Разработка технологии приготовления сухих дозированных форм комплексного иммуноглобулинового препарата

Мелихова, Александра Вадимовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка технологии приготовления сухих дозированных форм комплексного иммуноглобулинового препарата
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии приготовления сухих дозированных форм комплексного иммуноглобулинового препарата"

9846617

На правах рукописи

Мелихова Александра Вадимовна

Разработка технологии приготовления сухих дозированных форм комплексного иммуноглобулинового препарата

03.01.06. Биотехнология 14.03.09 Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 2010

004601714

Работа выполнена в Федеральном Государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Козлов Леонид Васильевич

доктор медицинских наук, профессор Макаров Владимир Александрович

Алёшкин Владимир Андрианович Лютов Андрей Германович,

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится « /3» „«елиг*./ 2010г. в /О час. на заседании Диссертационного совета Д 208.046.01 при Федеральном Государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального Государственного учреждения науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Автореферат разослан« £ » О4 2010г.

, /? /

Ученый секретарь диссертационного совета,--'/ ^ /

доктор медицинских наук ¿Л/" С (■ О.Ю. Борисова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В настоящее время клиницисты уделяют все больше внимания иммуноглобулиновым препаратам. Этому способствует постоянно регистрируемый рост иммунодефицитных состояний, вызываемых неблагоприятным взаимодействием организма с внешней средой, и появлением резистентности микроорганизмов к антибиотикам. В этой ситуации к перспективным лечебным средствам относится уже существующий и показавший высокую эффективность при лечении диарейных заболеваний комплексный иммуноглобулиновый препарат (КИП) (Алешкин В.А, Лютов А.Г., 2003).

Комплексный иммуноглобулиновый препарат для парентерального применения был разработан на базе лаборатории биохимии МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского под руководством проф. Н. В. Холчева в 70-х годах (Борисова И.В., Холчев Н.В.,1986). В 90-х годах В.А. Алёшкиным было предложено перорапьное применение КИП, и препарат был внедрен в клиническую практику. В настоящее время КИП широко применяется для профилактики и терапии острых кишечных инфекций (ОКИ) и ряда других заболеваний (Алёшкин В.А., Борисова И.В., Феклисова Л.В.,1997).

Иммуноглобулины трех классов ^А, ^М, входящие в состав КИП,

обеспечивают его высокий терапевтический эффект при оральном и ректальном применении, что было убедительно продемонстрировано клиницистами в течение 20 лет. В связи с высоким уровнем заболеваемости ОКИ, участившимися тяжелыми и затяжными формами инфекционного процесса, комплексный иммуноглобулиновый препарат используется все шире. Есть данные о том, что КИП эффективен не только для детей первых лет жизни, как считалось ранее, но и для взрослых, имеется опыт применения при ОРЗ (Грачёва Н. М„ 2003).

В настоящее время КИП выпускается в единственной лекарственной форме в виде сухой субстанции в стеклянных флаконах. В связи с этим более перспективной лекарственной формой являются таблетки и капсулы, которые имеют ряд преимуществ: удобство применения, хранения и транспортировки; маскировка специфического вкуса сывороточных белков; возможность защиты от действия неблагоприятных факторов ЖКТ.

Существующая технология производства КИП характеризуется длительностью, многостадийностью и имеет ряд недостатков, делающих ее непригодной для приготовления твердых дозированных форм препарата. В частности, на стадии выделения иммуноглобулинов в качестве основного фракционирующего агента используется органический растворитель - хлороформ в концентрации, обусловливающей

необходимость соблюдения особых условий, усложняющих проведение процесса. Сублимационное обезвоживание препарата в стеклянных флаконах чрезмерно продолжительно (до 2 суток) и не предусматривает возможности получения сухой субстанции КИП в количествах, необходимых для производства твердых дозированных форм (таблетки, капсулы).

В последние годы особое внимание уделяется биологической безопасности препаратов, получаемых из биологических жидкостей человека, и методам их стерилизации. Наиболее экономически выгодным и наиболее щадящим из всех существующих методов стерилизации препаратов, признан метод с использованием у-облучения (Кузин A.M., Каушанский Д.А., 1981). Однако отсутствуют сведения о возможности применения его для обработки сухого КИП.

Все вышеизложенное свидетельствует об актуальности разработки усовершенствованной технологии получения комплексного иммуноглобулинового препарата и создания новых лекарственных форм.

Цель исследования: разработка технологии получения сухой субстанции КИП, пригодной для создания твердых дозированных лекарственных форм препарата, и оценка терапевтической эффективности КИП в таблетках и капсулах на обезьянах, страдающих ОКИ.

Задачи исследования:

1. Предложить критерии оценки качества осадков "Б", получаемых на различных предприятиях по производству иммуноглобулина по методу Кона, как исходного сырья для приготовления КИП.

2. Изучить возможность использования солей двухвалентных металлов для выделения фракций, содержащих три основных класса иммуноглобулинов, и предложить оригинальную технологию получения субстанции КИП.

3. Оценить возможность интенсификации процесса сублимационного обезвоживания КИП с подбором необходимых стабилизаторов для сохранности физических и биологических свойств полученного материала.

4. Исследовать возможность стерилизации субстанции КИП методом гамма-облучения, оценить его влияние на биологическую активность, микробиологическую чистоту и биологическую безопасность.

5. Изучить механическую устойчивость иммуноглобулинов в сухой субстанции и приготовить различные лекарственные формы препарата (во флаконах, таблетках и капсулах).

6. Провести оценку токсичности всех полученных лекарственных форм препарата КИП на мышах и изучить безвредность и лечебную эффективность на обезьянах, больных ОКИ.

Научная новизна

Впервые показано, что соли двухвалентных металлов могут быть использованы для одновременного выделения иммуноглобулинов трех основных классов ^О, ^А и ^М. При этом фракционирование возможно из концентрированных субстанций, к которым, в частности, относится осадок Б. Наиболее эффективным фракционирующим агентом с точки зрения полноты выделения антител и чистоты получаемой фракции является сульфат меди.

Экспериментально обоснован выбор из ряда веществ различной природы (сахара, аминокислоты) стабилизирующих компонентов, определены их сочетания и концентрации, оказывающие наибольший защитный эффект от действия на иммуноглобулины неблагоприятных факторов технологических процессов переработки сухой субстанции КИП, приготовления готовых форм препарата и их хранения.

Впервые показано, что повышение температуры греющей поверхности полки до 55°С на этапе сублимации влаги из лиофильно высушиваемого препарата не оказывает негативного влияния на специфические свойства иммуноглобулинов, что вносит коррективы в существующее представление об их слабой устойчивости к обезвоживанию.

Предложена стерилизация сухой субстанции КИП гамма-облучением. Доза поглощенной радиации 20 кГр вызывает, в зависимости от вида использованных защитных веществ, потерю антисальмонеллезной активности иммуноглобулинов на 1-3 двукратных разведения и может приводить к изменению соотношения классов иммуноглобулинов. Наибольший защитный эффект оказывает комбинация 1% глицина и 2% глюкозы.

Впервые проведенные исследования по созданию твердых дозированных форм КИП дают представление о степени механоустойчивоста антител в сухом состоянии. Установлено, что воздействие физико-механических факторов, возникающих в процессе разрушения сухой субстанции КИП при ее измельчении и в ходе прессования таблеточной смеси при изготовлении таблеток, сопровождается снижением специфической активности иммуноглобулинов не более чем на одно двукратное разведение, но не оказывает влияния на соотношение классов иммуноглобулинов в препарате.

В экспериментах на обезьянах, больных острой кишечной инфекцией с диарейным синдромом, впервые показано, что разработанные твердые дозированные формы КИП -таблетки и капсулы обладают терапевтической эффективностью, не уступающей таковой

препарата, выпускаемого в настоящее время в виде сухой массы во флаконах, и достоверно превосходят эффективность антибиотикотерапии.

Практическая значимость

Предложены критерии оценки осадков Б с целью их дополнительного использования в качестве сырья для производства комплексного иммуноглобулинового препарата.

Использование сульфата меди на стадии выделения иммуноглобулинов из осадка Б, как основного фракционирующего агента, а экстрагента липидов и липопротеидов -хлороформа в концентрации не более 1%, исключает необходимость соблюдения особых условий проведения процесса, что, в свою очередь, обеспечивает снижение трудоемкости и повышение рентабельности всей технологии приготовления препарата.

Экспериментально обоснованный выбор состава и концентрации защитных компонентов обеспечивает стабильность специфических свойств иммуноглобулинов во всех разработанных лекарственных формах препарата в течение более 2 лет хранения.

Интенсификация подвода тепла к высушиваемому препарату на этапе сублимации влаги позволяет сократить длительность не только этого этапа, но и всего процесса высушивания КИП в 2,7 раза до 14 часов.

Доказана принципиальная возможность использования у- стерилизации для иммуноглобулинсодержащих препаратов, что способствует расширению сферы применения данного метода.

Сухая субстанции КИП позволяет приготовить твердые дозированные формы препарата, что удобно в использовании и способствует расширению сферы его применения.

Лекарственные формы комплексного иммуноглобулинового препарата, приготовленные по разработанной технологии, показали эффективность лечения обезьян, больных диарейными заболеваниями, в питомнике ГУ НИИ медицинской приматологии РАМН. Рекомендовано проведение клинических испытаний готовых лекарственных форм комплексного иммуноглобулинового препарата - капсул, таблеток, флаконов на людях.

Внедрение результатов работы

На базе лаборатории медицинской биотехнологии ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора разработаны и приготовлены экспериментальные серии комплексного иммуноглобулинового препарата во флаконах, таблетках и капсулах.

На основании проведенных исследований оформлены шесть патентов на изобретения:

1. Патент РФ № 2189833, А61К 39/395. Способ получения иммуноглобулинового препарата / A.B. Зорик, В.А. Алешкин, А.Г. Лютов, И.В. Борисова. Зарегистрирован в

Государственном реестре изобретений Российской Федерации 19 октября 2000 г. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

2. Патент РФ № 2255766, МПК А61К 39/395. Способ получения иммуноглобулинового препарата для профилактики и терапии бактериальных и вирусных инфекций, иммуноглобулиновый препарат для профилактики и терапии бактериальных и вирусных инфекций (варианты) и суппозитории на основе иммуноглобулинового препарата / Алешкин В.А., Новикова Л.И., Афанасьев С.С., Борисова И.В., Зуева М.М., Зорик A.B. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 5 марта 2003 г. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

3. Патент РФ № 2247578, МПК А61К 39/395. Состав, обладающий противомикробным действием / Мелихова A.B., Алешкин В.А., Давыдкин В.Ю., Давыдкин И.Ю., Афанасьев С.С., Борисова И.В., Рубальский О.В., Гаврин А.Г. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10 марта 2005 г. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

4. Патент РФ № 2334503, МПК A61J 3/10. Способ таблетирования медицинских иммунобиологических препаратов / Давыдкин И.Ю., Алешкин В.А., Давыдкин В.Ю., Рубальский О.В., Гаврин А.Г., Мелихова A.B., Афанасьев С.С. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 сентября 2008 г. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

5. Патент РФ № 2371200, МПК А61К 39/395. Способ получения иммуноглобулинового препарата / Мелихова A.B., Давыдкин В.Ю., Алешкин В.А., Давыдкин И.Ю. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 октября 2009 г. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

6. Патент РФ № 2371199, МПК А61К 39/395. Способ получения иммуноглобулинового препарата / Мелихова A.B., Давыдкин В.Ю., Алешкин В.А., Давыдкин И.Ю. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 октября 2009 г. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

Результаты исследований используются в научно-практической работе ФГУН МНИИЭМ им.Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

Экспериментальные серии препаратов КИП прошли успешные испытания при лечении больных ОКИ обезьян в питомнике ГУ НИИ медицинской приматологии РАМН

(г. Сочи - Адлер) под руководством академика РАМН, профессора Б.А. Лапина и доктора медицинских наук, профессора Э.К. Джикидзе. Оформлен акт о доклинических испытаниях от 9 апреля 2009 г.

Метод определения ионов меди используется в лаборатории медицинской биотехнологии ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора с 2001 года для определения качества комплексного иммуноглобулинового препарата.

Методика доклинических испытаний биопрепаратов, разработанная в ходе выполнения работы совместно с сотрудниками ГУ НИИ медицинской приматологии РАМН, легла в основу разработки «Новые алгоритмы доклинических испытаний неинъекционных иммунобиологических препаратов и БАД», награжденной серебряной медалью VII Московского международного салона инноваций и инвестиций на ВВЦ (Москва) в 2007 г.

Положения, выносимые на защиту:

1. Критериями качества осадков Б как сырья для производства комплексного иммуноглобулинового препарата являются концентрации общего белка и иммуноглобулинов, распределение иммуноглобулинов по классам IgG, IgA, IgM, титр антител к сальмонеллам, а также производный показатель, характеризующий долю иммуноглобулинов от общего белка.

2. Разработанный способ получения комплексного иммуноглобулинового препарата включает последовательную обработку гомогенизата осадка Б (III фракция по Кону) хлороформом и сульфатом меди, выделение иммуноглобулиновой фракции методом ультрафильтрации в присутствии комплексообразующего соединения с последующим концентрированием и возможным осаждением фракции полиэтиленгликолем, растворение осадка иммуноглобулинов, стабилизацию и стерилизующую фильтрацию.

3. Сухая субстанция комплексного иммуноглобулинового препарата пригодна для приготовления капсульной и таблетированной форм с использованием метода стерилизации у-облучением.

4. Комплексный иммуноглобулиновый препарат во флаконах, таблетках и капсулах, приготовленный по разработанной технологии с использованием в качестве фракционирующего агента сульфата меди, нетоксичен, безвреден и обладает терапевтическим эффектом при лечении острой кишечной инфекции с диарейным синдромом у обезьян.

Апробация работы

Диссертация апробирована на заседании секции Ученого Совета ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора «Медицинская биотехнология», протокол № 3 от 10 июня 2009 г.

Основные положения диссертационной работы доложены на: Российской конференции "Организм и окружающая среда: жизнеобеспечение и защита человека в экстремальных условиях", Москва, 2000; научно-практической конференции «Медицина будущего», Краснодар-Сочи, 2002; Международной научно-практической конференции памяти Г.И.Гончаровой «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования», Москва, 2002; IX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2002; 1-м международном Конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития», Москва, 2002; Третьей международной конференции, посвященной 80-летию института имени Пастера, «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», Санкт-Петербург, 2003; Научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения», Москва, 2003; XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2004; Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы совершенствования технологии производства и переработки продукции сельского хозяйства», Йошкар-Ола, 2005; Международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии в опытах на обезьянах», Сочи-Адлер, 2007.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 25 печатных работ, в том числе: 1 в издании, рекомендованном ВАК Российской Федерации, 2 - в периодических изданиях, 2 - в сборник научных трудов, 14 - в материалах конференций , 6 патентов на изобретение.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 152 страницах, состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Диссертация иллюстрирована 31 таблицей и 8 рисунками. Список литературы включает 159 работ, в том числе 102 - отечественных и 57 - иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Материалы. В качестве сырья для получения комплексного иммуноглобулинового препарата использовали осадок Б. Осадки Б были получены с шести предприятий по производству препаратов крови: Областной станции переливания

крови, г. Иваново; Предприятия по производству препаратов крови НИИЭМ им. Пастера, г. Санкт-Петербург; ОАО «Биомед» им И.И. Мечникова; ГУЛ по производству бактерийных препаратов им. Г.Н. Габричевского, г. Москва; Предприятия по производству бактерийных и иммунобиологических препаратов, г. Казань; Предприятия «Имбио», г. Нижний Новгород.

Для осаждения белков применяли полиэтиленгликоль (полиэтиленоксид) 4000 и 6000 (ТУ 2483-166005757587-2000 или ФС 42-1110-72), сульфат меди, сульфат цинка, хлороформ.

Животные. Испытания острой токсичности комплексного иммуноглобулинового препарата проведены на 50 беспородных белых мышах обоих полов с исходной средней массой 35 г.

Изучение переносимости и терапевтической эффективности лекарственных форм препарата проводили на обезьянах на базе ГУ НИИ медицинской приматологии РАМН (г. Сочи - Адлер). В исследованиях использовали обезьян вида макак резус и макак яванский весом 3,5-9,8 кг в возрасте от 1 до 10 лет. Использовано 15 здоровых и 35 больных острой кишечной инфекцией с диарейным синдромом приматов.

При анализе сырья и выделенной иммуноглобулиновой фракции использовали:

Иммунохимические методы

Преципитацию в геле по Оухтерлони проводили в 1 %-ном агаре, используя при этом моноспецифические антисыворотки к ^А, ^М человека.

Иммуноэлектрофорез (ИЭФ) проводили в 1,5 %-ном агаре на стеклянной пластине размером 9x12 см на аппарате «МиМБи» (ЬКВ, Швеция) в течение 1-1,5 ч при силе тока 40 мА и напряжении 200 В. По окончании электрофореза из траншей вынимали агар, заливали соответствующие антисыворотки и оставляли пластину во влажной камере при комнатной температуре в течение 18-24 часов для инкубации. Окончательный учет результатов проводили после окрашивания пластины.

Определение концентрации иммуноглобулинов в образцах проводили методом радиальной иммунодиффузии (РИД) по Манчини в 1 % агарозе. Подсчет результатов проводили с помощью прикладной программы для персональных компьютеров (РИД-3 и РИД-4), разработанной профессором Козловым Л.В. (МНИИЭМ им Г.Н. Габричевского).

Определение антисальмонеллезной и антишигеллезной активности осуществляли в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с помощью соответствующих диагностикумов согласно инструкциям производителя.

Химические методы

Определение сульфат-ионов осуществляли с помощью раствора ВаС12. При добавлении ВаС12 к белковому раствору, содержащему SO42', образуется осадок белого цвета: S042' + Ва2+ = BaS041

Качественное определение ионов меди основано на способности меди образовывать с аммиаком нерастворимое комплексное соединение голубого цвета: 2CuS04 + 2NH4OH = Cu2(0H)S04l + (NH4)2S04

При добавлении раствора аммиака по каплям к белковому раствору, содержащему ионы меди, образуется осадок голубого цвета.

Количественное определение ионов меди проводили с помощью тиосульфата натрия. Для этого к 5 мл раствора белковой фракции добавляли 0,4 мл 20% серной кислоты, перемешивали, к смеси прибавляли 0,3 г иодида калия. Раствор титровали 0,1 Н раствором тиосульфата натрия Na2S203 (7,9 г на 1 л Н20) до изменения окраски. Концентрация присутствующих в растворе ионов меди рассчитывалась согласно объему использованного тиосульфата натрия.

Физические методы

Удаление низкомолекулярных примесей, диализ и концентрирование белковых растворов осуществляли методом ультрафильтрации. Раствор подавался под определенным давлением на мембрану-фильтр, вследствие чего молекулы вещества, у которых величина меньше диаметра пор фильтра, проходили через мембрану, крупные же молекулы оставались в растворе. Ультрафильтрацию проводили на установке Pellicon MSA - Г (Millipore, США) с использованием мембран, задерживающих молекулы с массой выше 10000 и 20000 дальтон.

Гравитационное разделение материалов проводили на центрифугах РС-6 (Россия), К-24D и K-70D (MLW, Германия). Высушивание белковых растворов осуществляли в сублимационной установке LZ-9.2 (Frigera, Чехия).

Остаточную влажность различных материалов определяли гравиметрически, выдерживанием навесок в сухо-жаровом шкафу при 80 °С до постоянной массы.

Измельчение сухой субстанции КИП осуществляли в электромагнитном измельчителе на основе линейных индукторов ЕММ-0,2 (ОКБА, г. Йошкар-Ола).

Таблеточную смесь готовили смешением в заданных соотношениях измельченной сухой субстанции препарата с наполнителем - сахарным гранулятом, тальком и стеаратом кальция в барабанном смесителе СБ-50 (ОКБА, г. Йошкар-Ола).

Таблетки КИП прессовали на однопуансонном салазочном прессе РТ-1 с диаметром пуансона 12 мм (МСЗ, г. Мариуполь).

Приготовление твердых желатиновых капсул с измельченным порошком КИП осуществляли в ручной фармацевтической машине МС-2 Туре 1 (Регш, Италия) по инструкции изготовителя.

Планирование эксперимента и статистическая обработка результатов

Планирование эксперимента осуществляли по Зейделю-Гауссу. При определении оптимума выхода по двум факторам использовали экспрессный метод. Вначале, зафиксировав значение одного фактора на любом уровне, изучали зависимость выхода от другого и устанавливали частный оптимум по данному фактору. Далее, зафиксировав второй фактор на оптимальном уровне и варьируя значения первого фактора, находили по нему оптимум выхода. Предполагалось, что оптимум по первому фактору, найденный при значении второго фактора, соответствующем частному оптимуму по второму, является истинным оптимумом по двум факторам.

Для оценки достоверности различий средних величин при сравнении независимых совокупностей вариант использовали непараметрический критерий и (критерий Мэнн-Уитнея, Уайта или Вилкоксона для независимых совокупностей). Преимуществом метода является возможность сравнения выборок с полуколичественными данными и различающимся числом вариант.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение существующей технологии получения КИП выявило проблему оценки качества исходного сырья. Это объясняется тем, что хотя у-глобулин производится по единой технологии, балластные осадки «Б», получаемые на различных предприятиях и являющиеся сырьем для получения комплексного иммуноглобулинового препарата, существенно отличаются по составу из-за технического состояния, режимных параметров работы технологического оборудования конкретного производства и других факторов.

Анализ 29 осадков, полученных с 6 предприятий по получению гамма-глобулина по методу Кона, показал их значительные различия по всем измеренным характеристикам. Из этих осадков для прогнозирования возможного результата приготовления комплексного иммуноглобулинового препарата были выбраны несколько и рассчитаны характеристики препарата, который может быть получен из каждого образца осадка.

Прогноз возможного результата выделения иммуноглобулиновой фракции осуществляли расчетным методом, исходя из требований действующей фармакопейной статьи, в соответствии с которой КИП должен содержать белка - не менее 5,5-6,5 % (55-65 мг/мл), иммуноглобулинов - не менее 97% (53-63 мг/мл), распределение

иммуноглобулинов по классам должно быть в пределах: ДО - (50-70)%, ^А - (15-25)%, ^М- (15-25)%, а титр антител к сальмонеллам - не менее 1:320.

Расчеты были проведены для «идеальных» условий, исходя из того, что все количество иммуноглобулинов, исходно присутствующих в сырье, перейдет в готовый продукт, т.е. без учета неизбежных потерь в процессе фракционирования и выделения. В связи с этим ориентировались на минимальные допустимые концентрации общего белка и иммуноглобулинов в препарате.

Результаты расчетов показали (табл. 1), что из 6 осадков, отобранных методом случайной выборки, сырьем для выделения иммуноглобулиновой фракции с характеристиками, соответствующими требованиям ФС, могут являться только 4. В образцах под номером 8 и 23 содержание 1§М и IgA соответственно было ниже минимально допустимой величины (15%). Расчетный выход иммуноглобулиновой фракции в осадках 1 и 18, содержащих общего белка около 20 мг/мл и иммуноглобулинов менее 10 мг/мл, не превысил 18%, что свидетельствует о нецелесообразности использования этих осадков по экономическим соображениям.

Таблица 1. Ожидаемые характеристики КИП в случае его получения из соответствующего осадка Б

Характеристики образцов исходного сырья (осадков Б) Расчетные характеристики КИП

№ осадка Общий белок, мг/мл Содержание мг/мл Распределение Титр антител к сальмо неллам вРПГА Общий белок, мг/мл Содержание 1& мг/мл Распределение 18,% Титр антител к сальмо неллам вРПГА Выход, %

1«с ¡¿'А 1«С ^А 1«М

1 20,4 9,5 52,0 32,0 16,0 1:160 55,0 53,0 52,0 32,0 16,0 1:880 17,9

8 28,6 16,3 69,0 21,3 10,7 1:320 55,0 53,0 69,0 21,3 10,7 1:1040 30,7

9 34,6 20,2 52,7 21,7 25,6 1:640 55,0 53,0 52,7 21,7 25,6 1:1696 37,7

18 20,8 7,8 41,9 35,8 22,3 1:320 55,0 53,0 41,9 35,8 22,3 1:2174 14,7

22 47,0 29,6 50,0 30,2 19,8 1:640 55,0 53,0 50,0 30,2 19,8 1:1145 55,8

23 34,0 18,8 75,5 7,5 17,0 1:160 55,0 53,0 75,5 7,5 17,0 1:453 35,2

Следует учитывать, что при выделении из осадка Б и очистке ^-фракции ее специфическая активность, с одной стороны, возрастает за счет удаления балластных веществ и увеличения концентрации антител. С другой стороны, при последующей технологической переработке (обезвоживании, стерилизации) биологическая активность препарата может снижаться.

На основании проведенных исследований были обоснованы качественные показатели сырья, обеспечивающие получение иммуноглобулиновой фракции с заданными характеристиками: концентрация белка - не менее 25 мг/мл; концентрация иммуноглобулинов - не менее 15 мг/мл; соотношение ^ и общего белка - 1:2; распределение иммуноглобулинов по классам (%) - (75-50):(25-15):(25-15);

титр антител к сальмонеллам - не менее 1:160.

Таким образом, из первоначально отобранных 29 осадков, пригодными для получения иммуноглобулиновой фракции с заданными характеристиками оказались 15.

Разделение иммуноглобулинов и примесных белков возможно двумя путями: первый - выделением иммуноглобулинов в виде осадка; второй - осаждением примесных белков, при этом иммуноглобулины остаются в надосадочной жидкости.

Второй вариант представлялся более предпочтительным, поскольку в этом случае молекулы иммуноглобулинов, находящиеся в жидкой фазе и не меняющие своей конформации, должны подвергнуться наименьшему негативному воздействию. Анализ данных литературы показал, что вариант проведения процесса фракционирования с осаждением примесных белков возможен при использовании в качестве осадителей солей двухвалентных металлов. Их применение могло также дать такие преимущества, как малый расход реагента, отсутствие необходимости в дополнительном оборудовании, возможность проведения процесса при комнатной температуре.

На основании результатов предварительных исследований из двух видов солей двухвалентных металлов - сульфатов цинка и меди был выбран последний, как обеспечивающий более полное удаление примесей из иммуноглобулиновой фракции. В результате дальнейшего изучения влияния на процесс фракционирования концентрации сульфата меди, рН и температуры реакционной смеси, была разработана лабораторная схема выделения иммуноглобулиновой фракции из осадка Б. Введение дополнительных стадий позволило предложить схему, пригодную для препаративного получения раствора КИП (рис.1), основанную на последовательной обработке гомогенизированного осадка Б хлороформом до конечной концентрациии 1-3 % с целью удаления липидов низкой и высокой плотности, и раствором сульфата меди до конечной концентрации 0,006-0,012 % для осаждения примесных белков из иммуноглобулиновой фракции, очистке иммуноглобулиновой фракции от низкомолекулярных примесей ультрафильтрацией с последующим концентрированием и возможным осаждением иммуноглобулиновой фракции 12 % полиэтиленгликолем, растворением осадка иммуноглобулинов до конечной

Осадок Б

Улирафилырация

Ра»едение в 0,85?» Май рН=7,0 Концентрация белка 1-2% pHsS.3-5.4t =0-5°С

Фильтрат

Преципитат

ймам

Концентрат

Осаедвние расткороиПЭГ 12% по обмыурН=7,0

нсс1,1-»

Преципитат

Растюр Си$Од р=1,002 до конечн. конц. 0,000% рН=4,9-5,0

Преципитат

..........................и

Центрифуга! III

0,1 М ЭДТА рН=6,21% по объему

Рис. 1. Препаративная схема выделения КИП.

растворение а 0,85% ИаС1 рн=7,0

Глицин 1%, гл»«0!а2% рН=7,0

0<еет«яюиияиаерилн^ющаяф)ибтрац1м

концентрации белка 5 %, стабилизацией и стерилизующей фильтрацией раствора КИП (защищено патентом РФ №2189833 от 27.09.2002; патентом РФ №2371200 от 27.10.2009; патентом РФ № 2371199 от 27.10.2009). Стерилизующую и осветляющую фильтрации проводили через мембранные фильтры с диаметром пор 0,80 и 0,22 мкм соответственно. Полученный раствор комплексного иммуноглобулинового препарата анализировали, замораживали и хранили при температуре минус 30 "С.

Далее была проведена серия экспериментов по переходу от лабораторного уровня к опытно-промышленному, результаты которых показали (табл. 2), что с увеличением объемов реакционной смеси до 2, 10 и 50 л существенных изменений качественных характеристик выделенных иммуноглобулиновых фракций не происходило.

Таблица 2. Показатели качества КИП при использовании реакторов различной вместимости

Объем реакционной смеси, л Общий белок, мг/мл Содержание мг/мл Доля примесных белков, % Соотношение иммуноглобулинов, % Антисаль-монеллезная активность, / титр РПГА Удельная активность Общие лнпиды мг/мл

1вА 18М

0,05 7,7±1,7 7,5±1,7 1,9±0,9 62,6±6,7 21,2±6,1 15,4±3,4 135±95 17,4 ±10,6 0,08±0,1

2 45,2±10,0 46,9±13,9 2,3±1,0 56,5±9,2 19,4 ±9,2 21,1±8,1 924±337 24,2±10,3 0,41 ±0,2

10 35,2±0,2 34,1 ±0,2 2,9±0,1 )5,0±1,7 19,7±4,0 15,3 ±2,3 640 18,5±0,2 0,62±0,8

200 40,« 39,5 3,0 66,0 18,0 16,0 640 15,9 0,42

Учитывая вышеизложенное, разработанный метод получения комплексного иммуноглобулинового препарата может быть предложен для внедрения в производство.

Следующий этап исследований заключался в подборе оптимальных стабилизаторов для сохранения физико-химических и биологических свойств выделенной иммуноглобулиновой фракции. Было изучено влияние различных стабилизаторов на сохранение основных свойств иммуноглобулинов в препарате (табл. 3).

Таблица 3. Сравнительная характеристика КИП до и после сублимационного высушивания в присутствии стабилизирующих добавок

Препарат Вид стабилизатора Основные характеристики КИП

Общий белок, мг/мл Антисальмонеллезная активность, титр РПГА Соотношение %

180 1вА 18М

Исходный жидкий Нет 40,8 1:640 61 19 20

После сушки Нет 31,5 1:160 62 12 26

Глицин 1%, глюкоза 2% 38,8 1:640 65 15 20

Сахароза 2% 39,6 1:640 69 И 20

Мальтоза 2% 39,6 1:640 65 16 19

Было установлено, что наиболее эффективным оказалось использование 2 % мальтозы и смеси 2 % глюкозы с 1 % глицином. Применение этих веществ обеспечивало сохранность биологических свойств КИП (титр РПГА против сальмонелл, содержание белка и соотношение иммуноглобулиновых фракций). И, напротив, высушивание препарата без защитных компонентов во всех случаях приводило к снижению специфической активности на 2 двукратных разведения в реакции РПГА, и падению концентрации белка на 6-8 %, что объясняется денатурацией иммуноглобулинов при замораживании и высушивании.

Эксперименты с изменением различных режимных параметров сублимационной сушки позволили определить три возможных варианта проведения этого процесса. Повышение до 55 °С температуры греющей поверхности полки на этапе сублимации влаги не оказывало негативного влияния на специфические свойства иммуноглобулинов. Это вносит коррективы в существующее представление об их слабой устойчивости к обезвоживанию. Использованный прием позволил сократить длительность не только этапа сублимации, но и всего процесса высушивания КИП в 2,7 раза (до 14 часов). Применимость ускоренного варианта сушки была подтверждена результатами хранения сухого препарата в течение 6 месяцев при температуре 4±2 °С (защищено патентом РФ № 2247578 от 10.03.2005).

В ходе исследования возможности использования у-излучения для стерилизации сухой субстанции и флаконной формы КИП оценивали действие излучения на специфическую активность иммуноглобулинов и защитные свойства введенных в препарат стабилизаторов. Обработку препаратов у-излучением проводили на базе ОАО «Мегарат» (г. Москва). Стерилизующий эффект оценивали по наличию роста микрофлоры в образцах КИП до и после радиообработки на различных питательных средах (табл. 4). Антител к ВИЧ, гепатиту С, коронавирусу человека, поверхностному антигену (HBsAg) вируса гепатита В в исходном сырье и готовом препарате обнаружено не было.

Таблица 4. Характеристики препарата КИП с различными стабилизаторами до и после радиационной обработки

Доза У- облучения, кГр Вид стабилизатора Основные характеристики препарата

Содержание белка, мг/мл Акгисальмо-неллезная активность, титрРПГА Соотношение %

18С 18А 18М

Нет Глицин 1%, глюкоза 2% 49,6 1:640 65 15 20

Мальтоза 2% 48,8 1:640 65 16 19

Сахароза 2% 49,4 1:640 65 15 20

15 Глицин 1%, глюкоза 2% 49,4 1:640 67 15 18

Мальтоза 2% 39,0 1:320 60 18 22

Сахароза 2% 40,0 1:320 63 16 21

20 Глицин 1%, глюкоза 2% 35,0 1:320 68 17 15

Мальтоза 2% 25,8 1:160 62 13 25

Сахароза г% 23,4 1:80 39 35 23

В результате исследований было установлено, что радиационная обработка при величине поглощенной дозы 20 кГр обеспечивала стерилизацию препаратов, но вызывала

снижение антительной активности на одно двукратное разведение в РПГА (защищено патентом РФ №2255766 от 10.07.2005).

Хранение стабилизированного смесью глицина и глюкозы препарата после стерилизации у-излучением в течение 2 лет при 4±2 "С показало отсутствие изменений основных свойств препарата и его полное соответствие требованиям фармакопейной статьи.

Следовательно, этот метод может быть рекомендован для включения в технологию приготовления КИП при обязательном выполнении следующих условий: для стабилизации препарата используется смесь 1 % глицина и 2 % глюкозы; препарат до стерилизации имеет специфическую активность, минимум на одно двукратное разведение превышающую величину, регламентируемую ФСП 42-0381-3757-02.

Сухая субстанция КИП представляет собой легкий пористый рассыпчатый материал с размерами кусков от 0,5 до 20 см. В таком виде она не может быть использована для приготовления твердых дозированных форм препарата и должна быть подвергнута соответствующей технологической переработке. Исследование процесса измельчения субстанции позволило выбрать режим проведения процесса без потери специфической активности иммуноглобулинов. Смешение измельченной субстанции с наполнителем -сахарным гранулятом, тальком и стеаратом кальция при приготовлении таблеточной смеси также не вызывало изменения биологических свойств иммуноглобулинов. Однако при прессовании таблеток на салазочном прессе РТ-1 происходило падение антительной активности, но не более чем на одно двукратное разведение. В результате исследований разработан способ таблетирования иммунологических препаратов, обеспечивающий сочетание качества лекарственной формы и наличие заданных специфических свойств биологически активных компонентов (защищено патентом РФ № 2334503 от 27.09.2008). Указанным способом были приготовлены экспериментальные серии КИП в таблетках. При хранении таблеток в течение 1 года их свойства не изменялись. Через 1,5 года содержание белка снизилось со 156 до 112 мг, титр антител упал на 1 двукратное разведение (табл. 5).

Другой перспективной дозированной формой КИП являются твердые желатиновые капсулы. Технология их приготовления проще, чем таблеток, и включает стадии измельчения сухого материала, введения скользящих веществ или разобщителей (в случае необходимости) и собственно заполнения капсул препаратом. Для приготовления экспериментальных серий КИП в капсулах использовали ту же измельченную субстанцию, что и для таблеток. Каждая капсула № 1 содержала 150 мг белка. В

результате двухлетнего хранения при температуре 4±2 °С биологические свойства иммуноглобулинов в капсулах не менялись.

Таблица 5. Параметры таблеток КИП при хранении в течение 1,5 лет при температуре (4±2) °С

Срок хранения, мес. Общий белок, мг/табл. Активность против сальмонелл титр РПГА Соотношение иммуноглобулинов, %

180 18М 18А

0 150 1:320 62 18 20

6 144 1:320 67 16 17

12 123 1:160-1:320 62 17 21

18 112 1:160 61 18 21

Учитывая тот факт, что при разработке нового способа выделения иммуноглобулиновой фракции в качестве основного реагента был введен сульфат меди, необходимо было провести комплекс исследований по оценке безопасности препарата.

Первый этап включал определение содержания ионов сульфата меди в препарате различными методами. Качественный анализ образцов КИП с использованием хлорида бария не выявил наличия в препарате сульфат-ионов. Количественное определение, проведенное с помощью тиосульфата натрия, показало, что концентрация в препарате ионов меди не превышала 0,1 мг в сухой биомассе во флаконе или 0,02 мг/мл в жидком КИП. Анализ методом спектрофотометрии по ГОСТ 30178-96 показал, что содержание меди в одной дозе препарата составило от 0,008 до 0,02 мг, что соответствует (0,0016 -0,004 мг/мл) (табл. 6). Содержание ионов меди в нормальной сыворотке человека составляет 0,0015-0,008 мг/мл.

Таблица 6. Содержание ионов меди в образцах комплексного иммуноглобулинового препарата.

№ образца препарата 2+ Метод удаления Си из иммуноглобулиновой фракции Содержание меди (мг) в препарате

в 1 дозе в 1 мл

1 КИП во флаконах, приготовленный по регламенту 0,008 0,0016

2 Осаждение иммуноглобулинов 12 % ПЭГ 0,108 0,100 0,0216 0,020

3 Ультрафильтрация 0,020 0,015 0,004 0,003

4 Ультрафильтрация + осаждение 12 % ПЭГ 0,011 0,0022

Сравнительная оценка препаратов (табл. 7, рис. 2) показала, что полученный по разработанной технологии комплексный иммуноглобулиновый препарат во флаконах по своим качествам не уступает коммерческому аналогу.

Таблица 7. Показатели качества комплексного иммуноглобулинового препарата

Наименование параметра Величина параметра КИП, полученного методом

регламентным разработанным

Описание Сухая бело-серая пористая масса Сухая пористая голубоватая масса

Растворимость, мин 3,5±2 1,7±3

Прозрачность, ед ОП 0,047±0,002 0,038±0,005

Цветность, ед ОП 0,098±0,005 0,086±0,004

Концентрация белка, мг/мл 60±5 58±5

Содержание % 98,5±1,5 98,5±1,5

Количественное соотношение иммуноглобулинов, % 18С 18М %А 57,2±7,0 22,1±4,3 21,5±5,0 55,4±6,8 23,7±8,5 22,0±7,4

Специфическая активность, титр антител к: сальмонеллам шигеллам Флекснера 1:640- 1:1280 1:320 1:640- 1:1280 1:320

Содержание меди, мг 0,015±0,005 0,075±0,025

Концентрация липидов, мг на мг белка 0,050±0,025 0,034±0,025

Выход, % 14,16±5,8 24,59±6,4

Из данных табл. 7 видно, что выход готового продукта в среднем увеличился в 1,8 раза, содержание общих липидов было снижено в 1,5 раза.

Качество полученного препарата определяли иммуноэлектрофоретически. Комплексный иммуноглобулиновый препарат должен содержать только иммуноглобулины трех основных классов в, М, А. Наличие других сывороточных белков согласно действующей ФСП не должно превышать 3 %. При проведении иммуноэлектро-фореза использовали сыворотку против всех сывороточных белков человека. Наличие линий преципитации, соответствующих иммуноглобулинам в, М и А, характеризует присутствие этих белков в препаратах (рис. 2). Отсутствие других линий показывает, что примесные сывороточные белки в образцах КИП отсутствуют, что полностью удовлетворяет требованию чистоты препаратов, полученных как по существующему регламенту, так и по разработанной технологии.

Примечание: в первой лунке (сверху) -КИП, полученный согласно действующему регламешу; во второй лунке - КИП, полученный по разработанной технологии. В бороздках сыворотка против всех сывороточных белков человека.

Рис. 2. Иммуноэлектрофорез комплексного иммуноглобулинового препарата.

На втором этапе исследований оценивали острую токсичность экспериментальных серий КИП на 50 здоровых белых мышах обоего пола согласно ФС. Результаты экспериментов показали безвредность и отсутствие токсичности препарата для мышей.

Исследования по изучению безвредности и терапевтической эффективности лекарственных форм КИП на обезьянах были проведены сотрудниками НИИ медицинской приматологии РАМН (г. Сочи - Адлер) под руководством академика РАМН, профессора Б.А. Лапина и доктора медицинских наук профессора Э.К. Джикидзе.

Для оценки переносимости препаратов использовали 15 клинически здоровых обезьян вида макак резус, которые были разделены на 3 группы в соответствии с получаемой лекарственной формой КИП. Здоровые обезьяны получали по 1 дозе КИП (1 флакон, 2 капсулы или 2 таблетки) ежедневно утром за 30 мин до кормления в течение 5 дней. Наблюдение за животными велось 10 дней. Признаков ухудшения состояния обезьян не наблюдалось, масса тела в среднем не изменялась, не наблюдалось также каких - либо желудочно-кишечных расстройств. В течение 10 дней наблюдения обезьяны оставались здоровы и все были возвращены в вольеру.

Для изучения терапевтической эффективности использовали 35 больных приматов с выраженными симптомами дисфункции кишечника, частым стулом без патологических примесей. Общее состояние животных оценивалось как среднетяжелое. Обезьяны опытных групп получали по 1 дозе КИП (1 флакон, 2 капсулы или 2 таблетки, соответственно) ежедневно утром за 30 мин до кормления в течение 7 дней. Схема лечения обезьян контрольной группы: левомицетина-сукцинат в течение 7 дней (рис. 3). Средняя длительность клинических проявлений заболевания в группах обезьян при лечении препаратами КИП была ниже, чем в контрольной группе.

■ 1 - флаконы; 2 - капсулы; 3 - таблетки; 4 -антибиотик

Рис. 3. Длительность клинических проявлений ОКИ у обезьян, получавших лечение препаратами КИП и антибиотиком (левомицетина-сукцинат).

Сыворотки крови всех обезьян, взятых до лечения и на 6-й день эксперимента анализировали на содержание антител против сальмонелл и шигелл Флекснера в реакции РПГА. Средний титр антител до лечения составлял 1:10-1:20. Так как присутствие сальмонелл и шигелл Флекснера в ЖКТ обезьян не было подтверждено бактериологическим анализом, наличие антител свидетельствовало о контакте животных с упомянутыми антигенами, и возможно данный уровень антител является постоянным (норма) в крови. В ходе эксперимента практически у всех животных после лечения препаратами КИП наблюдалось повышение титра антител, как к сальмонеллам, так и к шигеллам Флекснера на одно - два двукратных разведения (рис. 4).

Ном ер животного в данном опыте

Рис. 4. Титр антител к шигеллам Флекснера в сыворотке крови больных обезьян до и после лечения.

Теоретическая основа энтерального применения КИП разработана еще недостаточно, однако установленный факт может свидетельствовать о проникновении содержащихся в препарате антител, либо их части, в кровь.

Таблица 8. Сравнение групп обезьян по длительности проявления клинических признаков ОКИ с помощью критерия Уайта

Препарат Длительность болезни, Число приматов в группе Наименьшее Пограничное

дни (число обезьян) суммарное число инверсий значение критерия и, при р<0,01

больных вылеченных

Флаконы КИП 2(5Н(2)-5(1)-6(1)-8(1) 10 10

Таблетки КИП 2(4)-3(1)-8(3)-9(1)-10(1) 10 10 28 19

Капсулы КИП 2(2)-3(])-5(1)-6(1)-7(3)-8(1)-11(1) 10 10 31

Левом ицетина 9(2)-11(1)-12(2) 5 3 7,5 8

-сукцинат

Обработка результатов экспериментов с помощью критерия Уайта показала достоверность различий сроков выздоровления обезьян, получавших КИП и антибиотик, что свидетельствует о высокой терапевтической эффективности разработанных форм комплексного иммуноглобулинового препарата.

Таким образом в результате проведенных исследований выбраны оптимальные критерии использования осадков Б в качестве сырья для получения комплексного иммуноглобулинового препарата. Разработан способ получения жидкого КИП, основанный на использовании сульфата меди. Подобраны стабилизаторы и режим сублимационного обезвоживания для максимального сохранения биологических свойств иммуноглобулинов. Разработаны способы приготовления дозированных лекарственных форм комплексного иммуноглобулинового препарата - во флаконах, таблетки и капсулы. Доказано отсутствие токсичности и наличие терапевтической эффективности различных лекарственных форм на мышах и обезьянах.

Выводы

1. Показано, что наиболее информативными критериями качества осадков Б являются концентрации белка и иммуноглобулинов, отношение содержания антител к общему белку, процентное распределение иммуноглобулинов по классам ^А, ^М, а также титр антител к сальмонеллам.

2. Разработана технология получения комплексного иммуноглобулинового препарата, основанная на последовательной обработке гомогенизированного осадка Б хлороформом и раствором сульфата меди, очистке иммуноглобулиновой фракции от низкомолекулярных примесей ультрафильтрацией в присутствии комплексообразующего соединения с последующим концентрированием и возможным осаждением иммуноглобулиновой фракции полиэтиленгликолем, растворением осадка иммуноглобулинов, стабилизацией и стерилизующей фильтрацией раствора КИП.

3. Доказана возможность интенсификации сублимационного обезвоживания КИП с сокращением общей длительности процесса в 2,7 раза при использовании в качестве стабилизаторов смеси глицина и глюкозы, что обеспечивает сохранность физических и биологических свойств полученного материала и его пригодность для приготовления флаконной, капсульной и таблеточной форм препарата.

4. Показано, что при стерилизации сухой субстанции комплексного иммуноглобулинового препарата гамма-излучением при дозе облучения 20 кГр, препарат удовлетворяет всем требованиям ФСП 42-0381-3757-02.

5. Разработан технологический цикл приготовления таблеток иммунологических препаратов, при котором воздействие физико-механических факторов, возникающих в процессе разрушения сухой субстанции КИП при ее измельчении и в ходе прессования таблеточной смеси, приводит к суммарному снижению специфической активности иммуноглобулинов не более чем на 1 двукратное разведение.

6. Комплексный иммуноглобулиновый препарат, приготовленный по экспериментальной технологии нетоксичен, безвреден и эффективен при лечении острой кишечной инфекции у обезьян с диарейным синдромом.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Давыдкин В.Ю. Отработка процесса сублимационного высушивания комплексного иммуноглобулинового препарата / Давыдкин В.Ю., Гаврин А.Г., Алёшкин

B.А., Лютов А.Г., Афанасьев С.С., Зорик A.B., Борисова И.В., Давыдкин И.Ю. // Сборник научных трудов ГУ МНИИЭМ им. Т.Н. Габричевского МЗ РФ "Проблемы инфекционных болезней (клиника, диагностика, лечение)". -М., 2000. - ч.2. - С. 61- 66.

2. Зорик A.B. Новый способ выделения иммуноглобулинов из осадка Б / Зорик A.B., Алёшкин В.А., Лютов А.Г., // Материалы 1 Международного Конгресса «Биотехнология -состояние и перспективы развития», 14-18 октября 2002 г.- М., 2002. - С. 65.

3. Алёшкин В.А. Испытание на обезьянах иммунобилогических препаратов при лечении инфекционных заболеваний / Алешкин В.А., Лапин Б.А., Давыдкин В.Ю., Воробьев A.A., Афанасьев С.С., Джикидзе Э.К., Стасилевич З.К., Давыдкин И.Ю., Борисова И.В., Кебу Т.И., Гвоздик Т.Е., Калашникова В.А., Гаврин А.Г., Зорик A.B., Новикова Л.И. // Сборник материалов научно-практической конференции «Медицина будущего». -М., 2002. - С. 45 - 46.

4. Давыдкин В.Ю. Получение экспериментальных серий новых лекарственных форм комплексного иммуноглобулинового препарата (КИП) / Давыдкин В.ЮАлёшкин В.А., Зорик A.B., Афанасьев С.С., Гаврин А.Г., Давыдкин И.Ю., Борисова И.В., Джикидзе Э.К., Новикова Л.И., Вдовенков В.В. // Сборник международной научно-практической конференции памяти Г.И. Гончаровой «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования». -М., 2002. - С. 66 - 67.

5. Джикидзе Э.К. Лечение диареи у обезьян различными готовыми лекарственными формами комплексного иммуноглобулинового препарата / Джикидзе Э.К., Алешкин В.А., Стасилевич З.К., Афанасьев С.С., Кебу Т.И., Давыдкин В.Ю., Гвоздик Т.Е., Борисова И.В., Калашникова В.А., Гаврин А.Г., Давыдкин И.Ю., Новикова Л.И., Зорик A.B. // Тезисы докладов IX Российского национального конгресса «Человек и лекарство». -М., 2002.- С. 609.

6. Алёшкин В.А. Место иммуноглобулиновых препаратов в лечении и реабилитации инфекционных больных / Алёшкин В.А., Лютов А.Г., Афанасьев С.С.,. Феклисова Л.В, Новикова Л.И., Мескина Е.Р., Давыдкин В.Ю., Борисова И.В., Давыдкин И.Ю., Галкина Л.А., Целипанова Е.Е., Репина И.Б., Кострова О.М., Зорик A.B., Гаврин А.Г., Манько Т.Н. // Новые лекарственные препараты,- Вып.4. -М., 2003. - С. 6-32.

7. Лапин Б.А. Оценка на обезьянах реактогашости и эффективности лекарственных форм комплексного иммуноглобулинового препарата / Лапин Б.А., Алёшкин В.А., Давыдкин В.Ю., Воробьев A.A., Джикидзе Э.К., Афанасьев С.С., Стасилевич З.К., Кебу Т.Н., Давыдкин И.Ю., Борисова И.В., Гвоздик Т.Е., Калашникова В.А., Гаврин А.Г., Зорик A.B., Новикова Л.И. // Журнал Микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2003. №3. - М., - С. 57-62.

8. Давыдкин. В.Ю. Новые лекарственные формы комплексного иммуноглобулинового препарата / Давыдкин В.Ю., Алёшкин В.А., Зорик A.B., Афанасьев

C.С., Гаврин А.Г., Давыдкин И.Ю., Борисова И.В., Джикидзе Э.К., Новикова Л.И. // Третья международная конференция, посвященная 80-летию института имени Пастера, «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», 4-5 сентября 2003 г. в Санкт-Петербурге. -М., 2003.-С. 160.

9. Мелихова A.B. Стабилизация фракций иммуноглобулинов при сублимационном высушивании комплексного иммуноглобулинового препарата / Мелихова A.B., Лютов А.Г., Алёшкин В.А., Гаврин А.Г., Давыдкин В.Ю., Давыдкин И.Ю. // International Journal on Immunorehabilitation. Физиология и патология иммунной системы. -М, 2003. - Т.5. №2. -С. 172.

10. Давыдкин В.Ю. Технологические аспекты рецептуростроения лекарственных форм иммуноглобулинов: Общие положения / Давыдкин В.Ю., Алёшкин В.А., Давыдкин И.Ю., Афанасьев С.С., Гаврин А.Г., Мелихова A.B. // Сборник материалов научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения»: Приложение к журналу «Вестник восстановительной медицины». -М., 2003. - С. 18-20.

11. Мелихова A.B. Технологические аспекты рецептуростроения лекарственных форм иммуноглобулинов: Разработка способа выделения Ig-фракции из осадка Б // Сборник материалов научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения»: Приложение к журналу «Вестник восстановительной медицины». - М., 2003. - С. 20-21.

12. Мелихова A.B. Технологические аспекты рецептуростроения лекарственных форм иммуноглобулинов: Влияние стабилизаторов на качество иммуноглобулинового препарата при сублимационном высушивании / Мелихова A.B., Лютов А.Г., Гаврин А.Г., Давыдкин В.Ю., Давыдкин И.Ю. // Сборник материалов научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения»: Приложение к журналу «Вестник восстановительной медицины». -М., 2003.-С. 22-23.

13. Давыдкин В.Ю. Технологические аспекты рецептуростроения лекарственных форм иммуноглобулинов: Сублимационное обезвоживание растворов иммуноглобулинового препарата./ Давыдкин В.Ю., Алёшкин В.А., Гаврин А.Г., Мелихова A.B., Давыдкин И.Ю., Афанасьев С.С., Новикова Л.И., Вдовенков В.В.// Сборник материалов научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения»: Приложение к журналу «Вестник восстановительной медицины». - М., 2003. - С. 23-24.

14. Давыдкин В.Ю. Технологические аспекты рецептуростроения лекарственных форм иммуноглобулинов: Измельчение сублимированной биомассы иммуноглобулинового препарата / Давыдкин В.Ю., Давыдкин И.Ю., Алёшкин В.А., Гаврин А.Г., Афанасьев С.С., Новикова Л.И., Мелихова A.B. // Сборник материалов научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения»: Приложение к журналу «Вестник восстановительной медицины». -М., 2003. - С. 24-25.

15. Давыдкин В.Ю. Технологические аспекты рецептуростроения лекарственных форм иммуноглобулинов: Непрерывный помол сублимированной биомассы иммуноглобулинового препарата / Давыдкин В.Ю., Давыдкин И.Ю., Алёшкин В.А., Гаврин А.Г, Афанасьев С.С., Мелихова A.B., Новикова Л.И. // Сборник материалов научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения»: Приложение к журналу «Вестник восстановительной медицины». -М., 2003. - С. 26-27.

16. Новикова Л.И. Использование гамма-облучения для стерилизации комплексного иммуноглобулинового препарата / Новикова Л.И., Бочкарева С.С, Борисова И.В., Зуева М.М., Афанасьев С.С., Мелихова A.B., Кострова О.М. // Сборник материалов научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения»: Приложение к журналу «Вестник восстановительной медицины». -М., 2003. - С. 28-29.

17. Джикидзе Э.К. Применение комплексных иммунобиологических препаратов для лечения диарейных заболеваний обезьян / Джикидзе Э.К., Афанасьев С.С., Стасилевич З.К., Борисова И.В., Гвоздик Т.Е., Давыдкин В.Ю., Кебу Т.И., Мелихова A.B., Султанова O.A., Калашникова В.А. // Сборник материалов научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения»: Приложение к журналу «Вестник восстановительной медицины». - 2003. - С. 36-37.

18. Давыдкин В.Ю. Разработка таблетированной формы комплексного иммуноглобулинового препарата / Давыдкин В.Ю., Давыдкин И.Ю., Алешкин В.А., Гаврин А.Г., Афанасьев С.С., Мелихова A.B., Новикова Л.И., Борисова И.В. // Тезисы докладов XI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». -М.,2004,-С.780.

19. Давыдкин И.Ю. Оценка процесса помола и таблетирования сухой биомассы иммуноглобулинов / Давыдкин И.Ю., Давыдкин В.Ю., Алешкин В.А., Мелихова A.B., Гулый К.Е., Блинов В.М. // Мосоловские чтения: Материалы межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы совершенствования технологии производства и переработки продукции сельского хозяйства». -М., 2005. - Вып. 7. - С. 225-227.

Изобретения

1. Патент РФ. № 2189833, А61К 39/395. Способ получения иммуноглобулинового препарата / A.B. Зорик, ВА. Алешкин, А.Г. Лютов, И.В. Борисова. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 19 октября 2000. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

2. Патент РФ. № 2255766, МПК А61К 39/395. Способ получения иммуноглобулинового препарата для профилактики и терапии бактериальных и вирусных инфекций, иммуноглобулиновый препарат для профилактики и терапии бактериальных и вирусных инфекций (варианты) н суппозитории на основе иммуноглобулинового препарата / Алешкин В.А., Новикова Л.И., Афанасьев С.С., Борисова И.В., Зуева М.М., Зорик A.B. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 5 марта 2003. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

3. Патент РФ. № 2247578, МПК А61К 39/395. Состав, обладающий противомикробным действием / Мелихова A.B., Алешкин В.А., Давыдкин В.Ю., Давыдкин И.Ю., Афанасьев С.С., Борисова И.В., Рубальский О.В., Гаврин А.Г. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10

марта 2005. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

4. Патент РФ. № 2334503, МПК A61J 3/10. Способ таблетирования медицинских иммунобиологических препаратов / Давыдкин И.Ю., Алешкин В.А., Давыдкин В.Ю., Рубальский О.В., Гаврин А.Г., Мелихова A.B., Афанасьев С.С. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 сентября 2008. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

5. Патент РФ. № 2371200, МПК А61К 39/395. Способ получения иммуноглобулинового препарата / Мелихова A.B., Давыдкин В.Ю., Алешкин В.А., Давыдкин ИЛО. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 октября 2009. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

6. Патент РФ. № 2371199, МПК А61К 39/395. Способ получения иммуноглобулинового препарата / Мелихова A.B., Давыдкин В.Ю., Алешкин В.А., Давыдкин И.Ю. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 октября 2009. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ИЭФ-

ФСП-

РИД-РПГА-

РАМН-

ОКИ-

ЖКТ-

ФС-

ФЭК-

ВИЧ-

ГФ-

ИФА -

ПЭГ-

КИП-

вирус иммунодефицита человека государственная фармакопея желудочно-кишечный тракт иммуноферментный анализ иммуноэлектрофорез

комплексный иммуноглобулиновый препарат острая кишечная инфекция полиэтиленгликоль(полиэтиленоксид) Российская академия медицинских наук радиальная иммунодиффузия реакция пассивной гемагглютинации фармакопейная статья фармакопейная статья предприятия фотоэлектрокапориметр иммуноглобулин класса в

IgM - иммуноглобулин класса М

IgA - иммуноглобулин класса А

HBsAg - поверхностный антиген вируса гепатита В

HCV - коронавирус человека

SC - секреторный компонент

PBS - фосфатный буферный раствор

Подписано в печать: 02.04.10

Объем: 1,5 усл.печ.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 256 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г.Москва, пр-т Вернадского, 39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мелихова, Александра Вадимовна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ИММУНОГЛОБУЛИНЫ, ИХ СВОЙСТВА И МЕТОДЫ

ВЫДЕЛЕНИЯ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1 Иммуноглобулиновые препараты в медицине.

1.2. Физико-химические свойства иммуноглобулинов.

1.3. Препаративные методы выделения иммуноглобулиновых композиций, содержащих три основных класса иммуноглобулинов

§А,

§М.

1.3Л. Методы фракционирования неорганическими солями.

1.3.2. Фракционирование органическими растворителями.

1.3.3. Выделение иммуноглобулиновой фракции полимерами.

1.3.4. Метод ионообменной хроматографии.

1.4. Стабилизация физико-химических и биологических свойств иммуноглобулиновых препаратов.

1.5. Методы стерилизации иммунобиологических препаратов и способы инактивации вирусов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Материалы и реактивы.

2.1.2. Экспериментальные животные.

2.2. Методы исследований.

2.2.1. Иммунохимические методы.

2.2.2. Химические методы.

2.2.3. Физико-химические методы.

2.2.4. Физические методы.

2.2.5. Биологические методы.

2.2.6. Планирование эксперимента и статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА СПОСОБА ВЫДЕЛЕНИЯ ИММУНО

ГЛОБУЛИНОВОЙ ФРАКЦИИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ КИП.

3.1. Сравнительная оценка качественного состава осадков Б и выбор критериев их пригодности в качестве исходного сырья для получения КИП.

3.2. Исследование эффективности фракционирования иммуноглобулинов солями двухвалентных металлов.

3.3. Разработка метода выделения очищенной иммуноглобули-новой фракции с использованием сульфата меди.

3.4. Определение содержания в препарате ионов меди.

ГЛАВА 4. СТАБИЛИЗАЦИЯ СВОЙСТВ И ПРИГОТОВЛЕНИЕ СУХИХ

ДОЗИРОВАННЫХ ФОРМ КИП.

4.1. Влияние стабилизаторов на физико-химические и биологические свойства КИП при сублимационном 98 обезвоживании.

4.2. Оценка эффективности стерилизации КИП у-облучением.

4.3. Приготовление твердых дозированных форм КИП.

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ БЕЗВРЕДНОСТИ И ЭФФЕКТИВНОСТИ

ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ КИП.

5.1. Испытание токсичности препарата на мышах.

5.2. Изучение безвредности и эффективности комплексного иммуноглобулинового препарата на обезьянах.

5.2.1. Испытание безвредности препарата на обезьянах.

5.2.2. Изучение терапевтического эффекта КИП при лечении острой кишечной инфекции с диарейным синдромом.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка технологии приготовления сухих дозированных форм комплексного иммуноглобулинового препарата"

В настоящее время клиницисты уделяют все больше внимания иммуноглобулиновым препаратам. Этому способствует постоянно регистрируемый рост иммунодефицитных состояний, вызываемых взаимодействием организма с внешней средой и процессом развития генофонда микроорганизмов [51]. Кроме того, применяемые в терапии острых и хронических инфекционных заболеваний химиотерапевтические препараты, в том числе антибиотики, обладают супрессорной активностью в отношении иммунной системы. Антибиотики угнетают фагоцитарную активность лейкоцитов и комплементарную активность сыворотки крови. Длительная и интенсивная антибиотикотерапия у ряда больных обусловливает развитие лекарственной резистентности возбудителей, дисбактериоза, кандидоза, аллергических реакций [57].

Важное значение в настоящее время приобрели инфекции, вызываемые условно-патогенными микроорганизмами, госпитальные инфекции, феномен суперинфицирования. По мнению клиницистов, будущее - за препаратами и схемами лечения, объединяющими в себе как специфическое действие на конкретный возбудитель, так и одновременное иммуномодулирующее действие [8]. Одним из наиболее перспективных направлений является разработка пероральных форм иммуноглобулиновых препаратов, так как данный способ введения имеет ряд преимуществ перед парентеральным [67,101]: непосредственная и быстрая доставка препарата в ЖКТ; простота введения; хорошая переносимость препарата; возможность добавления препарата в пищу; возможность увеличения объема вводимого препарата.

Комплексный иммуноглобулиновый препарат (КИП) для парентерального применения был разработан на базе лаборатории- биохимии МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского под руководством проф. Н. В. Холчева в 70-х годах. В 90-х годах В.А. Алешкиным была предложена концепция пероралыюго применения КИП, в соответствии с которой препарат используется для профилактики и терапии острых кишечных инфекций (ОКИ) и ряда других заболеваний [63, 39].

КИП содержит три класса иммуноглобулинов в, А, М, что обеспечивает высокий терапевтический эффект при его оральном и ректальном применении, убедительно демонстрируемый клиницистами уже более 10 лет [57]. В связи с высоким уровнем заболеваемости ОКИ, участившимися тяжелыми и затяжными формами инфекционного процесса комплексный иммуноглобулииовый препарат используется все шире. Есть данные о том, что КИП эффективен не только для детей первых лет жизни, как считалось ранее, но и для взрослых [39].

Существующая технология производства КИП характеризуется длительностью, многостадийностью и имеет ряд недостатков, делающих се непригодной для приготовления твердых дозированных форм препарата. В частности, на стадии выделения иммуноглобулинов в качестве основного фракционирующего агента используется органический растворитель -хлороформ в концентрации, обусловливающей необходимость соблюдения особых условий, усложняющих проведение процесса. Сублимационное обезвоживание препарата в стеклянных флаконах чрезмерно продолжительно (до 2 суток) и не предусматривает возможности получения сухой субстанции КИП в количествах, необходимых для производства твердых дозированных форм (таблетки, капсулы).

В последние годы особое внимание уделяется биологической безопасности препаратов, получаемых из биологических жидкостей человека, и методам их стерилизации [70]. Наиболее экономически выгодным и наиболее щадящим из всех существующих методов стерилизации препаратов, по мнению ряда авторов, признан метод с использованием у-облучения [46]. Однако, отсутствуют сведения о возможности применения его для обработки сухого КИП.

Все вышеизложенное свидетельствует об актуальности проведения исследовательской работы по усовершенствованию технологии получения комплексного иммуноглобулинового препарата и создание новых лекарственных форм. б

2. Изучить возможность использования солей двухвалентных металлов для выделения фракций, содержащих три основных класса иммуноглобулинов и предложить оригинальную технологию получения субстанции КИП.

4. Исследовать возможность стерилизации субстанции КИП методом гамма-облучения, оценить его влияние на биологическую активность , микробиологическую чистоту и биологическую безопасность.

Научная новизна

Впервые показано, что соли двухвалентных металлов могут быть использованы для одновременного выделения иммуноглобулинов трех основных классов ^С, 1§Д и ^М. При этом фракционирование возможно из концентрированных субстанций, к которым, в частности, относится осадок Б. Наиболее эффективным фракционирующим агентом с точки зрения полноты выделения антител и чистоты получаемой фракцииявляется сульфат меди.

Впервые проведенные исследования по созданию твердых дозированных форм КИП дают представление о степени механоустойчивости антител в сухом состоянии. Установлено, что воздействие физико-механических факторов, возникающих в процессе разрушения сухой субстанции КИП при ее измельчении и в ходе прессования таблеточной смеси при изготовлении таблеток, сопровождается снижением специфической активности иммуноглобулинов не более чем на одно двукратное разведение, но не оказывает влияния на соотношение классов иммуноглобулинов в препарате.

В экспериментах на обезьянах, больных острой кишечной, инфекцией с диарейным синдромом, впервые показано, что разработанные твердые дозированные формы КИП - таблетки и капсулы обладают терапевтической эффективностью, не уступающей таковой препарата, выпускаемого в настоящее время в виде сухой массы во флаконах, и достоверно превосходят эффективность антибиотикотерапии.

Практическая значимость

Использование сульфата меди на стадии выделения иммуноглобулинов из осадка Б, как основного фракционирующего агента, а экстрагента липидов и липопротеидов - хлороформа в концентрации не более 1%, исключает необходимость соблюдения особых условий проведения процесса, что, в свою очередь, обеспечивает снижение трудоемкости и повышение рентабельности всей технологии приготовления препарата.

Интенсивность подвода тепла к высушиваемому препарату на этапе сублимации влаги позволяет сократить длительность не только этого этапа, но и всего процесса высушивания КИП в 2,7 раза до 14 часов.

Лекарственные формы комплексного иммуноглобулинового препарата, приготовленные по разработанной технологии, показали эффективность лечения обезьян, больных диарейными заболеваниями, в питомнике ГУ НИИ медицинской приматологии РАМН: Рекомендованы проведения клинических испытаний готовых лекарственных форм комплексного иммуноглобулинового препарата - капсул, таблеток, флаконов на людях.

Внедрение результатов работы.

На основании проведенных исследований оформлены шесть патентов на изобретения:

1. Патент РФ. № 2189833, А61К 39/395. Способ получения иммуноглобулинового препарата / A.B. Зорик, В.А. Алешкин, А.Г. Лютов, И.В. Борисова Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 19 октября 2000. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

2. Патент РФ. № 2255766, МПК А61К 39/395. Способ получения иммуноглобулинового препарата для профилактики и терапии бактериальных и вирусных инфекций, иммуноглобулиновый препарат для профилактики и терапии бактериальных и вирусных инфекций (варианты) и суппозитории на основе иммуноглобулинового препарата / Алешкин В.А. Новикова Л.И., Афанасьев С.С., Борисова И.В., Зуева М.М., Зорик A.B. . Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 5 марта 2003. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

3. Патент РФ. № 2247578, МПК А61К 39/395. Состав, обладающий противомикробным действием / Мелихова A.B., Алешкин В.А., Давыдкин В.Ю., Давыдкин И.Ю., Афанасьев С.С., Борисова И.В., Рубальский О.В., Гаврин А.Г. (Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10 марта 2005. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

4. Патент РФ. № 2334503, МПК A61J 3/10. Способ таблетирования медицинских иммунобиологических препаратов / Давыдкин И.Ю., Алешкин

B.А., Давыдкин В.Ю., Рубальский О.В., Гаврин А.Г., Мелихова A.B., Афанасьев

C.С. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской

Федерации 27 сентября 2008. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

5. Патент РФ. № 2371200, МПК А61К 39/395. Способ получения иммуноглобулинового препарата / Мелихова A.B., Давыдкин В.Ю. Алешкин В.А., Давыдкин И.Ю. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 октября 2009. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

Экспериментальные серии препаратов КИП прошли успешные испытания при лечении больных ОКИ обезьян в питомнике ГУ НИИ медицинской приматологии РАМН (г. Сочи - Адлер) под руководством академика РАМН, профессора Б.А. Лапина и доктора медицинских наук, профессора Э.К. Джикидзе. Акт о доклинических испытаниях от 9 апреля 2009 года.

Положения, выносимые на защиту:

1. Критериями качества осадков Б как сырья для производства комплексного иммуноглобулииового препарата являются концентрации общего белка и иммуноглобулинов, распределение иммуноглобулинов по классам IgG, IgA, IgM, титр антител к сальмонеллам, а также производный показатель, характеризующий долю иммуноглобулинов от общего белка.

2. Разработанный способ получения комплексного иммуноглобулииового препарата включает последовательную обработку гомогенизата осадка Б (III фракция по Кону) хлороформом и сульфатом меди, выделение иммуноглобулиновой фракции методом ультрафильтрации в присутствии комплексообразующего соединения с последующим концентрированием и возможным осаждением фракции полиэтиленгликолем, растворение осадка иммуноглобулинов, стабилизацию и стерилизующую фильтрацию.

3. Сухая субстанция комплексного иммуноглобулииового препарата пригодна для приготовления капсульной и таблетированной форм с использованием метода стерилизации у-облучением.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены на: Российской • конференции "Организм и окружающая среда: жизнеобеспечение и защита человека в экстремальных условиях", Москва; 2000; научно-практической конференции «Медицина будущего», Краснодар-Сочи, 2002; Международной научно-практической конференции памяти Г.И.Гончаровой «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования», Москва, 2002; IX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2002; 1-м международном Конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития», Москва, 2002; Третьей международной конференции, посвященной 80-летию института имени Пастера, «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», Санкт-Петербург, 2003; Научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения», Москва, 2003; XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2004; Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы совершенствования технологии производства и переработки продукции сельского хозяйства», Йошкар-Ола, 2005; Международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии в опытах на обезьянах», Сочи-Адлер, 2007.

Публикации

Объем и структура диссертации

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Мелихова, Александра Вадимовна

выводы

1. Показано, что наиболее информативными критериями качества осадков Б являются концентрации белка и иммуноглобулинов, отношение содержания антител к общему белку, процентное распределение иммуноглобулинов по классам 1§А, ^М, а также титр антител к сальмонеллам.

4. Показано, что при стерилизации сухой субстанции комплексного иммуноглобулинового препарата гамма-излучением при дозе облучения 20 кГр препарат удовлетворяет всем требованиям ФСП 42-0381-3757-02.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мелихова, Александра Вадимовна, Москва

1. Ашмарин И. П., Васильев H.H., Амбросов В.А.Быстрые методы статистической обработки и планирование экспериментов. JI; Издательство Ленинградского ун-та, 1974.-С.76

2. Ашмарин И. П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л; Издательство Ленинградского ун-та, 1962.-С.179

3. Анастасиев В.В. Регуляция биологических систем. Горький, 1990.

4. Байрушин Ф.Т. Разработка промышленной технологии получения нового лечебного препарата «Орозин»: Дне.канд. биол. наук: 14.00.36. Уфа, 1995.- 102с.

5. Бейли К., Нейрот Г. Белки. М., 1996. - 4.2.

6. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. М., 1998.

7. Бекер М.Е. Биотехнология микробного синтеза. Рига: Зинагне, 1980.

8. Бланков Б.И., Клебанов Д.Л. Применение лиофилизации в микробиологии. -М.: Медгиз, 1961.

9. Большой энциклопедический словарь. Биология / Под ред. М. С. Гилярова. М.: Научное издательство «Большая Российская энциклопедия», 1998.-С. 355.

10. Большой энциклопедический словарь. Химия / Под ред. И.Л. Кнунянц. -М., 1998-С. 792.

11. Борисова И.В., Мухина H.A. Получение и исследование иммуноглобулинов из отходов производства препаратов крови // Сб. науч. тр. «Препараты нормальных и специфических иммуноглобулинов человека» М., 1976.-Т. XVIII.-С. 69-78.

12. Борисова И.В. Содержание иммуноглобулинов в сыворотках крови и в отходах производства у-глобулина (в осадке Б) // Сб. науч. тр. «Препараты нормальных и специфических иммуноглобулинов человека». М., 1976. -T.XVIII. - С. 66-68.

13. Борисова И.В. Экспериментальные исследования по получению комплексных препаратов иммуноглобулинов из сывороток плацентарной крови: Дис.канд. биол. наук: 14.00.36.-М., 1979.

14. Бэйли Дж. Методы химии белков. М., 1965.

15. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972.

16. Влияние гамма-облучения на иммобилизированный трипсин / Рыльцев В.В., Власов Л.Г., Самойлова Т.И. и др. // Прикладная биохимия и микробиология. 1984. - Т. 20, № 5. - С. 694-698.

17. Влияние гамма-излучения на компоненты вируса гепатита В и дельта-антиген / Михайлов М.И., Самойленко И.И., Заиров Г.К., Ананьев В.А. // Вопросы вирусологии. 1987. - Т. 32, № 1. - С. 68-71.

18. Влияние гамма-облучения на ферментативную активность коллалитина в процессе хранения / Белов A.A., Белова Л.А., Рыльцев В.В. и др. // Радиобиология. 1990. - Т. 30, № 4. - С. 519-521.

19. Влияние стабилизируемых добавок на аптикомплеменгарную активность иммуноглобулина / Доронина H.A., Сарафанова Л.Н., Мигунов В.Н. и др. // Сб. науч. тр. « Иммуноглобулины» Нижегородского мед. института под ред. Анастасиева В.В. -Н. Новгород, 1993.

20. Волькенштейн М.А. Б ио неорганическая химия и молекулярная биология // Молек.биол. 1982. - № 5. - С. 901-902.

21. Воспаление // Руководство для врачей под ред. В. В. Серова, В. С. Паукова. М., 1995г.

22. Временная инструкция по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода «ускоренного старения» при повышенной температуре. М., 1983.

23. Гапонов К.П. Процессы и аппараты микробиологических производств. -Л.: Легкая и пищевая промышленность, 1981.

24. Голубев Л.Г., Сажин Б.С., Валашек Е.Р. Сушка в химико-фармацевтической промышленности. -М.: Медицина, 1978.

25. Государственная фармакопея СССР X изд. М.: Медицина, 1968.

26. Государственная фармакопея СССР. 11-е изд. (репринтное) - Вып. 1,2. - М.: Медицина, 1998.

27. Даванков В.А., Навратил Дж. Уолтон. Лигандообменная хроматография. -М., 1989.

28. Давыдкин Ю.П., Похиленко В.Д., Давыдкин В.Ю., Давыдкин И.Ю. Анализ системы получения продуктов тонкого биотехнологического синтеза с позиции системного подхода: Микробиологическое производство: Обзорн. информ. М.: НИИСЭНТИ, 1992. - Вып. 1. - 20с.

29. Долгих В.Т. Основы иммунологии. М., 2000г.

30. Дэвени Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды и белки. -М., 1976г.

31. Евстратова К.И., Купина H.A., Малахова Е.Е. Физическия и коллоидная химия. М., 1990.

32. Зигмонди Р. Коллоидная химия. Киев, 1949.

33. Иммунитет слизистых или местный иммунитет / Richard Zeff // В кн.: Системы организма человека. Иммунология. 1996-1997. - Т.Н.

34. Иммунобиологические препараты и перспективы их при-менения в инфектологии / Под ред. Г.Г. Онищенко, В.А. Алешкина, С.С. Афанасьева, В.В. Поспеловой. М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2002.

35. Иммуногенность лечебных препаратов из плазмы, которые прошли термическую обработку / Jerry Kanellos // Downstream: Отчет о первой конференции по биотехнологии производства препаратов из плазмы. -Австралия. 1999.-Вып. 31.- С. 15-16.

36. Иммуноглобулины // Под ред. Г. Литмена, Р. Гуда. М.: Мир, 1981. -484 с.

37. Иммуноглобулины: Сб. науч. тр. / Нижегородский мед. ин-т; Ред. В.В. Анастасиев. Н. Новгород, 1998.

38. Иммуноглобулиновые препараты для энгерального применения в практике лечения детей и взрослых / Грачева H. М., Петров М. С., Аваков A.A., Партии О.С. // Новые лекарственные препараты. 2003. - Вып. 4. - С. 33-42.

39. Иммунологические методы / Под редакцией Г.Ф. Фримеля. М.: Медицина, 1987.

40. Исследование и разработка нового жидкого иммуноглобулина для внутривенного ведения: Vigam Liquid / John More // Downstream: Отчет о первой конференции по биотехнологии производства препаратов из плазмы. -Австралия, 1999. Вып. 31. - С. 22-24.

41. Колмакова М.В. Разработка технологии производства сывороточного альбумина лошади и использование его в иммунологической практике: Автореф. дис.канд. биол. наук: 14.00.36.-М., 1988.-19с.

42. Кошляков Д.А., Кошляк В.В. Парентеральное пищеварение и природа антител // Персиановский сборник. 1998.

43. Кофакт-концентрат проотромбинового комплекса с двойной инактивацией вирусов / J. Over // Downstream: Отчет о первой конференции по биотехнологии производства препаратов из плазмы. Австралия, 1999. - Вып. 31.-С. 26.

44. Краткая медицинская энциклопедия / Под ред. В.И. Покровского. М.: Научно-практическое объединение «Медицинская энциклопедия». «Крон-пресс», 1994. - Том 1. - С. 598.

45. Кузин A.M., Каушанский Д.А. Прикладная радиобиология. М.: Энергоиздаг, 1981. - С. 15,46.

46. Кульберг А.Я. Иммуноглобулины как биологические регуляторы. М.,1975.

47. Кяйвяряйнен А.И. Динамическое поведение белков, в водной среде и их функции. Л.: Наука, 1980. - 272 с.

48. Мазо В.К., Конышев В.А., Шатерников В.А. // Вопросы питания. 1982. - № 4. - С. 3-10.

49. Машковский М.А. Лекарственные средства. М.: Медицина, 1993. -Ч. И. - С. 466-467.

50. Место иммуноглобулиновых препаратов в лечении и реабилитации инфекционных больных / Алешкин В.А, Лютов А.Г., Афанасьев С.С. и др. // Новые лекарственные препараты. М., 2003. - Вып. 4. - С. 6-7.

51. Методы производства препаратов иммуноглобулина // Доклад Комитета экспертов ВОЗ «Использование иммуноглобулинов человека»: Серия технических докладов. ВОЗ. - № 327.

52. Методы очистки белков/ Р.Скоупс- М.: Мир, 1985.-С.57-90.

53. Милютина Л.Н., Воротынцева Н.В. Стратегия и тактика этиотропной терапии острых кишечных инфекций у детей на современном этапе // Антибиотики и химиотерапия. 1993. - Т. 38, № 1. - С. 46-52.

54. Молекулярная биология клетки / Б. Албертс, Д. Брей, Дж. Льюис и др. -М.: Мир, 1994.

55. Молекулярная биология. Физико-химические ¿методы и объекты молекулярной биологии / Под ред. Л.Л. Киселева. М., 1977. - Т. 10.

56. Новые иммуноглобулиновые препараты для энтерального применения / Алешкин В.А., Борисова И.В., Феклисова Л.В. и др. // Новые лекарственные препараты. М., 1997. - Вып. 2. - С. 3-11.

57. Общая химия / Н.Л. Глинка -Ленинград: Химия., 1980- С.217

58. Основы биохимии / А. Уайт, Ф. Хендлер, Э. Смит и др. М., 1981.

59. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985.

60. Очистка иммуноглобулинов хроматографией / J. Bertolini // Downstream: Отчет о первой конференции по биотехнологии производства препаратов из плазмы. Австралия, 1999. - Вып. 31. - С. 20-21.

61. Павлович С.А. Основы иммунологии. -Мн.: Выш. шк., 1997.

62. Петров Р.В. Иммунология и иммуногенетика. М.: Медицина, 1976.

63. Подольский М.В. Высушивание препаратов крови и кровезаменителей. -М.: Медицина, 1973.

64. Получение иммуноглобулинов для внутривенного введения, свободных от биологически активных примесей // Сб. науч. тр. под ред. Блохиной И.Н. «Иммуноглобулины и другие препараты крови». Горький, 1986. - С. 69-73.

65. Пономарев В.Д. Аналитическая химия. М.: Медицина, 1977.

66. Практикум по биохимии, под ред. Мешковой Н.П. и Северина С. Е. -М., Изд-во Моск. ун-та, 1979. С.430. С-82-87.

67. Препараты из плазмы где мы находимся и куда движемся? // Downstream: Отчет о первой конференции по биотехнологии производства препаратов из плазмы. - Австралия, 1999. - Вып. 31. - С. 30-31.

68. Препараты крови // Инструктивно-методические материалы по контролю и производству (под ред. Буренкова С. П).- М.: МЗ СССР, 1976. С. 383.

69. Прозорская К.Н., Стефани Д.В., Штеренгарц Б.П. и др. // Иммунология.- 1981.-№ 5.-С. 7-8.

70. Производственный регламент. Комплексный иммуногло-булиновый препарат сухой для энтерального применения (КИП). Immunoglobulinum complexus siccum ad usum enteralem / Минздрав РФ: Введ. 30.05.1996. M., 1996.- 86с.

71. Равич-Щербо М.И., Новиков В.В. Физическая и коллоидная химия. М.,1975.

72. Русанов В.М., Скобелев Л.И. Фракционтрование белков плазмы в производстве препаратов крови -М.: Медицина, 1983. с. 74.

73. Рыльцев В.В., Игнатюк Т.Е. , Самойленко И.И. и др. // Тез. Докладов 1 Всесоюзного радиологического съезда. Пущино, 1989. - Т. 3. - С. 800.

74. Сапин М.Р., Этинген Л.Е. Иммунная система человека. М., 1996.

75. Справочник химика, под ред. Грива З.И., Коц В.А., Пиастро В.Д., Томарченко С.Л.//том 3 -М., изд. " Химия" Ленинград . отд. 1964 С-1006

76. Стабилизация физико-химических свойств препаратов иммуноглобулинов при хранении / Благородов С.Г., Шепелев А.П., Дмитриева Н.А. и др. // Сб. науч. тр. «Иммунологические препараты» МНИИЭМ им Г.Н. Габричевского.-М., 1989.

77. Стефани Д.В., Вельтищев Ю.Е. Иммунология и иммунопатология детского возраста. М., 1996.1983.

78. Таубкин С.И., Таубкин И.С. Пожаро- и взрывоопасноеть пылевидных материалов и технологических процессов их переработки. М.: Химия, 1976.

79. Технология INACTINE прогресс в инактивации вирусов обол очечных и безоболочечных // Downstream: Отчет о первой конференции по биотехнологии производства препаратов из плазмы. - Австралия, 1999. - Вып. 31.- С. 27-28.

80. Установки для сушки пищевых продуктов: Справочник / М.А. Гришин, В.И. Атаназевич, Ю.Г. Семенов. -М.: Агропромиздат, 1989.

81. Физико-химические методы и объекты молекулярной биологии. Молекулярная биология / Под ред. Л.Л. Киселева М. 1977. - Т. 10. - С. 61.

82. Филипович Ю.Б. Биохимия белка и нуклеиновых кислот. М.: Просвещение, 1978.

83. Фрагментация и агрегация IgG в препаратах у-глобулина / Никитина В.Д., Холчев Н.В., Шнайдер Г.В. и др. // Сб. науч. тр. «Препараты нормальных и специфических иммуноглобулинов человека». -М.,1976. Т.XVIII. - С. 21-29.

84. Фрайфелдер Д. Физическая биохимия. М., 1980.

85. Фракционирование плазмы с помощью хроматографии и осаждения полиэтиленгликолем и каприловой кислотой / Joergeen Dam // Downstream: Отчет о первой конференции по биотехнологии производства препаратов из плазмы. Австралия, 1999.-Вып. 31. - С. 17-18.

86. Хаджиев К.Х. Химия иммуноглобулинов. Ташкент, 1971.

87. Халенева М.П. Эффективность разных способов накопления и обезвоживания биомассы в производстве таблетированного бифидумбактерина: Дис.канд. биол. наук: 03.00.07. -М., 1984. -204с.

88. Холчев Н.В. Препараты нормальных и специфических иммуноглобулинов человека // Сб. трудов МНИИВС им. И.И. Мечникова «Очистка и стандартизация препаратов крови человека». М., 1980 - С. 3 - 14.

89. Черкес Ф. К., Богоявленская JI. Б., Вельская Н. А. Микробиология. М.: Медицина, 1986.-С. 511.

90. Чернохвостова Е.В., Герман Г.П. Иммунохимическая диагностика гаммапатий//Методические рекомендации. -М., 1984. С. 51.

91. Чекнеев С. Б., Бабаева Е. Е., Жаркова М. С., Воробьева У.А., Порошина А. А. // Конформационные изменения у- глобулина привзаимодействии с катионами меди. // Иммунология №3, Том 26 М.: Медицина, 2005.- С.146-150

92. Шарманов Т.Ш. Влияние перорального поступления специфических антител и антигенов на гуморальный иммунный ответ организма // Вестник АМН СССР, 1986. -№ 11.-С. 39-40.

93. Andre С., Hermans J.F. et al. // J. exp. Med.- 1985. Vol. 142. - P. 15091519.

94. A simple procedure for assessing the stability of heat-aggregated IgG preparations / McCarthy D. et al. // J. Immunol. Methods. 1981. - V.41. - P. 75-79.

95. Bleek. W. et al. // Clin, and Exp. Immunol. 1989. - Vol. 77.

96. Bleeker W.K. An animal model for the detection of hypotensive sude effects of immunoglobulin preparation // Vox Sang. 1987. - N 52. - P. 281-290.

97. Blum P.M., Phlps D.L., Auk B.J. et al.//Pediatr. Res. 1981. - Vol. 15.-P. 1256-1260.

98. Brandtzaeg P. Immunological function of the intestines // Nord Med. -1990. № 105 (4).-P. 116-118.

99. Brandtzaeg P. Molecular and cellular aspects of the secretory immunoglobulin system // APMIS. 1995. - № 103 (1). - P. 1-19.

100. Brandtzaeg P. The human intestinal immune system: basic cellular and humoral mechanisms // Baillieres Clin. Rheumatol. 1996. - № 10 (1). - P. 1-24.

101. Effect of gamma irradiation on biological activity of thyrotropin / Strbak V., Macho L., Sedlak J., Hromadova M. // Endocrinol. Exp. 1976. - Vol. 10, № 1. - P. 311.

102. Gemant A. // J. Mol. Biol. 1977. - N.4. - P. 283-287.

103. Halls N. The microbiology of irradiation sterilization // Med. Device. Technol. 1992. - Vol. 3, № 6. - P. 37-45.

104. Human immunodeficiency virus (HIV) inactivation of banked bone by gamma irradiation / Salai M., Vonsover A., Pritch M. et al. // Transplant. 1997. -Vol. 2, № 1. - P. 55-56.

105. Human intravenous immunoglobulin preparation and virus inactivation by pasteurizzation and solvent detergent treatment / Chang C.E., Eo H.G., Lee Y.S. et al. //Prep. Biochem. Biotechnol. -2001. № 31(1). - P. 81-82.

106. Huston B.M., Brecher M.E., Bandarenko N. Lack of efficacy for conventional gamma irradiation of platelet concentrates to abrogate bacterial growth // Am. J. Clin. Pathol. 1998. - Vol. 109, № 6. - P. 743-747.

107. Pessi A., Bianchi E., Crameri A. et al. // Nature. -1993.- Vol. 362. P. 367369

108. Inactivation of human immunodeficiency virus by gamma radiation and its effect on plasma and coagulation factors / Hiemstra PI., Tersmette M., Vos A.H. et al. // Transfusion. 1991. - Vol. 31. № 1. - P. 32-39.

109. International forum. Vox Sang. 40. - P. 48-61.

110. Jarrctt E.E. Hall E. // Immunology. 1983. - Vol.48. - P. 49-58.

111. Lamm M. E. IgA-mucosal immune system // Annu Rev. Microbiol. 1988.

112. Lamm M. E. Interaction of antigens and antibodies at mucosal surfaces // // Annu Rev. Microbiol. 1997. - № 51. - P. 311-340.

113. Losonsky G.A., Johnson J.P., Winkelstein J.A. et al. // J. Clin. Invest. -1985. Vol. 76, №6. - P. 2362-2367.

114. Metal chelate affinity chromatography a new approach to protein fractionation / Porath J., Carlsson J., Olsson I., Belfrage G. // Nature. - London;» 1975. -P. 258, 598.

115. Methods of plasma protein fractionation // Edited by Curling J.M. -Academic press. 1980.

116. Ontogeny of the mucosal immune system and IgA deficiency / Brandtzaeg P., Nilssen D.E., Rognum T.O., Thrane P.S. // Gastroenterol Clinic North Am. 1991. -№30(3).-P. 397-439.

117. Oral IgA-IgG treatment of chronic non-specific diarhoea in infants and children / Casswal T.H., Hammarstrom L., Veress B. et al. // Acta Paediatr. 1996. -№85 (9).-P. 1126-1128.

118. Patent application № 0450412A1 (EU). Heat-treated IgM antibody preparation / Tsay Grace C., Jesmok G. (US); MILES INC. (US). Appl. № 91104391.7; Date of filing 21.03.91; Date of publication 09.10.91; Bulletin 91/41.

119. Patent № 4027010 US. Antistaphylococcous human immunoglobulin and method of preparing same / Kiselev et al. (RU). Patented 31.05.1977.

120. Patent № 3916026 US. / Biotest Serum-Institut G.m.b.H. (GE). Appl. № 05422056.

121. Patent № 4318902 US. Concentrated immunoglobulin solution suited for intravenous administration / Slephan Wolfgan (DE); Biotest-Serum-Institut G.m.b.H. (DE). Appl. № 110038; Filed 07.01.1980; Patented 09.03.1982.

122. Patent № 4246085 US. Fractionation of proteins / Patrick Mattock (US); United Kingdom Atomic Energy Authority (UK). Appl. № 06112109; Filed 14.01.1980; Patented 20.01.1981.

123. Patent № 5087695 US. Immunoglobulin extraction utilizing properties of colloidal solutions / William A.J. McAuley (CA); MCY Laboratories Canada, Inc. (CA). Appl. № 378975; Filed 12.07.1989; Patented 11.02.1992.

124. Patent № 4581231US. Inactivation of viruses containing essential lipids / Robert H. Purcell, Stephen M. Feinstone (US). Appl. № 06528258; Filed 31.08.1983; Patented 08.04.1986.

125. Patent № 3808189 US. Isolation of gamma globulin preparation enriched in IgA and IgM using polyethylene glycol / Charles Benedict Breuer (US); American Cyanamid Company (US). Appl. № 341423; Filed 15.03.1973; Patented 30.04.1974.

126. Patent № 5359038 US. Method for isolation immunoglobulin compounds in the feces / Eloy Padron (US). Appl. № 050166; Filed 03.05.1993; Patented 25.10.1994.

127. Patent № 5792838 US. Method for stabilizing immunoglobulin compositions / Marjorie Smith, Valentina Riveros-Rojas (GB3); Glaxo Wellcom Inc. (NC). Appl. № 465319; Filed 05.06.1995; Patented 11.08.1998.

128. Patent № 4379086 US. Method of preparing immunoglobulin suitable for intravenous administration using PEG / Tokusuke Kimura, Fumio Kurosu (JP); Fujizoki Pharmaceutical Co., Ltd. (JP). Appl. № 383050; Filed 28.05.1982; Patented 05.04.1983.

129. Patent № 5169627 US. Oral pharmaceutical composition containing a polyethylene glycol immunoglobulin G conjugate for reconstitution of secretory immunity and method of reconstituting secretory immunity / Charlotte Cunningham

130. Rundles (US); Mount Sinai School of Medicine of the City University of New York (US). Appl. № 783360; Filed 28.10.1991; Patented 08.12.1992.

131. Patent № 3597409 US. Process for recovering immunoglobulin A and immunoglobulin M / Charles Benedict Breuer (US); American Cyanamid Company (US). Appl. № 40399; Filed 25.05.1970; Patented 03.08.1971.

132. Patent № 4256631 US. Process for the preparation of immunoglobulin for intravenous administration / Nobuo Yokoo, Toshihito Mori (JP); Kowa Company Ltd. (JP).- Appl.№> 131539; Filed 18.03.1980; Patented 17.03.1981.

133. Patent № 5410025 US. Unmodified intravenously administered immunoglobulin preparations containing immunoglobulin M and/or A / Wolfgang Moller, Detlef Piechaczek (DE); Biotest Pharma GmbH (DE). Appl. №--154149; Filed 18.11.1993; Patented 25.04.1995.

134. Peroral immunotherapy with yolk antibodies for the prevent and treatment of enteric infection / Carlander D., Kollberg H., Wejaker P.E., Larsson A. // Immunol. Res. 2000. - № 21(1). - P. 1-6.

135. Poison A., Ruiz-Bravo C. Fractionation of Plasma with Polyethylene Glycol //Vox Sang. 1972.-№23 (l).-P. 107-118.

136. Rosenqvist E. et al. Thermal properties of human IgG // Molecul. Immunol. 1987. - V. 24,N5. - P. 495-501.

137. Sato H., Kidaka T., Flori Mi Sterilization of therapeutic immunoadsorbents by ionizing radiation // Int. J. Artif. Organs. 1986. - Vol. 9, № 2. - P. 131-136.

138. Schmiegel W. FI., Thiele H.G. Immunoregulation by the gut-associated immune system // Immun. Infekt. 1982 Sep; 10(5). - P. 169-174.

139. Stahman M.A., Spenser A. K., Honald G.R. // J. Biopolymer. 1977. - V16. -P. 1370-1378.

140. Survival of oral human immune strum globulin in the gastrointestinal tract of low birth weight infants / Blum P.M., Phelps D.L., Ank B.J. et al. // Pediatr. Res. 1981 Sep; 15(9). - P. 1256-1260.

141. The effect of gamma irradiation on collagen molecules, isolated alphachains, and crosslinked native fibers / Cheung D.T., Perelman N., Tong D., Nimni M. E. // J. Biomed. Mater. Res. 1990. - Vol. 24, № 5. - P. 581-589.

142. Wolf H.M., Eibl M.M. The anti-inflammatory effect of an oral immunoglobulin (IgA- IgG) preparation and its possible relevance for the prevention of necrotizing enterocolitis // Institute of Immunology, University of Vienna, Austria.

Информация о работе

Мелихова, Александра Вадимовна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.06

Диссертация

Разработка технологии приготовления сухих дозированных форм комплексного иммуноглобулинового препарата - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы