Технология и конструирование сухих биопрепаратов на основе микрокапельных порошков

Давыдкин, Валерий Юрьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Технология и конструирование сухих биопрепаратов на основе микрокапельных порошков
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Технология и конструирование сухих биопрепаратов на основе микрокапельных порошков"

На правах рукописи

Давыдкин Валерий Юрьевич

ТЕХНОЛОГИЯ И КОНСТРУИРОВАНИЕ СУХИХ БИОПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ МИКРОКАПЕЛЬНЫХ ПОРОШКОВ

03.01.06 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

2 7 лНЗ 2011

Москва-2011

4843481

^ч^та выполнена в Федеральном Государственном учреждении науки «Московский 1у^о-исследопательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н.

;бричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный консультант:

Засл. деятель науки РФ, доктор медицинских Афанасьев Станислав Степанович наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Кочеровец Владимир Иванович

доктор медицинских наук, профессор Макаров Владимир Александрович

доктор биологических наук Холоденко Василий Петрович

Ведущая организация:

Открытое акционерное общество «БИОХИММАШ» - ведущая организация в области разработки продуктов, технологии и оборудования микробиологического синтеза, г. Москва

Защита диссертации состоится «_» _2011г. в_час. на

заседании Диссертационного совета Д 208.046.01 при Федеральном Государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального Государственного учреждения науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Автореферат разослан «_»__2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук .

О.Ю. Борисова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Важное значение симбиотической микрофлоры для организма человека к настоящему времени общепризнанно и обосновано результатами многочисленных исследований (Перетц Л.Г., 1955; Шендеров Б.А., 1998; Bongle D. et al., 1999).

Нарушения качественного и количественного состава симбиотической микрофлоры объединяются термином "дисбактериоз" (Грачева Н.М. с соавт., 1986; Воробьев A.A. с соавт., 1998).

Для коррекции дисбиотическнх нарушений микрофлоры применяется целый комплекс лечебных мероприятий с учетом клинических проявлений основного заболевания и степени выраженности дисбактериоза, а также данных лабораторных исследований микрофлоры биотопа и состояния реактивности организма. Однако основную роль играет дифференцированное применение различных иммунобиологических препаратов, в том числе пробиотиков, являющихся наиболее физиологичными для коррекции микрофлоры и профилактики дисбиотических изменений, а также препаратов, применяемых для повышения резистентности организма, восстановления иммунного статуса (Грачева Н.М. с соавт., 1986; Алешкин В.А с соавт., 2000).

Вместе с тем, до настоящего времени в производстве сухих биопрепаратов единственным широко используемым методом стабилизации свойств биологических субстанций остается сублимационное (лиофильное) высушивание. Этот способ, обеспечивая высокое качество продукта, отличается чрезмерной длительностью (до 2 суток), а получаемая сухая субстанция без дополнительной переработки непригодна для приготовления сухих дозированных форм препаратов (Халенева М.П., 1984; Несчисляев В.А., 2005). Кроме того, получаемые с использованием этого способа высушивания пероральные препараты на основе живых пробиотических микроорганизмов нуждаются в защите от кислотно-ферментного комплекса пищеварительной системы. По-видимому, этим, а также стремлением придать биологическому началу новые фармакокинетические свойства (повышенную

биодоступность и защищенность от воздействия неблагоприятных факторов хранения и применения), объясняется появление разработок, направленных на создание технологий с иммобилизацией биокомпонентов, которая осуществляется сорбцией на различных носителях (Бородин Ю.И. с соавт., 1998; Молокеев А.В. с соавт., 2001; Бартоломойз И. с соавт., 2003; Вайншток И.И. с соавт., 2007).

Одним из вариантов современной технологии с наименьшим количеством стадий и продолжительностью является описанный в патентной литературе способ с непосредственным обезвоживанием биомассы пробиотических микроорганизмов моно - или поликомпонентного состава сорбентами (Нахабин И.М. с соавт., 1996; Ходак В.И. с соавт., 1998). Высушивание биомассы и приготовление препарата происходит на одной технологической стадии. Однако вследствие прямого контакта биомассы с сорбентом выживаемость клеток пробиотических микроорганизмов не превышает 1020%. Отсутствуют также сведения о принципиальной возможности и эффективности применения такого способа для получения сухих биопрепаратов немикробной природы (например, иммуноглобулинов).

Таким образом, не существует современной технологии приготовления пероральных иммунобиологических препаратов, отличающейся универсальностью в плане возможности переработки биологических компонентов различной природы. Вместе с тем рациональное использование особых свойств нового вида биологического материала - микрокапельного порошка в сочетании с обоснованным выбором обезвоживания создают предпосылку для разработки такой технологии. Однако системных исследований в этом направлении не проводилось, что и определило актуальность данной работы.

Цель исследования: На модели микроорганизмов Bifidobacterium adolescentis МС-42, Lactobacillus acidophilus (смесь штаммов NKb ЮОаш, К3Ш24) и иммуноглобулиновых комплексов типа КИП экспериментально обосновать новый концептуальный принцип и практические подходы к конструированию и технологии приготовления сухих комплексных биопрепаратов для профилактики и лечения заболеваний, ассоциированных с дисбалансом нормофлоры желудочно-кишечного тракта.

Задачи исследования:

1. На основе анализа и в эксперименте идентифицировать микрокапельный порошок как дисперсную систему, определить его основные свойства и требования к размерам микрокапель жидкости. Обосновать выбор устройства для приготовления микрокапельного порошка.

2. Определить технологические показатели состояния системы аэросил-биообъект, исследовать устойчивость биообъектов к механическим нагрузкам, возникающим при диспергировании жидкой субстанции, и выбрать оптимальный режим приготовления микрокапельных порошков в электромагнитном диспергаторе.

3. Определить требования к сорбенту как структурному элементу и биологически активному компоненту препарата и на примере модельного микроорганизма обосновать методический подход к проведению процесса сорбционно-контактной сушки микрокапельного порошка. Доказать общность установленных положений при обезвоживании микрокапельных порошков микроорганизмов и КИП.

4. Исследовать основные закономерности конвективной сушки микрокапельного порошка при атмосферном давлении. Обосновать компонентный состав и методический подход к конструированию биопрепаратов на основе комплекса сывороточных иммуноглобулинов и пробиотических микроорганизмов.

5. В экспериментах in vitro исследовать защитные свойства структурного компонента препарата - наноразмерного разобщителя аэросила.

6. Оценить нетоксичность и безвредность комплексного биопрепарата КИП и В. adolescentis МС-42 в экспериментах на мелких лабораторных животных и здоровых приматах. Изучить терапевтическую эффективность препарата при лечении обезьян, больных острой кишечной инфекцией с диарейным синдромом.

Научная новизна

Получены знания о структуре, основных свойствах и способе получения нового вида биоматериала - микрокапельного порошка, образующегося при диспергировании биологической жидкости во взвешенном слое наноразмерного разобщителя аэросила. Наиболее эффективно процесс формирования порошка протекает в электромагнитном диспергаторе, принцип действия которого основан на передаче энергии вращающегося электромагнитного поля рабочим ферромагнитным телам, осуществляющим механическое дробление жидкости.

Показано, что степень инактивации биокомпонента при диспергировании жидкой субстанции обусловливается его восприимчивостью к механическим нагрузкам. Наиболее чувствительными оказались клетки L. acidophilus (смесь штаммов NKi, ЮОаш, К3Ш24) и В. adolescentis МС-42, клетки Е. coli М-17 занимают промежуточное положение, и наименее чувствительным является энтерококк Е. faecium ГНКИ-27. Значительно большей механоустойчивостыо, чем энтеральные микроорганизмы, обладают сывороточные иммуноглобулины трех основных классов (IgG, IgA и IgM) в растворе КИП.

Доказано, что закономерности протекания процесса сорбционно-контактной сушки микрокапельного порошка являются общими для биологических субстанций различной природы. При этом гибель клеток энтеральных микроорганизмов независимо от их видовой принадлежности составляет от 30 до 70%, а наибольшее снижение антисальмонеллезной активности иммуноглобулинов - одно двукратное разведение.

близких к оптимальной температуре роста этих микроорганизмов, во избежание интенсивной гибели клеток как в процессе конвективного обезвоживания, так и последующего досушивания сорбционно-контактным методом.

Исследованиями in vitro впервые показан защитный эффект аэросильной оболочки, проявляющийся в затруднении доступа к сухому биологическому началу паров воды из воздуха и агрессивных составляющих желудочного и кишечного соков, и таким образом обеспечивающий негигроскопичность препарата и повышенную биодоступность бактериального компонента.

Впервые проведенными доклиническими испытаниями комплексного биопрепарата КИП и В. adolescentis МС-42 показана его нетоксичность и безвредность для приматов, а также 100% терапевтическая эффективность при лечении обезьян, больных острой кишечной инфекцией с диарейным синдромом. Исчезновение клинических проявлений заболевания сопровождалось выраженными положительными изменениями в микробиоценозе желудочно-кишечного тракта обезьян - повышением содержания нормальных Е. coli, существенным снижением количества таких условно-патогенных микроорганизмов, как Staph. epidermis, представители родов Enterococcus, Proteus, Klebsiella, и полной элиминацией Citrobacter.

Теоретическое значение работы

Обоснован концептуальный принцип разработки биопрепаратов нового поколения для коррекции дисбиотических нарушений в биотопах организма, базирующийся на сочетании в одной лекарственной форме обогащенных иммуноглобулиновых комплексов типа КИП с микробными пробиотиками, обладающими широким спектром и высоким уровнем антагонистической активности в отношении как патогенных, так и условно-патогенных возбудителей заболеваний.

Предложен метод конструирования сухих биопрепаратов, заключающийся в использовании особых свойств микрокапельного порошка и обеспечивающий получение препаратов перорального применения на основе биологических субстанций различной природы. Этот метод может быть использован в дальнейшем при разработке иммунобиологических препаратов для профилактики и терапии других заболеваний.

Практическая значимость

Предложен новый вид биологических материалов - микрокапельный порошок, относящийся к трехфазным микрогетерогенным дисперсным системам и обладающий вследствие особой структуры одновременно свойствами сухого порошка и жидкого аэрозоля, что существенно расширяет возможности его технологической переработки и обусловливает наличие улучшенных фармакокинетических свойств у сухого препарата.

Разработан способ обработки материалов и конструкция электромагнитного диспергатора для осуществления технологического процесса получения

микрокапельного порошка биологических жидкостей. Предложена упрощенная методика перехода при переработке суспензий микроорганизмов различных видов, базирующаяся на общей для большинства бактерий закономерности экспоненциальной их гибели с увеличением интенсивности механического воздействия.

Аналитически и экспериментально выдвинут ряд требований к физическим, физико-химическим и биологическим характеристикам сорбента, позволяющих обосновать его выбор в качестве структурного элемента сухого биопрепарата, получаемого сорбционно-контактной сушкой микрокапельного порошка.

Введение в технологическую схему двухэтапной стадии обезвоживания микрокапельных порошков приводит к несущественному увеличению длительности технологического цикла, обеспечивая повышение выживаемости бифидобактерий и лактобацилл до 50-70% и сохранение без потери антисальмонеллезной активности сывороточных иммуноглобулинов. Полученные результаты по выживаемости микроорганизмов не уступают, а по соханению специфической активности иммуноглобулинов превосходят результаты их лифильного обезвоживания.

Защита аэросильной оболочкой сухого биологического начала от воздействия влаги воздуха и агрессивных составляющих желудочного и кишечного соков обеспечивает следующие преимущества. Во-первых, исключается необходимость проведения специальных мероприятий, направленных на предотвращение гидратации препарата при выполнении технологических операций, что упрощает и удешевляет технологию в целом, а во-вторых, снижается инактивация биокомпонента при прохождении верхних отделов желудочно-кишечного тракта, что делает возможным уменьшение доз лекарственных веществ в препарате для достижения адекватного терапевтического эффекта.

С использованием разработанного метода сконструированы комплексные биопрепараты КИП и В. adolescentis МС-42, КИП и L. acidophilus (смесь штаммов NKi, ЮОаш и К3Ш24).

Внедрение результатов работы

На базе лаборатории медицинской биотехнологии ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора разработаны и приготовлены экспериментальные серии комплексных биопрепаратов КИП и В. adolescentis МС-42, КИП и L. acidophilus (штаммы NKb ЮОаш и К3Ш24).

На основании проведенных исследований оформлено 10 патентов на изобретения:

1. Пат. 1831801 СССР, B01F 13/08. Устройство для обработки материалов / И.Ю. Давыдкин, Ю.П. Давыдкин, В.Ю. Давыдкин, В.М. Блинов, С.Д. Никитинский (СССР). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 13.10.1992. Патентообладатель коллектив авторов.

2. Пат. 2026730 РФ, B01F 13/08. Способ обработки материалов / И.Ю. Давыдкин, Ю.П. Давыдкин, В.Ю. Давыдкин, В.М. Блинов, С.Д. Никитинский (РФ).

Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.01.95. Патентообладатель коллектив авторов.

3. Пат. 2161887 RU, A23D 9/00. Биологическая активная добавка / В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, В.Ю. Давыдкин, О.В. Рубальский, И.Ю. Давыдкин, Г.И. Ханина, А.Г. Гаврин, A.B. Алешкин, JI.A. Денисов, Д.С. Афанасьев, М.С. Афанасьев (RU). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.01.2001. Патентообладатель коллектив авторов.

4. Пат. 2164765 RU, A23L 1/30. Биологически активная добавка / В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, О.В. Рубальский, В.Ю. Давыдкин, Л.А. Денисов, И.Ю. Давыдкин, А.Г. Гаврин, A.B. Алешкин, Д.С. Афанасьев, М.С. Афанасьев (RU). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10.04.2001. Патентообладатель коллектив авторов.

5. Пат. 2240136 RU, А61К 39/395. Композиция, содержащая иммуноглобулины и целевые добавки / В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин, А.Г. Гаврин, О.В. Рубальский, A.B. Мелихова, И.В. Борисова, М.С. Афанасьев, Л.И. Новикова (RU). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.11.2004. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

6. Пат. 2247578 RU, А61К 39/395. Состав, обладающий противомикробным действием / A.B. Мелихова, В.А. Алешкин, В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин, С.С. Афанасьев, И.В. Борисова, О.В. Рубальский, А.Г. Гаврин (RU). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10.03.2005. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

7. Патент РФ № 2371200, МПК А61К 39/395. Способ получения иммуноглобулинового препарата / Мелихова A.B., Давыдкин В.Ю., Алешкин В.А., Давыдкин И.Ю. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27.10.2009. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

8. Пат. 2317064 RU, МПК А61К 6/00. Способ определения защитного действия покрытия капсул от содержимого желудка / Алешкин В.А., Лапин Б.А., Афанасьев С.С., Джикидзе Э.К., Симавонян К.В., Давыдкин В.Ю., Давыдкин И.Ю., Холодилова Л.И., Мелихова A.B., Трофимова Л.И., Кебу Т.И., Калашникова В.А., Егорова Т.П. (RU). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.04.2008. Патентообладатели ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, ГУ НИИ МП РАМН.

9. Пат. 2317065 RU, МПК А61К 6/00. Способ определения целевой доставки в желудочно-кишечном тракте твердой лекарственной формы с защитным покрытием / Алешкин В.А., Лапин Б.А., Давыдкин В.Ю., Джикидзе Э.К., Мелихова A.B., Симавонян К.В., Рубальский О.В., Давыдкин И.Ю. (RU). Зарегистрирован в

Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.02.2008. Патентообладатель коллектив авторов.

10. Пат. 2322506 RU, МПК C12Q 1/02. Способ определения защитного действия покрытия капсул для штамма Bifidobacterium adolescentis МС42 от содержимого желудка / Алешкин В.А., Лапин Б.А., Афанасьев С.С., Джикидзе Э.К., Симавонян К.В., Давыдкин В.Ю., Давыдкин И.Ю., Воропаева Е.А., Рубальский О.В., Холодилова Л.И., Мелихова А.В., Трофимова Л.И., Кебу Т.Н., Байракова А.Л., Калашникова В.А., Афанасьев М.С., Егорова Т.П. (RU). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.04.2008. Патентообладатели ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, ГУ НИИ МП РАМН.

Результаты исследований использованы в ОКБ А (г. Йошкар-Ола) при разработке и испытаниях аквабиодиспергатора на базе плоских двухсторонних индукторов, а также ОНОПБ (п. Восточный) при отработке промышленной технологии получения препаратов ветеринарного и медицинского назначения. Акты внедрения от 26 ноября 1991 г. и 22 октября 1992 г.

Экспериментальная серия комплексного биопрепарата КИП и В. adolescentis МС-42 прошла успешные доклинические испытания при лечении больных ОКИ обезьян в питомнике ГУ НИИ медицинской приматологии РАМН (г. Сочи - Адлер) под руководством академика РАМН, профессора Б.А. Лапина и доктора медицинских наук, профессора Э.К. Джикидзе. Акт о доклинических испытаниях от 9 апреля 2009г.

Методика доклинических испытаний биопрепаратов, разработанная в ходе выполнения работы совместно с сотрудниками ГУ НИИ медицинской приматологии РАМН, легла в основу разработки «Новые алгоритмы доклинических испытаний неинъекционных иммунобиологических препаратов и БАД», награжденной серебряной медалью VII Московского международного салона инноваций и инвестиций на ВВЦ (Москва) в 2007 г.

Разработан лабораторный регламент приготовления комплексного биопрепарата КИП и В. adolescentis МС-42.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанная универсальная технология приготовления сухих энтеральных биопрепаратов позволяет перерабатывать жидкие биологические субстанции различной природы и основана на переводе субстанций в устойчивое микрокапельное состояние в виде высокодисперсного порошка, что, в свою очередь, позволяет использовать различные интенсивные, в том числе и комбинированные, способы обезвоживания для получения сухих биопрепаратов.

2. Структурный компонент препарата - аэросил оказывает защитный эффект, проявляющийся в ограничении доступа к сухому биокомпоненту паров воды из воздуха и агрессивных составляющих желудочного и кишечного соков, в результате чего препарат приобретает повышенную устойчивость к неблагоприятным факторам пребывания в атмосфере воздуха и прохождения желудочно-кишечного тракта.

3. Концепция разработки биопрепаратов нового поколения для коррекции дисбиотических нарушений в микробиоценозе желудочно-кишечного тракта базируется на конструировании комплексных препаратов на основе сочетания обогащенных иммуноглобулиновых комплексов типа КИП с микробными пробиотиками, в совокупности обладающими широким спектром и высоким уровнем антагонистической активности в отношении как патогенных, так и условно-патогенных возбудителей заболеваний.

Апробация работы:

Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора 28 апреля 2009 г. протокол № 4.

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на VII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, 2000); VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (г. Москва, 2002); Международной научно-практической конференции памяти Г.И. Гончаровой «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования» (г. Москва, 2002); IX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, 2002); 1-м международном Конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (г. Москва, 2002); Третьей международной конференции, посвященной 80-летию института имени Пастера, «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (г. Санкт-Петербург, 2003); П-м Московском международном Конгрессе «Биотехнология; состояние и перспективы развития» (г. Москва, 2003); Научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения» (г. Москва, 2003); XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, 2004); Международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» (г. Москва, 2004); Симпозиуме «Лабораторные приматы для решения актуальных проблем медицины и биологии» (г. Москва, 2004); Третьей международной конференции «Высокие медицинские технологии XXI века» (г. Бенидорм, Испания, 2004); Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы совершенствования технологии производства и переработки продукции сельского хозяйства» (г. Йошкар-Ола, 2005); Всероссийской научной конференции «Перспективные направления использования лабораторных приматов в медико-биологических исследованиях» (г. Сочи-Адлер, 2006); Всероссийской конференции, посвященной 75-летию со дня открытия Чувашской государственной сельскохозяйственной академии (г. Чебоксары, 2006); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (г. Москва, 2007); Международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии в опытах на обезьянах» (г. Сочи-Адлер, 2007); Юбилейной Всероссийской научно-

практической конференции "Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения" (г. Н.Новгород, 2009).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 60 печатных работ, в том числе: 7 - в изданиях, рекомендованных ВАК Российской Федерации, 6 - в периодических изданиях, 4 - в сборниках научных трудов, 32 - в материалах конференций, разделы в 1 монографии, 10 патентов РФ на изобретения.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на русском языке и состоит из введения, 8 глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Общий объем диссертации 271 страница. Работа иллюстрирована 43 таблицами и 41 рисунком. Список литературы включает 474 работы, в том числе 378 - отечественных и 96 - иностранных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Материалы. В качестве модельного микроорганизма использовали облигатмые аэробные бактерии Serratia marcescens ВКМ-851. В исследованиях использовали также: Entherococcus (Sir.) faecium ГНКИ-27 - биокомпонент некоторых пробиотических препаратов; Escherihia coli М-17 - биокомпонент пробиотического препарата Колибактерин; Bifidobacterium adolescentis МС-42 - биокомпонент пробиотического препарата Бифидин; Lactobacillus acidophilus штаммы NK1; ЮОаш и К3Ш24- биокомпоненты пробиотика Ацилакт.

Для защиты коли - и бифидобактерий и лактобацилл от неблагоприятных факторов обезвоживания использовали сахарозо-желатиновую (СЖ) среду состава (% масс.): сахароза - 10, желатин пищевой - 1. Для остальных микроорганизмов -лактозо-тиомочевинную защитную среду (ЗС) состава (% масс.): лактоза - 20,0, тиомочевина - 6,6, полиглюкин - 1,5, аскорбиновая кислота - 3,6, вода дистиллированная - 68,3.

В качестве компонента комбинированного биопрепарата использовали комплексный иммуноглобулиновый препарат (КИП) жидкий (полуфабрикат), приготовленный в соответствии с патентом РФ № 2189833, А61К 39/395. Стабилизацию раствора КИП" перед обезвоживанием осуществляли введением в белковый раствор глицина и глюкозы в концентрации соответственно 1 и 2 % от объема раствора.

Для анализа иммуноглобулиновых фракций КИП использовали моноспецифические антисыворотки к иммуноглобулинам человека - IgG, IgM и IgA (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи), сыворотку крови человека с известным содержанием иммуноглобулинов (ППБП ЦНИИВС им. И.И. Мечникова), антисыворотку ко всем белкам плазмы крови человека (ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского).

Оценку изменения специфической активности КИП проводили с помощью диагностикума эритроцитарного сальмонеллезного О-антигенного жидкого (комплексного) по ФС 42-3408-97 (ГУП ПБП им. Г.Н. Габричевского).

Стабилизацию жидкости при получении микрокапельных порошков осуществляли гидрофобным аэросилом марки АМ-1-300 (Калуш, Украина) и R 972 (Degussa, Германия).

В качестве основных влагоемких сорбентов использовали карбоксильный катионит КБ-4П-2 с pH водной вытяжки 10,0-11,0 и окись алюминия основную с pH водной вытяжки 8,0-9,0.

Для регидратации микрокапельных порошков и полученных из них сухих биоматериалов использовали 0,85% раствор натрия хлорида с pH 5,6-5,8 с 1% Tween 20.

Животные. Испытания острой токсичности комплексного биопрепарата на основе КИП и бифидобактерий проведены на 50 беспородных белых мышах обоих полов на базе вивария ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

Изучение переносимости и терапевтической эффективности препарата проводили на обезьянах в клинике ГУ НИИ медицинской приматологии РАМН (г. Сочи - Адлер). В исследованиях использовали обезьян вида макак резус и макак яванский весом 1,0-9,5 кг в возрасте от 1,1 до 20 лет. Использовано 5 здоровых и 29 больных острой кишечной инфекцией с диарейным синдромом обезьян.

Микробиологические методы

Для глубинного выращивания marcescens применяли питательную среду (ПС) на основе гидролизата рыбо-костной муки (РКМ) с 0,8 % глюкозы. Культивирование Е. faecium и Е. coli проводили в ПС на основе ферментативного гидролизата казеина (ФГК). Накопление клеток В. adolescentis осуществляли в казеиново-дрожжевой (КД-5) среде и модифицированной среде КД-5с. Накопление клеток L. acidophilus проводили в гидролизатно-молочной (ГМ) среде. Питательные среды готовили в отделе питательных сред ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

Культивирование S. marcescens осуществляли в стеклянных колбах вместимостью 500 и 750 см3 при коэффициенте заполнения 0,2-0,3, частоте встряхивания 200-250 мин"1 в термостатируемой качалке G24 (New Brunswick Scientific, США). Температура и длительность процесса выращивания S marcescens составляли (29±1)°С и 24-30 часов соответственно. Энтеробактерии культивировали без аэрации при (36,6±0,5)°С в течение 15-17 часов. Биомассу В. adolescentis МС-42 и смеси трех штаммов L. acidophilus выращивали в лаборатории биологии бифидобактерий ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (рук. лаб., д.б.н. A.M. Амерханова).

Концентрирование выращенной биомассы S. marcescens, Е. faecium и Е. coli осуществляли гравитационным разделением в центрифугах МК-2 (MSE,

Великобритания) и T-24D (MLW, Германия), а также микрофильтрацией с использованием установок Н1Р100-43 (Amicon, США) и отечественного лабораторного аналога с половолоконным патроном типа АР-2 (Кириши). Бифидобактерии и лактобациллы использовали без концентрирования.

Подготовку биомассы к обезвоживанию проводили смешением концентрированной биосуспензии соответствующих микроорганизмов с защитной средой в массовом соотношении 2:1.

Акустическое воздействие на клетки микроорганизмов осуществляли с использованием ультразвуковой ванны Laborette (Fritch, Германия).

Ресуспендирование проб биоматериалов осуществляли с использованием программируемого ротационного шуттель-аппарата Multi RS-60 (Вектор-Бест, Россия) не менее 30 мин.

Концентрацию энтеробактерий в материалах определяли по росту в пробирках с жидкой питательной средой методом последовательных десятикратных разведений. Количество жизнеспособных энтеробактерий в пробе препарата рассчитывали как произведение числа живых особей в последнем разведении на 10 в степени номера предпоследней пробирки (Бевз Н.И., 1991). Биологическую концентрацию живых аэробных микроорганизмов в материалах определяли методом Пастера-Коха путем высева проб материалов на плотные питательные среды (Перт С. Дж., 1978).

Жизнеспособность микроорганизмов после воздействия различных факторов оценивали по их выживаемости. Выживаемость микроорганизмов в процессе хранения материалов определяли по отношению концентрации живых клеток в хранившихся материалах к таковой в свежеприготовленных.

Иммунохимические методы

Преципитацию в геле по Оухтерлони проводили в 1 % агаре с использованием моноспецифических антисывороток к IgG, IgA, IgM человека (Фримель Г.Ф., 1987).

Иммуноэлектрофорез проводили в 1,5 % агаре на стеклянной пластине размером 9x12 см в аппарате Multifor (LKB, Швеция) в течение 1,0-1,5 ч при силе тока 40 мА и напряжении 200 В (Чернохвостова Е.А. с соавт., 1984).

Определение концентрации иммуноглобулинов в образцах проводили методом радиальной иммунодиффузии по Манчини в 1% агарозе (Чернохвостова Е.А. с соавт., 1984).

Определение антисальмонеллезной активности осуществляли в реакции пассивной гемагглютинации с помощью соответствующих диагностикумов согласно инструкциям производителя.

Физико-химические методы

Концентрацию белка в образцах определяли спектрофотометрически на СФ-46 (ЛОМО, РОССИЯ) или КФК-3-01 (ЗОМЗ, Россия) по оптической плотности исследуемого белкового раствора при длине волны 280 и 260 им.

Концентрацию ионов водорода в дистиллированной воде, различных растворах, защитных средах, суспензиях микроорганизмов измеряли с помощью рН-метров Seven Easy и MP 225 (Mettler Toledo, Швейцария).

Физические методы

Массы навесок материалов измеряли с использованием весов лабораторных 1212МР (Sartorius, Германия), Adventurer (Ohaus, Швейцария) и аналитических WA-35 (PRLT, Польша), Adventurer Pro (Ohaus, Швейцария).

Относительную и остаточную влажность различных материалов определяли гравиметрически, выдерживанием навесок в сухо-жаровом шкафу при 105°С до постоянной массы по ГОСТ 24061-80.

Относительную влажность воздуха в помещениях измеряли гигрометром М-19 по ТУ 25-04-1862-72.

Вязкость растворов и биосуспензий определяли, используя стеклянные капиллярные вискозиметры типа ВПЖ, по методике изготовителя. Величину вязкости рассчитывали по известной формуле с учетом приведенной в паспорте постоянной вискозиметра. Плотность жидкостей измеряли с помощью набора стеклянных ареометров, а поверхностное натяжение - методом отрыва кольца (Тутова Э.Г. с соавт., 1987).

Изотермы сорбции-десорбции Брунауэра, Эммета и Теллера (БЭТ) паров воды сухими и влажными материалами строили по результатам определения равновесной влажности материалов при заданных значениях относительной влажности окружающей среды. Навески материалов выдерживались в эксикаторах над растворами серной кислоты различной концентрации до прекращения изменения массы навесок (Тутова Э.Г. с соавт., 1987).

Фракционно-дисперсный состав распылов суспензий и порошкообразных материалов определяли лазерным анализатором размеров частиц Master Particle Sizer М3.1 (Malvern Instruments, Великобритания) и микроскопией с использованием Ienamed 1 (Iena, Германия) по методикам производителей.

Стерилизацию питательных, защитных и разводящих сред осуществляли автоклавированием их в ВК-75 (Россия) при 12ГС и избыточном давлении 0,11 МПа. Стерилизацию аэросила и сорбентов с одновременным обезвоживанием проводили в сухо-жаровом шкафу SUP-4 (Венгрия) и ШСВЛ-80 (Россия) при температуре 120-140°С с выдержкой в установившемся тепловом режиме не менее 2 часов (Меньшиков В.В. с соавт., 2006).

Планирование эксперимента и статистическая обработка результатов

Планирование эксперимента осуществляли по Зейделю-Гауссу. При отыскании оптимума выхода по двум факторам использовали экспрессный метод (Ашмарин И.П. с соавт., 1975).

Результаты 3-5 определений экспериментальной величины представляли средней арифметической с доверительным интервалом, рассчитанным для вероятности 95%.

Для оценки достоверности различий средних величин при сравнении независимых совокупностей вариант использовали непараметрический критерий U, фигурирующий в различных руководствах как критерий Мэнн-Уитнея (Манн-Утни), Уайта или Вилкоксона для независимых совокупностей. Преимуществом метода является возможность сравнения выборок с полуколичественными данными и различающимся числом вариант.

При сравнении совокупностей с количественными данными использовали также метод попарного сравнения сопряженных вариант, корреляционный анализ и дисперсионный анализ одно- и двухфакторных комплексов.

Исследования выполнены под руководством и личном участии автора на базе отдела № 6 ВНИИ прикладной биохимии (НПО «Биомаш») РАО «Биопрепарат» и лаборатории медицинской биотехнологии ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (рук. лаб. - к.т.н., с.н.с. И.Ю. Давыдкин) при содействии лабораторий биологии бифидобактерий (рук. лаб. - д.б.н. A.M. Амерханова), иммунобиологических препаратов (рук. лаб. - к.м.н. Л.И. Новикова), а также лаборатории инфекционной патологии (зав. лаб. - д.м.н., проф. Э.К. Джикидзе) ГУ НИИ медицинской приматологии РАМН (директор - академик РАМН, проф. Б.А. Лапин).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Формирование микрокапельного порошка

Известно, что вода может находиться в виде мелких капель в. аэрозолях и эмульсиях, обладающих невысокой устойчивостью вследствие испарения капель или их слияния (коалесценции). Замедление испарения или предотвращение агрегации первичных капель возможно при использовании одного из факторов устойчивости дисперсных систем - структурно-механического. Если распылять жидкость в присутствии лиофобного сухого порошкообразного стабилизатора, то можно получить новый вид материала с особыми свойствами. Такой порошкообразный материал, названный микрокапельным порошком (первоначальное название - псевдосухой материал), был приготовлен нами диспергированием жидкости во взвешенный слой гидрофобного стабилизатора - наноразмерного диоксида кремния (торговая марка «Аэросил») с частицами размером 7-40 А° (рис.1).

Аэросил - это ультрадисперсная гетерогенная система т!г, дисперсионной средой которой является воздух. Частицы аэросила не могут являться для капель жидкости (воды) дисперсионной средой, так как не обладают основным свойством дисперсионной среды - сплошностью. Однако это свойство имеет находящийся в агрегатах частиц аэросила и окружающий порошок воздух. Это означает, что для

дисперсной фазы - микрокапель воды дисперсионной средой также является воздух, то есть налицо жидкий аэрозоль - система ж/г. Отсюда следует, что полученный материал представляет собой смешанную трехфазную микрогетерогенную дисперсную систему типа т-ж/г, в которой наноразмерная твердая дисперсная фаза (аэросил) является стабилизатором микрокапельного состояния жидкой дисперсной фазы.

Рис.1 - Фотография глобулы аэросила А-300, полученная методом просвечивающей электронной микроскопии (Нужный А.Ю. с соавт., 2007).

Получаемый вышеуказанным способом материал имеет вид порошка (рис. 2) и обладает присущими порошкам свойствами: сыпучестью (текучестью), насыпной плотностью, конусообразованием и сопротивлением сдвигу. Такие свойства, как слипаемость, гигроскопичность и смачиваемость у него отсутствуют. Микроскопический анализ этого материала показал, что жидкость не сорбирована частицами гидрофобного аэросила и находится в виде микрокапель в окружении (в слое) этих наноразмерных частиц (рис. 3), предотвращающих столкновение капель жидкости и их коалесценцию. При этом все капли покрыты слоем аэросила и часто имеют сферическую форму.

В серии предварительных экспериментов была проведена оценка возможности получения микрокапельного порошка в устройствах различных типов. В исследованиях использовали лабораторные установки на основе гидравлической, пневматической, гидромеханической плунжерной и винтовой форсунок, а также гомогенизатор, дисковый распылитель и электромагнитный диспергатор (ЭМД). Пригодными для получения микрокапельных порошков оказались устройства, реализующие механическое диспергирование жидкости. Из них, по совокупности характеристик удобства обслуживания, легкости герметизации рабочей зоны и возможности проведения непрерывного процесса, нами был выбран ЭМД (рис. 4).

Рис. 2 - Микрокапельный порошок Рис. 3 - Порошок на предметном стекле

бифидобактерий микроскопа (увеличение х100)

Электромагнитный диспергатор имеет следующие конструктивные особенности. Электромагнитная система ЭМД представляет собой два параллельно расположенных линейных индуктора, каждый из которых создает бегущее магнитное поле. При достаточном сближении индукторов бегущие навстречу друг другу поля начинают взаимодействовать и образуют вращающееся магнитное поле. Если поместить в зазор между индукторами в зоне действия магнитного поля выполненную из немагнитного материала рабочую камеру с изготовленными из любого магнитовосприимчивого материала рабочими телами (ФМТ), то эти тела под действием магнитного поля будут магнитоожижены - придут в интенсивное поступательно-вращательное движение с траекторией, соответствующей траектории движения поля.

Рис. 4 - Лабораторный электромагнитный диспергатор. 1 - несущая платформа; 2 - линейные индукторы; 3 - рабочая камера; 4 -ферромагнитные частицы; 5 - пульт управления; 6 - маховик фиксирующего механизма.

Существенной особенностью магнитоожиженного слоя ФМТ является то, что он может быть создан как при нормальном, так и избыточном давлении и разрежении, в жидкой, газообразной и гетерогенной среде. При этом в аппарате отсутствуют механические приводы, валы и динамические уплотнения, что обеспечивает возможность полной герметизации реакционной зоны. Такой способ обработки материалов позволяет эффективно осуществлять различные технологические процессы (эмульгирование, диспергирование, экстрагирование, дезинтеграцию, ферментативный гидролиз и др.) и их комбинации, массообмен в которых протекает на микроуровне. Заложенная конструкцией возможность регулирования интенсивности воздействия ферромагнитных тел за счет варьирования целого ряда параметров (напряженность магнитного поля, масса, размеры и количество ФМТ и др.), позволяет подбирать щадящие режимы обработки материалов, содержащих биологическое начало.

Использованный нами технологический подход к обоснованию размеров микрокапель в порошке позволил прийти к следующему. Капли в порошке покрыты одним или несколькими слоями аэросила. Следовательно, скорость их испарения будет заведомо меньше, чем капель такого же размера в воздухе, так как потребуется время на диффузию паров воды от поверхности капли через «шубу» аэросила к поверхности частицы порошка. Таким образом, для увеличения скорости испарения и интенсификации процесса высушивания необходимо стремиться получать порошок с минимально возможным размером капель.

В результате проведения серии экспериментов было показано, что независимо от сочетания режимных параметров процесса получения порошка, массового соотношения аэросила и жидкости, вида (вода, растворы солей, белков, суспензии микроорганизмов) и физико-химических свойств диспергируемых жидкостей, распределение капель по размерам в получаемых порошках подчиняется логарифмически нормальному закону. Минимальный медианный диаметр микрокапель в порошках изменяется в диапазоне 20-40 мкм.

Результаты исследований данного раздела работы защищены патентами на изобретение: СССР № 1831001 ви, В01Р 13/08 от 13.10.1992; РФ № 2026730 1Ш, В01Р 13/08 от 29.01.1995.

Исследование технологических параметров переработки системы аэросил-бносуспензня в электромагнитном диспергаторе

Экспериментально установлено, что система аэросил-жидкость при диспергировании жидкости в присутствии аэросила в рабочей камере аппарата может иметь три состояния: первое - микрокапельный порошок, второе - паста, третье -пена.

Порошкообразное состояние системы можно характеризовать технологическим параметром т„„„ - продолжительностью процесса, при которой достигается наименьший медианный диаметр микрокапель. Для характеристики второго состояния можно использовать технологический параметр т„ - длительность процесса

переработки компонентов, при которой система переходит в пастообразное состояние. Между т„ и т„,„ при переработке в ЭМД композиции аэросил-жидкость существует прямая связь (рис. 5). На характер этой связи не оказывают влияния ни физико-химические характеристики биосуспензий, ни режимные параметры работы электромагнитного диспергатора.

Рис. 5 - Связь между длительностью обработки 1 и медианным диаметром микрокапель О50.

Как указывалось выше, предложенный способ обработки материалов позволяет осуществлять различные технологические процессы, в том числе с использованием субстанций, содержащих биологическое начало. Причем, это начало может быть разной природы (ферменты, клетки микроорганизмов, включая вегетативные формы, спорообразующие бациллы и вирусы, и др.). Так, нами показаны положительные результаты при дезинтеграции клеток дрожжей с экстракцией белка щелочью, при получении устойчивых суспензий Bacillus ihuringiensis, сухой высокодисперсной вакцины вируса болезни Ньюкасла, высокодисперсной эмульсии противоящурной вакцины и др. Процесс получения микрокапельного порошка так же, как и эмульсии, основан на диспергировании жидкости (кинетический фактор устойчивости) с тем отличием, что в качестве структурно-механического фактора устойчивости образующихся микрокапель применяют не жидкий стабилизатор, а сухой порошок с наноразмерными частицами. Поскольку при получении микрокапельного порошка для дробления жидкости используется кинетическая энергия вращающихся с большой скоростью ферромагнитных рабочих тел, необходимо было оценить степень их возможного влияния на инактивацию биологического начала в диспергируемых суспензиях.

Из данных литературы известно, что инактивация микроорганизмов независимо от их вида в результате действия интенсивных механических нагрузок, термических факторов, неблагоприятных условий хранения соответствует реакции первого порядка и в графическом виде изображается экспоненциальной кривой. При логарифмировании величины выживаемости и построении графика в полулогарифмических координатах 1пВ - г кинетика приобретает вид прямой линии

(рис. 6). Эта закономерность использована нами для разработки упрощенной методики с целью исключения необходимости проведения полномасштабных исследований в случае перехода с одного вида перерабатываемого микроорганизма на другой. Суть ее заключается в следующем. В соответствии с вышеописанным способом получают микрокапельный порошок диспергированием в присутствии аэросила биомассы исследуемого живого микроорганизма. При достижении длительности процесса, большей гт/„ и меньшей т„ (например, при величине г„ равной 2 мин, можно выбрать 1,5 мин), останавливают процесс, отбирают пробу порошка и определяют выживаемость микроорганизма. Затем в координатах 1пВ - т строят график, проводя прямую линию через две точки: первую - натуральный логарифм выживаемости, определенной в опыте при заданной длительности процесса; вторую - 4,6 (натуральный логарифм 100 % выживаемости) при длительности обработки 0 мин (см. рис. 6). По построенной прямой выбирают продолжительность процесса, обеспечивающую полную выживаемость или приемлемую инактивацию микроорганизма.

Результаты определения по этой методике устойчивости некоторых энтеральных микроорганизмов к механическим нагрузкам, имеющим место при приготовлении микрокапельных порошков в ЭМД, представлены на рис. 6.

Длительность обработки в ЭМД, с

Рис. 6 - Изменение выживаемости энтеральных микроорганизмов с увеличением длительности обработки в рабочей камере аппарата: 1 - L. acidophilus (смесь штаммов NK,, ЮОаш и К3Ш24); 2 - Е. coli М-17; 3 - E.faecium ГНКИ-27.

Из данных рис. 6 следует, что наименьшей устойчивостью к воздействию двигающихся в рабочей камере аппарата с большой скоростью ферромагнитных тел обладают лактобациллы. Наиболее механоустойчивым является энтерококк. Клетки эшерихий занимают промежуточное положение.

Предложенная методика может применяться не во всех случаях, например, при наличии факторов, защищающих клетки микроорганизмов от повреждения и

искажающих картину инактивации. Поскольку исследуемый нами процесс основан на диспергировании жидкой биомассы ферромагнитными рабочими телами, то при получении микрокапельных порошков штаммов бифидобактерий, образующих межклеточный матрикс, мы столкнулись с эффектом увеличения концентрации бактериальных клеток (табл. 1).

Очевидно, дробление биосуспензии ферромагнитными телами в нашем случае, как и в случае обработки ими объемов культуральной жидкости, приводит к разрушению бифидопласта и высвобождению отдельных жизнеспособных клеток, способных образовывать колонии микроорганизмов. Величина возрастания количества жизнеспособных клеток В. ас1о1е5сепЧ$ МС-42 зависела от исходного содержания их в биомассе перед приготовлением микрокапельного порошка: чем ниже концентрация бактерий, тем выше был выход их после диспергирования (табл. 1). Максимальное увеличение концентрации бифидобактерий составило 8 раз.

Таблица 1 - Зависимость концентрации клеток В. ас1о1е5сепН5 МС-42 от длительности диспергирования и исходного их содержания в биомассе

Длительность обработки в ЭМД, мин Концентрация клеток В. ас1о1езсепиз МС-42 (КОЕ/мл) в порошке при начальном содержании в биомассе

1x10' 1хЮ8 1,4x10"

0,5 1x10' ЗхЮ" гхю''

1,0 2x10' 4x10" 4x10".

1,5 3x10' 4хЮ" 4*10''

2,0 8x10' 5x10" 5x10"

С целью определения кинетики инактивации бактериальных клеток при получении МП суспензию В. ас1о1е$сепШ МС-42 для разрушения межклеточного матрикса подвергали предварительной обработке ультразвуком напряженностью 10 Вт/см в течение 20 мин. По данным литературы, такой режим обработки приводил к снижению вязкости культуральной жидкости и увеличению числа КОЕ почти на порядок, не оказывая негативного воздействия на клетки бифидобактерий. Обработанную биомассу использовали для приготовления микрокапельного порошка. Величины выживаемости клеток на заданные моменты обработки в рабочей камере диспергатора логарифмировали и строили график (рис. 7), аналогичный рис. б.

Как следует из данных рис. 7, клетки бифидобактерий, как и лактобациллы, весьма чувствительны к воздействию рабочего органа ЭМД и могут быть отнесены к механолабильным микроорганизмам.

Дальнейшими исследованиями было показано, что сывороточные иммуноглобулины (1§0, ^А и 1§М) в растворе обладают большей устойчивостью к воздействию ферромагнитных тел, чем все ранее исследованные микроорганизмы (рис. 8). Только к 2 мин процесса обработки появляется тенденция к снижению активности антител (антисальмонеллезная активность составляет 1/160-1/320 в титрах РПГА). При достижении длительности диспергирования 2,5 мин антисальмонеллезная активность падает на одно двукратное разведение до 1/160. Этот факт дает большую

свободу в выборе оптимального режима получения микрокапельного порошка раствора КИП.

Рис. 7 - Выживаемость обработанных ультразвуком клеток В. айо1евсепЧз МС-42 при получении микрокапелыюго порошка в ЭМД.

Рис. 8 - Инактивация иммуноглобулинов ^А и ^М при получении

микрокапельного порошка 6% раствора КИП (для наглядности антисальмонеллезная активность выражена в единицах, обратных титру РПГА).

Таким образом, в результате проведенных исследований был предложен способ и техническое средство для перевода биологических жидкостей в микрокапельное состояние, позволяющие с одинаковой эффективностью получать микрокапельные порошки биомассы микроорганизмов различных видов и растворов иммуноглобулинов. Выбранный режим переработки обеспечивал практически полное сохранение жизнеспособности микробных клеток и специфической антительной активности.

Показанная возможность приготовления МП на основе биологических субстанций различной природы может рассматриваться как первый элемент универсальности разработанной технологии.

Исследование процесса сорбционно-коитактного обезвоживания микрокапельных порошков

Необходимость собственной разработки процесса была вызвана отсутствием в литературе данных о возможности применения метода сорбционно-контактной сушки для обезвоживания нового вида биологических материалов, каковыми являются микрокапельные порошки.

По данным литературы, механизм контактно-сорбционного массообмена определяется динамикой сорбции, которая, в свою очередь, является функцией ряда параметров (влагоемкости сорбента, длительности контакта материала с сорбентом, поверхности сорбции и др.). Учитывая это, применение для обезвоживания микрокапельных порошков сорбционно-контактного способа представляется перспективным по следующим соображениям: 1). развернутая поверхность жидкости в порошке, составляющая по нашим данным 0,04 - 0,09 м2 в 1 см3 порошка, может обеспечить большую площадь контакта с сорбентом; 2). сорбент будет являться одновременно наполнителем - компонентом готовой формы препарата.

Качественная оценка различных материалов, применение которых в виде сорбентов целесообразно с позиций технологии, физико-химического сродства к обезвоживаемому материалу и экономических соображений, основывается на сравнительном анализе их сорбционной емкости (влагоемкости). В результате экспериментального сопоставления ряда сорбентов по этому параметру, а также способности образовывать каркас - пространственную систему из сферических зерен (структурный элемент препарата), близости значений насыпной и утрясочной плотностей, механической прочности в сухом и увлажненном состоянии, величине рН, способности к неоднократной дегидратации сухим жаром при температуре до 200°С в течение 2 часов нами были выбраны: для исследований на первом этапе катионит КБ-4П-2, и для приготовления комплексных биопрепаратов микрогранулированная окись алюминия основная (табл. 2).

В результате обоснования методического подхода к обезвоживанию микрокапельных порошков сорбционно-контактным способом установлено следующее. Изучение ксероустойчивости 5. тагсезсепэ, используемой рядом исследователей в качестве модели вегетативных форм микроорганизмов, в микрокапельном порошке методом бесконтактного сорбционного массообмена в атмосферных условиях показало ее низкую дегидратационную устойчивость и невозможность достижения удовлетворительной выживаемости этих бактерий при высушивании без введения защитных сред (ЗС). Далее оценивали влияние на выживаемость модельного микроорганизма 5'. тагсеясет ВКМ-851при сорбционно-контактной сушке вариантов состава лактозо-тиомочевинной (ЛТ) защитной среды,

успешно применяемой при сублимационном обезвоживании, и соотношения масс защитной среды и биосуспензии. Введение в состав J1T пептона или глицерина, замена JIT на водную суспензию каолина, уменьшение соотношения биосуспензии и защитной среды до 2:0,5 или увеличение этого соотношения до 2:1,5 не дали положительных результатов. Лучшие результаты по выживаемости клеток S. marcescens в процессе высушивания и последующего хранения препаратов в различных температурно-временных режимах достигались при использовании лактозо-тиомочевинной защитной среды без вариаций ее состава и соотношении масс биосуспензии и защитной среды 2:1.

Таблица 2 - Соответствие сорбентов предъявляемым требованиям

Параметр и его величина Соответствие параметра требуемой величине для сорбентов

Цеолит 5А Цеолит 13Х Катионит КБ-4П-2 Катионит КУ 8x2 Окись алюминия Аэросил А-300 МКЦ Активн ыЛ уголь

Влагоемкость (при ф=10%), 5: 5 % + + + + + + + +

Диаметр гранул, 100-400 мкм - - + + + - + -

Насыпная плотность, £ 0,5 гхсм"3 - - + + + - - -

Утрясочная плотность, > 0,6 гхсм'3 - - + + + - - -

Истираемость, ¿0,9 - - + + + - - -

Величина рН, > 8,0 - - + - + - - -

Температура сушки, 200 °С + + + - + + - +

Включение в ГФ XI - - - - + + + +

Важным параметром процесса сорбционно-контактной сушки, влияющим на степень дегидратации биологического начала, является соотношение количества реагирующих компонентов - сорбента и обезвоживаемой биомассы, заключенной в микрокапельном порошке. Это соотношение получило название коэффициента сорбционного обезвоживания (КСО). В результате проведения следующей серии экспериментов не было отмечено существенных различий в выживаемости клеток модельного микроорганизма при высушивании микрокапельного порошка различными количествами смолы КБ-4П-2 (табл. 3, Рр<Рт при р=0,05).

Таблица 3 - Дисперсионный анализ выживаемости бактерий S. marcescens ВКМ 851 при варьировании величины КСО

Величина КСО Выживаемость клеток (%) в опыте Критерий значимости

1 2 3 расчетный табличный при р=0,05

2 37,3 48,0 66,9 0,16 3,29

3 50,5 48,2 53,8

4 38,4 47,5 76,8

5 64,4 48,5 58,5

Однако величина КСО, определяя влажности сорбента и порошка, оказывала существенное влияние на гибель клеток модельного микроорганизма при хранении препаратов. Так, в результате хранения в течение 6 месяцев при температуре 2-8°С в препарате с КСО=2 осталось жизнеспособными только 34,5% клеток »У. тагсе5сет, в препарате с КСО=3 - 65,8%, в препаратах с КСО от 4 и выше - гибели клеток не наблюдалось.

При контакте сорбента с обезвоживаемым микрокапельным порошком выделяется некоторое количество тепла, о чем свидетельствует повышение температуры смеси до 25-30°С, даже в случае применения охлажденных до отрицательных температур емкости и сорбента (рис. 9). Проведенная в серии экспериментов оценка эффективности вариантов отвода тепла от препарата через поверхность реактора показала, что для повышения выживаемости бактерий реакционную емкость с сорбентом необходимо предварительно охлаждать до температуры минус (18-22)°С. Смешение сорбента с порошком следует осуществлять равномерным вращением емкости без встряхивания и других интенсивных механических воздействий.

Рис. 9 - Термограмма смешения МП S. marcescens ВКМ-851с сорбентом КБ-4П-2, охлажденным до минус 22°С.

Другой важной характеристикой исследуемого процесса является динамика поглощения влаги сорбентом, в свою очередь определяющая изменение остаточной влажности высушиваемого материала и длительность технологического процесса. Как следует из результатов исследования динамики сушки МП Е. faecium ГНКИ-27 катионитом КБ-4П-2 (рис. 10), наибольшая скорость обезвоживания микрокапельного порошка (с 65,3 до 21%) и увлажнения сорбента (с 0 до 10%) наблюдается в первую минуту смешения компонентов. В нашем случае, как и в других способах сушки, это -этап удаления из МП свободной влаги, протекающий с постоянной скоростью. Затем после 1 мин смешения скорость обезвоживания начинает снижаться, и наступает период сушки с убывающей скоростью удаления влаги, когда из порошка сорбируется связанная влага. После 5 мин процесса влажность порошка и сорбента изменяется незначительно. К этому же моменту прекращается подъем температуры смеси порошка и сорбента (рис. 9). Дальнейшее смешение компонентов нецелесообразно. Окончательное перераспределение влаги в смеси происходит к 8-10 часам выдержки, которую, как правило, осуществляют при 2-8°С.

Длительностькомтакта, мин

Рис. 10 - Динамика сорбционно-контактного высушивания МП E.faecium ГНКИ-27 (1) и набора влаги смолой КБ-4П-2 (2).

Дополнительные эксперименты с S. marcescens показали, что закономерности изменения влажности микрокапельного порошка и влагопоглотителя, определяемые величиной КСО, являются общими для микроорганизмов различных видов. А дальнейшими исследованиями с использованием энтеральных микроорганизмов и раствора иммуноглобулинов установлено отсутствие влияния величины КСО в интервале от 4 до 10 на выживаемость биокомпонента (табл. 4, Fp<FT при р=0,05). Микрокапельные порошки S. marcescens ВКМ-851, E.faecium ГНКИ-27 и Е. coli М-17

обезвоживали катионитом КБ-4П-2, a L. acidophilus (смесь штаммов NK,, }00аш и К3Ш24), В. adolescentis МС-42 и КИП - окисью алюминия.

Таблица 4 - Дисперсионный анализ выживаемости биокомпонентов при различных величинах КСО

Биосуспензия Диапазон изменения Критерий значимости

КСО выживаемости, %* расчетный табличный при р=0,05

S. marcescens 2-5 37,3-76,8 0,16 3,29

Е. faecium 4-8 64,3 - 87,0 0,05 5,14

Е. coli 4-10 41,7-81,9 2,95 3,59

В. adolescentis 4-8 21,4-62,5 0,25 5,14

L. acidophilus 6-10 19,3-81,5 0,49 5,14

6% раствор КИП 4-8 1/80- 1/320 1,29 5,14

♦Примечание - антисальмонеллезная активность Ig в образцах МП в титрах РПГА

Таким образом, результаты проведенных исследований позволяют заключить, что закономерности протекания процесса сорбционно-контактной сушки микрокапельных порошков являются общими для биологических субстанций различной природы.

Конструирование комплексных биопрепаратов

Нами были разработаны технологии и предложен запатентованный микробно-сывороточный комплекс пробиотических микроорганизмов с КИП в виде твердых и мягких готовых форм. С целью обеспечения высокой биологической активности и защиты биологически активных веществ при изготовлении и хранении препаратов предложено включать в их состав соответствующие протективные вещества. Используя этот подход, препарат для лечения ОКИ и дисбактериоза ЖКТ конструировали на основе двух высокоактивных биокомпонентов - комплексного иммуноглобулинового препарата и штамма бифидобактерий В. adolescentis МС-42.

Комплексный иммуноглобулиновый препарат наряду с ^С содержит повышенные количества иммуноглобулинов 1§М и ^А. Благодаря этому КИП отличается от коммерческих препаратов нормального иммуноглобулина более высокими титрами антител против ряда возбудителей бактериальной природы (эшерихий, шигелл, сальмонелл и других энтеробактерий) и вирусов (грипп, ротавирус, герпес и др.). КИП применяют для терапии ОКИ у детей. В последнее время показана эффективность лечения препаратом больных кишечными инфекциями взрослых, а также перспективность использования препарата для терапии некоторых респираторных заболеваний (аденовирусной, парагриппозной и респираторно-синцитиальной вирусной инфекции).

Раствор КИП 6% получали патентованным способом. Стабилизацию иммуноглобулинов осуществляли введением в белковый раствор глицина и глюкозы в концентрации 1 и 2 % соответственно от объема раствора. Содержание антител против сальмонелл составляло не менее 1:320 в реакции пассивной гемагглютинации,

распределение иммуноглобулинов по классам - ^О (50-75%), ^А (15-25%), ^М (1525%). Для повышения десорбции антител раствор мог содержать до 5% ПЭГ 6000.

Штамм бифидобактерий В. ас/окхсепНх МС-42, обладает широким спектром ферментативной активности и выраженными антагонистическими свойствами против патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Этот штамм отличается укороченным циклом размножения и более высоким уровнем накопления биомассы по сравнению с широко используемыми в производстве штаммами вида В. Ы/и1ит. Как и штамму В. Ы[и1ит 1, В. ас/о!в.кепИ5 МС-42 свойственна высокая природная устойчивость к антибиотикам - стрептомицину, мономицину, левомицетину, канамицину, оксациллину, полимиксину, гентамицину, бензилпенициллину, нистатину. В. снЗокясепИз МС-42 является основой препарата Бифидин, предназначенного для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта, сопровождающихся нарушениями симбиотической микрофлоры и профилактики дисбиотических расстройств у пациентов групп риска (в условиях стрессовых ситуаций, после гормоно-химио-антибиотикотерапии, у участников арктических, подводных, космических экспедиций и др.). Бифидин применяют детям всех возрастов, в том числе новорождённым, подросткам и взрослым.

В экспериментах использовали культуру В. а/ЗокясепИз МС-42 3 генерации на ростовой среде КД-5 с содержанием живых клеток не менее 1х108 КОЕ/мл. Для защиты бифидобактерий в биомассу вводили СЖ в соотношении 2:1 по массе.

Предполагалось, что действие разработанного комплексного биопрепарата нового поколения, наряду с местным коррекционным влиянием на микрофлору патологического очага, будет направлено на быстрое купирование воспаления и санацию от возбудителя при помощи противомикробных антител через иммунную систему. Его применение должно обеспечить не только местное подавление патогенного начала в очаге воспаления, но и стимуляцию быстрой противомикробной защиты через системный иммунитет.

Результаты исследований предыдущих глав работы позволили предложить технологическую схему приготовления комплексного препарата КИП и В. айокхсепИз МС-42 (рис. 11). Сравнительный анализ этой схемы и технологической схемы получения сухих биопрепаратов на основе сублимационного высушивания показывает, что стадий в новой технологии меньше на 1 (3 против 4), а этапов - на 4 (6 против 10). Длительность производственного цикла с учетом выдержки препарата в течение 8-10 ч короче на 24 часа.

На первой стадии после введения протективных веществ раздельно готовили микрокапельные порошки бифидобактерий и КИП. Порошки получали в электромагнитном диспергаторе в ранее найденном оптимальном режиме. После отбора проб для определения относительной влажности, концентрации клеток бифидобактерий и антисальмонеллезной активности иммуноглобулинов, порошки биокомпонентов смешивали в соотношении 1:1 по массе.

Биомасса В. adolescentis МС-42

6% раствор КИП

Введение СЖ в соотношении 1:2 от массы биосуспезии

Диспергирование

Введение 1% глицина и 2% глюкозы от объема раствора

-Аэросил 10-15%-

Диспергирование в ЭМД

Микрокапельный порошок В. adolescentis МС-42

Микрокапельный порошок КИП

Рис. 11 - Технологическая схема приготовления сухого препарата КИП и В. adolescentis МС-42.

На второй стадии осуществляли сорбционно-контактпое высушивание смеси микрокапельных порошков микрогранулированной основной окисью алюминия, предварительно обезвоженной до остаточной влажности менее 1%. В металлическую реакционную емкость, охлажденную вместе с навеской окиси алюминия до

температуры минус (18-22)°С, засыпали такое количество смеси порошков, чтобы обеспечить соотношение массы сорбента и массы жидкости в порошках 5:1 (КСО=5). Емкость герметично закрывали и плавным вращением ее смешивали компоненты в течение 5 мин.

На третьей стадии выдерживали препарат при низкой положительной температуре. Емкость помещали в холодильник с температурой 2-8°С на 8-10 часов для установления термодинамического равновесия в препарате. По истечении времени выдержки отбирали пробы из емкости для анализа физико-химических и биологических характеристик сухого препарата.

Сухой препарат имел следующие характеристики: общая концентрация белка -55%; распределение иммуноглобулинов (%) по классам IgG:IgA:IgM - 60,1:19,6:20,3; антисальмонеллезная активность (титр РПГА) - 1:320; содержание живых бифидобактерий (КОЕ/г) - 0,2><108; КСО - 5; остаточная влажность (%) - 14,5 (влажность порошка-5,6, сорбента - 14,7).

Препарат был расфасован в твердые желатиновые капсулы № 1. Каждая капсула содержала 0,4 г препарата: 85 мг комплексного иммуноглобулинового препарата, 8,5х106 КОЕ бифидобактерий В. adolescentis МС-42 и 0,28 г основной окиси алюминия и аэросила.

В результате 12-месячного хранения препарата при температуре от 2 до 8°С гибели бифидобактерий и снижения специфической (антисальмонеллезной) активности иммуноглобулинов отмечено не было. Постепенное снижение концентрации живых клеток В. adolescentis МС-42 (10-15%) и тенденция к падению специфической антительной активности появились после 16 месяцев хранения препарата.

После испытания на острую токсичность препарат был отправлен в НИИ медицинской приматологии РАМН для проведения доклинических испытаний на обезьянах.

Следующий препарат для лечения ОКИ и дисбактериоза ЖКТ конструировали на основе комплексного иммуноглобулинового препарата и биомассы, взятых в соотношении 1:1:1, штаммов NK,, ЮОаш и К3Ш24 I- acidophilus.

Вышеуказанные штаммы лактобацилл являются основой пробиотика Ацилакт, сферы применения которого, как в моно, - так и комбинированной терапии разнообразны. Это и лечение атопического дерматита, и нормализация микробиоценоза ороназофарингеальной области, урогенитального тракта, ЖКТ при острых кишечных инфекциях, дисбактериозах кишечника и др. При лечении больных ротавирусным гастроэнтеритом отмечена несколько лучшая клиническая эффективность лактосодержащих препаратов по сравнению с коли - и бифидосодержащими препаратами, проявлявшаяся в более быстрой нормализации стула. В ряде случаев препараты лактобацилл при санации очага инфекции и лечении

поражений слизистой оболочки желудка, тонкого и толстого кишечника оказывались более эффективными, чем другие микробные препараты

С целью исключения даже гипотетической возможности нежелательного перераспределения влаги в препарате в результате изменения термодинамического состояния системы (например, при изменении температуры хранения препарата), необходимо уменьшить влажность входящего в состав препарата сорбента.

Достижение этой цели возможно двумя способами: 1 - увеличением КСО, то есть увеличением массы сорбента для обезвоживания порошка; 2 - уменьшением влажности микрокапелыюго порошка перед его сорбционно-контактной сушкой. Второй способ представлялся предпочтительным, так как позволял избежать разбавления препарата сорбентом и вызываемого этим разбавлением снижения концентрации клеток микроорганизмов и иммуноглобулинов. Как показали дальнейшие исследования, реализация второго способа возможна конвективной сушкой при атмосферном давлении, легко реализуемой и не требующей сложного оборудования.

Кроме СЖ среды в производстве ацилакта широко применяется сахарозо-желатино-молочная (СЖМ) среда, содержащая дополнительно 20% стерильного обезжиренного молока. Исследование влияния вида ЗС на выживаемость лактобацилл в процессе конвективного обезвоживания в неподвижном воздухе при 25°С показали, что сахарозо-желатиновая среда обеспечивает лучшую стабилизацию свойств клеток лактобацилл при конвективной сушке биомассы в микрокапельном состоянии и сорбционно-контактном досушивании порошка окисью алюминия, чем сахарозо-желатино-молочная среда. Выживаемость клеток L. acidophilus с СЖ на этапе атмосферного обезвоживания составила 100%, а при сорбционно-контактном высушивании в процессе получения сухого препарата выжило более 70% лактобацилл. В случае использования СЖМ отмирание клеток началось уже после 2 часов выдерживания на воздухе и через 4 часа в порошке осталось 58% жизнеспособных микроорганизмов. Досушивание порошка окисью алюминия не привело к существенной гибели клеток, и выживаемость лактобацилл составила 52,6%, что сопоставимо с результатами сублимационного высушивания этого вида микроорганизмов. В дальнейших исследованиях для стабилизации свойств лактобацилл использовали СЖ защитную среду.

Ускорение процесса испарения влаги при повышении температуры воздуха наглядно демонстрируют результаты следующих опытов с МП L. acidophilus (рис. 12).

Повышение температуры выдержки на 10°С, как это видно из данных рис. 12, приводило к сокращению длительности процесса более чем в полтора раза. Если при температуре воздуха 25°С влажность МП достигала заданного диапазона (25-35%) через 4 часа (31,7%, кривая 1), то при 35°С это происходило через 2,5 часа (32,2%, кривая 2). С увеличением температуры воздуха еще на 10°С (до 45°С) интенсификация процесса составляла уже более 2,5 раз. Влажность порошка снижалась до 30,8% через

1,5 часа выдержки (кривая 3). Повышенная температура в период удаления свободной влаги практически не влияла на жизнеспособность лактобацилл. Но при приближении влажности порошка к заданному диапазону происходила гибель примерно половины жизнеспособных микроорганизмов (при 35°С выживало 55,4, а при 45°С - 56,3% клеток). В случае высушивания МП при 25°С гибели клеток не происходило.

О 30 60 90 120 150 180 210 240 Длительность выдержки МП, мин

Рис. 12 - Кинетические кривые сушки МП L. acidophilus (смесь штаммов NKb ЮОаш и К3Ш24) при температуре воздуха в термостате 25 (1), 35 (2) и 45СС (3).

При досушивании частично обезвоженных порошков сорбционно-контактным способом наблюдалось следующее. Обезвоживание окисью алюминия порошка лактобацилл, выдерживавшегося при 25°С, привело к гибели только 29% клеток. В порошке, выдерживавшемся при 35°С, погибло уже 75%, а в порошке, высушиваемом при 45°С - 85% клеток лактобацилл.

Очевидно, использование для конвективного высушивания МП L. acidophilus температур, превышающих 35-40°С, не способствует сохранению жизнеспособности лактобацилл и нецелесообразно.

Другим эффективным вариантом интенсификации конвективного обезвоживания МП оказалась эвакуация паров воды из пространства над лотками с порошком за счет движения воздуха. Наложение низкоамплитудной вибрации также способствовало ускорению процесса.

Проведенные исследования позволили предложить следующую технологическую схему приготовления комплексного биопрепарата КИП и L. acidophilus (смесь штаммов NKb ЮОаш и К3Ш24) (рис. 13).

На первой стадии раздельно получали микрокапельные порошки биокомпонентов. Для получения порошка L. acidophilus использовали культуру третьей генерации с сахарозо-желатиновой защитной средой, введенной в биомассу в

Биомасса L acidophilus

6% раствор КИП

Введение СЖ в соотношении 1:2 к массе биосуспезии

Введение 1% глицина и 2% глюкозы от объема раствора

Диспергирование

вЭМД

Аэросил 10-15%

Диспергирование я.'АМД

Микрокапельный порошок L. acidophilus

Атмосферная сушка при 25°С . 120 мни!

Микрокапельный порошок КИП

Атмосферная сушка при 25"С

Смешение ^ порошков

Г Окись алюминия: влажность менее

I 1%, температура минус (18-22)°С,

Смесь порошков 1:1 соотношение с биосуспензией 6:1

Выдержка 8-10 ч при 2-8°С

Рис. 13 - Технологическая схема приготовления сухого препарата КИП и L. acidophilus.

массовом соотношении 1:2. Для получения порошка КИП использовали 6% раствор комплекса иммуноглобулинов трех основных классов (IgG, IgA, IgM) с

защитной средой (глицин - 1%, глюкоза - 2%). Порошки получали в электромагнитном диспергаторе.

На второй стадии осуществляли высушивание микрокапельных порошков. Процесс проводили в два этапа. На первом этапе раздельно осуществляли конвективное обезвоживание микрокапельных порошков КИП и L. acidophilus. Обезвоженные до 25-35% порошки КИП и L. acidophilus смешивали в соотношении 1:1. На втором этапе проводили сорбционно-контактное высушивание смеси микрокапельных порошков микрогранулированной основной окисью алюминия, предварительно обезвоженной до остаточной влажности менее 1% и охлажденной до температуры минус (18-22)°С.

На третьей стадии выдерживали препарат в холодильнике с температурой 2-8°С 8-10 часов для установления термодинамического равновесия.

Сухой препарат имел следующие характеристики: общая концентрация белка -48%; распределение иммуноглобулинов (%) по классам IgG:IgA:IgM - 60,0:18,1:21,9; антисальмонеллезная активность (титр РПГА) - 1:320; содержание живых лактобацилл (КОЕ/г) - 1,3x10s; КСО - 6; остаточная влажность (%) - 9,5 (влажность биокомпонента - 4,4, сорбента - 9,7). Препарат был расфасован в твердые желатиновые капсулы № 1. Каждая капсула содержала 0,3 г препарата: 100 мг комплексного иммуноглобулинового препарата, 1,0х 107 КОЕ L. acidophilus (смесь штаммов NKb ЮОаш и К3Ш24) и 0,15 г основной окиси алюминия и аэросила.

В результате 12 месячного хранения препарата при температуре от 2 до 8°С снижения концентрации лактобацилл и специфической (антисальмонеллезной) активности иммуноглобулинов не отмечено.

Подобранные режимы технологической переработки обеспечивают полное сохранение специфической активности иммуноглобулинов и 90-100% жизнеспособности L. acidophilus на стадии приготовления МП, а также отсутствие снижения антительной активности и выживаемость лактобацилл до 70% на стадии двухэтапного высушивания.

Показанная возможность одно- или двухстадийного обезвоживания МП на основе биологических субстанций различной природы может рассматриваться как второй элемент универсальности разработанной технологии.

Результаты исследований данного раздела работы защищены патентами РФ на изобретение: № 2161887 RU, A23D 9/00 от 20.01.2001; № 2164765 RU, A23L 1/30 от 10.04.2001; № 2240136 RU, А61К 39/395 от 20.11.2004; № 2247578 RU, А61К 39/395 от 10.03.2005; № 2371200 RU, А61К 39/395 от 27.10.2009.

Исследование защитных свойств структурного компонента препарата

Одним из основных недостатков биопрепаратов, получаемых сублимационным высушиванием, является их высокая гигроскопичность, приводящая к увлажнению препаратов при их пребывании в атмосфере (на воздухе) даже с невысокой относительной влажностью. Это привело к необходимости разработки специальных

приемов, предотвращающих увлажнение сухой микробной биомассы в процессе технологической переработки, и в целом к усложнению и удорожанию технологии приготовления дозированных форм биопрепаратов.

Результаты оценки гигроскопичности сухого биопрепарата на примере высушенного микрокапельного порошка Е. /аесшт ГНКИ-27, проведенной бесконтактным сорбционным массообменном по методике, аналогичной определению 8-образных изотерм сорбции Брунауэра, Эммета и Теллера влагопоглотителей,

Рис. 14 - Равновесная влажность препарата Е. faecium при различных значениях относительной влажности среды: 1 - лиофилизированная биомасса; 2 - сухой МП.

Аэросильная оболочка, затрудняя диффузию паров воды из окружающей среды, предохраняет сухую биомассу стрептококка в порошке от увлажнения. В диапазоне средней относительной влажности воздуха 20-60% влажность клеток не превысила 10%. С увеличением влажности среды до 80% влажность порошка поднялась до 14,8%, в то время как лиофилизированная биомасса увлажнилась до 30,2%.

Дополнительные эксперименты, проведенные с микрокапельными порошками и сублимационно высушенной биомассой S. marcescens с JIT защитной средой и пекарских дрожжей Sack, cerevisiae без введения защитных добавок, показали аналогичные результаты. Пониженная гигроскопичность высушенного порошка, по нашему мнению, обеспечивается аэросильной оболочкой и не зависит от вида микроорганизма и присутствия в биомассе веществ различной природы, входящих в состав ростовых сред и сред высушивания.

Следовательно, требования по минимальной гигроскопичности компонентов препарата, находящихся в контакте с живым биологическим началом, могут быть снижены или вообще исключены при конструировании сухих биопрепаратов на основе микрокапельных порошков. Отпадает также необходимость проведения некоторых специальных мероприятий, направленных на осушения воздуха и поддержание низкой

относительной влажности в помещении, где осуществляются такие технологические манипуляции с сухим препаратом, как дозирование, смешение, фасовка и др., что упрощает и удешевляет технологию приготовления биопрепарата в целом.

Как уже отмечалось ранее, разработки биопрепаратов нового поколения для коррекции дисбиозов направлены на улучшение фармакокинетических характеристик (повышенная биодоступность, пролонгированность действия и др.) и обеспечение широкого спектра действия препаратов. В отличие от фармацевтических препаратов для биопрепаратов живых пробиотических микроорганизмов под биодоступностыо следует понимать, по-видимому, способность лекарственной формы доставить к месту аппликации максимальное число жизнеспособных клеток от их введенного количества. С этих позиций актуальная проблема изыскания способов защиты биологического начала от инактивирующих факторов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), существующая с момента создания неампулированных форм биопрепаратов, преследует цель повышения биодоступности этого начала.

Проведенными нами in vitro исследованиями с использованием жидкой биомассы, лиофилизированного препарата и высушенного микрокапельного порошка В. adolescentis МС-42 установлено следующее (табл. 5).

Таблица 5 - Выживаемость клеток В. айо1езсепй$ МС-42 в препаратах через 2 часа выдержки в испытательных растворах.

Препарат Исходное содержание клеток в сосуде, КОЕ Концентрация клеток (выживаемость, %) в сосуде после выдержки в растворе

0,1 МНС1 рН 1,15 0,1 MHCI pH 1,15 0,1 МНС1 рН 2,5 холензима рН 9,15

с перемешиванием без перемешивания без перемешивания без перемешивания

Жидкая биомасса 1,0^10 0 0 2,0x10 (20,0%) 1,0x10 (10,0%)

Лиофилизирован-ная биомасса 3,5x10 0 0 1,2x10 (34,3%) 1,6x10 (0,32%)

Сухой микрокапельный порошок 3,7x10 0 3,4x10 (1,0%) 2,1x10 (56,7%) 2,2x10 (59,5%)

При выдерживании в моделировавшем кислую среду желудка растворе соляной кислоты с рН 2,5, соответствующим нормальной кислотности желудочного сока, снижение концентрации бифидобактерий штамма МС-42 во всех препаратах происходило в пределах одного разведения. Выживаемость клеток в порошке была выше, чем в жидкой биомассе и лиофилизированном препарате. Термостатирование в растворе НС1 с рН 1,15, соответствующим повышенной кислотности желудочного сока, привело к гибели всех клеток бифидобактерий жидкой и сублимированной биомассы. При этом содержание клеток в высушенном МП снизилось на 3 порядка с 107 до 104 КОЕ. Еще большее ужесточение условий эксперимента введением

интенсивного перемешивания растворов соляной кислоты с испытуемыми препаратами привело к гибели клеток во всех препаратах.

Выдерживание препаратов бифидобактерий в растворе холензима, содержащем желчь, протеолитические ферменты трипсин, амилазу и липазу и моделирующем кишечный сок, показало снижение концентрации клеток в жидкой биомассе штамма МС-42 на одно разведение. В лиофилизированном препарате гибель клеток составляла 3 порядка. Высушенный микрокапельный порошок во всех случаях демонстрировал наибольшую выживаемость клеток в растворе холензима - снижение концентрации бифидобактерий находилось в пределах одного разведения.

В аналогичных исследованиях, проведенных с препаратами L. acidophilus (смесь штаммов NK,, ЮОаш и К3Ш24), было показано (табл. 6), что в растворе соляной кислоты с рН 2,5, соответствующим нормальной кислотности желудочного сока, гибели клеток в жидкой биомассе и порошке не происходило, а в лиофилизированном препарате независимо от времени экспозиции погибло около 60% лактобацилл. При выдерживании в растворе холензима выжило более 40% клеток жидкой биомассы. В лиофилизированной биомассе произошло снижение концентрации на 1 порядок. В сухом МП гибели лактобацилл не наблюдалось.

Таблица 6 - Выживаемость L. acidophilus (смесь штаммов NKb ЮОаш и К3Ш24) в препаратах при выдерживании в испытательных растворах.

0,1 МНС1срН2,5 холензима с рН 9,15

1 ч 2ч 1 ч 2ч

Жидкая биомасса 2,9x10 2,9x10 (100%) 3,0x10 (100%) 1,2x10 (41,4%) 1,2x10 (41,4%)

Лиофилизирован-ная биомасса 1,0x10 6,0x10 (60,0%) 6,6x10 (66,0%) 2,4x10 (24,0%) 1,1x10 (11,0%)

Сухой микрокапельный порошок 1,3x10 1,4x10 (100%) 1,6x10 (100%) 1,3x10 (100%) 1,4x10 (100%)

Таким образом, защитный эффект аэросильной оболочки проявился и в затруднении доступа к поверхности частиц сухого биокомпонента агрессивных составляющих модельных желудочного и кишечного соков. Этот эффект был более выражен в растворе кислоты с меньшим значением рН, соответствующим повышенной кислотности желудочного сока, и при выдерживании препаратов в модельном кишечном соке.

В аналогичных экспериментах с лиофилизированным и высушенным из микрокапельного состояния раствором комплексного иммуноглобулинового препарата защитный эффект аэросильной оболочки не удалось подтвердить вследствие высокой устойчивости антител к действию раствора НС1 с рН 2,5, соответствующим

нормальной кислотности желудочного сока, и раствора желчи с протеолитическими ферментами при выбранной длительности экспонирования (рис. 15).

Рис. 15 - Иммуноэлектрофореграмма препаратов КИП после выдержки в испытательных растворах - исходный лиофилизированный КИП (1) после термостатирования в течение 2 часов в растворе НС1 (2) и в растворе холензима (3); | сухой МП КИП после термостатирования в течение 2 часов в растворе НС1 (4) и в растворе холензима (5).

Результаты этого эксперимента полностью согласуются с результатами исследований И.В. Борисовой с соавторами (1986 г) и опровергают устоявшееся 1 представление о «переваривании» иммуноглобулинов в желудке.

По данным литературы, желудочный сок обезьян в норме имеет рН 1,5-3,0 и по | химическим показателям и составу аналогичен желудочному соку здоровых людей. Это позволяет моделировать на приматах прохождение испытуемой лекарственной формой верхних отделов ЖКТ человека и примерно оценить его длительность с тем, чтобы определить необходимость принятия мер по защите действующего вещества от ( агрессивных составляющих желудочного и кишечного соков.

Исследования по рентгенографии проводили в питомнике НИИ медицинской приматологии РАМН (г. Сочи-Адлер). В опытах использовали клинически здоровых обезьян (половозрелых самцов) вида макак резус весом от 3 до 10 кг. Животные вылавливались из групповых клеток и вольер и размещались в индивидуальных клетках. Для обездвижения обезьян с сохранением глоточных рефлексов и моторики кишечника им вводили в/м 0,5-0,7 см3 5% калипсола. Неглубокий наркоз наступал через 3-5 мин. В этом состоянии обезьян извлекали из индивидуальных клеток и корнцангом вводили глубоко в ротоглотку (глубже корня языка) твердые желатиновые капсулы. Для лучшего продвижения капсулы по пищеводу шприцом вводили 2-10 мл воды. Обезьянам давали два вида капсул: № 4 без покрытия, заполненные мелкой

свинцовой дробью, и № 1 с кислото - и ферментоустойчивым покрытием, заполненные бария сульфатом. Первые ренгенограммы выполнялись через 10 мин после дачи капсул, для чего обездвиженную обезьяну помещали на снимочный стол рентгенаппарата в положении лежа на животе в передней прямой проекции.

На рентгенограммах, сделанных в ходе следующего эксперимента (рис. 16), видны этапы прохождения желудка и разрушения защищенных капсул в кишечнике обезьяны. Капсула с сульфатом бария через 10 мин после введения уже проникла с 4 дробинками из незащищенной и разрушившейся капсулы в двенадцатиперстную кишку (нижняя, рис. 16 а). На втором снимке (рис. 16 б), сделанном через 5 мин, видно разрушение этой капсулы, сопровождающееся выходом сульфата бария, и движение дроби по двенадцатиперстной кишке. При этом вторая защищенная капсула с 2 дробинками еще остается в желудке (верхняя, рис. 16 а, б). Ее попадание с остатками дроби в кишечник, и разрушение с высвобождением сульфата бария зафиксированы через 60 мин после введения (рис. 16 в).

Таким образом, длительность пребывания в желудке обезьяны введенных натощак твердых желатиновых капсул с кислотоустойчивым покрытием может достигать 120 мин, но в среднем составляет 30-60 мин. Высвобождение содержимого таких капсул происходит через 15-20 мин после попадания в двенадцатиперстную кишку, а длительность ее прохождения не превышает 60 мин.

Следовательно, общая продолжительность прохождения биологически активными компонентами препарата верхних отделов ЖКТ не должна превышать 2 часов.

Исходя из результатов исследований, представленных в этом разделе работы, в совокупности с выявленным протективным эффектом аэросильной оболочки, можно сделать вывод об отсутствии необходимости противокислотной защиты твердых желатиновых капсул, выбранных в качестве лекарственной формы разработанного биопрепарата. Во избежание дополнительной задержки в желудке и двенадцатиперстной кишке препарат следует назначать натощак за 30-60 мин до приема пищи.

Поскольку защита биологического начала от повреждающего воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды и желудочно-кишечного тракта создается структурным элементом препарата - аэросилыюй оболочкой, то это свойство препарата может расцениваться как еще один элемент универсальности разработанной технологии.

Результаты исследований данной главы работы защищены патентами РФ: № 2317064 Яи, А61К 6/00 от 20.02.2008; № 2317065 Ш, А61К 6/00 от 20.02.2008; № 2322506 Ш, С 12С> 1/02 от 20.04.2008.

Рис. 16 - Разрушение капсул в кишечнике обезьяны макак резус.

Длительность экспонирования: а - 10 мин; 6-15 мин; в - 60 мин.

(Рентгенограммы выполнены ст.н.с., к.м.н. Симавоняном К.В.)

Доклинические испытания комплексного препарата КИП и В. айоиъсепйъ МС-42

Доклинические испытания разработанного комплексного препарата включали три этапа исследований.

На первом этапе проводили испытание препарата на острую токсичность в соответствии с требованиями ГФ XI на беспородных здоровых белых мышах обоего пола. Каждую серию препарата испытывали на 5 мышах. Всего в эксперименте было использовано 50 мышей (25 опытных животных и 25 контрольных). Препарат вводили опытным мышам рег 05 однократно в количестве 0,05 г, что в 350 раз

превышает человеческую дозу из расчета на единицу массы тела. Шестидневное наблюдение за животными показало отсутствие снижения веса животных, как в контрольной, так и опытной группах. В процессе испытаний препарата гибели животных не наблюдалось, не отмечено также признаков заболеваний. Все экспериментальные животные хорошо перенесли препарат и были активны.

Целью второго этапа исследований являлась оценка безвредности разработанного препарата на здоровых приматах. Для этого использовали 5 клинически здоровых обезьян вида макак резус (4 самца и 1 самка) в возрасте 2,2-3,4 года весом 2,7-5,0 кг. Отбирались обезьяны с хорошей упитанностью, активные, подвижные, хорошо обволошенные, с нормальной окраской слизистых оболочек и оформленным стулом. Обезьяны получали по 2 капсулы препарата ежедневно утром за 30 мин до кормления в течение 7 дней. Наблюдение за животными велось 14 дней.

При даче препарата признаков ухудшения состояния обезьян не отмечено, масса тела в среднем не изменялась, не наблюдалось также каких-либо желудочно-кишечных расстройств. В течение 10 дней наблюдения обезьяны оставались здоровы и все были возвращены в вольеру.

Целью третьего этапа являлась оценка терапевтической эффективности препарата. Из спонтанно болеющих острой кишечной инфекцией (ОКИ) с диарейным синдромом обезьян вида макак резус и макак яванский было сформировано 4 группы общей численностью 29 животных в возрасте от 1,1 до 20 лет весом 1,0-9,5 кг. Диарейный синдром - частый жидкий стул со зловонным запахом без патологической примеси от 6 до 8 раз в сутки, умеренная сниженная активность.

Группа I (опытная) получала разработанный комплексный иммунобиологический препарат в твердых желатиновых капсулах № 1. Каждая капсула содержала 0,4 г препарата: 85 мг комплексного иммуноглобулинового препарата (КИП), 8,5><10б КОЕ бифидобактерий В. adolescentis МС-42, 0,28 г основной окиси алюминия и аэросила AM-1-300.

Группа II (сравнения) получала комплексный иммуноглобулиновый препарат в твердых желатиновых капсулах № 1. Каждая капсула содержала 150 мг КИП.

Группа III (сравнения) получала бифидобактерии в твердых желатиновых капсулах № 1. Каждая капсула содержала 2,3х Ю9 КОЕ В. adolescentis МС-42.

Группа IV (контрольная) получала офлоксацин в дозе 0,2 г и лаперамид (закрепляющие таблетки) 1 таблетку в день.

Капсулы приматам давали по вышеописанной отработанной методике.

Осуществлялось динамическое отслеживание клинических проявлений при диареях у обезьян с ежедневным наблюдением за состоянием животного (внешний вид, поза, активность, аппетит, агрессивность, частота и характер стула - ежедневно в процессе лечения и после его окончания в течение 7 дней). Взвешивали обезьян до, после окончания лечения и перед выпиской из клиники.

Сравнение результатов экспериментов свидетельствовало о том, что в опытной

группе I обезьян период исчезновения клинических признаков заболевания был в среднем в 1,2 раза длиннее, чем в группе сравнения II, в 1,8 и в 2,3 раза короче, чем в группе сравнения III и контрольной группе IV соответственно (рис. 17).

5 12 3 4

X - капсулы КИП; 2 - капсулы разработанного препарата; 3 -капсулы В. adolescente МС-42; 4 - таблетки офлоксацина

Рис. 17 - Длительность клинических проявлений ОКИ у обезьян, получавших лечение различными препаратами.

Обработка результатов исследований с помощью непараметрического критерия Мэнн-Уитнея (U) показала следующее (табл. 7). При сопоставлении групп I и II наименьшее расчетное суммарное число инверсий (Up) для длительности клинических проявлений ОКИ в этих группах составило 24,5, что больше пограничного значения критерия UT =15 (при П[ = 7, п2 = 9 и уровне достоверности 95%). Различие средних характеристик этих групп отсутствует. При сопоставлении групп I и III наименьшее расчетное суммарное число инверсий по принятой характеристике составило 9, что меньше пограничного значения критерия UT = 11 1 (при ni = 7, п2 = 7 и уровне достоверности 95%). Различие средних характеристик сравниваемых групп по длительности клинических проявлений у обезьян доказано. При сопоставлении групп I и IV наименьшее расчетное суммарное число инверсий 1 для длительности клинических проявлений ОКИ в этих группах составило 0, что 1 меньше пограничного значения критерия UT = 8 (при П| = 6, п2 = 7 и уровне достоверности 95%). Различие средних характеристик сравниваемых групп по длительности клинических проявлений у обезьян доказано. ¡

Следовательно, комплексный иммунобиологический препарат в твердых желатиновых капсулах (№ 1, 85 мг КИП, 8,5х 106 КОЕ бифидобактерий В. adolescentis ¡ МС-42, 0,28 г основной окиси алюминия и аэросила AM-1-300) при лечении острой кишечной инфекции обезьян обладает одинаковой терапевтической эффективностью с капсулами комплексного иммуноглобулинового препарата (№ 1, 150 мг КИП) и большей эффективностью, чем капсулы В. adolescentis МС-42 (№1, 2,3* 10* КОЕ '

бифидобактерий) и офлоксацин в таблетках по 0,2 г.

Таблица 7 - Сравнение групп обезьян по длительности проявления клинических признаков ОКИ с помощью критерия Мэнн-Уитнея.

Сравниваемые препараты Длительность болезни, дни (число обезьян) Средняя длительное ть болезни, дни Количество приматов в группе, п Наименьшее суммарное число инверсий U„ Пограничное значение критерия UT при р<0,05

Комплексный в капсулах 5(2)-6(3)-7(1)- Щ1) 6,4 7 24,5 15

КИП в капсулах 2(4)-3(1)-8(2)-9(1)-10(1) 5,1 9

Комплексный в капсулах 5(2)-6(3)-7(1)-10(1) 6,4 7 9 11

В. айо\е5сепИ5 МС-42 в капсулах 4(1)-8(1)-10(2)-12(1 >17(2) 11,4 7

Комплексный в капсулах 5(2)-6(3)-7(1)-10(1) 6,4 7 0 8

Офлоксацин в таблетках 11(2)-12(1)-14(1)-15(2) 13,0 6

Следует обратить внимание, что такой терапевтический эффект от применения разработанного биопрепарата был получен при том, что суточная доза его (2 капсулы) содержала КИП примерно в два раза меньше, чем в монопрепарате КИП, и бифидобактерий В. adolescentis МС-42 на два порядка меньше, чем в капсулах соответствующего монопрепарата. При этом в микробиоценозе ЖКТ обезьян происходили выраженные положительные изменения - возрастало количество нормальных представителей Е. coli, существенно снижалось количество таких условно-патогенных микроорганизмов, как Staph. epidermis, представителей родов Enterococcus, Proteus, Klebsiella, и были полностью элиминированы представители Citrobacter. Нормализация клинических показателей носила необратимый характер -не было ни одного случая рецидива заболевания при лечении приматов разработанным препаратом.

Таким образом, можно считать обоснованными новый концептуальный принцип сочетания иммуноглобулинового комплекса типа КИП с пробиотическими микроорганизмами и практические подходы к конструированию и технологии приготовления сухих комплексных биопрепаратов для профилактики и лечения заболеваний, ассоциированных с дисбалансом нормофлоры желудочно-кишечного тракта.

Выводы

1. Показано, что микрокапельный порошок представляет собой смешанную трехфазную микрогетерогенную дисперсную систему типа т-ж/г и обладает одновременно свойствами сухого порошка и жидкого аэрозоля. Разработан способ и предложено техническое средство для приготовления микрокапельных порошков.

2. Чувствительность биообъектов в жидкой субстанции к физическим факторам диспергирования определяется их природой: молекулы иммуноглобулинов трех основных классов (IgG, IgA и IgM) более устойчивы, чем энтеральные микроорганизмы E.faecium ГНКИ-27, Е. coli М-17, L. acidophilus (смесь штаммов NK|, ЮОаш, К3Ш24) и В. adolescentis МС-42. Предложенный режим получения микрокапельных порошков в электромагнитном диспергаторе обеспечивает полное сохранение специфической активности иммуноглобулинов и 90-100% жизнеспособности энтеральных микроорганизмов.

3. Определены требования к выбранной в качестве сорбента окиси алюминия по параметрам влагоемкости, величины рН, насыпной и утрясочной плотности, механической прочности и термостойкости. С применением биомассы различных микроорганизмов и растворов иммуноглобулинов показано, что закономерности протекания процесса сорбционно-контактной сушки микрокапельных порошков являются общими для биологических субстанций различной природы.

4. Разработан метод конструирования и технология приготовления комплексных биопрепаратов, включающая раздельное получение микрокапельных порошков биокомпонентов, их смешение, последующее одноэтапное обезвоживание сорбционно-контактной сушкой или двухэтапное с предварительным конвективным обезвоживанием и досушиванием влагоемким сорбентом, а также заключительную выдержку биопрепарата. Приготовлены экспериментальные серии препаратов КИП и В. adolescentis МС-42, КИП и L. acidophilus (смесь штаммов NKi, ЮОаш, КзШ24).

5. Защитный эффект аэросила проявляется в пониженной гигроскопичности препарата при его нахождении на воздухе и устойчивости к повреждающему воздействию агрессивных составляющих желудочного и кишечного соков при моделировании прохождения верхних отделов желудочно-кишечного тракта.

6. Доклиническими испытаниями показана нетоксичность и безвредность комплексного биопрепарата КИП и В. adolescentis МС-42. Терапевтическая эффективность препарата при лечении обезьян, больных ОКИ с диарейным синдромом, составляет 100% и достоверно превосходит эффективность антибиотикотерапии.

Практические рекомендации

дисперсным системам и получаемый диспергированием биологической жидкости в присутствии наноразмерного гидрофобного разобщителя аэросила. Приготовление микрокапельного порошка наиболее эффективно осуществлять в электромагнитном диспергаторе.

2. С целью исключения необходимости проведения полномасштабных исследований для отработки оптимального режима получения микрокапельного порошка в электромагнитном диспергаторе при переработке суспензий микроорганизмов различных видов может быть использована упрощенная методика перехода, базирующаяся на общей для большинства микроорганизмов закономерности экспоненциальной их гибели с увеличением интенсивности механического воздействия.

3. При выборе сорбента в качестве не только влагопоглотителя, но и структурного элемента сухого биопрепарата, необходимо учитывать его физические (фракционно-дисперсный состав, прочность, насыпную и утрясочную плотность), физико-химические (влагоемкость, термостойкость) и биологические (инертность, биологическая активность) свойства.

4. С целью повышения выживаемости пробиотических микроорганизмов и сохранения специфической активности сывороточных иммуноглобулинов технологическая схема приготовления комплексного биопрепарата должна включать легко реализуемую и не требующую сложного оборудования двухэтапную стадию сушки с обезвоживанием микрокапельного порошка до промежуточной влажности конвекцией при атмосферном давлении на первом этапе и досушиванием сорбционно-контактным способом - на втором.

5. Для повышения терапевтической эффективности комплексного биопрепарата, предназначенного для профилактики и лечения дисбиотических нарушений микробиоценоза ЖКТ, целесообразно при его конструировании использовать концептуальный принцип сочетания в одной лекарственной форме обогащенных иммуноглобулиновых комплексов типа КИП с микробными пробиотиками, в совокупности обладающими широким спектром и высоким уровнем антагонистической активности против как патогенных, так и условно-патогенных возбудителей заболеваний.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Давыдкин И.Ю. Способ получения высокодисперсного сухого пылевидного препарата / И.Ю. Давыдкин, Ю.П. Давыдкин, В.Ю. Давыдкин // Медицинская промышленность и биотехнология. Наука-производство-маркетинг. - 1992. - Вып. 5 - 6. - С. 58 - 62.

2. Давыдкин Ю.П. Анализ системы получения продуктов тонкого биотехнологического синтеза с позиции системного подхода. / Ю.П. Давыдкин, В.Д. Похиленко, В.Ю, Давыдкин, И.Ю. Давыдкин // Микробиологическое производство: Обзорн. информ. - М.: НИИСЭНТИ, 1992.-Вып. 1.-20 с.

3. Давыдкин Ю.П. Принципы масштабирования процессов микробиологического синтеза / Ю.П. Давыдкин, Г.Я. Щербаков, И.Ю. Давыдкин, В.Ю. Давыдкин // Микробиол. пр-во: Обзорн. информ. - М.: НИИСЭНТИ, 1992. - Вып. 6. - 24 с.

4. Давыдкин Ю.П. О движущей силе процесса сублимации влаги из различных материалов / Ю.П. Давыдкин, В.Д. Похиленко, И.Ю. Давыдкин, В.Ю. Давыдкин // Системы управления, автоматизация и оптимизация технологических процессов в медицинской промышленности: Обзорн. информ.-М.: НИИСЭНТИ, 1993.-Вып. 1.-40 с.

5. Давыдкин В.Ю. Отработка процесса сублимационного высушивания комплексного иммуноглобулинового препарата / В.Ю. Давыдкин, А.Г. Гаврин, В.А. Алешкин [и др.] // Проблемы инфекционных болезней. - М„ 2000. - Ч. 2. - С. 61 - 66.

6. Давыдкин В.Ю. Разработка технологии приготовления твердой дозированной формы БАД «Биобактерин» / В.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин, А.Г. Гаврин [и др.] // Тез. докл. VII Российского национального конгресса «Человек и лекарство», 10-14 апреля 2000 г. - М.,2000. -С. 568.

7. Давыдкин В.Ю. Оценка способа получения сухой высокодисперсной вакцины вируса болезни Ньюкасла / В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин (и др.] // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2001. - № 2. - С. 45 - 49.

8. Давыдкин В.Ю. Получение устойчивых суспензий Bacillus thuringiensis в электромагнитном аппарате / В.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин, И.Ю. Давыдкин, A.A. Воробьев |и др.] // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2001. -№ 4. - С. 7 -10.

9. Алешкин В.А. Место иммунобиологических препаратов в восстановительной коррекции функционального состояния пожилого человека / В.А. Алешкин, Н.В. Лобачев, В.Ю. Давыдкин [и др.] // Клиническая геронтология. - 2001. - Т.7, №8. - С. 74.

10. Алешкин В.А. Перспективы использования иммунобиологических препаратов в профилактике и лечении хронического хламидийного и стафилококкового носительства у детей / В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, Н.В. Лобачев, В.Ю. Давыдкин [и др.] // Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - М., 2002.-С. 135 - 137.

11. Давыдкин В.Ю. Получение экспериментальных серий новых лекарственных форм комплексного иммуноглобулинового препарата (КИП) / В.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин, A.B. Зорик [и др.] // Сб. материалов международной научно-практической конференции памяти Г.И.Гончаровой «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования». - М., 2002. - С. 66 - 67.

12. Давыдкин В.Ю. Особенности культивирования микроорганизмов в микрокаплях питательной среды / В.Ю. Давыдкин, С.С. Афанасьев, И.Ю. Давыдкин [и др.] // Сб. материалов международной научно-практической конференции памяти Г.И. Гончаровой «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования». - М., 2002. - С. 69.

13. Джикидзе Э.К. Лечение диареи у обезьян различными готовыми лекарственными формами комплексного иммуноглобулинового препарата / Э.К. Джикидзе, В.А. Алешкин, З.К. Стасилевич, С.С. Афанасьев, Т.И. Кебу, В.Ю. Давыдкин [и др.] // Тезисы докладов IX Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - М., 2002. - С. 609.

14. Давыдкин И.Ю. К вопросу о выживаемости микроорганизмов / И.Ю. Давыдкин, В.Ю. Давыдкин, E.H. Канаева [и др.] // Материалы 1-го международного Конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития» 14-18 октября в Москве. - М., 2002. - С. 348 - 349.

15. Давыдкнн В.Ю. Выживаемость пробиотиков на разных стадиях приготовления биопрепаратов / В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин [и др.] // Материалы 1-го международного Конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития» 14-18 октября в Москве. - М., 2002. - С. 349 - 350.

16. Иммунобиологические препараты и перспективы их применения в инфектологии / Под ред. Г.Г. Онищенко, В.А. Алешкина, С.С. Афанасьева, В.В. Поспеловой. - М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2002. - 608 с.

17. Феклисова Л.В. Клинико-иммунологические параллели при ОРВИ с обструктивным синдромом у детей, получавших и не получавших Кипферон, суппозитории / Л.В. Феклисова, В.М. Шебекова, Е.Е. Целипанова, С.С. Афанасьев, В.А. Алешкин, Л.А. Денисов, В.Ю. Давыдкин // Сборник трудов 5-го Когресса «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» 12-14 ноября 2002 г. - М., 2002. - С. 606.

18. Афанасьев С.С. Интерфероиовые иммунобиологические препараты. Перспективы их применения в лечении инфекционных больных / С.С. Афанасьев, В.А. Алешкин, Л.В. Феклисова, О.В. Рубальский, В.Ю. Давыдкин // Вестник Российской академии наук. - М.: Медицина, 2003. - С. 44 - 48.

19. Алешкин В.А. Место иммуноглобулиновых препаратов в лечении и реабилитации инфекционных больных /В.А. Алешкин, А.Г. Лютов, С.С. Афанасьев, Л.В. Феклисова, Л.И. Новикова, Е.Р. Мескина, В.Ю. Давыдкин [и др.] // Новые лекарственные препараты.- Вып. 4. - М.: ЗАО АДИ «Бизнес-Карта», 2003. - С. 6 - 32.

20. Алешкин В.А. Применение препаратов интерферона в лечении воспалительных заболеваний лимфаденоидного кольца глотки /В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, В.Ю. Давыдкин [и др.]//Медицинская картотека.-№ 1. -2003.-С. 26 - 27.

21. Давыдкин В.Ю. Культивирование микроорганизмов в микрообъемах питательной среды / В.Ю. Давыдкнн, С.С. Афанасьев, II.IO. Давыдкин, В.А. Алешкин, A.A. Воробьев, А.Г. Гаврин, A.B. Зорик // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - № 3.-2003.-С. 11-15.

22. Лапин Б.А. Оценка на обезьянах реактогенности и эффективности лекарственных форм комплексного нммуноглобулинового препарата / Б.А. Лапин, В.А. Алешкин, В.Ю. Давыдкин, A.A. Воробьев [и др./ // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -№ 3.-2003. - С. 57 - 62.

23. Давыдкин В.Ю. Новые лекарственные формы комплексного иммуиоглобулинового препарата / В.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин, A.B. Зорик [и др.] // Третья международная конференция, посвященная 80-летию института имени Пастера, «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» в Санкт-Петербурге 4-5 сентября 2003 г. - С.-Петербург, 2003. - С. 160.

24. Давыдкин И.Ю. Способ увеличения концентрации бифидобактерий в суспензии после культивирования / И.Ю. Давыдкин, В.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин [и др.] // Материалы II Московского международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 10-14 ноября 2003 г. в Москве. - М.: ЗАО «ПИК «Максима», 2003. -Ч. 2.-С. 61.

25. Мелихова A.B. Стабилизация фракций иммуноглобулинов при сублимационном высушивании комплексного иммуиоглобулинового препарата I A.B. Мелихова, А.Г. Лютов,

B.А. Алешкин, А.Г. Гаврин, В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин // International Journal on Immunorehabilitation. Физиология и патология иммунной системы. - М.: «Медицина-Здоровье», 2003. - Т. 5., № 2. - С. 172.

26. Алешкин В.А. Биотехнология - основа лечебного и профилактического направлений здравоохранения / В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, В.Ю. Давыдкин [и др.] // Сборник материалов научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты энтерапьного и внутривенного применения»: Приложение к журналу «Вестник восстановительной медицины». - М., 2003. - С. 6 - 9.

27. Мелихова A.B. Технологические аспекты рецептуростроения лекарственных форм иммуноглобулинов: Влияние стабилизаторов на качество иммуноглобулинового препарата при сублимационном высушивании / A.B. Мелихова, А.Г. Лютов, А.Г. Гаврин, В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин // Сборник материалов научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения»: Приложение к журналу «Вестник восстановительной медицины», - М., 2003. - С. 22 - 23.

28. Давыдкин В.Ю. Технологические аспекты рецептуростроения лекарственных форм иммуноглобулинов: Сублимационное обезвоживание растворов иммуноглобулинового препарата / В.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин, А.Г. Гаврин [и др.] И Сборник материалов научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения»: Приложение к журналу «Вестник восстановительной медицины». - М., 2003. -

C. 23 - 24.

29. Джикидзе Э.К. Применение комплексных иммунобиологических препаратов для лечения диарейных заболеваний обезьян ! Э.К. Джикидзе, С.С. Афанасьев, З.К. Стасилевич, И.В. Борисова, Т.Е. Гвоздик, В.Ю. Давыдкин [и др.] // Сборник материалов научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения»: Приложение к журналу «Вестник восстановительной медицины». - М., 2003. -С. 36-37.

30. Давыдкин В.Ю. Выживаемость бифидобактерий после распылительного обезвоживания / В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин [и др.] // Сборник материалов международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» 2-4 июня в Москве. - М„ 2004. - С. 175 - 176.

31. Давыдкин И.Ю. Эффективность фруктовых пюре в качестве защитных сред при сублимационном высушивании ацилакта / И.Ю. Давыдкин, В.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин

[и др.] // Сборник материалов международной конференции «Пробиотикй, пребиотики, еинбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» 24 июня в Москве. - М., 2004. - С. 177 - 178.

32. Давыдкин И.Ю. Выживаемость различных штаммов бифидобактерий в процессе сублимационного обезвоживания. Сообщение 1/ И.Ю. Давыдкин, В.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин [и др.] // Сборник материалов международной конференции «Пробиотики, пребиотики, еинбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» 2-4 июня в Москве. - М., 2004. - С. 178 - 179.

33. Давыдкин И.Ю. Выживаемость различных штаммов бифидобактерий при сублимационном обезвоживании. Сообщение 2 / И.Ю. Давыдкин, В.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин [и др.] // Сборник материалов международной конференции «Пробиотики, пребиотики, еинбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» 2-4 июня в Москве. - М., 2004. - С. 179 - 180.

34. Давыдкин И.Ю. Перспективность распылительного обезвоживания бифидобактерий / И.Ю. Давыдкин, В.Ю. Давыдкин, С.С. Афанасьев [и др.] // Сборник материалов международной конференции «Пробиотики, пребиотики, еинбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» 2-4 июня в Москве. - М., 2004. -С. 180-181.

35. Давыдкин В.Ю. Атмосферное обезвоживание клеток микроорганизмов / В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин [и др.] // Сборник материалов международной конференции «Пробиотики, пребиотики, еинбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» 2-4 июня в Москве. - М., 2004. - С. 181 - 182.

36. Давыдкин В.Ю. Сохраняемость микроорганизмов в готовых формах пробиотиков /

B.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин [и др.] // Сборник материалов международной конференции «Пробиотики, пребиотики, еинбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» 2-4 июня в Москве. - М., 2004. -

C. 182 - 183.

37. Алешкин В.А. Обезьяны - адекватная модель для изучения готовых лекарственных форм иммунобиологических препаратов / В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, В.Ю. Давыдкин // Материалы симпозиума «Лабораторные приматы для решения актуальных проблем медицины и биологии» 20-21 октября 2004 г. - М., 2004. - С. 45 - 46.

38. Давыдкин В.Ю. Универсальная концепция создания энтеральных биопрепаратов / В.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, И.Ю. Давыдкин // Материалы третьей международной конференции «Высокие медицинские технологии XXI века», 31 октября - 7 ноября 2004 г. в Испании, Бенидорм. - С. 39 - 40.

39. Алешкин В.А. Становление пробиотикотерапии в России / В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, В.В. Поспелова, А.А. Воробьев, Л.В. Феклисова, Ю.В. Несвижский, A.M. Амерханова, Л.В. Пожалостина, Е.А. Воропаева, М.С. Афанасьев, В.Ю. Давыдкин, В.М. Лахтин, И.Ю. Давыдкин // Вестник Российской академии медицинских наук. - 2005. - № 5.-С. 3-13.

40. Алешкин В.А. Изучение иммунобиологических препаратов на обезьянах / В.А. Алешкин, Б.А. Лапин, С.С. Афанасьев, В.В. Поспелова, Э.К. Джикидзе, В.Ю. Давыдкнн [и др.] // Материалы Всероссийской научной конференции «Перспективные направления

использования лабораторных приматов в медико-биологических исследованиях», 8-10 августа 2006 г. в Сочи-Адлер. - Сочи-Адлер, 2006. - С. 49 - 54.

41. Давыдкин И.Ю. Высокодисперсная эмульсия в технологии приготовления противоящурной вакцины / И.Ю. Давыдкин, В.Ю. Давыдкин, В.М. Блинов // Материалы всероссийской конференции, посвященной 75-летию со дня открытия Чувашской государственной сельскохозяйственной академии. - Чебоксары: ЧГСХА, 2006. - С. 242 - 244.

42. Давыдкин И.Ю. Закономерности эмульгирования в электромагнитном аппарате / И.Ю. Давыдкин, В.Ю. Давыдкин, В.М. Блинов // Материалы всероссийской конференции, посвященной 75-летию со дня открытия Чувашской государственной сельскохозяйственной академии. - Чебоксары: ЧГСХА, 2006. - С. 245 - 247.

43. Лапин Б.А. Приматы как перспективная модель оценки энтеросолюбильных покрытий готовых лекарственных форм / Б.А. Лапин, В.А. Алешкин, В.Ю. Давыдкин [и др.] // Материалы международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии в опытах на обезьянах» 19-22 сентября 2007 г. - Сочи-Адлер, 2007.-С. 205-212.

44. Давыдкин В.Ю. Спектр чувствительности производственных штаммов бифидобактерий к антибактериальным препаратам / В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин, О.Г. Жиленкова [и др.] // Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов 26-27 апреля 2007 г. в Москве. - М.: Санэпидмедиа, 2007. - Т.2. - С. 297 - 298.

45. Давыдкин В.Ю. Аналитический метод обоснования готовой формы пробиотика / В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин // Мат. юбил. Всеросс. науч.-практич. конф. "Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения", посвящ. 90-летию Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора и 20-летию Приволжского окружного центра по проф. и борьбе со СПИД. - Н.Новгород: Издатель Гладкова, 2009. - с. 337-340.

46. Давыдкин В.Ю. Некоторые аспекты культивирования бифидобактерий / В.Ю. Давыдкин, О.Г. Жиленкова, И.Ю. Давыдкин // Мат. юбил. Всеросс. науч.-практич. конф. "Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения", посвящ. 90-летию Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора и 20-летию Приволжского окружного центра по проф. и борьбе со СПИД. -Н.Новгород: Издатель Гладкова, 2009. - с. 340-342.

47. Давыдкин В.Ю. Эффективность защитных сред при сублимационном обезвоживании бифидобактерий / В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин, О.Г. Жиленкова, A.B. Мелихова // Мат. юбил. Всеросс. науч.-практич. конф. "Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения", посвящ. 90-летию Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора и 20-летию Приволжского окружного центра по проф. и борьбе со СПИД. - Н.Новгород: Издатель Гладкова, 2009. - с. 342-344.

48. Давыдкин В.Ю. Разработка технологии приготовления биопрепаратов нового поколения / В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин, A.B. Мелихова, О.Г. Жиленкова // Мат. юбил. Всеросс. науч.-практич. конф. "Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения", посвящ. 90-летию Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора и 20-летию Приволжского окружного центра по проф. и борьбе со СПИД. - Н.Новгород: Издатель Гладкова, 2009. - с. 331-334.

49. Давыдкин B.IO. Доклинические испытания комплексного препарата КИП и В. adolescentis МС-42 / В.Ю. Давыдкин, Э.К. Джикидзе, A.B. Мелихова [и др.] // Мат. юбил. Всеросс. науч.-практич. конф. "Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения", посвящ. 90-летию Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора и 20-летию Приволжского окружного центра по проф. и борьбе со СПИД. - Н.Новгород: Издатель Гладкова, 2009. - с. 334-337.

50. Sinitsyn А.Р. A hyperefficient process for enzymatic hydrolysis in the intensiv mass transfer reactor / A.P. Sinitsyn, A.V. Gusakov, I.Yu. Davydkin, V.Yu. Davydkin, O.V. Protas // Biotechnol. Letters.- 1993. - V. 15, № 3. -P. 283 -2S8.

Изобретения

1. Пат. 1831801 СССР, B01F 13/08. Устройство для обработки материалов / И.Ю. Давыдкин, Ю.П. Давыдкин, В.Ю. Давыдкии, В.М. Блинов, С.Д. Никитинский (СССР). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 13.10.1992. Патентообладатель коллектив авторов.

2. Пат. 2026730 РФ, B01F 13/08. Способ обработки материалов / И.Ю. Давыдкин, Ю.П. Давыдкии, В.Ю. Давыдкин, В.М. Блннов, С.Д. Никитинский (РФ). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.01.95. Патентообладатель коллектив авторов.

3. Пат. 2161887 RU, A23D 9/00. Биологическая активная добавка / В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, В.Ю. Давыдкин, О.В. Рубальский, ILIO. Давыдкин, Г.Н. Хашша, А.Г. Гаврин, A.B. Алешкин, J1.A. Денисов, Д.С. Афанасьев, М.С. Афанасьев (RU). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.01.2001. Патентообладатель коллектив авторов.

6. Пат. 2247578 RU, А61К 39/395. Состав, обладающий протнвомикробным действием / A.B. Мелихова, В.А. Алешкин, В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкии, С.С. Афанасьев, И.В. Борисова, О.В. Рубальский, А.Г. Гаврин (RU). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10.03.2005. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

7. Патент РФ № 2371200, МПК А61К 39/395. Способ получения нммуноглобулинового препарата / Мелихова A.B., Давыдкин В.Ю., Алешкин В.А., Давыдкин И.Ю. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27.10.2009. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

8. Пат. 2317064 RU, МПК A6IK 6/00. Способ определения защитного действия покрытия капсул от содержимого желудка / Алешкин В.А., Лапин Б.А., Афанасьев С.С., Джикидзе Э.К., Симавонян К.В., Давыдкин В.Ю., Давыдкин II.IO., Холодилова Л.И.,

Мелихова А.В., Трофимова Л.II., Кебу Т.И., Калашникова В.А., Егорова Т.П. (RU). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.04.2008. Патентообладатели ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, ГУ НИИ МП РАМН.

9. Пат. 2317065 RU, МПК А61К 6/00. Способ определения целевой доставки в желудочно-кишечном тракте твердой лекарственной формы с защитным покрытием / Алешкин В.А., Лапин Б.А., Давыдкин В.Ю., Джикидзе Э.К., Мелихова А.В., Симавонян К.В., Рубальский О.В., Давыдкин И.Ю. (RU). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.02.2008. Патентообладатель коллектив авторов.

10. Пат. 2322506 RU, МПК C12Q 1/02. Способ определения защитного действия покрытия капсул для штамма Bifidobacterium adolescentis МС42 от содержимого желудка / Алешкин В.А., Лапим Б.А., Афанасьев С.С., Джикидзе Э.К., Симавонии К.В., Давыдкин В.Ю., Давыдкин И.Ю., Воропаева Е.А., Рубальский О.В., Холодилова Л.И., Мелихова А.В., Трофимова Л.И., Кебу Т.П., Байракова АЛ., Калашникова В.А., Афанасьев М.С., Егорова Т.П. (RU). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.04.2008. Патентообладатели ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, ГУ НИИ МП РАМН.

Список сокращений БЭТ - изотермы сорбции Брунауэра, Эммета и Теллера ГМ - гидролизатно-молочная среда ГФ XI - государственная фармакопея XI издания ЖКТ - желудочно-кишечный тракт ЗС - защитная среда (среда высушивания) КД-5 - казеиново-дрожжевая среда №5 КИП - комплексный иммуноглобулиновый препарат КС - концентрированная суспензия КСО - коэффициент сорбционного обезвоживания ЛТ - лактозо-тиомочевинная защитная среда МП - микрокапельный порошок ОКИ - острая кишечная инфекция ПС - питательная среда ПЭГ - полиэтиленгликоль (полиэтиленоксид) РИД - радиальная иммунодиффузия РПГА - реакция пассивной гемагглютинации СЖ - сахарозо-желатиновая защитная среда СЖМ - сахарозо-желатино-молочная защитная среда УПМ - условно-патогенные микроорганизмы ФГК - ферментативный гидролизат казеина ФМТ - ферромагнитные тела ЭМД - электромагнитный диспергатор Ig - иммуноглобулин

IgG, IgM, IgA - иммуноглобулины классов G, М и А

Подписано в печать: 09.11.10

Объем: 2,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 76 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Давыдкин, Валерий Юрьевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ: ПРИМЕНЕНИЕ В ПРАКТИКЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И ТЕХНОЛОГИИ ПРИГОТОВЛЕНИЯ.

1.1. Сферы применения иммунобиологических препаратов.

1.1.1. Биопрепараты в акушерско-гинекологической практике.

1.1.2. Применение препаратов в терапевтической стоматологии.

1.1.3. Пробиотики в лечении больных с кранио-фациальной патологией.

1.1.4. Комплексное лечение некоторых заболеваний ЛОР-органов и легких.

1.1.5. Лечение больных атопическим дерматитом.

1.1.6. Биопрепараты при острых кишечных инфекциях и дисбактериозах кишечника.

1.2. Состав и лекарственные формы биопрепаратов.

1.2.1. Колисодержащие биопрепараты.

1.2.2. Бифидосодержащие препараты.

1.2.3. Биопрепараты на основе лактобацилл.

1.2.4. Споровые биологические препараты.

1.2.5. Иммуноглобулиновые и интерфероновые препараты.

1.3. Анализ технологий приготовления сухих биопрепаратов. 56 1.3.1. Способы обезвоживания биоматериалов.

1.3.1.1. Получение сухих материалов методом распылительной сушки.

1.3.1.2. Сублимационное высушивание биопрепаратов.

1.3.1.3. Сорбционно-контактное обезвоживание биопрепаратов.

1.3.2. Технологии получения сухих биопрепаратов.

1.3.2.1. Способы приготовления таблеток.

1.3.2.2. Технология приготовления порошков и капсул в производстве биопрепаратов.

1.3.2.3. Псевдосухие материалы в технологии 69 приготовления биопрепаратов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Микроорганизмы.

2.1.2. Питательные и защитные среды.

2.1.3. Биоматериалы, материалы и реактивы.

2.1.4. Экспериментальные животные.

2.2. Методы исследований.

2.2.1. Культивирование микроорганизмов, концентрирование биомассы и введение защитных сред.

2.2.2. Микробиологические методы.

2.2.3. Иммунохимические методы.

2.2.4. Физико-химические методы.

2.2.5. Физические методы.

2.2.6. Планирование эксперимента и статистическая обработка результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 3. ФОРМИРОВАНИЕ МИКРОКАПЕЛЬНОГО ПОРОШКА.

3.1. Микрокапельный порошок как дисперсная система.

3.2. Устройство для приготовления микрокапельных порошков

3.3. Обоснование требований к размерам микрокапель в порошке.

ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ПЕРЕРАБОТКИ СИСТЕМЫ АЭРОСИЛ

СУСПЕНЗИЯ В ЭЛЕКТРОМАГНИТНОМ ДИСПЕР-ГАТОРЕ.

4.1. Обоснование показателей состояния системы аэросил-жидкость при получении микрокапельных порошков.

4.2. Изучение зависимости выживаемости микроорганизмов от режимных параметров процесса образования микрокапельных порошков в ЭМД.

ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА СОРБЦИОННО-КОНТАКТНОГО ОБЕЗВОЖИВАНИЯ МИКРОКАПЕЛЬНЫХ ПОРОШКОВ.

5.1. Обоснование методического подхода обезвоживания микрокапельного порошка при контакте с влагоемким сорбентом.

5.1.1. Выбор типа сорбента для контактного обезвоживания микрокапельных порошков.

5.1.2. Исследование основных закономерностей процесса с использованием модельного микроорганизма.

5.2. Сорбционно-контактное обезвоживание МП энтеральных микроорганизмов.

ГЛАВА 6. КОНСТРУИРОВАНИЕ КОМПЛЕКСНЫХ БИОПРЕПАРАТОВ.

6.1. Обоснование компонентного состава комплексного препарата КИП и В. adolescentis МС-42.

6.2. Приготовление сухого биопрепарата комплекса иммуноглобулинов и бифидобактерий.

6.3. Обоснование методического подхода к конструированию биопрепарата КИП и L. acidophilus (смесь штаммов NKb

100аш,К3Ш24).

6.3.1. Исследование основных закономерностей конвективной сушки МП при атмосферном давлении.

6.3.2. Выбор компонентного состава комплексного биопрепарата.

6.3.3. Приготовление комплексного препарата КИП и L. acidophilus (смесь штаммов NKb ЮОаш, К3Ш24).

ГЛАВА 7. ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАЩИТНЫХ СВОЙСТВ СТРУКТУРНОГО КОМПОНЕНТА ПРЕПАРАТА.

7.1. Оценка гигроскопичности сухого препарата, полученного из микрокапельного порошка.

7.2. Изучение in vitro защитного эффекта аэросила при моделировании воздействия неблагоприятных факторов пищеварительной системы.

7.3. Рентгенография прохождения капсулами верхних отделов желудочно-кишечного тракта обезьян.

ГЛАВА 8. ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ КОМПЛЕКСНОГО

ПРЕПАРАТА КИП И В. ADOLESCENTIS МС-42.

8.1. Оценка острой токсичности биопрепарата.

8.2. Изучение безвредности и терапевтической эффективности препарата КИП и В. adolescentis МС-42 на обезьянах.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Технология и конструирование сухих биопрепаратов на основе микрокапельных порошков"

Атуальность проблемы

Важное значение симбиотической микрофлоры для организма человека к настоящему времени общепризнанно и обосновано результатами многочисленных исследований [25, 107, 201, 226, 278, 316, 375, 376, 394, 396, 413, 415, 417, 429,433, 451, 458, 461].

Симбиотическая микрофлора составляет основу микроэкологии человека. Все сообщающиеся с внешней средой полости тела человека, а также кожные покровы заселены микроорганизмами, которые представлены несколькими сотнями видов бактерий, без учёта одновременной персистенции вирусов, простейших, грибов [68, 194, 428, 434, 445]. Макроорганизм и населяющая его микрофлора составляют чётко интегрированную структуру, сложившуюся в процессе длительного эволюционного развития. Эта интеграция обеспечивает слаженную работу всех органов^ и систем, базирующуюся до известной степени на принципе саморегуляции.

Нарушения качественного и количественного состава симбиотической микрофлоры объединяются термином "дисбактериоз" [442, 443], под которым в настоящее время понимают [68] «любые количественные и качественные изменения типичной для данного биотопа микрофлоры человека и животных, возникающие в результате воздействия ' на макро- и микроорганизм различных факторов экзогенного и эндогенного характера, влекущие за собой выраженные клинические проявления со стороны макроорганизма или являющиеся следствием каких-либо патологических процессов в организме».

В современных условиях на фоне частого воздействия неблагоприятных экологических факторов и широкого распространения в повседневной практике противомикробных лекарственных средств, дисбиотические нарушения микрофлоры носят массовый характер и выявляются практически среди всех слоев населения. По данным Российской академии наук, до 90% населения страны страдают теми или иными отклонениями от оптимального состава симбиотической микрофлоры [65, 212, 215]. Наиболее незащищенными от них являются дети, особенно первого полугодия жизни. Даже у находящихся на грудном вскармливании отклонения по срокам становления нормального бакгериоценоза кишечника с преобладанием бифидофлоры встречаются с частотой до 25% [3, 76, 77, 152, 170, 171].

Для коррекции дисбиотических нарушений микрофлоры применяется целый комплекс лечебных мероприятий с учетом клинических проявлений основного заболевания и степени выраженности дисбактериоза, а таюке данных лабораторных исследований микрофлоры биотопа и состояния » реактивности организма. Наряду с общетерапевтическими мероприятиями (диета, ферменты, витамины и т.п.) при необходимости проводится селективная деконтаминация патогенной и условно-патогенной микрофлоры (бактериофаги, антисептики, антибактериальные препараты и т.п.). Однако основную роль играет дифференцированное применение различных иммунобиологических препаратов, в том числе пробиотиков, являющихся наиболее физиологичными для коррекции микрофлоры и профилактики, дисбиотических изменений, а таюке препаратов, применяемых для повышения резистентности организма, восстановления иммунного статуса [5; 24, 68, 78, 82, 83, 149, 155, 191, 192, 338, 397, 403].

Спектр иммунобиологических препаратов для терапии дисбиотических состояний биотопов организма широк и включает сывороточные иммуноглобулины (нормальный и комплексный), пробиотики (микробные препараты нормофлоры), цитокины (интерферопы, интерлейкины, фактор некроза опухолей-a), иммуномодуляторы и др. [134]. Лекарственные формы их различны - от жидких ампулированных до твердых дозированных (таблетки, капсулы) форм. Разнообразны и технологии их приготовления.

Вместе с тем, до настоящего времени в производстве сухих биопрепаратов единственным широко используемым методом стабилизации свойств биологических субстанций остается сублимационное (лиофильное) высушивание. Этот способ, обеспечивая высокое качество продукта, отличается чрезмерной длительностью (до 2 суток), а получаемая сухая субстанция без дополнительной переработки непригодна для приготовления сухих дозированных форм [37, 142, 202, 224, 369, 389, 446]. Кроме того, получаемые с использованием этого способа высушивания пероральные препараты на основе живых пробиотических микроорганизмов нуждаются в защите от кислотно-ферментного комплекса пищеварительной системы. По-видимому, этим, а также стремлением придать биологическому началу новые фармакокинетические свойства (повышенную биодоступность и защищенность от воздействия неблагоприятных факторов хранения и применения), объясняется появление разработок, направленных на создание технологий с иммобилизацией биокомпонентов, которая осуществляется сорбцией на различных носителях [113, 114, 115, 116, 117, 118, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240].

Одним из вариантов современной технологии с наименьшим количеством стадий и продолжительностью является описанный в патентной литературе способ с непосредственным обезвоживанием биомассы пробиотических микроорганизмов моно - или поликомпонентного • состава * сорбентами [234, 235, 236, 237, 238]. Высушивание биомассы и приготовление препарата происходит на одной технологической стадии. Однако вследствие прямого контакта биомассы с сорбентом выживаемость клеток пробиотических микроорганизмов не превышает 10-20%. Отсутствуют также сведения о принципиальной возможности и эффективности применения такого способа для получения сухих биопрепаратов немикробной природы (например, иммуноглобулинов).

Таким образом, не существует современной технологии приготовления пероральных иммунобиологических препаратов, отличающейся универсальностью в плане возможности переработки биологических компонентов различной природы. Вместе с тем создание нового вида биологического материала - микрокапельного порошка, рациональное использование его особых свойств в сочетании с обоснованным' выбором обезвоживания создают предпосылку для разработки такой технологии. Однако системных исследований в этом направлении не проводилось, что и определило актуальность данной работы.

Цель исследования

На модели микроорганизмов Bifidobacterium adolescentis МС-42, Lactobacillus acidophilus (смесь штаммов NKb ЮОаш, К3Ш24) и иммуноглобулиновых комплексов типа КИП экспериментально обосновать новый концептуальный принцип и практические подходы к конструированию и технологии приготовления сухих комплексных биопрепаратов для профилактики и лечения заболеваний, ассоциированных с дисбалансом нормофлоры желудочно-кишечного тракта.

Задачи исследования

Научная новизна

Показано, что степень инактивации биокомпонента при диспергировании жидкой субстанции обусловливается его восприимчивостью к механическим нагрузкам. Наиболее чувствительными оказались клетки L. acidophilus (смесь штаммов NKj, ЮОаш, К3Ш24) и В. adolescentis МС-42, клетки Е. coli М-17 занимают промежуточное положение, и наименее чувствительным является энтерококк Е. faecium ГНКИ-27. Значительно большей механоустойчивостью, чем энтеральные микроорганизмы, обладают сывороточные иммуноглобулины трех основных классов (IgG, IgA и IgM) в растворе КИП.

Впервые проведенными исследованиями атмосферного обезвоживания микрокапельных порошков бифидобактерий и лактобацилл установлено, что температура осушающего воздуха не должна превышать 35-40°С, то есть величин, близких к оптимальной температуре роста этих микроорганизмов, во избежание интенсивной гибели клеток как в процессе конвективного обезвоживания, так и последующего досушивания сорбционно-контактным методом.

Впервые проведенными доклиническими испытаниями комплексного биопрепарата КИП и В. adolescentis МС-42 показана его нетоксичность и безвредность для приматов, а также 100% терапевтическая эффективность при лечении обезьян, больных острой кишечной инфекцией с диарейным синдромом. Исчезновение клинических проявлений заболевания сопровождалось выраженными положительными изменениями в микробиоценозе желудочно-кишечного тракта обезьян - повышением содержания нормальных Е. coli, существенным снижением количества таких условно-патогенных микроорганизмов, как Staph. epidermidis, представители родов Enterococcus, Proteus, Klebsiella, и полной элиминацией Citrobacter.

Теоретическое значение работы

Обоснован концептуальный принцип разработки биопрепаратов нового поколения для коррекции дисбиотических нарушений в биотопах организма, базирующийся на сочетании в одной лекарственной форме обогащенных иммуноглобулиновых комплексов типа КИП с микробными пробиотиками, обладающими широким спектром и высоким уровнем антагонистической активности против как патогенных, так и условно-патогенных возбудителей заболеваний.

Предложен метод конструирования сухих биопрепаратов, заключающийся в использовании особых свойств микрокапельного порошка и обеспечивающий получение препаратов перорального применения на основе биологических субстанций различной природы, и являющийся основой L универсальной технологии. Этот метод может быть использован в дальнейшем при разработке иммунобиологических препаратов для профилактики и терапии других заболеваний.

Практическая значимость

Разработан способ обработки материалов и конструкция электромагнитного диспергатора для осуществления технологического процесса получения микрокапельного порошка биологических жидкостей. Предложена упрощенная методика перехода, при переработке суспензий микроорганизмов различных видов, базирующаяся на общей для большинства бактерий закономерности экспоненциальной их гибели с увеличением интенсивности механического воздействия.

С использованием разработанного метода сконструированы комплексные биопрепараты КИП и В. adolescentis МС-42, КИП и L. acidophilus (смесь штаммов NKb ЮОаш и К3Ш24).

Внедрение результатов работы

На основании проведенных исследований оформлено 10 патентов на изобретения:

1. Пат. 1831801 СССР, B01F 13/08. Устройство для обработки материалов / И.Ю. Давыдкин, Ю.П. Давыдкин, В.Ю. Давыдкин, В.М. Блинов; С.Д. Никитинский (СССР). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 13.10.1992. Патентообладатель коллектив авторов.

2. Пат. 2026730 РФ, B01F 13/08. Способ обработки материалов / И.Ю. Давыдкин, Ю.П. Давыдкин, В.Ю. Давыдкин, В.М. Блинов, С.Д. Никитинский (РФ). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.01.95. Патентообладатель коллектив авторов.

3. Пат. 2161887 RU, A23D 9/00. Биологическая активная добавка / В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, В.Ю. Давыдкин, О.В. Рубальский, И.Ю. Давыдкин,

Г.И. Ханина, А.Г. Гаврин, A.B. Алешкин, JI.A. Денисов, Д.С. Афанасьев, М.С. Афанасьев (RU). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.01.2001. Патентообладатель коллектив авторов.

4. Пат. 2164765 RU, A23L 1/30. Биологически активная добавка / В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, О.В. Рубальский, В.Ю. Давыдкин, J1.A. Денисов, И.Ю. Давыдкин, А.Г. Гаврин, A.B. Алешкин, Д.С. Афанасьев, М.С. Афанасьев (RU). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10.04.2001. Патентообладатель коллектив авторов.

6. Пат. 2247578 RU, А61К 39/395. Состав, обладающий-противомикробным действием / A.B. Мелихова, В.А. Алешкин, В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин, С.С. Афанасьев, И.В. Борисова, О.В. Рубальский,

A.Г. Гаврин (RU). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10.03.2005. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

7. Патент РФ № 2371200, МПК А61К 39/395. Способ получения иммуноглобулинового препарата / Мелихова A.B., Давыдкин В.Ю., Алешкин

B.А., Давыдкин И.Ю. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27.10.2009. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

8. Пат. 2317064 RU, МПК А61К 6/00. Способ определения защитного действия покрытия капсул от содержимого желудка / Алешкин В.А., Лапин-Б.А., Афанасьев С.С., Джикидзе Э.К., Симавонян К.В., Давыдкин В.Ю., Давыдкин И.Ю., Холодилова Л.И., Мелихова A.B., Трофимова Л.И., Кебу Т.И., Калашникова В.А., Егорова Т.П. (RU). Зарегистрирован в

Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.04.2008. Патентообладатели ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, ГУ НИИ МП РАМН.

9. Пат. 2317065 RU, МПК А61К 6/00. Способ определения целевой доставки в желудочно-кишечном тракте твердой лекарственной формы с защитным покрытием / Алешкин В.А., Лапин Б.А., Давыдкин В.Ю., Джикидзе Э.К., Мелихова А.В., Симавонян К.В., Рубальский О.В., Давыдкин И.Ю. (RU). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.02.2008. Патентообладатель коллектив авторов.

10. Пат. 2322506 RU, МПК C12Q 1/02. Способ определения защитного действия покрытия капсул для штамма Bifidobacterium adolescentis МС42 от содержимого желудка / Алешкин В.А., Лапин Б.А., Афанасьев С.С., Джикидзе Э.К., Симавонян К.В., Давыдкин В.Ю., Давыдкин И.Ю., Воропаева Е.А., Рубальский О.В., Холодилова Л.И., Мелихова А.В., Трофимова Л.И., Кебу Т.И., Байракова АЛ., Калашникова В.А., Афанасьев М.С., Егорова Т.П. (RU). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.04.2008. Патентообладатели ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, ГУ НИИ МП РАМН.

Разработан лабораторный регламент приготовления комплексного биопрепарата КИП и В. ас1о1езсепйз МС-42.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанная универсальная технология приготовления сухих биопрепаратов позволяет перерабатывать жидкие биологические субстанции различной природы и основана на переводе субстанций в устойчивое микрокапельиое состояние в виде высокодисперсного порошка, что в свою очередь позволяет использовать различные интенсивные, в том числе и комбинированные, способы обезвоживания.

2. Структурный компонент препарата - наноразмерный аэросил оказывает защитный эффект, проявляющийся в ограничении доступа к сухому биокомпоненту паров воды из воздуха и агрессивных составляющих желудочного и кишечного соков, в результате чего препарат приобретает повышенную устойчивость к неблагоприятным факторам пребывания в атмосфере воздуха и прохождения желудочно-кишечного тракта.

3. Концепция разработки биопрепаратов нового поколения для коррекции дисбиотических нарушений в микробиоценозе желудочно-кишечного тракта базируется на конструировании комплексных препаратов на основе сочетания обогащенных иммуноглобулиновых комплексов типа КИП с микробными пробиотиками, в совокупности обладающими широким спектром и высоким уровнем антагонистической активности против как патогенных, так и условно-патогенных возбудителей заболеваний.

Апробация работы:

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на VII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2000; VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 2002; Международной научно-практической конференции памяти Г.И. Гончаровой «Пробиотические микроорганизмы -современное состояние вопроса и перспективы использования», Москва, 2002; IX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2002; 1-м международном Конгрессе «Биотехнология — состояние и перспективы развития», Москва, 2002; Третьей международной конференции, посвященной 80-летию института имени Пастера, «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», Санкт-Петербург, 2003; П-м Московском международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2003; Научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения», Москва, 2003; XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2004; Международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы», Москва, 2004; Симпозиуме «Лабораторные приматы для решения актуальных проблем медицины и биологии», Москва, 2004; Третьей международной конференции «Высокие медицинские технологии XXI века», Бенидорм (Испания), 2004; Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы совершенствования технологии производства и переработки продукции сельского хозяйства», Йошкар-Ола, 2005; Всероссийской научной конференции «Перспективные направления использования лабораторных приматов в медико-биологических исследованиях», Сочи-Адлер, 2006; Всероссийской конференции, посвященной 75-летию со дня открытия Чувашской государственной сельскохозяйственной академии, Чебоксары,

2006; IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 2007; Международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии в опытах на обезьянах», Сочи-Адлер, 2007; Юбилейной Всероссийской научно-практической конференции "Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения", Н.Новгород, 2009.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 60 печатных работ, в4 том числе: 7 - в изданиях, рекомендованных ВАК Российской Федерации, 6 - в периодических изданиях, 4 - в сборниках научных трудов, 32 - в материалах конференций, разделы в 1 монографии, 10 патентов РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 271 странице, состоит из введения, 8 глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 43 таблицами и 41 рисунком. Список литературы включает 474 работы, в том числе 378 - отечественных и 96 - иностранных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Давыдкин, Валерий Юрьевич

выводы

2. Чувствительность биообъектов в жидкой субстанции к физическим факторам диспергирования определяется их природой: молекулы иммуноглобулинов трех основных классов (IgG, IgA и IgM) более устойчивы, чем энтеральные микроорганизмы Е. faecium ГНКИ-27, Е. coli М-17, L. acidophilus (смесь штаммов NKb ЮОаш, К3Ш24) и В. adolescentis МС-42. Предложенный режим получения микрокапельных порошков в электромагнитном диспергаторе обеспечивает полное сохранение специфической активности иммуноглобулинов и 90-100% жизнеспособности энтеральных микроорганизмов.

3. Определены требования к выбранной в качестве сорбента окиси алюминия по параметрам влагоемкости, величины pH, насыпной и утрясочной плотности, механической прочности и термостойкости. С применением биомассы различных микроорганизмов и растворов иммуноглобулинов показано, что закономерности протекания процесса сорбционно-контактной сушки микрокапельных порошков являются общими для биологических субстанций различной природы.

4. Разработан метод конструирования и технология приготовления комплексных биопрепаратов, включающая раздельное получение микрокапельных порошков биокомпонентов, их смешение, последующее одноэтапное обезвоживание сорбционно-контактной сушкой или двухэтапное с предварительным конвективным обезвоживанием и досушиванием влагоемким сорбентом, а также заключительную выдержку биопрепарата. Приготовлены экспериментальные серии препаратов КИП и В. adolescentis МС-42, КИП иХ. acidophilus (смесь штаммов NKb ЮОаш, К3Ш24).

6. Доклиническими испытаниями показана нетоксичность и безвредность комплексного биопрепарата КИП и В. а^кясепйз МС-42. Терапевтическая эффективность препарата при лечении обезьян, больных ОКИ с диарейным синдромом, составляет 100% и достоверно превосходит эффективность антибиотикотерапии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для конструирования биопрепаратов с улучшенными фармакокинетическими свойствами целесообразно использовать новый вид биологических материалов - микрокапельный порошок, относящийся к трехфазным микрогетерогенным дисперсным системам и получаемый диспергированием биологической жидкости в присутствии наноразмерного гидрофобного разобщителя аэросила. Приготовление микрокапелыгого порошка наиболее эффективно осуществлять в электромагнитном диспергаторе.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Давыдкин, Валерий Юрьевич, Москва

1. Ажгихин И.С. Технология лекарств. М.: Медицина, 1975. - 511 с.

2. Акоев Ю.С., Сенцова Т.Б., Яцык Г.В. Новый взгляд на дисбиозы у новорождённых детей // Рос. педиатрич. журн. 2000. - № 5. - С. 13-14.

3. Алексеев К.В., Шалдырван. Лекарственные формы интерферона // Антибиотики и химиотерапия. 1990. - № 9. - С. 51 - 54.

4. Алёшкин В.А., Султанова C.B., Афанасьев С.С. Некоторые особенности иммунодиагностики и иммунотерапии торпидных хронических смешанных инфекций гениталий // International Journal on Immunorehabilitation. 2000. -V. 2, №2.-P. 76.

5. Алешкин В.А., Борисова И.В., Холчев Н.В. Получение и исследование комплексных иммуноглобулиновых препаратов // Новые лекарственные препараты. Экспресс-информация. -М., 1993. В. 3. - С. 1 - 11.

6. Алёшкин В.А., Амерханова A.M., Бандоян А.К., Бояркина Л.А. Новые подходы к конструированию препаратов-пробиотиков // Клиническая геронтология. 2001. - Т. 7, № 8. - С. 74 - 75.

7. Алёшкин В.А., Зацепин Ю.К., Башлай А.Г. Получение противодифтерийного иммуноглобулина // Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине. Уфа. - 1995. - 4.1. - С. 100 - 102.

8. Алешкин В.А., Борисова И.В., Новикова Л.И. Разработка препаратов для профилактики и терапии инфекционных заболеваний // Проблемы мед. биотехнологии и иммунологии инфекционных болезней. М. - 1996. - Т. 2. -С. 7-21.

9. Алешкин В.А., Борисова И.В., Феклисова Л.В. Новые иммуноглобулиновые препараты для энтерального применения // Новые лекарственные препараты. М., 1997. - Вып. 2. - С. 3 - 11.

10. Алешкин В.А., Лютов А.Г., Антонян Р.К. Технологические аспекты вирусологической безопасности КИПа // Производственная трансфузиология на рубеже XXI века. М. - 1999. - С. 51 - 52.

11. Амбарцумян А.Д., Арутюнян К.Э., Тер-Степанян М.М. Молочнокислые бактерии в профилактике и лечении гнойно-воспалительных заболеваний //

12. Мат-лы VIII съезда Всерос. об-ва эпидемил., микробиол. и паразитологов. -М. 2002. - Т. 1 . - С. 132 - 133.

13. Апастасиев В.В. Разработка технологии получения нового поколения иммуноглобулинов для терапии инфекционных и аутоиммунных заболеваний человека.: Автореф.дисс. докт. биол. наук.- М. 1997. - 49 с.

14. Антонова Л.В. Острые воспалительные заболевания придатков матки: этиология, клиника, диагностика, терапия: Автореф. дис. докт. мед. наук. -М. 1990.-52 с.

15. Антоняи А.Р. Клинико-лабораторная эффективность пероральных иммуноглобулиновых препаратов при острых кишечных инфекциях вирусной и бактериальной этиологии у детей: Автореф.дис. канд. мед. наук. М. -1999. - 22 с.

16. Антоняи Р.К. Иммуноглобулин человеческий для внутривенного введения, вирусинактивированный // Производственная трансфузиология на рубеже XXI века. М. - 1999. - С. 39.

17. Арзуманян В.Г., Мокроносова М.А., Самуилова Т.Л., Гервазиева В.Б. Дрожжеподобные грибы на коже больных атопическим дерматитом // Ж. микробиол.- 1998.-№3.-С. 10-13.

18. Асцатурова O.P. Диагностика и лечение вульвовагинальной и хламидийной инфекции в 3 триместре беременности: Автореф дис. канд. мед. наук. -M.- 1998.-21 с.

19. Афанасьев С.С. Антитела против энтеробактерий, лизоцим и бета-лизины, стимулированные сапрофитами: Дис. канд. мед. наук. Воронеж. -1970.-205 с.

20. Афанасьев М.С., Алёшкин В.А., Сидорова И.С. и др. Результаты клинических испытаний комплексного иммунобиологического препарата

21. Кипферон-суппозитории // Аллергология и иммунология. 2000. - Т. 1, № 2. -С. 29.

22. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. — JL: Медицинская литература, 1962. 179 с.

23. Ашмарин И.П., Васильев H.H., Амбросов В.А. Быстрые методы статистической обработки и планирование экспериментов. JL: Изд-во Ленингр. ун-та, 1975. - 77 с.

24. Бактерийный препарат нового поколения «Споробактерин» / A.B. Алешкин, С.С. Афанасьев, В.Ю.Давыдкин, Т.Н. Манько, И.Ю. Давыдкин, А.Г. Гаврин // Парафармацевтика. № 2 (12). - 2003. - С. 21.

25. Бала М.А., Смирнова A.A., Цой A.C. Эффективность энтеросорбентов в комплексной реабилитации больных хронической патологией пищеварительной системы // IX Российский национальный конгресс "Человек и лекарство" 8-12 апреля в Москве М. - 2002. - С. 39.

26. Балезин С.А. Практикум по физической и коллоидной химии. М.: Просвещение, 1980.-271 с.

27. Бевз Н.И. Новый препарат-эубиотик на основе двух видов бифидобактерий (В. bifidum и В. longum) и его нормализующая микробиоценоз кишечника активность: Дис.канд. биол. наук. М., 1991. -123 с.

28. Бекер М.Е. Обезвоживание микробной биомассы. Рига: Зинатне, 1967. -361 с.

29. Бекер М.Е., Дамберг Б.Э., Рапопорт А.И. Анабиоз микроорганизмов. -Рига: Зинатне, 1981. 247 с.

30. Белоусов В.А., Вальтер М.Б. Основы дозирования и таблетирования лекарственных порошков. — М.: Медицина, 1980. 216 с.

31. Бланков Б.И., Клебанов Д.Л. Применение лиофилизации в микробиологии. М.: Медгиз, 1961. - 263 с.

32. Блохина И.Н., Соколова К.Я., Аникина Т.А. Комплексное использование биологических препаратов для лечения и профилактики острых кишечных инфекций и заболеваний, вызванных условно-патогенными микроорганизмами у детей. М. - 1989. - С. 119 - 124.

33. Богданова В.В., Анцупова A.C. Испытание профилактической эффективности колибактерина в детских учреждениях // Научные основы вакцинно-сывороточного дела. 1969. - Казань. - С. 224 - 229.

34. Богданова В.В., Анцупова A.C. Испытание профилактической эффективности колибактерина в детских учреждениях // Научные основы вакцинно-сывороточного дела. 1969. - Казань. - С. 224 - 229.

35. Богомолов Б.П., Генина Г.С. Применение колибактерина в период реконвалесценции после острой дизентерии // Применение колибактерина для профилактики и лечения кишечных заболеваний и технология его производства. 1967. - М. - С. 232-235.

36. Болотов В.Д., Мурашова А.О., Феклисова JI.B. Новый минералопробиотик "Кальцидум" // Мат-лы VIII съезда Всерос. об-ва эпидемил., микробиол. и паразитологов. М. - 2002 - Т. 1. - С. 139.

37. Бондаренко В.М., Лиходед В.Г. Идеи И.И. Мечникова и современная микроэкология кишечника человека // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2008. - №5. - С. 23 - 29.

38. Бондаренко В.М., Воробьев A.A. Дисбиозы и препараты с пробиотической функцией // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -2004.-№1.-С. 84-92.

39. Бондаренко В.М., Грачева Н.М. Препараты пробиотики, пребиотики и синбиотики в терапии и профилактике кишечных дисбактериозов // Фарматека. 2003. - №7. - С. 56 - 63.

40. Борисова И.В., Мухина H.A. Получение и исследование иммуноглобулинов из отходов производства препаратов крови // Сб. науч. тр. «Препараты нормальных и специфических иммуноглобулинов человека» -М., 1976. Т. XVIII. - С. 69 - 78.

41. Борисова И.В. Содержание иммуноглобулинов в сыворотках крови и в отходах производства у-глобулина (в осадке Б) // Сб. науч. тр. «Препараты нормальных и специфических иммуноглобулинов человека». М., 1976. -T.XVIII. - С. 66 - 68.

42. Борисова И.В. Экспериментальные исследования по получению комплексных препаратов иммуноглобулинов из сывороток плацентарной крови: Дис.канд. биол. наук: 14.00.36. -М., 1979.-21 с.

43. Борисова И.В., Алешкин В.А., Холчев Н.В. Комплексные иммуноглобулиновые препараты для перорального и ректального применения // Сб. научных трудов "Иммунобиологические препараты". М. - 1989. - С. 5 -9.

44. Бэйли Дж. Методы химии белков // Пер. с англ. Под. ред. А.Е. Браунштейна. - М.: Мир, 1965. - 284 с.

45. Вельтищев Ю.Е., Святкина О.Б. Атопическая аллергия у детей // Рос. вестн. перинатол. и педиатрии. 1995. - № 1- С. 4-10.

46. Ветлугина К.Ф., Любарт A.M. Опыт профилактического применения колибактерина в детских учреждениях // Применение колибактерина для профилактики и лечения кишечных заболеваний и технология его производства. 1967. - М. - С. 125-127.

47. Вивденко М.И., Шабалин К.Н. Исследование условий получения равномерных капель размеров 1 0,5 мм. // Изв. вузов. Химия и хим. технол., 1965. - Т.8, №4. - С. 685 - 690.

48. Вилыианская Ф.Л., Поспелова В.В. Жизнь и научная деятельность профессора Л.Г. Перетца // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1989,-№5.-С. 109-110.

49. Вилыпанская Ф.Л., Поспелова В.В., Рахимова Н.Г. Эффективность комплексного препарата бификол при хронических кишечных расстройствах //Сов. медицина. 1974. -№3.-С. 100- 104.

50. Витман A.A. Распыливание жидкости форсунками. — М.: ГосэнергоиздатД962. 246 с.

51. Влодавец В.В. Определение жизнеспособности бактерий в аэрозоле // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1963. - №4. - С. 46 - 50.

52. Водилова О.В. Значение углеводного состава кала для дифференциальной диагностики кишечных заболеваний у детей первого года жизни // Материалы VI Всерос. конфер. "Здоровое питание". М. - 2000. - С. 8-9.

53. Волынский М.С. Необыкновенная жизнь обыкновенной капли. М.: Знание, 1986.- 144 с.

54. Воробьёв A.A., Украинцев А.Д., Бережной A.M., Земсков Е.М. Влияние ферментов и секретов желудочно-кишечного тракта на вакцинный штамм ЕВ // Микробиология. 1976. - № 10. - С. 98 - 101.

55. Воробьёв A.A., Пак С.Г., Савицкая К.И. и др. Дисбактериозы у детей. Учебное пособие для врачей и студентов. М. - 1998. - 60 с.

56. Ворошилина H.H. Микробы вида Lactobacillus acidophilus как основа фармакопейных форм бактерийных препаратов: Дисс.канд. мед. наук. М., 1982.- 181 с.

57. Гавришева H.A., Антонова Т.В. Инфекционный процесс. Клинические и патофизиологические аспекты. Учебное пособие. С.-Петербург. - 1999. -256 с.

58. Гапонов К.П. Процессы и аппараты микробиологических производств. -М.: Легкая и пищевая промышленность, 1981. 240 с.

59. Глинка Н.Л. Общая химия: Учебн. пособие для вузов. 21-е изд., стереотипное / Под ред. В.А. Рабиновича. - Л.: Химия, 1980. - 720 с.

60. Глушанова H.A. Экспериментальное обоснование новых подходов к коррекции микробиоценоза кишечника: Дисс.док. мед. наук. Новокузнецк, 2005.-265 с.

61. Голдовский A.M. Анабиоз. Л.: Наука, 1981. - 136 с.

62. Гомберг М.А., Соловьев A.M., Некрасов A.B., Иванова A.C. Иммунотерапия при хроническом персистирующем урогенитальном хламидиозе // ЗППП. 1997. - № 4. - С. 34 - 36.

63. Гончарова Г.И. Бифидофлора человека, её защитная роль в организме и обоснование сфер применения препарата бифидумбактерина: Автореф.дис. док. биол. наук. М. - 1982. - 38 с.

64. Гончарова Г.И., Козлова Э.П., Лянная A.M., Чистякова В.И. Значение бифидофлоры для организма человека и необходимость её нормализации // Новые лекарственные препараты. Экспресс-информация. М. - 1987. - Вып. 4.-С. 1 - 5.

65. Гончарова Г.И. Изучение бифидобактерий, разработка препарата "Сухой бифидумбактерин" и его эффективность при кишечных заболеваниях детей первого года жизни: Автореф. .дис. канд. биол. наук. М. - 970. - 20 с.

66. Гончарова Г.И., Лянная A.M. Культуральная, морфологическая и биохимическая характеристика Bacterium bifidum // Тр. МНИИЭМ «Кишечные и воздушнокапельные инфекции». Т. XIII. - М., 1969. - С. 415 -426.

67. Государственная фармакопея СССР XI изд. М.: Медицина, 1990. -Вып. 1.-397 с.

68. Градус Л.Я. Руководство по дисперсионному анализу методом микроскопии. М.: Химия, 1979. - 232 с.

69. Грачёва Н.М., Гончарова Г.И., Аваков A.A. Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение при дисбактериозе кишечника. Методические рекомендации. М. - 1986. - 23 с.

70. Грачёва Н.М., Ющук Н.Д., Чупринина Р.П. Дисбактериозы кишечника, причины возникновения, диагностика, применение бактерийных биологических препаратов (пособие для врачей и студентов). М. - 1999. - 44 с.

71. Грачёва Л.А. Цитокины в онкогематологии,- М.: Алтус. 1996. - 168 с.

72. Гранитов В.М. Хламидиозы Н.Новгород, Изд-во НГМА. - 2000. - 192

73. Грачева Н.М., Петрова М.С., Аваков A.A., Партии О.С. Иммуноглобулиновые препараты для энтерального применения в практике лечения детей и взрослых / Новые лекарственные препараты 2003. - Вып.4. -С.33 - 42.

74. Грачёва Н.М., Ющук Н.Д., Чупринина Р.П. Дисбактериозы кишечника, причины возникновения, диагностика, применение бактерийных биологических препаратов. М. - 1999. - 44 с.

75. Грачёва Н.М., Гаврилов А.Ф., Щербаков И.Т., Леонтьева H.H. Эффективность коротких курсов лечения бактерийными биопрепаратами у больных ОКИ // Новые лекарственные препараты. М. - 1990. - № 5. - С. 9 -16.

76. Грачёва Н.М., Чупринина Р.П., Мацулевич Т.В. Дифференцированное применение биологических бактерийных препаратов при острых кишечных инфекциях вирусно-бактериальной природы в современных условиях. Учебное пособие. М. - 1999. - 24 с.

77. Грачёва Н.М., Поспелова В.В., Гаврилов А.Ф. Применение колисодержащих бактерийных биопрепаратов у больных с дисбактериозом кишечника // Новые лекарственные препараты. Экспресс-информация. 1986. -М.-Вып. 12.-С. 1-5.

78. Грачёва Н.М., Поспелова В.В., Гаврилов А.Ф. Применение бактерийных биопрепаратов у больных с острыми кишечными инфекциями // Мед. аспекты микробной экологии. -1991.-М. С. 183- 191.

79. Грачева Н. М., Петров М. С., Аваков A.A., Партии О.С. Иммуноглобулиновые препараты для энтерального применения в практикелечения детей и взрослых // Новые лекарственные препараты. 2003. - Вып. 4. - С. 33 - 42.

80. Григорьев A.B., Бондаренко В.М., Абрамов H.A. Разработка и клиническая оценка пробиотика "Бифидумбактерин форте" // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1997. - № 3. - С. 92 - 96.

81. Гуйго Э.И., Журавская Г.К., Каухчешвили Э. Сублимационная сушка в пищевой промышленности. М.: Пищевая промышленность, 1972. -433 с.

82. Давыдкин Ю.П., Похиленко В.Д., Давыдкин В.Ю., Давыдкин И.Ю. Анализ системы получения продуктов тонкого биотехнологического синтеза с позиции системного подхода. Микробиологическое производство: Обзорн. информ. М.: НИИСЭНТИ, 1992. - Вып. 1. - 20 с.

83. Давыдкин И.Ю., Давыдкин В.Ю., Давыдкин Ю.П., Блинов В.М. Масштабирование процессов тонкого измельчения биологических материалов: Процессы и аппараты химико-фармацевтических производств: Обзорн. информ. НИИСЭНТИ, 1992. - Вып. 2. - 22 с.

84. Даниэльс Ф., Олберти Р. Физическая химия. М.: Мир, 1978. - 638 с.

85. Дашевский Ю.Я., Аваков A.A. Эффективность применения бификола при сальмонеллёзе // Сб. науч. тр. «Биологические препараты для профилактики, терапии и диагностики инфекционных заболеваний». М. -1983.-С. 102- 105.

86. Дей К., Селбин Д. Теоретическая неорганическая химия. 3-е. изд. М.: Химия, 1976.-567 с.

87. Демиховский И.Е. Бактерии-антагонисты, обитающие в полости рта человека, и возможность их терапевтического применения: Автореф.дис. канд. мед. наук. М., 1974. - 23 с.

88. Денисова И.В. Санитарно-гигиеническая и микробиологическая характеристика новых пробиотических препаратов «Соя-бифидум» и «Соя-лактум»: Автореф.дис. канд. мед. наук. Оренбург, 2006. - 23 с.

89. Демешева М.И. Совершенствование технологии лекарственных форм бифидумбактерина: Автореф.дис. канд. фарм. наук. Пермь, 2005. -22 с.

90. Долинов К.Е. Основы технологии сухих биопрепаратов. М.: Медицина, 1968. - 196 с.

91. Дубинин A.B., Бабин В.Н., Раевский П.М. Трофические регуляторные связи кишечной микрофлоры и макроорганизма (к патогенезу синдрома раздражённой толстой кишки) // Клинич. медицина. 1991. - № 7. - С. 24-28.

92. Дунский В.Ф., Никитин Н.В., Соколов М.С. Моподисперсные аэрозоли. -М.: Наука, 1975. 188 с.

93. Дьякова Е.И., Шандалов Б.Я. Применение сухого колибактерина с целью профилактики и терапии кишечных заболеваний у детей раннего возраста // Научные основы вакцинно-сывороточного дела. 1969. - Казань. -С. 222 - 224.

94. Евстратова К.И., Купина H.A., Малахова Е.Е. Физическая и коллоидная химия: Учеб. для фармвузов и факультетов / Под ред. К.И. Евстратовой. М.: Высшая школа, 1990. - 487 с.

95. Зайцева О.В., Левшин И.Б., Лаврентьев A.B. и др. Частота встречаемости и особенности течения бронхиальной астмы у детей, ассоциированной с Chlamydia pneumoniae // Педиатрия. 1999. - № 1. - С. 29 -33.

96. Заявка 2002106749 RU, МПК7 А61К 9/22. Оральные лекарственные формы / Й. Бартоломойз (DE), И. Циглер (DE); Грюненталь ГМБХ (DE). -Заявл. 29.08.2000; Опубл. 20.11.2003.

97. Заявка 2002117074 RU, МПК7 А61К 35/74. Способ получения сухих форм комплексного препарата-пробиотика / М.М. Алсынбаева, Ф.А. Байгузина, В.Ф. Кулагин, Т.Н. Кузнецова (RU). Заявл. 28.06.2002; Опубл. 27.02.2004.

98. Заявка 2002117254 RU, МПК7 А61К 33/06. Комплексный препарат / В.Д. Болотов, A.C. Зальцман, И.И. Вайншток и др. (RU). Заявл. 28.06.2002; Опубл. 20.01.2004.

99. Заявка 2006100740 RU, МПК А61К 35/00. Комплексный препарат-пробиотик в иммобилизованной и лиофилизированной форме и способ его получения / A.B. Молокеев, P.M. Ильина, P.M. Яцентюк и др. (RU). Заявл. 10.01.2006; Опубл. 20.07.2007.

100. Заявка 2004108581 RU, МПК7 А61К 35/66. Способ получения сухого пробиотического препарата «БАЦЕЛЛ» / А.И. Петренко, В.А. Ярошенко, А.Г. Кощаев и др. (RU). Заявл. 22.03.2004; Опубл. 27.09.2005.

101. Заявка 97110769 RU, МПК6 А61К 9/48. Способ получения капсул, содержащих бактерии В. bifidum (бифидумбактерин сухой в капсулах) / Б.И. Алин, О.Б. Красильникова, A.A. Ворончихин и др. (RU). Заявл. 26.06.1997; Опубл. 10.06.1998.

102. Заявка 99112456 RU, МПК7 А61К 35/74. Биопрепарат для повышения продуктивности / А.Н. Панин, Н.И. Малик, Е.В. Малик, И.Ю. Вершинина1Ш); ВГНИИ контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (БШ).-Заявл. 12.06.1999; Опубл. 10.06.2001.

103. Заявка 2000103216 ГШ, МПК 7 А61К 31/7064. Новая композиция / Бродхед Джоанн (ОВ); АСТРА ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ ЛТД. (ОВ). -№2000103216/14; Заявлено 29.06.1998; Опубл. 10.01.2002.

104. Заявка 2001101910 1Ш, МПК 7 А61К 9/127. Способ получения липосом / Грегориадис Грегори, Зади Брахим, Джайасекера Прамукх Налака (ОВ); ДЗЕ СЕКРЕТЕРИ ОФ СТЕЙТ ФОР ДЕФЕНС (ОВ). №2001101910/14; Заявлено 16.06.1999; Опубл. 27.11.2002.

105. Заявка 2005140093 БШ, МПК А61Ь 27/12. Неорганический резорбируемый материал для замены костей / Гербер Томас (БЕ); АРТОСС ГМБХ (ЭЕ). №2005140093/15; Заявлено 24.05.2004; Опубл. 27.06.2007.

106. Заявка 95110319 БШ, МПК 6 А61К 35/74. Способ получения пробиотического препарата / В.М. Батарагин, С.М. Кузина, М.Н. Мартовецкий, Н.Б. Голуб (БШ). Заявл. 19.06.1995; Опубл. 27.03.1996.

107. Заявка 2002129938 RU, МПК 7 C12N 1/20. Пробиотическая добавка и способ ее получения / Г.В. Кулаков, В.В. Михайлов, A.B. Колосков (RU). -Заявл. 11.11.2002; Опубл. 10.08.2004.

108. Зимон А.Д. Адгезия пыли и порошков. М.: Химия, 1976. - 432 с.

109. Зорик A.B., Алешкин В.А., Лютов А.Г. Новый способ выделения иммуноглобулинов из осадка Б // Материалы 1 Международного Конгресса «Биотехнология состояние и перспективы развития», 14-18 октября 2002 г. в Москве. - М.: ЗАО «ПИК «Максима», 2002. - С. 65.

110. Иммунохимический анализ // Под ред. Л.А.Зильбера. М.: Медицина, 1968.-300 с.

111. Иммунобиологические препараты и перспективы их применения в инфектологии / Под ред. Г.Г. Онищенко, В.А. Алешкина, С.С. Афанасьева, В.В. Поспеловой. М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2002. - 608 с.

112. Исрафилов А.Г., Лютов А.Г., Кудашева Г.Б. и др. Способ получения внутривенного иммуноглобулина (ВВИГ) с pH 3,9-4,4 // International jornal of immunorehabilitation. 1998. - № 10,- P. 174 - 181.

113. К вопросу использования электромагнитных аппаратов для получения высокодисперсных эмульсий / А.Г. Гаврин, В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин, В.М. Блинов, С.С. Афанасьев // Проблемы инфекционных болезней. -М.,2000. -Ч. 2.-С. 261 -266.

114. Каншина H.H. Оценка адгезии бактерийных препаратов как критерий эффективности их применения в комплексном лечении больных острой дизентерией: Дис.канд. мед. наук. -М. 1996. - 121 с.

115. Кантере В.М. Системный подход к анализу и синтезу промышленной системы культивирования микроорганизмов // В кн.: Применение математических методов в микробиологии. Пущино, 1975. - С. 97 - 119.

116. Карпов A.M., Улумиев A.A. Сушка продуктов микробиологического синтеза. М.: Пищевая промышленность, 1982. - 216 с.

117. Кафаров В.В., Винаров А.Ю., Гордеев Л.С. Системный подход к анализу биологических систем/ В кн.: Математическое моделирование сложных ХТС. Таллин, 1982. - С. 116 - 117.

118. Кафаров В.В., Винаров А.Ю., Гордеев Л.С. Моделирование и системный анализ биохимических производств. М.: Лесная промышленность, 1985. - 280 с.

119. Кашкин П.Н., Долииская А.Г., Соколова Н.М. О бактерицидных свойствах натурального желудочного сока // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол,- 1953. -№ 8. С. 59 - 64.

120. Кашковская Н.В. Экспериментально-клиническое обоснование применения биологических микробных препаратов в гинекологии и стоматологии: Автореф. дис. канд. биол. наук. М. - 1992. - 17 с.

121. Кельцев Н.В. Основы адсорбционной техники. М.: Химия, 1976. -511 с.

122. Кира Е.Ф. Бактериальный вагиноз: клиника, диагностика и лечение: Автореф. дис. докт. мед наук. С-П. - 1995. - 45 с.

123. Козлова Э.П. Микрофлора кишечника новорождённых детей в норме и патологии и восстановление её бифидумбактерином: Автореф.дис. канд. мед. наук. M. - 1978. - 25 с.

124. Коколина В.Ф., Зубакова О.В. Диагностика и лечение урогенитальных инфекций в гинекологии детского и подросткового возраста. Москва. - 1998. - 19 с.

125. Кокуев A.B. Действие ректального и ингаляционного введения лекарственных форм рекомбинантного а2-интерферона с комплексным иммуноглобулиновым препаратом при инфекционно-воспалительных заболеваниях: Дис.канд. мед. наук. М. - 2000. - 88 с.

126. Королюк A.M., Савичева A.M., Мартикайиен З.М. Пробиотическая стимуляция вагинальной микрофлоры // Мат-лы VIII съезда Всерос. об-ва эпидемия., микробиол. и паразитологов. М. - 2002. - Т. 1. - С. 186 - 187.

127. Короткий Н.Г., Бельмер C.B., Фабрика Н.П., Григорьева Е.В. К вопросу о патогенезе атопического дерматита // Вестн. Акад. постдипломн. мед. образования. М. - 1999. -№ 2. - С. 12 - 18.

128. Короткий Н.Г., Тихомиров A.A. Современная фармакотерапия аллергодерматозов у детей // Рос. педиатрич. журнал. 2000. - № 3. - С. 38 -41.

129. Крамарь B.C. Опыт лечения детей, больных хронической дизентерией, сухим колибактерином //Применение колибактерина для профилактики и лечения кишечных заболеваний и технология его производства. 1967. - М. -С. 134- 137.

130. Красик Jl.JI. Усовершенствование производства колибактерина и разработка нового экспериментального препарата из молочных бактерий штамма Lbm. plantarum 8Р-АЗ: Автореф.дис. канд. биол. наук. 1972. -Пермь. - 29 с.

131. Кузьменко Л.Г., Соколов А.Л., Капустин И.В. Инфицированность детей с бронхиальной астмой цитомегаловирусом и возбудителями микоплазмоза, пневмоцистоза, хламидиоза // Педиатрия. 1999. - № 1. - С. 15 -20.

132. Культивирование микроорганизмов в микрообъемах питательной среды / В.Ю. Давыдкин, С.С. Афанасьев, И.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин, A.A. Воробьев, А.Г. Гаврин, A.B. Зорик // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.- № 3. -2003. С. 11 - 15.

133. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1980. - 293 с.

134. Лапин Б.А., Джикидзе Э.К., Крылова Р.И., Стасилевич З.К., Яковлева Л.А. Проблемы инфекционной патологии обезьян. М.: Издательство РАМН, 2004. - 140 с.

135. Лебедева О.В., Бажукова Т. А. Профилактика дисбиотических изменений у детей // Мат-лы VIII съезда Всерос. об-ва эпидемил., микробиол. и паразитологов. М. - 2002. - Т. 1. - С. 196 - 197.

136. Ленцнер A.A. Лактобактерии в профилактике и лечении дисбактериозов кишечника // Тез. докл. IV Всерос. съезда эпидемиологов и микробиологов. 1978.-М. - С. 123 - 124.

137. Ленцнер A.A. Антагонистическая активность лактобацилл микрофлоры человека // Мат-лы науч. конф. «Аутофлора здорового и больного организма». 1972. - Таллин. - С. 157 - 160.

138. Лизько H.H. Дисбактериозы экстремальных состояний //Антибиотики и медицинская биотехнология. 1987. - Т. 32, № 3. - С. 184 - 186.

139. Литяева Л. А. Микроэкологические подходы к профилактике инфекционных заболеваний у новорождённых: Автореф.дис. докт. мед. наук.-М.- 1992.-41 с.

140. Лукьянов А.Б. Физическая и коллоидная химия. М.: Химия, 1988. -288 с.

141. Лыкова Е.А., Бондаренко В.М., Сидоренко C.B. Сочетанная антибактериальная и пробиотическая терапия хеликобактер-ассоциированных заболеваний у детей // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.- 1999. -№2.-С. 76-81.

142. Лыков A.B. Теория сушки. М.: Энергия, 1968. - 471 с.

143. Лютов А.Г., Алешкин В. А. Разработка внутривенного иммуноглобулина нового поколения // Сб. тр. МНИИЭМ им. Т.Н. Габричевского «Проблемы мед. биотехнологии и иммунологии инфекционных болезней». М., - 1996. - Т.2. - С. 21 - 27.

144. Лютов А.Г., Алешкин В.А., Исрафилов А.Г. Особенности производственного процесса приготовления комплексного иммуноглобулинового препарата // Актуальные вопросы диагностики, терапии и профилактики инфекционных заболеваний. М. - 1997.- С. 6.

145. Майстрах Е.В. Гипотермия и анабиоз. М.,Л.: Наука, 1964. - 327 с.

146. Мальнева Н.С. Изменение состояния тканей пародонта при воздействии некоторых экстремальных факторов: Автореф.дис. канд. мед. наук.-М.- 1997.- 16 с.

147. Мацулевич Т.В., Новокшонов А.А., Мурашова А.О. Пробифор в лечении острых кишечных инфекций // IX Российский национальный конгресс "Человек и лекарство", 8-12 апреля 2002 г. в Москве М.-С. 290.

148. Машкиллейсон А.С. Красный плоский лишай // Заболевания слизистой оболочки полости рта и губ. М. - 1992. - С. 10 - 13.

149. Маянский А.Н. Микробиология для врачей (очерки патогенетической микробиологии). Н.Новгород: Издательство Нижегородской государственной медицинской академии, 1999. - 400 с.

150. Мелихова А.В. Разработка технологии приготовления сухих дозированных форм комплексного иммуноглобулинового препарата: Автореф. дисс. канд. биол. наук. М. - 2010. - 29 с.

151. Мельничук Г.М. Применение эубиотика "Ацилакт" в комплексном лечении пародонтита: Автореф. дис. канд. мед. наук. М. - 1995. - 25 с.

152. Местное применение лекарственных форм, содержащих человеческий рекомбинантный интерферон а-2 / В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, М.С. Афанасьев и др. // Методические рекомендации. Астрахань, 2001. - 8с.

153. Методы общей бактериологии: Пер. с англ. / Под ред. Ф.Герхарда и др. М.: Мир, Т.1.- 1984. - С. 458 - 464.

154. Минушкин О.Н., Ар датская М.Д., Бабин В.Н. Изучение содержания и профиля летучих жирных кислот в кале у больных с дисбактеиозом толстой кишки // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. -1995.-T. V, № 3. С. 155.

155. Мирошник O.A. Бактерийные и биологические препараты для коррекции дисбиозов // Тез. Всерос. конфер. "Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространённых заболеваний человека". М. - 1999. - С. 33.

156. Миттел К. Мицелообразование, солюбилизация и микроэмульсии. -М.: Мир, 1980.-598 с.

157. Митрохин С.Д. Метаболиты нормальной микрофлоры человека в экспресс-диагностике и контроле лечения дисбиоза толстой кишки: Автореф. дис. док. мед. наук. М. - 1998. - 37 с.

158. Молохова Е.И. Экспериментально-теоретическое обоснование составов, технологии и стандартизации лекарственных форм пробиотиков: Автореф. .дис. док. фарм. наук. Пермь, 2003. - 45 с.

159. Морозова В.Т., Миронова И.И., Марцишевская P.JI. Лабораторная диагностика патологии пищеварительной системы. М.: Лабора, 2005. - 128 с.

160. Мунблит В .Я., Тальрозе В.Л., Трофимов В.И. Термоинактивация микроорганизмов. -М.: Наука, 1985. 248 с.

161. Муравьев И.А. Технология лекарств. М.: Медицина, 1971. - 752 с.

162. Наумова О.В., Белова Е.Е., Хабазова Е.И. Аутофлора человека в норме и патологии и её коррекция. Горький. - 1988. - 52 с.

163. Несчисляев В.А. Пробиотики: микробиологические и технологические аспекты получения, контроля и конструирования препаратов: Автореф.дис. док. мед. наук. Пермь, 2005. - 45 с.

164. Никитин Е.Е. Сушка биопрепаратов методом распыления // Труды Московского НИИ эпидемиологии, микробиологии и гигиены «Сушка биологических материалов, вопросы механизации и автоматизации производства». -М., 1960. -Вып. VII. С. 151 - 161.

165. Никитин Е.Е. Сушка биопрепаратов методом распыления // Труды Московского НИИ эпидемиологии, микробиологии и гигиены «Сушка биологических материалов, вопросы механизации и автоматизации производства». -М., 1960.-Вып. VII. С. 151-161.

166. Никитин Е.Е., Звягин И.В. Замораживание и высушивание биологических препаратов. М.: Колос, 1971. - 343 с.

167. Нисевич Н.И., Гаспарян М.О., Новокшонов A.A. и др. Применение ударных доз бифидумбактерина-форте при острых кишечных инфекциях у детей // Terra medica. 1999.-№ 51.-С. 14-15.

168. Новик Т.Н., Астапович Н.И., Самарцев A.A., Рябая Н.Е. Выделение и характеристика белково-полисахаридного комплекса, секретируемого В. adolescentis // Микробиология. 1997. - Т. 66, № 5. - С. 621 - 627.

169. Новокшонов A.A., Соколова Н.В., Портных О.Ю. Клиническая эффективность энтеросорбента фильтрум при острых кишечных инфекциях у детей // IX Российский национальный конгресс "Человек и лекарство" 8-12 апреля в Москве М. - 2002. - С. 324.

170. Новые подходы к конструированию препаратов-пробиотиков на основе бифидобактерий / Бандоян А.К., Амерханова A.M., Алешкин В.А. и др. // Сб. науч. тр. «Проблемы инфекционных болезней». М., 2000. - С. 284 -286.

171. Обеспечение безопасности в клинико-диагностических лабораториях. Справочное пособие. М.: Лабора, 2006. - 336 с.

172. Озерная М.С. Клинико-микробиологическое обоснование применения бактерийных и иммунных препаратов при ОКИ у детей раннего возраста: Автореф. дис. канд. мед. наук.-М. 1991.-21 с.

173. Олейниченко E.B. Побочные биологические эффекты антибактериальной терапии у пульмонологических больных и пути их коррекции.: Автореф. дис. канд. мед. наук. 1977.-22 с.

174. Олейник И.И., Жданова Л.П., Быченко Б.Д., Робустова Т.Г. Бактериологическая диагностика неспорогенных анаэробных инфекций при острых одонтогенных воспалительных процессах. Методические рекомендации. — М. 1985. - 28 с.

175. Олейниченко Е.В. Эффективность аципола в профилактике дисбактериоза кишечника при антибактериальной терапии // Антибиотики и химиотерапия. 1999. - Т. 4, № 1. - С. 23 - 25.

176. Олейникова Е.А., Маковоз Р.К. Методика определения и природа бактерицидного действия желудочного сока // Лабораторное дело. 975. - № 4.-С. 239-242.

177. Осипова И.Г. Экспериментально-клиническое изучение споровых пробиотиков: Автореф. .дис. док. биол. наук. М, 2006. - 48 с.

178. Оценка способа получения сухой высокодисперсной вакцины вируса болезни Ньюкасла / В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин, А.Г. Гаврин, A.A. Ворообьев, С.С. Афанасьев // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2001. - № 2. - С. 45 - 49.

179. В.А. Калашникова, А.Г. Гаврин, A.B. Зорик, Л.И. Новикова // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. № 3. - 2003. - С. 57 - 62.

180. Пажи Д.Г., Галустов B.C. Распылители жидкости. М.: Химия, 1979. -228 с.

181. Панин А.Н., Малик Н.И., Малик Е.В. Иммунобиология и кишечная микрофлора. "Аграрная наука", НК "Родник". - 1998. - 47 с.

182. Парфёнов А.И., Калоев Ю.К., Сафонова С.А. и др. Дисбактериоз кишечника // Московский мед. журнал. 1998. - Т. 1, № 12. - С. 7.

183. Патент 2270684 RU, МПК А61К 33/24. Лекарственный препарат «ВИТАСОРБ» / А.Г. Гриценко (RU). № 2005101244/15; Заявл. 20.10.2005; Опубл. 27.02.2006.

184. Патент 2076722 RU, МПК6 А61К 35/74. Способ получения сухой биомассы лакто-, коли- или бифидобактерий / B.C. Пучнин, H.H. Чугунова, В.А. Насчисляев (RU); Пермский фармацевтический институт (RU). № 94024323/13; Заявл. 29.06.1994; Опубл. 10.04.1997.

185. Патент 2227036 RU, МПК7 А61К 33/06. Способ лечения кишечных инфекций у детей / Т.В. Мацулевич, JI.B. Феклисова, JI.B. Титова, И.В. Щепина (RU); ЗАО «Партнер» (RU). № 2002109287/14; Заявл. 11.04.2002; Опубл. 20.04.2004.

186. Патент 2104299 RU, МПК6 C12N 1/04. Способ получения сухих бактериальных препаратов / В.И. Ходак, П.П. Фукс, В.Г. Квачов, Э.П. Петренчук (RU). № 96110483/13; Заявл. 24.05.1996; Опубл. 10.02.1998.

187. Патент 2043587 RU, МПК6 F26B 5/16. Способ сушки биологических материалов / А.И. Григоренко, Н.В. Крамской, A.B. Колосков и др. (RU); Вирусологический центр НИИ микробиологии МО РФ (RU). № 92001747/06; Заявл. 22.10.1992; Опубл. 10.09.1995.

188. Патент 2067114 RU, МПК6 C12N 1/20. Способ получения сухого пробиотического препарата / И.М. Нахабин, В.В. Перелыгин, Ю.С. Биркина, A.B. Старцев (RU); ГНИИ прикладной микробиологии (RU). № 5016135/13; Заявл. 05.12.1991; Опубл. 27.09.1996.

189. Патент 2164801 RU, МПК7 А61К 35/74. Препарат-пробиотик в сухой иммобилизованной форме / A.B. Молокеев, Л.Г. Никулин, P.M. Ильина и др. (RU); Дочернее ГУЭПП «Вектор-Биальгам» (RU). № 99125163/13; Заявл. 06.12.1999; Опубл. 10.04.2001.

190. Патент 1156693 СССР. Способ лечения воспалительных заболеваний женской половой сферы / Бакулева Л.П., Желнина Р.К., Нестерова A.A. и др. (СССР). Заявлено 20 июня 1982.

191. Патент 2146531 РФ. Способ лечения инфекционных заболеваний / Султанова С.В., Алёшкин В.А., Афанасьев С.С. и др. (РФ). Зарегистрирован 20.03.2000 г.

192. Патент 2137498 RU, МПК6 А61К 38/32. Способ лечения дисбактериозов кишечника / А.Л. Бурмистрова, Т.А. Суслова, Э.А. Рыбин и др. (RU). № 96119817/14; Заявл. 01.10.1996; Опубл. 20.09.1999.

193. Патент 2200566 RU, МПК7 А61К 35/74. Способ получения лактобактерина / В.А. Несчисляев, И.В. Фадеева (RU); Пермское НПО «Биомед» (RU). № 96119817/14; Заявл. 01.10.1996; Опубл. 20.09.1999.

194. Патент 2083666 RU, МПК6 C12N 1/20. Способ получения сухого бактериального препарата «Бифацид» / В.И. Ганина, В.Ф. Семенихина, В.Ф. Иноземцева и др. (RU). № 95113405/13; Заявл. 27.07.1995; Опубл. 10.07.1997.

195. Патент 2174400 RU, МПК7 А61К 35/74. Лечебно-профилактический препарат, содержащий бифидобактерии / Т.Н. Кузнецова, А.Ф. Садыкова, Т.А. Баталова, А.Н. Нуртдинова (RU); ГУП «Иммунопрепарат» (RU). № 2000111666/13; Заявл. 10.05.2000; Опубл. 10.10.2001.

196. Патент 2182008 RU, МПК7 А61К 35/74. Вводимая перорально, ректально или интравагинально композиция, содержащая живые бактерии / И.Н. Самойленко, О.И. Самойленко, Т.В. Хорошева и др. (RU). № 2000126345/14; Заявл. 20.10.2000; Опубл. 10.05.2002.

197. Патент 2185842 RU, МПК7 А61К 35/74. Лекарственный препарат для профилактики и лечения урогенитальных инфекций / Т.Н. Кузнецова, А.Ф.

198. Хазиев, O.B. Кунягина (RU); ГУП «Иммунопрепарат» (RU). № 99121116/14; Заявл. 06.10.1999; Опубл. 27.07.2002.

199. Патент 2065305 RU, МПК6 А61К 35/74. Способ получения сухого пробиотического препарата / В.Б. Зинченко, И.М. Нахабин, Ю.П. Падерин и др. (RU); ГНИИ прикладной микробиологии (RU). № 5015484/13; Заявл. 05.12.1991; Опубл. 20.08.1996.

200. Патент 2284354 RU, МПК C12N 1/20. Пробиотик / М. Микелсаар (ЕЕ), М. Зилмер (ЕЕ), Т. Куллисаар (ЕЕ), X. Аннук (ЕЕ), Е. Сонгисепп (ЕЕ); Тартусский университет (ЕЕ). № 2003137810/13; Заявл. 21.06.2002; Опубл. 27.09.2006.

201. Патент 2314819 RU, МПК А61К 35/74. Лечебно-профилактическое пробиотическое средство / А.И. Леляк, A.A. Малярчук (RU). № 2006122653/13; Заявл. 23.07.2004; Опубл. 27.02.2006.

202. Патент 2189833 РФ, А61К 39/395. Способ получения иммуноглобулинового препарата / A.B. Зорик, В.А. Алешкин, А.Г. Лготов, И.В. Борисова (РФ); ГУ МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского МЗ РФ. № 2000126310/14; Заявлено 19.10.2000; Опубл. 27.09.2002, Бюл. №27.-6 с.

203. Патент № 2140787 RU, МПК6 А61К 35/74. Способ получения бифидумбактерина сухого / Бубнов Н.В., Петров И.Г. (RU). № 98105327/13; Заявлено 13.03.1998; Опубл. 10.11.1999, Бюл. №3.-4 с.

204. Патент № 2232808 RU, МПК 7 C12N 7/00. Биопрепарат на основе бактериофагов для профилактики и лечения сальмонеллеза животных / Э.А. Светоч, С.В. Ленев, В.В. Перелыгин и др. (RU) № 2002127149/13; Заявл. 11.10.2002; Опубл. 20.07.2004, Бюл. № 20.-17 с.

205. Патент 2159624 RU, МПК7 А61К 35/66. Средство для коррекции микробиоценоза / Григорьев А.В., Егорова С.М., Григорьева Т.А. (UA); Григорьев А.В. (UA). №99104933/14; Заявл. 18.03.1999; Опубл. 27.11.2000, Бюл. №33.

206. Патент 1831801 СССР, В 01 F 13/08. Устройство для обработки материалов / И.Ю. Давыдкии, Ю.П. Давыдкин, В.Ю. Давыдкин, В.М. Блинов, С.Д. Никитинский (СССР). № 4927044/26; Заявлено 16.04.91; Зарегистрировано 13.10.1992 (непубл.). - 3 с.

207. Патент 2026730 РФ, B01F 13/08. Способ обработки материалов / И.Ю. Давыдкин, Ю.П. Давыдкин, В.Ю. Давыдкин, В.М. Блинов, С.Д. Никитинский (РФ). № 4915199/26; Заявлено 28.02.91; Опубл. 20.01.95, Бюл. №2.-5 с.

208. Перетц Л.Г. Значение нормальной микрофлоры для организма человека. М. - 1955. - 431 с.

209. Перетц Л.Г. СоН-антагонизм и Coli-терапия. Ленинград, 1935. - 80 с.

210. Петрова Л.В. Комплексная терапия заболеваний слизистой оболочки рта и красной каймы губ с применением эубиотиков // Сб. тр. юбил. конф. педиатр, ф-та РГМУ «Актуальные вопросы дерматологии и венерологии». -М -1997.-С. 163 164.

211. Петрянов-Соколов И.В., Сутугин А.Г. Аэрозоли. М.: Наука, 1989. -144 с.

212. Подольский В.М. Высушивание препаратов крови и кровезаменителей.- М.: Медицина, 1973.- 192 с.

213. Полинг JI. Общая химия. М.: Мир, 1974. - 846 с.

214. Покатилова А.И., Галкина Л.А., Мацулевич Т.В. Результаты использования высоких доз бифидумбаюгерина-форте при ОКИ у детей раннего возраста // Новые технологии в терапии и профилактике инфекционных заболеваний у детей. Санкт-Петербург. - 2000. - С. 46.

215. Поспелова В.В., Пожалостина Л.В., Агеева Л.В. Коррекция микробиоценоза желудочно-кишечного тракта и полости рта с помощью ацилакта // Мат-лы конф. "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями". С.Петербург. - 1998. - С. 210.

216. Поспелова В.В. Микробные биопрепараты для коррекции бактериоценоза кишечника, их конструирование и применение: Дисс.док. мед. наук. М., 1979. - 459 с.

217. Поспелова В.В., Грачёва ILM., Ханина Г.И. Эубиотики эффективное средство нормализации микрофлоры и вклад МНИИЭМ в их разработку (к 100-летию института) // Врач. - 1997. - № 4. - С. 30 - 32.

218. Поспелова В.В., Манвелова М.А., Рахимова Н.Г. Ацидофильные лактобактерии и их значение в системе средств, регулирующих бактериоценоз //В кн.: Медицинские аспекты микробной экологии. 1991. - М. - С. 175 -182.

219. Прахин Е.И., Куртасова JI.M., Перьянова О.В. Оценка эффективности биовестина у детей, инфицированных микобактериями туберкулёза // Материалы VI Всерос. Конф. «Здоровое питание». М. - 2001. - С. 161 - 162.

220. Применение препаратов интерферона в лечении воспалительных заболеваний лимфаденоидного кольца глотки /В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, В.Ю. Давыдкин, Т.Н. Манько, И.Ю. Давыдкин, А.Г. Гаврин // Медицинская картотека. №1. - 2003. - С. 26 - 27.

221. Применение замораживания-высушивания в биологии // Под ред. Р. Харриса. М.: Иностранная литература, 1956. - 533 с.

222. Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы // Сб. матер, междунар. конф. под ред. В.А. Алешкина, 2-4 июня 2004 г. в Москве. М., 2004. - 242 с.

223. Пробиотические микроорганизмы современное состояние вопроса и перспективы использования // Сб. матер, междунар. науч.-практич. конф. памяти Г.И. Гончаровой под ред. В.А. Алешкина. - М., 2002. - 88 с.

224. Производственный регламент. Комплексный иммуноглобулиновый препарат сухой для энтерального применения (КИП). Immunoglobulinum complexus siccum ad usum enteralem / Минздрав РФ: Введ. 30.05.1996. M., 1996.-86 с.

225. Протоклитова Н.С., Воротынцева Н.В., Трембовля С.И. Применение бификола и бифидумбактерина при лечении детей, больных дизентерией и сальмонеллёзом // Тез. докл. I Всерос. съезда инфекционистов «Кишечные инфекции и инвазии» 1977. - Уфа. - С. 177- 179.

226. Равич-Биргер Е.Д., Эпштейн-Литвак Р.В. Бактериологические и серологические методы исследования при инфекционных заболеваниях. М.: Медицина, 1965.-248 с.

227. Равич-Щербо М.И., Новиков В.В. Физическая и коллоидная химия. -М.: Высшая школа, 1975. 255 с.

228. Разработка технологии приготовления твердой дозированной формы БАД «Биобактерин» / В.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин, А.Г. Гаврин и др. // Тез. докл. VII Российского национального конгресса «Человек и лекарство», 10-14 апреля 2000 г. М.,2000. - С. 568.

229. Разработка мягкой лекарственной формы с цитокинами / Т.Н. Манько, С.С. Афанасьев, В.Ю. Давыдкин, В.А. Алешкин, А.Г. Гаврин, И.Ю. Давыдкин, A.B. Мелихова // Материалы II Московского международного

230. Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 10-14 ноября 2003 г. в Москве. М.: ЗАО «ПИК «Максима», 2003. - 4.1. - С. 144 - 145.

231. Разработка измельчителя для биопрепаратов / Давыдкин И.Ю., Давыдкин В.Ю., Давыдкин Ю.П. и др. // Медицинская промышленность и биотехнология. Наука-производство-маркетинг. 1992. - Вып. 7. - С. 11- 33.

232. Рахимова Н.Г. Разработка комплексного бактерийного препарата бификола и его эффективность при кишечных расстройствах, связанных с дисбактериозом: Автореф. дис. канд. биол. наук. 1977. -М. - 16 с.

233. Репринцева С.М., Федорович Н.В. Новые методы термообработки и сушки химико-фармацевтических препаратов. Минск: Наука и техника, 1979.-248 с.

234. Розенцвейг П.Э., Сандер Ю.К. Технология лекарств и галеновых препаратов. Д.: Медицина, 1967. - 772 с.

235. Рокасуева JI.A. Атопический дерматит у детей: комплексная терапия с использованием ацидофильного лактобактерина: Автореф. дис. канд. мед. наук.-М.- 1996.- 16 с.

236. Рощупкин В.И., Лукашевич К.К., Самусевич Н.Т. Бификол в комплексной терапии острой дизентерии // Сов. медицина. 1977. - № 5. - С. 60 - 66.

237. Савельева P.A. О бактерицидном действии натурального желудочного сока на туляремийный микроб // Ж. микробиол. 1956. - № 2. -С. 42 - 47.

238. Савицкая К.И., Воробьёв A.A., Русанова Е.В. и др. Роль неспорообразующих анаэробов в формировании микробного пейзажа содержимого толстой кишки у больных с воспалительными процессами различной локализации // Вестн. РАМН. 1996. - № 2. - С. 15-23.

239. Сайфуллин М.А., Зверева H.H. Энтеросгель в лечении острых кишечных инфекций у детей // IX Российский национальный конгресс "Человек и лекарство" 8-12 апреля в Москве М. - 2002. - С. 391.

240. Самарцев A.A., Астапович H.H., Новик Г.И. Особенности роста и образования внеклеточных протеиназ Bifidobacterium adolescentis 94-БИМ //Микробиология. 1997. - Т. 66, № 5. - С. 635 - 639.

241. Сапожникова B.C. Разработка и изучение свойств антистафилококкового и противостолбнячного иммуноглобулинов для внутривенного введения: Автореф. дис. канд.биол. наук. Л., 1990. - 20 с.

242. Семенихина В.Ф., Ганина В.И., Лешина B.C., Банникова A.A. Сухой молочный продукт "Бифацид" // Сб. науч. тр. ВНИМИ "Производство десертных молочных продуктов. 1986. - М. - С. 45 - 47.

243. Сенов П.Л. Фармацевтическая химия. М.: Медицина, 1978. - С. 132 -133.

244. Серебрянский Ю.Е., Афанасьев С.С., Алёшкин В.А. Проблемы цитокинотерапии инфекционных заболеваний. М. - 2000. - 106 с.

245. Скирда Г.И., Лаврушко B.C. Влияние молочного колибактерина на кишечную микрофлору детей, больных острой дизентерией Зонне // Труды Моск. НИИЭМ «Кишечные и воздушно-капельные инфекции». 1969. - М. -Т. XIII.-С. 281 - 282.

246. Смирнова Г.И. Аллергодерматозы у детей (особенности течения и тактика лечения): Автореф. дис. докт. мед. наук. М. - 1997. - 46 с.

247. Смирнов В.В., Резник С.Р., Выоницкая В.А. и др. Современные представления о механизмах лечебно-профилактического действия пробиоти-ков из бактерий рода Bacillus // Микробиол. журнал. 1993. - Т. 55, № 4. - С. 92-112.

248. Смирнова Т.В., Шелекетина И.И., Чернякова В.И., Селезнёва С.И. О лечебном действии колибактерина // Врачебное дело. 1982. - № 11. — С. 68 -71.

249. Сорокулова И.Б. Перспективы применения бактерий рода Bacillus для конструирования биопрепаратов // Антибиотики и химиотерапия. 1996. - Т. 41, № 10.-С. 13 - 15.

250. Сорокулова И.Б. Сравнительное изучение биологических свойств биоспорина и других коммерческих препаратов па основе бацилл //Микробиол. журнал. 1997. - Т. 35, № 6. - С. 43 - 49.

251. Сорокулова И.Б. Влияние пробиотиков из бацилл на функциональную активность макрофагов // Антибиотики и химиотерапия-1998. Т. 44, №2. -С. 20 - 23.

252. Сорокулова И.Б. Теоретическое обоснование и практика применения бактерий рода Bacillus для конструирования новых пробиотиков: Автореф. дис. докт. биол. наук. 1999. - Киев. - 37 с.

253. Способ обезвоживания КИП методом распылительного высушивания / Давыдкин В.Ю., Давыдкин И.Ю., Афанасьев С.С. и др. // Сб. матер, конф. «Пробиотические микроорганизмы современное состояние вопроса и перспективы использования». - М., 2002. - С. 67.

254. Способ получения тест-культуры / Давыдкин И.Ю., Давыдкин В.Ю., Алибеков К.Б., Давыдкин Ю.П., Егоров О.П. // Передовой производственный опыт в медицинской промышленности, рекомендуемый для внедрения. -1991.-Вып. 11 12.-С. 6- 10.

255. Стасилевич З.К. Экспериментальные сальмонеллезы и колиэнтериты у обезьян. Автореф. дисс. . канд. мед. наук. Сухуми, 1961. -22 с.

256. Стасилевич З.К., Кебу Т.И., Томасян A.B., Сахарова Т.В. Этиологическая структура шигеллезов у обезьян Адлерского питомника // Журн. микробиол. 1994.- Т.6. - С. 7 - 8.

257. Студеникин М.Я., Соколова Т.С. Аллергические болезни у детей. М. - 1986.-287 с.

258. Суворова К.Н. Атопический дерматит: иммунопатогенез и стратегия иммунотерапии // Рус. мед. журнал. Спец. выпуск "Дерматология". 1998. -№6.-С. 363 - 367.

259. Тамм А.О., Вия М.П., Микельсаар М.Э. и др. Метаболиты кишечной микрофлоры в диагностике дисбактериоза кишечника //Антибиотики и медицинская биотехнология. 1987. - № 3. - С. 191 - 195.

260. Тарасова Н.Б. К выбору штаммов лактобактерий для введения в препараты, нормализующие микрофлору кишечника // Тр. Моск. НИИЭМ «Кишечные и воздушно-капельные инфекции». 1969. - М. - С. 444 - 449.

261. Тарасова Н.Б. Опыт получения сухого лактобактерина // Тр. Моск. НИИЭМ «Кишечные и воздушно-капельные инфекции». 1969. - М. - Т. 13 -С. 450-456.

262. Трембовля С.И., Воротынцева Н.В., Курносова H.A. Применение биологического препарата бификола для долечивания детей реконвалесцептов дизентерии. Методические рекомендации. М. - 1977.- 6 с.

263. Технологическая инструкция к ТУ 9280-003-49947596-99 на производство биологически активной пищевой добавки «Биоангин». -Москва, 1999.-36 с.

264. Торопова Н.П., Синявская O.A., Градинаров A.M. Тяжёлые (инвалидизирующие) формы атопического дерматита у детей. Методы медико-социальной реабилитации // Рус. мед. журн. 1997. - 11. - С. 713 -720.

265. Трофимова И.Б., Мищурис Л.А., Гевондян B.C. и др. Новое в патогенезе и лечении атопического дерматита // Вестн. дерматол. и венерол. -2001.-№ 2.-С. 9- 13.

266. ТУ 9383-001-18756307-2003. Кипацид. Биологически активная добавка к пище. 11 с.

267. ТУ 9383-002-18756307-2000. Таблетки «СЕПТОФЕРОН». Биологически активная добавка к пище.- ОАО «Иммуно-Гем». 2000. - 11 с.

268. Тутова Э.Г., Куц П.С. Сушка продуктов микробиологического производства. М.: Агропромиздат,1987. - 303 с.

269. Ульямс В., Ульямс X. Физическая химия для биологов. М.: Мир, 1976.-600 с.

270. Ульянова И.Л. Влияние коррекции биоценоза влагалища на исходы хирургического лечения у больных с гиперпластическими процессами шейки матки: Автореф. дис. канд. мед. наук. М. - 1994. - 24 с.

271. Уорсинг А., Геффнер Дж. Методы обработки экспериментальных данных: Пер. с англ. // Под ред. A.C. Монина. М.: Иностранная литература, 1953. - 345 с.

272. Учайкин В.Ф., Новокшонова A.A., Соколова И.В., Корнюшин М.А. Современные подходы к лечению ОКИ у детей // Педиатрия. 1996. - № 3. -С. 49- 54.

273. Федосеев К.Г. Физические основы и аппаратура микробного синтеза биологически активных соединений. М.: Медицина, 1977. - 304 с.

274. Феклисова J1.B., Новокшонова В.А. Кишечная коли-инфекция у детей. Учебное пособие. М. - 1996. - 14 с.

275. Феклисова Л.В. Клинико-лабораторная характеристика кишечных и респираторных инфекций у детей: Автореф. дис. докт. мед. наук. М. - 1975. -29 с.

276. Феклисова Л.В., Мескина Е.Р., Галкина Л.А. и др. Применение комбинированных иммунобиологических препаратов для лечения инфекционных болезней у детей // Новые лекарственные препараты 2003. -Вып.4. - С. 43 - 52.

277. Феклисова Л.В., Ганина В.И., Иноземцева В.Ф. и др. Новый микробный препарат бифацид при лечении детей, больных ОКИ // Российский вестник перинатологии и педиатрии. 1996. - № 4. - С. 18 - 22.

278. Феклисова Л.В., Мескина Е.Р., Покатилова А.И. и др. Новые комбинированные иммунобиологические препараты в лечении вирусно-бакгериальных инфекций у детей. Пособие для врачей. М. - 2002. - 16 с.

279. Феклисова JI.В., Новокшонова В. А., Галкина Л.А. и др. Иммуноглобулины человека в лечении вирусно-бактериальных инфекций у детей. Пособие для врачей. Москва. - 1999. - 15 с.

280. Феклисова Л.В., Ганина В.И., Иноземцева В.Ф. и др. Новый микробный препарат Бифацид в лечении детей, больных острыми кишечными инфекциями // Рос. вестн. перинаталогии и педиатрии. — 1996. Т. 41, № 4. -С. 18-21.

281. Феклисова Л.В., Королёва Н.С., Бавина H.A. и др. Новый биологический препарат аципол для лечения и оздоровления детей. Учебное пособие. М. - 1996. - 12 с.

282. ФСП 42-0194695305. Иммуноглобулиновый комплексный препарат (КИП), лиофилизат для приготовления раствора для приема внутрь. ЗАО «Иммуно-Гем» - 2006. - 19 с.

283. Фукс H.A. Механика аэрозолей. М.: Изд-во АН СССР, 1955. - 352 с.

284. Хавкин А.И., Жихарева Н.С. Опыт применения сорбентов у детей с функциональными нарушениями желудочно-кишечного тракта // IX Российский национальный конгресс "Человек и лекарство" 8-12 апреля в Москве М. - 2002. - С. 479 - 480.

285. Халенева М.П. Эффективность разных способов накопления и обезвоживания биомассы в производстве таблетированного бифидумбактерина: Дис.канд. биол. наук. -М., 1984.-204 с.

286. Ханина Г.И. Бактерийные препараты в неампулированных формах и изыскание способов их защиты от разрушающих воздействий: Дис.канд. биол. наук: 03.00.07. М., 1980. - 236 с.

287. Холчев Н.В. Препараты нормальных и специфических иммуноглобулинов человека // Сб. тр. «Очистка и стандартизация препаратов крови человека». М. - 1980. - С. 3 - 14.

288. Хронические и рецидивирующие заболевания носоглотки хламидийной этиологии у детей / В.А. Алешкин, Н.В. Лобачев, С.С. Афанасьев и др. // Проблемы инфекционных болезней. М., 2000. - Ч. 2. - С. 113-116.

289. Чахкиев P.O. Роль клеточного и гуморального иммунитета в патогенезе красного плоского лишая: Автореф. дис. канд. мед. наук. Киев. -1980.- 16 с.

290. Шендеров Б.А. Нормальная микрофлора и её роль в поддержании здоровья человека // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. 1998. - Том VIII. - С. 61 - 65.

291. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. / Том I: Микрофлора человека и животных и её функции. М., "Грант". - 1998.-288 с.

292. Шендеров БА. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Том 3: Пробиотики и функциональное питание. М.:ГРАНТЪ, 2001. -288 с.

293. Шерман Ф. Эмульсии. JL: Химия, 1972. - 448 с.

294. Щербаков И.Т. Патоморфология слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта при острых бактериальных, вирусных кишечных инфекциях и хронических колитах: Дис. докт. мед. наук. М. - 1996. - 240 с.

295. Щербаков И.Т., Гаврилов А.Ф., Грачёва Н.М. и др. Влияние лактосодержащих бактерийных биологических препаратов на процессы репарации в слизистой оболочке толстой кишки // Сб. науч. тр. МНИИЭМ «Иммунобиологические препараты». 1989. - М. - С. 157 - 161.

296. Шебекова В.М., Феклисова JI.B., Целипанова Е.Е. и др. Противодифтерийный иммуноглобулиновый препарат человека в лечении больных дифтерией // Материалы VIII съезда педиатров России. — М. — 1998. — С. 176.

297. Эльпинер И.Е. Ультразвук. Физико-химическое и биологическое действие. М.: Физматгиз, 1963. - 420 с.

298. Эткинс П. Физическая химия. М.: Мир, 1980. - Т.1 - 557 с.

299. Ярных B.C. Применение аэрозолей в ветеринарии.- М.: Сельхозиздат, 1962. 240 с.

300. A hyperefficient process for enzymatic cellulose hydrolysis in the intensiv mass transfer reactor / Sinitsyn A.P., Gusakov A.V., Davydkin I.Yu., Davydkin V.Yu., Protas O.V. // Biotechnol. Letters. 1993. - V. 15, № 3. - P. 283 - 288.

301. Akao Т., Che G.M., Kobashi K. et al. Isolation of a human intestinal anaerobe Bifidobacterium sp. strain SEN, capable of hydrolyzing sennosides to sennidins // Appl.- Environ.-Microbiol. 1994. - V. 60, № 3. - P. 1041 - 1043.

302. Annuk H., Schepetova J., Kullisaar T. Characterization of intestinal lactobacilli as putative probiotic candidates // J. of Appl. Microbiol. 2003. -Vol.94.-P. 403 -412.

303. Antheunisse J., de Bruin-Tol J.W., van der Polvan Solst M. E. Survival of microorganisms after drying and storage // Ant. van Leuw. J. Serol. Microbiol. -1981. Vol.47, №6. - P. 539 - 545.

304. Ballow M. Mechanisms of action of intravenous immunoglobulin: clinical implications in autoimmune and inflammatory diseases // Intravenous immunoglobulin: research and therapy. Bath.- UK.- 1996.- P. 123 128.

305. Barandun S., Kistler P., Jenet F., Isliker H. Intravenous administration of human y-globulin // Vox sanguinis. 1962. - V.7, № 2 .- P. 157 - 174.

306. Barandun S., Isliker H. Development of immunoglobulin preparations for intravenous use // Vox sanguinis. 1986. - V. 51. - P. 157 - 160.

307. Bengmark S. Ecological control of the gastrointestinal tract. The role of probiotic flora // Gut. 1998. - V. 42. - P. 2 - 7.

308. Berkman S.A., Lee M.L., Gale R.P. Clinical uses of intravenous immunoglobulins // Annals of internal medicine. 1990. - V. 112, № 4. - P. 278 -292.

309. Bougie D., Reland N., Lebeurrier F., Arhan P. Effect of propionibacteria supplementation on fecal bifidobacteria and segmental colonic transit time in healtly human subjects // Scand. J. Gastroenterol. 1999. - V. 34, № 2. - P. 144 -148.

310. Cauci S., Driussi S., Monte R. et al. Immunoglobulin A response against Gardnerella vaginalis hemolysin and salidase activity in bacterial vaginosis // Am. J. Obstet. Gynaecol.- 1998.-V. 178, № 3. P. 511 -515.

311. Cisalpino E.O., Pereira L.H., De Carvalho A.C.T. Rotavirus in Callithrix Geoffroyi (Humbolt, 1812) // A primatologia no Brasil. 1991. - Vol.3.- P. Ill -117.

312. Cooper R.R. Immunologic aspects of atopic dermatitis // Current Concepts in Skin Disorders. 1986. - № 4. - P. 10 - 23.

313. De Roos N.M., Katan M.B. Effects of probiotic bacteria on diarrhea, lipid metabolism and carcinogenesis: a review of papers published between 1988 and 1998 // Am. J. Clin. Nutr. 2000. - Vol.71, №2. - P. 405 - 410.

314. De Simone C., Famularo G., Harp J. et al. Effect of Lactobacilli on Cryptosporidium parvum infection in man and animals // Microecol. Therapy. — 1995.-V. 25.-P. 23-31.

315. Decker R. Diagnostik and therapie genitaler infectionen wahrend kindheit, pubertat and adoleszenz // Gynaekol. 1983. -Bd. 16, № 1. - S. 56 - 60.

316. Delire M. Immunoglobulins. Rationale for the clinical use of polyvalent intravenous immunoglobulins. Petersfield.- UK. - 1995. - 88 p.

317. Dzhikidze E.K., Stasilevich Z.K., Krylova R.I. Spontaneous bacterial and viral infections in non-human primates // Baltic J. Lab. Anim. Sci. 1999. - Vol.9. -P. 98- 112.

318. Eichhorn W., Czerny C.-P. Enteric coronaviruses in primates // Zentralbl. Veterinarmed. B. 1988. - Vol.35. - P. 709 - 712.

319. Eugster A.K., Kalter S.S., Kim C.S., Pinkerton M.E. Isolation of adenoviruses from the baboons (Papio sp.) with respiratory and enteric infection // Arch. Gesamte Virusforsch. 1969. - Vol. 26. - P. 260 - 270.

320. Fang H., Elina T., Heikki A., Seppo S. Modulation of humoral immune response through probiotic intake // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2000. -Vol. 29, №1,- P. 47 -52.

321. Fuller R. Probiotics in man and animals // J. Appl. Bacteriol. 1989. - №66. -P. 365 - 378.

322. Fuller R. Probiotics in human medicine // Gut. 1991. - Vol.32, №4. - P. 439 - 442.

323. Fuller R., Gibson G.R. Probiotics and prebiotics: microflora management for improved gut health // Clin. Microbiol. Infect. 1998. - №4. - P. 477 - 480.

324. Gall L.S. Normal fecal flora of man // Amer. J. Clin. Nutr. 1970. - V. 23, № 11. - P. 1457- 1465.

325. Goerg K.J., Schlorer E. Probiotic therapy of pseudomembranous colitis. Combination of intestinal lavage and oral administration of Escherichia coli // Dtsch. Med. Wochenschr. 1998. - V. 123, № 43. - S. 1274 - 1278.

326. Haenel H. Human normal and abnormal gastrointestinal flora // Amer. J. Clin. Nutr.-1970.-V. 23, № 11.-P. 1433 1439.

327. Hanifin J.M., Chan S.C. Diagnosis and treatment of atopic dermatitis // Dermatol. Ther. 1996. - № 1. - P. 9 - 18.

328. Hill M.J. Metabolism of carbohyrates and glycosides // Microbial Metabolism in the Digestive Tract. / ed. Hill M.J. Acad. Press N.-Y. - 1986. - P. 31-40.

329. Hirayama K., Rafter J. The role of probiotic bacteria in cancer prevention // Microb. Infect. 2000. - V. 2, № 6. - P. 681 - 686.

330. Homoe P., Prag J., Olsen C.B., Farholt S. Nasopharyngeal bacteria found on blood agar plates from healthy children in Greenland // Int. J. Circumpolar. Health.- 1998. Vol. 57, № 1. - P. 32 - 39.

331. Holzapfel W.H., Haberer P., Geisen R. et al. Taxonomy and important features of probiotic microorganisms in food and nutrition // Am. J. of Clin. Nutr. -2001. Vol.73. -P. 3655 - 3735.

332. Holzapfel W.H., Haberer P., Snel J. et al. Overview of gut flora and probiotics//Int. J. of Food Microbiol. 1998. - Vol.41. - P. 85 - 101.

333. International symposium on Atopic Dermatitis (6th) and European immunodermatology Society meeting (7th) (7-9 June, 1996). Aarbus, Dehmark.

334. Kailasapathy K.A., Chin J. Survival and therapeutic potential of probiotic organisms with reference to Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp. // Immunol. Cell. Biol. 2000. - Vol.78. - P. 80 - 88.

335. Kawai V., Konishi H., Horitsu H.H. et al. Purification and characterization of D-xylose isomerase from Bifidobacterium adolescentis // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1994. - V. 58, № 4. - P. 691 - 694.

336. Khedkar J.N., Sannabhadti S.S., Dave J.M. Inhibitory effect of Bifidobacterium adolescentis (Hbl) on faecal coliform count // J. of Dair. Foods and Home Sciences. 1994.-V. 13, № 03/04.-P. 187- 191.

337. Kiss T., Gratwohl A., Frei R. et al. Bacillus subtilis infections // Schweiz. Rundsch. Med. Prax. 1988. - № 77. - P. 1219 - 1223.

338. Larsen B., Galask R.P. Vaginal microbial flora : composition and influences of host physiology // Ann. Intern. Med. 1982. - V. 96, № 8. - P. 926 -930.

339. Lee A., Neglected N. The microbial ecology of the gastrointestinal tract // Adv. Microbiol. Ecol.- 1985. V. 8.-P. 115 - 162.

340. Lee S.K, Kim V.B., Ji G.E. Note: purification of amylase secreted from Bifidobacterium adolescentis // J. Appl. Microbiol. 1997. - V. 83, № 3. - P. 267 -272.

341. Lilly D.M., Stillwell R.H. Probiotics: growth promoting factors produced by microorganisms // Science. 1965. - Vol.147, №3659. - P. 747 - 748.

342. Liotet S., Catalan F., Franck M. Immunisation anti-Chlamydia apres stimulation du systcme de defense immunitaire des muqueuses par voie orale ches l'animal // Bull. Acad. vet. Fr. 1993. - Vol. 66, № 1. - P. 63 - 70.

343. Luckey T.D. Introduction to the ecology of the intestinal flora // Amer. J. Clin. Nutr. 1970,-V. 23, № 11.-P. 1430- 1432.

344. Luckey T.D. Overview of gastrointestinal microecology // Die Nahrung-1987. V. 31, № 5-6. - P. 359 - 364.

345. McClure H.M., Strozier L.M., Keeling M.E. Enteropathogenic Escherichia coli infection in anthropoid apes // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1972. -Vol. 161. -№6. - P. 687 - 689.

346. Moore W.E., Holdeman L.V., Cato E.P. et al. Variation in periodontal floras // Infect. Immunol. 1984. - V. 46. - P. 720 - 726.

347. Moore W.E., Holdeman L.V., Smibert R.M. et al. Bacteriology of severe periodontitis in young adult humans // Infect. Immunol. 1982. - V. 38. - P. 1137 -1148.

348. Moore W.E., Holdeman L.V., Smibert R.M. et al. Bacteriology of experimental gingivitis in children // Infect. Immunol. 1984. - V. 46. - P. 1 - 6.

349. Monk G.W., McCaffrey P.A., Davies M.S. Studies on the mechanism of sorbed water killing of bacteria // J. Bacteriol. 1957. - V.73. - P. 661 - 672.

350. Mukai T., Toba T., Ohori H. Collagen binding of Bifidobacterium adolescentis // Curr.-Microbiol. 1997. -V. 34, № 5. - P. 326 - 331.

351. Novik G.I., Astapovich N.I., Riabaia N.E., Bogdan A.S. Biological activity of the protein-polysaccharide complex secreted by Bifidobacterium adolescentis // Microbiologiia. 1997. - V. 66, № 5. - P. 628 - 634.

352. Nissle A. Uber die Grundlagen einer neuen ursachlichen Bekämpfung der patologischen Darmflora // Dtsch. Med. Wochenschr. 1916. - № 42. - S. 1181 -1184.

353. Nissle A. Die antagonistische Behanlung chronischer Darmstorungen mit Colibacterien // Med. Klinik. 1918. - V. 2, № 14. - S. 29 - 30.

354. Oggioni M.R., Pozzi G., Vaiensin P.E. Recurrent Septicemia in an Immunocompromised Patient Due to Probiotic Strains of Bacillus subtilis // J. Clin. Microbiol. 1998.-Vol. 36.-№ i.p. 325 -327.

355. Onderdonk A.B. Wissemann K.W. Normal vaginal microflora // In: "Vulvovaginitis".-N-Y-Basel-Hong Kong. 1993. - P. 285 - 303.

356. Onions A., Smith D. Current status of culture preservation and technology // Brobl. Cult. Collect. Symp. Osaka, 1984. - P. 41 - 47.

357. Pathology of Simian Primates / An edit.: R.N.T-W-Fiennes-London. 1972. -VI.-929 p.

358. Plein K., Holtz J. Therapeutic effects of Saccharomyces boulardii on mild residual symptoms in a stable phase of Cron's disease with special respect to chronic diarrhea- a pilot study // Z. Gastroenterol. 1993. - V. 31, № 2. - S. 129 -134.

359. Richard V., Van der Auwera P., Snoeck R. et al. Nosocomial bacteremia caused by Bacillus species // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1988. - № 7. - P. 783 -785.

360. Roberfroid M.B. Prebiotics and probiotics: are they functional foods? // Am. J. Clin. Nutr. 2000. - Vol.71,№6. - Suppl. - P. 1682 - 1687.

361. Romond M.B., Chadli N., Mitsuoka T., Romond C. Host-intestinal microflora interactions: role of mucus and gynolactose // Bifidobacteria and Microflora. 1990. - V. 9, № 2. - P. 119 - 130.

362. Rosebury T. Experimental air-born Infection. Baltimore, 1947.

363. Saarela M., Lahteenmaki L., Critterden R. et. al. Gut bacteria and health foods the European perspective // Int. J. of Food Microbiol. - 2002. - Vol.78. - P. 99-117.

364. Sampson H.A., Jolic P.L. Increased plasma histamine concentration after food challenges in children with atopic dermatitis // Engl. J. Med. 1984. - V. 311. -P. 372 - 376.

365. Sampson H.A., Jolic P.L. Increased plasma histamine concentration after food challenges in children with atopic dermatitis // Engl. J. Med. 1984. - V. 311. -P. 372- 376.

366. Sanders M.E. Overview of functional foods: emphasis on probiotic bacteria //Int. Dairy J. 1998.-Vol.8, №5/6.-P. 341 -347.

367. Savage D.C. Microbial ecology of the gastrointestinal tract // Ann. Rev. Microbiol. 1977.-V. 31.-P. 107 - 133.

368. Schwartz R.S. Overview of biochemistry and safety of a new native intravenous gamma globulin, IGIV, pH 4.25 // Amer. J. Medicine. 1987. - V. 83. -Suppl. 4A. - P. 46 - 51.

369. Simon G.L., Gorbach S.L. Intestinal microflora // Med. Clin. North. Amer.- 1982. V. 66.-P. 567-574.

370. Staffar K. H., Jahn J., Claussen N. Flowavility of Powders under the influence of vibrations // Pouder Mettalurgy International. 1977. - V.9. - P. 20 -23.

371. Strickland R.G. Gastritis // Springer sem. Immunopathol. 1990. - Bd.12. -H.2/3.-P. 203 -217.

372. Strus M. The significance of lactic acid bacteria in treatment and prophylaxis of digestive tract disorders // Postepy-Hig.-Med.-Dosw. 1997. - V. 51, №6.-P. 605 -619.

373. Stuker G., Oshiro L.S., Schmidt N.J. et al. Virus detection in monkeys with diarrhea: the association of adenoviruses with diarrhea and possible role of rotaviruses // Lab. Anim. Sci. 1979. - Vol.29. - P. 610 - 616.

374. Superantigens: Molecular biology, immunology and relevance to human disease. / Ed. By Leung Y.M., Huber B.T., Schlievert P.M.-Marcel Dekker, Inc. NY-Basel-Hong Kong. 1977.

375. Thestrup-Pedersen K. Environmental factors and atopic dermatitis- And who has the disease increased in incidence? // JEADV. 1997. -V. 9, Supp 1. - P. 16.

376. Thomas M., and Whittet H. Atypical meningitis complicating a penetrating head injury // J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 1991. - № 54. - P. 92 - 93.

377. Thomas J.P. A comparative Study of the viability of bacterial aerosols // Doct. diss, series Publ. Michigan. - 1955. - №13. - P. 49.

378. Velasco E., De Sousa Martins C.A., Tabak D., Bouzas L.F. Bacillus subtilis infection in a patient submitted to a bone marrow transplantation // Rev. Paul. Med. 1992. - № 110.-P. 116-117.

379. Veld J.H., Bosschaert M.A.R., Shortt C. Health aspects of probiotics // Food Sci. Technol. Today. 1998. - Vol.12, №1. -P.46 - 50.

380. Wallet F., Crunelle V., Roussel-Delvallez M. et al. Bacillus subtilis as a cause of cholangitis in polycystic kidney and liver disease // Am. J. Gastroenterol. -1996.-№91.-P. 1477- 1478.

381. ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ «МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ ИМ. Г.Н.ГАБРИЧЕВСКОГО» ФЕДЕРАЛЬНОЙ СЛУЖБЫ ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА

382. ТЕХНОЛОГИЯ И КОНСТРУИРОВАНИЕ СУХИХ БИОПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ МИКРОКАПЕЛЬНЫХ1. ПОРОШКОВ052011504981. На правах рукописи1. ДАВЫДКИН ВАЛЕРИЙ ЮРЬЕВИЧ0301.06 Биотехнология

383. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

384. Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор С.С.Афанасьев1. МОСКВА-20111. ОГЛАВЛЕНИЕ1. ВВЕДЕНИЕ. 81. ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

385. ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ: ПРИМЕНЕНИЕ В ПРАКТИКЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И ТЕХНОЛОГИИ ПРИГОТОВЛЕНИЯ. 21

386. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

387. ГЛАВА 3. ФОРМИРОВАНИЕ МИКРОКАПЕЛЬНОГО ПОРОШКА. 84

388. Микрокапельный порошок как дисперсная система.84

389. Устройство для приготовления микрокапельных порошков 91

390. Обоснование требований к размерам микрокапель в порошке.94

391. ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ПЕРЕРАБОТКИ СИСТЕМЫ АЭРОСИЛ

392. СУСПЕНЗИЯ В ЭЛЕКТРОМАГНИТНОМ ДИСПЕР-ГАТОРЕ. 100

393. Обоснование показателей состояния системы аэросил-жидкость при получении микрокапельных порошков. 100

394. Изучение зависимости выживаемости микроорганизмов от режимных параметров процесса образования микрокапельных порошков в ЭМД. 105

395. ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА СОРБЦИОННО-КОНТАКТНОГО ОБЕЗВОЖИВАНИЯ МИКРОКАПЕЛЬНЫХ ПОРОШКОВ. 125

396. Сорбционно-контактное обезвоживание МП энтеральных микроорганизмов. 139

397. ГЛАВА 6. КОНСТРУИРОВАНИЕ КОМПЛЕКСНЫХ БИОПРЕПАРАТОВ. 146

398. Обоснование компонентного состава комплексного препарата КИП и В. adolescentis МС-42. 146

399. Приготовление сухого биопрепарата комплекса иммуноглобулинов и бифидобактерий. 148

400. ГЛАВА 7. ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАЩИТНЫХ СВОЙСТВ СТРУКТУРНОГО КОМПОНЕНТА ПРЕПАРАТА. 175

401. Оценка гигроскопичности сухого препарата, полученногоиз микрокапельного порошка. 175

402. Изучение in vitro защитного эффекта аэросила при моделировании воздействия неблагоприятных факторов пищеварительной системы. 177

403. Рентгенография прохождения капсулами верхних отделов желудочно-кишечного тракта обезьян. 185

404. ГЛАВА 8. ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ КОМПЛЕКСНОГО

405. ПРЕПАРАТА КИП И В. ADOLESCENTIS МС-42. 190

406. Оценка острой токсичности биопрепарата. 190

407. Изучение безвредности и терапевтической эффективности препарата КИП и В. adolescentis МС-42 на обезьянах. 1901. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. 2061. ВЫВОДЫ. 215

408. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ. 2171. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. 2191. СОКРАЩЕНИЯ

409. AJIT аланинаминотрансфераза ACT - аспартатаминотрансфераза АтД - атопический дерматит ББП - бактериальные биопрепараты ББФ - бифидумбактерин-форте

410. БЭТ изотермы сорбции Брунауэра, Эммета и Теллера

411. ГМ гидролизатно-молочная среда

412. ГФ XI государственная фармакопея XI издания

413. ЖКТ желудочно-кишечный тракт

414. ЗС защитная среда (среда высушивания)

415. ИГАРВ антиротавирусный иммуноглобулин1. ИФН-а интерферон-альфа

416. КД-5 казеиново-дрожжевая среда №5

417. КИП комплексный иммуноглобулиновый препарат1. КПД красный плоский лишай

418. КС концентрированная суспензия

419. КСО коэффициент сорбционного обезвоживания

420. JIT лактозо-тиомочевинная защитная среда1. МП микрокапельный порошок

421. ОКИ острая кишечная инфекция

422. ОНФО ороназофарингеальная область

423. ОРВИ — острая респираторная вирусная инфекция1. ПС питательная среда

424. ПЭГ полиэтиленгликоль (полиэтиленоксид)

425. РБ — рецидивирующий бронхит

426. РИД радиальная иммунодиффузия

427. РПГА — реакция пассивной гемагглютинации

428. СЖ сахарозо-желатиновая защитная среда

429. СЖМ сахарозо-желатино-молочная защитная среда1. ТГ тиогликолевая среда

430. УПМ условно-патогенные микроорганизмы

431. ФГК ферментативный гидролизат казеина1. ФМТ — ферромагнитные тела

432. ФСП фармакопейная статья предприятия

433. ХГП — хронический генерализованный пародонтиг

434. ХРАС хронический рецидивирующий афтозный стоматит

435. ЭМД электромагнитный диспергаториммуноглобулин

436. М, ^А иммуноглобулины классов в, М и А1. ВВЕДЕНИЕ1. Атуальность проблемы

437. Важное значение симбиотической микрофлоры для организма человека к настоящему времени общепризнанно и обосновано результатами многочисленных исследований 25, 107, 201, 226, 278, 316, 375, 376, 394, 396, 413, 415, 417, 429,433, 451, 458, 461.

438. На основе анализа и в эксперименте идентифицировать микрокапельный порошок как дисперсную систему, определить его основные свойства и требования к размерам микрокапель жидкости. Обосновать выбор устройства для приготовления микрокапельного порошка.

439. В экспериментах in vitro исследовать защитные свойства структурного компонента препарата наноразмерного разобщителя аэросила.

440. Теоретическое значение работы

441. С использованием разработанного метода сконструированы комплексные биопрепараты КИП и В. adolescentis МС-42, КИП и L. acidophilus (смесь штаммов NK1; ЮОаш и К3Ш24).

442. Внедрение результатов работы

443. На основании проведенных исследований оформлено 10 патентов на изобретения:

444. Пат. 2161887 RU, A23D 9/00. Биологическая активная добавка / В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, В.Ю. Давыдкин, О.В. Рубальский, И.Ю. Давыдкин,

445. Г.И. Ханина, А.Г. Гаврин, A.B. Алешкин, JI.A. Денисов, Д.С. Афанасьев, М.С. Афанасьев (RU). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.01.2001. Патентообладатель коллектив авторов.

446. Пат. 2247578 RU, А61К 39/395. Состав, обладающий-противомикробным действием / A.B. Мелихова, В.А. Алешкин, В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин, С.С. Афанасьев, И.В. Борисова, О.В. Рубальский,

447. A.Г. Гаврин (RU). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10.03.2005. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

448. Патент РФ № 2371200, МПК А61К 39/395. Способ получения иммуноглобулинового препарата / Мелихова A.B., Давыдкин В.Ю., Алешкин

449. B.А., Давыдкин И.Ю. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27.10.2009. Патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

450. Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20.04.2008. Патентообладатели ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, ГУ НИИ МП РАМН.

451. Разработан лабораторный регламент приготовления комплексного биопрепарата КИП и В. ас1о1езсепйз МС-42.

452. Основные положения, выносимые на защиту:

453. Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора 28 апреля 2009 г. протокол № 4.

454. Объем и структура диссертации

455. ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ: ПРИМЕНЕНИЕ В ПРАКТИКЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И1. ТЕХНОЛОГИИ ПРИГОТОВЛЕНИЯ

456. В нашей стране коррекцию дисбиотических нарушений проводят, как правило, назначением иммунобиологических препаратов с учетом особенностей возбудителя заболевания и иммунологического статуса организма.

457. Сферы применения иммунобиологических препаратов

458. У девочек при клинических проявлениях вульвовагинита, бактериального вагиноза и субкомпенсированного дисбиоза применение местной аппликации лактобактерина способствовало устойчивой стабилизации нормального уровня лактофлоры 157.

459. Результаты комплексной терапии инфекции урогенитального тракта с применением эубиотиков демонстрировали большую эффективность в плане реабилитации структуры и функции плацентарной ткани при хронической внутриматочной инфекции 35.

460. В группах больных с аналогичными формами заболеваний, получавших другой лактосодержащий пробиотик "Лактобактерин", получены несколько менее выраженные положительные результаты, чаще сохранялись дисбактериальные нарушения бактериоценоза.

461. Постоянство дисбиотических нарушений ОНФО и кишечника у детей с врождённой кранио-фациальной патологией определяет необходимость коррекционной бактериотерапии на разных этапах хирургического лечения 1, 196, 287, 373.

462. Опыт применения споровых биологических бактерийных препаратов при острых кишечных инфекциях у детей до настоящего времени невелик.

463. Состав и лекарственные формы биопрепаратов

464. Первый отечественный бифидосодержащий пробиотик

465. Вариант производственного штамма В. adolescentis МС-42 (В-1) входит в состав двухкомпонентного пробиотика «Бифацид», содержащего дополнительно штамм L. acidophilus и разработанного ВНИИ молочной промышленности 320, 364.

466. Отдельную группу составляют биопрепараты на основе живых культур микроорганизмов, не свойственных бактериоценозу человека апатогенных представителей рода Bacillus.

467. Анализ технологий приготовления сухих биопрепаратов

468. Основными физическими факторами, регулирующими интенсивность обмена веществ в живых клетках, являются температура и влажность.

469. При снижении температуры системы (криоанабиоз) подавляется активность ферментов, замедляется обмен веществ, развитие, рост, движение и т.д. 180.

470. Состояние ксероанабиоза достигается обезвоживанием различными способами, наибольшее распространение из которых получили сублимационное, распылительное и контактно-сорбционное высушивание.13.1.1. Получение сухих материалов методом распылительной сушки

471. В. М. Подольским получены положительные результаты распылительного высушивания кровезаменителей: низкомолекулярного поливинилпирролидона (гемодез), полиглюкина, гидролизата казеина, гидролизина, белкового кровезаменителя БК-8 282.

472. В ряде случаев распылительное высушивание биопрепаратов позволяет получать результаты, не уступающие сублимационному обезвоживанию.

473. Сохранение специфической активности биокомпонентов находится в прямой зависимости от температуры обезвоживания. Однако сушка жидких биоматериалов в слое при низких температурах и атмосферном давлении протекает крайне медленно.

474. Процесс сублимационной сушки включает три этапа: 1) замораживание материала; 2) сублимацию льда и удаление образующихся паров; 3) удаление связанной влаги при температуре выше 0°С (досушивание).

475. Сущность иммобилизации заключается в том, что биокомпонент прикрепляется к поверхности сорбента или проникает в его структуру (капилляры, поры). При использовании пористых сорбентов (активные угли, силикагели и др.) реализуются оба варианта.

476. Вакуумную или сублимационную сушку используют для обезвоживания иммобилизованной глюконатом кальция биомассы штамма В. subtilis ЗН при получении таблетированной формы препарата-пробиотика 231.

477. Таблетки дозированная лекарственная форма, получаемая прессованием лекарственных или смеси лекарственных и вспомогательных веществ, предназначенная для внутреннего, наружного, сублингвального, имплантационного или парентерального применения 80.

478. При приготовлении колибактерина в капсулах сухую культуру размельчали, т.е. получали порошок, и заполняли им твердые желатиновые капсулы 293.

479. Исходя из изложенного, разработку технологии получения сухих биопрепаратов, отличающейся универсальностью в плане возможности переработки биологических субстанций различной природы, следует считать актуальной.

480. Предпосылкой успешного решения такой задачи может явиться подход к конструированию препаратов на основе использования микрокапельного состояния биокомпонентов.

481. ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ21. Материалы21.1. Микроорганизмы

482. В качестве модельного микроорганизма использовали облигатные аэробные бактериии Serratia marcescens. Штамм S. marcescens ВКМ-851 был получен из Всесоюзной коллекции микроорганизмов (Пущино).

483. В исследованиях использовали также:

484. Entherococcus (Str.) faecium ГНКИ-27 биокомпонент некоторых пробиотических препаратов (коллекция НИИ прикладной микробиологии, Оболенск);

485. Escherihia coli М-17 биокомпонент пробиотического препарата Колибактерин (коллекция НИИ особо чистых биопрепаратов, г. Санкт-Петербург);

486. Работы с S. marcescens, Е. faecium и Е. coli проводились на базе ВНИИ прикладной биохимии. Исследования с использованием В. adolescentis и L. acidophilus в МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского.21.2. Питательные и защитные среды

487. Для глубинного выращивания S. marcescens применяли питательную среду (ПС) на основе гидролизата рыбо-костной муки (РКМ) состава: КН2Р04 0,8 гхл"1,

488. MgS04x7H20 0,12 гхл"1, FeS04x7H20 - 0,08 гхл"1, глицерин - 8,0 млхл"1, вода дистиллированная - до 1,0 л. Содержание аминого азота - от 160 до 320 мг%. рН среды до стерилизации - 7,0±0,2.

489. Перед инокулированием питательной среды клетками микроорганизмов в нее вносили глюкозу в количестве 0,8% объемных.

490. Клетки Е. coli выращивали в среде на основе казеинового гидролизата (МРТУ-42) с 230-250 мг% аминного азота, рН 7,0-7,5 и с 0,1-0,4% хлорида натрия с добавкой 0,5-0,6% пептона и 3,5-4,0% агара.

491. Накопление клеток L. acidophilus проводили в гидролизатно-молочной (ГМ) среде с аминным азотом 118-135 мг%, пептоном 0,5-1,0%, натрием хлористым 0,18-0,20% и триптофаном 34-43 мг%. рН среды 6,4-6,6.

492. Для остальных микроорганизмов лактозо-тиомочевинную защитную среду (ЗС) состава (% масс.): лактоза - 20,0, тиомочевина — 6,6, полиглюкин -1,5, аскорбиновая кислота - 3,6, вода дистиллированная - 68,3.

493. Для анализа иммуноглобулиновых фракций КИП использовали моноспецифические антисыворотки к иммуноглобулинам человека ^М и сыворотку крови человека с известным содержаниемиммуноглобулинов, антисыворотку ко всем белкам плазмы крови человека.

494. Оценку изменения специфической активности КИП проводили с помощью диагностикума эритроцитарного сальмонеллезного О-антигенного жидкого (комплексного).

495. Стабилизацию жидкости при получении микрокапельных порошков осуществляли гидрофобным аэросилом марки АМ-1-300 и Я 972.

496. В качестве основных влагоемких сорбентов использовали карбоксильный катионит КБ-4П-2 с рН водной вытяжки 10,0-11,0 и окись алюминия основную с рН водной вытяжки 8,0-9,0.

497. Для получения жидкого хладоагента с начальной температурой минус 18-22°С использовали смесь льда и хлорида натрия в соотношении 10:3 по массе.

498. В качестве модельной жидкости на первых этапах исследований процесса получения микрокапельных порошков использовали дистиллированную воду.

499. Перечень материалов и реактивов приведен ниже.

500. Наименование Норматив Примечание

501. Антисыворотки к ^С, Sigma for immunochem. res.и ^А

502. Антисыворока ко всем Sigma for immunochem. res.белкам

503. Диагностикум ФС 42-3408-97сальмонеллезный

504. Диагностикум ФС 42 3403-97шигеллезный

505. Агар ГОСТ 16280-89 Бактериологический

506. Гидролизат казеина ТУ 9385-002- Бактериологичекий00479327-98

507. Пептон ферментативный ГОСТ 13805-76 Б актериологическийсухой

508. Молоко сухое обезжирен- ГОСТ 10970-87 Массовая доля основногоное вещества 98 %

509. Масло иммерсионное ГОСТ 13739-78 Для микроскопии

510. Альбумин БС ТУ 09-10-342-75 Марки А

511. Аэросил АМ-1-300 ТУ-6-18-185-19

512. Аскорбиновая кислота ГФ X, ст. 6 Ч.д.а.

513. Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72

514. Глицерин ГОСТ 6259-75 Ч.д.а.

515. Глюкоза ГОСТ 975-88 Ч.д.а.1. Глицин ГОСТ 5860-75 Ч.1. КБ-4П-2 ГОСТ 20298-74

516. CysteinxHClxH20 D-6900 Heidelberg 1 für biochemischen

517. Лактоза ТУ 6-09-2293-79 Ч.д.а.

518. Сахароза ГОСТ 5833-75 Ч.д.а.

519. Полиглюкин (декстран) ГОСТ 6034-74

520. Тиомочевина ГОСТ 6344-73 Х.ч.1. AI 203 ТУ 6-09-426

521. CH3C00Nax3H20 ГОСТ 199-78 Х.ч.

522. С2Н5ОН ГОСТ 5262-67 Ректификат

523. FeS04x7H20 ГОСТ 4148-78 Х.ч.

524. H2S04 ГОСТ 14262-78 ОСЧ 11-151. HCl ГОСТ 3118-77 Х.ч.

525. HOC(CH2COOH)2COONH4 ГОСТ 7234-79 Ч.

526. K2HP04x3H20 ГОСТ 2493-75 Х.ч.

527. MgS04x7H20 ГОСТ 4523-77 Х.ч.

528. MnS04x5H20 ГОСТ 435-77 Х.ч.1. NaCl ГОСТ 4233-77 Х.ч1. NaOH ГОСТ 11078-78 Х.ч21.4. Экспериментальные животные

529. Испытания острой токсичности комплексного биопрепарата на основе КИП и бифидобактерий проведены на 50 беспородных белых мышах обоих полов на базе вивария МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского.

530. Использовано 5 здоровых и 29 больных острой кишечной инфекцией с диарейным синдромом обезьян 166.22. Методы исследований22.1. Культивирование микроорганизмов, концентрирование биомассы и введение защитных сред

531. Подготовку биомассы к обезвоживанию проводили смешением концентрированной биомассы соответствующих микроорганизмов с соответствующей защитной средой в массовом соотношении 2:1.

532. Биомассу В. adolescentis МС-42 и смесь трех штаммов L. acidophilus получали из лаборатории биологии бифидобактерий МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского (рук. д.б.н. A.M. Амерханова).22.2. Микробиологические методы

533. Ресусиендирование проб биоматериалов осуществляли с использованием программируемого ротационного шуттель-аппарата МиШ ЯБ-бО не менее 301. МИН.

534. БК = Ых 10 х V/ Р, где БК- биологическая концентрация клеток в материале, КОЕ/г, КОЕ/мл;

535. И- среднее арифметическое числа колоний в пробирках;п степень последнего разведения;

536. V- объем разводящей жидкости, мл;

537. Р навеска сухого (г) или объем жидкого (мл) материала.

538. БК = Ых10п+1хУ/Р, где БК- биологическая концентрация ¡слеток в материале, КОЕ/г, КОЕ/мл;

539. И- среднее арифметическое числа колоний на чашках;п — степень разведения;

540. V- объем разводящей жидкости, мл;

541. Р навеска сухого (г) или объем жидкого (мл) материала.

542. Доверительный интервал концентрации клеток в материалах определялся с вероятностью 95 % по формуле1.5/N = 2 /Т 0,5,где Т- общее количество колоний во всех пробирках или на всех чашках в данном разведении.

543. Жизнеспособность микроорганизмов после воздействия различных факторов оценивали по их выживаемости.

544. Выживаемость клеток в процессе получения микрокапельных порошков (В{) рассчитывали по формуле

545. В, = БКмпх (.1+ у)х 100/БКбс, где БКЛШ концентрация клеток в МП, КОЕ/г;

546. БКбс концентрация живых клеток в биосуспензии, КОЕ/мл; отношение массы аэросила к массе биосуспензии в МП.

547. Выживаемость микроорганизмов при обезвоживании МП до промежуточной влажности или в отделенном рассевом сухом порошке (В2) определяли по выражению

548. Выживаемость микроорганизмов при приготовлении сухого препарата сорбционным обезвоживанием (Вз) рассчитывали по формуле

549. Вз = БКпхМпх 100 / БКмпх Ммп, где БКп концентрация клеток в сухом препарате, КОЕ/г;

550. Мп масса сухого препарата, г;

551. Млт масса МП, взятого для приготовления сухого препарата, г.

552. Выживаемость микроорганизмов в процессе хранения материалов (В4) определяли по отношению концентрации живых клеток в хранившихся материалах к таковой в свежеприготовленных.22.3. Иммунохимические методы

553. Преципитацию в геле по Оухтерлони проводили в соответствии с 133. в 1 % агаре, используя при этом моноспецифические антисыворотки к ^О, ^А, ^М человека.

554. Определение антисальмонеллезной активности осуществляли методом РПГА с помощью соответствующих диагностикумов согласно инструкциям производителя в соответствии с 303.

555. Концентрацию белка в образцах определяли спектрофотометрически на СФ-46 или КФК-3-01 56. Для этого измеряли оптическую плотность исследуемого белкового раствора при 280 и 260 нм. Затем рассчитывали концентрацию белка по формуле Калькара:

556. С = 1,45 х ОД280 0,74 х ОД260 , где С - концентрация белка, мг/мл;

557. ОД280 показатель оптической плотности раствора при 280 нм;

558. ОД260 показатель оптической плотности раствора при 260 нм.

559. С = 8Х(А./А2), где С концентрация общих липидов, г/л;

560. А1 оптическая плотность пробы;

561. А2 оптическая плотность стандарта.22.4. Физико-химические методы

562. Физико-химические характеристики жидкостей определяли в соответствии с рекомендациями 31.

563. Вязкость растворов и биосуспензий определяли, используя стеклянные капиллярные вискозиметры типа ВПЖ, по методике изготовителя. Величину вязкости рассчитывали по известной формуле, с учетом приведенной в паспорте постоянной вискозиметра.

564. Плотность жидкостей измеряли с помощью набора стеклянных ареометров.

565. Поверхностное натяжение жидкостей определяли методом отрыва кольца.22.5. Физические методы

566. Относительную и остаточную влажности различных материалов определяли гравиметрически, выдерживанием навесок в сухо-жаровом шкафу при 105°С до постоянной массы.

567. Реологические характеристики порошков (насыпная и утрясочная плотность, угол естественного откоса, текучесть и т.д.) определяли в соответствии с рекомендациями 129.

568. Разделение сухих препаратов на компоненты (сорбент и биокомпонент) проводили на вибростенде Laborette-20 Fritch или вибросите Vipo с использованием мини сита с размером ячеек 100 мкм.

569. Относительную влажность воздуха в помещениях измеряли гигрометром М-19.

570. Дезинфекционную обработку бокса после проведения работ осуществляли аэрозолями 1% хлорамина или 3% перекиси водорода с 0,5% моющего средства с экспозицией не менее 1 часа.

571. Фасовку сухих биопрепаратов в твердые желатиновые капсулы осуществляли в фармацевтической машине МС-2 Туре 1 Регт по инструкции изготовителя.

572. Методы получения микрокапельных порошков и их сорбционно-контактного обезвоживания подробно описаны в соответствующих разделах работы.

573. Некоторые частные методические приемы приведены в дальнейшем изложении при описании экспериментов.22.6. Планирование эксперимента и статистическая обработка результатов

574. При обработке экспериментальных данных использовали следующие статистические методы.

575. Результаты 3-5 определений экспериментальной величины представляли средней арифметической с доверительным интервалом, рассчитанным для вероятности 95%.

576. При сравнении совокупностей с количественными данными использовали также:- метод попарного сравнения сопряженных вариант;- корреляционный анализ;-дисперсионный анализ одно- и двухфакторных комплексов 27, 28, 165,353.

577. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ГЛАВА 3. ФОРМИРОВАНИЕ МИКРОКАПЕЛЬНОГО ПОРОШКА

578. Микрокапельный порошок как дисперсная система

579. В табл. 1 приведены условно принятые границы размеров частиц систем с различной раздробленностью вещества 72, 100.

Информация о работе

Давыдкин, Валерий Юрьевич
доктора биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

Технология и конструирование сухих биопрепаратов на основе микрокапельных порошков - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы