Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Биологическое обоснование создания биопрепаратов, эффективных в отношении фузариозных заболеваний сельскохозяйственных культур

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Биологическое обоснование создания биопрепаратов, эффективных в отношении фузариозных заболеваний сельскохозяйственных культур"

На правах рукописи

КАЛЬКО

Галина Валентиновна

БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ СОЗДАНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ, ЭФФЕКТИВНЫХ В ОТНОШЕНИИ ФУЗАРИОЗНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ КУЛЬТУР

Специальность: 06.01.11 - Защита растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1996

Диссертационная работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте заадаты растений (г. Санкт-Петербург)

Научный руководитель - кандидат биологических наук

В. А. Павжшн.

Официальные оппоненты ~ доктор сельскохозяйственных наук,

Ведущая организация - Санкт-Петербургский Государственный

в т£_ часов на заседании Диссертационного совета Д.020.01.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты растений по адресу:

189620, г. Санкт-Петербург-Пушкин, шоссе Подбельского, д.с

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийског научно-исследовательском институте защиты растений

профессор В.В.Котова кандидат биологических наук Г.Н.Маршунова

аграрный университет

Зашита диссертации состоится

С'О

Автореферат разослан "//'

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г.А. Наседкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Борьба с болезнями, вызываемыми грибами рода Fusarium является весьма актуальной. Фузариозные грибы широко распространены в природе и поражают подавляющее большинство с/'х культур. Борьба с фузариозными заболеваниями затруднена высокой адаптивностью возбудителей, что обусловлено наличием у них лабильного и гетерогенного генетического аппарата (Левитин, 1983), высокой метаболитной активностью, способностью существовать в сапрофитной и паразитной формах и использовать разнообразные органические соединения в качестве источников питания (Билай, 1978).

В связи с широкой распространенностью и в России, и за рубежом фузариозов овощных и зерновых культур (Пересыпкин, 1989; Ouf eta£,, 1981а,б; Гринберг и др., 1979; Шипилова и др., 1985,

Егураздова, 1986; Kukedy, 1977; Pasti, 1977; Zwatz, 1987; Tomasovic, 1987; Wilcoxson etat, 1988; Hani, 1980 и др.) и высокой вредоносностью этих болезней, особенно фузариоза колоса зерновых, а также недостаточной эффективностью существующих средств борьбы с фузариозами, крайне актуально создание новых эффективных и экологически безопасных средств борьбы с этими болезнями. Наиболее перспективным представляется развитие агротехнических (Summereil étal., 1988; Heich, Hamilton, 1985) и биологических мер борьбы с фузариозами (Omoifo, Ikotum, 1987; Baker, 1987; и др.).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось обоснование возможности создания эффективных и экологически безопасных микробиологических средств борьбы с фузариозными заболеваниями растений.

В процессе работы были решены следующие задачи:

- Отобраны штаммы микробов-антагонистов, эффективных в отношении ряда фузариозных грибов (11 штаммов, принадлежащих к 5 видам);

- Предложен новый метод оценки чувствительности фитопато-генных грибов в отношении микробов-антагонистов в течение различных стадий жизненного цикла in vitro;

- Изучены физиолого-биохимические особенности и антагонистическая активность двух перспективных штаммов микробов- антагонистов Bacillus subtIiis-10-ВИЗР и Streptomyces felle-us-8-ВИЗР, продуцентов новых биопрепаратов алирина Б и алирина

С, проведен анализ динамики их роста и развития на искусственных питательных средах, предложены временные лабораторные регламенты производства препаратов., разработаны количественные микробиологические методы определения активных метаболитов в образцах биопрепаратов, изучена биологическая активность различных препаративных форм.

- Оценена эффективность лабораторных образцов биопрепаратов алирина Б и алирина С в модельных лабораторных и вегетационных опытах на огурце с искусственным заражением семян F.oxysporum; оценено влияние биопрепаратов на развитие растений огурца и их пораженность корневыми гнилями в производственных тепличных опытах.

- Оценена эффективность алирина Б, алирина С, а также лабораторных образцов метаболитных биопрепаратов хризомала, глобе-рина и Г-9 против фузариоза колоса пшеницы, вызванного заражением колосьев штаммами F.graminearum и F.sporotrichiella в мелкоделяночных полевых опытах в течение 3-х лет.

Научная новизна данной работы заключается в том, что

- была предложена схема многоступенчатого скрининга штаммов-антагонистов фузариозных грибов in vitro и in vivo, подтвердившая свою эффективность;

- сформирована коллекция штаммов микробов-антагонистов, перспективных для создания новых биопрепаратов для борьбы с фузариозами (метаболитных - 12 штаммов, для интродукции в аг-робиоценозы - 2 штамма);

- предложен новый метод комплексной оценки чувствительности фитопатогенных грибов в отношении микробов-антагонистов в стадии конидий и в состоянии зрелого мицелия in vitro;

- выявлены некоторые элементы эколого-физиологических механизмов защитного действия штаммов-антагонистов и их метаболитов: фиторегуляторное влияние на растение и ингибирующая активность в отношении фитопатогенных грибов.

Практическая значимость. Данная работа выполнена в ходе реализации проекта ГНТП "Высокоэффективные процессы производства продовольствия" (подпроект "Биопестициды" - 0.12.02.2003М).

Результаты проведенных исследований рекомендованы для составления временных лабораторных регламентов получения биопрепаратов алирина Б и алирина С на основе B.subtilis-10-БИЗР и 3,felleus-8-BM3P. Представлены материалы по отработке оптимальной препаративной формы алирина Б и алирина С. Предложены

количественные микробиологическим методы контроля биологической активности этих препаратов.

Проведенные лабораторные и вегетационные испытания на искусственном инфекционном фоне, а также опыты в производственных условиях обосновывают возможность эффективного использования новых биопрепаратов алирина Б и алирина С против корневых гнилей огурца в условиях защищенного грунта. Результаты производственных опытов положены в основу технологии применения алирина Б и алирина С.

Новые метаболитные биопрепараты глоберин, хризомал и Г-9, а также смесь алирина Б и С показали обнадеживающие результаты, снижая пораженность растений пшеницы фузариозом колоса в мел-коделяночных полевых опытах с искусственным инфекционным фоном.

Таким образом, образцы биопрепаратов на основе отобранных штаммов-антагонистов показали высокую эффективность против фу-зариозных грибов ризосферы (возбудителей фузариозных гнилей огурца) и филлоплана растений (возбудителей фузариоза колоса пшеницы).

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на республиканской конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" (Кишинев, 1991), конференции "Интродукция микроорганизмов в окружающую среду" (Москва, 1994), Всероссийском научно-производственном совещании "Экологически безопасные и беспестицид-ные технологии получения растениеводческой продукции" (Краснодар, 1994), международной конференции "Biotechnology St.Petersburg' 94" (С.-Петербург, 1994) и Всероссийском съезде по защите растений "Защита растений в условиях реформирования агропромышленного комплекса: экономика, эффективность, экологич-носгь" (С.-Петербург, декабрь 1995 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на Л if страницах, состоит из введения, обзора литературы (1 глава) , описания материалов и методов исследований (2 глава), изложения и обсуждения полученных экспериментальных результатов (главы 3,4,5), выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложений. Работа проиллюстрирована 41 таблицей и 17 рисунками. Список литературы содержит 312 наименований.

- 4 -

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Введение. Во введении показана актуальность темы диссертации и сформулированы основная цель и задачи исследования.

Обзор литературы. Изложены имеющиеся в литературе сведения о направлениях микробиологической защиты растений от болезней и микробиологических методах борьбы с фузариозами. Проанализированы принципы и способы отбора штаммов микробов-антагонистов, культивирования микроорганизмов. Обобщены сведения о создании препаративной формы биопрепаратов.

Материалы и методы исследований. Оценивали биологическую активность коллекции чистых культур микроорганизмов методами блоков, лунок, бумажных дисков и серийных разведений (Егоров, 1986). В качестве тест-культур использовали 11 штаммов 5 видов фузариозных грибов, полученных из ВНИИФ и лаборатории микологии и фитопатологии ВИЗР.' В коллекцию тест-грибов вошли штаммы, различающиеся по патогенности, географическому месту выделения и видам растений хозяев, выделенные из корней, стеблей и генеративных органов растений. Идентификацию двух активных антагонистов провели по определителям Берги (Bergey, 1986) и Га-узе Г.Ф. и соавторов (1983). По дифференцирующим морфологическим и физиолого-биохимическим признакам культура Bacillus sp. N 10 была отнесена к виду Bacillus subtilis (Ehrenberg-) Cohn 1872, а штамм Streptomyces sp. N 8 к виду Streptomyces feileus Lindenbein 1952.

В экспериментах использовали опытные образцы биопрепаратов на основе отобранных нами штаммов: алирин Б - биопрепарат на основе Bacillus subtilis-10-ВИЗР (представляет собой распылительно высушенную культуральную жидкость - смачивающийся порошок, содержащий живые клетки и комплекс метаболитов, титр 10 млрд. спор/г, Щелковский комбинат, Московская обл.); алирин С

- биопрепарат на основе Streptomyces felleus-8-ВИЗР (смачивающийся порошок, представляющий собой конвенционно высушенную биомассу клеток, титр 1 млрд. спор/г, Щелковский комбинат, Московская обл.); лабораторные образцы биопрепаратов хризомал

- на основе метаболитов Streptomyces chrysomallus N Р-21; гло-берин - метаболитов Streptomyces globisporus Л-242; Г-9 - метаболитов Streptomyces loidensis Г-9. В качестве эталонов сравнения использовали известные биопрепараты триходермин (титр 0,5-1,0 млрд. спор/г, производство ТОО "Биозар", с/з "Белая дача", Московская обл.) и бактофит (титр 10 млрд.

опор/г, з-д "Прогресс", г. Ст-епногорск, Казахстан).

Культивирование микробов-антагонистов проводили в колбах на качалке при объеме заполнения к объему колбы 1:12 и в лабораторном ферментере объемом 5 л на базе ВИЗР и НПО "Виомаш" (Москва). В процессе культивирования Streptomyces feIleus-3 определяли изменения сухой биомассы в единице объема культу-ральной жидкости весовым методом, рН среды, количество редуцирующих Сахаров по методу Бертрана (Плешков, 1976), биологическую активность экстракта биомассы методом лунок и бумажных дисков в отношении тест-гриба Alternaría brassicicoUv При культивировании Bacillus subtills-10 учитывали морфологию изменения клеток и титр методом Виноградского-Шульгиной-Брида (Егоров, 1976). Для изучения потребления питательных веществ в процессе роста и спорообразования определяли содержание амин-ного азота колориметрическим методом по реакции с нингидрином (Кононова, Фаворская, 1962) и редуцирующих Сахаров в культу-ральной жидкости (Плешков, 1976), а также антагонистическую активность по диаметру зон отсутствия роста тест-культуры -Alternarla brassicicola.

В целях поиска оптимальной товарной формы биопрепаратов на основе микробов-антагонистов B.subtilis-10 и S.Felleus-8 али-рина Б и алирина С была проведена работа по изучению влияния 9 различных наполнителей на биологическую активность методом лунок (Егоров, 1986) и титр спор биопрепаратов. Образцы наполнителей были предоставлены Киевским институтом химии поверхностей АН Украины. Наполнители использовали в двух концентрациях: 0,1 и 1,0 г на 100 мл среды для алирина Б и на 100 г влажного мицелия алирина С.

Лабораторную оценку антагонистической активности опытных образцов биопрепаратов проводили в модельных опытах на проростках огурца, искусственно зараженных F.oxysporum 1 (Быкова, 1992). На следующем этапе оценивали эффективность опытных образцов биопрепаратов в вегетационных опытах на искусственном инфекционном фоне с использованием стерильной почвы. Заражение растений проводили путем замачивания поврежденных проростков в суспензии Fusarium oxysporum 1 (1 млн. спор/мл). После посадки инфицированных и незараженных проростков в вазоны вносили антагонисты проливом суспензий препаратов. Результаты опыта учитывали через 20-40 дней. Учитывали длину растений, количество листьев, завязей (если они образовывались) и определяли разви-

- 8 -

тие болезни (Хохряков и др., 1984).

Конечным этапом оценки эффективности биопрепаратов были производственные опыты 1991-1994 годов. Опыты проводили в пленочных теплицах (1991 г., с-з "Детскосельский", Ленинградской обл., гибрид ТСХА-77) и стеклянных теплицах (1993 г., АО "ЛЕТО", гибрид Аэлита, первый культурооборот; 1994 г., АО "ЛЕТО", гибрид Королек, продленный культурооборот , Ленинградская обл.). Испытывали различные концентрации алирина Б и алирина С. а также смесей этих биопрепаратов. В качестве эталонов сравнения использовали биопрепараты триходермин (норма внесения 1 г под растение), бактофит (норма внесения i г/м2). Препараты вносили в почву проливом суспензии при посадке семян, высадке рассады на постоянное место и через месяц после этого.

В течение всего вегетационного периода учитывали влияние биопрепаратов на рост и развитие растений (высоту растений, количество листьев и количество завязей оценивали раз в неделю) , а также на развитие и распространенность корневых гнилей (Хохряков и др., 1984) и урожайность огурца.

В 1991-1993 гг. на опытном поле ВИЗР были проведены мелко-деляночные полевые опыты по испытанию эффективности лабораторных образцов биопрепаратов в отношении возбудителей фузариоза колоса пшеницы F.graminearm¡ и F.sporotrichiella. Колосья пшеницы сорта Ленинградка заражали в фазу цветения по методике Mesterhasv (1978). Развитие болезни учитывали в процентах по площади поражения колоса и количеству семян с явным поражением. В контроле анализировали колосья обработанные водой в период цветения.

Во всех опытах in vivo из пораженных растений выделяли возбудителей заболеваний (Билай, 1982) и идентифицировали по определителю Билай В.Л. (1977).

При статистической обработке полученного экспериментального материала использовали общепринятые методики ( Рокитский, 1867; Воробьев И др., 1989).

Схема скрининга. Основной задачей было отобрать микробы-антагонисты, перспективные в качестве продуцентов биопрепаратов против фузариозных заболеваний растений, как метаболитных, так и на основе живых культур микроорганизмов, пригодных для интродукции в агробиоценозы.

Мы предлагаем схему многоступенчатого скрининга штаммов in vitro и 1л vivo (рис. 1). На первом этапе тестируют этанольные

экстракты биомассы и фильтраты культуральных жидкостей штаммов микроорганизмов in vitro на активность в отношении F.graminea-rum 3 (la). Наиболее активные штаммы тестируют методом серийных разведений (16) и отпределяют их биологическую активность в отношении видов F.culmorum, F.oxysporum, F.sporotrlchiella и F.sajnbuclnuin (2). Затем их суммарную антагонистическую актив-

Рис. 1. Схема ступенчатого скрининга штаммов-антагонистов активных в отношении фузариозных грибов

- з -

ность оценивают методом блоков в двух модификациях (3). Скрининг in vivo включает лабораторные (4), вегетационные (5) и мелкоделяночные полевые опыты (6) с созданием искусственных инфекционных фонов. Для искусственного заражения использовали возбудителей корневых гнилей огурца F.oxysporum 1 и фузариоза колоса пшеницы F.graminearum 3,4 и F.sporotrichiella 6. На конечном этапе тестировали опытные образцы биопрепаратов на основе отобранных штаммов в производственных условиях.

Результаты отбора in vitro. В результате скрининга было показано, что 15 отобранных штаммов обладали выраженной антибиотической активностью in vitro в отношении штаммов F.graminea-гшп, F.culmoruin, F.oxysporum, F.sporotrichiella и F.sambuci-nirni, а также Alternaria brassicicola, Colletotrichum antra^en-tarium, Verticilliuir, dahliae, Whetzelinia sclerotiorum, Bipo-laris sorokiniana, Ascochyta fabae, Phoma exiqua, Septoria no-dorum и Rhizoctonia solani (диаметр зоны лизиса 9-30 мм, этапы •1,2 (рис. 1)).

Нами был предложен новый подход для оценки чувствительности фитопатогенных грибов к микробам-антагонистам не только на стадии конидий, но и в состоянии мицелия (3-й этап скрининга, рис. 1). Для характеристики общей чувствительности грибов к антагонистам мы предлагаем использовать метод блоков в двух модификациях. Первый - традиционный метод, при котором оценивают ингибирование прорастания конидий гриба помещением блока со зрелой культурой антагониста на поверхность чашки Петри, засеянной конидиями фитопатогенного гриба. Второй - модифицированный метод для оценки способности антагонистов ингибиро-вать зрелый мицелий фитопатогена при помещении блоков с мицелием на поверхность агаровой пластинки, засеянной спорами антагонистов. Для интерпретации результатов была предложена шкала (от 0 до +++ в зависимости от диаметра зоны отсутствия роста тест-гриба или зоны роста антагониста с шагом 5 мм; диаметр блока - 5 мм).

В таблице 1 представлены результаты оценки чувствительности 11 штаммов грибов рода Fusarium в отношении антагониста B.sub-tilis-10-ВИЗР при использовании данной методики.

Проведенные исследования показали, что культуры S.felle-us-8-ВИЗР и B.subtilis-10-BM3P проявляли высокую биологическую активность в отношении всех изученных штаммов фузариозных грибов. Механизм подавления фитопатогенов сложен, многокомпонен-

- з -

■ген, возможно не одинаков в отношении.различных штаммов грибов и нуждается в дальнейшем изучении. Согласно полученным результатам, in vitro наиболее чувствительными к S.felleus-8 были штаммы F.graminearum 1, 2 и 4. Антагонист ингибировал их развитие как на стадии прорастания конидий, так и в состоянии зрелого мицелия, причем рост мицелия подавлялся в большей степени. Наиболее устойчивы были штаммы F.oxvsporum 2 и F.culmo-rum 7, которые антагонист слабо ингибировал на всех стадиях развития культур. Наибольшую чувствительность к B.subtilis-10 показали штаммы F.graminearum 1, 2, 3 и F.sambucinmi, которые антагонист сильно ингибировал на всем протяжении жизненного цикла. Антагонист подавлял наиболее устойчивые штаммы F.oxys-porum 2 и F.culmoriun 7, 5 и 6 только на стадии прорастания ко-

Таблица 1

Комплексная оценка чувствительности штаммов фитопатогенных грибов рода Fusarium в отношении B.subtilis-10-BM3P (на основе прямого и модифицированного методов блоков)

Тест- Чувствительность Чувствительность

культура конидий мицелия Комплексная

фитопатогенного (традиционный (модифицированный чувстви-

гриба метод) метод блоков) тельность

r.graminearujn 1 ++4 44 44444

F.graminearuiri 2 444 + 4 44444

F.graminearum 3 +++ 44 44444

F.graminearuiü 4 4 44 444

F.oxysporum 1 444 .. 4 44+4

F.oxvsporum 2 +4+ 0 444

F.culmorum 7 44+ 0 44+

F.culrorum 5 444 0 444

F.culmorum 6 444 0 44+

F.sambucinum 444 44 44444

F.sporotricbiella 444 4 4444

Традиционный метод: 0 - диаметр зоны отсутствия роста тест-гриба (зоны роста антагониста) 5-10 мм; + - 11-15 мм; ++ - 16-20 мм; +++ - более 20 мм; модифицированный метод: ++ - диаметр зоны роста фитопатогена 5-10 мм; + - 11-15 мм; 0 - больше 15 мм; диаметр блока - 5 мм

- 10 -

нидий, a F.graminearum 4 на обеих стадиях развития.

Эффективность лабораторных образцов биопрепаратов на основе отобранных штаммов в опытах с искусственным инфекционным фоном. Эффективность в отношении корневых гнилей огурца (возбудитель F.oxysporum 1).

На первом этапе скрининга in vivo (4, рис. 1) в модельных опытах на проростках огурца было показано, что из 10 метабо-литных биопрепаратов (на основе отобранных на предыдущих этапах штаммов-антагонистов] 5 существенно снижали развитие корневых гнилей огурца. Наибольшую эффективность проявили образцы хризомад и S-44, снизившие поракениость проростков корневыми гнилями на 30.5 и 30,1%%, соответственно. Препараты Г-9 и 1583 снижали пораженность корневыми гнилями на 21,1% и 20,2%, а 191 - на 12,5%.

В вегетационных опытах с созданием искусственного инфекционного фона (5, рис. 1) было показано, что внесение препаратов алирина Б и алирина С (на основе B.subtilis-10 и S.felleus-8) существенно снижало развитие корневых гнилей огурца. Наиболее интенсивно подавление развития болезни происходило при внесении 0,001 г алирина С на 1 кг почвы - в 1,7 раза и 1,0 и 0,1 г алирина Б - в 1,7-1,9 раза.

Еще более эффективно было применение смеси алирина Б и алирина С в концентрациях 0,5+0,5 и 0,05+0,05 г биопрепаратов на 1 кг почвы , которое снижало в 2,2-2,7 раза развитие корневых гнилей.

Этап вегетационных опытов на жестком искусственном инфекционном фоне показал эффективность биопрепаратов в отсутствии почвенного фунгисгазиса, а также позволил отобрать наиболее оптимальные дозы и сочетания биопрепаратов.

Эффективность лабораторных образцов биопрепаратов против фузариоза колоса пшеницы на искусственном инфекционном фоне

В 1991-1993 гг. лабораторные образцы биопрепаратов алирина Б и алирина С в концентрациях 0,1% и 1,0% и метаболитных биопрепаратов на основе отобранных штаммов стрептомицетов глобе-рин (Л-242), Г-9, хризомал (Р-21) в концентрации 0,1% показали высокую эффективность в мелкоделяночных полевых опытах в отношении фузариоза колоса, вызванного F.graminearum (рис. 2). В качестве химического эталона использовали фоликур, который по данным других авторов выгодно отличался от прочих фунгицидов не только профилактическим, но и некоторым лечебным действием

(Тютерев, 1991).

Погодные условия 1991, 1992 и 1993 годов сильно различались, что отразилось на пораженности растений фузариозом колоса (Рис. 2). В 1991 году распространенность фузариоза колоса в естественном фоне составила 107.. в варианте с искусственным заражением - 73.3%. Лето 1992 года было жарким и сухим, естественный инфекционный фон был незначительным, не превышая 15%, а в варианте с инокуляцией распространенность фузариоза колоса составляла лишь 28,2%. Лето 1993 года было дождливым и прохладным: распространенность фузариоза колоса на естественном фоне составила 53,3% и достигла 100% при искусственном заражении Р.^гаМпеагит.

Однократная обработка колосьев, проведенная всеми биопрепаратами в 1991 году, была не очень эффективна в отношении фузариоза колоса. Тем не менее, препарат Г-9 достоверно снижал распространенность фузариоза колоса. Все биопрепараты существенно уменьшали развитие болезни и % больных зерен.

Распространенность фузарион колось, у

ЛЫ.___мм-, шь

1991 1992 1993

И1 К»итро»к Ш (ст. «ей Е23 Глебчик Ш Хриюмал

рз г-г си ¿Аири« в*С ЩШ Фвлакур

Рис. 2

Влияние применения биопрепаратов на распространенность фузариоза колоса яровой пшеницы в мелкоделяночных полевых опытах с искусственным инфекционным фоном (Р.^гапипеагшО в 1991, 1992 и 1993 годах (сорт Ленинградка, опытное поле ВИЗР, Ленинградская обл., 1991 г. - однократная обработка в фазу цветения, 1992, 1993 гг. двукратная - в фазы выколашивания и цветения пшеницы)

В жаркий и засушливый 1992 год двукратное применение всех испытанных метаболитных биопрепаратов снижало распространенность фузариоза колоса ниже уровня естественного инфекционного фона: Г-9 - в 2 раза, глоберина - в 4,6 раза, хризомала - в 6,3 раза по сравнению с контролем. Наблщалось значительное подавление развития болезни и снижение X больных зерен, за исключением препарата Г-9, при применении которого уменьшался только % больных зерен (в 1,7 раза). Глоберин ингибировал развитие заболевания в 2,1 раза, уменьшал % больных зерен - в 1,8 раза, хризомал - в 19,0 и 3,8 раза соответственно. Применение смеси биопрепаратов алирина Б и алирина С снижало распространенность фузариоза колоса в 2,8 раза (до уровня естественного фона), развитие - в 2,5 и % больных зерен в 7,8 раза.

Наиболее жесткий инфекционный фон наблюдался в 1993 году, который отличался прохладным и дождливым летом. Эффективность всех биологических препаратов была несколько ниже, чем в предыдущий год. Тем не менее, применение метаболитного препарата Г-9 подавило распространенность фузариоза колоса до уровня ее-

рОСЛ р "С.П*'. .4 НОГ:Ь фун-приоз-: К,";-/ЮСй { */С

Рис. 3

Влияние применения биопрепаратов на распространенность фузариоза колоса яровой пшеницы в мелкоделяночных полевых опытах с искусственным инфекционным фоном (Р.эрогоШсМеПа) в 1992 и 1993 годах (сорт Ленинградка, опытное поле ВИЗР, двукратная обработка в фазы выколашвания и цветения пшеницы)

тественного инфекционного фона. Его эффективность была на уровне химического эталона фоликура. Достоверное снижение распространенности болезни отмечено в случае применения биопрепаратов алирина Б и С (в 1,4 раза), хризомала (в 1,6 раза) и Г-9 (в 2,3 раза). Все изученные биопрепараты достоверно уменьшали развитие болезни: смесь алиринов - в 1,9, глоберин -в 3,1, хризомал в 4,4, Г-9 - в 6,1 раза. Химический эталон фо-ликур снижал распространенность заболевания в 2,1 раза, развитие - в 6,8 раза.

Основным возбудителем фузариоза колоса в условиях средней полосы и северо-запада России является Р. 5рого1гасЫе11а. Опыты по оценке эффективности биопрепаратов в отношении этого фи-топатогена проводили в 1992 и 1993 годах.

В 1992 году распространенность фузариоза колоса на естественном инфекционном фоне составила 15,0%, в варианте с искусственным заражением Р. эрогоШсМеПа - 52,8% (Рис. 3). Применение глоберина. Г-9, смеси алиринов и хризомала снизило распространенность фузариоза колоса в 2,0, 2,3, 9,4 и 19,0 раз соответственно. Достоверно уменьшались развитие заболевания и X больных зерен (в 2,4-6,0 и 1,2-2,2 раза). Наиболее существенно ограничили распространенность болезни метаболитные биопрепараты Г-9 и хризомал, а также смесь алирина Б и алирина С. Та же закономерность наблюдалась в 1993 году, однако подавление распространенности заболевания было не столь существенным (Рис. 3). При 100% распространенности болезни в варианте с ис-. кусственным заражением колосьев биопрепараты достоверно снижали распространенность и развитие заболевания: алирин Б и С в 1,4 и 2,4 раза, Г-9 - 1,4 и 2,8, хризомал - в 1,8 и 6,2 раза.

Наилучшую эффективность в отношении Р. БрогсЛНсЫеПа показал метаболнтный биопрепарат хризомал , который ограничивал распространенность фузариоза колоса до уровня химического контроля (в 1992 году ниже а, в 1993 году до уровне естественного инфекционного фона).

Суммируя полученные данные, можно отметить, что эффективность биопрепаратов зависит от интенсивности развития фузариоза колоса: при низкой интенсивности поражения биопрепараты более эффективны. Это необходимо учитывать при дальнейшей отработке технологии применения биопрепаратов.

Фиторегуляторная активность - один из элементов зколого-фи-зиологических механизмов защитного действия биопрепаратов. Фи-торегуляторная активность наблюдалась у многих препаратов. В опытах на проростках (4-й этап скрининга, рис. 1) препарат 3-44 существенно снижал длину и вес проростков, препарат 1583, напротив, существенно увеличивал длину и вес проростков.

В вегетационных опытах было показано стимулирование завязе-образования у растений огурца биопрепаратом алирином Б и смесью алирина Б и алирина С (на 40-100%). В производственных опытах смесь алирина Б и С стимулировала рост растений на 23-52%. Ростстимулирующий эффект сопровождался более ранним цветением и повышением урожайности (табл. 2).

На различных гибридах в разные годы были получены существенные прибавки урожая: 7% в 1991, 102% в 1993 и 23,6% в 1994 гг. Прибавка урожайности варьировала в зависимости от гибрида, культурооборота, фитосанитарной обстановки и погодных условий.

Мы предлагаем использовать систему биометрических наблюдений в теплицах как метод оценки фиторегуляторного эффекта биопрепаратов.

Эталоны сравнения триходермин и бактофит также обладают фи-

Влияние внесения биопрепаратов на количество завязей и урожайность огурца в производственном опыте на пропаренном грунте (1993 г., первый оборот, гибрид Аэлита АО "ЛЕТО", Ленинградская обл.)

Таблица 2

Количество завязей и плодов, шт.

Дата -

учета 17.02.93 25.02.93 4.03.93

Суммарный урожай

Вариант Завязи Завязи Плоды Завязи Плоды кг кг/м'

Контроль Триходермин

3,3

5,7 9,9 1,4 16,6 3,1 667 8,0

4,3 10,2 1,8 17,9 2,1 1304 15,7

8

б

0,5 16,9 1,1 599 7,2

Бактофит Алирин

Б+С

6,2 12,2 1,8 19,0 2,3 1213 14,6

НСР0. 05

2,1 0,8

3,0 1,0

торегуляторным действием: бактофит стимулировал рост растений огурца на 19-36Х, повышал урожайность на 7% (1994) и 118% (1993). Триходермин в течение двух лет увеличивал урожайность на 4-11%, существенно повышая выход ранней продукции.

Биопрепараты алирин Б и алирин С. Определяли динамику развития штаммов-продуцентов алирина Б и алирина С на средах, отобранных для дальнейшей оптимизации.

Анализ морфологических и физиолого-биохимических особенностей штамма B.subtilis-10 в процессе роста и развития культуры при глубинном периодическом культивировании показал, что экспоненциальная фаза роста наблюдалась с 5 до 10 часов культивирования, после чего начиналась фаза споруляции, завершавшаяся к 48 часам роста. Переход культуры к дифференциации не был связан с лимитацией источниками С и N: сушественное обеднение среды редуцирующими сахарами и аминным азотом наблюдали только через 72 часа роста. Накопление антибиотических веществ достигало максимума в ранней стационарной фазе. Полученные данные позволяют сократить время ферментации штамма B.subtilis-10 до 48 часов в данных условиях культивирования и состава питательной среды. Выход препарата на отобранной среде составляет 21-23 г с литра культуральной жидкости. При ферментации в других условиях срок окончания процесса должен определяться 80-100% образованием спор.

Изучение роста и развития культуры S.felleus-8 показало, что экспоненциальная фаза роста завершилась к 32-48 часам. Время культивирования S.felleus-8 зависит от динамики накопления биомассы, изменения pH и биологической активности, а, следовательно, условий культивирования, и должно продолжаться после окончания фазы быстрого роста 2-3 суток. Выход препарата на данной среде составляет 18-20 г с литра среды.

В результате проведенных исследований были подобраны среды для лабораторных регламентов производства препаратов на основе B.subtilis-10 и S.felleus-8, пригодные в качестве основы для дальнейшей оптимизации, изучен рост и развитие антагонистов на отобранных средах, выявлены морфологические и физиолого-биохи-мические критерии для разработки опытно-промышленного регламента получения алирина С и алирина Б.

Анализ влияния 9 наполнителей, полученных из Киевского института химии поверхностей АН Украины, на качество биопрепаратов алирина Б и алирина С в момент изготовления препаратов и

Таблица 3

Влияние внесения биопрепаратов на пораженность растений огурца гибрида Королек корневыми гнилями в производственном опыте (АО "ЛЕТО", Ленинградская обл., 1994 г)

27.03.94 15.04.94

26.05.94

23.06.94

31.07.94

29.07.94

Вариант_

Р% RZ

PZ R%

PZ RZ

Выпады Р% растений, шт

Выпа- Выпады ды рас- растений, тений шт. ZM

PZ

Ш

Алирин

Б+С 8.6 2.5 21.9 10.2 62.0 15.5 9 Бакто-

фит 11.7 3.4 33.3 13.3 48.9 13.8 9 Трихо-

дермин 14.6 4.0 37.1 21.4 64.6 18.8 11 Контроль 34.7 11.0 56.6 33.3 68.8 22.9 10

100 31.1 21 88 83.Ü 85.0 27.5

100 4.1.8 34 115 108.5 94.4 31.9

100 45.5 45 99 93.4 94.4 37.5

100 52.2 32 106 100.0 94.7 42.3

HCPo.i 2.3 12.0 6.5 9.5 13.8

Р - распространенность болезни, R - развитие болезни, * - X к контролю.

Основные возбудители корневых гнилей - Fusarium oxysporum, F.culmorum.

при двухмесячном хранении выявил, что наиболее перспективными для алирина Б оказались наполнители Л-300. А-А, ТЮг и гумат, для алирина С - гумат, Ко А, А-300 и А-А. Наполнители способствовали сохранению спор в жизнеспособном состоянии и активности биопрепаратов, сохраняя титр спор в образцах в 5-30 раз выше, чем в контроле.

По лабораторным регламентам, составленным на основе данных по изучению культивирования штаммов-продуцентов алирина Б и алирина С, были наработаны лабораторные образцы этих биопрепаратов для изучения их эффективности в отношении фузариозных гнилей огурца в производственных условиях.

Производственные опыты по оценке эффективности биопрепаратов алирина Б, алирина С и их смесей. Действие лабораторных образцов биопрепаратов алирина Б и алирина С и их смесей изучали в производственных пленочных и стеклянных теплицах на пропаренном и непропаренном грунте. Опыты были поставлены в первом и продленном оборотах на гибридах огурца Аэлита, ТСХА и Королек.

В 1991 г. в пленочных теплицах алирин С (доза - 0,3 г/м2) снизил развитие корневых гнилей в 2,2 раза, алирин Б (0,3 г/м2)- в 3,6 раза, в то время как смесь алирина Б и С (0,3+0,3 г/м2) - в 7,9 раза. Хотя снижение развития и распространенности корневых гнилей и повышение урожая огурцов сильно варьиро-зали в зависимости от года, типа теплиц и гибрида огурцов, именно при совместном использовании алирина Б и С были получены наибольшие урожаи и наибольшее снижение лораженности растений корневыми гнилями. Очевидно это связано с тем, что биопрепараты аяирин Б и алирин С обладают различными механизмами действия в отношении фитопатогенных грибов. На пропаренном грунте наблюдали снижение распространенности корневых гнилей до 4-х раз, развития болезни - в 1,5-7,9 раза, уменьшение количества выпадов на 10-171 (Таблица 3). Эталоны сравнения бак-тофит и триходермин проявляли аналогичное действие, но показали меньшую эффективность. Бактофит в опытах 1993 и 1994 годов снижал распространенность корневой гнили до 1,5 раз, развитие до 3-х раз. Триходермин в 1991 г. снизил распространенность корневых гнилей в 10 раз, развитие болезни в 21,5 раза. В 1993 г. триходермин уменьшил распространенность корневых гнилей в 2 раза, развитие - в 2-3 раза. В 1994 г. триходермин не проявил существенного защитного эффекта к концу вегетации (снижение

развития болезни на 5% при 100% распространенности болезни).

На непропаренном грунте (1993) при однократном внесении препаратов к концу вегетации защитный эффект показала только смесь алиринов Б и С, снизив распространенность корневых гнилей в 1,6 раза и развитие заболевания в 1,8 раза.

В производственных опытах была подтверждена эффективность смеси алирина Б и С и отработаны основные элементы технологии применения препаратов (дозы, кратность и сроки обработок).

ВЫВОДЫ

1. Разработана схема многоступенчатого скрининга перспективных для создания биопрепаратов штаммов микробов-антагонистов. Схема включает первичный скрининг in vitro в отношении штаммов 5 видов основных возбудителей фузариозов с/х растений ( F.graminearum, F.culmoruni, F.oxysporum, F.sporotrichiella, F.sambucinum ); на следующих этапах скрининга оценивают биологическую активность антагонистов и их метаболитов в модельных лабораторных, вегетационных и мелкоделяночных опытах на искусственном и естественном инфекционных фонах (возбудители F.oxysporm, F.graminearum, F.sporotrichiella).

2. В результате первичного скрининга штаммов микроорганизмов и их метаболитов в отношении важнейших возбудителей фуза-риозных заболеваний с/х растений и последующей селекции было отобрано 14 перспективных штаммов: B.subtilis-10, S.felleus-8, S.violocanus 320, Streptomyces sp. S-15, Streptomyces sp. 1583, Streptomyces sp. S-44, S.loidensis Г-9, S.violocanus 191, S. chrysomallus S-143, S.globlsporus JI-242, S. surgutus 0166, S. chrysomallus P-21, S. cremeus 729, Streptomyces sp. S-21 (диаметр зоны задержки роста в отношении F.graminearum 3 - 14-30 мм). Перспективность этих штаммов-антагонистов была подтверждена их активностью в отношении других фитопатогенных грибов, вызывающих опасные заболевания растений: Alternaria brasslcicola, Colletotrichum antramentarium, Verticillium dah-liae, Whetzelinia sclerotiorum, Bipolaris sorokiniana, Ascoc-hyta fabae, Phoma exiqua, Septoria nodorurti, Rhizoctonia sola-nl.

3. Разработан метод комплексной оценки in vitro чувствительности фитопатогенных грибов на стадиях прорастающих конидий и мицелия к антагонистам, основанный на двух модификациях метода блоков. Метод позволяет оценить комплексную чувстви-

тельность фитопатогена к антагонисту на протяжении разных этапов жизненного цикла (на основе балльной шкалы) , а также определить на какой стадии развития фитопатогена наиболее эффективен антагонист.

4. Показано, что штаммы-продуценты B.subtilis-10 и S.felle-us-8 обладают антагонистической активностью по отношению к 11 штаммам 5 видов фузариозных грибов. Наиболее устойчивы штаммы F.oxysporum 2 и F.culmorum 7 (возбудители корневых гнилей овоаных культур), наиболее чувствительны - F.gramlnearuin 1 и 2 (возбудители фузариоза колоса пшеницы). В целом виды F.grami-nearum были менее устойчивы к антагонистам, чем F.oxysporum и F.culmorum .

5. При тестировании ряда биопрепаратов на основе метаболитов актиномицетов в модельных опытах на проростках огурца с искусственным заражением растений F.oxysporum показано, что препараты Р-21 (хризомал), Г-9, S-44, 191 и 1583 на 30,5-12,5% снижают развитие корневых гнилей проростков.

6. На основании изучения морфологических и физиолого-биохимических свойств штаммов подобраны среды для культивирования B.subtilis-10 и S.felleus-8, продуцентов алирина В и алирина С пригодные в качестве основы для дальнейшей оптимизации. Изучен рост и развитие антагонистов на отобранных средах. Определены морфологические и физиолого-биохишческие критерии для определения длительности промышленных ферментации. Выход биопрепаратов на отобранных средах 18-23 г с литра, титр - 109 и Ю10 кл./г. Подобранные питательные среды предложены для временных лабораторных регламентов производства препаратов.

7. Изучено влияние 9 наполнителей на жизнеспособность и стабилизацию антагонистической активности опытных образцов алирина Б и алирина С. Отобраны наиболее перспективные наполнители: для алирина Б - ТЮг , А-300, А-А и гумат; для алирина С - гумат, КоА, А-А. Наполнители способствуют сохранению титра жизнеспособных спор и активности биопрепаратов, сохраняя титр спор в 5-30 раз выше, чем в контроле.

8. Показан фиторегуляторный и ростстимулируювдй эффект на растениях огурца биопрепаратов алирина Б, смеси алирина Б и алирина С, метаболитного биопрепарата 1583. Биопрепараты увеличивают высоту растений на 23-52£, количество завязей - на 40-90%, урожайность - на 7-23,6%, а в благоприятных фитосани-тарных условиях до 1021.

9. В вегетационных опытах на искусственном инфекционном фоне показано, что внесение препаратов алирина В и алирина С существенно снижает развитие корневых гнилей огурца. Биопрепарат алирин Б в дозах 1,0 и 0,1 г на кг почвы снижает развитие корневых гнилей в 1,7-1,9 раза. Алирин С в дозе 0,001 г/кг почвы - в 1,7 раза. Наиболее эффективно применение смеси алирина Б и алирина С в концентрациях 0,5+0,5 и 0,05+0,05 г биопрепаратов на кг почвы,- которое снижает развитие болезни в 2,2 -2,7 раза.

10. В производственных опытах наилучшие результаты как на пропаренном, так и непропаренном грунте были получены при внесении смеси препаратов алирин Б и С. При одно-трехкратном внесении смеси биопрепаратов наблюдается снижение распространенности корневых гнилей до 4-х раз, развития болезни - в 1,5-7,9 раза, уменьшение количества выпадов на 10-17%. Данные по дозам и кратности обработок предложены для регламента применения биопрепаратов.

и. В мелкоделяночных полевых опытах наибольшую эффективность в отношении Р. ^гапйпеагит и Р.БропЛгасМеПа проявляют биопрепараты глоберин, хризомал, Г-9 и смесь алирина Б и С. Лабораторные образцы биопрепаратов снижают распространенность фузариоза колоса в 1,4-19,0 раз, развитие болезни - в 1,9-19,0 раз, % больных зерен - в 1,2-7,8 раза.

12. Эффективность биопрепаратов в отношении возбудителей фузариозов с/х культур значительно зависит от уровня распро- • страненности и развития болезней (биологическая эффективность биопрепаратов при средней пораженности растений в 2-3 раза выше, чем при высокой). В связи с этим необходимо проводить профилактические обработки биопрепаратами или обработки по первым симптомам заболеваний.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Предлагаем использовать систему биометрических тестов как надежный метод оценки фиторегуляторной активности биопрепаратов в производственных условиях.

2. Для ограничения фузариозных корневых гнилей огурца в защищенном грунте и повышения продуктивности рекомендуем проводить трехкратную обработку растений огурца смесью биопрепаратов алирин Б и алирин С в дозе 0,6 г/м2 (при высеве семян, пересадке рассады на постоянное место и через месяц после этого).

Основные положения диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Калько Г.В., Новикова И.И. Отбор штаммов и метаболитов, перспективных в качестве основы биопрепаратов для борьбы с болезнями растений// Тез. докл. 2-й республиканской конференции "Микробиология в сельском хозяйстве", Кишинев, 1991, с. 82

2. Калько Г.В.. Новикова И.И., Литвиненко А.И. Изучение антагонистических свойств Bacillus sp. и Streptomyces sp. по отношению к фитопатогенным грибам рода Fusarium// Тез. докл. 2-й республиканской конференции "Микробиология в сельском хозяйстве", Кишинев, 1991, с. 83

3. Новикова И.И., Иващенко В.Г., Калько Г.В., БойковаИ.В., Назаровская Л.А., Литвиненко А.И. Испытание новых биопрепаратов в борьбе с фузариозом колоса пшеницы// Микология и фитопатология, 1994, т.28. вып. 1, с. 70-75

4. Нугманова Т.А., Микуцкая Н.Э., Антипова O.A., Холяв-ко Н-М., Комарова Т.Д., Новикова И.И., Калько Г.В., Литвиненко А.И. Лабораторный регламент на производство алирина Б концентрированного смачивающегося порошка. 28 с.

5. Калько Г.В., Новикова И.й., Павлюшин В.А. Испытание биопрепаратов алирина Б и алирина С в борьбе с фузариозными заболеваниями растений// Тез. конф. "Интродукция микроорганизмов в окружающую среду", Москва, с. 45-46

6. Новикова И.И., Калько Г.В., Лагутина Т.М. О влиянии продуцентов биопрепаратов алирина Б и алирина С на выживание фи-топатогенного гриба Fusarium oxysporim Schlecht, emend. Snyd. в торфогрунте// Тез. конф. "Интродукция микроорганизмов в окружающую среду", Москва, с. 75-76

7. Новикова И.И., Калько Г.В., Нугманова Т.А., Литвиненко А.И. Штамм Streptomyces fei leus -8 ВИЗР - продуцент биопрепарата для защиты растений от фитопатогенных грибов. Заявка на патент. Положительное решение от 28.02.1994 г

8. Novikova I.I., Boikova I.V., Konev U.E., Pavlushin V.A., Kalko G.V. e.a. New ecologically clean biopreparations for plant protection// International conf. "Biotechnology St.Pe-tersburg'94" St.Petersburg, Russia, September 21-23, p. 111-112

9. Калько Г.В., Новикова И.И. Разработка системы микробиологической защиты огурца от корневых гнилей в закрытом грунте// Экологически безопасные и беспестицидные технологии полу-

- SS -

чения растениеводческой продукции. - Пущино, 1994. ч. IL- с. 154-155

10. Калько Г.В., Новикова И.И., Павлюшин В.А. Роль метабо-литных биопрепаратов в залдете растений огурца от корневых гнилей в условиях закрытого грунта// Экологически безопасные и беспестицидные технологии получения растениеводческой продукции. - Пущино, 1994. ч. П.- с. 155-156

11. Novikova I.I., Boikova I.V., BikovaG.A., KalkoG.Y., Sergeeva M.E. Different aproaches in biological control of plant diseases.//European journal of Plant Pathology. 13 International Plant Protection Congress the Haque - the Netherlands. 2-7 july 1995. Abstracts., p.

12. Новикова И.И., Литвиненко А.И., Калько Г.В. Изучение влияния новых биопрепаратов на основе штаммов микробов-антагонистов на комплекс возбудителей корневых гнилей огурца// Микология и фитопатология, 1995, т.29, вып. 5, с.

13. Иенин Ю.Д., Кругликова Л.Ф., Калько Г.В., Новикова И.И. Характеристика алирина Bi основного компонента фунгицидного препарата, продуцируемого штаммом Bacillus subtilis 10-ВИЗР// Антибиотики и химиотерапия, 1995, т. 40, N 5, с. 3-7.

14. Калько Г.В. Метод для оценки чувствительности фитопато-генных грибов в отношении штаммов микробов-антагонистов in vitro// Защита растений в условиях реформирования агропромышленного комплекса: экономика, эффективность, экологичность. Тез. докл. Всерос. съезда по защите растений (С.-Петербург, декабрь 1995 г.), С.-Пб., 1995, с. 316