Разработка иммунобиологических препаратов для диагностики сибирской язвы

Горобец, Елена Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка иммунобиологических препаратов для диагностики сибирской язвы
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка иммунобиологических препаратов для диагностики сибирской язвы"

На правах рукописи

ГОРОБЕЦ Елена Александровна

Разработка иммунобиологических препаратов для диагностики сибирской язвы

03.00.07 - микробиология 03.00.23 - биотехнология

(1 5 ОКТ 2009

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ставрополь - 2009

003479619

Работа выполнена в ФГУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Афанасьев Евгений Николаевич;

доктор биологических наук Василенко Надежда Филипповна.

Официальные оппоненты: заслуженный деятель науки РФ,

доктор биологических наук, профессор Дмитриев Анатолий Федорович;

кандидат медицинских наук Беличенко Андрей Викторович.

Ведущая организация: ФГУЗ «Иркутский научно-исследовательский

противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора

Защита диссертации состоится « ХЗ» (^ШМа^^У^-_2009 г.

в -/Х-часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.256.09 в Ставропольском государственном университете по адресу: 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина, д. 1, корп. 2, комн. 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета.

Автореферат разослан «_ » 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Ржепаковский И. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сибирская язва (антракс) — уникальная инфекционная болезнь животных и человека. Однажды возникнув в какой-либо местности, она может укореняться, сохраняя на многие десятилетия угрозу повторных вспышек.

По данным ВОЗ, сибирская язва продолжает регистрироваться среди животных в 158 странах мира и составляет 100-120 тысяч случаев в год. На территории России за период с 1900 года зарегистрировано более 35 тысяч стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктов и более 70 тысяч вспышек инфекции. Прогноз по этой инфекции в России на ближайшие годы остается неблагоприятным (Онищенко Г.Г., 2002; Онищенко Г.Г., Верещагин А.И., 2005).

Возбудитель сибирской язвы способен проникать в организм человека и животных через повреждения кожных покровов, кишечный тракт и дыхательные пути, вызывая развитие кожной и висцеральной формы заболевания, которое в большинстве случаев заканчивается летально вследствие развития сепсису. Сам. возбудитель этого заболевания обладает способностью образовывать споры, высоко устойчивые к неблагоприятным факторам внешней среды, что обусловливает его длительное сохранение в анабиотическом состоянии в природе. Эта особенность споровой формы палочки антрахса способствует созданию долговременных стационарно неблагополучных пунктов, что приводит к,постоянной угрозе заражения людей и развитию эпизоотий.

Несмотря на значительное количество методов лабораторной диагностики сибирской язвы, среди ускоренных и экспресс-методов люминесцентная микроскопия занимает ведущее место. Кроме того, это - самый быстрый и надежный метод исследования, позволяющий в течение 3-5 часов дать ускоренный ответ на наличие в исследуемом материале сибиреязвенного микроба. Основную роль дця ранней и ретроспективной диагностики сибирской язвы и выявления иммунологической поствакцинальной или постинфекционной перестройки организму играет кожно-аллергическая проба с сибиреязвенным аллергеном (Онищенко Г Г.».Васильев Н.Т., Литусов Н.В. и др., 1999; Буярова C.B., Хаертынов К.С., Галиуллин А.К. и др., 2000). На сегодняшний день лабораторные службы не обеспечены сертифицированными препаратами для диагностики сибирской язвы (Куличенко А.Н., Еременко Е.И., Цыганкова О.И., 2008). Поэтому исследования в этом направлении остаются весьма актуальными.

Цель исследования: разработка иммунобиологических препаратов для идентификации Bacillus anthracis и диагностики сибирской язвы.

Основные задачи исследования:

1. Изучить штаммы микроорганизмов, взятые для исследования, по основным идентификационным тестам.

2. Изучить ростовые свойства питательных сред различного состава и условия культивирования для накопления микробной массы В. anthracis (споровой, капсульной и соматической форм).

3. Выделить специфические антигены из различных биологических форм сибиреязвенного микроба (споровой, капсульной и вегетативной).

4. Получить споровые, капсульно-соматические и соматические сибиреязвенные антисыворотки.

5. Получить иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные соматические, споровые, капсульйо-соматические флуоресцирующие, провести лабораторные испытания на гомологичных и гетерологичных штаммах микроорганизмов.

6. Модифицировать способ изготовления сибиреязвенного антигена (ан-траксина) для кожно-аллергической пробы.

Научная новизна работы. Разработан научно-методический подход к выделению специфических антигенов В. аШИгасгз, находящегося в споровой и вегетативной формах, а также его капсульного вещества.

Получены споровые, капсульно-соматические, соматические высокоактивные кроличьи антисыворотки на основе оптимальной комбинации различных специфичных антигенов сибиреязвенного микроба и иммунокорректоров с различным механизмом действия.

Для повышения специфичности сибиреязвенных сывороток применен регенерируемый аффинный сорбент с магнитными свойствами, позволяющий ускорить и упростить процесс сорбции неспецифических антител.

Практическая значимость работы. Разработанные методические приемы по накоплению биомассы сибиреязвенного микроба, извлечению из нее специфических антигенов, получению высокоактивных иммунных сывороток, выделению из них иммуноглобулинов, оптимизация параметров конъюгации и флуорохрома позволили получить сибиреязвенные флуоресцирующие споровые, соматические, капсульно-соматические иммуноглобулины для идентификации сибиреязвенного микроба.

Модификация технологии производства аллергена сибиреязвенного (ан-траксина) позволила'снизить потери конечного продукта, увеличить срок годности с двух до Грех лет и сохранить все его свойства.

Материалы научных разработок легли в основу 2 нормативных документов, утвержденных на федеральном уровне: регламент производства № 1458-04 «Аллерген сибиреязвенный жидкий для внутрикожной пробы (антраксин)» и фармакопейная статья предприятия 42-0397782706 «Аллерген сибиреязвенный жидкий для внутрикожной пробы (антраксин), раствор для внутрикожного введения».

Одобрена Ученым советом СтавНИГГЧИ и утверждена директором института НД: пусковой регламент, инструкция по применению на иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные капсульно-соматические люминесцирующие сухие (ггротокол № 3'от 30.03.2007 г.); пусковой регламент, технические условия, инструкция по применению на иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные соматические адсорбированные флуоресцирующие сухие (протокол № 7 от 31.10.2008 г.); пусковой регламент, технические условия, инструкция по применению на иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные споровые адсорбированные флуоресцирующие сухие (протокол № 9 от 26.12.2008 г.).

Положения, выносимые на защиту:

1. Определены микробиологические и биотехнологические приемы и условия,

2. обеспечивающие получение высокоспецифичных антигенов сибиреязвенного микроба, находящегося в трех биологических формах: споровой, инкапсулированной, бескапсульной (вегетативной).

3. Разработанные схемы иммунизации кроликов-продуцентов (дозы антигенов, временные интервалы, способы и кратность их введения, комбинации иммунокорректоров с различным механизмом действия) позволяют получать высокоактивные, специфичные сибиреязвенные споровые, кап-сульные и капсульно-соматические гипериммунные антисыворотки практически у 100 % животных.

4. Модификация основных этапов изготовления аллергена-антраксина (экстракция, очистка) и разработанный ускоренный режим его лиофилизации с защитной средой высушивания сокращают время производства и потери продукта, увеличивают срок годности препарата до трех лет при сохранении всех его свойств.

5. Разработанные иммунобиологические препараты (флуоресцирующие иммуноглобулины и аллерген-антраксин) отвечают требованиям, предъявляемым к индикационным препаратам, и демонстрируют высокую эффективность при диагностике сибирской язвы и идентификации различных биологических форм В. апАгаая (споровой, инкапсулированной, вегетативной).

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлены на VI Межгосударственной научно-практической конференции Государств-участников СНГ (Волгоград, 13-14 сентября, 2005); VII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества Независимых Государств» (Оболенск, 3-5 октября, 2006); Втором съезде военных врачей медико-профилактического профиля Вооруженных сил Российской Федерации «Современные проблемы военной профилактической медицины, пути их решения и перспективы развития» (Санкт-Петербург, 15-17 ноября, 2006); Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 21-22 ноября, 2006), Всероссийской научной конференции, посвященной 210-й годовщине основания Военно-медицинской академии «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекциошшх заболеваний» (Санкт-Петербург, 17-18 апреля, 2008); расширенной научной конференции лабораторий и отделов СтавНИПЧИ Роспотребнадзора (Ставрополь, 2009).

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 13 опубликованных научных работах, в том числе 1 работа - в периодических изданиях из перечня рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы,' приложений. Работа изложена на 163 страницах, содержит 13 таблиц и 16 рисунков. Список литературы включает 217 источников, из них 156 отечественных и 61 зарубежный.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

При выполнении работы использованы 60 штаммов микроорганизмов: Bacillus anthracis (14 шт), Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Bacillus subtilis, Bacillus species (46 шт) из лаборатории «Коллекция патогенных микроорганизмов» ФГУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора.

Питательные среды готовили на базе лаборатории питательных сред для культивирования микроорганизмов 1-4 групп патогенности ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора.

В опытах использованы 60 кроликов обоего пола породы «Шиншила», массой 2,5-3 кг; 200 беспородных белых мышей, массой 18-20 г; 40 морских свинок, массой 250-300 г.

Разрушение микробных клеток проводили на установке УЗДН-2Т (Россия) при частоте колебаний 44 кГц и пресс-дезинтеграторе Х-25 (LKB, Швеция). Определение оптической плотности при контроле разрушения бактериальных клеток проводили на фотоэлектроколориметре КФК-3 при X 540 им.

Количественное определение белка проводили по методу О. Warburg и W. Christian (1941) сравнением поглощения белка при 280 и 260 нм на спектрофотометре СФ-46 (Практическая химия белка, 1989).

Кроликов иммунизиройали с применением иммунокорректоров феракрила, тималина, циклофосфана, а также полного адьюванта Фрейнда. Контроль титра специфических антител в сыворотках определяли в непрямой реакции имму-нофлуоресценции (НРИФ) по Т.Н. Weiler^ А.Н. Coons (1954). Микроскопию препаратов осуществляли в люминесцентном микроскопе серии «Люмам».

Специфическую активность антигенов микроорганизмов и полученных иммунных сывороток определяли в реакции иммунодиффузии (РИД) в 1 % агаровом геле (Difco, USA) по О. Ouchterlony (1949).

Для осаждения белков использовали сульфатный метод (Русанов В.М., Скобелев Л.И., 1980); метод фракционирования белковых смесей полиэтиленг-ликолем (ПЭГ) по A. Poison, G.M. Potgier, J.E. Largier (1964) и каприловой (октановой) кислотой (Steibuch G., Andran R., 1969).

Конъюгацию иммуноглобулинов с флуоресцеин-5-изотиоцианатом (ФИТЦ) фирмы «Sigma» проводили по X. Шторц (Stortz, 1987). Прямой метод окраски препаратов осуществляли по А.Н. Coons, М.Н. Kaplan (1950). Очистку конъюга-тов от непрореагировавшего флуорохрома осуществляли , гель-фильтрацией (сефадекс G-50) на хроматографической системе «Minicoldlab» (LKB, Швеция).

Лиофилизацию препаратов проводили в камере TG-5 (Германия).

Результаты серологических исследований были обработаны статистически по методу Е.П. Тамбовцева, С.Г. Ахметкалиева, H.H. Пятницкого (1969).

Математическую обработку результатов экспериментов проводили на компьютере (программа MS Office Excel ХР) (Лапач С.Н., Чубенко A.B., Бабич П.Н., 2001).

Результаты собственных исследований

Микробиологические аспекты получения специфических антигенов В. anthracis и сибиреязвенных аптцсывороток

На первом этапе исследований мы провели сравнительное изучение основных фенотипических свойств, присущих В. anthracis: тинкгориальные свойства, морфология колоний на плотных питательных средах, характер роста на бульоне, подвижность, чувствительность к пенициллину (тест «жемчужного ожерелья»), чувствительность к сибиреязвенному бактериофагу «Гамма А-26», лецитиназная активность, способность гемолизировать эритроциты, капсулообразование. Были протестированы 14 штаммов В. anthracis и 46 штаммов спорообразующих близкородственных микроорганизмов, относящихся к различным видам.

Тесты были характерны для сибиреязвенного микроба и свидетельствовали о стабильности фенотипических свойств всех штаммов В. anthracis, взятых в опыты.

Сравнительный анализ фенотипических свойств близкородственных сапро-фитов рода Bacillus выявил достаточно широкую вариабельность их биологических свойств: некоторые штаммы обладали одним или даже сочетанием нескольких признаков, характерных для возбудителя сибирской язвы: два штамма не мутили бульон Хоттингера, один из них давал слабоположительный результат в тесте на щелочную фосфатазу, другой, кроме этих признаков, был леци-тиназно и гемолитически неактивным; гемолитическая активность отсутствовала у 2 штаммов, у одного этот признак сочетался с отрицательным результатом в тесте на лецитиназную активность, у другого — со слабым результатом на щелочную фосфатазу; из 11 неподвижных штаммов 3 сочетали этот признак с сомнительным результатом в пробе «жемчужного ожерелья», 4 - с отсутствием лецитиназной активности, один - со слабоположительным тестом на щелочную фосфатазу, а один штамм обладал всеми этими свойствами (таблица 1).

Таблица 1 - Сравнение основных фенотипнческях свойств штаммов сибиреязвенного __микроба ц штаммов близкородственных бацилл_

Количество Количество

Фенотипические свойства штаммов штаммов

В. anthracis (из 14) близкородственных бацилл (из 46)

Характер роста на МПА Л-форма 14 46

Характер роста на МПБ пристеночное кольцо или легкая пяенха на поверхности прозрачного бульона 14 2

Подвижность неподвижный 14 И

Тест «жемчужного ожерелья» положительный 14 2 (сомнительный результат)

Фосфатазная слабоположительная - 5

активность отрицательная 14 -

Лецитиназная положительный 3 40

активность отрицательная 11 6

Гемолитическая отрицательная 14 2

активность

Капсулообразование положительный 10 -

На этом основании можно сказать, что при идентификации выделенных штаммов по биологическим свойствам необходимо использовать весь комплекс фенотштических тестов, а также привлекать другие надежные методы, например, ПЦР, реакцию иммунофлуоресценции, позволяющие четко дифференцировать сибиреязвенный микроб от штаммов близкородственных микроорганизмов.

Учитывая особенности биологии сибиреязвенного микроба, проявляющиеся в возможностях его существования в различных морфологических формах: споровой, инкапсулированной, вегетативной (бескапсульной), мы провели ряд исследований по изучению ростовых свойств питательных сред различного состава и условий культивирования для накопления биомассы каждой из перечисленных форм В. anthracis.

Для сравнительного изучения спорообразования и накопления споровой биомассы В. anthracis мы использовали следующие питательные среды: Гладстона-Филдса (Gladstone L.P., Fields P., 1940), картофельный агар и среду из казеинового перевара, наиболее пригодные для спорообразования. Для посева на вышеуказанные питательные среды и агар Хоттингера (контрольная среда) использовали вирулентные и вакцинные штаммы В. anthracis. Восемнадцатичасовые культуры вегетативных клеток смывали 0,15 М раствором NaCl и путем разведений получали концентрацию 1х103 м.кУмл. Посевной материал наносили в объеме 0,1 мл на поверхность пяти чашек каждой питательной среды. Посевы инкубировали при 32 °С. Спорообразование оценивали, подсчитывая количество спор и вегетативных клеток в 10 полях зрения в мазках, окрашенных по Ребигеру. Мазки готовили через 2,3,4,6, 8,10, 12, 14 суток. Процент спорообразования подсчитывали, вычисляя среднее количество спор В. anthracis. Спорообразование на среде Гладстона-Филдса было максимальным (98-100 %) на 12 сутки инкубации, тогда как на остальных средах и контрольной к этому сроку образовывалось (15+5) % спор.

Для изучения, капсулообразования сибиреязвенного микроба мы использовали 1 % сывороточно-бикарбонатный агар Хоттингера, агаризованную питательную среду «СОПЭК» и жидкую белковую среду ГТСИ, на которые засевали вирулентные сибиреязвенные штаммы и вакцинный штамм В. anthracis 71/12 споровые формы. Посевы помещали в анаэростат, в котором 50% воздуха замещали углекислотой, инкубировали при температуре (36+1) °С в течение (20+2) часов. Образовавшиеся колонии на плотных питательных средах были полупрозрачные, слизистые, тянущиеся за петлей, что характерно для М- или SM-форм сибиреязвенного микроба. Как показали исследования, капсулообра-зование происходило на всех испытанных питательных средах, но для дальнейших манипуляций по препаративному выделению капсульного вещества В. anthracis мы избрали менее сложную по солевому составу среду - сывороточно-бикарбонатный агар Хоттингера. От жидкой питательной среды ГКН мы отказались из-за необходимости центрифугирования для получения бакмассы.

Получение биомассы вегетативной формы бациллы антракса не составило особых трудностей. Споры, засеянные на агар Хоттингера pH 7,0 и выдержанные при температуре (35,5+0,5) °С, начинали прорастать уже через (18+2) часа инкубации. Посевы представляли сплошной рост «газоном», состоящий только из вегетативных форм микроба. Контроль образования вегета-

тивной формы и чистоты культуры проводили микроскопированием мазков, окрашенных по Граму.

Таким образом, нами определены питательные среды и временные рамки для накопления биомасс различных биологических форм сибиреязвенного микроба в достаточных количествах для производственных целей.

Водорастворимые антигенные комплексы споровой и вегетативной форм сибиреязвенного микроба из биомасс В. anthracis Sterne 34F2, автоклавированных при 2 атм 1,5 часа, изолировали комплексным методом: водно-солевой экстракцией, механической и ультразвуковой дезинтеграцией (рисунок 1).

Рисунок 1 -Получение водорастворимых антигенных комплексов споровой и вегетативной форм сибиреязвенного микроба. 9

В основу методики по извлечению очищенного капсульного вещества положен способ, изложенный О.Н. Лопаткиным, Н.П. Буравцевой, Т.Н. Фунтико-вой и др. (1979), в нашей модификации, заключающейся в увеличении концентрации натрия хлорида в экстрагирующем растворе до 3 %, в преципитирующем растворе (МН4)2804 - до 60 %, сокращении срока диализа на 24 часа и введении этапа ультрафильтрации на сефадексе в-100 на конечном этапе (рисунок 2).

Рисунок 2 - Выделение очищенного капсульного вещества В. апЛгаш.

.Выделенные водорастворимые комплексы и капсульное вещество сибиреязвенного микроба использовали в дальнейшем для получения гипериммунных сывороток и контроля их активности.

При получении антиспоровых иммунных кроличьих сывороток за основу была взята схема, разработанная И.С. Тюменцевой (1996). Для иммунизации животных использовали водорастворимый антиген, иммунокорректор - феракрил (смесь железных (П, П1) солей полиакриловой кислоты), который способен вызывать выраженное увеличение антителообразующих Т- и В-клеток (Кирдей Е.Г., Пинигина Н.М., Тюменцев С.Н. и др., 1986). Дополнительно в качестве имму-ногена введен детрит клеток В. апЛгаси споровой формы. Грундиммунизация включала пять последовательных парентеральных введений смеси антигена с 3% водно-спиртовым раствором феракрила с интервалами 3-7 дней. Через 30 суток после последней инъекции у животных брали из краевой вены уха кровь и отделяли не менее 4 мл иммунной сыворотки, в которую добавляли антиген с

целью получения комплекса «Аг-Ат». Основной цикл иммунизации состоял из четырех внутривенных инъекций комплекса «Аг-Ат» через каждые 3-4 дня тому же животному, от которого была получена иммунная сыворотка. Впервую инъекцию основного цикла дополнительно вводили детрит в смеси с феракрилом в подушечки передних лап и подколенные лимфоузлы задних лап. Результаты изучения специфической активности гипериммунных сывороток обрабатывали статистическим методом по Е.П. Тамбовцеву, С.Г. Ахмет-калиееу, H.H. Пятницкому (1969), вычисляя средние титры в НРИФ и РИД, которые равны 1:512 (+18,1 %; -15,3 %) и 1:32 (+13,3 %; - 11,7 %) соответственно. При этом иммуностимулирующий эффект при отсутствии токсического воздействия на животное, без возникновения адьювантной болезни достигался у 95% кроликов. Продолжительность цикла иммунизации составила 49-54 дня.

Для получения сибиреязвенных соматических антисывороток мы адаптировали схему иммунизации, предложенную E.H. Афанасьевым (2000) для получения чумных, бруцеллезных, сибиреязвенных (антиспоровых) и других диагностических сывороток: водорастворимый антиген пятикратно вводили кроликам внутривенно, одновременно внутримышечно в качестве иммуномодулятора инъецировали тималин, в третью инъекцию дополнительно вводили внутримышечно циклофосфан.

При данном способе продолжительность цикла иммунизации составляла 31-35 дней, расход антигенного материала - 1,5 мг на одного кролика. Титры специфических антител в сыворотках животных-продуцентов при определении в РИД достигали показателей 1:64 (+ 4,2 %; - 4,0 %), а в НРИФ -1:16384 (+13,3 %; -11,7 %).

Капсульно-соматические сибиреязвенные иммунные сыворотки удалось получить по разработанной нами схеме, заключающейся в комбинированном внутривенном введении капсульного вещества, конъюгированного с бычьим сывороточным альбумином, в возрастающих дозах и внутримышечных инъекциях (с однократным введением в подколенные лимфоузлы) соматического антигена в смеси с неполным адьювантом Фрейнда (для создания депо) на фоне введения иммунокорректоров - тималина и циклофосфана.

При такой схеме иммунизации титры специфических антител в бивалентных сыворотках при определении в НРИФ (на вегетативной и капсульной формах) были 1:8192 (+13,3 %; -11,7 %) по соматическому антигену и 1:2048 (+13,3; -11,7 %) по капсуле. В РИД иммунные сыворотки формировали с капсульным веществом одну, а с соматическим антигеном — две линии преципитации.

Таким образом, по результатам исследования разработаны эффективные схемы иммунизации для получения сибиреязвенных гипериммунньгх сывороток, основанные на оптимальной комбинации различных антигенов с иммуно-корректорами, обеспечивающие высокий специфический иммунный ответ практически у 100 % животных, значительное сокращение сроков иммунизации, материальных и трудозатрат. ' -'

Полученные сибиреязвенные гипериммунные сыворотки являются высококачественным биологическим сырьем для их применения при изготовлении флуоресцирующих иммуноглобулинов.

Получение иммуноглобулинов флуоресцирующих для идентификации сибиреязвенного микроба

При определении специфичности полученных гипериммунных сибиреязвенных сывороток на 46 штаммах-сапрофитах (В. megaterium, В. thuringiensis, В. subtilis, В. cereus, В. spp.) в НРИФ наблюдалось свечение на 2-3 креста у 5-ти штаммов В. cereus (10,8 %), 2-х - В. megaterium (4,3 %) и 2-х - В. subtilis (4,3 %). Вследствие чего возникала необходимость в сорбции неспецифических антител.

Для иммуносорбции неспецифических антител из сибиреязвенных сывороток мы применили антигенный мапноиммуносорбент, предложенный КВ. Жарниковой (2004). При конструировании аффинного сорбента с магнитными свойствами в качестве матрицы использовали оксид железа и алюмосиликат. Для придания магно-сорбенту аффинных свойств на его поверхность иммобилизировали белковые ли-ганды — водорастворимые антигены, полученные из гетеролошчных штаммов микроорганизмов - В. cereus 250, В. cereus 104, В. cereus 111, В. cereus 8, В. megaterium 5. Магнитные свойства иммуносорбента позволили упростить процесс отделения его от жидкой фазы в магнитном поле и исключить процесс длительного центрифугирования. При сорбции иммунных сывороток использование данного иммуносорбента позволило не только освободить их от неспецифических антител на одном этапе, но и сохранить первоначальную активность нативных сывороток.

Для сравнительного изучения способов выделения IgG мы избрали три метода: фракционирование сульфатом аммония, каприловой кислотой и поли-этиленгликолем. IgG, выделенные разными способами, оценивали по количественному содержанию белка в растворе, чистоте иммуноглобулиновой фракции, определяемой методом электрофореза в агарозном геле, специфической активности - в РИД и НРИФ.

Ставя перед собой задачу получения сибиреязвенных иммуноглобулинов для реакции иммунофлуоресценции, нам было необходимо подобрать оптимальные условия конъюгации иммуноглобулинов с флуоресцеин-5-изотиоцианатом (ФИТЦ): количество флуорохрома, значения рН и температуры реакционной смеси, времени конъюгации, влияние молярных отношений Мф/Мб на серологическую активность конъюгатов, а также изучить физико-химические свойства, чувствительность и специфичность конъюгатов.

Всего было проанализировано по 5 серий иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных споровых, соматических, капсульно-соматических с концентрацией белка 0,9-1,1% и молярным отношением Мф/Мб от 3,8 до 11,0. Наилучшие серии конъюгатов были получены в наших экспериментах из IgG, выделенных каприловой кислотой, при значениях рН реакционной смеси 9,5, при использовании нагрузки ФИТЦ -20 мг на 1 г белка, при температуре 20 °С и 4-х часовом контакте белка с красителем. Оптимальной концентрацией белка полученных флуоресцирующих иммуноглобулинов является (10+1) мг/мл, а показатель молярного соотношения флуорохром/белок - 3-5,5.

Нами получено по 10 экспериментально-производственных серий сибиреязвенных флуоресцирующих иммуноглобулинов. Специфическая активность вышеперечисленных препаратов испытывалась на нативных свежеприготовленных взвесях штаммов В. anthracis, находящихся в разных биологических формах, в пяти повторностях в концентрации 5x108 м.к./мл по ОСО мутности производства ФГУН ГИСК им. ДА. Тарасевича Роспотребнадзора (рисунок 3).

ЕЁИ \ ШШ.

Рисунок 3-Я апЖгаЫя, окрашенные флуоресцирующими иммуноглобулинами (Морфология споровой (А), вегетативной (Б) и капсульной (В) форм В. аМИгасгя).

Установлено, что специфическая активность препаратов всех приготовленных серий характеризовалась красящим титром, равным разведению 1:32 — 1:128 при исследовании мазков гомологичных возбудителей, рабочее разведение препаратов — 1:16 — 1:64.

При контроле специфичности в опыт были взяты штаммы-сапрофиты (В. сегеш - 11 штаммов; В. тег^а1е.пит - 7 штаммов; В. Ошт&егшЫ - 6 штаммов, В. БиЬйШ — 11 штаммов; В. нрр. — 11 штаммов), полученные в споровой и вегетативной биологических формах, окрашенные рабочим разведением флуоресцирующих иммуноглобулинов, соответствующих той или иной форме микроба. Результаты контролен свидетельствовали о высокой специфичности препаратов, так как у 46 испытанных близкородственных спорообразующих штаммов-сапрофитов не отмечено специфического свечения микробных клеток, что говорит о надежности реакции имму-нофлуоресценции как дифференциального теста при идентификации В. ашИгаск.

Для определения чувствительности флуоресцирующих иммуноглобулинов использовали штаммы В. аЫИгасЬ в следующих концентрациях: 5x106; 1x106; 5х105; 2,5х105; 1х105; 5х104

м.к./мл. Установлено, что рабочее разведение испытанных серий препаратов давало возможность обнаруживать микробы в мазках из чистых культур, приготовленных из 2,5x105 и более микробных клеток в 1 мл. С помощью всех серий удалось выявить единичные бактерии в мазках, приготовленных из взвесей, содержащих 5х104 м.к./мл.

Оценка физико-химических свойств флуоресцирующих иммуноглобулинов (внешний вид, растворимость, прозрачность, цветность, рН, потеря в массе при высушивании, концентрация белка, количественное соотношение ФИТЦ/белок), специфической активности и чувствительности показала их соответствие основным требованиям, предъявляемым к подобным препаратам.

Таким образом, нами отработан технологический процесс получения иммуноглобулинов диагностических сибиреязвенных флуоресцирующих для идентификации сибиреязвенного микроба (рисунок 4).

Рисунок 4 — Получение иммуноглобулинов диагностических сибиреязвенных флуоресцирующих сухих

Иммунобиологические препараты, разработанные нами, а также биологическое сырье для их изготовления (антигены, иммунные сыворотки) нуждались в стабилизации их исходных свойств. В связи с тем, что названные препараты имели свой порог биодеградации, необходимо было отработать единый, оптимальный, экономичный режим сублимации.

Лиофилизацию проводили на установке для сублимационной сушки ТО-5 с использованием двух режимов: «длительного» (длительность удаления свободной воды - (14,5+1) час, связанной влаги - (10,5+1) час, конечная температура подогрева - (25+1) °С и «ускоренного» (длительность периода сублимации и изотермического отторжения влаги в течение 6 часов с подогревом материала до (45+2,5) °С, общая длительность процесса сушки - 16 часов).

Изучение физико-химических и биологических свойств препаратов с применением «ускоренного» режима лиофильного высушивания показало, что использование «жестких» параметров сушки не отразилось на их свойствах. Для практических целей могут быть использованы оба режима лиофильного высушивания.

Получение сибиреязвенного аллергена (антраксина) для кожно-аллергической пробы В комплексе мероприятий по борьбе с сибиреязвенной инфекцией важное место занимает своевременная диагностика заболевания у людей и животных. Основную

роль дли ранней и ретроспективной диагностики сибирской язвы и выявления иммунологической поствакцинальной или постинфекционной перестройки организма играет кожно-аллегическая проба с сибиреязвенным аллергеном.

С 1994 г. в СтавНИПЧИ началось освоение производственного выпуска сибиреязвенного аллергена и составление нормативной документации.

Впервые регламент № 399-97 на аллерген сибиреязвенный жидкий для внутри-кожной пробы (антраксин) был утвержден ФГУН ГИСК им. Тарасевича Роспот-ребнадзора в 1997 г., а фармакопейная статья (ФС 42-3878-99) - в 1999 г. С этого момента в СтавНИПЧИ налажен коммерческий выпуск антраксина. По истечении срока действия НД и с учетом изменившихся требований к ее оформлению были составлены и утверждены в соответствующем порядке новый регламент производства (РП № 1458-04) и фармакопейная статья предприятия (ФСП 42-0397782706), одним из разработчиков которых являлась автор настоящих исследований.

Однако, используемая технология производства не лишена некоторых недостатков. Так, этап фильтрования приводит к потере 1/4-1/3 готового продукта и занимает от 2-х до 3-х часов. Еще одним существенным недостатком является то, что коммерческий антраксин выпускался в жидкой форме, что значительно лимитирует срок его годности.

В модифицированном нами технологическом процессе экстракцию аллергена проводили путем кислотного гидролиза: 2 N раствором уксусной кислоты, заменив кипячение автоклавированием в течение 1,5 ч при температуре 110 °С (0,5 атм). Этап фильтрации заменили центрифугированием при 6000 об/мин в течение (20±5) минут, значительно сократив потери препарата.

Для стабилизации сибиреязвенного аллергена-антраксина нами впервые применен «ускоренный», довольно жесткий по технологическим параметрам режим лиофильного высушивания, по общей длительности составляющий (17+1) ч (рисунок 5).

1 Этапы подготовки биомассы II Этапы получения аллергена сибиреязвенного (антраксина) Ш Заключительный этап

1. Приготовление питательной среды 5, Делипидизация микробных клеток 9. Розлив в ампулы

2. Выращивание В. атЬгаш СТИ-1 6. Кислотный гидролиз микробной биомассы 10. Стерилизация автоклавированием

3. Автоклавирование микробной биомассы 7. Ценрифугирование 11. Лиофилизация («ускоренный режим), опай

* * ♦

4. Лиофилизация 8. Корректировка рН (7,2-7,6) 12. Проведение контролен

Рисунок 5 - Этапы изготовления аллергена сибиреязвенного сухого для внутрикожной пробы (антраксина).

Для подбора оптимальной защитной среды высушивания было изготовлено по 5 серий препарата с различными защитными средами: серии С 1-5 - 15 % раствор сахарозы, , серии С 6-10 - тиомочевиновая среда, состоящая из 10 % раствора сахарозы, 1 % раствора желатина, 1 % раствора тиомочевины, и серии С 11-15 - без защитной среды. По внешнему виду антраксин, высушенный с тиомочевиновой средой, представлял собой плотную мелкопористую, хорошо растворимую таблетку, белого цвета, без признаков микроотгаивания. В ампулах С 1-5 с высоким процентом сахарозы при лиофилизации часто происходила ее карамелизация. Антраксин, лиофилизированный без среды высушивания, имел вид рыхлой, пористой таблетки, рассыпающейся при встряхивании. Результаты исследований свидетельствуют о том, что оптимальной защитной средой высушивания явилась тиомочевиновая среда. В форме лиофилизата с тиомочевиновой средой было изготовлено 5 серий препарата.

Таким образом, нам удалось оптимизировать технологию производства аллергена сибиреязвенного (антраксина), что позволило снизить потери конечного продукта, отработать «ускоренный» режим стабилизации антраксина методом лиофильного высушивания, увеличить срок годности с двух до трех лет, сохранив все свойства препарата.

Сработанные нами иммунобиологические препараты пользуются постоянным спросом И применяются в лабораторной практике Федеральными государственными учреждениями здравоохранения «Центры гигаены й эпидемиологии». Иммуноглобулины сибиреязвенные флуоресцирующие регламентированы для специфической индикации сибиреязвенного микроба, и они входят в перечень укомплектования диагностическими препаратами и расходными материалами специализированных противоэпидемических бригад (СПЭБ) согласно Приказу № 330 от 22.11.2007 г. МЗ и соцразвития РФ «О регламенте функционирования СПЭБ». Иммуноглобулины флуоресцирующие и аллерген сибиреязвенный жидкий для внут-рикожной пробы (антраксин) рекомендованы для применения при индикации, идентификации возбудителя сибирской язвы и диагностики заболевания (МУК 4.208 Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы, 2008).

ВЫВОДЫ

1. Определены питательные среды различного состава и условия культивирования для накопления биомассы разных биологических форм В. агиИгаск в достаточных количествах для производственных целей: максимальное спорообразование на среде Гладстона-Филдса на 12 сутки инкубации; оптимальная среда для капсулообразования - 1 % сывороточно-бикарбонатный агар Хотгингера при инкубации В. агйкгасЬ в течение 20 ч; для получения вегетативной формы микроба - инкубация 18 ч на агаре Хотгингера

2. Из споровой, инкапсулированной, вегетативной форм сибиреязвенного микроба изолированы специфические антигены, определены их дозы и комбинации с иммунокорректорами различного механизма действия (фе-ракрил, тималин, циклофосфан), сроки и способы инъецирования кроликам-продуцентам, что дало возможность получить высокоактивные антисыворотки практически у 100 % животных.

3. Определены оптимальные параметры изготовления иммуноглобулинов диагностических сибиреязвенных флуоресцирующих сухих (споровых, соматических, капсульно-соматических): концентрация белка (10+1) мг/мл, количество флуорохрома (20 мг на 1 г белка), значение рН (9,5) и температуры реакционной смеси (20 °С), время конъюгации (4 часа), влияние Мф/Мб на серологическую активность конъюгатов (3-5,5), обеспечивающие специфическое свечение в реакции прямой иммунофлуоресценции микробным клеткам В. апЛгас!з и отсутствие такового у близкородственных микроорганизмов (В. те§Шепит, В. //шля^/еято, В. яиЫИя, В. сегеш, В. ярр.), что свидетельствует о надежности этого метода как идентификационного в сравнении с другими биологическими тестами, которые выявлялись у части спорообразующих штаммов-сапрофитов в том или ином количестве и степени выраженности.

4. Осуществлена модификация способа изготовления аллергена сибиреязвенного (антраксина), применяемого для ранней и ретроспективной диагностики сибирской язвы, касающаяся способа гидролиза, очистки, стабилизации препарата методом сублимации, что позволило значительно снизить его потери, сократить время изготовления, а также увеличить срок годности с двух до трех лет, при этом сохранив все свойства аллергена.

5. Разработанные высокоспецифичные иммунобиологические препараты дают возможность проводить качественную идентификацию сибиреязвенного микроба и диагностику сибирской язвы в специализированных учреждениях практического здравоохранения.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Горобец, Е.А. Опыт получения сибиреязвенных капсульно-соматических флуоресцирующих иммуноглобулинов / Е.А. Горобец // Актуальные проблемы медицины: Сб. научн. работ. - Томск, 2004. - Т. 3. - С. 294.

2. Горобец, Е.А. Совершенствование биотехнологии производства аллергена антраксина / Е.А. Горобец // Актуальные проблемы медицины: Сб. научн. работ. - Томск, 2004. - Т. 2. - С. 294.

3. Горобец, ЕА. Разработка биотехнологии изготовления капсульно-соматических сибиреязвенных люминесцирующих иммуноглобулинов / Е.А. Горобец // Естествознание и гуманизм: Сб. научн. работ. - Томск, 2005. - С. 37.

4. Горобец, Е.А. Стабилизация сибиреязвенного аллергена антраксина методом лиофильного высушивания / Е.А. Горобец // Санитарная охрана территорий государств участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях: Мат-лы VI Межгосудар. научно-практ. конф. государств-участников СНГ, 13-14 сент. 2005 г. - Волгоград, 2005. - С. 225-226.

5. Горобец, Е.А. Современное состояние лабораторной диагностики сибирской язвы (обзор литературы) / ЕА. Горобец // Ставрополь, 2005. — 38 с. — Библи-огр. - 131 назв. - Деп. в ВИНИТИ г. Москва 01.04.05, № 443-В 2005.

6. Горобец, Е.А. Оптимизация биотехнологии получения капсульно-соматических флуоресцирующих иммуноглобулинов для диагностики сибирской язвы / Е.А. Горобец, Е.Н. Афанасьев, Е.В. Жданова // Фундамен-

тальные исследования в биологии и медицине: Сб. научн. трудов. - Ставрополь, 2006.-С. 174-175.

7. Горобец, Е.А. Подбор методов выделения капсульно-соматических сибиреязвенных иммуноглобулинов для диагностики сибирской язвы / ЕА. Горобец, E.H. Афанасьев, И.С. Тюменцева, Е.В. Жданова, Л.И. Заревина // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств: Мат-лы VII Межгосудар. научно-практ. конф. государств-участников СНГ 3-5 октября 2006 г. - Оболенск, 2006. - С. 194-195.

8. Коготкова, О.И. Контроль биотехнологии производства и качества аллергена сибиреязвенного жидкого для внутрикожной пробы (антраксина), раствора для внутрикожного введения / О.И. Коготкова, И.С. Тюменцева, E.H. Афанасьев, Г.И. Лямкин, Е.А. Горобец, Н.Ф. Василенко, В.Д. Май" екая, Н.В. Чурикова, Е.С. Шиянова, A.A. Зуенко // Современные проблемы военной профилактической медицины, пути их решения и перспективы развития: Мат-лы II съезда военных врачей медико-профилактического профиля вооруженных сил РФ 15-17 ноября 2006 г. -Санкт-Петербург, 2006. - С. 496.

9. Горобец, Е.А. Разработка и получение иммунобиологических препаратов для лабораторной диагностики сибирской язвы / Е.А. Горобец, E.H. Афанасьев, И.С. Тюменцева // Вестник СГУ. - Ставрополь, 2006. - Вып. 47 (2) - С. 290 - 292.

10. Коготкова, О.И. Контроль биотехнологии производства медицинских биологических препаратов для диагностики особо опасных зоонозных инфекций / О.И. Коготкова, B.Ä. Проскурина, И.С. Тюменцева, E.H. Афанасьев, Г.И. Лямкин, Н.Ф. Василенко, Л.В. Ляпустина, В.Д. Майская, Н.В. Чурикова, Е.С. Шиянова, A.A. Зуенко, Е.А. Горобец // Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней: Тез. Всеросс. научно-практической конф., 21-22 ноября 2006 г. - Москва, 2006. - С. 49.

11. Горобец, Е.А. Совершенствование способа получения иммунных кроличьих сибиреязвенных капсульно-соматических сывороток / Е.А. Горобец, E.H. Афанасьев, И.С. Тюменцева, Н.Ф. Василенко // Медицинский Вестник Северного Кавказа. - Ставрополь, 2008. - №1 (9). - 42-44.

12. Тюменцева, И.С. Разработка рациональной биотехнологии получения диагностических иммунных сывороток / И.С. Тюменцева, E.H. Афанасьев, Е.В. Жданова, Й.В. Жарникова, Н.Е. Афанасьев, М.П. Лаврешин, Е.А. Горобец, С.А. Курчева, A.A. Семирчева // Вестник Российской военно-медицинской академии. - Санкт-Петербург, 2008. - Приложение № 2 (22). -Ч. 1.-С. 210-211.

13. Алиева, Е.В. Опыт получения иммунных сывороток для производства диагностических препаратов / Е.В. Алиева, И.С. Тюменцева, E.H. Афанасьев, М.П. Лаврешин, Н.Е. Афанасьев, Е.А. Горобец, A.A. Семирчева, А.Ю. Миронов // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». - 2008. - № 1. - С. 10-13.

Подписано в печать 26.09.09 Формат 60x84 1/16 Усл.печ.л. 1,05 Уч.-изд.л. 1,06

Бумага офсетная_Тираж 100 экз._Заказ 290

Отпечатано в цехе оперативной полиграфии Краевого комитета государственной статистики 355000, Ставрополь, ул.Пушкина, 4.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Горобец, Елена Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. СИБИРСКАЯ ЯЗВА: СОВРЕМЕННЫЕ АСПЕКТЫ МИКРОБИОЛОГИИ, ЭПИДЕМИОЛОГИИ И ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ (обзор литературы).

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Штаммы микроорганизмов, взятые в работу.

2.2. Питательные среды.

2.3. Аппаратное оснащение исследований.

2.4. Тесты для идентификации штаммов В. аШкгаЫз.

2.5. Получение и характеристика антигенных комплексов микроорганизмов.

2.6. Физико-химические методы.

2.7. Методы контроля антигенов и сывороток.

2.8. Выделение иммуноглобулинов.

2.9. Получение и контроль иммунофлуоресцирующих конъюгатов.

2.10. Сублимация биологического материала.

2.11. Характеристика лабораторных животных, использованных в опытах.

2.12. Методы математической и статистической обработки результатов.

Глава 3. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПОЛУЧЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИГЕНОВ В. аШкгаЫБ И СИБИРЕЯЗВЕННЫХ АНТИСЫВОРОТОК.

3.1. Изучение фенотипических свойств сибиреязвенного микроба и близкородственных бацилл, взятых для исследования.

3.2. Изучение ростовых свойств питательных сред различного состава и условий культивирования для накопления биомассы разных биологических форм сибиреязвенного микроба.

3.3. Выделение специфических антигенов сибиреязвенного микроба.

3.4. Получение споровых, капсульных-соматических и соматических сибиреязвенных гипериммунных сывороток.

Глава 4. ПОЛУЧЕНИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА.

4.1. Получение иммуноглобулинов диагностических 72 сибиреязвенных антиспоровых, капсульно-сома-тических, соматических флуоресцирующих, изучение их диагностической ценности.

4.2. Стабилизация свойств иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных методом сублимации.

Глава 5. ПОЛУЧЕНИЕ СИБИРЕЯЗВЕННОГО АЛЛЕРГЕНА (АНТРАКСИНА) ДЛЯ КОЖНО

АЛЛЕРГИЧЕСКОЙ ПРОБЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка иммунобиологических препаратов для диагностики сибирской язвы"

Актуальность проблемы.

Сибирская язва (антракс) - уникальная инфекционная болезнь животных и человека. Однажды возникнув в какой-либо местности, она может укореняться, сохраняя на многие десятилетия угрозу повторных вспышек.

Возбудитель сибирской язвы способен проникать, в организм человека и животных через повреждения кожных покровов, кишечный тракт и дыхательные пути, вызывая развитие кожной и висцеральной формы заболевания, которое в большинстве случаев заканчивается летально вследствие развития сепсиса. Сам возбудитель этого заболевания обладает способностью образовывать споры, высоко устойчивые к неблагоприятным факторам внешней среды, что обусловливает его длительное сохранение в анабиотическом состоянии в природе. Эта особенность споровой формы палочки антракса способствует созданию долговременных стационарно неблагополучных пунктов, что приводит к постоянной угрозе заражения людей и развитию эпизоотий.

Несмотря на значительное количество методов лабораторной диагностики сибирской язвы, среди ускоренных и экспресс-методов люминесцентная микроскопия занимает ведущее место. Кроме того, это - самый быстрый и надежный метод исследования, позволяющий в течение 3-5 часов дать ускоренный ответ на наличие в исследуемом материале сибиреязвенного микроба. Основную роль для ранней и ретроспективной диагностики сибирской язвы и выявления иммунологической поствакцинальной или постинфекционной перестройки организма играет кожно-аллергическая проба с сибиреязвенным аллергеном (Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Литусов Н.В. и др., 1999; Буярова C.B., Хаертынов К.С., Галиуллин А.К. и др., 2000). На сегодняшний день лабораторные службы не обеспечены сертифицированными препаратами для диагностики сибирской; язвы (Куличенко; А.Н., Еременко Е.И., Цыганкова 0:И., 2008). Поэтому исследования в этом направлении остаются весьма актуальными.

Цель исследования: разработка иммунобиологических препаратов.для идентификации Bacillus anthracis и диагностикисибирской- язвы.

Основные задачи исследования:

1. Изучить штаммы микроорганизмов^.взятые:для исследования, по основным идентификационнымместам:

2. Изучить ростовые свойства питательных сред различного состава и условия культивирования для накопления микробной массы В. anthracis (споровой, капсулыюй и соматической форм).

3: Выделить специфические, антигены, из различных! биологических . формхибиреязвенного микроба (споровой, капсульной и вегетативной).

4. Получить споровые, капсульно-соматические и соматические сибиреязвенные антисыворотки.

5; Получить, иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные соматические, споровые, капсульно-соматические флуоресцирующие, провести лабораторные; испытания на гомологичных и гетерологичных штаммах микроорганизмов.

6. Модифицировать способ изготовления* сибиреязвенного антигена (антраксина) для; кожно-аллергической проб ы.

Научная новизна работы.

Разработан научно-методический1 подход к выделению специфических антигенов В; anthracis, находящегося в споровой и вегетативной формах, а также его капсульного вещества.

Получены споровые, капсульно-соматические, соматические высокоактивные кроличьи антисыворотки на основе оптимальной комбинации различных специфичных антигенов сибиреязвенного микроба и иммунокоррек-торов с различным механизмом действия.

Практическая значимость работы.

Разработанные методические приемы по накоплению биомассы сибиреязвенного микроба, извлечению из нее специфических антигенов, получению высокоактивных иммунных сывороток, выделению из них иммуноглобулинов, оптимизация параметров конъюгации ^О и флуорохрома позволили получить сибиреязвенные флуоресцирующие споровые, соматические, капсульно-соматические иммуноглобулины для идентификации сибиреязвенного микроба.

Модификация технологии производства аллергена сибиреязвенного (антраксина) позволила снизить потери конечного продукта, увеличить срок годности с двух до трех лет и сохранить все его свойства.

Материалы научных разработок легли в основу 2 нормативных документов, утвержденных на федеральном уровне: регламент производства № 1458-04 «Аллерген сибиреязвенный жидкий для внутрикожной пробы (ан-траксин)» и фармакопейная статья предприятия 42-0397782706 «Аллерген сибиреязвенный жидкий для внутрикожной пробы (антраксин), раствор для внутрикожного введения».

Одобрена Ученым советом СтавНИПЧИ и утверждена директором института НД: пусковой регламент, инструкция по применению на иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные капсульно-соматические люминес-цирующие сухие (протокол № 3 от 30.03.2007 г.); пусковой регламент, технические условия, инструкция по применению на иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные соматические адсорбированные флуоресцирующие сухие (протокол № 7 от 31.10.2008 г.); пусковой регламент, технические условия, инструкция по применению на иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные споровые адсорбированные флуоресцирующие сухие (протокол № 9 от 26.12.2008 г.).

Положения, выносимые на защиту:

1. Определены микробиологические и биотехнологические приемы-и условия-, обеспечивающие получение высокоспецифичных антигенов сибиреязвенного микроба, находящегося в трех биологических формах: споровой, инкапсулированной, бескапсульной (вегетативной).

2. Разработанные схемы иммунизации кроликов-продуцентов (дозы антигенов, временные интервалы, способы и кратность их введения, комбинации иммунокорректоров с различным механизмом действия) позволяют получать высокоактивные, специфичные сибиреязвенные споровые, капсульные и капсульно-соматические гипериммунные антисыворотки практически у 100 % животных.

3. Модификация основных этапов изготовления аллергена-антраксина (экстракция, очистка) и разработанный ускоренный режим его лиофи-лизации с защитной средой высушивания сокращают время производства и потери продукта, увеличивают срок годности препарата до трех лет при сохранении всех его свойств.

4. Разработанные иммунобиологические препараты (флуоресцирующие иммуноглобулины и аллерген-антраксин) отвечают требованиям, предъявляемым к индикационным препаратам, и демонстрируют высокую эффективность при диагностике сибирской язвы и идентификации различных биологических форм В. anthracis (споровой, инкапсулированной, вегетативной).

Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы были представлены на VI Межгосударственной научно-практической конференции- Государств-участников СНГ (Волгоград, 13-14 сентября, 2005); VII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества Независимых Государств» (Оболенск, 3-5 октября, 2006); Втором съезде военных врачей медико-профилактического профиля Вооруженных сил Российской Федерации «Современные проблемы военной профилактической медицины, пути их решения и перспективы развития» (Санкт-Петербург, 15-17 ноября, 2006); Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 21-22 ноября, 2006), Всероссийской научной конференции, посвященной 210-й годовщине основания Военно-медицинской академии «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 17-18 апреля, 2008); расширенной научной конференции лабораторий и отделов Став-НИПЧИ Роспотребнадзора (Ставрополь, 2009).

Публикации.

Основное содержание диссертации отражено в 13 опубликованных научных работах, в том числе 1 работа — в периодических изданиях из перечня рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы, приложений. Работа изложена на 163 страницах, содержит 13 таблиц и 16 рисунков. Список литературы включает 217 источников, из них 156 отечественных и 61 зарубежный.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Горобец, Елена Александровна

ВЫВОДЫ

1. Определены питательные среды различного состава и условия-культивирования для накопления биомассы разных биологических форм В. аЫкгаыБ в достаточных количествах для производственных целей: максимальное спорообразование на среде Гладстона-Филдса на 12 сутки инкубации; оптимальная среда для капсулообразования - 1 % сы-вороточно-бикарбонатный агар Хоттингера при инкубации В. апИггаыБ в течение 20 ч; для получения вегетативной формы микроба — инкубация 18 ч на агаре Хоттингера.

2. Из споровой, инкапсулированной, вегетативной форм сибиреязвенного микроба изолированы специфические антигены, определены их дозы и комбинации с иммунокорректорами различного механизма действия (феракрил, тималин, циклофосфан), сроки и способы инъецирования кроликам-продуцентам, что дало возможность получить высокоактивные антисыворотки практически у 100 % животных.

3. Определены оптимальные параметры изготовления иммуноглобулинов диагностических сибиреязвенных флуоресцирующих сухих (споровых, соматических, капсульно-соматических): концентрация белка (10+1) мг/мл, количество флуорохрома (20 мг на 1 г белка), значение рН (9,5) и температуры реакционной смеси (20 °С), время конъюгации (4 часа), влияние Мф/Мб на серологическую активность, конъюгатов (3-5,5), обеспечивающие специфическое свечение в реакции прямой иммуноф-луоресценции микробным клеткам В. аЫкга&8 и отсутствие такового у близкородственных микроорганизмов (В. megaterium, В. ¡киг^гетгя, В. яиЪиШ, В. сегет, В, зрр.), что свидетельствует о надежности этого метода как идентификационного в сравнении с другими биологическими тестами, которые выявлялись у части спорообразующих штаммов-сапрофитов в том или ином количестве и степени выраженности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Сибирская язва относится к разряду особо опасных зоонозных инфекций и в настоящее время остается актуальной проблемой для здравоохранения и сельского хозяйства многих стран мира. Эта инфекция имеет глобальную распространенность, неравномерно охватывая все континенты и не регистрируясь лишь на немногочисленных островных территориях (Бакулов И.А., Гаврилов В.А., Селиверстов В.В., 2001; Черкасский Б.Л., 2002). Устойчивость сибиреязвенного микроба в почве, обусловленная феноменальной способностью спор сохраняться десятилетиями (Буравцева Н.П., Еременко Е.И., Цыганкова О.И. и др., 1998), способствует возникновению потенциально опасных по сибирской язве территорий, что приводит к развитию эпизоотических и эпидемических вспышек этого заболевания (Онищенко Г.Г., 2002; Онищенко Г.Г., Верещагин А.И., 2005).

События сентября-ноября 2001 г. в США, когда споры возбудителя сибирской язвы стали причиной многочисленных биотеррактов, сделали очевидной потенциальную опасность применения этого патогена, что послужило новым толчком для продолжения детального изучения этой инфекции и ее возбудителя, а также проведения исследований в области лабораторных методов диагностики и идентификации возбудителя сибирской язвы (Лобзин Ю.В., Волжанин В.М., Захаренко С.М., 2002; Рязанова А.Г., 2006; Evans R.G., Crutcher J.M., Shadel В. et al, 2002; Inglesby T.V., О' Toole Т., Henderson D.A. et al., 2002; Jernigan D.B., Raghunathan P.L., Bell B.P. et al., 2002).

В нашей работе представлены результаты научно-методических разработок по получению иммунобиологических препаратов для идентификации сибиреязвенного микроба и диагностики сибирской язвы.

На первом этапе исследований мы провели сравнительное изучение основных фенотипических свойств, присущих В. anthracis: тинкториальные свойства, морфология колоний на плотных питательных средах, характер роста на бульоне, подвижность, чувствительность к пенициллину (тест «жемчужного ожерелья»), чувствительность к сибиреязвенному бактериофагу «Гамма А-26», лецитиназная активность, способность гемолизировать эритроциты, капсулообразование. Были протестированы 14 штаммов В. anth-racis и 46 штаммов спорообразующих близкородственных микроорганизмов, относящихся к различным видам.

Тесты были характерны для сибиреязвенного микроба и свидетельствовали о стабильности фенотипических свойств всех штаммов- В. anthracis, взятых в опыты.

Сравнительный анализ фенотипических свойств близкородственных сапрофитов рода Bacillus выявил достаточно широкую вариабельность их биологических свойств: некоторые штаммы обладали одним или даже сочетанием нескольких признаков, характерных для возбудителя сибирской язвы: два штамма не мутили бульон Хоттингера, один из них давал слабоположительный результат в тесте на щелочную фосфатазу, другой, кроме этих признаков, был лецитиназно и гемолитически неактивным; гемолитическая активность отсутствовала у 2 штаммов, у одного этот признак сочетался с отрицательным результатом в тесте на лецитиназную активность, у другого — со слабым результатом на щелочную фосфатазу; из 11 неподвижных штаммов 3 сочетали этот признак с сомнительным результатом в пробе «жемчужного ожерелья», 4 - с отсутствием лецитиназной активности, один - со слабоположительным тестом на щелочную фосфатазу, а один штамм обладал всеми этими свойствами.

На этом основании можно сказать, что при идентификации выделенных штаммов по биологическим свойствам необходимо использовать весь комплекс фенотипических тестов, а также привлекать другие надежные методы, например, ПЦР, реакцию иммунофлуоресценции, позволяющие четко дифференцировать сибиреязвенный микроб от штаммов близкородственных микроорганизмов.

Учитывая особенности биологии сибиреязвенного микроба, проявляющиеся в возможностях его существования в разных морфологических формах: споровой, инкапсулированной, вегетативной (бескапсульной), мы провели ряд исследований по изучению ростовых свойств питательных сред различного состава и условий культивирования для накопления биомассы каждой из перечисленных форм В. anthracis.

Для сравнительного изучения спороборазования и накопления споровой биомассы В. anthracis мы использовали агар Гладстона-Филдса (Gladstone L.P., Fields P., 1940), картофельный агар и питательную среду из казеинового перевара; наиболее пригодные для спорообразования.

Для посева на вышеуказанные питательные среды и агар Хоттингера (контрольная, среда); использовали вирулентные и вакцинные штаммы В: anthracis. Восемнадцатичасовые культуры вегетативных клеток смывали 0,15 М раствором NaCF и путем, разведений получали концентрацию 1x103 м.к./мл. Посевной материал наносили в объеме 0,1 мл на поверхность пяти чашек каждой питательной среды. Посевы инкубировали при. 32 °С. Спорообразование оценивали, подсчитывая количество спор и вегетативных клеток в 10шолях* зрения в мазках, окрашенных по Ребигеру. Мазки готовили через 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14 суток. Процент спорообразования подсчитывали, вычисляя среднее количество спор В. anthracis.

Спорообразование на среде Гладстона-Филдса было максимальным (98-100 %) на 12 сутки инкубации, тогда как на остальных средах и контрольной к этому сроку образовывалось (15+5) % спор.

Для изучения капсулообразования сибиреязвенного микроба мы использовали 1 % сывороточно-бикарбонатный агар Хоттингера, агаризован-ную питательную среду «СОПЭК» и жидкую белковую среду ГКИ, на которые засевали вирулентные сибиреязвенные штаммы и штамм В. anthracis 71/12. Посевы помещали в анаэростат, в котором 50% воздуха замещали углекислотой, инкубировали при температуре (36+1) °С в течение (20+2) часов. Образовавшиеся, колонии на плотных питательных средах были полупрозрачные, слизистые, тянущиеся за петлей, что характерно для М- или SM-форм сибиреязвенного микроба.

Как показали исследования, капсулообразование происходило на всех испытанных питательных средах, но для дальнейших манипуляций по препаративному выделению капсульного вещества В. anthracis мы избрали менее сложную по солевому составу среду — сывороточно-бикарбонатный агар Хоттингера. От жидкой белковой питательной среды ГКИ мы отказались из-за необходимости центрифугирования для получения бакмассы.

Для более полного извлечения водорастворимых антигенных компонентов сибиреязвенного микроба (споровой и вегетативной' форм) мы сочли целесообразным использовать режим ультразвуковой дезинтеграции микробных клеток в сочетании с водно-солевой экстракцией (Афанасьев E.H., 1984; Тюменцева И.С., 1996). В силу того, что споры В. anthracis оказались довольно устойчивы к воздействию УЗ-дезинтеграции, для разрушения спор мы предварительно проводили экструзию на Х-прессе - пятикратное продав-ливание через фильеры замороженной при минус (45+5) °С биомассы. Кроме этого, на конечном этапе мы вдвое увеличили концентрацию раствора натрия хлорида, в который дополнительно добавили 1 % раствор тритона Х-100, который является лучшим реагентом, позволяющим максимально увеличить выход растворимых компонентов мембран, выделяемых в неденатурируемых условиях. Диализировали против дистиллированной воды, разливали в ампулы ШПВ-6 и лиофилизировали. Детрит суспендировали в дистиллированной воде и также лиофилизировали. Все манипуляции по изоляции антигенов проводили на холоду при 4° С.

В основу методики по извлечению очищенного капсульного вещества положен способ, изложенный О.Н. Лопаткиным, H.H. Буравцевой, Т.Н. Фун-тиковой и др. (1979), в нашей модификации, заключающейся в увеличении концентрации натрия хлорида в экстрагирующем растворе до 3 %, в преци-питирующем:растворе (NHt^SC^ - до 60 %, сокращении срока диализа на 24 часа и введении этапа ультрафильтрации на сефадексе G-100 на конечном этапе.

Выделенные водорастворимые комплексы и капсульное вещество В. anthracis использовали в дальнейшем для получения: гипериммунных сывороток и контроля их активности.

Анализ - литературы показал, что получаемые- экспериментаторами; сибиреязвенные антисыворотки к различным* антигенным фракциям спор и соматическим антигенам, а также капсульно-соматические иммунные сыворотки отличались различной активностью- и специфичностью, при-; этом циклы иммунизации; характеризовались длительностью, большим расходом? антигенного материала, травматичностыо; для животных при их довольно значительном отходе (падеж, и низкие титры специфических антител) (Лопаткин О.Н., Фунтикова Т.Н., Буравцева H.H., Матющенко B.C., 1983; Фунтикова Т.Н., Буравцева Н.П., Матющенко B.C. и др. 1983; Жданова E.H., Чернов B.C., Гончарова М.Н. и др., 1989; Чернов B.C., Жданова E.H., Гончарова М.Н., 1989; Найманов П.И., Михайлова В.А., Безносов М.В. и др., 1993; Тюv менцев С.Н., Безносов М.В., Андреевская Н.М. и др., 1993).

При получении антиспоровых иммунных кроличьих сывороток за основу была взята схема, разработанная И:С. Тюменцевой (1996). Для, иммунизации ¡ животных использовали водорастворимый антиген, иммунокорректор i¿

- феракрил (смесь железных (II, III): солей полиакриловой кислоты), который способен вызывать выраженное увеличение антителообразующих Т- и В-клеток (Кирдей Е.Г., Пинигина Н.М., Тюменцев С.Н и др., 1986). Дополнительно в качестве иммуногена введен детрит клеток В. anthracis споровой формы. Грундиммунизация включала пять последовательных парентеральных введений смеси антигена с 3% водно-спиртовым раствором феракрила с интервалами 3-7 дней. Через 30 суток после последней инъекции у животных брали из краевой вены уха кровь и отделяли не менее 4 мл иммунной сыворотки, в которую добавляли антиген с целью получения комплекса Аг-Ат. Основной цикл иммунизации состоял из четырех внутривенных инъекций комплекса Аг-Ат через каждые 3-4 дня тому же животному, от которого была получена иммунная сыворотка. В первую инъекцию основного цикла дополнительно вводили детрит в смеси с феракрилом в подушечки передних лап и подколенные лимфоузлы задних лап.

Специфическая активность полученных гипериммунных сывороток в НРИФ достигала 1:512 (+18,1 %; -15,3 %) и в РИД 1:32 (+13,3 %;'- 11,7 %). При этом иммуностимулирующий эффект при отсутствии токсического воздействия на животное, без возникновения адьювантной болезни достигался у 95 % кроликов. Продолжительность цикла иммунизации составляла 49-54 дня.

Для получения сибиреязвенных соматических антисывороток мы адаптировали схему иммунизации, предложенную E.H. Афанасьевым (2000) для получения чумных, бруцеллезных, сибиреязвенных (антиспоровых) и других диагностических сывороток: водорастворимый антиген пятикратно вводили кроликам внутривенно, одновременно внутримышечно в качестве иммуно-модулятора инъецировали тималин, в третью инъекцию дополнительно вводили внутримышечно циклофосфан (N1- бис/р-хлорэтил)-К'-0-триметиловый эфир диамида фосфорной кислоты).

Использование в качестве иммуномодулятора тималина способствует значительному повышению титров специфических антител сывороток крови за счет увеличения числа антителообразующих клеток в результате стимуляции функции макрофагов и хелперных Т-клеток. Циклофосфан, являясь кла-сическим иммуносупрессором, также активизирует макрофаги, стимулируя фагоцитарную, цитотоксическую и супрессивную (в отношении, главным образом, Т-лимфоцитов) функции (Лазарева Д.Н., Алехин Е.К., 1985). Такая избирательность в действии иммуностимулятора, с одной стороны, и определенная селективность в действии иммуносупрессора — с другой, служат оптимальной комбинацией препаратов обеих групп и режимов их использования для активации одних механизмов иммунитета и выключения других.

При данном способе продолжительность цикла иммунизации составляла 31-35 дней, расход антигенного материала — 1,5 мг на одного кролика. Титры специфических антител в сыворотках животных-продуцентов при определении в РИД достигали показателей 1:64 (+4,2 %; -4,0 %), а в БРИФ — 1:16384 (+13,3 %;-11,7%).

При данном способе иммунизации титры специфических антител в бивалентных сыворотках при определении в БРИФ (на вегетативной и кап-сульной формах) были 1:8192 (+13,3 %; -11,7 %) по соматическому антигену и 1:2048 (+13,3; -11,7 %) по капсуле. В РИД иммунные сыворотки формировали с капсульным веществом одну, а с соматическим антигеном - две линии преципитации.

Таким образом, по результатам исследования разработаны эффективные схемы иммунизации для получения сибиреязвенных гипериммунных сывороток, основанные на оптимальной комбинации различных антигенов с иммунокорректорами, обеспечивающие высокий специфический иммунный ответ практически у 100 % животных, значительное сокращение сроков иммунизации, материальных и трудозатрат.

При определении специфичности полученных гипериммунных сибиреязвенных сывороток на 46 штаммах-сапрофитах (В. megaterium, В. thuringien-sis, В. subtilis, В. cereus, В. spp.) в НРИФ наблюдалось свечение на 2-3 креста у 5-ти штаммов В. cereus (10,8 %), 2-х - В. megaterium (4,3 %) и 2-х - В. subtilis (4,3 %). Вследствие чего возникала необходимость в сорбции неспецифических антител.

Исследования О.Н. Лопаткина, И.В. Кронгауз (1983), И.С. Тюменцевой (1996), E.H. Афанасьева (2000) свидетельствуют о том, что при сорбции сибиреязвенных сывороток с использованием твердофазных полиакриламид-ных сорбентов на основе водорастворимых антигенов из гетерологичных штаммов не происходило попадания в сыворотки антигенного материала, и в них отсутствовал комплекс «антиген-антитело», мешающий в дальнейшем созданию диагностических систем. Такая иммуносорбция приводила к повышению специфичности сывороток. Титры антител снижались незначительно (в 1,5-2 раза), и конечный продукт оставался качественным сырьем для дальнейшей работы.

Так как способ приготовления полиакриламидных сорбентов включает использование высокотоксичных импортных реактивов и трудоемок, для иммуносорбции неспецифических антител из сибиреязвенных сывороток мы применили антигенный магноиммуносорбент, предложенный И.В. Жарнико-вой (2004).

При изготовлении аффинного сорбента с магнитными свойствами в качестве матрицы использовали оксид железа и алюмосиликат.

Для придания магносорбенту аффинных свойств на его поверхность иммобилизировали белковые лиганды — водорастворимые антигены, полученные из гетерологичных штаммов микроорганизмов - В. cereus 250,

В. cereus 104, В. cereus 111, В. cereus 8, В. megaterium 5. Магнитные свойства иммуносорбента позволили упростить процесс отделения его от жидкой фазы в магнитном поле и исключить процесс длительного центрифугирования. При сорбции иммунных сывороток использование данного иммуносорбента позволило не только освободить их от неспецифических антител на одном этапе, но и сохранить первоначальную активность нативных сывороток.

Способы выделения иммуноглобулинов из иммунных сывороток, отличаются большим разнообразием и эффективностью.

Для. сравнительного изучения мы избрали три метода выделения IgG: сульфатом аммония, каприловой кислотой и полиэтиленгликолем. Иммуноглобулины, выделенные разными способами, оценивали по количественному содержанию. белка в растворе, чистоте иммуноглобулиновой фракции, определяемой методом электрофореза в агарозном геле, специфической активности - в РИД и НРИФ.

Ставя перед собой задачу получения сибиреязвенных иммуноглобулинов для реакции-иммунофлуоресценции, нам было необходимо подобрать оптимальные условия конъюгации иммуноглобулинов с флуоресцеин-5-изотиоцианатом (количество флуорохрома, значения pH и температуры- реакционной! смеси, времени конъюгации, влияние молярных отношений Мф/Мб на серологическую активность конъюгатов), а также изучить физико-химические свойства, чувствительность и специфичность конъюгатов. Конъюгацию IgG с ФИТЦ проводили по методу A. Storz (1987).

Оценку результатов специфической активности и специфичности конъюгатов определяли на фиксированных мазках гомологичных и гетероло-гичных штаммов, находящихся в различных биологических формах прямым методом-окраски препаратов по А.Н. Coons, М.Н. Kaplan (1950).

Всего было проанализировано по 5 серий иммуноглобулинов, флуоресцирующих сибиреязвенных споровых, соматических, капсульно-соматических с концентрацией белка 0,9-1,1 % и молярным отношением Мф/Мб от 3,8 до 11,0. Установлено, что на степень связывания иммуноглобулинов с красителем влияют рН реакционной смеси и концентрация флуо-рохрома. Было отмечено, что после добавления красителя в первые минуты происходило снижение рН среды на 1,0+0,2, затем на протяжении 25-30 минут продолжалось дальнейшее снижение рН среды на 0,3-0,5. При этом степень конъюгации белка с ФИТЦ уменьшалась прямопропорционально снижению значения рН реакционной смеси, и значительная часть красителя не вступала в реакцию с белком. В связи с этим важен контроль показателей рН и проведение их корректировки в первые минуты после добавления ФИТЦ и через 30 мин после начала метки.

Наилучшие серии конъюгатов были получены в наших экспериментах из иммуноглобулинов в, выделенных каприловой кислотой, при значениях рН реакционной смеси 9,5, при использовании нагрузки ФИТЦ -20 мг на 1 г белка, при температуре 20 °С и 4-х часовом контакте белка.с красителем. Оптимальной концентрацией белка полученных флуоресцирующих иммуноглобулинов является (10+1) мг/мл, а показатель молярного соотношения флуо-рохром/белок - 3-5,5.

Используя вышеуказанные условия конъюгации иммуноглобулинов и флуоресцеин-5-изотиоцианата, нами получено по 10 экспериментально-производственных серий сибиреязвенных флуоресцирующих иммуноглобулинов. Специфическая активность вышеперечисленных препаратов испыты-валась на нативных свежеприготовленных взвесях штаммов В. аМкгаЫБ, находящихся в разных биологических формах, в пяти повторностях в концентрации 5x108 м.к./мл по ОСО мутности производства ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора. Установлено, что специфическая активность препаратов всех приготовленных серий характеризовалась красящим титром, равным разведению 1:32 - 1:128 при исследовании мазков гомологичных возбудителей, рабочее разведение препаратов - 1:16 - 1:64. '

При контроле специфичности в опыт были взяты штаммы-сапрофиты (В. сегеия — 11 штаммов; В. megaterium — 7 штаммов; В. Миг^гетгБ — 6 штаммов, В. БиЬНШ — 11 штаммов; В. $рр. - 11 штаммов), полученные в споровой и вегетативной биологических формах, окрашенные рабочим разведением флуоресцирующих иммуноглобулинов, соответствующих той или иной форме микроба. Результаты контролей свидетельствовали о высокой специфичности препаратов, так как у 46 испытанных близкородственных спорооб-разующих штаммов-сапрофитов не отмечено специфического свечения микробных клеток, что говорит о надежности реакции иммунофлуоресценции как дифференциального теста при идентификации В. anthracis.

Для определения чувствительности флуоресцирующих иммуноглобулинов использовали штаммы В. anthracis в следующих концентрациях: 5x106; lxlO6; 5x10s; 2,5х105; lxlO5; 5х104 м.к./мл. Установлено, что рабочее разведение испытанных серий препаратов давало возможность обнаруживать микробы в мазках из чистых культур, приготовленных из 2,5x105 и более микробных клеток в 1 мл. С помощью всех серий удалось выявить единичные бактерии в мазках, приготовленных из взвесей, содержащих 5x104 м.к./мл.

Оценка- физико-химических свойств флуоресцирующих иммуноглобулинов (внешний вид, растворимость, прозрачность, цветность, рН, потеря в массе при высушивании, концентрация белка, количественное соотношение ФИТЦ/белок), специфической активности и чувствительности показала их соответствие основным требованиям, предъявляемым к подобным препаратам.

Таким образом, нами получены иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные флуоресцирующие для идентификации сибиреязвенного микроба. На иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные флуоресцирующие составлена следующая нормативная документация, одобренная Ученым советом СтавНИПЧИ и утвержденная директором института: пусковой-регламент, инструкция по применению на иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные капсульно-соматические люминесцирующие сухие (протокол № 3 от 30.03.2007 г.); пусковой регламент, технические условия, инструкция по применению на иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные соматические адсорбированные флуоресцирующие сухие (протокол № 7 от 31.10.2008 г.); пусковой регламент, технические условия, инструкция по применению на иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные споровые адсорбированные флуоресцирующие сухие (протокол № 9 от 26.12.2008 г.).

Продолжительность процесса сублимационной сушки, во время которого регулируется температура высушиваемого материала до температуры минус 25 °С, составляла для сывороток крови (4+0,5) ч, антигенов - (3+0,5) ч, иммуноглобулиновых конъюгатов (2,5+0,5) часа. Во время сублимации строго поддерживалось низкое давление в камере, порядка 10-30 Па, и как можно более низкая температура испарителя - от минус 40 °С до минус 45 °С. Повышение температуры от минус 10 °С происходило постепенно, занимая определенное время, которое было оптимальным для сывороток - (7,5+0,5), антигенов-(5,5+0,5) ч, иммуноглобулиновых конъюгатов (3,5+0,5) часа.

Этап десорбции, т.е. удаление связанной влаги, происходил медленно, что являлось следствием увеличения энергии связи с материалом: для сывороток и антигенов — (11+1,0) ч, иммуноглобулиновых конъюгатов (7+1,0) часа. Температура препаратов постепенно росла до значения максимальной температуры досушивания, т.е. равновесного влагосодержания, практически равного остаточной влажности. Температура продукта должна быть высокой, однако ниже температуры, при которой он денатурирует. Оптимальная температура препаратов на этом этапе составляла (26,5+1,5) °С.

Терминальный период процесса сушки происходил до момента приближения регистрированных значений к заданным параметрам, которые не менялись в течение (2,5+0,5) ч и соответственно равнялись следующим показателям: температура десублиматора - минус' 70 °С, температура нагревателей равна температуре материала и равна температуре десорбции, т.е. (26,5+1,5) °С.

Кроме вышеописанного «длительного» (I) режима лиофилизации (24+2) ч, нами отработан «ускоренный» (II) (16+2) ч режим сушки, при котором сокращено время удаления как свободной воды (почти вдвое), так и связанной воды. При I режиме длительность удаления свободной воды — (14,5+0,5) ч, связанной влаги - (10,5+0,5) ч при конечной температуре подогрева,(25+1) °С. При II режиме длительность периода сублимации и десорбции предусмотрены в течение (15+3) ч при повышении температуры плиты до 45 °С.

В комплексе мероприятий по борьбе с сибиреязвенной инфекцией важное место занимает своевременная диагностика заболевания у людей и животных. Основную роль для ранней и ретроспективной диагностики сибирской язвы и выявления иммунологической поствакцинальной или постинфекционной перестройки организма играет кожно-аллегическая проба с сибиреязвенным аллергеном.

С 1994 г. в Ставропольском научно-исследовательском противочумном институте началось освоение производственного выпуска сибиреязвенного аллергена и составление нормативной документации.

Впервые регламент № 399-97 на аллерген сибиреязвенный жидкий для внутрикожной пробы (антраксин) был утвержден ФГУН ГИСК им. Тарасе-вича в 1997 г., а фармакопейная статья (ФС 42-3878-99) была утверждена в 1999 г. С этого момента в СтавНИПЧИ налажен коммерческий выпуск ан-траксина. По истечении срока действия НД и с учетом изменившихся требований к ее оформлению были составлены и утверждены в соответствующем порядке новый регламент производства (РП № 1458-04) и фармакопейная статья предприятия (ФСП 42-0397782706), одним из разработчиков которых являлась автор настоящих исследований.

Однако, вышеизложенная технология производства не лишена некоторых недостатков. Так, этап фильтрования приводит к потере 1/4-1/3 готового продукта и занимает от 2-х до 3-х часов. Еще одним существенным недостатком является то, что коммерческий антраксин жидкий, что значительно лимитирует срок его годности.

В модифицированном нами технологическом процессе экстракцию аллергена проводили путем кислотного гидролиза: 2 N раствором уксусной кислоты, заменив кипячение автоклавированием 1,5 часа при температуре 110 °С (0,5 атм). Этап фильтрации заменили центрифугированием при 6000 об/мин в течение (20±5) минут.

Для подбора оптимальной защитной среды высушивания было изготовлено по 5 серий препарата с различными защитными средами: серии С 1-5 — 15 % раствор сахарозы, серии 6-10 - тиомочевиновая среда, состоящая из 10 % раствора сахарозы, 1 % раствора желатина, 1 % раствора тиомочевины, и серии С 11-15 - без защитной среды.

Результаты исследований свидетельствуют о том, что оптимальной защитной средой высушивания явилась тиомочевиновая среда. В форме лиофилизата с тиомочевиновой средой было изготовлено 5 серий препарата.

По внешнему виду антраксин, высушенный с тиомочевиновой средой, представлял собой плотную мелкопористую, хорошо растворимую таблетку, белого цвета, без признаков микрооттаивания. В ампулах С 1-5 с высоким процентом сахарозы при лиофилизации часто происходила ее карамелизация.

Антраксин, лиофилизированный без среды высушивания, имел вид рыхлой, пористой таблетки, рассыпающийся при встряхивании.

Разработанные нами иммунобиологические препараты пользуются постоянным спросом и применяются в лабораторной практике Федеральными государственными учреждениями здравоохранения «Центры гигиены и эпидемиологии». Иммуноглобулины сибиреязвенные флуоресцирующие регламентированы для специфической индикации сибиреязвенного микроба, и они входят в перечень укомплектования диагностическими препаратами и расходными материалами специализированных противоэпидемических бригад (СПЭБ) согласно Приказу № 330 от 22.11.2007 г. МЗ и соцразвития РФ «О регламенте функционирования СПЭБ».

Иммуноглобулины флуоресцирующие и аллерген сибиреязвенный жидкий для внутрикожной пробы (антраксин) рекомендованы для применения при индикации, идентификации возбудителя сибирской язвы и диагностики заболевания (МУК 4.2-08 Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы, 2008).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Горобец, Елена Александровна, Ставрополь

1. Абалакин, В.А. Влияние протективного антигена Bacillus anthracis на формирование иммунитета под действием сибиреязвенных живых вакцин / В.А. Абалакин, Н.П. Буравцева, Б.Л. Черкасский // Журн. микробиол. 1990. - № 5. - С. 72-75.

2. Абалакин, В.А. Выявление специфических антигенов при экспериментальной сибирской язве / В.А. Абалакин, A.B. Сергеева, Б.Л. Черкасский // Журн. микробиол. 1989. - № 12. - С. 63-67.

3. Абалакин, В.А. Применение иммунологической адсорбции в гетерогенном иммуноферментном анализе при определении антител к про-тективным детерминантам Bacillus anthracis / В.А. Абалакин // Журн. микробиол. 1989. - № 2. - С. 63-67.

4. Абгарян, А.Г. Совершенствование методов индикации возбудителя сибирской язвы: Дис. . канд. мед. наук: (03.00.07) / А.Г. Абгарян. -Ставрополь, 2001. 128 с.

5. Абдуллин, Х.Х. Эпизоотология / Х.Х. Абдуллин // Сибирская язва. -М.: «Колос», 1976. С. 81-82.

6. Адилов, Д.А. К клинике сибирской язвы / Д.А. Адилов, Б.М. Агзамов // Мед. журн. Узбекистана. 1973. - № 1. - С. 62-64.

7. Азизбекян, P.P. Нестабильность некоторых ауксотрофных маркеров Bacillus thuringiensis / P.P. Азизбекян, P.A. Белых // Генетика. 1981. -Т. 17, № 11. - С. 1936-1944.

8. Активность сывороток, полученных по различным схемам иммунизации / А.Е. Волков и др. // Особо опасные и редко встречающиеся тропические инфекции: Тез. докл. Волгоград, 1980. — С. 14-15.

9. Афанасьев, E.H. Научно-методические аспекты экспресс-диагностики возбудителей особо опасных зоонозных инфекций (чума, бруцеллез, сибирская язва): Автореф. дис. . докт. мед. наук: (03.00.07) / E.H. Афанасьев. Ростов-на-Дону, 2000. - 45 с.

10. Африкян, Э.К. Энтомопатогенные бактерии и их значение: Дис. . докт. биол. наук / Э.К. Африкян. Ереван, 1973. - 418 с.

11. Бабич, М.А. Получение очищенного полисахаридного антигена из культур сибирской язвы / М.А. Бабич, В.А. Плотникова // Труды Гос. науч.-контрольного ин-та вет. препаратов. 1952. - Т. 3. - С. 167-169.

12. Бакулов, И.А. Сибирская язва (антракс): новые страницы в изучении «старой» болезни / И.А. Бакулов, В.А. Гаврилов, В.В. Селиверстов. -Владимир: «Посад», 2001. 218 с.

13. Безносов, М.В. Выделение и изучение специфических антигенов Bacillus anthracis с целью конструирования диагностических профилактических препаратов: Автореф. дис. . канд. биол. наук (03.00.07) / М.В. Безносов. Саратов, 2000. - 22 с.

14. Безносов, М.В. Серологические методы диагностики сибирской язвы / М.В. Безносов, Е.П. Голубинский, A.B. Родзиковский // Журнал инфекционной патологии. 1998. — Т. 5, № 4. — С. 21-25.

15. Бернгоф, Ф.Г. Упрощенный способ приготовления специфических агглютинирующих тифо-паратифозных сывороток / Ф.Г. Бернгоф, П.И. Скрыпник // Журн. микробиол. 1937. - Т. 19, № 2. - С. 226-235.

16. Биохимия и иммунология микробных полисахаридов / Н.В. Васильев и др.-Томск, 1984.-174 с.

17. Биргер, О.Г. Сибирская язва // Микробиологические методы исследования при инфекционных заболеваниях / О.Г. Биргер. М.: Медицина, 1975.-С. 77-93.

18. Бланков, Б.И. Применение лиофилизации в микробиологии / Б.И Бланков, Д.Л. Клебанов. М., 1961. - С. 57-60, 86-87.

19. Богоявленская, Л.Б. Стандартизация диагностических реагентов модели О-сальмонелезных сывороток: Автореф. дис. . докт. мед. наук / Л.Б. Богоявленская. Москва, 1973. - 23 с.

20. Буравцева, Н.П. Кадастр стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктов в Кабардино-Балкарской республике / Н.П. Буравцева, Е.И. Еременко, А.Г. Абгарян / СтавНИПЧИ; протокол № 9, 1999 от 21.10.99

21. Буравцева, Н.П. Свойства сибиреязвенного аллергена-антраксина / Н.П. Буравцева, Н.М. Иеляпин, Т.Н. Фунтикова // Сборник научных трудов. Новороссийск, 1994. - Вып. 1. С. 14-16.

22. Бургасов, П. Н. Сибиреязвенная инфекция / П.Н. Бургасов, Г.И. Рожков. М.: Медицина, 1984. - 208 с.

23. Бурденко, Т.А. Разработка и использование РНГА для серодиагностики сибирской язвы: Автореф, дис. . канд. мед. наук / Т.А. Бурденко. — Кишинев, 1973. 18 с.

24. Бурденко, Т.А. Серологические методы исследования при сибирской язве / Т.А. Бурденко // Иммунодиагностика и специфическая профилактика инфекционных болезней. Кишинев, 1974. - С. 84-92.

25. Внеклеточные биологические продукты / Ю.В. Езепчук и др. // Эпиде-миол., микробиол. и инфекционные болезни. — 1978. № 3. - С. 197200.

26. Гинсбург, H.H. Сибирская язва / H.H. Гинсбург. Москва: Медицина,1975.- 160 с.

27. Гипериммунные сыворотки / С.П. Карпов и др. Томск, 1976. - 378 с.

28. Горобец, Е.А. Опыт получения сибиреязвенных капсульно-соматических флуоресцирующих иммуноглобулинов / Е.А. Горобец // Актуальные проблемы медицины: Сб. науч. работ. — Томск, 2004. — Т. З.-С. 294.

29. Горобец, Е.А. Разработка биотехнологии изготовления капсульно-соматических сибиреязвенных люминесцирующих иммуноглобулинов / Е.А. Горобец // Естествознание и гуманизм: Сб. науч. работ. Томск, 2005.-С. 37.

30. Горобец, Е.А. Разработка и получение иммунобиологических препаратов для лабораторной диагностики сибирской язвы / Е.А. Горобец, E.H. Афанасьев, И.С. Тюменцева // Вестник СГУ: Научный журнал. -Ставрополь, 2006. Вып. 47 (2). - С. 290-292.

31. Горобец, Е.А. Совершенствование биотехнологии производства аллергена1 антраксина / Е.А. Горобец // Актуальные проблемы медицины: Сб. науч. работ. Томск, 2004. - Т. 2. - С. 294.

32. Горобец, Е.А. Современное состояние лабораторной диагностики сибирской язвы (обзор литературы) / Е.А. Горобец. Ставрополь, 2005. -38 с. - Деп. в ВИНИТИ 01.04.2005 г., № 443-В2005.

33. Гофман, И.Л. Опыт производственного изготовления сывороток к типовым и групповым антигенам шигелл Флекснера / И.Л. Гофман // Кишечные и воздушно-капельные инфекции. М., 1969. - С. 511-518.

34. Демина, Н.С. Действие дегидратации на микроорганизмы / Н.С. Демина, С.В. Лысенко // Биол. науки. 1987. - № 8. - С. 50-52.

35. Детекция штаммов сибиреязвенного микроба с использованием ПЦР / И.В. Тучков и др. // Генетика, микробиология и совершенствование методов лабораторной диагностики особо опасных инфекций.- Саратов. 1991. - С. 89-91.

36. Диагностика сибирской язвы / Л.И. Маринин и др. // Проблемы мед. и экол. биотехнологии: Сб. тез. докл. юбил. науч. конф., посвящ. 25-летию ГНЦ прикладной микробиол., 14-15 дек. 1999 г. — Оболенск, 1999.-С. 106-107.

37. Долинов, К.Е. Основы технологии сухих препаратов. М.: Медицина, 1969.-С. 8-40; 97-152.

38. Дунаев, Г.В. Биология возбудителя / Г.В. Дунаев, С.Г. Колесов // Сибирская язва. М.: Колос, 1976. - С. 11-49.

39. Езепчук, Ю.В. Биохимические основы иммуногенности Bacillus anth-racis: Автореф. дис. . док. биол. наук / Ю.В. Езепчук. М., 1968. - 59 с.

40. Еременко, Е.И. Биологические и популяционные аспекты патогенно-сти Bacillus anthracis: Дис. . док. мед. наук: (03.00.07) / Е.И. Еременко. Ставрополь, 1997. - 275 с.

41. Еременко, Е.И. Методические рекомендации по выделению штаммов сибиреязвенного микроба с атипичным капсулообразованием и вирулентностью / Е.И. Еременко, Н.П. Буравцева, В.А. Проскурина. М., 1987.- 11 с.

42. Еременко, Е.И. Методические рекомендации по оценке патогенных и иммуногенных свойств сибиреязвенных культур in vitro / Е.И. Еременко, Н.П. Буравцева', Т.Н. Фунтикова. Москва., 1997. - 5 с.

43. Еременко, Е.И. Потребность сибиреязвенного микроба в факторах роста и новые питательные среды для его культивирования / Е.И. Ерёменко: Автореф. дис. . канд. мед. наук: (03.00.07) /Е.И. Еременко. — Саратов, 1986. 26 с.

44. Ефременко, В.И. Магносорбенты в микробиологических исследованиях / В.И. Ефременко. Ставрополь, 1996.- 131 с.

45. Жданова, Л.Г. Действия ультразвука на биологические свойства бактерий кишечной группы. Сообщ. 1. Дезинтегрирующее действие ультразвука /Л.Г. Жданова, И.Ф. Перс // Журн. микробиол. 1961. - № 11.-С. 73-79.

46. Жолдошев, С.Т. Оценка кожно-аллергической пробы в диагностике сибирской язвы у людей / С.Т. Жолдошев, А.Б. Гончарова // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 2007. - Вып. 93. - С. 89-90.

47. Заболеваемость сибирской язвой животных и людей в Предкавказье и Закавказье в 1960-1961 гг. / Н.И. Макаров и др. Журн. микробиол. -1963. -№5-С. 112-113.

48. Иммуноаллергическая диагностика сибирской язвы человека с помощью антраксина / Э.Н. Шляхов и др.// Журн. микробиол. 1970. - № 6. - С. 79-83.

49. Кантеева, Е.А. Оптимизация этапов приготовления чумных, туляре-мийных, бруцеллезных иммунобиологических препаратов: Автореф. дис. . канд. мед. наук / Е.А. Кантеева. Ставрополь, 1996. - 25 с.

50. Карпенко, В.В. Обезболивание животных в эксперименте: Методические рекомендации / В.В. Карпенко, В.И. Сачков. М., 1985. - 53 с.

51. A.c. № 1390836 Способ стимуляции антителообразования у животных / Е.Г. Кирдей, Н.М. Пинигина, С.Н. Тюменцев и др. 1986. Заявлено; Опубл., Бюл. № 1.

52. Коваленко, A.A. Разработки хемилюминесцентного анализа для идентификации сиб. язвы: Автореф. дис. . канд. мед. наук: (03.00.07) / A.A. Коваленко. Саратов, 1992. - 18 с.

53. Кожухов, В.В. Перспектива развития вакциннопрофилактики сибирской язвы /В.В. Кожухов, С.В. Сурков, И.Д. Кравец // Материалы научн. конференции НИИ микробиологии МО РФ, 30.11 01.12. 1995. -Киров, 1995.-С. 10.

54. Колиснык. A.B. Иммуноглобулиновая природа преципитирующих антител к основным антигенам холерного вибриона // Иммунология и иммунопрофилактика чумы и холеры. Саратов, 1980. - С. 198-201.

55. Колиснык, A.B. Иммуноглобулиновый спектр и серологическая активность специфических антител к некоторым антигенам холерного вибриона: Автореф. дис. . канд. биол. наук / A.B. Колиснык. — Саратов, 1981.-23 с.

56. Коников, P.E. Реакция торможения непрямой гемагглютинации как метод типирования гипериммунных сибиреязвенных сывороток / P.E. Коников, Ф.С. Носков, O.A. Сомов // Журн. микробиол. 1996. - № 10. -С. 45-49.

57. Конструирование ПЦР-тест-систем для обнаружения опасных патогенных бактерий: возбудителей чумы, бруцеллеза и сибирской язвы / А.Н. Куличенко и др. // Материалы I Всероссийской науч.- практ. конф. -Сочи, 1996. С. 67-70.

58. Корн, М.Я. Основные физические представления о люминесценции и методика исследования препаратов, обработанных люминесцентными сыворотками / М.Я. Корн // Иммунолюминесценция в медицине. М.: Медицина, 1977. - С. 70.

59. Краткий определитель бактерий Берги. М.: Мир, 1980. - С. 287, 289.

60. Кузьмин, H.A. Люминесцентная микроскопия в диагностике бактериальных болезней животных / H.A. Кузьмин // Люминесцентный анализ в ветеринарии. М.: Колос, 1997. - С. 77-84.

61. Кузьмин, H.A. Об антигенных связях возбудителя сибирской язвы и сапрофитных аэробных бацилл / H.A. Кузьмин // Сибирская язва в СССР и проблемы ее ликвидации. М., 1968. - С. 67-68.

62. Кузьмин, H.A. Некоторые данные о соматических антигенах Bacillus anthracis / H.A. Кузьмин II Журн. микробиол. 1971. - № 2. - С. 131137.

63. Куличенко, А.Н. Современные проблемы сибирской язвы в Российской Федерации / А.Н. Куличенко, Е.И. Ерёменко, О.И. Цыганкова // Вестник Российской военно-медицинской академии. Санкт-Петербург, 2008. - №2 (22) . - Ч. II. - Приложение. - С. 619-620.

64. Куфлина, С.А. Эвтаназия экспериментальных животных: Методические рекомендации по выведению животных для экспериментов / С.А. Куфлина, Т.Н. Павлова. -М., 1985. 9 с.

65. Кэбот Е.А. Экспериментальная иммунология / Э.А. Кэбот, М.М. М.: Медицина. - 1968. - С. 539-582.

66. Лабораторная диагностика для обнаружения возбудителя сибирской язвы: Методические указания. Ставрополь, 2008. - 65 с.

67. Лазарева, Д.Н. Стимуляторы иммунитета /Д.Н. Лазарева, Е.К. Алехин. -М.: Медицина, 1985.-255 с.

68. Леви, М.И. Реакция пассивной гемагглютинации и нейтрализации антител при некоторых инфекциях / М.И. Леви, Н.И. Басова, Ю.Г. Сучков // Журн. микробиол. 1962. - № 10. - С. 40-45.

69. Левина, E.H. Метод иммунофлуоресценции для выявления возбудителей сибирской язвы / E.H. Левина, В.Р. Архипова, И.П. Павлова // Метод иммунофлуоресценции в диагностике инфекционных заболеваний. -М., 1969. С. 50-53.

70. Левина, E.H. Меченные флуоресцеином антитела для выявления бактерий сибирской язвы. Сообщение 1 / E.H. Левина // Журн. микробиол. -1958.-№ 1.-С. 9-15. I

71. Левина, E.H. Получение капсульных сибиреязвенных сывороток и методы определения их иммунологической активности // E.H. Левина, В.Р. Архипова // Лаб. дело. 1964. - № 10. - С. 610-623.

72. Лобзин, Ю.В. Сибирская язва / Ю.В. Лобзин, В.М. Волжанин, С.М. За-харенко // Клиническая микробиология и антимикробная терапия. -2002. Т.4, № 2. - С. 104-127.

73. Методы получения и изучения капсульных антигенов вирулентных и авирулентных штаммов сибиреязвенного микроба / О.Н. Лопаткин, и др. // Микробиол., иммунол., клиника и эпидемиол. инфек. заболеваний: Сб. науч. работ. Ставрополь, 1979. - С. 19-20.

74. Методы изучения биологических свойств возбудителя сибирской язвы / Л.И. Маринин и др. М:: ЗАО МП «Гигиена», 2009. - С. 62-68.

75. Микробиологическая диагностика сибирской язвы / Л.И. Маринин и др. -М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999. 224 с.

76. Митин, С.С. Получение цитоплазматических антигенов для определения активности противосибиреязвенных сывороточных препаратов в реакции диффузной преципитации / С.С. Митин // Биол. препараты против инфекционных болезней животных. М., 1981. - С. 23-28.

77. Напалкова, Г.М., Зыкин Л.Ф., Голосеев Ю.А., Мананков В.В. // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций: Матер, науч. конф. Волгоград, 1992. — С. 165.

78. Научные основы производства диагностических препаратов (Сыворотки для идентификации энтеробактерий) / В.В. Смирнов и др.- Киев: Наукова Думка, 1980. 195 с.

79. Никитин, A.B. Получение фракции цитоплазмы сибиреязвенного вакцинного штамма 71/12 / A.B. Никитин // Соврем, пробл. зооноз. инфекций. М., 1981.-С. 102-103.

80. Носков, Ф.С. Флуоресцирующие антитела и их применение в вирусологии / Ф.С. Носков // Респираторные вирусные инфекции. Л., 1969. - С. 217-242.

81. Обеззараживание биологического материала и объектов внешней среды, зараженных бактериями I-IV групп патогенности, при исследовании методом ПНР: Методические указания / А.Н. Куличенко и др. -Саратов, 1996. С. 9.

82. Онищенко, Г.Г. О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2004 году: Государственный доклад/ Г.Г. Онищенко, А.И. Верещагин. М., 2005. - С. 182-183.

83. Опыт использования генодиагностики в целях оптимизации эпидемиологического надзора за сибирской язвой / В.В. Кутырев и др. // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2000. - № 4. - С. 17-21.

84. Опыт получения иммунных сывороток для производства диагностических препаратов / Е.В. Алиева и др. // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». 2008. - № 1. — С. 10-13.

85. Оценка возможности идентификации! возбудителя сиб. язвы с использованием моноклональных антител к протективному антигену / Г.Д. Елагин и др. // Тез. докл. научно-практической конф. Саратов, 1997-Т. 2.-С. 174.

86. Печникова, И.В. Влияние сред высушивания на способность чумной вакцины ЕВ вызывать продукцию антител в организме экспериментальных животных / И.В. Печникова, А.И. Тинкер // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1977. - Вып. 3. - С. 32-34.

87. Получение высокоактивных иммунных сывороток против сибиреязвенного микроба / С.Н. Тюменцев и др. // Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особо опасных инфекций. Ставрополь, 1993. - С. 298-299.

88. Получение диагностических препаратов к антигену возбудителя сибирской язвы / C.B. Буярова и др. // Научные основы производства вет. биол. препаратов: Тез. докл. Всеросс. науч.-практ. конф., посвящ. 30-летию ВНИИТ и БП. Щелково, 2000. - С. 246-247.

89. Получении и сравнительная оценка экспериментальных сибиреязвенных сывороток в опытах на различных животных / И.Д. Кравец и др. // Журн. микробиол. 1975. - № 1. - С. 85-88.

90. Приготовление и применение магнитных сорбентов для изучения антигенов микроорганизмов: Методические рекомендации / В.Г. Пушкарь и др.- Волгоград, 1984. 16 с.

91. Приказ № 1179 от 10 октября 1983 г. Об утверждении нормативов затрат кормов для лабораторных животных в. учреждениях здравоохранения. М, 1983.

92. Приказ № 330 от 22.11.2007. О регламенте функционирования СПЭБ. М.: МЗ и соцразвития РФ, Федеральная служба в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2007 - С. 67, 69, 106-107.

93. Притулин, П.И. Об ускоренной диагностике сибирской язвы с применением флуоресцирующих антител / И.П. Притулин, H.A. Кузьмин // Ветеринария. 1959. - С. 69-73.

94. Прогнозирование выживаемости лиофилизированных клеток Yersinia pestis EV, основанное на методе «ускоренного хранения» / Н.В. Лопатина и др.// Вестник Всесоюз. микробиол. общества (Ростовское отделение). Ростов-на-Дону, 1989. - Вып. 1. - С. 4-147.

95. Разработка рациональной биотехнологии получения диагностических иммунных сывороток / И.С. Тюменцева и др. // Вестник Российской военно-медицинской академии. Санкт-Петербург, 2008. - № 2 (22). — Приложение. - Ч. 1. - С. 210-211.

96. Рязанова, А.Г. Характеристика биологических свойств атипичных штаммов сибиреязвенного микроба, усовершенствование методов их индентификации и дифференцирования от близкородственных бацилл:

97. Автореф. дис. . канд. мед. наук: (03.00.07)/ А.Г. Рязанова. Ростов-на-Дону, 2006. - 23 с.

98. Сибирская язва / Н.П. Буравцева и др. // Лабораторная диагностика возбудителей опасных инфекционных болезней. Саратов, 1998. — Т. 1. - С. 50-89.

99. Сибирская язва / П.Н. Бургасов и др. М.: Медицина, 1970. - 128 с.

100. Сибирская язва: актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики / Г.Г. Онищенко и др. М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999. - 448 с.

101. Совершенствование способа получения иммунных кроличьих сибиiреязвенных капсульно-сомати^еских сывороток / Е.А. Горобец и др. // Медицинский вестник Северного Кавказа. Ставрополь, 2008. - № 1 (9). - С. 42-44.

102. Степанов, A.C. Разработка основ генетического анализа возбудителя сибирской язвы: Дис. . док. мед. наук: (03.00.07) / A.C. Степанов. — Саратов, 1992. 230 с.

103. Тамбовцев, Е.П. Методы статистической обработки результатов серологических реакций / Е.П. Тамбовцев, С.Г. Ахметкалиев, Н.П. Пятницкий // Журн. микробиол. 1969. - №10. - С. 26-31.

104. Тимошин, В.Б. Конструирование видоспецифического ДНК- зонда для индикации возбудителя сибирской язвы: Автореф. . дис. кан. мед. наук: (03.00.07) / В.Б. Тимошин. Саратов, 1994. - С. 22.

105. Ультразвуковая дезинтеграция бруцелл / Н.Г. Шин и др. // Изв. АН Каз. СССР. Сер. биол. 1973. - № 1.-С. 68-71.

106. Фадеева, Jl.JI. Консервация вирусов различных групп для целей длительного хранения / Л.Л. Фадеева, Э.В. Халецкая, А.Ю. Селеднева // Методы исследования в молекулярной, общей и медицинской вирусологии. М., 1987. - С. 66-73.

107. Чард, Т. Радиоиммунологические методы / Т. Чард. — М.: Мир, 1981.246 с.

108. Черкасский, Б.Л. Микробные антигены / Б.Л. Черкасский, В.А. Аба-лакин, Л.В. Сергеева // Сб. науч. трудов МосНИИЭМ. 1978. - Т. XX. -С. 143-146.

109. Черкасский, Б.Л. Эпидемиология и профилактика сибирской язвы / Б.Л. Черкасский. М.: «ИНТЕРСЭН». - 2002. - 384 с.

110. Шаханина, К.Л. Иммуносорбенты и их использование для выделения чистых антител / К.Л. Шаханина // Биохим. и биофиз. микроорганизмов. Горький, 1981. -В.9. - С.15-23.

111. Шесточенко, М.А. Люминесцентный анализ в ветеринарии / М.А. Шесточенко, Н.А. Кузьмин. М.: Колос, 1979. - С.77-84.

112. Шляхов, Э.Н. Реакция иммунитета при сибирской язве / Э.Н. Шляхов // Актуальные вопросы иммунологии. — М., Медицина, 1964. С. 166194.

113. Шляхов, Э.Н. Сибиреязвенный аллерген-антраксин (Принципы конструирования, методы получения, экспериментальное изучение, применение в эпидемической практике): Автореф. дис. . докт. мед. наук / Э.Н. Шляхов. Кишинев, 1965. - 53 с.

114. Шляхов, Э.Н. Химический антраксин. Некоторые биологические, биохимические и иммунохимические данные / Э.Н. Шляхов, С.А. Шварц // Антракс. Кишинев: Катря Молдовеняску. - 1964. - С. 97116.

115. Шторц, X. Иммунофлуоресценция / X. Штоц // Иммунологические методы. М.: Медицина, 1987. - С. 128-148.

116. A multiplex PCR system for Bacillus anthracis / D.L. Robertson et al. // The 2-nd International Workshop on the molecular biology oí B. anthracis, B. cereus, B. thuringiensis. Taos, New México, USA, August 11-13. -1999. -P. 53.

117. Ansari, A.A. Purifícation antigemoglobin antibody using cross-einked im-munoadsorbent /А.А. Ansari // S. immunol. Methods. 1981. - Vol. 42, N 1. -P. 45-51.

118. Anthrax as a biological weapon, 2002: updated recommendations for management / T.V. Inglesby et al. // JAMA. 2002. - Vol. 287, N 17. - P. 22362252.

119. Barber, G. Sur les poliosides du Bacillus anthracis / G. Barber, E. Zilistean, I. Nafta // Arch, roumain, pathol. 1957. - Vol. 16, N 4. - P. 573578.

120. Beuntner, E.H. A reveas immunodiffusion assay for antibody protein concentration in antisera or conjugates to human IgG / E.H. Beuntner // Stan-dartization in immunofluorescence. Oxford. Blackwell Scientific Publ, 1970.-Pat. 2.-P. 165-169.

121. Bruno, J.G. In vitro selection of DNA aptamers to anthrax spores with electrachemiluminescence detection / J.G. Bruno, J.L. Kiel // Biosens Bio-electron 1999. May 31; 14 (5): 457-464.

122. Castro, A. Ultrasensitive, direct detection of a specific DNA sequence of Bacillus anthracis in solution / A. Castro, RT. Okinaka // Analyst 2000 Jan; 125(1): 9-11.

123. Cherry, W.B. Staining bacterial smeare with fluorescentantibody V. The rapid identification of Bacillus anthracis incultury and human / W.B. Cherry, E.M. Freeman // Zbl. Balct. 1961. - Bd. 175. - P. 582-597.'

124. Coons, A.H. Localisation of antigen in tissue cells / A.H. Coons, M.H. Kaplan//J. Exp. Med. 1950. - Vol. 91, N 1.-P. 81-89.

125. Demonstration of a capsule plasmid in Bacillus anthracis / B.D. Green et el. // Infect. Immun. 1985. - Vol. 49. - P. 291-297.

126. Dieter, C., Dagmar F. II Bacillus Ed. C. R. Harwood. New York, London. Plenum Press. 1989. - P. 5-26.

127. Differentiation of Bacillus anthracis and other Bacillus species by lectins / H.B. Cole et al. II J. Clin. Microbpol. 1984. Jan; 19 (1): 48-53.

128. Dowdle, W.R. Phage-fluorescent-antifage staining system for B.anthracis / W.R. Dowdle, A.A. Hausen//J.Imt. Dis. 1960. - Vol. 108, N2.-P. 125132.

129. Ekurimte, F.S. Isolation and purification of cell wall polysaccharide of Bacillus anthracis /F.S. Ekurimte, Singh, K.A. Tayber // FEMS. Microbiol. Lett. 1991. - Vol. 82, N 3. - P. 257-262.

130. Enzyme-linked lectinosorbent assay (ELLA) for detecting Bacillus anthracis / K. Graham et el. // Eur. J. Clin. Microbiol. 1984. Jun; 3 (3): 210212.

131. Ezzell, J.W. Immunological analysis of cell-associated antigens of Bacillus anthracis / J.W. Ezzell, T.G. Abshire // Infec. and immunity. 1988. -Vol. 56. - P. 349-356.

132. Evans, D.V. Production of toxin Bacillus anthracis / D,V. Evans, T.V. Shoesmith//Lancet. 1954. -Vol.1, N3.- P. 136-137.

133. Scheme for solation and identification of Bacillus anthracis / E.I. Eremen-co et el. // Proceds of the 1st European Conference on Dangerous Pathogeus, Wiuchester, Eugland. 1999. - P. 43.

134. Fellows, P.F. A survey of worldwide strains of Bacillus anthracis / P.F. Fellows // Proc. Inter. Workshop on anthrax. Winchester, England. September 19-21. 1996. -N 87. - P. 33.

135. Fluck, R. Fluorescent serological studies on cross reaction between spores of Bacillus anthracis and spores of others aerobic sporeforming bacteria / R. Fluck, R. Bohm, D. Strauch // Zbl. Vet. Med. 1977. - Vol. 24. - P. 497507.

136. Franek, J. Application of fluorescent antibodies for demonstrating B. anthracis in the organs of infect animals / J. Franek // J. Hyg. Epidem. Microbiol. Immunol. 1964.-Vol.8.-P. 111-119.

137. Gladstone, J.P. Simple culture medium for general use without meat extract or peptone / J.P. Gladstone, P. Fields // Brit. J. Exp. Pathol. 1940. -Vol. 21.-P. 161-173.

138. Goldman, M. Fluorescent antibody method / M. Goldman. New York, 1968.-242 p.

139. Hum, B.A.L. Production of reagent antibodies / B.A.L. Hum, S.M. Chantler // Methods in Enzymology. 1980. - Vol. 70, N 5. - P. 104-142.

140. Identification of Bacillus anthracis by using monoclonal antibody to cell wall galactose-N-acetylglucosamine polysaccharide / Ezzell, J.W Jr et al. // J. Clin. Microbiol. 1990. Feb; 28 (2): 223-31.

141. Induction of motility in Bacillus anthracis by means of bacterial lisates / E.R. Brown et al. // J. Bacteriol. 1958. - Vol. 69. - P. 590-602.

142. Isolation of a spetific chromosomic DNA sequense of Bacillus anthracis and its possible use in diagnosis / G. Patra et al. // FEMS Immun, and medical microbiol. 1996.-Vol. 15.-P. 221-231.

143. Ivanovisc, G. Problems concerning the polygenesis of Bacillus anthracis / G. Ivanovisc, I. Folder // Acta. Physiol. Acad. Sei. Hyng. 1958. - Vol. 5, N 1. - P. 89-109.

144. Ivanovisc, G. Unter welcken Bedingungen werden bieder Nährboden -Züchtung der Milzbrandbazillen Kapseln gebildet / G. Ivanovisc // Zbl. Bact. 1937. - Vol. 138. - P. 449.

145. Investigation of bioterrorism related anthrax, United States, 2001: epidemiologic findings / D.B. Jemigan et al. // Emerg. Infect. Dis. - 2002. -Vol. 8. - P. 1019-1028.

146. Levitt, J. The role of «SH» and «SS» in the resistance of cells to high and low temperature / J. Levitt // The cell and environmental temperature /Ed. A. S. Iroschin. London: Pergamon Press, 1967. - P. 269-274.

147. Meynell, E. The role of serum and dioxide in capsule formation by Bacillus anthracis / E. Meynell, G.C. Meynell 11 J.Gen.Microbiol. 1964. - Vol. 34,N. l.-P. 153-154.

148. Mikesell, P. Evidence for plasmid-mediated toxin production in Bacillus anthracis / P. Mikesell // Infect. Immun. 1983. - Vol. 39. - P. 371-376.

149. Mester, L. Sur les groupements terminoux du polysaccharide immunospecifique du Bacillus anthracis / L. Mester, E. Moclar, G. Ivanovics // C. r. Acad. Sci. 1962. - Vol. 254, N 5. - P. 944-945.

150. Nichol, J.C. Biophysical studies of blood plasma proteins / J.C. Nichol, H.F. Deutsch // J. Am. chem. Soc. 1948. - Vol. 70. - P. 80-83.

151. PCR based characterization of Bacillus anthracis as mean for ecological studies / G. Patra et al. // Abstract Book. 3-rd International Conference on Anthrax Plymouth, England. 7-1 Oyh September 1998. P. 10.

152. Phillips, A.P. Assement of immunofluorescence measurement of individual bacteria in direct and undirect assays for Bacillus anthracis and Bacillus cereus / A.P. Phillips, K.L. Martin // Gene. 1982. - Vol. 53, N 2. - P. 223 -231.

153. Phillips, A.P. Differentiation between spores Bacillus anthracis and Bacillus cereus by a guantitative immunofluorescence technique / A.P. Phillips, K.L Martin, M.G. Broster // Clin. Microbiol. 1983. - Vol. 17, N 1. - P. 4447.

154. Phillips, A.P. Identification of Bacillus anthracis by polyclonal antibodies against extracted vegetative cell antigens / A.P. Phillips, J.W. Ezzell // J. Appl. Bacteriol. 1989. - Vol. 66. - P. 419-32.

155. Phillips, A.P. Investigation of surfagencsin in the genus Bacillus by the polyclonal antibodies in immunofluorescence test / A.P. Phillips, K.L. Martin //Appl. Bacteriol. 1998 - Vol. 64, N 1. - P. 47-55.

156. Poison, A. The fractionation of protein mixtures by linear polymers of high molecular weigh / A. Poison, G.M. Potgieter, J.E. Largier // Biochem. Biophis. Acta. 1964. - Vol. 82. - P. 463-475.

157. Quinn, C.P. Spore protein antigen specific to Bacillus anthracis / C.P Quinn, P.C.B Turnbull, I. Meiling // Proc. Internat. Workshop on Anthrax, 11-13 april 1989. Winchester, England, 1990. - Vol. 68. - P. 81-84.

158. Recherchessur les hartens du Bacillus anthracis et llur locolijations dans la cellule bacteriemie / Y.Barber et al. II Arch. Roumain. Pathol. Esptl. Et microbial. 1957. - Vol. 19, N 3. - P. 379-389.

159. Redway, K.F. Effect of carbohydrates and related compounds on the long-term presarvation of treeze-dried bacteria / K.F. Redway, S.P. Lapage //Cryobiology. 1974. -Vol. 11,N l.-P. 73-79.

160. Serolgical studies of patient with cutaneos and oralopharyneal anthrax from nothem Thailand / T. Sirisantana et al. // Amer. J. Trop. Med. Hyg. — 1998. Vol. 39, N 6. - P. 575-581.

161. Single cell studies 19S antibody production / G.J.V. Nossal et al. // J. xp. Med. 1964.- V. 119, N3.-P. 485-502.

162. Steibuch, G. The isolation of IgG from mmanalion serra with the acid of caprilic / G. Steibuch, R. Andran // Acch of Biochem. Stray and Biophys. -1969.-Vol. 139.-P. 279-284.

163. Stopa, P.J. The flow cytometry of Bacillus anthracis spores revisited / P.J. Stopa // Cytometry, 2000. Dec 1; 41(4) : 237-244.

164. Tenover, F.C. Diagnostic deoxyribonucleicacid probes for infectious diseases / F.C. Tenover // Clinical Microbiology Reviews. 1988. - N 9. - P. 49-67.

165. Terrorism from a public health perspective / D.G. Evans et el. // Am. J. Med. Sei. Jun. 2002. - Vol. 323, N 6. - P. 291-292.

166. The demonstration of Bacillus anthracis in envionmental speciment by convential and fluorescent antibody techniques / J.Z. Biegeleisen et al. // Am. J. Hyg. 1962. - Vol. 75. - P. 230-239.

167. Thorne, C.B. An agar-diffusion method for titrating Bacillus anthracis immunizing antigen and its application to a study of antigen production /

168. C.B. Thome, F.C. Belton // J. Gen. Microbiol. 1957. - Vol. 17, N 2. - P.i505.506. 1i

169. Thome, C.B. Biochemical properties of virulent and avirulent strains of Bacillus anthracis / C.B. Thome // Ann. N.Y.Acad. Sci. 1960. - Vol. 88, N 6. - P. 1024-1033.

170. Topley, W.W.G. An outline of immunity / W.W.G. Topley. London: Eward, 1933. —414 p.

171. Vancurik, J. Studies on the glutamil-peptide antigen (GPP) in the genus Bacillus: The frequence of its occurence and presence in the cell wall / J. Vancurik, P. Schreiderkc // Folia microbiol. -1971,- Vol. 16, N 2. P.74-82.

172. Ziperle, G.F. Glucosamine substitution and muramidase susceptibility in Bacillus anthracis / G.F. Ziperle, J.W. Ezzell, R.J. Doyle //Can J. Microbiol. 1984. - Vol. 30, N 5. - P. 553-559.

Информация о работе

Горобец, Елена Александровна
кандидата биологических наук
Ставрополь, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Разработка иммунобиологических препаратов для диагностики сибирской язвы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы