Получение противосибиреязвенных иммуноглобулиновых препаратов человека в эксперименте и изучение их биологических свойств

Долматов, Владимир Юрьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение противосибиреязвенных иммуноглобулиновых препаратов человека в эксперименте и изучение их биологических свойств
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение противосибиреязвенных иммуноглобулиновых препаратов человека в эксперименте и изучение их биологических свойств"

На правах рукописи

г*

ДОЛМАТОВ Владимир Юрьевич

ПОЛУЧЕНИЕ ПРОТИВОСИБИРЕЯЗВЕННЫХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВЫХ ПРЕПАРАТОВ ЧЕЛОВЕКА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

03.00.23 - биотехнология 14.00.29 - гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Киров - 2008

003450348

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор C.J1. Шарыгин доктор биологических наук А.Г. Лютов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.Н. Мигунов доктор медицинских наук, профессор A.B. Степанов

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение науки «Государственный научно-исследовательский институт

стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. JI.A. Тарасевича Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека»

Защита диссертации состоится «_»_2008 г.

в Ю00 на заседании диссертационного совета Д 208.046.01 Федерального государственного учреждения науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека» (125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора»

Автореферат разослан 8 октября 2008 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

С.Ю. Комбарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Сибирская язва - тяжёлое инфекционное заболевание, внимание к которому и в России, и во всем мире в последнее время значительно возросло, что связано, в первую очередь, с угрозой биотерроризма, уже нашедшей практическое воплощение на территории США [Jernigan J.A. et al., 2001, Pittman P.P. et al., 2005]. Споры возбудителя сибирской язвы - Bacillus anthracis - с точки зрения большинства представителей военных ведомств и антитеррористических организаций, на сегодняшний день представляют собой наиболее опасное самостоятельное биологическое оружие [Рубинштейн Э., 2001]. Кроме того, остаётся высокой вероятность возникновения эпидемий инфекции в результате активизации широко распространённых почвенных резервуаров сибиреязвенного микроба [Пименов Е.В. с соавт., 2000].

Основным средством лечения сибирской язвы у людей в настоящее время являются антибактериальные препараты [Онищенко Г.Г. с соавт., 1999]. Однако даже при использовании антибиотиков последнего поколения, передовых методов диагностики и высокотехнологичного оборудования смертность при лёгочной форме инфекции достигает 45 % [Spencer R.C., 2003]. Проведение интенсивной химиотерапии может вызывать ряд неблагоприятных побочных эффектов вплоть до летального исхода вследствие масштабного высвобождения токсина при разрушении клеток возбудителя [Hanna Р., 1999, Collier R.J. et al., 2003]. Единственный производимый в настоящее время антитоксический препарат - «Глобулин противосибиреязвенный лошадиный жидкий» - предназначен для внутримышечного введения, поэтому его применение не позволяет достичь быстрого нарастания антител в крови реципиента до защитного уровня. Современная научная разработка, направленная на ферментативное расщепление молекул иммуноглобулина, содержащихся в препарате, и выделение иммунохимически чистых (РаЬ)2-фрагментов, может привести к

созданию антитоксического лекарственного средства, пригодного для внутривенного введения [Маринин Л.И. и соавт., 1999]. Однако любые гетерогенные сывороточные препараты обладают сенсибилизирующими свойствами и способны вызывать у людей анафилактические реакции [Шарыгин С.Л., 1997].

Мировой опыт разработки и применения специфичных внутривенных иммуноглобулинов человека (ВВИГ) свидетельствует об их высокой эффективности и ареактогенности при лечении тяжёлых инфекционных заболеваний различной этиологии [Сапожникова B.C., 1990, Мальцева О.В., 2002, Шкуратова О.В., 2002, Arnon S.S. et al., 2006], поэтому актуальность создания аллогенного антитоксического противосибиреязвенного иммуноглобулина, пригодного для внутривенного введения, не вызывает сомнений. Основой нового препарата могут стать антитела к протективному антигену (ПА) В. anthracis - единственной антигенной детерминанте сибиреязвенного микроба, иммуногенные свойства которой однозначно доказаны [Cote C.K. et al., 2003]. Определённый интерес представляет также разработка комплексного препарата для энтерального применения, содержащего иммуноглобулины трёх основных классов с антительной активностью в отношении ПА.

Цель исследования - получение экспериментальных образцов противосибиреязвенных иммуноглобулиновых препаратов из плазмы крови человека и изучение их биологических свойств.

Задачи исследования

1. Оценить возможность выделения антител человека к протективному антигену В. anthracis из донорской плазмы, определить минимальную специфическую активность иммунного сырья, достаточную для получения противосибиреязвенных препаратов.

2. Изучить динамику гуморального ответа доноров на иммунизацию комбинированной сибиреязвенной вакциной и ревакцинацию живой вакциной, установить возможный период заготовки и условия хранения иммунной плазмы.

4. Изучить спектр антител к различным антигенным детерминантам сибиреязвенного токсина и оценить токсиннейтрализующую активность полученных экспериментальных образцов препаратов in vitro.

5. Определить профилактическую и лечебную эффективность внутривенного иммуноглобулина в эксперименте на животных.

Основные этапы работы выполнены в рамках договора № Ю-д-2002 от 01.07.02 г. между ФГУ «Кировский НИИ гематологии и переливания крови Росмедтехнологий» (КНИИГиПК) и ФГУ «48 Центральный НИИ Минобороны России» (ЦНИИ МО) о совместном научном исследовании «Разработка технологий и создание аппаратурно-технических линий по производству препаратов против сибирской язвы», а также в рамках научно-исследовательской работы КНИИГиПК по созданию специфичных иммуноглобулинов человека для внутривенного введения (номер государственной регистрации комплексной темы 01200604343).

Научная новизна

Впервые показана возможность получения аллогенного противосибиреязвенного иммуноглобулина, пригодного для внутривенного введения, из плазмы иммунизированных доноров. По материалам исследования подана заявка на патент Российской Федерации «Иммуноглобулин человека противосибиреязвенный для внутривенного введения» № 2006129089/20/03/608, приоритет от 10.08.06 г.

Установлен минимальный уровень антител к протективному антигену В. anthracis в сырье для получения препарата. Охарактеризована динамика содержания антител в крови доноров, иммунизированных сибиреязвенными вакцинами. Оценена стабильность специфической активности плазмы при хранении.

Показано, что экспериментальные образцы иммуноглобулинов содержат антитела к различным антигенным детерминантам сибиреязвенного токсина. В опыте на культуре клеток определена токсиннейтрализующая активность препаратов.

Доказана профилактическая и лечебная эффективность внутривенного иммуноглобулина в эксперименте.

Практическая значимость работы

Определены требования к иммунному сырью и условия его хранения. Показана возможность использования трёх технологических схем выделения антител из донорской плазмы с целью получения противосибиреязвенных иммуноглобулиновых препаратов для внутривенного и энтерального применения.

Внедрение результатов исследования в практику

Отработана технология получения иммуноглобулина для внутривенного введения с применением метода инкубации в кислой среде, утверждён промышленный регламент ПР-187563 07-02-06.

Укомплектована технологическая линия производства специфичных внутривенных иммуноглобулинов человека в отделе препаратов крови ФГУ «КНИИГиПК Росмедтехнологий», утверждено два лабораторных регламента.

Проведено аппаратурное оснащение экспериментально-производственной лаборатории фракционирования плазмы ЗАО «Иммуно-Гем», сформирована линия по выпуску «Иммуноглобулинового комплексного препарата» (ПР-18756307-03-06) и налажено его промышленное производство.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Однократная вакцинация доноров комбинированной сибиреязвенной вакциной обеспечивает образование антител к протективному антигену В. агйкгат в титре не менее 1:400 у 69 % людей. Заготовку иммунной плазмы целесообразно начинать с пятой недели после иммунизации.

2. Технология этанольного фракционирования донорской плазмы с последующим пепсинолизом полупродукта или его инкубацией в кислой среде позволяет получать иммуноглобулиновые препараты, пригодные для внутривенного введения и содержащие антитела к третьему, четвёртому доменам протективного антигена, а также к летальному фактору сибиреязвенного микроба.

3. Образцы внутривенного иммуноглобулина при профилактическом и лечебном применении в эксперименте обладают защитным эффектом, сравнимым с действием гипериммунного лошадиного противосибиреязвенного препарата.

Апробация работы

Диссертация апробирована на расширенной научно-лабораторной конференции ФГУ «Кировский НИИ гематологии и переливания крови Росмедтехнологий» 22.05.08 г.

Основные результаты работы доложены на научной конференции «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (г. Киров, 2005 г.), научно-практической конференции молодых учёных «Вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (г. Киров, 2007 г.), Российской научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (г. Санкт-Петербург, 2007 г.) и Всероссийском совещании «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины (Епифановские чтения)» (г. Киров, 2008 г.).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 15 работ.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 105 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, трёх глав с изложением результатов собственных исследований, заключения и выводов. Список литературы включает 119 источников, из них 75 отечественных и 44 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 22 рисунками и 21 таблицей.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Иммунизация доноров коммерческими сибиреязвенными вакцинами разрешена Государственным научно-исследовательским институтом стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. JI.A. Тарасевича (письмо № 81-07/47 от 12.03.01 г.). Кадровым донорам станции переливания крови КНИИГиПК, давшим письменное информированное согласие на вакцинацию и прошедшим медицинский осмотр, вводили «Вакцину сибиреязвенную комбинированную сухую и жидкую для подкожного применения» серии 1/02 или 5/02 производства ЦНИИ МО. Всего иммунизирован 61 донор. При ревакцинации использовали «Вакцину сибиреязвенную живую сухую для подкожного и скарификационного применения» серии 185 производства ЦНИИ МО. Всего ревакцинировано 8 доноров. Вакцины вводили однократно подкожно в объёме 0,5 мл.

Содержание антител в сыворотке крови людей, а также в технологических белковых растворах, концентратах иммуноглобулинов и в иммуноглобулиновых препаратах определяли методом непрямого гетерогенного иммуноферментного анализа (ИФА) с применением «Тест-системы иммуноферментной для определения титров антител к протективному антигену сибиреязвенного микроба в сыворотке крови человека», разработанной сотрудниками ЦНИИ МО. Доноров допускали к плазмодаче на основании приказа Минздрава РФ № 364 от 14.09.01 г. Плазму заготавливали методом плазмафереза. Хранение плазмы осуществляли в соответствии с приказами Минздрава РФ № 193 от 07.05.03 г. и Минздравсоцразвития РФ № 147 от 21.02.05 г.

В лабораторном опыте фракционирования использовали 9 порций иммунной плазмы общим объёмом 2745 мл. Белковые фракции разделяли по технологии, описанной в «Типовом комплексном регламенте производства белковых препаратов плазмы донорской крови» (утв. зам. министра

здравоохранения СССР 21.12.79 г.). Фракцию В растворяли в 0,9 % водном растворе хлорида натрия, диализовали и стерилизовали фильтрацией. В результате эксперимента получено 40 мл концентратов иммуноглобулинов. Экспериментально-производственные серии ВВИГ получены из 172 л иммунной плазмы: 2 серии общим объёмом 1,7 л по технологии пепсинолиза [Сапожникова B.C., Шарыгин C.JL, 1996 г.] (серии № 1 и № 2) и одна серия объёмом 1,8 л по технологии инкубации в кислой среде [Алёшкин В.А., Лютов А.Г., 1998 г.] (серия № 3). Из 400 г фракции Б, выделенной при производстве серий № 1 и № 2, получены две экспериментальные серии комплексного иммуноглобулинового препарата (КИП) общим объёмом 250 мл по технологии извлечения иммуноглобулинов из фракции Б [Алёшкин В.А. и соавт., 1997 г.] (серии № 4 и № 5). Пять образцов препарата серии № 3 лиофилизировали.

Физико-химические, химические, биохимические, иммунохимические и биологические параметры концентратов иммуноглобулинов и иммуноглобулиновых препаратов определяли, в основном, в соответствии с МУК 4.1/4.2.588-96. Концентрацию мальтозы устанавливали по методике, описанной в Государственной фармакопее (ГФ XI). Анализ молекулярных параметров проводили методом эксклюзионной колоночной хроматографии с использованием сефакрила S-300. Антикомплементарную активность (АКА) серий № 1 и № 2 определяли в соответствии с МУК 3.3.2.1063-01, серии № 3 - по ФСП 42-0194488403. Содержание IgG, IgA, IgM оценивали методом радиальной иммунодиффузии в геле. Контроль на наличие HBsAg, антител к ВИЧ, вирусу гепатита С и возбудителю сифилиса проводили методом ИФА с использованием коммерческих тест-систем.

С целью изучения спектра антител в иммуноблоттинге осуществляли электрофорез антигенных детерминант В. anthracis, полученных сотрудниками ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ГНЦ ПМБ), в 10 % полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. После электрофореза разделённые фракции переносили на нитроцеллюлозную мембрану «Hybond-

ECL» («Amersham», США). Антитела визуализировали с помощью пероксидазы и диаминобензидина.

Спектр антител в непрямом гетерогенном ИФА оценивали по стандартной методике с использованием полученных ранее антигенов (ГНЦ ПМБ), пероксидазы и орто-фенилендиамина.

Токсиннейтрализующую активность иммуноглобулиновых препаратов определяли в стандартном МТТ-тесте на культуре клеток J774A.1 с использованием компонентов сибиреязвенного экзотоксина, выделенных специалистами ГНЦ ПМБ.

Индекс превентивных свойств (ПС) концентрата иммуноглобулинов изучали в эксперименте на молодых белых беспородных мышах обоего пола массой от 10 до 12 г. Животным опытной группы вводили внутрибрюшинно по 0,5 мл исследуемого раствора, первой контрольной группы - по 0,5 мл стерильного 0,9 % водного раствора хлорида натрия. Животных второй контрольной группы оставляли интактными. Через 3 - 3,5 часа осуществляли подкожное заражение животных опытной и второй контрольной групп тест-дозой спор штамма СТИ-1 В. anthracis в объёме 0,2 мл. Результаты учитывали через 4 суток.

Профилактическую эффективность ВВИГ оценивали на 18 беспородных морских свинках обоего пола массой от 250 до 300 г. Животным опытной группы вводили подкожно по 4 мл исследуемого образца, морским свинкам группы сравнения - по 2 мл «Глобулина противосибиреязвенного лошадиного жидкого» серии 33 производства ЦНИИ МО. Животных контрольной группы оставляли интактными. Через 24 часа осуществляли подкожное заражение животных всех трёх групп 50 LD50 культуры тест-штамма 71/12 Я anthracis в объёме 1 мл. За животными наблюдали в течение 10 суток от момента заражения. Специфичность гибели животных в течение срока наблюдения определяли путём высева отпечатков паренхиматозных органов (печени, селезенки) на чашки с плотной питательной средой Хоттингера с последующей микроскопической оценкой выросших колоний.

Терапевтическую эффективность ВВИГ изучали в остром опыте на 38 кроликах. В экспериментах использовали животных массой от 2,0 до 2,5 кг, беспородных, обоего пола. Для подкожного заражения животных применяли дозы 10 и 100 LD5o тест-штамма 4-7 В. anthracis в объёме 1 мл. Лечение животных начинали через 24 ч после заражения. Количество вводимых препаратов рассчитывали на основании максимальных рекомендованных для человека терапевтических доз и коэффициента отношения массы и поверхности тела человека и кролика. ВВИГ вводили внутривенно 1 раз в сутки, «Глобулин противосибиреязвенный лошадиный жидкий» серии 33 производства ЦНИИ МО - внутримышечно 1 раз в сутки, антибиотик -внутримышечно 2 раза в сутки. Лечение продолжали в течение 5 суток. Специфичность гибели животных определяли, как описано выше.

Статистический анализ проводили с использованием программ «Excel» («Microsoft», США) и «Biostat» (McGraw Hill). Принятое значение уровня значимости равно 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Установление достаточного уровня антител в противосибиреязвенном внутривенном иммуноглобулине и иммунной плазме

Высоким уровнем противосибиреязвенного иммунитета является 75 % выживаемость при инфицировании, что соответствует индексу ПС 0,4 [Бургасов П.Н. и соавт., 1965, Бургасов П.Н. и соавт., 1972]. При этом существует строгая корреляция между ПС и уровнем антител к ПА: индекс 0,4 соответствует титру 1:1600 5 % белкового раствора [Елагин Г.Д. и соавт., 1997]. Следовательно, минимальным содержанием антител в противосибиреязвенном ВВИГ, номинальная концентрация белка в котором равна 5 %, можно считать титр 1:1600.

Для оценки возможности получения препарата, обладающего достаточной активностью, был проведён лабораторный опыт выделения антител к ПА В. аЫкгаЫз из иммунной плазмы. Для эксперимента случайным образом было отобрано 9 порций субстанции общим объёмом 2745 мл, заготовленной от пяти доноров, иммунизированных сухой формой комбинированной сибиреязвенной вакцины. Целевые антитела в ходе предварительных исследований специфической активности крови доноров были выявлены в титре не ниже 1:400.

На каждой стадии фракционирования отбирали образцы технологических растворов, в которых определяли содержание целевых антител и концентрацию белка. Усреднённые результаты исследования представлены в табл. 1. В связи с вариабельностью концентрации белка в образцах, с целью корректного сравнения специфической активности, был вычислен удельный показатель - приведённый титр - частное обратного титра раствора и концентрации белка в процентах.

Таблица 1

Специфическая активность технологических растворов на этапах _фракционирования иммунной плазмы_

Технологический раствор Средний обратный титр Средняя концентрация белка, % Средний приведённый титр

Фильтрат плазмы 467 4,1 112

Супернатант А8 429 3,6 122

Супернатант А нет 2,4 нет

Супернатант А, нет 0,3 нет

Супернатант Б нет 0,4 нет

Супернатант В нет 0,0 нет

Концентрация белка при осаждении фракции А8 уменьшалась в среднем на 12,2 %, при этом приведённый титр растворов увеличивался на 9 %, что свидетельствует о почти полном переходе антител к ПА в полупродукт супернатант А8. Целевые антитела в супернатанте А не были обнаружены, несмотря на значимую концентрацию белка в образцах, что

является доказательством их полного осаждения в полупродукте - фракции А. В полупродукте супернатанте Б, а также в отходах - супернатантах А! и В -антитела не удалось обнаружить вследствие предельно низкой концентрации белка.

Полученные концентраты иммуноглобулинов визуально были оценены как бесцветные, слабо опалесцирующие. В иммуноэлектрофорезе (ИЭФ) выявлена интенсивная дуга преципитации [§С и дополнительная дуга преципитации альбумина; в электрофорезе (ЭФ) - в среднем 94,4 % фракции у-глобулинов и 5,6 % фракции альбумина. Средний приведённый титр образцов в 2,3 раза превышал аналогичный показатель исходной плазмы. Результаты опыта позволяют сделать заключение о стабильности антител к ПА В. агаИгаск в процессе фракционирования иммунного сырья.

Индекс ПС одного из концентратов иммуноглобулинов, содержащего 9,9 % белка и антитела к ПА В. аЫкгас'к в титре 1:3200, что эквивалентно титру 1:1600 5 % раствора, составил 0,4. Таким образом, проведенное исследование продемонстрировало наличие принципиальной возможности получения противосибиреязвенного ВВИГ, обладающего достаточной активностью.

Опыт разработки ВВИГ различной специфичности свидетельствует, что целевые антитела в процессе производства концентрируются не менее чем в 4 раза [Шарыгин С.Л., 1997, Мальцева О.В., 2002]. Следовательно, минимальным уровнем антител к ПА в иммунной плазме, содержание белка в которой также примерно равно 5 %, следует считать титр 1:400.

Характеристика экспериментальных серий противосибиреязвен-ных иммуноглобулиновых препаратов человека

Из иммунной плазмы с применением 3 различных технологических приёмов было получено 5 экспериментальных серий противосибиреязвенных иммуноглобулиновых препаратов человека. Их основные параметры представлены в табл. 2.

Основные параметры противосибиреязвенных иммуноглобулиновых препаратов человека

Параметр Серия № 1 Серия № 2 Серия № 3 Серия № 4 Серия № 5

Концентрация белка, % 5,3 5,4 4,5 6,9 7,4

Содержание антител к ПА В. агйЪгасхь, титр 1:1600 1.1600 1:3200 1:1600 1:800

Фракционный состав в ИЭФ Интенсивная дуга преципитации ígG с расщеплением ДО, 1&А - -

Фракционный состав в ЭФ, %: - а2-глобуяины, - ¡3-глобулины, - у-глобулины. 0 0 100 0 0 100 0 0 100 2,5 24,8 72,7 8,5 24,5 67,0

Молекулярные параметры, % - полимеры, - димеры; - мономеры, - фрагменты 0,0 5,8 79,7 14,5 0,0 3,3 84,9 11,8 0,0 4,9 94,7 0,4 - -

АКА 1 мг белка потребляет 0 СНда 2 СН50 сохраняют активность в присутствии 10 мг белка - -

Содержание иммуноглобулинов, "г/мт - - - 31,3 8,8 7,5 10,5 18,5 6,1

Препараты серий № 1, № 2 и № 3 представляли собой бесцветные, прозрачные, стерильные, апирогенные, нетоксичные растворы со сниженной АКА, свободные от маркёров основных гемотрансмиссивных инфекций. Белковых примесей по результатам ИЭФ (рис. 1) и ЭФ не выявлено, полимеры не обнаружены (рис. 2). Таким образом, параметры серий № 1, № 2 и № 3 удовлетворяли требованиям, предъявляемым к ВВИГ. Специфическая активность препаратов достигла эффективного уровня.

Рисунок 1. Иммуноэлектрофореграмма иммуноглобулинового препарата

серии № 1

Примечание.

Катод слева, анод справа.

В траншеях антисыворотка кролика к белкам сыворотки крови человека.

В лунках:

1 - сыворотка крови человека;

2 - иммуноглобулиновый препарат серии № 1.

Объем элюата, мл Рисунок 2. Хроматограмма иммуноглобулинового препарата серии № 3

Препараты серий № 4 и № 5 представляли собой стерильные растворы, свободные от маркёров основных гемотрансмиссивных инфекций. Соотношение иммуноглобулинов трёх основных классов (^0 : ^М : 1§А) составило 4 : 1 : 1 в серии № 4 и 1,5 : 3 : 1 в серии № 5. Основные параметры препаратов удовлетворяли требованиям, предъявляемым к иммуноглобулинам для энтерального применения.

Хранение образцов ВВИГ более 30 месяцев при температуре от 2 до 6 °С не вызвало снижения специфической активности, что свидетельствует о высокой стабильности антител к ПА. В процессе лиофилизации внутривенного иммуноглобулина содержание целевых антител изменений также не претерпело. Это указывает на наличие принципиальной возможности получения препарата в сухой лекарственной форме.

Определение условий заготовки и хранения иммунного сырья

Комбинированная вакцина была выбрана для иммунизации доноров как наиболее иммуногенная и наименее реактогенная из всех типов вакцин, выпускаемых в настоящее время. Доноры по мере прохождения медицинского осмотра были разделены на две группы численностью 38 и 23 человека. В первой группе применяли сухую форму вакцины, во второй -жидкую. Срок наблюдения составил 20 недель. Целевые антитела не были выявлены у 8 доноров (13 %); в крови ещё 11 иммунизированных (18 %) антитела к ПА были зарегистрированы на уровне, не достаточном для получения иммунной плазмы. Характеристика специфической активности сыворотки крови доноров, ответивших целевой антителопродукцией на вакцинацию, представлена в табл. 3. На основании полученных результатов можно заключить, что продолжительность циркуляции антител к ПА в крови и доля иммунологически активных доноров достаточны для организации заготовки иммунного сырья.

Суммарная длительность и средний срок первой регистрации антител к ПА В. ашкгат в титре 1:400 или выше были сопоставимы в обеих группах. Относительное количество доноров с высоким содержанием целевых антител различалось статистически незначимо (р = 0,446 на основании расчёта критерия т). Следовательно, для иммунизации допустимо применять как сухую, так жидкую форму вакцины.

Различия в иммунологической активности мужчин и женщин признаны статистически незначимыми на основании расчёта критерия %2

(р = 0,497). Таким образом, с целью получения плазмы для изготовления противосибиреязвенных иммуноглобулиновых препаратов человека рационально иммунизировать доноров обоего пола любой формой комбинированной сибиреязвенной вакцины, а первую явку для исследования специфической активности крови назначать через 5 недель после вакцинации.

Таблица 3

Характеристика специфической активности сыворотки крови доноров, ответивших целевой антителопродукцией _на вакцинацию комбинированной сибиреязвенной вакциной_

Показатель Сухая форма вакцины Жидкая форма вакцины

Первая регистрация антител к ПА в титре 1:400, недели после вакцинации 5 6

Суммарная продолжительность регистрации титра 1:400 или более высокого, недели 10 10

Относительное количество доноров, содержание антител к ПА в крови которых достигло титра 1:400, % 74 61

Ревакцинацию провели восьми донорам первой группы через 13-14 месяцев после первичной иммунизации. Уже через неделю целевые антитела были зарегистрированы в титре 1:800. Динамику специфической активности крови можно описать как постепенное снижение титров. Суммарная продолжительность циркуляции антител на достаточном уровне составила 35 недель. Следовательно, ревакцинация доноров позволяет значительно расширить сырьевую базу для получения противосибиреязвенных иммуноглобулиновых препаратов.

С целью определения стабильности антител к ПА в процессе хранения плазмы, образцы сыворотки иммунизированных доноров со значимой специфической активностью замораживали, а затем выдерживали при температуре не выше минус 30 °С. По истечении 6, 9, 12 или 20 месяцев в сыворотке повторно определяли содержание целевых антител. Всего исследовано 28 образцов, из них 21 с исходным титром 1:800 и 7 с исходным

титром 1:400. Через 6, 9 и 12 месяцев среднее содержание целевых антител сохранялось на исходном уровне. Снижение специфической активности зарегистрировано через 20 месяцев хранения сыворотки, причём во всех случаях падение титров было равно одному шагу разведения в ИФА. Путём расчёта парного критерия Стьюдента уменьшение содержания антител к ПА через 20 месяцев признано статистически значимым (р = 0,016 для исходного титра 1:800 и р = 0,000 для исходного титра 1:400). Следовательно, срок хранения иммунного сырья не должен превышать 1 год после заготовки при температуре не выше минус 30 °С.

Изучение биологических свойств противосибиреязвенных иммуноглобулиновых препаратов человека

Методом иммуноблоттинга в препаратах всех серий выявлены антитела к ПА, а также к его третьему и четвёртому доменам (рис. 3). В ИФА дополнительно показано наличие антител к летальному фактору В. апМгайя.

12 3 4

шмЧ» - 170 Ш,

ШШ] - 1э:>кД

....

;

. I -2бкд

Рисунок 3. Иммуноблот противосибиреязвенного иммуноглобулинового препарата человека

Примечание. Дорожки:

1 - ПА;

2 - третий домен ПА;

3 - четвёртый домен ПА;

4 - маркёры молекулярной массы. Справа указаны величины молекулярных масс

маркерных белков.

Токсиннейтрализующей активностью in vitro также обладали все экспериментальные образцы препаратов (рис. 4). Первая, вторая и четвёртая серии в разведении 1:5 нейтрализовали летальный токсин практически полностью, а серии № 3 и № 5 - примерно на 140 %. Данный феномен можно объяснить активацией или ингибированием клеточных процессов по Fc-рецепторному механизму. Связываясь с рецепторами типа FcyRII, специфичными к иммунным комплексам, кластер молекул «антиген -антитело» мог интенсифицировать, например, синтез и экскрецию цитокинов или, напротив, блокировать реакции апоптоза, повышая тем самым процент выживших клеток. Серии № 1, № 2 и № 4 аналогичного влияния не оказывали, видимо, вследствие частичного нарушения эффекторных функций молекул IgG.

200% 180? it | 160% | 140?« g 120% | 100?« I 80% |, 60% % 40%

М 20% 0%

1:160 1:80 1:40 1:20 1:10 1:5 Разведение

—♦—Серии №№ 1 и 2 -»—Серия № 3 -в-Серия № 4 -*-Серия № 5

Рисунок 4. Кривые нейтрализации летального токсина противосибиреязвенными иммуноглобулиновыми препаратами человека

В табл. 4 представлены результаты оценки профилактической эффективности противосибиреязвенного ВВИГ на морских свинках. Номинальная концентрация белка в лошадином глобулине составляет 10 %, а в иммуноглобулине человека - 5 %, поэтому последний был применён в

удвоенной дозировке. Его эффективность была несколько ниже, чем у препарата сравнения (50 % выживших морских свинок против 67 %), однако расчёт точного критерия Фишера позволил сделать заключение, что зарегистрированные различия не являются статистически значимыми (р = 1,000).

Таблица 4

Профилактическая эффективность противосибиреязвенного внутривенного _иммуноглобулина человека__

Группа животных Количество морских свинок Относительное количество выживших животных через 10 суток после заражения, %

взятых в опыт павших выживших

Опытная (4 мл ВВИГ подкожно, через 24 ч 50 ЬО50 штамма 71/12 в 1 мл подкожно) 6 3 3 50

Сравнения (2 мл лошадиного глобулина подкожно, через 24 ч 50 1Л)5о штамма 71/12 в 1 мл подкожно) 6 2 4 67

Контрольная (50 ЬО50 штамма 71/12 в 1 мл подкожно) 6 6 0 0

Сходные результаты были получены при экспериментальной оценке эффективности применения ВВИГ в качестве средства монотерапии на кроликах (табл. 5). Введённая доза сибиреязвенного микроба моделировала инфекционный процесс средней степени тяжести, приводящий к 100 % гибели животных в течение 15 суток. Курс лечения иммуноглобулином для внутривенного введения снизил смертность на 33 %, а лошадиным глобулином - на 50 %. На основании расчёта точного критерия Фишера различия в доле выживших кроликов также признаны статистически незначимыми (р = 1,000).

Лечебная монотерапевтическая эффективность противосибиреязвенного _внутривенного иммуноглобулина человека_

Группа животных Количество кроликов Относительное количество выживших животных через 15 суток после заражения, %

взятых в опыт павших выживших

Опытная (10 ЬБ50 штамма 4-7 в 1 мл подкожно; через 24,48, 72, 96, 120 ч 2,4 мл ВВИГ внутривенно) 6 4 2 33

Сравнения (10 ЬО50 штамма 4-7 в 1 мл подкожно; через 24,48, 72, 96, 120 ч 1,2 мл лошадиного глобулина внутримышечно) 6 3 3 50

Контрольная (10 1Т>5о штамма 4-7 в 1 мл подкожно) 6 6 0 0

Применение ВВИГ в комплексе с антибиотиком было более эффективно, чем использование комбинации внутримышечного лошадиного глобулина с антибактериальным препаратом (табл. 6). Заражающая доза моделировала тяжёлую форму сибиреязвенной инфекции, вызывающую летальный исход у 100 % кроликов в течение 5 суток. На 30 сутки после заражения относительное количество выживших животных в опытной группе составило 60 %. Такой же результат был зарегистрирован в первой группе сравнения. Во второй группе сравнения выжило 20 % животных. По-видимому, более выраженная эффективность комбинации иммуноглобулина для внутривенного введения с ампициллином обусловлена хорошо известным и применяемым на практике синергизмом действия ВВИГ и антибиотиков [Козлов В.К., 2006].

Лечебная эффективность противосибиреязвенного внутривенного

иммуноглобулина человека в комплексной терапии с антибиотиком

Группа животных Количество кроликов Относительное количество выживших животных через 30 суток после заражения, %

взятых в опыт павших выживших

Опытная (100 LD50 штамма 4-7 в 1 мл подкожно; через 24, 48, 72, 96, 120 ч 2,4 мл ВВИГ внутривенно, через 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108,120, 132 ч 560 мг ампициллина внутримышечно) 5 2 3 60

Первая сравнения (100 LD50 штамма 4-7 в 1 мл подкожно; через 24, 48, 72, 96, 120 ч 1,2 мл лошадиного глобулина внутримышечно, через 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120, 132 ч 560 мг ампициллина внутримышечно) 5 2 3 60

Вторая сравнения (100 LD50 штамма 4-7 в 1 мл подкожно; через 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120, 132 ч 560 мг ампициллина внутримышечно) 5 4 1 20

Контрольная (100 LD50 штамма 4-7 в 1 мл подкожно) 5 5 0 0

Результаты проведённых исследований свидетельствуют о достаточно высокой эффективности экспериментальных образцов противосибиреязвенного ВВИГ, сопоставимой с защитными свойствами лошадиного

глобулина. Вместе с тем, потенциал аллогенного препарата значительно выше, чем гетерогенного: максимальная разовая доза ВВИГ составляет 2 г белка на 1 кг массы тела, то есть в среднем около 2800 мл 5 % раствора, в то время как допустимый объём инъекции лошадиного глобулина, лимитированый способом введения и, главным образом, гетерогенной природой препарата, может составлять не более 100 мл 10 % белкового раствора. Максимальная курсовая доза ВВИГ достигает 14 л в пересчёте на 10 % белка, в то время как лошадиного глобулина - только 400 мл. Таким образом, перспективность противосибиреязвенного внутривенного иммуноглобулина человека сомнений не вызывает.

Автор благодарен всем сотрудникам лаборатории препаратов крови КНИИГиПК (руководитель - к.б.н. A.B. Дробкова), станции переливания крови КНИИГиПК (главный врач - В.К. Куноф), сотрудникам ЦНИИ МО (начальник - д.м.н. И.В. Борисевич), с.н.с. ФГУН «ГНЦ прикладной биотехнологии и микробиологии» к.б.н. Е.В. Беловой, с.н.с. ФГУН «МНИИ эпидемиологии и микробиологии» д.б.н. А.Г. Лютову за участие в работе.

выводы

1. Впервые показана принципиальная возможность концентрации антител человека к протективному антигену В. anthracis (заявка на патент РФ № 2006129089/20/03/608). Минимальным защитным уровнем антител во внутривенном иммуноглобулине является титр 1:1600 по результатам иммуноферментного анализа, а в исходной плазме - 1:400.

2. Однократная иммунизация доноров сухой или жидкой формой комбинированной сибиреязвенной вакцины обеспечивает циркуляцию антител к протективному антигену на значимом уровне у 69 % людей. Заготовка иммунной плазмы возможна с 5 недели после вакцинации. Антитела стабильны в процессе хранения сырья в течение 12 месяцев при температуре не выше минус 30 °С.

3. По технологии этанольного фракционирования донорской плазмы получены экспериментальные образцы противосибиреязвенных иммуноглобулинов человека. Препараты, произведённые с применением пепсинолиза и инкубации в кислой среде, содержат антитела к протективному антигену В. anthracis в титре 1:1600 и 1:3200 соответственно и отвечают требованиям, предъявляемым к внутривенным иммуноглобулинам. Препарат для энтерального применения, полученный с применением метода извлечения иммуноглобулинов из фракции Б, содержит целевые антитела в титре не менее 1:800.

4. Экспериментальные серии иммуноглобулинов, полученные с применением 3 различных технологических приёмов, содержат антитела к третьему и четвёртому доменам протективного антигена, а также к летальному фактору сибиреязвенного микроба. Препараты обладают токсиннейтрализующей противосибиреязвенной активностью in vitro.

5. В экспериментах на животных доказана высокая профилактическая и лечебная эффективность внутривенного иммуноглобулина, сопоставимая с защитным эффектом, оказываемым гипериммунным лошадиным глобулином.

ПУБЛИКАЦИИ

1. Долматов В.Ю., Блинова Е.А., Дробкова A.B., Карпова М.В. Изучение влияния процесса фракционирования плазмы на специфическую активность антител человека к протективному антигену сибиреязвенного микроба: Материалы научно-практической конференции молодых учёных «Вопросы трансфузиологии и клинической медицины». - Киров, 2007. -С. 30-31.

2. Долматов В.Ю., Блинова Е.А., Дробкова A.B., Карпова М.В., Шевцов А.Н., Боровской Д.В. Опыт выделения иммуноглобулинов из донорской плазмы, содержащей антитела к протективному антигену сибиреязвенного микроба: Сборник научно-практических работ «Производственная и клиническая трансфузиология: реальность и перспективы». - Воронеж, 2007. - С. 85 - 86.

3. Долматов В.Ю., Дробкова A.B., Карпова М.В., Мальцева О.В., Шевцов А.Н., Боровской Д.В. Гуморальный иммунный ответ доноров плазмы на комбинированную сибиреязвенную вакцину // Трансфузиология. - 2007. -Т. 8, № 1 - 2. - С. 41 -42.

4. Долматов В.Ю., Дробкова A.B., Карпова М.В., Шевцов А.Н., Боровской Д.В. Гуморальный иммунный ответ доноров на комбинированную сибиреязвенную вакцину // Проблемы гематологии и переливания крови. -2005. -№3.- С. 43-44.

5. Долматов В.Ю., Дробкова A.B., Карпова М.В., Шевцов А.Н., Боровской Д.В. Изучение стабильности содержания антител к протективному антигену Вас. anthracis в сыворотке крови доноров: Сборник «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины». - Киров, 2005. -С. 152- 153.

6. Долматов В.Ю., Дробкова A.B., Лютов А.Г., Мальцева О.В., Шевцов А.Н., Боровской Д.В., Елагин Г.Д., Карпова М.В., Вершинина O.A., Блинова Е.А., Шарыгин C.JI. Возможность получения противосибиреязвенного иммуноглобулина человека для внутривенного введения // Проблемы особо опасных инфекций. - 2008. - № 2. - С.39 - 42.

7. Долматов В.Ю., Дробкова A.B., Мальцева О.В., Блинова Е.А., Шарыгин С.Л., Лютов А.Г., Вершинина O.A., Карпова М.В., Князев М.Г., Шалагинова Т.Д., Гребенева Г.А., Шевцов А.Н., Боровской Д.В. Противосибиреязвенный внутривенный иммуноглобулин человека: Сборник «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины». - Киров, 2008.-С. 27-28.

8. Долматов В.Ю., Дробкова A.B., Мальцева О.В., Вершинина O.A., Карпова М.В., Шалагинова Т.Д., Шевцов А.Н., Боровской Д.В. Влияние ревакцинации на содержание антител к протективному антигену Вас. anthracis в сыворотке крови иммунизированных доноров: Сборник трудов юбилейной научно-практической конференции «Специализированная медицинская помощь», посвящённой 75-летию медицинской службы и 10-летию госпиталя ГУВД Свердловской области. - Екатеринбург: Издательство Уральского университета, 2005. - С. 620 - 622.

9. Долматов В.Ю., Дробкова A.B., Мальцева О.В., Вершинина O.A., Карпова М.В., Шалагинова Т.Д., Шевцов А.Н., Боровской Д.В. Изучение содержания антител к протективному антигену Вас. anthracis в сыворотке крови иммунизированных доноров: Сборник «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины». - Киров, 2005. - С. 148 - 151.

10. Долматов В.Ю., Дробкова A.B., Мальцева О.В., Карпова М.В., Вершинина O.A., Шалагинова Т.Д., Шевцов А.Н., Елагин Г.Д., Боровской Д.В., Лютов А.Г., Шарыгин С.Л. Тактика заготовки сырья для получения внутривенного противосибиреязвенного иммуноглобулина человека // Вестник Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова. - 2007. - № 3. - С. 124 - 131.

11. Долматов В.Ю., Дробкова A.B., Мальцева О.В., Шарыгин С.Л. Изучение стабильности основных параметров противосибиреязвенного внутривенного иммуноглобулина человека: Сборник «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины». - Киров, 2008. - С. 26 - 27.

12. Долматов В.Ю., Дробкова A.B., Погорельский И.П., Мальцева О.В., Шевцов А.Н., Елагин Г.Д., Белова Е.В., Боровской Д.В., Карпова М.В., Вершинина O.A., Блинова Е.А., Лютов А.Г., Шарыгин С.Л. Фармацевтическая разработка противосибиреязвенного внутривенного иммуноглобулина человека // Успехи современного естествознания. - 2008. - № 5. - С. 96 - 98.

13. Долматов В.Ю., Карпова М.В. Оценка возможности определения содержания антител человека к протективному антигену Bacillus anthracis в концентрированных белковых растворах методом иммуноферментного анализа // Трансфузиология. - 2007. - Т. 8, № 1 - 2. -С. 42-43.

14. Дробкова A.B., Мальцева О.В., Блинова Е.А., Шалагинова Т.Д., Шарыгин С.Л., Долматов В.Ю., Дармов И.В., Шевцов А.Н., Боровской Д.В. Получение и оценка протективных свойств противосибиреязвенного концентрата иммуноглобулина человека // Трансфузиология. - 2007. - Т. 8, № 1 -2.-С. 43.

15. Мостовская Е.В., Лютов А.Г., Долматов В.Ю., Дробкова A.B., Соловьёв А.Ф., Карпова М.В., Мальцева О.В., Блинова Е.А., Бочкарёва С.С., Тюриков Ю.М. Габриглобин как основа создания специфических иммуноглобулинов для внутривенного введения: Материалы научно-практической конференции молодых учёных «Вопросы трансфузиологии и клинической медицины». - Киров, 2007. - С. 39 - 41.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Долматов, Владимир Юрьевич

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Эпидемиология и этиопатогенез сибиреязвенной инфекции.

1.2. Клинические проявления сибирской язвы и лечение инфицированных людей.

1.3. Технологические аспекты получения препаратов па основе иммуноглобулинов человека для лечения инфекционных заболеваний.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Материалы исследования.

2.2. Технологические приёмы выделения иммуноглобулинов из донорской плазмы

2.3. Технология заготовки иммунной плазмы.

2.4. Методы определения физико-химических, химических, биохимических, иммунохимических и биологических параметров препаратов.

2.5. Методы экспериментальной оценки превентивных свойств, профилактической и лечебной эффективности.

2.6. Статистический анализ.

Результаты исследования и их обсуждение.

Глава 3. Получение противосибиреязвепных иммуноглобулиновых препаратов человека.

3.1. Изучение стабильности антител к протективному антигену сибиреязвенного микроба в процессе фракционирования плазмы.

3.2. Установление уровня антител в иммунном сырье, достаточного для получения специфичных иммуноглобулинов.

3.3. Получение экспериментальных серий препаратов и определение их основных параметров.

Глава 4. Технологические приёмы заготовки иммунного сырья и определение условий его хранения.

4.1. Изучение гуморального ответа доноров на иммунизацию сибиреязвенными вакцинами.

4.2. Оценка стабильности специфической активности иммунной плазмы в процессе хранения.

Глава 5. Изучение биологических и защитных свойств иммуноглобулиновых препаратов.

5.1. Определение спектра антител к различным антигенным детерминантам сибиреязвенного токсина.

5.2. Оценка токсиннейтрализующей активности.

5.3. Изучение профилактической и лечебной эффективности внутривенного иммуноглобулина.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение противосибиреязвенных иммуноглобулиновых препаратов человека в эксперименте и изучение их биологических свойств"

Актуальность проблемы

Сибирская язва - тяжёлое инфекционное заболевание, внимание к которому и в России, и во всем мире в последнее время значительно возросло. Это связано, в первую очередь, с угрозой биотерроризма, уже нашедшей практическое воплощение на территории США [89, 103]. Споры возбудителя сибирской язвы — Bacillus anthracis - с точки зрения большинства представителей военных ведомств и ан гитеррористических организаций, на сегодняшний день представляют собой самое опасное самостоятельное биологическое оружие [58]. Кроме того, остаётся высокой вероятность возникновения эпидемий инфекции в результате активизации широко распространённых почвенных резервуаров сибиреязвенного микроба [53].

Основным средством лечения сибирской язвы в настоящее время являются антибактериальные препараты [52]. Однако даже при использовании антибиотиков последнего поколения, передовых методов диагностики и высокотехнологичного оборудования смертность при лёгочной форме инфекции достигает 45 % [108]. Проведение интенсивной химиотерапии может вызывать ряд неблагоприятных побочных эффектов вплоть до летального исхода вследствие масштабного высвобождения токсина при разрушении клеток возбудителя [83, 86]. Единственный антитоксический препарат — противосибиреязвенный лошадиный иммуноглобулин - предназначен для внутримышечного введения, поэтому его применение не позволяет достичь быстрого нарастания антител в крови реципиента до протективного уровня. Современная научная разработка, направленная на ферментативное расщепление молекул иммуноглобулина, содержащихся в препарате, и выделение иммунохимически чистых (РаЬ)2-фрагментов, может привести к созданию антитоксического лекарственного средства, пригодного для внутривенного введения [43]. Однако любые гетерогенные сывороточные препараты обладают сенсибилизирующими свойствами и способны вызывать у людей реакции анафилактического типа [70].

Центральным звеном в патогенезе сибирской язвы признан протективный антиген [84]. Выполняя функцию молекулы-переносчика, он является необходимым компонентом реализации цитотокснческих эффектов летального и отёчного токсинов [90]. Кроме того, протективный антиген в организме млекопитающих индуцирует образование антител, препятствующих развитию сибирской язвы, поэтому представляет собой перспективную антигенную детерминанту с точки зрения получения лечебных иммунобиологических препаратов [92, 101].

Мировой опыт разработки и применения специфичных внутривенных иммуноглобулинов человека свидетельствует об их высокой эффективности и ареактогснности при лечении тяжёлых инфекционных заболеваний различной этиологии [30, 42, 61, 70, 73, 77]. В связи с этим перспективным направлением решения актуальной проблемы лечения людей, заражённых сибирской язвой, является создание аллогенного антитоксического противосибиреязвенного иммуноглобулина, пригодного для внутривенного введения. Основой нового препарата могут стать антитела к протективному антигену В. ап^гасгБ.

Отечественные технологии получения внутривенных иммуноглобулинов предусматривают два варианта снижения антикомплементарной активности: либо ферментативную обработку полупродукта [33], либо его инкубацию в кислой среде [39]. Препараты, полученные с применением этих методов, содержат в то время как немаловажную роль в иммунной защите человека играют также плазменные ^М и 1§Д. Метод дополнительного извлечения иммуноглобулинов всех трёх классов из фракции Б позволяет получать комплексный препарат для энтерального применения.

Разработка нового лекарственного средства достаточно длительна и включает множество этапов, от лабораторных опытов изготовления экспериментальных образцов продукта до клинических испытаний препарата. При этом необходим комплексный подход к решению целого ряда задач.

Следовательно, актуальной проблемой является определение принципиальной возможности получения эффективных противосибиреязвенных препаратов на основе иммуноглобулинов человека.

Цель исследования — получение экспериментальных образцов противосибиреязвенных иммуноглобулиновых препаратов из плазмы крови человека и изучение их биологических свойств.

Задачи исследования

3. Получить из иммунной плазмы по трём различным технологическим схемам концентраты иммуноглобулинов, пригодные для внутривенного и энтерального применения, и определить их биохимические параметры.4. j Изучить спектр антител к различным антигенным детерминантам сибиреязвенного токсина и оценить токсиннейтрализующую активность полученных экспериментальных образцов препаратов in vitro.

Научная новизна

Впервые показана возможность получения аллогенного протпвосибиреязвеппого иммуноглобулина, пригодного для внутривенного введения, из плазмы иммунизированных допоров. По материалам исследования подана заявка на патент Российской Федерации «Иммуноглобулин человека противосибпреязвенный для внутривенного введения» 2006129089/20/03/608, приоритет от 10.08.06 г.

Установлен минимальный уровень антител к протективному антигену В. ап1кгас\8 в сырье для получения препарата. Охарактеризована динамика содержания антител в крови доноров, иммунизированных сибиреязвенными вакцинами. Оценена стабильность специфической активности плазмы при хранении.

Доказана профилактическая и лечебная эффективность внутривенного иммуноглобулина в эксперименте.

Практическая значимость работы

Определены требования к иммунному сырью и условия его хранения. Показана возможность использования трёх технологических схем выделения антител из донорской плазмы для получения противосибиреязвенных иммуноглобулиновых препаратов для внутривенного и энтералыюго применения.

Внедрение результатов исследования в практику

Отработана технология получения иммуноглобулина для внутривенного введения с применением метода инкубации в кислой среде, утверждён производственный регламент ПР-18756307-02-06.

Укомплектована технологическая линия производства специфичных внутривенных иммуноглобулинов человека в отделе препаратов крови ФГУ «КНИИГиПК Росмедтехнологий».

Основные положения, выносимые на защиту

1. Однократная вакцинация доноров комбинированной сибиреязвенной вакциной обеспечивает образование антител к протективному антигену В. аМкгаа'я в титре не менее 1:400 у 69 % людей. Заготовку иммунной плазмы целесообразно начинать с пятой недели после иммунизации.

2. Технология этанольного фракционирования донорской плазмы с последующим пепсннолизом полупродукта или его инкубацией в кислой среде позволяет получать иммуноглобулиновые препараты, пригодные для внутривенного введения и содержащие антитела к третьему, • четвёртому доменам протективного антигена, а также к летальному фактору сибиреязвенного микроба.

Апробация работы

Диссертация апробирована на расширенной научно-лабораторной конференции ФГУ «Кировский РЖИ гематологии и переливания крови Росмедтехнологий» 22.05.08 г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 15 работ.

Объем и структура диссертации

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Долматов, Владимир Юрьевич

ВЫВОДЫ

1. Впервые показана принципиальная возможность концентрации антител человека к протективному антигену В. anthracis (заявка на патент РФ № 2006129089/20/03/608). Минимальным уровнем антител во внутривенном иммуноглобулине является титр 1:1600 по результатам иммуноферментного анализа, в исходной плазме - 1:400.

4. Экспериментальные серии иммуноглобулинов, полученные с применением 3 различных технологических приёмов, содержат антитела к третьему и четвёртому доменам протективного антигена и к летальному фактору сибиреязвенного микроба. Препараты обладают токсиннейтрализующей противосибиреязвенной активностью in vitro.

5. В экспериментах па животных доказана высокая профилактическая и лечебная эффективность внутривенного иммуноглобулина, сопоставимая с защитным эффектом, оказываемым гипериммунным лошадиным глобулином.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время эпидемиологическая ситуация по сибирской язве остаётся неблагоприятной, что обусловлено угрозой активизации почвенных резервуаров возбудителя и осуществления актов биотерроризма с использованием спор В. аШкгаЫз [5, 53, 58]. Висцеральные формы инфекции приводят к летальному исходу в 100 % случаев [38]. Основным средством лечения людей, заражённых сибирской язвой, являются антибиотики [43]. В связи с высокой вероятностью стремительного развития висцеральной формы заболевания пациентам проводят интенсивный курс химиотерапии, пренебрегая возможными негативными побочными реакциями [52]. Однако, опыт отражения террористической атаки в 2001 г. в США показал недостаточную эффективность современных антибактериальных препаратов: летальность при лёгочной форме инфекции достигла 45 %, несмотря на использование передовых методов диагностики, высокотехнологичного медицинского оборудования и информированность общественности о чрезвычайной ситуации [11, 108]. Единственный специфичный препарат - противосибиреязвенный лошадиный глобулин - является гетерологичным и предназначен для внутримышечного введения. Его использование с большой вероятностью вызывает анафилактические реакции, а инъекционный способ применения не обеспечивает быстрого нарастания концентрации антител в крови реципиента до протектнвного уровня [26, 36, 42, 44, 54, 61, 70].

Патогенез сибирской язвы может быть остановлен путём блокирования одного из компонентов экзотоксина В. апШга™ - протектнвного антигена. Неслучайно большинство современных разработок лекарственных средств для борьбы с инфекцией призваны вызывать его дисфункцию [77, 81, 87, 88, 96, 97, 98, 105, 109, 114]. Опыт использования специфичных внутривенных иммуноглобулинов при лечении тяжёлых инфекций различной этиологии [42, 61, 70, 73, 77] свидетельствует о возможности решения актуальной проблемы лечения людей, заражённых сибирской язвой, путём разработки технологии получения противосибиреязвенного иммуноглобулина человека. Основой препарата могут стать антитела к протективному антигену В. ап&гас18. Представляется также перспективным получение комплексного пммуноглобул и нового препарата, содержащего антитела к протективному антигену и предназначенному для энтерального применения. Такое лекарство может быть эффективно за счёт содержания иммуноглобулинов не только класса в, но и классов М и А, а также за счёт способа введения, позволяющего доставлять антитела непосредственно к очагу поражения: перорально при гастроинтестинальной форме и накожно при кожной форме сибирской язвы.

В процессе сепарирования 9 порций плазмы, заготовленной от иммунизированных доноров, продемонстрирована стабильность антител к протективному антигену при фракционировании и доказана принципиальная возможность их концентрации. Потери специфической активности зарегистрированы только при осаждении фракции А8. Их величина составила 3 %. На остальных стадиях процесса переход целевых антител в отходы не зафиксирован. Полученные растворы иммуноглобулинов содержали антитела в среднем титре 1:2400, кратность их концентрации составила 2,3. В иммуноэлектрофорезе и электрофорезе выявлена незначительная примесь альбумина к основной фракции у-глобулинов (^О).

Высоким уровнем противосибиреязвенного иммунитета признана 75 % выживаемость, что соответствует индексу ПС 0,4 [14, 15]. Существует строгая корреляция между ПС и уровнем антител к ПА: индекс 0,4 соответствует титру 1:1600 5 % раствора [21]. Номинальная концентрация белка в ВВИТ также равна 5 %, следовательно, достаточным уровнем целевых антител в противосибиреязвенном препарате можно считать титр 1:1600. Значение индекса ПС раствора иммуноглобулинов, полученного в лабораторном опыте фракционирования иммунной плазмы и содержащего 9,9 % белка и антитела к ПА В. аШкгас18 в титре 1:3200, составило 0,4. Таким образом, показана принципиальная возможность получения эффективного противосибиреязвенного ВВИТ.

Опыт разработки технологии получения различных специфичных ВВИТ из иммунной плазмы свидетельствует, что целевые антитела в процессе производства концентрируются не менее чем в 4 раза [42, 70]. Следовательно, минимальным уровнем антител к ПА в иммунной плазме следует считать титр 1:400.

Из 172 л иммунной плазмы, заготовленной методом плазмафереза от иммунизированных доноров, по технологии этанольного фракционирования получено 5 экспериментальных серий иммуноглобулинов человека. Серии № 1 и № 2 произведены с применением пепсинолиза, серия № 3 — с применением инкубации в кислой среде, серии № 4 и № 5 - с применением извлечения иммуноглобулинов из фракции Б. Серии № 1, № 2 и № 3 соответствовали требованиям, предъявляемым к внутривенным препаратам, в том числе по антикомплементарной активности и вирусбезопасности, и содержали антитела к протектнвному антигену в титре 1:1600 - 1:3200. Опытная лиофилизация внутривенного иммуноглобулина не оказала влияния на уровень антител. Это доказывает принципиальную возможность получения противосибиреязвенного препарата в сухой лекарственной форме.

Специфическая активность по истечении более чем 30 месяцев хранения образцов не изменилась, что свидетельствует о высокой стабильности целевых антител. Например, активность внутривенного иммуноглобулина против клещевого энцефалита, антистафилококкового и противостолбнячного уменьшалась примерно вдвое в течение 24 месяцев [42, 61].

Серии № 4 и № 5 соответствовали требованиям, предъявляемым к иммуноглобулиновым препаратам для эптерального применения, в том числе по вирусбезопасности, и содержали антитела к протектнвному антигену В. аЫкгаыя в титре 1:800 - 1:1600. Отношение иммуноглобулинов трёх основных классов (^в : ^М : ^А) составило 4 : 1 : 1 в серии № 4 и 1,5 : 3 : 1 в серии № 5.

Для определения возможности заготовки иммунной плазмы изучен гуморальный ответ 61 донора на первичную иммунизацию комбинированной сибиреязвенной вакциной и 8 доноров на ревакцинацию живой вакциной. Целевые антитела на значимом уровне, го есть в титре 1:400 или более, выявлены у 69 % вакцинированных впервые людей. Этот показатель несколько ниже, чем установленный ранее для доноров противоклещевой плазмы (73 %) [42] и противодифтерийной (85 %) [73], но всё же достаточный для заготовки иммунного сырья. Иммунологически неактивными оказались 13 % доноров; у 18 % специфическая активность крови не достигла достаточного для заготовки иммунной плазмы уровня.

Значимый уровень целевых антител был зарегистрирован в среднем через 5 недель после вакцинации, что продолжительнее аналогичного периода времени развития активной антителопродукции доноров антисинегнойной (1 месяц) [37] и противодифтерийной плазмы (30 суток) [73]. Средняя суммарная продолжительность регистрации антител к протективному антигену в титре не менее 1:400 составила 10 недель. Статистически значимых различий между гуморальным иммунным ответом доноров на введение сухой или жидкой формы вакцины, а также между иммунореактивностью мужчин и женщин не выявлено.

Целевые антитела в крови ревакцинированных доноров на значимом уровне были зарегистрированы уже через неделю после введения вакцины. Суммарная продолжительность регистрации специфической активности, достаточной для получения иммунной плазмы, составила 35 недель. Таким образом, ревакцинация существенно расширяет сырьевую базу для изготовления противосибиреязвенных иммуноглобулиновых препаратов человека.

С целью определения стабильности антител к протективному антигену в процессе хранения плазмы образцы сыворотки иммунизированных доноров, специфическая активность которых была значимой, замораживали и выдерживали при температуре не выше минус 30 °С. По истечении не менее 6, 9, 12 или 20 месяцев сыворотку размораживали и определяли в ней содержание целевых антител. Всего исследовано 28 образцов, из них 21 с исходным титром

1:800 и 7 с исходным титром 1:400. Через 6, 9 и 12 месяцев среднее содержание целевых антител сохранялось на исходном уровне. Снижение специфической активности зарегистрировано через 20 месяцев хранения сыворотки, причём во всех случаях падение титров было равно одному шагу разведения, что не превышает ошибку метода ИФА. Путём расчёта парного критерия Стьюдента уменьшение содержания антител к протективному антигену через 20 месяцев признано статистически значимым. Следовательно, срок хранения иммунного сырья не должен превышать 1 год после заготовки при температуре не выше минус 30 °С.

Методами иммуноблоттиига и иммуноферментного анализа во всех 5 сериях препаратов выявлены антитела к летальному фактору, а также к третьему, и четвёртому доменам протективного антигена В. апЖгас18. Результаты исследования позволяют сделать заключение о возможной принадлежности антител к протективному антигену иммуноглобулинам всех трёх основных классов, а антител к летальному фактору - преимущественно 1§М.

Противосибиреязвенная токсиннейтрализующая активность на культуре чувствительных клеток выявлена для всех экспериментальных серий иммуноглобулинов. В разведении 1:5 серии № 1, № 2 и № 4 нейтрализовали летальный токсин почти полностью, а серии № 3 и № 5 показывали примерно 140 % результат. В литературе, посвящённой оценке токсиннейтрализующей активности моноклональных антител [11, 81, 96, 114], подобный эффект не описан. Данный феномен можно объяснить активацией или ингибированием клеточных процессов по Рс-рецепторному механизму. Связываясь с рецепторами типа РсуБШ, специфичными к иммунным комплексам, система молекул «антиген - антитело» могла интенсифицировать, например, синтез и экскрецию цитокинов или, напротив, блокировать реакции апоптоза, повышая тем самым процент выживших клеток. Серии № 1, № 2 и № 4 аналогичного влияния на клетки не оказывали, видимо, вследствие нарушения эффекторных функций молекул ^О.

В экспериментах па 18 морских свинках и 38 кроликах изучена профилактическая и лечебная эффективность внутривенного иммуноглобулина. По результатам опытов сделан вывод о сопоставимых защитных свойствах иммуноглобулинового препарата человека и лошадиного противосибиреязвенного глобулина. Перспективность применения аллогенного препарата обусловлена отсутствием анафилактической реакции у реципиента и высокой допустимой дозой введения.

Таким образом, в результате проведённого исследования получено 5 экспериментальных серий иммуноглобулинов человека, содержащих антитела к третьему и четвёртому доменам протективного антигена и к летальному фактору В. anthracis. Препараты нейтрализовали сибиреязвенный токсин in vitro и оказывали выраженный защитный эффект при заражении экспериментальных животных спорами различных штаммов В. anthracis. Параметры серий № 1, № 2 и № 3 соответствовали требованиям, предъявляемым к внутривенным препаратам, специфическая активность была стабильна при хранении образцов в течение 31 месяца и лиофилизации. Параметры серий № 4 и № 5 соответствовали требованиям, предъявляемым к комплексным иммуноглобулиновым препаратам для энтерального применения. Установлено минимальное и достаточное содержание целевых антител в противосибиреязвенном внутривенном иммуноглобулине и исходной плазме. Показано, что при заготовке иммунного сырья можно использовать сухую и жидкую форму комбинированной сибиреязвенной вакцины. Определён возможный период заготовки и условия хранения плазмы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Долматов, Владимир Юрьевич, Киров

1. Абалакин В. А. Применение иммунологической адсорбции в гетерогенном иммуноферментном анализе при определении антител к протективным детерминантам Bacillus anthracis II Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1987. - № 11. — С. 90-94.

2. Аверченков В.М., Палагин И.С. Внутривенные иммуноглобулины: механизмы действия и возможности клинического применения // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2004. -№ 3. - С. 273-281.

3. Алёшкин В.А., Борисова И.В., Быко-Янко Г.В. Способ получения иммуноглобулинового препарата для профилактики и терапии бактериальных и вирусных заболеваний // Патент RU 2084229.

4. Алешкин В. А., Лютов А.Г. Препарат иммуноглобулина для внутривенного введения и способ его получения // Патент RU 2122864.

5. Алёшкин В.А., Лютов А.Г., Афанасьев С.С. и др. Место иммуноглобулиновых препаратов в лечении и реабилитации инфекционных больных // Новые лекарственные препараты. 2003. -№ 4. - С. 6 - 32.

6. Анастасиев В.В. Иммуноглобулин для внутривенного введения. — Нижний Новгород: Издательство НГМА, 2000. 168 с.

7. Анастасиев В.В. Применение иммуноглобулинов. Нижний Новгород: Издательство НГМИ, 1993. - 27 с.

8. Ашмарин И.П., Воробьёв A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. — Л.: Государственное издательство медицинской литературы, 1962. — 180 с.

9. Бакулов И.А., Гаврилов В.А., Селиверстов В.В. Сибирская язва (антракс). Новые страницы в изучении старой болезни. Владимир: Посад, 2001.

10. Бектимиров Т.А. Иммунопрофилактика сибирской язвы // Вакцинация.2002. № 3. - С. 11.

11. Белова Е.В. Особенности иммунного ответа на протективный антиген и летальный фактор В. anthracis: подходы к созданию вакцины нового поколения: дис. канд. биол. наук: 03.00.07 / Белова Елена Валентиновна. Оболенск, 2006. - 145 с.

12. Бесядовский P.A., Иванов К.В., Козюра А.К. Справочное руководство для радиобиологов. М., 1978.

13. Бургасов П.Н., Рожков Г.И. Метод оценки противосибиреязвенного иммунитета по превентивным свойствам сыворотки // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1972. - № 6. — С. 124 -134.

14. Бургасов П.Н., Рожков Г.И., Тамарин A.JL и др. Метод оценки иммунитета по превентивным свойствам сыворотки крови и новая эффективная схема иммунизации людей против сибирской язвы // Информационный сборник. 1965. - № 1. - С. 5 - 33.

15. Владимиров В.Г. Расчет количества лекарственных препаратов на поверхность тела как один из способов определения равноэффективных доз для животных и человека //Фармакология и токсикология. 1976. -№1. - С.123 - 128

16. Гланц С. Медико-биологическая статистика / Перевод с английского. — М.: Практика, 1999. 459 с.

17. Государственная фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырьё / 11-е изд., доп. М.: Медицина, 1990.-400 с.

18. Егоров A.M. Теория и практика иммунофермептного анализа / Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. и др. М.: Высшая школа, 1991. -288 с.

19. Инструкция по применению сывороток диагностических моноспецифических против IgG (H+L), IgG (Н), IgM (Н), IgA (Н) человека, сухих: Утверждена заместителем председателя Гскомсанэпиднадзора РФ 27.01.95 г.

20. Инструкция по контролю стерильности консервирующей крови, её компонентов, препаратов, консервированного костного мозга, кровезаменителей и консервирующих растворов: Утверждена первым заместителем Министра здравоохранения РФ 22.05.1995 г.

21. Инструкция по применению вакцины сибиреязвенной живой сухой для подкожного и скарификационного применения: Утверждена Главным государственным санитарным врачом РФ 17.03.2002 г.

22. Инструкция по применению вакцины сибиреязвенной комбинированной сухой и жидкой для подкожного применения: Утверждена Главнымгосударственным санитарным врачом РФ 03.2002 г.

23. Инструкция по применению глобулина противосибиреязвенного лошадиного жидкого: Утверждена Главным государственным санитарным врачом РФ 28.03.2000 г.

24. Инструкция по применению тест-системы иммуноферментной для определения титров антител к протсктивному антигену сибиреязвенного микроба в сыворотке крови человека: Утверждена начальником НИИ микробиологии МО РФ 28.04.2004 г.

25. Инструкция по проведению автоматического донорского плазмафереза на аппарате «Автоферез-С»: Утверждена заместителем Министра здравоохранения РФ 19.05.1999 г.

26. Инструкция по проведению донорского плазмафереза: Утверждена первым заместителем министра здравоохранения РФ 29.05.1995 г.

27. Информационный листок фирмы «Биотест Фарма ГмбХ», Германия // Вестник гематологии. 2006. - № 3. - С. 2.

28. Ипатенко Н.Г. Сибирская язва / Ипатенко Н.Г., Гаврилов В.А., Зелепукин B.C. и др. М.: Колос, 1996. - 335 с.

29. Казанцев А.П., Матковский B.C. Справочник врача-инфекциониста. М.: Медицина, 1973. - 240 с.

30. Киселёва И.А., Анастасиев В.В., Чадаев В.А. и др. Особенности получения иммуноглобулина для внутривенного введения: Иммуноглобулины и другие препараты крови. Л., 1976. - С. 47 - 54.

31. Клиническое применение иммуноглобулина для внутривенного введения ГАБРИГЛОБИН Пособие для врачей. М., 2007. - 20 с.

32. Козлов В.К. Сепсис: этиология, иммунопатогенез, концепция современной иммунотерапии. СПб., 2006.

33. Кораблёва H.H., Хоре H.H. Влияние гемотрансфузионной терапии на специфический противостолбнячный иммунитет // Гематология и трансфузиология. 1989. - № 3. - С. 26 - 29.

34. Лазыкина A.B. Технологические приёмы получения концентратоваллоантител к эндотоксину Pseudomonas aerugienosa: дис. канд. биол. наук: 03.00.04, 14.00.29 / Лазыкина Анна Викторовна. Киров, 1999. -161 с.

35. Лобзин Ю.В., Волжанин В.М., Захаренко С.М. Сибирская язва // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2001. — Т. 4, №2.-С. 104- 127.

36. Лютов А.Г., Алёшкин В.А., Тюриков Ю.М. и др. Изучение переносимости и клинической эффективности Габриглобина нового отечественного иммуноглобулина для внутривенного введения // Новое в трансфузиологии. - 2002. - № 33. - С. 61 - 72.

37. Мальцева О.В. Разработка технологии получения и изучение свойств иммуноглобулина против клещевого энцефалита для внутривенного введения: дис. канд. биол. наук: 03.00.04 / Мальцева Ольга Валерьевна. Киров, 2002. - 128 с.

38. Маринин Л.И., Степанов A.B., Алёшкин В.А. и др. Мониторинг сибирской язвы. — М., 1999. 186 с.

39. Мирошниченко В.П. Сибирская язва // Днсування та д1агностика. 2001. -№ 1.

40. Мостовская Е.В. Оптимизация технологии получения жидкой формы иммуноглобулина для внутривенного введения: дис. канд. биол. наук:1400.36, 14.00.29 /Мостовская Елена Викторовна. -М., 2004. 137 с.

41. МУК 3.3.2.1063-01 Определение антикомплементарной активности препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения: Утверждены Главным государственным санитарным врачом РФ 12.07.2001 г.-М.: Минздрав России, 2001.- 16 с.

42. О внедрении в практику работы службы крови в Российской Федерации метода карантинизации свежезамороженной плазмы: Приказ МЗ РФ от 07.05.2003 г. № 193.

43. О внесении изменения в Приказ Минздрава России от 07.05.03 г. № 193: Приказ МЗиСР РФ от 21.02.2005 г. № 147.

44. Об утверждении порядка медицинского обследования донора крови и её компонентов: Приказ МЗ РФ от 14.09.2001 г. № 364.

45. Онищенко Г.Г. Иммунобиологические препараты и перспективы их применения в инфектологии / Онищенко Г.Г., Алёшкин В. А., Афанасьев С.С. и др. М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2002. - 608 с.

46. Онищенко Г.Г. Сибирская язва: актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики / Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Литусов Н.В. и др. М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999.-448 с.

47. Пименов Е.В., Кожухов В.В., Строчков Ю.И. Создание вакцин против сибирской язвы // Природа. 2000. - № 10. - С. 4 - 12.

48. Попов В.Г., Щербаков Г.Я., Маринин Л.И. и др. Профилактика и терапия сибиреязвенной инфекции // Сборник докладов I Российского симпозиума по биологической безопасности. -М., 2003.

49. ПР № 01966992-04-05. Промышленный регламент на производствопрепарата Иммуноглобулина человека против клещевого энцефалита: Утверждён директором ФГУ «КНИИГиПК Росздрава» 10.01.2006 г.

50. Регламент производства № 1 Иммуноглобулина нормального человека для внутривенного введения: Утверждён директором НИИ гематологии и переливания крови 12.11.1999 г.

51. Регламент производства № 1502-04 Глобулин противосибиреязвенный лошадиный жидкий. Том 2: Утверждён начальником НИИ микробиологии МО РФ 09.04.03 г.

52. Рубинштейн Э. Биотерроризм: значение антимикробных препаратов // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2001. - Т. 3, №4.-С. 290-300.

53. Руководство по инфекционным болезням / Под ред. Лобзина Ю.В. -СПб.: Фолиант, 2000. 932 с.

54. Русанов В.М., Левин И. Лечебные препараты крови. М.: Медпрактика-М, 2004. 284 с.

55. Сапожникова B.C. Разработка и изучение свойств антистафилококкового и противостолбнячного иммуноглобулинов для внутривенного введения: дис. канд. биол. наук: 03.00.04 / Сапожникова Вера Сергеевна. — Киров, 1990.- 195 с.

56. Сапожникова B.C., Шарыгнн С.Л. Способ получения иммуноглобулина для внутривенного введения // Патент RU 2068695.

57. Смирнов К. Микробы делятся с ближними // Новая газета. — 2005. -№ 79. С. 20.

58. Смирнова Н.И., Кутырев В.В. Сравнительный анализ молекулярно-генетических особенностей генов и их эволюционных преобразований у возбудителей холеры, чумы и сибирской язвы // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2006. № 2. — С. 9 - 19.

59. Типовой комплексный регламент производства белковых препаратов плазмы донорской крови: Утверждён заместителем Министра здравоохранения СССР 21.12.1979 г.

60. ФС 42-0091-02 Плазма для фракционирования: Утверждена руководителем Департамента государственного контроля лекарственных средств и медицинской техники МЗ РФ 27.09.2002 г. 9 с.

61. ФС 42-3159-95 Иммуноглобулин нормальный человека для внутривенного введения: Утверждена Заместителем начальника инспекции Государственного контроля качества лекарственных средств и медицинской техники 03.07.95 г.

62. ФСП 42-0194-4884-03 «ГАБРИГЛОБИН ^ ®», раствор для инфузий (Иммуноглобулин человека нормальный): Утверждена генеральным директором ЗАО «Иммуно-Гем» 03.12.2003 г.

63. Шарыгин С.Л. Препараты внутривенных иммуноглобулинов из донорской плазмы для терапии бактериальных и вирусных инфекций (получение и клиническое применение): дис. докт. мед. наук: 14.00.29 / Шарыгин Сергей Леонидович. Киров, 1997. - 286 с.

64. Шемякин И.Г., Пухальский А.Л., Степаншина А.Н. и др. Профилактический и терапевтический эффекты а 1-кислого гликопротеина у мышей, инфицированных В. аМкгаа'я II Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2005. № 10. - С. 440 - 445.

65. Шкуратова О.В. Разработка научно-методических основ технологии производства специфического препарата для лечения больных дифтерией: Автореф. дис. . канд. биол. наук: 03.00.07 / ФГУ «НПО «Вирион». Уфа, 2002. - 23 с.

66. Agrawal A., Pulendran В. Anthrax lethal toxin: a weapon of multisystem destruction // Cell. Mol. Life Sci. 2004. - Vol. 61. - P. 2859 - 2865.

67. Arnon S.S., Schechter R., .Maslanka S.E. et al. Human Botulism Immune Globulin for the Treatment of Infant Botulism // N. Engl. J. Med. 2006. -Vol. 354.-P. 462-471.

68. Baillie L., Hibbs S., Tsai P. et al. Role of superoxide in the germination of Bacillus anthracis endospores // FEMS Microbiol Lett. 2005. - Vol. 245. -P. 33 - 38.

69. Batty S., Chow E.M., Kassam A. et al. Inhibition of mitogen-activated protein kinase signalling by Bacillus anthracis lethal toxin causes destabilization of interleukin-8 mRNA // Cell. Microbiol. 2006. - Vol. 8. - P. 130 - 138.

70. Bonuccelli G., Sotgia F., Frank P.G. et al. Anthrax Toxin Receptor (ATR/TEM8) is Highly Expressed in Epithelial Cells Lining the Toxin's Three Sites of Entry (Lung, Skin, and Intestine) // Am. J. Physiol. 2005.

71. Brossier F., Levy M., Landier A. et al. Functional analysis of Bacillus anthracis protective antigen by using neutralizing monoclonal antibodies //1.fect. Immun. 2004. - Vol. 72. - P. 6313 - 6317.

72. Cleret A., Quesnel-Hellmann A., Vallon-Eberhard A. et al. Lung dendritic cells rapidly mediate anthrax spore entry through the pulmonary route // J. Immunol. 2007. - Vol. 178. - P. 7994 - 8001.

73. Collier R.J., Young J.A. Anthrax toxin // Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 2003. -Vol. 19.-P. 45 -70.

74. Dixon T.C., Meselson M., Guillemin J. et al. Anthrax // The New England journal of medicine. 1999. - Vol. 341. - P. 815-826.

75. Hanna P. Lethal toxin actions and their consequences // Journal of applied microbiology. 1999. - Vol. 87. - P. 285 - 287.

76. Huber M., Vor Dem Esche U., Grunow R. et al. Generation of mouse polyclonal and human monoclonal antibodies against Bacillus anthracis toxin // Drugs Exp. Clin. Res. 2005. - Vol. 31. - P. 35 - 43.

77. Hull A.K., Criscuolo C.J., Mett V. et al. Human-derived, plant-produced monoclonal antibody for the treatment of anthrax // Vaccine. 2005. - Vol. 23. -P. 2082-2086.

78. Jernigan J.A., Stephens D.S., Ashford D.A. et al. Bioterrorism-Related Inhalational Anthrax: The First 10 Cases Reported in the United States // Emerging infectious diseases. 2001. - Vol. 7. - P. 933 - 944.

79. Juris S.J., Melnyk R.A., Bolcome R.E. 3rd et al. Cross-linked forms of the isolated N-terminal domain of the lethal factor are potent inhibitors of anthrax toxin // Infect. Immun. 2007. - Vol. 75. - P. 5052 - 5058.

80. Kang T.J., Fenton M.J., Weiner M.A. et al. Murine macrophages kill the vegetative form of Bacillus anthracis // Infect. Immun. 2005. - Vol. 73. -P. 7495-7501.

81. Karginov V.A., Robinson T.M., Riemenschneider J. et al. Treatment ofanthrax infection with combination of ciprofloxacin and antibodies to protective antigen of Bacillus anthracis // FEMS Immunol. Med. Microbiol. -2004,-Vol. 40.-P. 71-74.

82. Krantz B.A., Trivedi A.D., Cunningham K. et al. Acid-induced Unfolding of the Amino-terminal Domains of the Lethal and Edema Factors of Anthrax Toxin // J. Mol. Biol. 2004. - Vol. 344. - P. 739 - 756.

83. Lacy D.B., Wigelsworth D.J., Melnyk R.A. et al. Structure of heptameric protective antigen bound to an anthrax toxin receptor: a role for receptor in pH-dependent pore formation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. - Vol. 101.-P. 13147-13151.

84. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. - Vol. 227. - P. 680 - 685.

85. Lim N.K., Kim J.H., Oh M.S. et al. An anthrax lethal factor-neutralizing monoclonal antibody protects rats before and after challenge with anthrax toxin // Infect. Immun. 2005. - Vol. 73. - P. 6547 - 6551.

86. Maynard J.A., Maassen C.B., Leppla S.H. et al. Protection against anthrax toxin by recombinant antibody fragments correlates with antigen affinity // Nat. Biotechnol. 2002. - Vol. 20. - P. 597 - 601.

87. Mohamed N., Clagett M., Li J. et al. A high-affinity monoclonal antibody to anthrax protective antigen passively protects rabbits before and after aerosolized Bacillus anthracis spore challenge // Infect. Immun. 2005. — Vol. 73.-P. 795-802.

88. Mourez M. Anthrax toxins // Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 2004.

89. Peterson J.W., Comer J.E., Baze W.B. et al. Human monoclonal antibody AVP-21D9 to protective antigen reduces dissemination of the Bacillus anthracis Ames strain from the lungs in a rabbit model // Infect. Immun.2007. Vol. 75. - P. 3414 - 3424.

90. Pimental R.A., Christensen K.A., Krantz B.A. et al. Anthrax toxin complexes: heptameric protective antigen can bind lethal factor and edema factor simultaneously // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. - Vol. 322. -P. 258 - 262.

91. Pittman P.P., Leitman S.F., Barrera Oro J.G. et al. Protective antigen and toxin neutralization antibody patterns in anthrax vaccinees undergoing serial plasmapheresis // Clinical and diagnostic laboratory immunology 2005. — Vol. 12. - P. 713-721.

92. Quinn C.P., Dull P.M., Semenova V. et. al. Immune responses to Bacillus anthracis protective antigen in patients with bioterrorism-related cutaneous or inhalation anthrax // J. Infect. Dis. 2004. - Vol. 190. - P. 1228 - 1236.

93. Sastry K.S, Tuteja U., Batra H.V. Generation and characterization of monoclonal antibodies to protective antigen of Bacillus anthracis // Indian J. Exp. Biol.-2003.-Vol. 41.-P. 123 128.

94. Scobie H.M., Young J.A. Interactions between anthrax toxin receptors and protective antigen // Curr. Opin. Microbiol. 2005. - Vol. 8. - P. 106 - 112.

95. Shen Y., Zhukovskaya N.L., Guo Q. et al. Calcium-independent calmodulin binding and two-metal-ion catalytic mechanism of anthrax edema factor // EMBO J. 2005.

96. Spencer R.C. Bacillus anthracis // Journal of Clinical Pathology. 2003. -Vol. 56.-P. 182- 187.

97. Subramanian G.M., Cronin P.W., Poley G. et al. A phase 1 study of PAmAb, a fully human monoclonal antibody against Bacillus anthracis protective antigen, in healthy volunteers // Clin. Infect. Dis. 2005. - Vol. 1. - P. 12 - 20.

98. Tada H., Shiho O., Kuroshima K. et al. An improved colorimetric assay for interleukin 2 // J. Immunol. Methods. 1986. - Vol. 93, № 2. - P. 157 - 165.

99. Tournier J.N., Quesnel-Hellmann A., Mathieu J. et al. Anthrax Edema Toxin Cooperates with Lethal Toxin to Impair Cytokine Secretion during Infection of Dendritic Cells // J. Immunol. 2005. - Vol. 174. - P. 4934 - 4941.

100. Turgeon A.F., Hutton B., Dean A. et al. Meta-analysis: intravenous immunoglobulin in critically ill adult patients with sepsis // Ann. Intern. Med. 2007. - Vol. 6. - P. 193 - 203.

101. Weiss S., Kobiler D., Levy H. et al. Immunological correlates for protection against intranasal challenge of Bacillus anthracis spores conferred by a protective antigen-based vaccine in rabbits // Infect. Immun. 2006. - Vol. 1. -P. 394 -398.

102. Wild M.A., Xin H., Maruyama T. et al. Human antibodies from immunized donors are protective against anthrax toxin in vivo // Nat. Biotechnol. 2003. -Vol. 11.-P. 1305 - 1306.

103. Williamson E.D., Hodgson I., Walker N.J. et al. Immunogenicity of recombinant protective antigen and efficacy against aerosol challenge with anthrax // Infect. Immun. 2005. - Vol. 73. - P. 5978 - 5987.

104. Zhang S., Cunningham K., Collier R.J. Anthrax protective antigen: efficiency of translocation is independent of the number of ligands bound to the prepore // Biochemistry. 2004. - Vol. 43. - P. 6339 - 6343.

105. Zhang S., Finkelstein A., Collier R.J. Evidence that translocation of anthrax toxin's lethal factor is initiated by entry of its N terminus into the protective antigen channel // Proc. Natl. Acad. Sci .USA. 2004.

106. Zhang S., Udho E., Wu Z. Et al. Protein translocation through anthrax toxin channels formed in planar lipid bilayers // Biophys. J. 2004. - Vol. 17.

107. Zhao P., Liang X., Kalbflcisch J. et al. Neutralizing monoclonal antibody against anthrax lethal factor inhibits intoxication in a mouse model // Hum. Antibodies. 2003. - Vol. 12. - P. 129 - 135.

Информация о работе

Долматов, Владимир Юрьевич
кандидата биологических наук
Киров, 2008
ВАК 03.00.23

Диссертация

Получение противосибиреязвенных иммуноглобулиновых препаратов человека в эксперименте и изучение их биологических свойств - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Получение противосибиреязвенных иммуноглобулиновых препаратов человека в эксперименте и изучение их биологических свойств - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы