТ-1, ВВС, ВЭС, вируса болезни Ауески и репродуктивно-респираторного синдрома свиней.

Отобраны наиболее перспективные клоны-продуценты моноклональных антител с высокой стабильностью и антителопродуцирующей акгивностью. на которые

составлены паспорта и проведено их депонирование во Всероссийской коллекции клеточных культур Института цитологии РАН, г.Санкт-Петербург.

Получены жидкие и лиофилизированные препараты моноклональных антител и их конъюгаты с пероксидазой хрена, пригодные для определения вирусов и противовирусных антител в сыворотке крови сельскохозяйственных животных, а также для изучения антигенной структуры возбудителей и анализа генно-инженерных продуктов и синтетических пептидов.

Создана коллекция моноклональных антител для использования в дифференциальной диагностике болезней с вирусной этиологией.

Сконструированы, изготовлены и испытаны диагностические наборы на основе поли- и моноклональных антител для обнаружения вирусов ящура и проти-воящурных антител в ИФА.

Ряд предложенных нами методических разработок применяется во ВНИИЗЖ и могут быть использованы другими учреждениями, занимающимися производством средств диагностики и профилактики ящура и других болезней сельскохозяйственных животных при выявлении возбудителей, дифференциации штаммов и их контроле при производстве вакцин.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработка методов получения инактивированных, очищенных и концентрированных антигенов вирусов и их фрагментов, относящихся к различным таксономическим группам (семейства: Р1согпаутс1ае, СаПсмпс!ае, НегреэуИс^ае, ТодауИс1ае).

2. Разработка методов получения специфических, гомогенных, очищенных, концентрированных и конъюгированных препаратов моноклональных антител к вирусным антигенам и их фрагментам для выявления и идентификации типовой и подтиповой принадлежности штаммов, возбудителей болезней, протекающих с везикулярным синдромом и некоторых других болезней вирусной этиологии.

3. Характеристика коллекции моноклональных антител к производственным штаммам вирусов ящура (А5, А22, О,, С, №564, Азия-1 №48, САТ-1 №96) и болезни Ауески (УНИИЭВ-18В).

4. Схема идентификации антигенных сайтов на поверхности частиц вируса ящура с использованием моноклональных антител в различных вариантах иммуно-ферментного анализа и реакции нейтрализации.

5. Технология изготовления безопасных в ветеринарно-санитарном отношении антительных и антигенных препаратов для выявления возбудителей и для осуществления ретроспективной диагностики вышеуказанных болезней с помощью моноклональных антител.

Апробация результатов исследований. Основные положения диссертационной работы на разных этапах ее выполнения рассматривались на заседаниях ученого соЕета ВНИЯИ, ВНИИЗЖ, ВНИИВВиМ, на заседаниях научно-технических советов ГУВ МСХ СССР и ГУНИ и ЭПУ МСХ СССР, на координационных совещаниях исполнителей НИР по проблеме ящура стран-членов СЭВ, Международных , Всесоюзных, Всероссийских и межинститутских научных конференциях.

Разработанные методы и средства проходили межинститутские, межведомственные и межлабораторные комиссионные проверки. Диагностические наборы на основе МАТ экспонировались на ВДНХ в 1989г. и удостоены серебряной медали.

Публикации результатов исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано 61 печатная работа в материалах международных конференций, рабочих совещаний специалистов стран-членов СЭВ, материалах Всесоюзных и Всероссийских конференций по проблемам ветеринарной вирусологии, иммунологии, биотехнологии, генной и клеточной инженерии и эпизоотологии , в том числе получено 5 авторских свидетельств, 2 патента и 1 положительное решение ВНИИГПЭ на выдачу патента Российской Федерации.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страни-

цах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список использованной литературы, который включает 8 £ работ на русском языке и ХЛ 7" работ иностранных авторов. Диссертация иллюстрирована 84 таблицами и 53 рисунками.

В приложении представлены документы, подтверждающие результаты отдельных этапов работы, их научную и практическую ценность.

Исследования по диссертационной работе выполнены в 1984-1997гг. во ВНИЯИ) ВНИИЗЖ в соответствии с утвержденными плановыми заданиями. В вы-юлнении отдельных разделов работы принимали участие сотрудники Института ;имической и биологической физики АН Эстонии: д.б.н. М.Ю. Саарма, к.б.н. Г.Э.Неуман, ВНИИЗЖ - к.б.н. Н.Л.Давыдова, к.б.н. С.Р.Кирюхин. к.б.н. С.П.Аминева, :.б.н. А.И.Молчанова, д.в.н. Ж.А.Шажко, д.в.н. В.А.Мищенко, к.в.н. Н.Е.Камалова, :.б.н. А.С.Красоткина, м.н.с. В.Ю.Фоменко, биологи -Т.В.Жбанова, Л.У.Маматкулова, 1а что приношу им свою благодарность.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы

Антигены вирусов. Для получения монокпональных антител и скрининга юзитивных гибридных клонов использовали антигены:

-1468 антиген вируса ящура А5 Алье, А22 N2550, О, №1618, О, №194, С, №564, Азия-1 №48, САТ-1 №96;

-128 компонент вируса ящура А22№550;

-синтетические пептиды - фрагменты вирусного белка \/Р1 вируса ящура А22 №550 с последовательностью аминокислот 145-155, конъюгированные с гемоциа-1Ином улитки (К1_Н) и 141-160 - с овальбумином (ОУА);

-150-1608 антиген вирусов везикулярной болезни свиней (ВВС, типы 0-75 и "-75 ) и везикулярной экзантемы свиней (ВЭС, типы А-48 и С-72);

-антиген вируса болезни Ауески, штамм УНИИЭВ-18В;

-антиген вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС) 13олят №9-182/93 "Курский", выделенный от свиней в Курской области д.в.н. ¡.А.Мищенко.

Характеристика монокпональных антител. В опытах по характеристике юлученных монокпональных антител в различных иммунохимических реакциях ис-юльзовали 146Э антигены вируса ящура подтипов: А7, А10, А12, А24, А27, ),Кауфбойрен, 02, 03, 05, 06, О10, О,, , С2, С, №65/67, С,-ТЛ112, Азия-1 №48, 674, '46, 938, 1179, 1214, 1395, САТ-1 №389, 155, ВУ, ЭУУА, ЭК БА. Штаммы вируса |щура, ВВС и ВЭС любезно предоставлены из музея вирусов д.в.н. Ж.А.Шажко, .в.н. Н.С.Масловой и к.в.н. С.Р.Кременчугской.

s

Эпитопное картирование антигенов. В работе по эпитопному картировг нию антигенов использовали синтетические пептиды, соответствующие аминокис потным последовательностям белка VP1 вируса ящура А22, штамм N2550: 10-25, 5С 70, 50-70 KLH (пептид конъюгированный с белковым носителем - гемоцианино! улитки, KLH), 90-98, 90-98 KLH, 136-152, 136-159, 142-151, 142-155, 136-155, (14£ 151)п (полимер, мономером которого являются аминокислотные остатки облает 145-151), 175-189, 197-213, 197-213 KLH, 141-160 OVA (в качестве белкового нос* теля использовали овальбумин), 145-155 BSA (конъюгат с бычьим сывороточньн альбумином);

Синтетический пептид ВЯ О,, штамм Кауфбойрен: последовательность амк нокислот 136-152;

Синтетические пептиды ВЯ Азия-1 №48: последовательность аминокисло 140-153, 136-153, 132-153, 137-157, 193-208"

Характеристика монокпональных антител к вирусу болезни AyecKi В исследованиях по характеристике полученных монокпональных антител к вир^ су болезни Ауески, штамм УНИИЭВ-18В были использованы следующие штаммы изоляты вируса болезни Ауески:

-Арский - полевой изолят, выделенный от свиней в 1967г. в Татарстане, пс лучен от д.в.н. Г.Х.Камалова (ВНИВИ, г.Казань);

-Мараштанский, БРАН, БУК и Женевский получены от д.в.н. Г.Х.Камалова;

-Туркменский - полевой изолят, выделенный в 1992г. от верблюдов в Туркм£ нистане д.в.н. В.А.Мищенко;

-УНИИЭВ-18В - вирус , выделенный от свиней в 1962г. в Харьковской облает! получен из УНИИЭВ, г.Харьков;

-МК-25 - полевой изолят, выделен в Болгарии в 1983г.

** Химический синтез пептидов был осуществлен сотрудниками лаборатории генетик ВНИЯИ (ВНИИЗЖ) АН.Петровым, А.В.Павловым и А.В.Луговским (завлаб. С.С.Рыбаков) сотрудниками лаборатории химии пептидов Института биоорганической хими им.М.И.Шемякина АН СССР, (завлаб. О.М.Вопьлина ).

Штаммы вируса РРСС, используемые для характеристики полученных моноклональных антител:

-111/92 "Датский" любезно предоставлен доктором А.Ботнер (Дания, Линдхольм, Государственный институт ветеринарной вирусологии);

-"Лелистад" - получен из Центральной ветеринарной лаборатории (Англия, Вейбридж).

Миеломные клетки. При разработке гибридомной технологии использовали следующие миеломные клеточные линии:

-РА1, полученные из Института химической и биологической физики АН Эстонии (Таллинн);

-N50/1, полученные из Института вирусологии им.Д.Ф.Ивановского АМН СССР; (г.Москва);

-РЗ-ХбЗ Ад 8 х 653 из Института вирусных болезней с.-х. животных, (Великобритания);

-Эр2/0, полученные из ВНИИВВиМ (г.Покров). Все они являются производными линии РЗК, полученной из миеломы мышей ВА!_В/с МОРС-21. Клетки не способны синтезировать собственные иммуноглобулины.

Миеломные клетки культивировали на среде ДМЕМ или ИРМ1 - 1640 с добав-пением 10% эмбриональной сыворотки коров. Плотность насыщения для этих клеток 1,0 -1,5 х 106 клеток на 1 мл. Цикл размножения 16 часов.

Миеломные клетки поддерживали на стеклянных или пластиковых (50 мл) иатрасах при 37°С. Пересев проводили три раза в неделю с частичной заменой <ультуральной среды на свежую.

Процедуру подготовки клеток для гибридизации проводили следующим обра-юм. Клетки после энергичного встряхивания переносили из культуральных сосудов з центрифужные пробирки и центрифугировали 7-10 мин при 700д. Осадок ресус-1ендировали в 5 мл среды без сыворотки и подсчитывали концентрацию клеток.

Для гибридизации использовали 10-12 х 106 клеток. Для закладки на хранение миеломные клетки использовали в логарифмической фазе роста.

Животные. Для получения иммунных спленоцитов и асцитической жид-;ости, содержащей моноклональные антитела, использовали инбредных мышей 1инии ВАЬВ/с обоего пола с массой тела 18-25г., полученных из питомников

"Центральный", "Столбовая", "Светлые горы" АМН (Московская область) и ВОНЦ АМН (г.Москва).

Растворы и реактивы для гибридомных и миеломных клеток. Все растворы и среды готовили на деионизированной воде. Для выращивания миеломных и гибридомных клеток использовали среду DMEM и RPMI-1640, приготовленные из сухого препарата фирмы "Flow Lab." (США) с добавлением 10-20% сыворотки эмбрионов коров фирмы "Flow Lab.", "Sigma", а также сыворотки отечественного производства, полученные из ИЭМ им.Гамалеи (г.Москва) и из Среднеазиатского филиала ВНИЯИ (г.Душанбе). Полную ростовую среду хранили при +4°С не более 6 недель. Непосредственно перед использованием в среду добавляли гентамицин в концентрации 80 мкг/мл.

Для селекции гибридомных клеток после гибридизации при поддержании и клонировании гибридомных культур применяли селективную среду, содержащую гипоксантик-аминоптерин-тимидин (ГАТ) в концентрации: гипоксантина -104М, ами-ноптерина 4 х 10'7М, тимидина - 1,6 х 10"5М. Для этого к полной ростовой среде DMEM или RPMI-1640 добавляли 50-кратный концентрат ГАТ фирмы "Flow Lab.". Для ее приготовления к 500 мл полной ростовой среды добавляли 5мл 50-кратного концентрата ГАТ.

Лизис эритроцитов, присутствующих в суспензии спленоцитов и в асцити-ческой жидкости, проводили , применяя 0,83% водной раствор хлорида аммония. Раствор стерилизовали автоклавированием в течение 30 минут при 0,5 атм. и хранили при +4°С.

Для гибридизации клеток готовили 50% раствор ПЭГ с м.м. 4000 фирмы "Serva" или "Merck". 0,5 г. ПЭГа помещали в коническую пробирку и стерилизовали кипячением в течение 30 минут на водяной бане либо автоклавированием при 120°С и 1 атм. Затем , охладив расплавленный ПЭГ при 45-50°С добавляли к нему 0,5 мл среды DMEM без сыворотки и одну каплю диметилсульфоксида. Нейтральную среду полученного раствора создавали путем добавления 1-2 капель (-100 мкп) 7,5%-ного раствора бикарбоната натрия.

Для иммунизации мышей и индукции асцитов применяли полный адъювант Фрейнда фирмы "Calbiochem", фирмы "Sigma" или ангарское масло (ТУ-38-101-884-84) в смеси с парфюмерным или вазелиновым маслами в соотношении 2:1.

При замораживании миеломных или гибридомных клеток в качестве криофи-лактиков использовали ДМСО или этиленгликоль фирмы "Serva" в концентрации 510%.

Растворы и реактивы для других исследований. При выполнении работ по концентрированию и очистке иммуноглобулинов использовали следующие растворы : насыщенный раствор сульфата аммония (761 г/л); 20% раствор ПЭГ с м.м.6000; фосфатно-буферный раствор, рН 7,6; 2М раствор NaCI; ЗМ раствор NaCI; раствор А: 20мМ-Трис HCI, рН 8,5; раствор В: 20 мМ Трис-HCI, рН 7,0 с 0,ЗМ NaCI.

Ингредиенты для электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) применяли в соответствии с прописью по Laemmli (1970).

Конъюгацию иммуноглобулинов с пероксидазой хрена проводили с использованием следующих растворов: раствор NaJO (51 мг/мл), раствор этиленгликоля (36 мкл/мл); 0,2 М карбонатный буфер, 100-кратный концентрат раствора боргидрида натрия (18 мг/мл), раствор мертиолята (0,1 г/л) готовили непосредственно перед применением.

При постановке ИФА сорбцию антигена или антител на пластик проводили в Трис-буферном растворе , рН 7,1, содержащем 0,05 М Трис и 0,2 М NaCI. Рабочие разведения антител и конъюгатов готовили на блокирующем растворе , содержащем 10% эмбриональной сыворотки коров и 0,05% Твина-20.

Наличие иммунного комплекса выявляли при добавлении субстратного раствора 0,04% раствора ортофенилендиамина фирмы "Merck" в 1М цитратном буфере (0,357 г цитрата натрия в 1 мл), рН 5,0 с 0,05% перекиси водорода.

Субстратный раствор готовили непосредственно перед внесением в лунки.

Для получения диагностических препаратов МАТ использовали пероксидазу хрена (производства Олайнского НПО "Биохимреактив", метаперийодат и боргид-рид натрия (фирма "Merck").

При анализе активности МАТ применяли кроличий антимышиный иммуноглобулин, конъюгированный с пероксидазой хрена (конъюгат), производства Института эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи (г.Москва). Рабочее разведение конъюгата готовили на блокирующем растворе в соответствии с инструкцией по применению. Разведение конъюгата проводили непосредственно перед применением.

2.2. Методы

Концентрирование и очистка вируса ящура. 10% суспензию лапинизи-рованного вируса, приготовленного на 0,02М фосфатном буферном растворе (рН 7,75) очищали от клеточных белков хлороформом (30% по объему) и центрифугированием при 17 000д в течение 20 мин в центрифуге Весктап и2-21.

Суспензию культурального вируссодержащего материала освобождали от клеточного детрита низкоскоростным центрифугированием при 2 000д в течение 10 мин. Вирус осаждали 10% полиэтиленгликолем (ПЭГ) с молекулярной массой 6 000 в течение 16-18 часов при 4°С. Перед внесением ПЭГ в вируссодержащую суспензию добавляли ЫаС1 до конечной концентрации 0,2М и оставляли на ночь при 4°С. Осадок собирали центрифугированием при 17 000д в течение 20 минут, ресус-пендировали в 0,02 М фосфатно-буферном растворе, рН 7,5 (до 1/100 исходного объема) и очищали хлороформом.

К надосадочной жидкости добавляли 6% ПЭГ и оставляли на 1 час при 4°С.

Осадок собирали центрифугированием при 17 000 д в течение 20 минут и ресуспендировали в буферном растворе БТЕ (0,02 М Трис-НС1, рН 7,5; 0,15 М №С1; 0,001 М ЕДТА) до 1/1000 исходного объема. Полученный таким образом вирус очищали высокоскоростным центрифугированием в градиенте хлористого цезия-сахарозы с плотностью 1,5 и 1,04 г/см3 соответственно в центрифуге Боп/аП при 70 000 д в течение 6 часов при 10°С.

Фракционирование градиента проводили с помощью проточного спектрофотометра 1Мсогс1 (1-КВ) при длине волны 280 нм. Фракции, соответствующие пикам оптической плотности, объединяли и диализовали против БТЕ- буферного раствора (рН 7,5) при 4°С для освобождения от хлористого цезия.

Чистоту и гомогенность вирусных препаратов контролировали под электронным микроскопом иЕМ-ЮОВ и методом электрофореза в ПААГ. Количество полученного вируса расчитывали с помощью спектрофотометрического метода.

Однако основной объем работ по получению МАТ был проведен с инактиви-рованными препаратами ВЯ. В качестве инактиванта использовали 18% водный раствор р-аминоэтилэтиленимина в течение 24-х часов при температуре 26-27°С и рН 7,4.

Титрование вирусной суспензии до инактивации и последующую проверку на инфекционность проводили на культуре свиной почки, выращенной в монослое.

Все полученные антигены имели концентрацию вирусспецифического белка 100-800 мкг/мл, были активны в ИФА и РН и обладали высокой иммуногенной активностью. Титр антител в сыворотке крови иммунизированных мышей линии ВА1_В/с составлял в ИФА и РН не менее 1:1000 и 1:16 соответственно.

12Э антиген ВЯ получали из 1463 компонента вируса кислотным гидролизом. К суспензии 146Э компонента добавляли 10% 1М соляной кислоты, инкубировали 15 минут при комнатной температуре нейтрализовали добавлением 10% 1М раствора Трис (расчет по объему). Концентрация вирусспецифического белка составляла 100-300 мкг/мл. 123 антигены были активны в ИФА, обладали иммуногенной активностью. После введения 12Э антигена титр антител в сыворотке крови иммунизированных мышей составлял не менее 1:1000.

Концентрирование и очистка вирусов ВВС и ВЭС. Вирус везикулярной болезни свиней (типы Т-75 и 0-72) выращивали на перевиваемой культуре клеток 1ВЯЗ-2. Инактивацию вируса проводили с помощью (3-аминоэтилэтиленимина в концентрации 0,05% (по объему) в течение 24 часов при температуре 20°С.

Вирус везикулярной экзантемы свиней (типы А-48 и С-72) выращивали на перевиваемой культуре клеток ПСГК-30.

Инактивацию вируса проводили 0,05% метаоксиметилморфолином в течение 48 часов при 37°С.

Суспензию культурального вируссодержащего материала освобождали от клеточного детрита низкоскоростным центрифугированием при 2000 д в течение 10 минут. Очищенные и концентрированные антигены ВВС и ВЭС получали двухкратным осаждением ПЭГ с последующим центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия - сахарозы в течение 6 часов при 98 000 д в бакет-роторе АН-627 (6x36 мл) центрифуги ОТД-65В.

Для этого в очищенную от детрита суспензию добавляли 10% ПЭГ с молекулярной массой 6000. Перед внесением ПЭГ в вирусную суспензию добавляли ЫаС1 до конечной концентрации его 0,15-0,2 М. Для формирования осадка материал оставляли на 1-2 часа при температуре 4°С. Преципитат осаждали центрифугированием при 4000д в течение 30 минут. Осадок растворяли в 1/10 (от первоначаль-

ного объема) 0,02 М растворе фосфатного буфера , рН 7,5-7,6. Полученную суспензию очищали 15% хлороформом и после центрифугирования при 4000 д в течение 30 минут вирус повторно концентрировали 10% (по объему) ПЭГ 6000. Суспензию оставляли на 1-2 часа для формирования осадка, полученный осадок собирали центрифугированием в течение 30 минут при 8000 д, ресуспендировали в 1/10 (от предыдущего объема) 0,02 М фосфатном буфере, рН 7,5-7,6 и вновь очищали хлороформом. В результате достигалась кратность концентрирования в 100 раз. Полученный таким образом вирус очищали высокоскоростным центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия-сахарозы с плотностью 1,37-1,04 г/см3 соответственно в центрифуге ОТД-65В при 98000д в течение 6 часов.

Фракционирование градиента проводили с помощью перистальтического насоса "МЫрЫэ-г", проточного спектрофотометра 1Мсогс1 (1-КВ) при длине волны 254 нм.

Фракции, соответствующие пикам оптической плотности, объединяли и диа-лизовали от сахарозы и хлористого цезия против 100 объемов фосфатного буфера в течение 12-18 часов. Эффективность диализа контролировали с помощью рефрактометра.

Материал считали максимально освобожденным от сахарозы и хлористого цнзия при коэффициенте преломления п=1,334.

Чистоту и гомогенность вирусных препаратов контролировали под электронным микроскопом и методом электрофореза в ПААГ. Количество полученного вируса рассчитывали с помощью спектрофотометрического метода. Иммунобиологические свойства полученных вирусных концентратов изучали в ИФА и при иммунизации мышей ВА1.В/С, используемых при получении гибридом-продуцентов монокло-нальных антител к вирусам ВВС и ВЭС. Иммунизация мышей ВА1.В/С (при концентрации антигенов ВВС и ВЭС 40 мкг/мышь) приводила к выработке антител в титре 1:1000-1:10 000 через 21 день.

Концентрация вирусспецифического белка в концентрированных препаратах составляла 100-1400 мкг/мл.

Концентрирование и очистка вируса болезни Ауески .Вирус болезни Ауески выращивали на перевиваемой культуре клеток ВНК-21. Инактивацию вируса проводили с помощью димера р-аминоэтилэтиленимина в концентрации 0,05-

0,15%. рН 7,6-7,8 в течение 20 часов при температуре 26°С. При необходимости рН вируссодержащей суспензии доводили 5М раствором аммиака до 7,6-7,8.

Суспензию культурального вируссодержащего материала освобождали от клеточного детрита низкоскоростным центрифугированием при 2000 g в течение 10 минут. Вирус осаждали 10% ПЭГ-115 в течение 16-18 часов при 4°С. При концентрировании в вируссодержащую суспензию вносили 3% NaCI, а затем ПЭГ-115 до конечной концентрации 10%, рН 7,2-7,4. Осадок собирали центрифугированием при 10°С и 3500 g в течение 30 минут и ресуспендировали в растворе Хенкса, рН 7,2-7,4 в объеме в 100 раз меньше исходного. Полученный таким способом вирус выделяли в градиенте хлористого цезия - сахарозы плотностью 1,3-1,16 г/см3 соответственно в течение 6 часов при 98 000 g в бакет-роторе АН-627 (6 х 36 мл) центрифуги ОТД-65В. Фракционирование градиента проводили с помощью проточного спектрофотометра Uvicord (LKB) при длине волны 280 нм. Фракции, соответствующие пикам оптической плотности, объединяли и диализовали от сахарозы и хлористого цезия против 100 объемов фосфатного буфера в течение 12-18 часов.

Чистоту и гомогенность вирусных препаратов контролировали под электо-ронным микроскопом и методом электрофореза в ПААГ. Количество полученного вируса расчитывали с помощью спектрофотометрического метода. Иммунобиологические свойства полученных вирусных концентратов изучали в ИФА и при иммунизации мышей BALB/c. Титр антител у иммунизированных животных составляли не менее чем 1:1000 .

Концентрирование и очистка вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС). Вирус РРСС выращивали в течение 3-5 дней в альвеолярных легочных макрофагах (АМФ) поросят 1-6 недельного возраста по разработанной нами методике (Л.А.Глобенко и соавт. 1994г.). Закрепленные на поверхности пластиковых матрасов АМФ инфицировали вирусом РРСС. После 72-144 часовой инкубации инфицированные клетки промораживали при -70сС, суспензию инфицированных вирусом макрофагов центрифугировали при 2000 g в течение 30 минут.

Надосадочную жидкость (супернатант) собирали в стерильную емкость. Клетки ресуспендировали в 1/50 от исходного объема 0,025-0,05 М Трис-HCI буфера с 0,025 ЭДТА-Na и 0,001 М ФМСФ (фенилметилсульфонилфлуорид). Из клеток

вирус извлекали 3-кратной гомогенизацией в гомогенизаторе Поттера или измельчителе тканей в течение 3-5 минут в половинном или таком же объеме вышеуказанного буфера. Частицы клеток после каждой гомогенизации отделяли центрифугированием при 6000 g в течение 20 минут, супернатанты объединяли, вирус осаждали центрифугированием при 11200 g в течение 90 минут через слой 20% раствора сахарозы. Объем подслаиваемого раствора сахарозы составлял 10% от объема центрифугируемой суспензии антигена. Осадок антигена ресуспендировали в 1/10 первоначального объема в STE буфера. Агрегированный материал отделяли центрифугированием при 6000 g в течение 10 минут и повторно центрифугировали при том же режиме. Образовавшиеся осадки ресуспендировали в 1/5 или 1/100 исходного объема в Трис-HCI или STE буфере , рН 7,4-7,6.

Чистоту и гомогенность вирусных препаратов контролировали под электронным микроскопом и методом электрофореза в ПААГ.

Иммунобиологические свойства полученных вирусных концентратов изучали в ИФА и при иммунизации мышей BALB/c., кроликов, морских свинок и свиней. Ре-ференс-сывороткой служила сыворотка, полученная из Центральной ветеринарной лаборатории Вейбридж (Великобритания). Препараты вируса проверяли на специфичность с гипериммунными сыворотками свиней к возбудителям классической чумы свиней (КЧС), парвовирусной инфекции, энтеровирусного энцефаломиокар-дита свиней и болезни Ауески. Вирус РРСС изучали в непрямой реакции иммуно-флуоресценции (НРИФ), реакции нейтрализации в культуре клеток MARC-145, а также в ИФА с использованием компонентов набора фирмы IDEXX (США).

Иммунизация. Для иммунизации использовали мышей, которым 2-3 -кратно интраперитонеально вводили антигены в концентрации 40-100 мкг на мышь. Первое введение проводили с полным адъювантом Фрейнда или ангарским маслом в соотношении 1:1, второе и последующее - без адъюванта. Бустерные инъекции антигена с увеличенной концентрацией антигена (по сравнению с предыдущим введением) проводили за 3-5 суток до гибридизации.

Решение о кратности введения антигена принимали, исходя из титра антител в сыворотке крови мышей, взятой из хвостовой вены. Определение титра антител в сыворотке крови проводили в непрямом ТФ ИФА.

Гибридизация. Гибридизацию миеломных и селезеночных клеток мышей ВА1.В/с сначала проводили по методике Саарма и сотр. (1985), а затем по разработанной нами методике, адаптированной к получению противоящурных монокпо-нальных антител (Л.А.Глобенко и соавт., 1986 и 1994гг.).

Скрининг гибридных клонов, секретирующих противовирусные антитела, осуществляли в непрямом ТФ ИФА. Для получения стабильных высокопродуцирую-щих гибридом проводили их трехкратное клонирование методом предельных разведений.

Кариологический анализ гибридных клеток. Кариологические исследования проводили по методу Мурхед и соавт. (1963).

По полученным данным строили идиограммы распределения числа хромосом.

Данные кариологического анализа использовали при составлении паспортов на штаммы гибридных, культивируемых клеток, перспективных для биотехнологии.

Изоферментный анализ гибридных клеток. Изоферментный анализ по лактатдегидрогеназе (ЛДГ) проводили по методике Монте де Ока с соавт. (1969).

Иммунохимические реакции. Для характеристики МАТ проводили анализ их активности в различных реакциях. РСК, РН, РДСК, РЗ осуществляли в соответствии с методиками (Собко с соавт., 1974; Сюрин с соавт., 1991).

В связи с тем, что ВНИИЗЖ имеет с 1995 года статус Региональной справочной ящурной лаборатории МЭБ тестирование МАТ с этого времени проводили в реакции микронейтрализации на микропанелях.

Выделение и очистка моноклональных антител. В зависимости от целей исследований моноклональные антитела выделяли из культуральной и асцити-ческой жидкостей по разработанной нами методике, включающей 2-3-х кратное осаждение антител насыщенным раствором сульфата аммония с последующим диализом против воды и фосфатно-буферного раствора. В дальнейшем методика была нами усовершенствована и использована при определении эпитопов ВЯ с помощью МАТ, очищенных аффинной хроматографией.

Выделение иммуноглобулинов высаливанием сульфатом аммония. Асцитическую жидкость фильтровали через два слоя фильтровальной бумаги. Разводили в два раза ФБР и подвергали очистке от жироподобных веществ добав-

лением 2-5% (по объему) полиэтиленимина и после флокуляции белков, 2-5% (по объему) хлороформа. После центрифугирования при 5-6 тыс. об./мин надосадоч-ную жидкость использовали для дальнейшей очистки.

Первое высаливание проводили при концентрации сульфата аммония (СА) равной 50% от насыщения. Концентрация СА при втором высаливании варьировала от 33 до 45% от насыщения в зависимости от интенсивности формирования осадка. На конечной стадии осадок растворяли в минимальном объеме ФБР и диа-лизовали против этого раствора при 4°С в течение 24-48 часов. Активность полученного препарата определяли в ИФА, содержание белка - методом спектрофото-метрии при 280 нм.

Степень чистоты полученных препаратов анализировали методом электрофореза по Лэммли (1970).

Концентрирование МАТ полиэтиленгликолем. Асцитическую жидкость разводили в 2 раза ФБР, рН 7,4 и добавляли равный объем 20% ПЭГ с молекулярной массой 6000 на ФБР. После 5-минутного инкубирования на льду суспензию центрифугировали 15 минут при 4000 об./мин.

Осадок растворяли в двойном объеме ФБР, снова осаждали при таком же режиме центрифугирования и конечный осадок растворяли в минимальном объеме ФБР. Количество белка определяли спектрофотометрически, активность полученных глобулинов - в ИФА.

Очистка МАТ высокоэффективной жидкостной хроматографией (HPLC). Выделение МАТ из асцитической жидкости мышей проводили на анионо-обменной колонке PROTEIN РАК DEAE 5PW 7,5 мм х 7,5 см. Для элюции применяли растворы: А-20 мМ Трис - HCI буфер, рН 8,5; В - 20 мМ Трис- HCI буфер, рН 7,0 с добавлением 0,3 М NaCI. Градиент элюции составлял 0-100% раствора В за 30 минут, скорость элюции - 1 мл/мин. Детектирование проводили при 280 нм. (Работа проводилась совместно с к.б.н. Ю.А.Холиным).

Полученные фракции концентрировали на ультрафильтрационной ячейке с фильтром ХМ-50. Качественный состав фракции определяли электрофорезом по Лэммли, активность иммуноглобулинов - в ИФА.

Аффинная хроматография препаратов МАТ на белок А-сефарозе. Выделение иммуноглобулинов на колонке с использованием белок А-сафарозы про-

водили по методике, описанной в Hybridoma Techniques (1980). Активность иммуноглобулинов в выделенных фракциях определяли в ИФА.

Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ). Качественный состав выделенных фракций определяли методом электрофореза по Laemmli (1970)

Конъюгирование моноклональных антител с пероксидазой хрена. Конъюгирование проводили методом перийодатного окисления (NaKane Р., 1974 и NaKamura К., 1984) в нашей модификации.

Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА). Тестирование позитивных клонов, характеристику полученных моноклональных антител и оценку их пригодности для диагностических целей проводили в различных вариантах имму-ноферментного анализа.

Для проведения реакций использовали 96-луночные планшеты для иммунологических реакций Ленинградского завода медицинских полимеров и 96-луночные планшеты фирмы "Dynatech".

Непрямой вариант ИФА. В лунки планшета вносили по 100 мкл раствора антигена в рабочем разведении. После инкубации в течение 1 часа при 37°С не-сорбировавшийся антиген удаляли 3-кратным отмыванием. Для блокировки вносили по 100 мкл раствора , содержащего 10% фетальной сыворотки и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Разведение МАТ готовили непосредственно в лунках с блокирующим раствором, после чего вновь проводили инкубацию. Несвязавшиеся МАТ удаляли 3-кратным промыванием, затем в лунки вносили конъюгат в рабочем разведении (100 мкл/лунка), который готовили непосредственно перед применением.

После инкубации (1 час при 37ПС) непрореагировавшие компоненты удаляли 4-5-кратным отмыванием . Для выявления иммунологических комплексов в каждую лунку вносили по 100 мкл раствора субстрата и выдерживали 5-15 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 4N серной кислоты (H2S04). Положительная реакция характеризовалась появлением желтой окраски разной интенсивности, отрицательная - бесцветной. В контрольный ряд лунок добавляли все компоненты, кроме МАТ.

Учет реакци проводили на фотометре фирмы "Dynatech", измеряя оптическую плотность содержимого лунок при 405 нм.

Улавливающий или "сандвич-вариант". Кроличьи поликлональные иммуноглобулины против вируса ящура различных типов в рабочем разведении сорбировали на лунках полистироловых планшет в течение 1 часа при 37°С. После блокировки вносили антиген в рабочем разведении в блокирующем растворе. Последующие стадии проводили, как описано выше.

Жидкофазный вариант. МАТ реагируют с антигеном в жидкой фазе и полученные комплексы улавливаются поликпональными антителами, сорбированными на лунки планшета.

Сенсибилизацию лунок планшета и последующую блокировку проводили как описано выше. Параллельно с сенсибилизацией в отдельном планшете, не обладающем сорбционными свойствами по отношению к белку, готовили разведения антител (аналогично предыдущим вариантам ИФА). В эти же лунки вносили антиген в рабочем разведении по 100 мкл на лунку. Смесь антигена и антител в жидкой фазе инкубировали 1 час при 37°С.

Конкурентный вариант. Лунки планшетов сенсибилизировали поликпональными антителами, блокировали , наносили антиген в рабочем разведении. Затем одновременно в лунки вносили по 50 мкл МАТ в разведениях и по 50 мкл конъ-югата МАТ с пероксидазой хрена в рабочем разведении. После добавления субстрата проводили учет реакции.

При определении взаимного расположения эпитопов вируса ящура с помощью моноклональных антител и их концентрацию определяли методом ИФА аддитивного теста по Ргцие! е.а. (1972).

Статистическая обработка результатов. Каждый опыт повторяли не менее 3 раз. Статистическую обработку полученных данных проводили по методу Стьюдента. Средние значения, среднеквадратичные ошибки вычисляли по известным формулам (Ашмарин и др., 1975).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1.Получение очищенных и концентрированных антигеноо

При получении инактивированных очищенных и концентрированных антигенов и их фрагментов, таких как вирус ящура, возбудитель болезни Ауески использовали методы препаративного выделения 146S и 12S частиц ВЯ и 150S компонента ВБА, разработанные ранее другими исследователями.

При работе с менее изученными возбудителями, такими как вирусы везикулярной болезни свиней, везикулярной экзантемы свиней и релродуктивно-респираторного синдрома свиней необходимо было оптимизировать наработку возбудителей в чувствительных системах (перевиваемые культуры клеток, альвеолярные макрофаги поросят), а также способы их инактивации, очистки, концентрирования и сохранения в течение всего технологического цикла.

Контроль очищенных и концентрированных вирусов осуществляли по титру инфекционности, гомогенности при электрофорезе в агарозном геле, по активности и специфичности - в ИФА, по иммуногенности - на мышах BALB/c - доноров иммунных спленоцитов.

Полученные препараты вируса ящура при аналитическом центрифугировании характеризовались гомогенным пиком и имели константу седиментации 146S. Все полученные антигены имели концентрацию вирусспецифического белка 1001400 мкг/мл, были активны в ИФА, РИА и обладали высокой иммуногенной активностью. Титр антител в сыворотке крови иммунизированных мышей составлял 8 ИФА не менее 1:1000, а в РН - 1:16.

Установлено, что оптимальными условиями для сохранения 146S компонента вируса является температура-196°С и -70°С при добавлении криопротектора глицерина или этиленгликоля. В этих условиях срок хранения составлял не менее 12 месяцев. Очищенные и концентрированные препараты вирусов ВВС и ВЭС обладали высокими иммунизирующими свойствами для мышей. При иммунизации мышей вирусом ВБС (концентрация антигена 40 мкг на мышь) через 21 день титр антител в сыворотке крови был от 1:1000 до 1:10000.

Полученные очищенные препараты вируса болезни Ауески имели концентрацию вирусспецифического белка 100-300 мкг/мл, были активны в ИФА и обладали

высокой иммуногенной активностью. Титр антител в сыворотке крови иммунизированных мышей был не менее 1:1000 в ИФА.

В наших опытах было осуществлено концентрирование вируса РРСС в 100400 раз, а степень очистки при этом составила 96-98%. Активность вируссодержа-щей суспензии в ИФА зависела от кратности концентрирования и была в пределах от 1:400 до 1:10000. Электронно-микроскопические исследования показали,что в препаратах содержится большое количество вирусных частиц диаметром 43-83 нм.

3.2 Культивирование и хранение миеломных клеток

Линии миеломных клеток, поступившие во ВНИЯИ (ВНИИЗЖ) из нескольких лабораторий России и зарубежья постепенно адаптировали к новым условиям культивирования до полного восстановления их пролиферативной активности.

По результатам пяти параллельных гибридизаций отобрали миеломную линию PAI, не секретирующую собственных иммуноглобулинов и обеспечивающую наиболее высокий выход антителосекретирующих клонов при слиянии с иммунными спленоцитами. Гибридомы, полученные на основе PAI, были неприхотливы в росте и размножались без фидерных клеток.

Результаты опытов по криоконсервированию миеломных и гибридомных клеток показали, что оптимальными является ступенчатое замораживание клеток на программном замораживателе и наиболее технологичный криофилактик - этилен-гликоль, ранее не применявшийся для хранения этих клеток, который позволил в наших опытах сохранять не менее 88% жизнеспособных клеток в течение 10 лет. В результате проведенной работы адаптированы и заложены на хранение пять линий мышиной миеломы, пригодных для получения гибридом, отработаны условия выращивания и хранения миеломных линий. Разработана методика по длительному сохранению при температуре-196°С миеломных и гибридомных клеток.

3.3 Разработка схемы иммунизации мышей линии BALB/c

Важным этапом в гибридомной технологии является получение мышиных лимфоцитов, сенсибилизированных определенным антигеном. С этой целью иммунизировали мышей BALB/c, используя различные схемы иммунизации. Схемы отличались количеством иммунизаций, интервалом между ними, дозой антигена и местом его введения.

В наших опытах проведены исследования по оптимизации схемы иммунизации мышей линии ВА1_В/с 146Б антигеном вируса ящура А2г. Для проведения опыта животных разделили на три группы. Животным первой группы антиген вводили в дозе Юмкг, ворой - 40 мкг, третьей - 65 мкг на мышь. Всех животных иммунизировали трижды. Антиген вводили внутрибргашинно. Первой группе в сочетании с полным адъгавантом Фрейнда (в соотношении 1:1), второй и третьей группам - без адъю-ванта. Интервал между первым и вторым введениями антигена был 7,14, 19, 21, 28, 35 и 42 дня. Вторую и третью иммунизацию проводили с интервалом 3-7 дней.

Проведенные исследования показали, что ранее всего ( к 14 дню) максимальный иммунный ответ достигался при введении антигена в дозе 40 мкг/мышь. При этом титр антител (1:1000 - 1:10000) в сыворотке крови мышей сохранялся в течение двух недель. Значительное увеличение дозы антигена не приводило к заметному улучшению результатов, но оказывало побочный токсический эффект. Уменьшение или увеличение дозы антигена приводило к замедленному развитию иммунного ответа.

В опытах было также показано, что оптимальным является двукратное внут-рибрюшинное введение антигена в дозе 40-100 мкг на мышь с интервалом в 19-35 дней. В качестве адъюванта для первой иммунизации наряду с полным адъюван-том Фрейнда можно использовать отечественный адъювант типа неполного на основе ангарского масла (ТУ 38-10 -1884-84).

В результате проведенных исследований усовершенствована схема иммунизации мышей ВА1.В/С антигенами некоторых вирусов с целью получения стабильных гибридом.

3.4 Гибридизация миеломных и селезеночных клеток и получение стабильных линий гибридом

Основным этапом в получении гибридом является процедура гибридизации миеломных и селезеночных клеток, производимая в суспензии под воздействием ПЭГ.

Гибридизацию клеток проводили по следующей схеме. За 18-20 часов до опыта миеломные клетки пассировали для получения культуры в логарифмической фазе роста. У иммунизированных мышей линии ВА1_В/с за сутки до гибридизации

отбирали кровь из хвостовой вены и сыворотку крови исследовали в непрямом ИФА на присутствие вирусспецифических антител. Если титр антител составлял 1:1000 и более селезенки иммунизированных мышей использовали для гибридизации, которую проводили по схеме, описанной Саарма и сотр. в нашей модификации.

Усовершенствован процесс получения гибридом, секретирующих МАТ заданной специфичности, включающий использование оптимального соотношения мие-ломных и селезеночных клеток (1:5 - 1:10). Инкубацию с 50%-ным ПЭГ с ММ 4000, содержащим 1% диметилсульфоксида, проводили в течение 5 минут с последующим разбавлением ПЭГ питательной средой в течение 5 минут.

Уменьшение времени инкубирования приводило к снижению сливающегося действия ПЭГ и даже к полному отсутствию клонообразования. В результате увеличения времени инкубации происходило формирование крупных вакуолизированных клеток, быстро теряющих антителосекретирующую способность.

Показано, что процедура центрифугирования для удаления ПЭГ перед внесением клеток в селективную среду не является обязательной. Это говорит о том, что ПЭГ в такой концентрации не токсичен для сливаемых клеток и не влияет на рост гибридных клонов.

Анализ клеточной гомогенности получаемых гибридом показал, что лишь около 18% культур, растущих в лунках после гибридизации, были предположительно монокпональны. Для получения стабильных клеточных линий, обладающих высокой антителопродуцирующей активностью, проведено клонирование гибридом методом предельных разведений. Клонирование давало существенное повышение титров антител ( в 5-100 раз в зависимости от клона) и усиление клонообразующей активности. Было установлено, что линии гибридом различаются по своей клонообразующей способности.

Для выращивания гибридом были отобраны питательные среды (ДМЕМ, RPMI-1640, Iscov's) со стабильной осмотичностью, высокой буферной емкостью (содержащие 20мМ HEPES -[4-(2-hydrooxyethyl)-piperazinesulfonic acid]) с добавлением инсулина в качестве ростстимулирующего фактора на всех этапах культивирования гибридных клонов до начала первичного скрининга (1,5 мес.).

3.5 Скрининг позитивных клонов гибридомных клеток

В наших исследованиях для первичного скрининга гибридом, а также для анализа культуральных и асцитических жидкостей использовали метод ИФА на полистироловых планшетах.

Для проведения первичного скрининга гибридом на 7-14 день после гибридизации из лунок с растущими клонами отбирали по 50-100 мкл культуральной жидкости и тестировали в ИФА на наличие вирусспецифических антител. Первичные неклонированные гибридомы в процессе культивирования постепенно теряли ан-тителосекретирующую способность через 10-20 пассажей (1-2 месяца культивирования) . После двукратного клонирования стабилизировалась и повышалась анти-телопродуцирующая активность.

Таким образом, была отработана система скрининга позитивных клонов и контроля стабильности их антителосекретирующей активности. Показано, что титр МАТ в культуральной жидкости варьировал от 1:100 - 1:1000. В индуцированных гибридомными клетками асцитических опухолях мышей титр антител составлял 1:10 000- 1:1 000 000.

3.6. Некоторые характеристики гибридных клеток

После клонирования первичных гибридом были получены стабильные перевиваемые линии, секретирующие моноклональные антитела к вирусам. Из нескольких гибридомных линий, секретирующих МАТ к каждому из возбудителей, отбиралась одна наиболее технологичная, отличающаяся высокой пролифера-тивной активностью и стабильной антителопродуцирующей способностью. На каждую такую линию гибридом составлялся паспорт, куда входили основные характеристики перевиваемой клеточной линии.

В результате проведенных исследований получены некоторые характеристики гибридных клеток: кариотип, спектр изоферментов ЛДГ соответствует мышиному типу. Модальный класс - 70-87 хромосом, спектр ЛДГ представлен одной изофор-мой с дополнительной полосой. Индекс пролиферации культуры за 48 часов составил 5,1, митотический цикл 24 часа, время удвоения популяции - 18,8 часа.

Из всего многообразия методов контроля клеточных культур на отсутствие посторонних агентов при контроле контаминации бактериями, грибами, микоплаз-

мами и вирусами нами были использованы микробиологический, цитохимический и электронно-микроскопический методы исследования.

Микробиологический контроль для обнаружения контаминации микоплазма-ми проводили на стандартных полутвердых и жидких средах с добавлением лошадиной сыворотки и дрожжевого экстракта.

Цитохимический анализ контаминации включал окраску клеток оливомицином и акридиновым оранжевым.

Кроме того, микоплазменную контаминацию культур проводили с помощью электронного микроскопирования ультратонких срезов. Постоянный контроль контаминации 'слеточных культур позволил в течение длительного времени поддерживать in vitro и in vivo наиболее перспективные и стабильные штаммы гибри-домных клеток.

3.7 Изучение влияния различных факторов на сохраняемость гибридомных клеток

В процессе работы с гибридными клетками возникла необходимость их сохранения: длительного- в жидком азоте при -196°С, временного в бытовом холодильнике (+4°С) и при транспортировке без предохраняющих термосов (+22°С). С целью решения этого вопроса нами изучалась сохраняемость полученных гибридных клеток при +4°С и +22°С, а также подбирались режим замораживания и оптимальный криофилактик для хранения клеток в жидком азоте (-196°С).

На основании проведенных исследований были определены оптимальные условия хранения гибридомных клеток. Отработан режим охлаждения клеток для последующего хранения в жидком азоте. Показано, что оптимальным криофилакти-ком для гибридомных клеток является этиленгликоль в концентрации 5%.

Было показано, что токсичность этиленгликоля наиболее низкая в концентрации 5% и эта концентрация в процессе криоконсервирования гибридом позволяет увеличивать время экспозиции клеток с защитными веществами, которое необходимо для выполнения технологических операций. Кроме того отмечено, что исключение процедуры отмывания клеток от криофилактика центрифугированием улучшает технологию культивирования и сохранения гибридом.

С учетом этих данных разработана "Методика по длительному сохранению при -196°С миеломных клеточных линий и гибридом".

3.8 Получение и наработка первичных препаратов моноклональных антител

Результаты проведенного нами анализа закономерностей асцитообразова-ния при введении мышам четырех линий гибридом и их сублиний показали, что частота образования асцитных опухолей колебалась от 53,3 до 91,3%, а солидных - от О до 16%. формирование асцитов происходило в среднем за 10-22 суток, специфическая активность антител в асцитических жидкостях, определяемых в непрямом ИФА, составляла 1:10 ООО - 1:1 ООО ООО.

Показано, что полученные гибридомы обладали способностью к образованию асцитов на протяжении последовательных 30-50 пассажей на мышах . Процент приживления гибридом при перевивках составлял 100%. Титр специфических антител в процессе пассирования гибридом не изменялся.

Мы испытывали в качестве сенсибилизирующих агентов пристан, полный адъювант Фрейнда, адъювант "Filaxia", ангарское и парфюмерное масла. Результаты проведенных испытаний позволили сделать заключение, что оптимальным праймирующим препаратом для индукции асцитных опухолей при наработке МАТ является ангарское масло. Оно обеспечивало 100% приживляемость гибридных клеток и образование асцитных опухолей в среднем на 11 день после инокуляции клеток.

3.9 Получение очищенных препаратов моноклональных антител и их характеристика

Очищенные препараты МАТ получали, применяя высокоэффективную жидкостную хроматографию (HPLC) на ионообменной колонке PROTEIN РАС DEAE 5PW и аффинную хроматографию с использованием белок А-сефарозы. При проведении экспериментов было показано, что наиболее эффективным способом одноступенчатой очистки МАТ является использование аффинной хроматографии на белок А-сефарозе с предварительным осаждением иммуноглобулинов сульфатом аммония. Оптимальнным буфером для сорбции антител является 1,5М глициновый буфер рН

8,9 с ЗМ ЫаС1. рН элюирующего раствора необходимо подбирать индивидуально для каждого МАТ. Процедуру подбора условий элюции можно облегчить, определив подкласс иммуноглобулинов.

Определение подкласса иммуноглобулинов. Нами проведено выделение классов и подклассов МАТ к возбудителям болезней, протекающих с везикулярным синдромом. При помощи наборов фирмы "5его(ек" и "Са1ЫосЬет" определены подклассы 55 МАТ к вирусу ящура пяти типов (А, О, С, Азия-1 и САТ-1), а также 18 МАТ к вирусу ВБС тип Т-75; 23 МАТ к вирусу ВВС тип 0-72 и 24 МАТ к вирусу ВЭС тип С-72.

В результате проведенных исследований выделены иммуноглобулины к ВЯ следующих подклассов: 1дв1 - 62%, 1дС2а - 34%, 1д02Ь - 4%, к другим возбудителям болезней с везикулярным синдромом (ВБС, ВЭС): 1дС 1 - 80%, 1дв 2а - 9%, 1дС 2Ь -10%, 1дМ - 1%.

3.10 Активность моноклональных антител в иммунохимических реакциях

Наиболее перспективным молекулярно-биологическим методом дифференциации штаммов вируса ящура является иммуноферментный анализ (ИФА) с использованием высокоспецифичных моноклональных антител, полученных на один эпитоп вируса. В наших исследованиях для определения пригодности моноклональных антител при проведении диагностических и молекулярно-биологических исследований вначале были изучены их активность в различных иммунохимических реакциях, а затем определен характер взаимодействия МАТ с полным вирусом и его субъединицами в ИФА.

Проведенные опыты и межлабораторные комиссионные исследования показали, что противоящурные моноклональные антитела, обладают высокой нейтрализующей и комплементсвязывающей активностью, способностью образовывать специфические комплексы преципитации с антигеном, обладают защитными свойствами.

Отмечено, что разные линии гибридом обладают различной вируснейтрали-зующей активностью. Моноклональные антитела в РСК были типоспецифичны-ми и не взаимодействовали с гетерологичными антигенами. Активность монокло-

нальных антител в этой реакции составляла не более 1:4-18 В РДП монокпональ-ные антитела были активны в разведениях 1:256 - 1:1024 Титр поликлональной мышиной сыворотки к вирусу А22 составил 1:32.

3.11 Взаимодействие моноклональных антител с 146 S компонентом вируса ящура в различных вариантах ИФА

В настоящее время для изучения свойств возбудителей различных заболеваний нашли широкое применение биохимически гомогенные, специфичные к одной определенной антигенной детерминанте, стабильные по специфичности и авидности моноклональные антитела. Чаще всего при изучении молекулярной биологии вирусов, разработке и совершенствовании методов лабораторной диагностики вирусных инфекций применяют моноклональные антитела, конъюгированные с различными ферментами.

Получение препаратов МАТ, конъюгированных с пероксидазой хрена.

Конъюгированные препараты МАТ применяли при конструировании диагностических тест-систем , а также при проведении конкурентного иммунофермент-ного анализа при изучении антигенных детерминант вируса ящура типа А22№550, О,№194 и Азия-1 №48. Традиционная процедура конъюгирования МАТ с пероксидазой хрена занимает гне менее 36 часов. Был введен ряд модификаций в методику Nakamura R. (1984), в результате которых время конъюгирования сократилось до 15-18 часов. Было показано, что активность препаратов и стабильность их при хранении одинаковы.

В результате получены конъюгированные препараты МАТ к ВЯ пяти типов (А, О, С, Азия-1 и САТ-1). Активность полученных препаратов в ИФА была не ниже 1:200.

Характеристика гибридом, продуцирующих МАТ заданной специфичности. Сконструированы мышиные лимфоцитарные гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к 146S компоненту вируса ящура, 12S компоненту ВЯ, а также к синтетическим пептидам 145-155 и 141-160 белка VP1 ВЯ А22№550. Кроме того получены гибридомы-продуценты МАТ к вирусу ВБС, ВЭС, к вирусам болезни Ауески и репродуктивно-респираторного синдрома свиней. Гибридомы депонированы в банке клеточных культур Института цитологии РАН. На депонированные

штаммы гибридных клеток получены свидетельства о депонировании, авторские свдетельства и патенты ВНИИГПЭ РФ. Установлено, что противоящурные МАТ обладали широким для этого вида антител спектром свойств: нейтрализующей, ком-плементсвязывающей и протективной активностью, а также способностью образовывать с антигеном комплексы преципитации. Показана типоспецифическая активность МАТ в РН, РЗ, РСК, РДСК, РКоА, РИФ, РИА и ИФА.

Изучение активности МАТ показало их разнообразие по способности реагировать с гомо- и гетерологичными вирусами в иммуноферментном анализе и реакции нейтрализации. Отмечно, что все МАТ, положительно реагирующие в ИФА, не всегда обладают вируснейтрализующей активностью (ВНА). Моноклональные антитела, полученные на 12Б компонент ВЯ Агг№550 и синтетические пептиды 145-155 КШ и 141-160 0\/А\/Р1 ВЯ типа А22 не обладали вируснейтрализующей активностью.

Проведение исследований по определению вируснейтрализующей активности МАТ представляет практический интерес, так как наибольшую диагностическую ценность представляют нейтрализующие антитела, полученные к уникальным эпитопам с узконаправленной видовой специфичностью.

Изучение антигенных детерминант с использованием моноклональ-ных антител. В первую очередь выявляли МАТ, взаимодействующие с нейтрализующими эпитопами. Большинство МАТ, полученных к цельному вириону ВЯ пяти типов (А, О, С, Азия-1 САТ-1), ВБА и некоторые антитела к ВВС и ВЭС обладали высокой вируснейтрализующей активностью.

Определение активности МАТ с гомологичным типом вируса в различных вариантах ИФА. В наших экспериментах была определена активность МАТ в различных модификациях ИФА для установления зависимости эпитопов МАТ от конформации вирусных частиц на модели антигенов ВЯ типов А, О и Азия-1. Проанализировав взаимодействие МАТ к вирусу ящура типа А, была отмечена значительная разница в активности антител с гомологичным вирусом и его производными в различных вариантах ИФА (Табл.1).

Антитела 1 группы взаимодействовали с конформационно-зависимым эпито-пом, полностью разрушающимися при сорбции антигена на пластик.

Антитела 2 группы, нейтрализующие вирусную инфекционность, также взаимодействовали с конформационно-зависимым эпитопом. Однако его зависимость зт конформации была выражена слабее, чем у эпитопов 1 группы, поскольку антитела 1-ой группы взаимодействовали с вирусом в непрямом варианте ИФА намного :лабее , чем в "сандвич" и жидкофазном.

Антитела 3 группы, в которую вошло 1 МАТ, полученное на 146Б компонент ЗЯ, и все антитела к 12Б компоненту взаимодействовали с внутренним линейным эпитопом, наиболее выраженным на вирусных частицах, сорбированных на пластик.

Таблица 1

Характеристика МАТ к вирусу ящура Аг2№550

Активность в различных вариантах ИФА (1д)

.Шифр МАТ ВНА непрямой "сандвич" Жидко-фазный Конкурентно-ингибиционный Группа

146Б 146-Т 12Б ПП 146Э 146-Т 146Э 146Э 146-Т

<146 Б А22№550

4 + 2,1 0 0 0 4,2 3.5 4,2 2.6* 2,6 1

5-2 + 2,1 0 0 0 3,5 3.5 4.2 2,6 0

2А4 + 1,4 0 0 0 3,5 3,5 4,9 0 0

А1Д4 + 2,8 1.4 1,4 0 3,5 3,5 3,5 2,6 2,6 "2

А2А2 + 4,2 2,8 2,8 0 4,9 4,9 4,9 2,2 2,4

А2Д2 + 4.2 2,3 2,8 0 4,9 4,9 4,9 2,4 2,5

А7А2 + 2,8 1.4 1,4 0 3,5 3,5 3,5 2.9 2,9

А1В4 - 4,2 4,2 4.2 2,8 2,8 2,8 0 0 0 3

К12Э А22№550

4В2 - 3.5 4,2 >4.9 2.8 2,8 2,8 0 0 0

4ВЗ - 4,2 3,5 >4,9 2.8 2,1 2,8 0 0 0

5В4 - 4,9 4,9 >4,9 2,8 2.8 2,8 0 0 0

5С4 - 2.8 2.8 2,8 2,8 1.4 1,5 0 0 0

4А5 - 2,8 2,8 4.2 2.8 1,4 2,8 0 0 0

4В4 - 4,2 4,2 >4,9 2,8 2.8 2,8 0 0 0

4Д5 - 4,9 2,8 >4,9 2,8 2,8 2.8 0 0 0

* - 1д величина обратного разведения антигена, дающего 50% ингибирования реакции со 146Б компонентом;

146 Т - вирус, обработанный трипсином; 12Б - субъединицы вируса; ПП - полипептиды.

Антитела, полученные на вирус ящура типа О в различных вариантах ИФА также проявляли неодинаковую активность (табл.2)

Таблица 2

Характеристика МАТ, полученных к вирусу ящура О,

Шифр МАТ ВНА Активность в различных вариантах ИФА (1д) Группа

непрямой "сандвич" Жидко-фазный Конкурентно-ингибиционный

146Э 146-Т 12Б ПП 1465 1463 146Э 146-Т 123

2Д2 + 4,2 <1.0 2.8 2,8 5,6 4,9 2,5* 1,4 0 1

7Д6 + 4,2 1,4 1,4 1,4 3,5 3,5 2,1 0 0 М

4Д5 + 4,9 <1,0 2,1 1,4 3,5 2,1 2,0 1,0 0

ГВ2 + 4,2 3.5 0 0 3,5 2,1 2,6 2.3 0 2

ГВ6 + 4,9 4,2 0 0 4,9 3,5 1.7 1,7 0

ГВВ6 + >4,9 4,2 0 0 4,9 3,5 2,1 2,3 0

ГВС4 + >4,9 4,2 0 0 4,9 3,5 1,7 1,7 0

19ВВ5 + 4,9 4,9 4,9 4,9 4,9 4,2 2,3 2,3 0 3

БА4 - 3,5 2,8 0 0 2,8 1,4 2,6 2,9 2,3 4

ГА6 - 2,8 3,5 0 0 2,1 1,4 2,3 2,3 2,3 "

17Д6 - 3,5 3,5 0 0 1,4 0 2.3 2,0 0

* 1д величина обратного разведения антигена, дающего 50% ингибирования реакции со 146Э антигеном.

МАТ первой группы, нейтрализующие инфекционность вируса, распознавали линейный эпитоп, поскольку они реагировали с пептидом и активность этих антител во всех вариантах ИФА была одинакова.

МАТ ГВВ6. ГВС4, 4Д5, ГВ2 нейтрализующие также распознавали линейный эпитоп. Поскольку антитела этой группы наиболее активны в непрямом ИФА, мы предположили, что на поверхности нативной вирусной частицы этот эпитоп частично маскируется конформационными складками. Антитела, неактивные в реакции

нейтрализации, также как ненейтрализующие МАТ к ВЯ типа А, взаимодействовали с внутренним эпитопом, недоступным для антител в растворе.

Изучение взаимодействия МАТ, полученных к вирусу ящура Азия-1 в различных вариантах ИФА, с гомологичным вирусом позволило выделять только одно антитело 1В4, взаимодействующее с линейным эпитопом (табл.3).

Таблица 3

Характеристика МАТ, полученных к вирусу ящура Азия-1 №48

Активность в различных вариантах ИФА (1д)

Шифр ВНА непрямой "сандвич" Жидко-фазный Группа

МАТ 146Б 146-Т 12Б ПП 146Э 146Э

А4 + 2,8 2,1 <1.0 <1,0 4,9 4,2 1

1А13 + 2,8 2,1 <1,0 <1,0 3,5 3,5

1А14 + 2,8 1,4 <1,0 0 4,2 3,5

1В4 - 2,8 3,5 4,2 2,1 2,8 0 2

2АЗ - 2,8 0 0 <1,0 3.5 0 3

2В4 - 3,5 <1,0 <1,0 <1,0 4,2 0

2С4 - 2,1 <1,0 <1,0 <1,0 2,8 0

2Д2 - 2,3 <1,0 0 0 3,5 0

В реакции нейтрализации это антитело не нейтрализовало вирусную ин-фекционность.

Таким образом, нейтрализующие МАТ к ВЯ типа А распознавали 2 конфор-мационно-зависимых сайта, антитела к ВЯ типа О взаимодействовали с линейными нейтрализующими сайтами, МАТ к ВЯ типа Азия-1 в различных вариантах ИФА распознавали 1 линейный и 2 конформационных сайта на поверхности вириона гомологичного вируса .

Взаимодействие МАТ с гомологичным антигеном и его производными. Для выяснения характера конформационной зависимости определялась активность МАТ с различными производными 146Б частицы гомологичного вируса.

Изучение активности в непрямом, "сандвич" и конкурентно-ингибиционном вариантах ИФА показало (табл.1), что эпитопы МАТ к ВЯ типа А, отнесенные ранее к первой группе , экспонированы только на интактных вирионах, т.е. являются 1468-специфичными. Эпитопы связывания антител 2 группы выявлялись на 146Б и ела-

бее на 12Э субъединицах Антитела 3 группы взаимодействовали, по-видимому, с 12Б специфичными эпитопами, поскольку проявляли наибольшую активность с 12Э субъединицами.

Определение активности МАТ к ВЯ типа О позволило выделить один линейный эпитоп на поверхности вирусных частиц, взаимодействующий с антителом 19ВВ5 (табл.2). Активность этого антитела со всеми производными 146Б компонента была одинакова.

Эпитопы МАТ 2Д2, 7Д6 и 4Д5 выявлялись на всех производных 146Б компонента, однако, намного слабее, чем на интактном вирионе.

Таким образом, эпитопы связывания МАТ к ВЯ типа О, за исключением МАТ 19ВВ5, в той или иной степени зависят от конформации антигена.

Изучение взаимодействия МАТ к вирусу ящура типа Азия-1 с различными производными 146Э частиц показало, что только один линейный эпитоп МАТ 1В4 выявлялся на всех производных 1468 компонента (табл.3). По-видимому , он определяется первичной аминокислотной последовательностью вирусного белка. Эпитопы остальных МАТ определялись конформацией интактных вирусных частиц.

Изучая влияние трипсина на интактность эпитопов частиц вируса ящура, можно определить локализацию эпитопов на \/Р1, а также взаимосвязь эпитопа с сайтом прикрепления к клетке.

Наши исследования позволили выделить 3 сайта на поверхности частиц вируса ящура типа А. Первый полностью разрушался при сорбции на пластик обработанных трипсином 1463 частиц (146-Т), однако в растворе его конформация не изменялась. Активность МАТ ко 2 сайту в непрямом ИФА снижалась на 50%, однако в конкурентно-ингибиционном ИФА она не изменялась по сравнению с активностью со 146Э компонентом. Антитела 3 группы взаимодействовали с трипсин-резистентным эпитолом.

Антитела к вирусу ящура типа О проявляли неодинаковую активность с обработанным трипсином вирусом. Эпитопы этих антител являются трипсин-резистентными. Антитела 1 группы не проявляли активности с трипсинизирован-ным вирусом.

3.12 Выявление уникальных и консервативных сайтов на поверхности частиц вируса ящура с помощью моноклональных антител

Для выявления как консервативных , т.е. общих, так и уникальных , характерных для отдельного типа или штамма вируса ящура эпитопов, определялась перекрестная активность МАТ с различными типами ВЯ в непрямом ИФА.

МАТ, полученные к 146S компоненту ВЯ типа А, отнесенные ранее к 1 группе, по активности с гетерологичными типами были разделены на 2 подгруппы.

MAT 1А подгруппы распознавали уникальный сайт на поверхности частиц гомологичного подтипа А. Одно МАТ ( 1В подгруппа) взаимодействовало с частицами ВЯ типа А (А2г) и О . 2 группа МАТ реагировали с уникальным, характерным только для частиц ВЯ типа А сайтом. МАТ, полученные на 12S компонент ВЯ А22, взаимодействовали с частицами ВЯ типов А и Азия-1 (группа ЗА). Антитела ЗВ подгруппы взаимодействовали со всеми исследуемыми типами ВЯ, распознавая высоксконсервативный эпитоп.

Изучение перекрестной активности МАТ к вирусу ящура типа О показало, что все они распознают уникальные для типа О эпитопы.

Анализ типоспецифичности МАТ к вирусу ящура типа Азия-1 показал, что нейтрализующие МАТ взаимодействовали с эпитопами, имеющимися на гомологичном антигене, т.е. были типоспецифичны. Некоторые ненейтрализующие МАТ перекрестно реагировали с частицами ВЯ типов А и С, и только одно MAT (1В4) взаимодействовало со всеми исследуемыми типами вируса. Это антитело, по-видимому, распознает высококонсервативный эпитоп.

3.13 Локализация эпитопов на вирусном белке VP1 с использованием синтетических пептидов

Локализация эпитопов на вирусном белке VP1 определена следующим этапом работы. Одним из способов определения локализации эпитопов является постановка различных вариантов ИФА с использованием синтетических пептидов в качестве антигенов ( Parry N.R. е.а., 1987).

Из всех исследуемых МАТ к вирусу ящура типа А, только одно нейтрализующее MAT 2А4 взаимодействовало с пептидами. Это антитело перекрестно взаимодействовало с ВЯ типов А и О, со смесью синтетических пептидов (СП) (175-183)

А22 и (136-152) О, и по активности не отмечалось по реакции с нативными вирусными частицами. Анализ аминокислотной последовательности области 136-152 VP1 этих двух типов вируса показал, что гомологичные только для 2-х типов А и О аминокислотные остатки (а.о.) расположены в позициях 151-152. Последовательность 175-189 включает несколько участков гомологии. Таким образом, а.о. в позиции 151-152 (Leu-Ala) и а.о. области 175-189, по-видимому, формируют эпитоп данного антитела.

Более точно локализовать эпитопы нейтрализующих антител можно только после получения вариантов вируса, избежавших нейтрализации и секвенирования генов структурных белков этих вариантов.

Остальные МАТ, полученные в этой серии опытов к вирусу ящура типов А и О. не взаимодействовали с синтетическими пептидами в непрямом ИФА, что , по-видимому, связано с высокой степенью зависимости эпитопов этих МАТ от кон-формации вирусных частиц (Pairy N.P., 1989). Особенно это характерно для ВЯ типа О .

При изучении взаимодействия МАТ, полученных к вирусу ящура типа Азия-1 с синтетическими пептидами было показано, что нейтрализующие МАТ взаимодействовали с пептидами, соответствующими 140-153 и 193-208 а.о. VP1 ВЯ Азия-1.

Все ненейтрализующие МАТ взаимодействовали только с пептидом 140153. Вероятно, аминокислоты этой области принимают участие в формировании эпитопов данных МАТ.

Локализация эпитопа МАТ 1В4 согласуется с данными о присутствии высококонсервативного трипептида Arg-Gly-Asp внутри гипервариабельной области MO-ISO; во-первых, это антитело взаимодействует со всеми типами ВЯ; во-вторых, взаимодействует с пептидами, соответствующими этой области. Вероятно, МАТ 1В4 связываются с этим трипептидом и он полностью или частично входит в состав эпитопа дакного антитела.

Таким образом, на поверхности частиц ВЯ А22 было выявлено шесть сайтов связывания МАТ: у частиц вируса Ot - четыре и у вируса Азия-1 - три сайта взаимодействия с МАТ.

В предыдущих исследованиях было показано, что МАТ к 12Б компоненту ВЯ А22 и антитела к 146Б компоненту вируса ящура типа Азия-1 проявляли одинаковую специфичность. Поэтому нам интересно было выяснить, распознают эти антитела разные сайты на поверхности частиц вируса или один.

При постановке конкурентного ИФА было отмечено, что связывание конъюга-та 1В4 в присутствии антитела 4А5 (группа ЗВ) не только не ингибировалось, а наоборот, усиливалось с вирусными частицами обоих типов.

Таким образом, результаты экспериментов свидетельствуют о наличии на 12Б частицах по меньшей мере 3-х сайтов: два из них являются консервативными и присутствуют на 12Б частицах всех исследованных типов ВЯ и один экспонирован на вирусных частицах типов А и Азия-1.

3.14 Определение взаимного расположения эпитопов на поверхности

вирусных частиц

Топографическое картирование эпитопов проводили в конкурентном ИФА с использованием меченых и немеченых МАТ ( по МсСиИоидИ е.а., 1986). При постановке конкурентного иммуноферментного анализа с МАТ, полученными к вирусу ящура типа А, было отмечено, что вопреки ожидаемому ингибированию связывания меченых МАТ в присутствии немеченых наблюдалась стимуляция связывания меченых МАТ вирусными частицами. Подобный эффект отмечали некоторые исследователи на модели других вирусов (Матвеева Н.Л., 1987). Поэтому, наряду с применением вышеуказанного варианта ИФА были проведены исследования по эпитопному картированию вируса ящура О1. С, Азия-1 и САТ-1 с использованием соответствующих МАТ и конкурентного ИФА ( по В.Рг^ие1 е.а., 1972) - ИФА - аддитивный тест. Было предложено применение аддитивного теста для изучения антигенного профиля вируса ящура. МАТ вносили парами или поочередно во всех возможных комбинациях в планшеты, которые сенсибилизированы антигеном, и далее проводили ИФА по обычной схеме.

Характеристику профиля вируса ящура типа О проводили после определения нейтрализующихся эпитопов и с учетом результатов взаимодействия МАТ с гомо- и гетерологичными антигенами, а также сравнительного определения спе-

цифичности антител со 146Б, 12Э антигенов и синтетических пептидов с определенной последовательностью аминокислот.

Исходя из описанных выше принципов классификации МАТ по эпитопам, выделили четыре группы пар антител. 1 группа: ГВВЗ и БД4; 18ВЗ и БД4; ГВВЗ и 18ВЗ; 2 группа: ГВС5 и ГВС6; 3 группа : 19В6 и нГВС2; 4 группа: ГВВ6.

Каждая пара МАТ конкурировала за один и тот же эпитоп, в то время как МАТ из разных групп взаимодействовали с разными эпитопами МАТ. ГВВ6 конкурировало со всеми исследованными нейтрализующими МАТ по вариантам, предполагающим адсорбцию на разные эпитопы. Поэтому МАТ ГВВ6 было отнесено в отдельную четвертую группу.

Таким образом, с помощью восьми исследованных нейтрализующих антител были выделены четыре независимых эпитопа на антигене С>1№194.

Для более полной характеристики вируса О, №194 в опыт были взяты ещё четыре ненейтрализующих МАТ: 17Д6, 18А6, ГА6 и 18А4. Причем из нейтрализующих были выбраны МАТ БД4, ГВС5, 19В6, ГВВ6, как определяющие отдельные эпитопы.

Проведение конкурентного ИФА позволило заключить, что все четыре ненейтрализующих МАТ определяют различные эпитопы и что эпитопы, определяемые нейтрализующими и ненейтрализующими МАТ, различны.

Среди ненейтрализующих МАТ особенно выделяется МАТ ГА6, взаимодействие которого почти со всеми МАТ не зависело от очередности нанесения антител.

Для эпитопов, определяемых парами МАТ 18А4, 18В6; ГВВ6, 18В6; ГВВ6, 17Д6; ГВВ6, 18А4, результаты конкурентного ИФА свидетельствуют о слабой зависимости между ними. Остальные эпитопы в той или иной мере взаимозависимы.

Используя данные конкурентного ИФА построена модель взаимного пространственного расположения эпитопов. Каждый эпитоп в модели представлен точкой на поверхности антигена. Модель представляет собой тетраэдр из нейтрализующихся эпитопов, определяемых МАТ БД4, ГВС5, 19В6 с вершиной, определяемой МАТ ГВВ6. Симметрично вершине тетраэдра расположен эпитоп , соответствующий антителу ГА6. Эпитопы, определяемые МАТ 18А4 и 18В6, расположены как бы по направлению лучей пятиконечной звезды. Углы, образуемые между эпито-

пами, определяемые МАТ 18В6, БД4 и БД4. 18А4, а также 18В6, ГА6 и ГА618А4 составляют приблизительно 90°. Эпитоп , соответствующий МАТ ГА6, можно назвать внутренним и, учитывая его заметную функциональную стабильность, отнести к центральному связующему участку модели. Вероятно, этим объясняется и особое положение точки, фиксирующей расстояние между эпитопами, определяемыми МАТ ГВВ6, ГА6. Эпитоп, определяемый МАТ 17А6, расположен в одной плоскости с эпитопами, определяемыми МАТ ГВС5, ГВВ6 и 19В6.

Также как и при конкурентном анализе МАТ к вирусу ящура О, в опытах с МАТ к вирусу С, можно было составить пары антител С2С4, С6А5; С5Д1, С2С4; С8ВЗ, С5СЗ и С5С2, С5СЗ. Это позволило идентифицировать на антигене С,№564 семь различных эпитопов и построить пространственную модель их расположения.

Модель эпитопов на антигене С,№564 более компактна по сравнению с антигеном О1. Она также состоит из верхнего тетраэдра, определяемого нейтрализующим МАТ С8ВЗ. Симметрично вершине расположен ненейтрализующийся эпитоп, определяемый МАТ С6А5, с отходящими от него лучами, на вершине которых находятся эпитопы, определяемые нейтрализующими МАТ С5С2 и С6А6. В основании тетраэдра находятся два эпитопа, с которыми взаимодействуют ненейтрализующие МАТ С5Д1 и С51АЗ и один эпитоп, связывающийся с нейтрализующим антителом С2С4. Существенным различием моделей для вируса О, и С, является относительное расположение нейтрализующихся и ненейтрализующихся эпитопов:

В модели вируса О, нейтрализующиеся эпитопы находятся только на тетраэдре, представляющем часть фигуры, а в модели вируса С, они расположены почти симметрично эпитопу, определяемому МАТ С2С4, котрый находится на вершине данной фигуры.

Таким образом, построение модели эпитопов для антигенов О1 и С, позволило заметить, что существуют как общие черты во взаимном расположении эпитопов, так и существенные различия.

Общим является физическая форма моделей и свойства верхнего эпитопа. Различия отмечаются в количестве выявленных эпитопов ( на антигене С1 их семь, а на антигене О, - восемь), в расположении нейтрализующихся эпитопов и в плотности их "упаковки".

Модели пространственного расположения эпитопов на антигенах Азия-1 и САТ-1, несмотря на разное число МАТ, по которым они были построены, имеют существенное сходство.

Обе модели состоят из верхнего тетраэдра с вершиной - сильно нейтрализующимся эпитопом, определяемым антителами A3 и SD1 и основанием, в котором на антигене Азия-1 находятся эпитопы, определяемые двумя нейтрализующими MAT 1А13 и А4 и ненейтрализующим 2Д2, а на антигене САТ-1 - два нейтрализующихся, определяемые MAT SA3 и NSB3 и ненейтрализующимися, определяемый антителом SC1.

Практически симметрично эпитопу, находящемуся на вершине тетраэдра у обоих антигенов, расположен ненейтрализующийся эпитоп, определяемый антителами 2АЗ и NSA1 соответственно для антигенов Азия-1 и САТ-1.

В модели эпитопов антигена Азия-1, кроме верхнего и нижнего тетраэдров, определены положения и ещё трех ненейтрализующихся эпитопов, находящихся на значительном расстоянии от вершинного эпитопа, определяемого антителом A3. Два эпитопа, определяемые антителами ЗА6 и F7, расположены по лучам под углом 120°, а один (MAT 2В4) лежит в плоскости эпитопов, взаимодействующих MAT 1А13, A3, 2Д2.

Что касается модели эпитопов антигена САТ-1, то имеющиеся МАТ позволили выделить лишь один эпитоп, определяемый антителом NSB5, соответствующий эпитопу антигена Азия-1, определяемому антителом ЗА6.

Большая часть нейтрализующихся эпитопов в моделях обоих антигенов расположена на верхнем тетраэдре и лишь один эпитоп, определяемый антителом NSB5 (к ВЯ САТ-1). расположен на луче.

3.15 Характеристики моноклональных антител к вирусу ящура типов А, О, С, САТ-1 и Азия-1

Большинство моноклональных антител к вирусу ящура А2г№550 обладали высокой нейтрализующей и комплементсвязывающей активностью, способностью образовывать специфические комплексы с антигеном, обладали защитными свойствами.

Установлено, что большинство МАТ к вирусу ящура обладают высокой специфической активностью в отношении гомологичного вируса, другие в той или иной степени реагировали с вирусом О, и С,. Полученные результаты подтверждают данные МсСиПоидИ е.а. (1987) о том, что на вирусных частицах, принадлежащих к разным типам и подтипам возбудителя, имеются идентичные, сходные и уникальные антигенные детерминанты.

Получены МАТ на 146Э и 12Б антигены и изучены их характеристики с гете-ро- и гомологичными штаммами ВЯ типа А. Моноклональные антитела к 12Б компоненту ВЯ А22 взаимодействовали со всеми исследуемыми типами ВЯ (А, О, С, Азия-1 и САТ-1), но не реагировали с возбудителями других болезней с везикулярным синдромом (ВВС и ВЭС).

Часть монокпональных антител к вирусу ящура О, обладали вируснейтрали-зующей активностью (31 из 46 исследованных МАТ). Установлена активность МАТ в ИФА, РИА, РСК, РДС, РН и РЗ на мышатах-сосунах.

На основании данных, полученных в иммунохимических реакциях, Составлена коллекция монокпональных антител для дифференциации штаммов и вариантов вируса ящура типа О. Все исследованные моноклональные антитела, кроме МАТ 18С4, реагировали только с гомологичным типом вируса ящура. Дифференциация штаммов внутри вариантов О! было возможно с использованием пяти МАТ.

Найти различия между штаммами О, №1618 и 0,№194 было возможно только по уровню активности взаимодействия с ними МАТ в РН и ИФА. Активность этих МАТ с одним из указанных штаммов была в два раза выше, чем с другим. МАТ из коллекции различали четыре варианта антигена типа О в ИФА: 02, 05, О10 и О,,.

Изучение свойств моноклональн' ix антител к вирусу ящура С,№564 на специфичность проведено с гетеро- и гомологичными антигенами вируса ящура. По результатам этих исследований составлена коллекция МАТ к вирусу ящура С,. Пять моноклональных антител были типоспецифичны (реагировали в ИФА только с гомологичным вирусом) и три нейтрализовали антиген С,. Четыре антитела, представленные в коллекции, взаимодействовали с тремя штаммами гомологичного вируса С,. Антитела С2С5, С5СЗ, С6А6 отличали штаммы С,№564 и С,-ТЛ-112 от С, №65/67. Выявить антитела, которые реагировали бы с каким-либо из двух штаммов (С,№564 и С,-ТЛ-112 ), не удалось, но было отмечено, что титр трех антител (С5СЗ,

С2С4, С2С5) со штаммом вируса С,№564 и со штаммом С,-ТЛ-112 составлял 5,0 и 3,0 lg соответственно.

Были проведены исследования одиннадцати монокпональных антител, полученных на производственный штамм вируса ящура Азия-1 №48.

Результаты исследования взаимодействия монокпональных антител к вирусу ящура Азия-1 со штаммами вируса ящура в непрямом ИФА показали, что все исследованные монокпональные антитела были специфичны и активны с гомологичным вирусом. Часть МАТ взаимодействовала с гетерологичными антигенами: пять антителе вирусом ящура А2г. шесть -с вирусом С, и по одному - с О, и CAT-1. Четыре антитела из одинадцати обладали вируснейтрализующей активностью

Все нейтрализующие монокпональные антитела обладали высокой специфической активностью и не реагировали с гетерологичными антигенами. Четких внут-риштаммовых отличий с помощью указанных антител выявить не удалось.

Исследования монокпональных антител, полученных к 146S компоненту вируса ящура САТ-1 №96, показали, что все полученные МАТ обладали специфической активностью с гомологичным вирусом, но два антитела реагировали с вирусом О,, три - с С, и четыре МАТ реагировали с вирусом везикулярной болезни свиней. У исследованных антител не отмечено перекрестной активности с вирусом ящура А22 №550 и Азия-1 N248, а также с вирусом везикулярной экзантемы свиней.

Наибольшую диагностическую ценность , на наш взгляд, представляет МАТ NSB5, которое обладало строгой типоспецифической активностью и реагировало только с гомологичным штаммом вируса САТ-1 №96.

3.16 Изучение диагностической ценности моноклональных антител при разработке методов диагностики ящура и дифференциации вирусов.

Были проведены испытания препаратов моноклональных антител в лабораторной диажостике ящура и идентификации типов А, О, С, Азия-1, САТ-1 и вирусов ВБС и ВЭС, а также для дифференциации штаммов вируса в пределах одного иммунологического типа.

Кроме того монокпональные антитела были испытаны для обнаружения вируса ящура в объектах ветеринарного надзора (вода, сено, зернофураж, воздух).

В качестве препаратов МАТ использовали асцитическую жидкость мышей, содержащую эти антитела, очищенные аффинной хроматографией на белок А-сефарозе, а также их конъюгаты с пероксидазой хрена. При испытаниях монокло-нальных антител в диагностических целях оценивали специфичность и чувствительность методов выявления антигенов вируса ящура в исследуемых материалах и противоящурных антител в сыворотках крови животных с помощью ИФА. РИА, РСК, РДСК, РН и РЗ на мышатах-сосунах, РИФ и РКоА.

Взаимодействие МАТ с гомо- и гетерологичными антигенами проведено в разных вариантах иммуноферментного анализа. Подобран более надежный вариант постановки ИФА, сочетающий применение в качестве подложки поликлональ-ных антител, а в качестве детекторных - моноклональных антител в виде конъюга-тов. Подобраны МАТ, позволяющие выявить в пробе Знг вирусспецифического белка.

На основании проведенных исследований сделан вывод о возможности получения на основе МАТ строго типоспецифических диагностических моноклональных препаратов - реагентов ИФА. При этом целесообразно одновременное применеие поли- и моноклональных антител при выявлении и идентификации вируса ящура в ИФА при лабораторной диагностике вызываемого им заболевания.

Кроме того, получены положительные результаты при титровании противоящурных антител в сыворотке крови восприимчивых животных в ИФА вместо или наряду с традиционно применяемой реакцией нейтрализации.

3.17 Получение и характеристика моноклональных антител к вирусам везикулярной болезни свиней и везикулярной экзантемы свиней.

Полученные МАТ к возбудителям болезней, протекающих с везикулярнм синдромом (ВВС типы 0-72 и Т-75; ВЭС типы С-72 и А-48) пригодны для дифференциации возбудителей в модельном шифрованном опыте.

Моноклональные антитела против вирусов ВВС (типы 0-72 и Т-75) и ВЭС (типы С-72 и А-48) реагируют с антигенами гомологичного типа в разведениях, достаточных для идентификации возбудителей в афтозных и культуральных вируссо-держащих материалах.

При работе с шифрованными вируссодержащими препаратами показана высокая специфичность МАТ и целесообразность их применения для идентификации вирусов, вызывающих болезни, протекающие с везикулярным синдромом.

3.18 Получение и характеристика моноклональных антител к вирусу болезни Ауески

Изучение свойств МАТ, полученных на вирус болезни Ауески, штамм УНИИ-ЭВ-18В и оценка возможности их практического использования проведена в серии опытов с гетеро- и гомологичными антигенами. В качестве гетерологичных антигенов были испытаны возбудители ящура (A22№550 и Азия-1 №48), везикулярной болезни свиней (тип Т-75), диареи крупного рогатого скота. Полученные МАТ обладали вируснейтрализующей активностью и протективными свойствами на мышатах-сосунах, не взаимодействовали с гетерологичными антигенами, активность трех из них с гомологичными антигенами была неодинаковой.

Дифференциировать штаммы и изоляты ВБА с помощью МАТ возможно по уровню их активности. Наиболее узким спектром взаимодействия обладает МАТ 1В4, которое наиболее активно реагирует со штаммами УНИИЭВ-18В и БРАН, что вероятно свидетельствует о высокой степени родства вышеуказанных антигенов.

MAT 1С4 наиболее активно реагирует с антигенами ВБА штаммов УНИИЭВ-18В, БРАН и БРУК-628, а MAT 1С6 в равной степени взаимодействует со всеми испытанными штаммами возбудителя, что свидетельствует о наличии общего эпи-топа на вирионе вышеуказанных штаммов. Результаты исследований штаммов и изолятов вируса болезни Ауески с помощью МАТ и ИФА подтверждены работой В.А.Мищенко и соавт. (1996), проведенной с поликлональными сыворотками в РН, где производственный штамм УНИИЭВ-18В и БРАН имеют достаточную степень родства. В то же время исследованиями А.П.Аминева и соавт. (1996) с помощью рестрикционного картирования генома обнаружили различия в структуре возбудителя , что позволило отнести штаммы УНИИЭВ-18В и БРАН в разные подгруппы по принятой европейской классификации генома вируса. Проведенные работы по получению МАТ и применению их для диагностики и эпитопного картирования возбудителя свидетельствуют о перспективности исследований в этом направлении.

3.19 Получение и характеристика моноклональных антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней

Моноклональные антитела к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС) были получены для оценки возможности их практического применения при выявлении специфического антигена РРСС в патологическом материале от павших или вынужденно убитых животных, а также при выявлении противовирусных антител в сыворотке крови от больных и переболевших животных, т.к. при использовании в качестве реагентов ИФА поликпональных сывороток отмечалась неспецифическая реакция с большинством испытуемых проб.

Возникшие трудности при наработке и выделению высококачественного антигена РРСС, необходимого на всех этапах получения и тестирования МАТ, были преодолены за счет разработки и адаптации к условиям лаборатории методы наработки и выявления вируса РРСС на легочных альвеолярных макрофагах поросят. Проведено изучение свойств 5 МАТ, полученных на изолят вируса РРСС №9182/93, выделенного от больных свиней в Курской области (В.А.Мищенко и соавт 1994) и взаимодействие их со штаммом "1е1уБ(асГ.

Активность полученных МАТ с вирусом РРСС (изолят "Курский" была приблизительно такой же, как со штаммом "1_е1уз1асГ). Однако с помощью МАТ 1Д2 и 2ДЗ можно было отличить степень взаимодействия указанных антител, активность этих МАТ с гомологичным антигеном была существенно выше, чем с гетерологич-ным штаммом "Лелистад", который используется в нашей стране в качестве производственного при изготовлении вакцин против РРСС (А.А.Гусев и соавт., 1997).

Таким образом, использование МАТ, обладающих высокой специфической активностью, создают предпосылки для разработки диагностических препаратов нового поколения, помогут частично заменить поликлональные антисыворотки и ювысить эффективность проводимых анализов полевых изолятов.

3.20 Использование моноклональных антител для совершенствования методов лабораторной диагностики ящура

Для анализа возможности использования моноклональных антител, полученных к возбудителям болезней, протекающих с везикулярным синдромом (ВЯ типов О, С, Азия-1, САТ-1, ВВС, ВЭС), а также к вирусам болезни Ауески и репродук-

тивно-респираторного синдрома свиней, проведены испытания препаратов антител для лабораторной диагностики указанных болезней, а также идентификации штаммов вируса в пределах одного иммунологического типа в ИФА.

В качестве диагностических препаратов МАТ использовали асцитическую жидкость мышей, содержащую эти антитела, очищенные аффинной хроматографией на белок А-сефарозе. а также их конъюгаты с пероксидазой хрена. В результате очистки и концентрирования препаратов происходило повышение активности МАТ на 0,7-2,8 lg, т.е. в 5-20 раз. При конъюгировании с пероксидазой активность большинства препаратов МАТ снижалась на 0,7 lg. Но на некоторые антитела процесс конъюгирования влияния не оказывал, а в ряде случаев активность антител даже увеличилась, что можно объяснить особенностью самих антител.

Проведено испытание препаратов МАТ в объектах ветеринарного надзора (вода, воздух, зернофураж) и пробах, содержащих антигены ВЯ различного происхождения. На основании исследований и комиссионных испытаний сделано заключение, что МАТ пригодны для индикации ВЯ в объектах ветеринарного надзора, как при определении вида возбудителя и его дифференциации от возбудителей других везикулярных болезней, так и при типизации вируса ящура.

При выявлении противовирусных антител в сыворотке крови сельскохозяйственных животных наиболее оптимальным оказался жидкофазный вариант ИФА, позволяющий сохранять нативную конформацию вирусных частиц, который можно использовать вместо или наряду с традиционно используемой реакцией нейтрализации.

Для оценки коррелятивной зависимости результатов титрования противоя-щурных антител в жидкофазном ИФА с помощью диагностического набора на основе МАТ и РН было исследовано 1200 проб сыворотки крови крупного рогатого скота разного возраста ( от 1 до 7 лет), отобранных в различные сроки ( от 10 дней до 12 месяцев) после вакцинации животных би- (А,О) и трехвалентной (А,О,С) вакциной против ящура. РН ставили на мышатах-сосунах против 1000ЛД5о/0,1мл гомологичного вируса. Оценку существенности различий проводили методом критерия знаков на ЭВМ типа IBM PC.

Проведенные исследования показали, что коэффициент парной корреляции результатов титрования антител, проведенных обоими методами был достаточно высок и составлял 0,833-0,922.

3.21 Разработка диагностических наборов на основе поли- и моноклональных антител для определения типов вируса ящура и противоящурных антител

Проведено изучение диагностической ценности МАТ и определение их места в схеме лабораторной диагностики ящура с помощью реакции иммунофлуорес-ценции (РИФ), коагглютинации (РКоА) и иммуноферментного анализа. Полученные данные свидетельствуют о возможности получения на основе МАТ строго типоспе-цифичных в ИФА , РИФ и РКоА диагностикумов. Помимо специфичности изучена чувствительность в ИФА с участием МАТ в сравнении с поликлональными антисыворотками.

Установлено, что наиболее специфичным является вариант ИФА с использованием системы МАТдпя улавливания и детекции антигенов вируса.

Несколько менее специфичным оказался вариант, в котором улавливающими были поликлональные антитела (ПАТ), а детекторными МАТ. Наименее ;пецифичен вариант ИФА с использованием только ПАТ. Хотя среднее значение выявляемого МбБ антигена в системе с ПАТ составляло 4 нг в анализируемом збъеме.

Чувствительность варианта с МАТ варьировала в зависимости от клона гмб-зидомы в диапазоне от 400 до 3 нг/мл. Следовательно, использование некоторых слонов МАТ позволяло выявлять гомологичный вирус с такой же чувствительностью, :ак в варианте только с ПАТ. Но такое сочетание давало узкую специфичность *1ФА, что ограничивало целесообразность его практического применения.

Вариант, сочетающий поли- и моноклональные антитела по чувствительности анимали промежуточное положение . В то же время по специфичности оказался ¡олее надежным, в нем улавливающими были поликлональные антитела, а де-екторными - МАТ. Сделан вывод о целесообразности одновременного применения оли- и моноклональных антител при выявлении и идентификации ВЯ с помощью 1ФА при лабораторной диагностике вызываемого им заболевания, а также индика-

ции в объектах ветеринарного надзора. Так, конъюгаты МАТ к ВЯ О, №194 позволяли успешно выявлять вирус в воде, воздухе и зернофураже.

Для идентификации штаммовой принадлежности возбудителей в ИФА составлена коллекция МАТ к ВЯ пяти типов (А, О, С, Азия-1 и САТ-1), возбудителям ВВС, ВЭС, ВБА. РРСС. Разработаны диагностические наборы на основе поли- и моно-кпональных антител, пригодные для обнаружения вируса ящура типов А, О, С, Азия-1 и САТ-1, а также антител в сыворотках крови восприимчивых животных.

Наборы прошли апробацию в лабораториях эпизоотологии и диагностики ВНИЯИ (ВНИИЗЖ) в 1989 и 1997 гг., в лаборатории диагностики Среднеазиатского филиала ВНИЯИ ( 1991г.), а также в лаборатории инструментальных методов контроля и лиофилизации ВГНКИ.

В результате проведенных межлабораторных, межинститутских и межведомственных испытаний диагностические наборы на основе МАТ пригодны для обнаружения ВЯ в шифрованных материалах и объектах ветеринарного надзора, а также противоящурных антител в сыворотке крови сельскохозяйственных животных.

ВЫВОДЫ

I. Усовершенствованы методики наработки, выделения и очистки вирусных анти-енов, пригодных для иммунизации мышей линии ВА1_В/с, скрининга позитивных слонов гибридных клеток и постановки иммунохимических реакций с монокпональ-ными антителами.

Получены гибридомы-продуценты моноклональных антител и отобраны их наиболее перспективные клоны, синтезирующие антитела к возбудителям ящура, ВВС, ЗЭС и болезни Ауески, обладающие высокой стабильностью и антителопродуци-эующей активностью

3. Получены монокпональные антитела к возбудителям болезней с везикулярным ;индромом (ящуру, его фрагментам и синтетическим пептидам, ВВС, ВЭС), болезни Ауески, репродуктивно-респираторного синдрома свиней. Изучены их биологи-■)еские свойства в различных иммунохимических реакциях с гомо- и гетерологичны-ии антигенами и их производными. Создана коллекция штаммов гибридом, секре-гирующих монокпональные антитела к возбудителям ящура штаммов А5, А22, О, Зь Азия-1, САТ-1; ВВС; ВЭС; болезни Ауески и репродуктивно-респираторного синдрома свиней.

1 Разработаны методы выделения специфических иммуноглобулинов, и на их эснове получены жидкие и лиофилизированные препараты моноклональных антител и их конъюгаты с пероксидазой хрена, при годные для идентификации вирусов л противовирусных антител в сыворотках крови сельскохозяйственных животных, а гакже для изучения антигенной структуры вирусных частиц, их фрагментов и синтетических пептидов.

5. Установлено, что монокпональные антитела могут сохранять свои биологиче-;кие свойства не менее года при температуре +4°С и более года при отрицательных температурах.

6. Составлена коллекция моноклональных антител, полученных на производственные штаммы вируса ящура А22 №550, О, №194, О, №1618, С, №564, Азия-1 №48 и САТ-1 №96, обладающие высокой штаммоспецифической активностью, пригодных для использования в составе диагностических наборов с применением ИФА.

7. Разработаны и успешо прошли комиссионную апробацию наборы на основе поли- и моноклональных антител к вирусу ящура штаммов А5, А22, О,, С,, Азия-1 и САТ-1 для:

-обнаружения возбудителя в патологическом материале и объектах ветеринарного надзора в ИФА, позволяющие выявлять в испытуемых образцах 1-10 нг/мл вируса;

-определения противоящурных антител в сыворотке крови сельскохозяйственных животных в жидкофазном варианте ИФА, который может быть использован вместо или наряду с традиционно-применяемой реакцией нейтрализации. Коэффициент корреляции между титрами антител в этих реакциях составил 0,8330,922.

8. Разработана схема идентификации антигенных детерминант вируса ящура , предусматривающая характеристику сайтов связывания моноклональных антител по их активности с гомо- и гетерологичными антигенами в реакции нейтрализации и в различных вариантах иммуноферментного анализа.

9. Изучены антигенные детерминанты вируса ящура пяти типов с помощью моноклональных антител, полученных на 146S, 12S частицы и синтетический пептид (141-160) -фрагмент белка VP1 вируса ящура А22 №550, а также на 146S компонент вируса О, №194, О, №1618, С, №564, Азия-1 №48 и САТ-1 №96.

10. Обнаружено на поверхности 146S частиц вируса ящура А22 №550 шесть сайтов связывания, О, №194 - восемь, Ci - семь, Азия-1 - семь и САТ-1 - шесть сайтов связывания моноклональных антител. На поверхности 12S частиц вируса ящура

А22 N3550 идентифицировано 3 различных сайта связывания антител, два из которых являются высококонсервативными и экспонированы на вирионах пяти изученных типов вируса

11. Построена модель взаимного расположения эпитопов на поверхности частиц вируса ящура О, №194, С, №564, Азия-1 №48, САТ-1 №96.

12. Усовершенствован метод постановки ИФА с использованием заранее сенсибилизированных планшетов, позволяющий в течение трех часов провести иммуно-ферментный анализ с применением моноклональных антител на наличие возбудителей в патматериале и объектах ветеринарного надзора, а также противовирусных антител в сыворотке крови сельскохозяйственных животных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. На основании проведенных исследований разработаны и предлагаются для практики:

-"Регламент на диагностические наборы для определения типов вируса ящура в ИФА на основе поли- и моноклональных антител", утвержд. ГУВ МСХ 25.02.1991г.;

-"Методика получения и поддержания гибридных клеток, секретирующих мо-ноклональные антитела к вирусу ящура", утвержд. директором ВНИЯИ 28.11.1986г.;

-"Методика по длительному сохранению при -196°С миеломных клеточных линий и гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к 1468 компоненту вируса ящура А22", утвержд. директором ВНИЯИ 18.11.1987г.;

-"Методика очистки и концентрирования моноклональных антител против вируса ящура типов А и О из асцитов и культуральных жидкостей", утвержд. директором ВНИЯИ 08.09.1988г.;

-"Метод обработки результатов титрования иммунной сыворотки в непрямом твердофазном иммуноферментном тесте с постоянной дозой иммобилизованного антигена", утвержд. директором ВНИИЗЖ 26.02.1993г.;

-"Методика идентификации антигенных сайтов на поверхности частиц вируса ящура с использованием моноклональных антител в иммуноферментном анализе", утвержд. директором ВНИИЗЖ 18.08.1993г.;

-" Методика выделения моноклональных антител из асцитической жидкости мышей с использованием аффинной хроматографии и их конъюгирования с пе-роксидазой хрена", утвержд. директором ВНИИЗЖ 18.08.1993г.;

-"Методика получения высокоочищенных концентратов вируса везикулярной болезни свиней и вируса везикулярной экзантемы свиней", утвержд. директором ВНИИЗЖ 26.03.1993г.;

-"Методика получения и поддержания гибридных клонов, секретирующих мо-ноклональные антитела к вирусу ящура Азия-1", утвержд. директором ВНИИЗЖ 22.03.1994г.;

-"Методические указания по выделению вирусов на альвеолярных макрофагах поросят", утвержд. директором ВНИИЗЖ 22.03.1994г.;

-"Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L.. используемый для получения монокпональных антител к вирусу ящура типа А22. Авторское свидетельство №1489177, приоритет от 05 05.1987г.

-"Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L , продуцирующих моноклональные антитела к 146S компоненту вируса ящура А5 (Алье)". Авторское свидетельство №1731202, приоритет от 02.01.1991г.

-"Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L , - продуцент монокпональных антител к вирусу ящура Oi №1618". Приоритет от 26.10.1987г. а-О. //.■>

-" Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., - продуцент монокпональных антител к 146S компоненту вируса ящура О/'. Авторское свидетельство №1692146, приоритет от 08.06.1989г.

-" Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., - продуцент моноклональных антител к 146S компоненту вируса ящура С,№ 564". Авторское свидетельство N21692147, приоритет от 08.06.1989г.

-" Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., - продуцент моноклональных антител к 146S компоненту вируса ящура Азия-1". Патент на изобретение №2012594, приоритет от 01.07.1991г.

-" Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., - продуцент моноклональных антител к вирусу болезни Ауески штамм УНИИЭВ-18В". Патент на изобретение №2092554, приоритет от 19.04.1995г.

"Штамм гибридных культивируемых клеток, продуцирующих моноклональные антитела к вирусу везикулярной болезни свиней штамм Т-75." Положительное решение ВНИИГПЭ на выдачу патента РФ, приоритет от 11.08.1997г.

-"Штамм гибридомы GVBAU-94, продуцирующий моноклональные антитела к вирусу болезни Ауески". Свидетельство о депонировании NaBCKK (П) -642Д от 23.06.1994г.

-"Штамм гибридом VBS №1-96, продуцирующий моноклональные антитела к вирусу везикулярнйо болезни свиней штамм Т-75". Свидетельство о депонировании №ВСКК(П) -647Д от 13.05.1996г.

-"Штамм гибридомы N210 ГПЯ 0\/А-90, продуцирующий моноклональные ан-тиетла к пептиду 141-160 белка \/Р1 вируса ящура А22". Свидетельство о депонировании №ВСКК(П) -514Д от 29.01.91г.

-"Штамм гибридомы N212 ГПЯ КШ-90, продуцирующий моноклональные ан-тиетла к пептиду 145-155 белка \/Р1 вируса ящура А22". Свидетельство о депонировании №ВСКК(П) -513Д от 29.01.91г.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гпобенко Л.А., Манин Б.Л., Бурдов А.Н., Худяков Г.А., Давыдова Н.Л, Ма-маткупова Л. У. Поддержание и длительное сохранение перевиваемых клеток мышиной миеломы//Акт. пробл. вет. вирусол.: Тез. докл. науч. конф. ВНИЯИ.-Владимир, 1986.-С.23-24.

2. Бурдов А.Н., Худяков Г.А., Глобенко Л.А., Давыдова Н.Л., Шоршнев В.И. Разработка методов получения гибридомных клонов, продуцирующих монокло-нальные антитела //Протокол научно-коорд. совещ. стран-членов СЭВ, ЧССР.-Усти-на-Лабе, 1986,- С.33-37

3. Худяков Г.А., Манин Б.Л., Глобенко Л.А., Давыдова Н.Л., Бурдов А.Н. Использование этиленгликоля при криоконсервировании гибридом// Протокол 2-го симпозиума стран-членов СЭВ по пробл. "Профилакт. и эфф. борьба с ящуром".-НРБ.-София, 1987, C.4ib

4. Глобенко Л.А., Саарма М.Ю., Неуман Т.Э., Давыдова Н.Л., Бурдов А.Н., Худяков Г.А., Маматкулова Л.У., Пономарев А.П. Получение моноклональных антител к 146S компоненту вируса ящура А22 //Акт. пробл. вет. вирусол.: Тез. докл. науч. конф. ВНИЯИ.-Владимир, 1987. -Ч.2,-С.16-17.

5 .Давыдова Н.Л., Глобенко Л.А., Бурдов А.Н., Худяков Г.А. Оптимизация схемы иммунизации мышей линии BALB/c 146S антигеном вируса ящура для получения гибридом //Акт. пробл. вет. вирусол.: Тез. докл. науч. конф. ВНИЯИ.-Владимир, 1987,-4.1.-С.35-36.

6. Гпобенко Л.А., Давыдова Н.Л., Худяков Г.А., Бурдов А.Н.. Иванющенков В.Н.. Ковалева И.А., Карачевцева В.И. Видовая идентификация производственных мие-ломных линий ПАИ-85 и изучение условий её поддержания //Акт. пробл. вет. вирусол.: Тез. докл. науч. конф. ВНИЯИ.-Владимир, 1987,- Ч.1.- С.49-50.

7. Неуман Г.Э., Глобенко Л.А.. Давыдова Н.Л., Пономарев А.П.. Шоршнев В И., Бурдов А Н., Худяков Г.А., Саарма М.Ю. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., используемый для получения моноклональных антител к вирусу ящура типа А22: А. с. 1489177 СССР. Приоритет 05.05.1987.

8. Глобенко Л.А., Давыдова Н.Л., Иванющенков В.Н., Бурдов А.Н., Кирюхин С.Р. Клонирование гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела

против вируса ящура // Акт. пробл. вет. вирусол.: Тез. докл. науч. конф., ВНИЯИ.-Владимир, 1988. -Ч. 1.-С. 15-16.

9. Сатина Т.А.. Окулова О.Н., Кожаева Г.И., Глобенко Л.А., Давыдова Н.П., Камалова Н.Е., Перевозчикова H.A.. Иванющенков В.Н., Шажко Ж.А. Очистка и концентрирование моноклональных антител против вируса ящура типов А22 и О, // Акт. пробл. вет. вирусол.: Тез. докл. науч. конф., ВНИЯИ.-Владимир, 1988. -Ч.1.- С.17.

10. Шажко Ж.А., Камалова Н.Е., Давыдова Н.П., Глобенко П.А., Иванющенков

B.Н. Сравнительная оценка диагностичческой ценности ИФМ с использованием моно- и поликлональных антительных диагностикумов при ящуре II Акт. пробл. вет. вирусол.: Тез. докл. науч. конф., ВНИЯИ.-Владимир, 1988. -Ч. 1.-С.53-54.

11. Глобенко П.А., Давыдова Н.Л., Иванющенков В.Н., Бурдов А.Н., Худяков Г.А., Молчанова А.И., Кирюхин С.Р. Изучение в иммунологических реакциях активности моноклональных антител против авируса ящура О)//Акт. пробл. вет. вирусол.: Тез. докл. науч. конф., ВНИЯИ.-Владимир,1988.-4.1.-С.54-55.

12. Синякова О.Н., Глобенко П.А., Иванющенков В.Н., Рыбаков С.С., Кирюхин

C.Р., Молчанова А.И. Изучение моноклональных антител в радиоиммунологическом анализе к вирусу ящура О, №1618 // Акт. пробл. вет. вирусол.: Тез. докл. науч. конф., ВНИЯИ.-Владимир, 1988. 4.1.-С.55-56.

13. Перевозчиков В.А., Быкова Т.Н., Молчанова А.И., Холин Ю.А., Давыдова Н.П., Гпобенко Л.А., Иванющенков В.Н. Электронно-микроскопическое изучение взаимодействия моноклональных антител с вирусом ящура // Акт. пробл. вет. вирусол.: Тез. докл. науч. конф., ВНИЯИ.-Владимир,1988.-4.1.-С.56-57.

14. Глобенко Л.А., Давыдова Н.Л., Иванющенков В.Н., Бурдов А.Н., Худяков Г.А.. Молчанова А.И., Кирюхин С.Р. Опыт выращивания гибридом-продуцентов про-тивоящурных моноклональных антител II Акт. пробл. вет. вирусол.: Тез. докл. науч. конф., ВНИЯИ.-Владимир. 1988. Ч. 1.-С. 12-13.

15. Кожаева Г.И., Сатина Т.А., Молчанова А.И., Глобенко Л.А., Перевозчикова H.A., Иванющенков В.Н., Перевозчиков В.А. Применение ИФА для количественного определения 146S антигена вируса ящура в исследуемых материалах // Акт. пробл. вет. вирусол.: Тез. докл. науч. конф., ВНИЯИ.-Владимир, 1988. 4.2.-С.21-22.

16. Глобенко Л.А., Давыдова Н.Л., Неуман Т.Э., Саарма М.Ю., Бурдов А.Н., Пономарев А.П., Маматкулова Л.У., Худяков Г.А. Штамм гибридных культивируе-

мых клеток животных Mus musculus L- продуцент моноклональных антител к вирусу ящура О, №1618: A.c. 1565021 СССР. Приоритет 26.10.87.

17. Глобенко Л.А., Бурдов А.Н., Иванющенков В.Н., Худяков Г.А., Давыдова Н.Л., Кирюхин С.Р., Молчанова А.И., Чепуркин A.B. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L.- продуцент моноклональных антител к 146S компоненту вируса ящура О, : A.c. 1692116 СССР. Приоритет 08.06.1989.

18. Глобенко Л.А.. Бурдов А.Н., Иванющенков В.Н., Худяков Г.А., Саарма М.Ю., Давыдова Н.Л., Кирюхин С.Р., Молчанова А.И., Аминева С.П. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L.- продуцент моноклональных антител к 146S компоненту вируса ящура С, №564: A.c. 1692117 СССР. Приоритет 08.06.1989.

19. Глобенко Л.А., Кирюхин С.Р., Давыдова Н.П., Баранов С.Г., Маматкулова Л.У., Иванющенков В.Н., Дудников А.И. Сравнительное изучение влияния некоторых сенсибилизирующих агентов на образование асцитных опухолей у мышей при получении противоящурных моноклональных антител //Матер, семинара стран-членоь СЭВ. Разработка и использ. новых адъювантов для биотех. целей.-Владимир, 1990.-С. 13-14.

20. Глобенко Л.А., Давыдова Н.Л., Кирюхин С.Р., Аминева С.П., Иванющенков В.Н., Худяков Г.А., Бурдов А.Н. Изучение основной нейтрализующей детерминанты вируса ящура Oi с помощью моноклональных антител // Совр. пробл. иммунол., биотехн., генной и клеточной инженерии в вет. медицине.: Тез. докл.- Н.Новгород, 1990.-С.31-32.

21. Давыдова Н.Л., Аминева СЛ., Глобенко Л.А., Маматкулова Л.У., Иванющенков В.Н. Активность противоящурных моноклональных антител в различных вариантах иммуноферментного анализа // Совр. пробл. иммунол., биотехн., генной и клеточн. инженерии в вет. медицине: Тез. докл.-Н.Новгоров, 1990.-С.37-38.

22. Аминева СЛ., Давыдова Н.Л., Глобенко Л.А., Иванющенков В.Н., Перевозчиков В.А. Оптимизация условий афинной хроматографии мышиных моноклональных антител на белок-А сефарозе // Акт. пробл. вет. вирусол.: Тез. докл. конф. мо-подых ученых ВНИЯИ.-Владимир, 1990.-С.57-58.

23. Давыдова Н.Л., Аминева С.П., Кирюхин С.Р., Гпобенко Л.А. Конкурентный анализ связывания моноклональных антител с антигенами вируса ящура О, // Акт.

пробл. вет. вирусол.: Тез. докл. конф. молодых ученых ВНИЯИ.-Владимир, 199 С.58-59

24. Мудрак Н.С., Давыдова Н.Л.. Гпобенко Л.А., Дрягалин H.H., Чепуркин А. Молчанова А.И. Использование белок А-сефарозы для выделения иммуноглобуг нов, иммунизированных синтетическим пептидом // Акт. пробл. вет. вирусол.: Т( докл. конф. молодых ученых ВНИЯИ.-Владимир, 1990.-С.64-65.

25. Глобенко Л.А., Давыдова Н.Л., Иванющенков В.Н., Аминева С.П., Перевс чиков В.А., Бурдов А.Н. Анализ антигенных детерминант вируса ящура А22 с г мощью моноклональных антител II Вет. медицина, экономич. соц. и эколог, проб. Тез. докл. Республ. конф.-Харьков. 1990.-С.255-256.

26. Глобенко П.А., Давыдова Н.Л., Иванющенков В.Н., Аминева С.П., Перевс чиков В.А., Бурдов А.Н. Анализ антигенных детерминант вируса ящура А22 с п мощью моноклональных антител II Иммунология,- 1991,- №1.-С.66-68.

27. Гпобенко Л.А., Давыдова Н.Л. Получение противоящурных моноклонаг ных антител и изучение их свойств // К новой стратегии борьбы с ящуром: Тез. доь междунар. конф.-Владимир, 1991.-С.122-124.

28. Рахмангулов М.Т., Кулаков В.Ю.. Черняев Ю.А., Быкова Т.Н., Красотки,

A.C., Глобенко Л.А., Маматкулова Л.У. Сравнительная оценка антигенности cei штаммов вируса ящура типа САТ-1 // Вопр. вет. вирусол., микробиол. и эпизоо Матер, науч. конф. ВНИИВВиМ.-Покров, 1992,-4.1.-С. 182-183.

29. Давыдова Н.Л., Гпобенко ПЛ., Кирюхин С.Р., Спирин В.К, Баранов С Получение и характеристика моноклональных антител к вирусу ящура А5 "Алье" Вопр. вет. вирусол., микробиол. и эпизоот.: Матер, науч. конф. ВНИИВВиМ.-Покрс 1992,- 4.2.-С.351.

30. Гпобенко Л.А., Давыдова Н.Л. Получение противоящурных моноклонаг ных антител и изучение их свойств //Ящур. К новой стратегии борьбы с ящуроп Владимир, 1992.-Ч.2.-С.94-104.

31. Глобенко Л.А., Кирюхин С.Р., Аминева С.П., Давыдова Н.Л., Перевозчик

B.А., Луговской A.B., Рыбаков С.С. Моноклональные антитела на синтетическ! пептид -фрагмент VP1 вируса ящура А22 // Тез. докл. Первого съезда иммунолоп России - Новосибирск, 1992.-С.107-108.

32. Глобенко Л.А.. Бурдов А.Н., Иванющенков В.Н., Худяков Г.А, Давыдова Н.Л., Кирюхин С.Р., Баранов С.Г., Молчанова А.И., Кожаева Г.И., Спирин В.К. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L.,- продуцент монокпо-нальных антител к 146S компоненту вируса ящура А5 -Алье: A.c. 1751202 СССР. Приоритет 01.04.1992.

33. Бусол В.О., Стегнш Б.Т., Соловйов С. Т., Соповйова Л.Р., Рибаков С.С., Перевозчтов В.А., Глобенко Л.О., Кирюх'м С.Р. Удосконалення методу очистки анти-гешв Bipycy лейкозу велико! poraToi худоби//Бютехн. вет. препар.: Матер, науково-практ. конф,- Харюв, 1993.- С.3-4.

34. Бусол В.О., Стегнш Б. Т., Соловйов С.Т., Глобенко Л.О., Красотмна A.C., Юрюх'м С.Р., Молчанова A.I., Камалова Н.Е., Рибаков С.С., Петров В.М. Одержання i вивчення властивостей моноклональных антитт до Bipycy лейкозу велико! poraToi худоби // Бютехн. вет. препар.: Матер, науково-практ. конф.- Харьюв, 1993.-С.6-8.

35. Стегнш Б. Т., Бусол В.О., Берус Б. Т., Бтоус A.M., Сукач О.М., Глобенко Л.О. Дослщжения дихально1 активное^ кл1минних культурб яки використовуються в бютехнологм // Бютехн. вет. препар.: Матер, науково-практ. конф,- Харьюв, 1993 -С.62-63.

36. Глобенко Л.О., Красотюна A.C., Маматкулова Л.У., Круглоголова Т.М., Карпова 1.П., Гamina Е.В. Вщчення штам1в Bipycy ящуру САТ-1 за допомоглю моно-клональних антитт // Бютехн. вет. препар.: Матер, науково-практ. конф,- Харьюв, 1993,- С.72.

37. Глобенко Л.О., Красотюна A.C., Юрюхт С.Р., AMiHeea С.П. Застосування моноклональних антитт при разробц1 молекулярно-бюлопчних метод1в вивчения структуры eniToniB Bipycy ящуру С, // Бютехн. вет. препар.: Матер, науково-практ. конф,-Харьюв, 1993.-С.73.

38. Стегнш Б.Т., Бтоус A.M.. Глобенко Л.О., Красотюна A.C., Юрюх'т С.Р. Оцтка ефективност! р1зних KpionpoTeKTopie для низькотемпературного консерву-вання мюломних лшш khîthh // Бютехн. вет. препар.: Матер, науково-практ. конф,-XapbKiB,1993.-C.79-80.

39. Глобенко Л.О., Красотюна A.C., Камалова Н.Е., Юрюхт С.Р., Рибаков С.С., Петров В.М., Галюна Е.В., Бусол S.O., Стегнш Б. Т., Соловйов С. Т. Розробка методу fliamocTHKH лейкозу В.Р.Х.З. використанням моноклональних антитт i синте-

тичних пептид|в// Бютехн. вет препар.: Матер, науково-практ. конф.- Харьюв, 1993. С98

40. Шажко Ж.А., Глобенко Л.О., Камалова Н.Е., Давидова Н.П., Карпова 1.П., KipioxiH С.Р.. Дудникова Е.К., Ам/нева С.П. Маматкупова Л.У. Розробка Haöopie дл? виявлення Bipyca ящура з допомогою 1ФА на ochobí moho- i пол1клональних антитт А Бютехн. вет. препар.: Матер, науково-практ. конф,-Харьюв, 1993,-С. 101.

41. Глобенко Л.А.. Маматкупова Л.У., Белокопытова А.Ф., Давыдова Н.Л., Аминева С.П., Молчанова А.И., Баранов С.Г., Бурдов А.Н., Худяков Г.А., Спирин В. К. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L.,- продуцент моноклональных антител к 146S компоненту вируса ящура Азия-1: Патент РФ №2012594. Приоритет 01.07.1991.

42. Аминева СЛ., Петров В.Н., Глобенко Л.А., Мищенко В.А., Рыбаков С.С. Моноклональные антитела и синтетические пептиды для диагностики лейкоза крупного рогатого скота // Вирусн. и микробн. болезни с.-х. ж-ных: Тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф.-Владимир, 1995,-С.35.

43. Аминева СЛ., Прохватипова Л.Н., Гпобенко Л.А., Мищенко В.А., Рыбаков С.С. Моноклональные антитела для определения специфической активности различных антигенов вируса лейкоза КРС в ИФА II Вирусн. и микробн. болезни с.-х. ж-ных: Тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф.- Владимир, 1995,- С.351.

44. Глобенко Л.А., Жбанова Т.В., Аминева СЛ., Мищенко В.А., Баборенко Е.П., Крахмапева Г.Н. Получение гибридом и моноклональных антител к вирусу болезни Ауески // Вирусн. и микробн. болезни с.-х. ж-ных: Тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф.-Владимир, 1995.-С.49.

45. Глобенко П.А., Красоткина A.C., Рыбаков С.С., Луговской А.Н., Кирюхин С.Р. Изучение антигенных детерминант вируса ящура О, с использованием моноклональных антител и синтетических пептидов // Вирусн. и микробн. болезни с.-х. ж-ных: Сб. науч. тр. ВНИИЗЖ.-Владимир, 1995 -С.32-42.

46. Рахмангулов М.Г., Кулаков В.Ю., Давыдов И.В., Глобенко Л.А., Красоткина A.C., Черняев Ю.А. Антиген - зависимая активность лимфоидных клеток и гуморальный иммунный ответ лабораторных животных на антигены вируса ящура II Вирусн. и микроб, болезни с.-х. ж-ных: Сб. науч. тр. ВНИИЗЖ..-Владимир,1995.-С.77-81.

47. Глобенко ПЛ., Красоткина A.C., Молчанова А.И., Карпова И.П., Крутого-за Т.Н., Галкина Е.В. Изучение эпитопов вируса ящура Азия-1 и САТ-1 с по-щью моноклональных антител // Вирусн. и микробн. болезни с.-х. ж-ных: Сб науч.

ВНИИЗЖ.-Владимир, 1995.-С.7-18.

48. Мищенко В.А., Камалова Н.Е., Никитин В.А., Глобенко Л.А., Сатина Т.А. рактеристика штамма №9-18£/93 вируса релродуктивно-реслираторного синдро-

свиней // Вирусн. и микробн. болезни с.-х. ж-ных: Сб. науч. тр. ВНИИЗЖ.-адимир, 1995.-С. 104-108.

49. Гпобенко ПЛ., Крахмалева Г.Н., Камалова Н.Е., Мищенко В.А., Жбанова 3., Сатина Т.А. Получение и применение легочных альвеолярных макрофагов росят // Вирусн. и микробн. болезни с.-х. ж-ных: Тез. докл. Всерос. науч.-практ. нф. ВНИИЗЖ.-Владимир, 1995.-С.133.

50. Глобенко Л.А., Жбанова Т.В., Аминева С.П., Камалова Н.Е., Мищенко В.А. рактеристика моноклональных антител к вирусу болезни Ауески // Вирусн. и мик-бн. болезни с.-х. ж-ных: Тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф. ВНИИЗЖ,-|адимир,1995.-С.50.

51. Глобенко Л.А., Жбанова Т.В., Мищенко В.А., Крахмалева Т.Н., Камалова Е. Моноклональные антитела к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома иней // Вирусн. и микробн. болезни с.-х. ж-ных: Тез. докл. Всерос. науч.-практ. нф. ВНИИЗЖ.-Владимир, 1995.-С.51.

52. Фоменко В.Ю., Глобенко Л.А., Шажко Ж.А. Получение очищенных и кон-нтрированных препаратов вируса везикулярной экзантемы свиней // Общ. эпизо-ол., иммунол., экология, и методол. пробл.: Матер, междунар. науч. конф -фьков, 1995.-С. 527-528.

53. Фоменко В.Ю., Шажко Ж.А., Глобенко Л.А. Получение гибридом, секрети-кзщих моноклональные антитела к возбудителям везикулярной экзантемы свиней везикулярной болезни свиней II Общ. эпизоотол., иммунол., экологич. и методол. юбл.: Матер, междунар. науч. конф.-Харьков, 1995.-С.529-531.

54. Гпобенко Л.А., Жбанова Т.В., Мищенко В.А. Получение гибридом и моно-онагьных антител к вирусу болезни Ауески // Общ. эпизоотол., иммунол., эколо-ч. и методол. пробл.: Матер, междунар. науч. конф.-Харьков,1995.-С.525-526.

55. . Глобенко Л.А., Жбанова Т.В., Мищенко В.А. Изучение свойств монокло-нальных антител к вирусу болезни Ауески II Общ. эпизоотол., иммунол., экологич. и методол. пробл.: Матер, междунар. науч. конф.-Харьков, 1995.-С.263-264.

56. Гпобенко Л.А., Аминева С.П., Петров В.Н., Прохватипова Л.Н., Стеений Б.Т. Использование моноклональных антител для диагностики лейкоза крупного рогатого скота II Общ. эпизоотол., иммунол., экологич. и методол. пробл.: Матер, междунар. науч. конф.-Харьков, 1995.-С.240-243.

57. Глобенко Л.А., Жбанова Т.В., Камалова Н.Е., Мищенко В.А., Баборенко ЕЛ. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L.,- продуцирующий моноклональные антитела к вирусу болезни Ауески штамм УНИИЭВ-18В Патент РФ №2092554. Приоритет 19.04.1995.

58. Глобенко Л.А., Фоменко В.Ю., Шажко Ж.А., Дудников С.А., Жбанова Т.В. Получение гибридом и моноклональных антител к вирусу везикулярной болезни свиней II Пробл. инфекц. патол. с.-х. ж-ных:Тез. докл. конф.-Владимир, 1997.-С. 115-116.

59. Аминева СЛ., Давыдова Н.П., Маматкулова Л. У., Глобенко Л.А., Мищенко В.А. Получение и характеристика моноклональных антител к вирусу ящура типа Азия-1 // Биохимия.-1997.-№5.-С.550-555.

60. Камалова Н.Е., Дудников С.А., Никешина Т.Б.Лузанкова О.С., Быкова Л.А., Байбиков Т.З., Дрыгие В.В., Андреев В.Г., Гпобенко Л.А. Получение препаратов антигена вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС) на альвеолярных макрофагах II Пробл. инфекц. патол. с.-х. ж-ных: Тез. докл. конф.-Владимир, 1997.-С. 109-110.

61. Глобенко Л.А., Фоменко В.Ю., Жбанова Т.В., Шажко Ж.А., Дрыгин S.S., Дудников С.А. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L.- продуцент моноклональных антител к вирусу везикулярной болезни свиней штамм Т-75. Положительное решение ВНИИГПЭ о выдаче патента РФ от 11.08.97г.

Отпечатано на базе Отдела координации научных исследований. информации и международных связей ВНИИЗЖ.

Тира" 9С -экз. , май 1998 года