Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка комплекса иммунодиагностических тест-систем для обнаружения возбудителя сибирской язвы

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка комплекса иммунодиагностических тест-систем для обнаружения возбудителя сибирской язвы"

На правах рукописи

Хлынцева Анна Евгеньевна

РАЗРАБОТКА КОМПЛЕКСА ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ

03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 МАП 20¡2

Оболенск - 2012

005016667

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека РФ

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Шемякин Игорь Георгиевич;

кандидат биологических наук Козырь Арина Владимировна

Официальные оппоненты:

Афанасьев Станислав Степанович, заслуженный деятель науки, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им Г. Н. Габричевского" Роспотребнадзора, заместитель директора по биотехнологии

Степанов Алексей Вячеславович, доктор медицинских наук, профессор, ЗАО «Национальные биотехнологии» (Оболенск), генеральный директор

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова))

Защита состоится «15» мая 2012 г. в 14 ч на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации по адресу: 142279, Московская обл., Серпуховский р-н, п. Оболенск, ФБУН ГНЦ ПМБ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

Автореферат разослан у/3 » апреля 2012 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Разработка современных диагностических систем для детекции возбудителя сибирской язвы представляет собой одну из наиболее актуальных задач борьбы с сибиреязвенной инфекцией. Сибирская язва является острым инфекционным заболеванием людей и животных, вызываемым аэробным спорообразующим грамположительным микроорганизмом Bacillus anthracis.

По классификации ВОЗ Россия относится к зоне спорадического проявления инфекции. Однако, в последние годы в стране отмечается неуклонный рост территорий, неблагополучных по сибирской язве, таким образом, службы надзора Российской Федерации оценивают санитарно-эпидемиологическую обстановку по этому заболеванию как напряженную [Лукьянова и др., 2011].

Возбудитель - В. anthracis представляет собой грамположительную палочку длиной 6-10 мкм и шириной 1-2 мкм. Она неподвижная, образует споры и капсулу. Хорошо растет на различных питательных средах. Споры сибирской язвы весьма устойчивы во внешней среде, они могут сохраняться в почве несколько десятков, а, возможно, и сотни лет, формируя устойчивые природные очаги инфекции.

Источником В. anthracis считают больных домашних и диких животных, организм которых предоставляет естественные условия для развития и размножения этого патогена [Ипатенко и др., 1987]. При этом источником могут быть и животные-бациллоносители, с атипичным или бессимптомным течением заболевания [Онищенко и др., 1999]. Заражение может наступать при уходе за больными животными, убое скота, обработке мяса, а также при контакте с продуктами животноводства (шкуры, кожи, меховые изделия, шерсть, щетина), обсемененными спорами сибиреязвенного микроба. Основным резервуаром В. anthracis считается почва [Ипатенко и др., 1987]. К тому же, почва может быть и непосредственным источником инфекции сибирской язвы - известны случаи заболевания людей и животных, возникшие в результате контакта с заражённой почвой [Маринин и др. 2008].

Основными факторами патогенности возбудителя сибирской язвы являются капсула и бинарный экзотоксин. Однако, в конечном итоге, вирулентность бактерии определяется суммой факторов, которая до конца не изучена [Okinaka et al, 2006]. Капсульные антигены кодируются генами, расположенными на плазмиде рХ02, а токсинный комплекс и некоторые ферменты, необходимые для синтеза капсулы - на плазмиде рХ01. Действие сибиреязвенного токсина не ограничивается блокировкой иммунного ответа и реакции макрофагов и нейтрофилов. При развитии лёгочной, кишечной и септической форм инфекции действие токсинов становится системным и приводит к гибели организма. Механизм интоксикации до конца не ясен [Chauncey et al, 2011], однако, очевидно, что при определённой концентрации токсина в крови наступает так называемое «состояние невозврата», при котором любая терапия существующими в настоящее время методами оказывается неэффективной [Barr et al, 2010].

Важнейшую роль играет ранняя диагностика инфекции и необходимость детекции низких концентраций возбудителя сибирской язвы в окружающей среде и продуктах питания. К настоящему времени в нашей стране и за рубежом разработан целый ряд экспериментальных иммунодиагностических тест-систем, предназначенных для выявления возбудителя сибирской язвы и его антигенов [Терешкина и Девдариани, 2008]. Однако экспериментальные разработки зачастую не завершаются внедрением результатов в практику на уровне сертифицированных

препаратов, как правило, из-за несоответствия принятым параметрам специфичности (неспецифическое взаимодействие с близкородственными видами, такими как Bacillus cereus и др.).

Таким образом, для разработки эффективных средств иммунодиагностики сибирской язвы необходимы дополнительные фундаментальные и прикладные исследования. Помимо создания собственно диагностических систем, существенную роль в разработке новых диагностических средств играет идентификация антигенов или их фрагментов, специфичных исключительно для В. anthracis. В качестве основы для быстрой разработки различных типов современных диагностикумов наиболее перспективными и универсальными являются панели моноклональных антител (МКА), на основе которых можно создавать широкий спектр диагностических средств, учитывающих как особенности патогенеза сибирской язвы, так и современные форматы высокочувствительных систем детекции микроорганизмов и их факторов вирулентности.

В настоящее время в России существуют четыре коммерческих препарата для иммунологического определения сибирской язвы: «Иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные соматические люминесцирующие сухие» (СтавНИПЧИ), «Иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные антиспоровые (адсорбированные) люминесцирующие сухие» (СтавНИПЧИ), «Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сибиреязвенные неадсорбированные сухие» (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи) и «ИХ тест-система В. anthracis» (ГНЦ ПМБ). Чувствительность первых двух препаратов не превышает 105 микробных клеток/мл пробы и чаще всего недостаточна для обнаружения возбудителя в почве. Кроме того, даже адсорбированные люминесцирующие иммуноглобулины не дают 100% специфичности и могут давать ложноположительные результаты со спорами В. cereus и Bacillus thuringiensis. Чувствительность «ИХ тест-системы В. anthracis» не превышает 108 - 109 спор/мл. В связи с этим, необходимость в создании новых методов и средств индикации возбудителя сибирской язвы не вызывает сомнений.

Цель исследования - создание комплекса высокоэффективных и чувствительных иммунодиагностических тест-систем для определения возбудителя сибирской язвы, основанных на специфичных МКА, анализ их эффективности и идентификация антигенной мишени МКА.

Задачи исследования:

1. Получить и охарактеризовать панель моноклональных мышиных антител к В. anthracis. Провести изучение полученных МКА на наличие внутри- и межвидовой перекрестной активности при помощи коллекции патогенных и сапрофитных бацилл.

2. Разработать на основе полученных МКА диагностические тест-системы в формате ИФА и латекс-агглютинации.

3. Сконструировать систему для селективного концентрирования возбудителя сибирской язвы на основе магнитных частиц с иммобилизованными МКА.

4. Идентифицировать антигенную мишень полученных МКА, использованных при разработке диагностических тест-систем.

Научная новизна:

1. Получена и охарактеризована панель МКА к спорам В. anthracis. Определены изотипы антител, константы аффинности, подобраны диагностически значимые пары антител, не конкурирующих за связывание антигена. Показана специфичность взаимодействия антител с возбудителем сибирской язвы и отсутствие перекрестных реакций с близкородственными микроорганизмами.

2. Идентифицирована антигенная мишень МКА, использованных при разработке тест-систем, представляющая собой белок ЕА1, поверхностный антиген В. anthracis. Показано взаимодействие МКА, примененных при разработке тест-систем, с рекомбинантным белком ЕА1, полученным в гетерологичной системе экспрессии в Е. coli.

Практическая ценность диссертации:

1. С применением МКА разработаны диагностические тест-системы на основе ИФА, латексных частиц и магноиммуносорбентов, проведено определение чувствительности и специфичности разработанных тест-систем. Тест-системы успешно прошли комиссионные испытания.

2. Высоко экспрессная тест-система «Набор реагентов для определения спор Bacillus anthracis в реакции латекс-агглютинации» получила государственную регистрацию (Регистрационное удостоверение № ФСР 2011/12159 от 20 октября 2011 года Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития).

3. Тест-система на основе магноиммуносорбентов способна специфически детектировать споры штаммов сибирской язвы в концентрациях -1х103 спор/мл. Данная система позволяет проводить селективное концентрирование спор возбудителя сибирской язвы из проб окружающей среды и рекомендована к внедрению в практику работы учреждений Санэпиднадзора.

4. Получен Патент на изобретение №2439148 Cl РФ «Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 1Е6 -продуцент моноклональных антител для специфичного обнаружения спор Bacillus anthracis».

5. Разработаны и внедрены на Федеральном уровне методические указания «Порядок организации и проведения лабораторной диагностики сибирской язвы для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней» МУ 4.2.2941-11,2011 г.

Положения, выносимые на защиту:

1. Полученная панель из шести МКА, являющихся специфичными к белку ЕА1 S-слоя возбудителя сибирской язвы и не дающих перекрестных реакций с близкородственными микроорганизмами, может быть использована для создания иммунодиагностикумов для определения В. anthracis.

2. «Набор реагентов для определения спор Bacillus anthracis в реакции латекс-агглютинации» обладает чувствительностью от 1хЮ5 спор/мл до 2х106 спор/мл и выше, а также высокой специфичностью. Данный латексный диагностикум может быть использован в лабораторной диагностике для детекции как споровой, так вегетативной форм возбудителя сибирской язвы.

3. «Набор реагентов. Тест-система иммуноферментная магноиммуносорбентная для выявления возбудителя сибирской язвы в споровой

форме моноклональная» обеспечивает выявление спор возбудителя сибирской язвы с высокой чувствительностью (1х103 спор/мл) и специфичностью. Концентрация спор возбудителя сибирской язвы на поверхности МИС позволяет максимально освобождаться от посторонней микрофлоры при исследовании проб окружающей среды (вода, почва).

Личный вклад соискателя. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в сотрудничестве, главным образом, с к.б.н. Е.В. Беловой (ГНЦ ПМБ), к.б.н. A.M. Барановым (ГНЦ ПМБ), к.б.н. A.B. Козырь (ГНЦ ПМБ), к.б.н. A.B. Колесниковым (ГНЦ ПМБ), к.м.н. С.С. Ветчининым (ГНЦ ПМБ), к.м.н. Е.В. Барановой (ГНЦ ПМБ), д.б.н. И.В. Жарниковой (СтавНИПЧИ) и д.б.н., проф. И.Г. Шемякиным. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль автора была определяющей. В исследованиях также принимали участие сотрудники ГНЦ ПМБ Р.И. Миронова и Н.М. Лунева.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и представлены на: IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников содружества независимых государств» (Волгоград, 2008); Всероссийской научной конференции «Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология» посвященная 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ МИНОБОРОНЫ РОССИИ», (Киров, 2008); Научно-практической конференции СМУиС РОСПОТРЕБНАДЗОРА, ФГУН ГНЦ ПМБ, «Биологическая безопасность в современном мире» (Оболенск, 2009); Научно-практической конференции СМУиС РОСПОТРЕБНАДЗОРА, ФГУН ГНЦ ПМБ, «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2010); Юбилейной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины», (СПбМАПО, Санкт-Петербург, 2010); VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010» (Москва, 2010); III Научно-практической школе-конференции СМУиС РОСПОТРЕБНАДЗОРА, ФГУН ГНЦ ПМБ, «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2011).

План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены на заседании Ученого совета ГНЦ ПМБ 24 декабря 2008 г., протокол № 8. Результаты исследований доложены на заседании межлабораторного семинара ГНЦ ПМБ (протокол № 22 от 28 декабря 2011 г).

Публикации. Основное содержание работы отражено в 10 научных публикациях, в том числе в трех статьях, опубликованных в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, в одном патенте на изобретение №2439148 С1 РФ. ив МУ 4.2.2941-11,2011 г.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований с их обсуждением, заключение, выводы и указатель литературы, включающий 38 работ отечественных и 119 - зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 9 рисунками и

16 таблицами. Приложения состоят из трех статей, опубликованных по теме диссертации.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Штаммы микроорганизмов. В работе использованы 29 штаммов возбудителя сибирской язвы и 57 штаммов близкородственных споровых сапрофитов рода Bacillus, полученных из лаборатории микробиологии сибирской язвы ФБУН ГНЦ ПМБ, из коллекции патогенных микроорганизмов ФГУЗ СтавНИПЧИ, из коллекции микроорганизмов ФКУЗ ИркутскНИПЧИ Сибири и ДВ и из коллекционного центра живых культур ФГУЗ ВолгоградНИПЧИ.

Споры использованных в работе штаммов микроорганизмов получали при выращивании микроорганизмов на голодном L-агаре/по Луриа (Луриа-Бертани), вегетативные клетки микроорганизмов получали при выращивании микроорганизмов на агаре Хоттингера (Оболенск, РФ).

Получение гибридом. Для иммунизации использовали мышей линии BALB/c. Мышей иммунизировали путем двукратного, с тридцатидневной экспозицией, подкожного введения спор штамма В. anthracis СТИ-1, эмульгированных с полным (первая иммунизация) и неполным (вторая иммунизация) адъювантом Фрейнца (Sigma, США). Бустер-дозы препарата (107спор) вводили внутривенно в физиологическом растворе. Проверку титра специфичных антител у иммунизированных мышей проводили непрямым твердофазным ИФА по методу A.M. Егорова [Егоров и др., 1991]. Интенсивность окрашивания анализировали при длине волны 492 нм (фотометр Пикон, РФ). В качестве отрицательного контроля использовали сыворотку крови интактной мыши. Для гибридизации брали мышей с титром специфичности 1:32000. Гибридизацию проводили по стандартному протоколу [Kohler & Milstein, 1975], в качестве партнера для слияния использовали мышиную миеломную клеточную линию X63-Ag8.653. Полученные гибридомные клоны были первично проскринированы в ИФА. Гибридомы, проявляющие иммунореактивность в отношении спор В. anthracis в ИФА, клонировали и переклонировали методом лимитирующих разведений на 96-луночных планшетах с макрофагальным фидерным слоем. После повторной проверки специфической активности в ИФА отобрали гибридные клоны, продуцирующие антитела к спорам В. anthracis. Полученные клоны гибридом продуцентов МКА масштабировали, заложили на хранение в жидком азоте и использовали для наработки специфичных антител in vivo и in vitro.

Выделение и очистка МКА. Выделение МКА из асцитической жидкости проводили путем аффинной хроматографии на колонке с белком G-сефарозой (Protein G Sepharose 4 Fast Flow), согласно рекомендации производителя (GE Healthcare, Швеция). Чистоту полученных иммуноглобулиновых фракций оценивали методом SDS-PAGE-электрофореза в денатурирующих условиях. Концентрацию иммуноглобулинов определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм на спектрофотометре Smart Spec Plus (BIO RAD, США).

Определение подклаееовой принадлежности. Подклассы полученных МКА определяли с помощью набора для определения изотипов мышиных моноклональных антител (Roche Diagnostic Corporation, США).

Определение аффинностн МКА. Константу аффинности МКА определяли в неконкурентном иммуноферментном анализе по методу Beatty [Beatty et al., 1987].

Определение специфической и перекрестной активности полученных

МКА в отношении спор В. anthracis и спор близкородственных спорообразующих бацилл проводили методом дот-блот анализа.

Подбор пар МКА проводили в двухсайтовом дот-блот анализе. Приготовление биотинилирующего реагента проводили по методу Duk [Duk, 1994]. Рабочий титр конъюгированных МКА определяли в ИФА.

Получение иммунопероксидазных конъюгатов сибиреязвенных. Коньюгаты получали методом перйодатного окисления по Nakane [Nakane & Kawaoi, 1974]. Рабочий титр и специфическую активность конъюгатов определяли по методике Clark [Clark & Adams, 1977] в «сэндвич» - варианте ИФА.

Для конструирования латексного диагностикума использовали латексные частицы А-63-21 (Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва). Иммобилизацию МКА на латексных частицах проводили согласно протоколу производителя. Лиофильное высушивание латексных суспензий с иммобилизованными МКА проводили с использованием лиофильной сушки Epsilon 2-4 LSC, («Christ», Германия). Реакцию латекс-агглютинации (РЛА) проводили в круглодонных 96-луночных планшетах (Медполимер, Россия). В качестве отрицательного контроля использовали 0,1 M боратный буфер, pH 8,2.

Для разработки тест-системы иммуноферментной

магнонммуносорбентой были использованы магноиммуносорбенты (МИС), полученные по методике, описанной в изобретении [Пат. РФ. №2138813, G-01, №33/543]. Чувствительность и специфичность МИС проверяли путем постановки ИФА со штаммами В. anthracis и штаммами близкородственных бацилл в споровой форме. В качестве отрицательного контроля использовали фосфатно-солевой буфер с альбумин-твином (USB, США). Учет результатов проводили на фотометре (Пикон, РФ) для ИФА при длине волны 492 нм. Положительными считали результаты, если оптическая плотность образцов в два и более раз превышала оптическую плотность отрицательного контроля.

Получение рекомбинантных белков В. anthracis ЕА1 и BclA. ДНК штамма В. anthracis СТИ-1 была амплифицировали с использованием пары праймеров, специфичных к 5' и 3'- концам кодирующих областей генов eal и bel А. Гены был клонировали в экспрессионный вектор на основе pET-MASMT [Патент РФ №2355769], содержащий последовательности для N-концевых пептидов MASMT, His6 и с-тус, используемые для аффинной очистки, детекции, и оптимизации трансляционного контекста белков. Рекомбинантные антигены ЕА1 и BclA продуцировали в Е. coli BL21(DE3) и очищали металл-хелатной хроматографией. Очищенный препарат проверяли на взаимодействие с полученными МКА методом иммуноблоттинга.

Результаты исследований и обсуждение

Отбор высокоаффннных и специфичных МКА

Одним из важных этапов работы по конструированию иммунодиагностических тест-систем с использованием МКА является отбор стабильных клеточных линий (гибридом), продуцирующих высокоаффинные, специфичные МКА.

В ходе работ получили и охарактеризовали панель из 20 гибридных клонов, продуцирующих МКА к спорам возбудителя сибирской язвы В. anthracis. Следует отметить, что антигенные различия между спорами представителей рода Bacillus минимальны [Quinlant & Foegeding, 1997], и отсутствие перекрестного взаимодействия антител, полученных к спорам В. anthracis, со спорами близкородственных спорообразующих бацилл является одним из важнейших факторов, обеспечивающих возможность применения полученных антител для разработки специфичных диагностических тест-систем.

Исследование специфической активности полученных МКА показало, что шесть из исследованных МКА - 4Е6, 2В8, 3G3, 2С8, 6В6 и 1Е6 - специфически взаимодействовали со спорами 16 штаммов возбудителя сибирской язвы в концентрации 105 спор/мл и не давали перекрестных реакций со спорами близкородственных бацилл. Результаты по определению специфической активности МКА представлены в таблице 1.

В качестве кандидатов для конструирования иммунодиагностических тест-систем было отобрано шесть МКА (4Е6, 2В8, 3G3, 2С8, 6В6 и 1Е6), специфически взаимодействовавших со спорами В. anthracis и не связывавших споры близкородственных микроорганизмов.

Отобранные МКА охарактеризовали (рис. 1), показали, что МКА, 2В8, 3G3, 2С8, 6В6, 1Е6 относятся к иммуноглобулинам изотипа Gl, а МКА 4Е6 - изотипа G2a. Чистоту выделенных препаратов иммуноглобулинов и молекулярные массы легкой и тяжелой цепей полученных МКА определяли методом белкового SDS-ПААГ электрофореза. Результаты по определению констант аффинности МКА показали, что наибольшей аффинностью обладают три антитела: 1Е6, 6В6 и 3G3.

Во многих случаях для конструирования иммунодиагностичесих тест систем используют диагностически значимые пары антител, что позволяет снизить неспецифическое взаимодействие и проводить выделение возбудителя из больших объемов проб. Для формирования диагностических пар было необходимо выбрать из имеющейся панели антитела, не только не конкурирующие за общие сайты связывания, но и не теряющие специфической активности при конъюгировании с ферментной или иной меткой. Подбор пар МКА осуществляли методом двухсайтового дот-блот анализа. В результате установили, что наибольшая чувствительность анализа (до 10б спор/мл) достигалась при использовании в качестве первого антитела МКА 1Е6, 3G3, и в качестве второго антитела - МКА 6В6. При использовании других комбинаций антител реакция была менее интенсивна (рис. 2).

Подобранные пары МКА использовали при конструировании ИФА-тест-системы и МИС для выявления возбудителя сибирской язвы в споровой форме.

Таблица 1 - Перекрестная активность МКА с бактериальными спорами

Споры (10;спор мл) штаммов микроорганизмов Реактивность моноклональных антител

4E6 2 BS 3G3 2С8 6В6 1Е6 4С2 1G7

B.pantotkenticus B-139S ■ - - - - - - +

B.Iarvae В-1400 - - - - - - - +

B.poh-myxa В-1559 - - - - - - - +

B.thuringiensis В-214 - - - - - - - +

В.пайо В-193 - - - - - - - +

B.ah-eiB-1555 - - - - - - - +

B.brevis В-1567 - - - - - - - +

B.megaterium В-1435 - - - - - - - +

B.îicheniformis В-14И - - - - - - - +

B.subtilis B-1405 - - - - - - + +

В. antracoides В-217 - - - - - - - +

B.pasteuni В-1962 - - - - - - - +

B.cereus В-160 - - - - - - + +

B.sphaericus B-l 152 - - - - - - - +

B.maceraus В- 1410 - - - - - - - +

B.species В-1967 - - - - - - - +

B.azotoformaus В-1956 - - - - - - - +

B.puhifaciens В-1402 - - - - - - - +

B.ßrmvs В-1994 - - - - - - - +

В. laterosporus В-1404 - - - - - - - +

B.pumilis В-5007 - - - - - - - +

B.anthracis СТИ-1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

B.anthracis М-71 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

B.anthracis М-71/12 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

B.anthracis 34F2 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

B.anthracis 228/8 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

B.anthracis 220 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

B.anthracis 81/1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

B.anthracis 6381 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

B.anthracis A-205 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

B.anthracis A-206 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

B.anthracis A-210 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

B. anthracis A-211 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

B.anthracis 8189 + + + + + + + ++ + + + + + + + + + + + +

B.anthracis 193 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

B.anthracis 173 -н- ++ ++ ++ ++ ++ + + +

B.anthracis 4-7 -н- ++ ++ ++ -н- ++ + + +

(+ + +), (-¡-"О, (+) - степень интенсивности реакции; (-) - отсутствие реакции.

4Е6 2В8 ЛОЗ М 2С8 6В6 1Е6 Константы аффинности МКА

зэз 2,2x10'М1

2С8 3,6x10'М"1

6В6 4,1х108М1

1Е6 3,9x10'М"1

2В8 4.3x10йМ-1

4Е6 3,8х106М-'

55 кДа тяжелая цепь 26 к-Да

легкая цепь

Изотипы МКА

I

1вС,2д

■паз

ЗвЗ 2С8 6В6 1Е6 2В8 4Е6 К+

Рисунок 1 - Характеристика полученных МКА

4 1

5 2

6 3

4 1

5 2

6 3

1-МКАЗСЗ

2- МКА 2С8

3- МКА 6В6

4 1

5 2

6 3

4 I

5 2

6 3

4- МКА 1Е6

5- МКА 4Е6

6- МКА 2В8

4 I

5 2

6 3

Рисунок 2 - Подбор диагностически значимых пар МКА

Разработка иммунодиагностнческих тест-систем

В данной работе основное внимание сосредоточили на разработке современных высокоспецифичных тест-систем на основе иммуноферментного анализа, латекс-агглютинации и тест-системы для селективного концентрирования возбудителя сибирской язвы с использованием магноиммуносорбентов.

Разработка тест-системы для выявления и идентификации спор методом иммуноферментного анализа

На основании проведенной работы по конструированию иммуноферментной тест-системы разработали и утрердили комплект нормативной документации, включающий в себя инструкцию по применению и технические условия (ТУ 938811

103-78095326-2009, ОКП 938890). Для оценки эффективности сконструированной иммуноферментной тест-системы были провели комиссионные испытания на базе Иркутского научно-исследовательского противочумного института Роспотребнадзора. Подлинность, чувствительность и специфичность иммуноферментной тест-системы проверяли путем постановки «сэндвич-ИФА» с 10 штаммами В. anthracis и с 10 штаммами близкородственных бацилл в споровой форме. В качестве положительного контроля использовали взвесь В. anthracis СТИ-1 (положительный контроль), входящая в комплект набора реагентов (табл.2).

В ходе проведенных испытаний установили, что иммуноферментная тест-система выявляла споры штаммов возбудителя сибирской язвы в концентрации 1x10б спор/мл и не обладала перекрестной активностью со штаммами близкородственных микроорганизмов в концентрации 1х10б спор/мл и выше, за исключением двух штаммов В. cereus 412 и В. thuringiensis 2002, с которыми наблюдалась положительная реакция в концентрации 1х107 спор/мл. Таким образом, диагностическое применение тест-системы возможно только при использовании серийных разведений образца.

Таблица 2 - Результаты исследования чувствительности и специфичности ИФА тест-системы в «сэндвич-ИФА» со спорами штаммов микроорганизмов рода Bacillus

Концентрация микроорганизмов (спор/мл)

Штаммы бацилл 1х107 1х106

Повторностп эксперимента

1 2 3 1 2 3

В. anthracis П-9 0,908 0,931 0,911 0,421 0,417 0,444

В. anthracis 11-29 1,456 1,343 1,246 0.530 0,498 0,487

В. anthracis 11-45 1,450 1,411 1,387 0,485 0,490 0,476

В. anthracis 11-47 0,851 0,867 0,810 0,320 0,307 0,290

В. anthracis И-63 1,313 1,303 1,287 0,443 0,428 0,404

В. anthracis И-271 0,745 0,732 0,768 0,289 0,312 0,308

В. anthracis И З 19 0,652 0,648 0,671 0,217 0,243 0,225

В. anthracis И-345 0,472 0,456 0,408 0,231 0,212 0,236

В. anthracis И-358 0,853 0,876 0,881 0,289 0,312 0,307

Б. anthracis И-359 0,614 0,634 0,598 0,290 0,231 0,245

В. subtilis 830 0,021 0,017 0.044 0,006 0,013 0,078

В. cereus 412 0.154 0.098 0,110 0.030 0,098 0,087

В. cereus 504 Т 0,085 0,090 0,076 0,085 0,090 0,076

В. cereus 690 0,020 0,007 0,090 0,020 0,067 0,090

В. thuringiensis 49 0,043 0.028 0.004 0,043 0,058 0,074

В. thuringiensis 2002 0.089 0,112 0,148 0,089 0,012 0,008

В. mesentericus 407 0,017 0,043 0,025 0,037 0,028 0,034

В. mesentericus 61 0,031 0,012 0,036 0,051 0,043 0,015

В. anthracoides 6 0,094 0,051 0,042 0.006 0,016 0,027

B.anthracoides 366 0,056 0,035 0,081 0,071 0,039 0,030

Конструирование сибиреязвенного латексного диагностикума

Для конструирования сибиреязвенного латексного диагностикума использовали МКА 1Е6. Оптимальная нагрузка на латексных частицах моноклональных антител составила 20 мкг на 50 мкл исходной латексной суспензии. Чувствительность и специфичность сибиреязвенной латексной суспензии оценивали в PJIA с инактивированными культурами трех штаммов В. anthracis и с пятью гетерологичными штаммами рода Bacillus.

В результате проведенного анализа установили, что полученная латексная сибиреязвенная суспензия с иммобилизованными МКА 1Е6 выявляет исследованные штаммы возбудителя сибирской язвы в концентрации до 2,0x106 спор/мл и не имеет перекрестной активности с гетерологичными штаммами рода Bacillus.

Для увеличения срока годности латексные суспензии лиофильно высушили. Чувствительность и специфичность лиофильно высушенных латексных суспензий определяли в РИА (рис 3).

В результате проведенного анализа установили, что по чувствительности и специфичности лиофильно высушенный латексный препарат не уступает исходной жидкой латексной суспензии с иммобилизованными МКА и может быть использован в качестве компонента латексного сибиреязвенного диагностикума для определения спор В. anthracis.

Ъ. "о- С- с- о. с. Ъ.

о

0

1 ?

D

Э ООО ос.» С £ :}0'ОООС е<|

ооооосс э эоооос< 1000000'

>ооо

эоое^ сО О Осе1! с

А - В. anthracis 71 12

В - В. amhracis М-71

С - положительный контроль

D - B.cereus 160

Е В. licheniformisü-UU

F - В. subtilisB-U05

G В. megaterium В-1435

Н - отрицательный контроль

Рисунок 3 - Оценка чувствительности и специфичности латексной суспензии после лиофильного высушивания со спорами штаммов рода Bacillus

На основании проведенной работы по конструированию латексного диагностикума разработали и утвердили комплект нормативной документации, включающий в себя инструкцию по применению и технические условия (ТУ 9388112-78095326-2010), код ОКП 938890), а также изготовили экспериментально-производственные серии сибиреязвенного латексного диагностикума.

Для оценки эффективности сконструированного диагностикума провели комиссионные испытания экспериментальных образцов латексного диагностикума на базе Иркутского, Ставропольского и Волгоградского научно-исследовательских

противочумных институтов Роспотребнадзора. Чувствительность и специфичность латексного диагностикума проверяли путем постановки PJIA с 17 штаммами В. anthracis и с 36 штаммами близкородственных бацилл в споровой форме. В результате проведенных испытаний установили, что «Набор реагентов для определения спор Bacillus anthracis в реакции латекс-агглютинации» обнаруживал споры возбудителя сибирской язвы в концентрации от 1х105 спор/мл до 2x106 спор/мл и выше. Реакции со спорами различных видов спорообразующих бацилл в концентрации 1х108 спор/мл и ниже не выявили. Исключение составляет Bacillus cereus VRRL 569, споры которого обнаружили в концентрации 1х108 спор/мл. В виду наличия перекрестно-реагирующих антигенов у представителей рода Bacillus, допускается при проведении РЛА положительный результат с гетерологичными штаммами не более, чем у 10 % от числа исследуемых штаммов. В нашем случае этот показатель составил 2,7 %.

Экспериментально-производственные серии латексного диагностикума прошли приемочно-технические испытания в аккредитованном Росздравнадзором испытательном центре. На данный набор «Набор реагентов для определения спор Bacillus anthracis в реакции латекс-агглютинации» получено Регистрационное удостоверение Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития № ФСР 2011/12159 от 20 октября 2011года.

Конструирование тест-системы для селективного концентрирования спор В. anthracis на основе магнитных частиц с иммобилизованными МКА

Для дальнейшего совершенствования методов индикации возбудителя сибирской язвы объединили метод предварительного концентрирования искомого инфекционного агента на магноиммуносорбентах с последующей детекцией в ИФА. Для разработки иммуноферментной магноиммуносорбентой тест-системы требуется пара антител. Первое антитело, иммобилизованное на магнитных частицах, связывается с исследуемым антигеном, образуя комплекс «антиген-антитело». Второе антитело, коньюгированное с пероксидазой хрена, обеспечивает визуализацию реакции, катализируя расщепление орто-фенилендиамина.

Для разработки иммуноферментной магноиммуносорбентой тест-системы использовали: МИС, полученные по методике, описанной в изобретении (Пат. РФ. №2138813, G-01, №33/543) в сотрудничестве со специалистами СтавНИПЧИ Роспотребнадзора; пара МКА 1Е6-6В6. МКА 1Е6 иммобилизовали на магнитных частицах, а МКА 6В6 конъюгировали с пероксидазой хрена для обеспечения визуализации реакции в ИФА.

На основе полученных магноиммуносорбентов скомпоновали диагностические иммуноглобулиновые сибиреязвенные моноклональные тест-системы для иммуноферментного анализа.

Для оценки эффективности сконструированных диагностикумов были проведены комиссионные испытания на базе Иркутского и Волгоградского научно-исследовательских противочумных институтов Роспотребнадзора.

Чувствительность и специфичность тест-системы проверяли путем постановки ИФА с 8 штаммами В. anthracis и с 19 штаммами близкородственных бацилл в споровой форме, а также с образцами объектов окружающей среды (почва и вода), искусственно контаминироваными данными микроорганизмами (табл. 4 и 5).

Таблица 4 - Чувствительность и специфичность тест-системы иммуноферментной магноиммуносорбентной

Названое штамма Чувствительность в НФА (спор/мл) Название штамма Чувствительность в ПФА (спор/мл)

В. anthracb 81/1 1,0x103 Bacillus subtilis 6633 >1.0x105

В. anthracis 228/8 1,0x103 Bacillus mrcoides 2 > 1,0x105

В. anthracis СТН-1 1,0x103 Bacillus cereus 160 >1,0x105

В. anthracb 575/122 1,0x103 Bacillus cereus VRRL 569 >1.0x105

В. anthracis 614/1 1,0x103 B. subtilis 37 > 1.0x105

В. anlhracis 71/12 1,0x103 B. subtilis 83 >1,0x105

В. anthracis 298/2 1,0x103 B. megaterium 89 > 1.0 Xl05

В. anlhracis 3 БК-2 1,0x103 B. cereus 104 >1,0x105

Bacillus cereus 1 > 1,0 Xl05 B. cereus 250 > 1,0x105

Bacillus cereus UHA > 1.0 Xl05 В cereus 16 > 1,0x105

Bacillus cereus 8035 > 1,0 х105 Ii. megaterium 2 > 1,0x105

Bacillus subUlis 6051 > 1,0 Х105 Bacillus thuringiensis var. Pasteriuer > 1,0 х105

Bacillus megaterium 5 > 1.0 х105 Bacillus mesentericus 6 > 1.0x105

В результате установили, что тест-система выявляет споры штаммов сибирской язвы в концентрациях до 103 спор/мл и не выявляет гетерологичные культуры рода Bacillus в споровой форме в концентрации 105 спор/мл и ниже.

Результаты исследований проб почвы и воды, искусственно зараженных спорами микроорганизмов показали, что тест-система выявляет споры возбудителя сибирской язвы в концентрации не менее 103 спор/мл и не выявляет спорообразующие бациллы в концентрации 105 спор/мл.

Таблица 5 - Эффективность обнаружения сибиреязвенного микроба в пробах из объектов окружающей среды, искусственно контаминированных спорами В. апЛгаЫя и других бацилл

Название пробы Название штамма Концентрация бактерий в пробе спор/мл Результаты ИФА

Проба воды Bacillus anthracis 81/1 2x104 +*

Проба воды Bacillus anthracis 81/1 2x103 +

Проба воды Bacillus anthracis 81/1 2x102

Проба воды Bacillus subtilis 6633 1x105 -

Проба воды Bacillus megaterium 5 1x105 -

Проба воды Bacillus cereus 1 1x105 -

Проба почвы Bacillus anthracis 81/1 2x104 +

Проба почвы Bacillus anthracis 81/1 2x103 +

Проба почвы Bacillus anthracis 81/1 2x102 -

Проба почвы Bacillus subtilis 6633 1x105 -

Проба почвы Bacillus megaterium 5 1x105 -

Проба почвы Bacillus cereus 1 1x105 -

*+выявлено; **-не выявлено

Идентификация мишени для МКА, использованных при разработке тест-систем

Для получения МКА, специфичных к поверхностным антигенам бактерий могут быть использованы целые клетки, либо специфические фракции клеток, например компоненты мембран и клеточных стенок, а также компоненты спор (если таковые образуются данными микроорганизмами). Поверхностные антигены - компоненты мембран и спор - экспонированы в окружающую среду и могут быть эффективными мишенями, как для диагностики, так и для разработки вакцин. Вместе с тем, следует отметить, что при выделении сложных компонентов, таких как мембраны или компоненты спор, возможна их контаминация другими компонентами клеток, поскольку критерии чистоты выделения для сложных клеточных структур, равно как и методики, обеспечивающие такое выделение, разработать и воспроизвести весьма сложно. В силу этого, а также в силу особенностей иммунного ответа, интенсивность которого обусловлена в первую очередь не количеством антигена, а эффективностью индукции, основными мишенями для антител могут быть минорные компоненты целевых структур, или даже контаминирующие препарат антигены, принадлежащие к другим структурам микроорганизма. Индукция специфического иммунного ответа в случае комплексных антигенов является сложной задачей, однако, её решение позволяет не только определить мишень для избранного антитела и определить её диагностическую ценность, но и внести вклад в изучение характера ответа иммунной системы на данный микроорганизм. Идентификация иммунодоминантных антигенов бактерий и их локализации может оказать существенную помощь при разработке как специфических диагностикумов, так и эффективных вакцин.

Исследование взаимодействия моноклональных антител с поверхностью спор

В сотрудничестве с заведующим сектором гибридом отдела иммунобиохимии Ветчининым С.С. приготовили ФИТЦ - меченые антитела (ФИТЦ-МКА 1Е6, ФИТЦ-МКА-ЗвЗ и ФИТЦ-МКА 6В6). Взаимодействие данных ФИТЦ-МКА со спорами штамма В. апЖгаЫя СТИ-1 и со спорами 4 штаммов близкородственных бацилл (В. сегеш В-160, В. апЖгасоШея В-217, В. йшпп&етгз В-214, В. хиЬ1Ш.ч В-1405) изучили методом прямой иммунофлуоресценции. В качестве отрицательного контроля использовали препараты спор без обработки ФИТЦ-МКА (рис. 3).

Согласно данным флуоресцентной микроскопии, в препарате спор В. амИгаси СТИ-1 ФИТЦ-меченные МКА связывались не только со спорами, но и с так называемым клеточным дебрисом, формируемым при споруляции. Взаимодействие со спорами исследованных контрольных видов бацилл отсутствовало. Споры имели собственное желтовато-белое свечение при исследовании мазков на флуоресцентном микроскопе при длине волны облучения 495 нм.

J 2 3 4 5

la 2a 3a 4a 5a

Рисунок 4 - Взаимодействие ФИТЦ-МКА IE6 со спорами штаммов рода Bacillus. 15 - препараты спор, обработанных ФИТЦ-меченными МКА 1Е6 к спорам возбудителя сибирской язвы: 1- В. anthracis СТИ-1, 2 - B.cereus В-160, 3 -В. anthracoides В-217, 4-5. thuringiensis В-214, 5-5. subtilis В-1405. 1а-5а -препараты спор без обработки ФИТЦ-меченными МКА 1Е6 к спорам возбудителя сибирской язвы

Предварительные данные по иммуноблоттингу препаратов разрушенных спор с использованием полученных МКА в качестве зондов показали, что антитела реагируют с высокомолекулярным (70-100 кДА) материалом. Вместе с тем, МКА окрашивали различные наборы мультимерных полос, что затрудняло идентификацию молекулярного веса потенциальной мишени.

Предприняли попытки анализа ранее полученных различными исследователями данных о потенциальных иммунодоминантных мишенях при иммунизции животных различными высокомолекулярными поверхностными анигенами 5. anthracis. Предполагалось получить наиболее перспективные антигены в рекомбинантной форме и провести анализ полученных МКА на предмет взаимодействия с этими белками.

BclA и ЕА1

Одним из наиболее подробно описанных поверхностных антигенов 5. anthracis, проявляющих иммунодоминантность, является коллагеноподобный гликопротеин экзоспориума патогена, BclA. Этот белок может формировать олигомеры, и является одним из основных иммунодоминантных компонентов экзоспориума [Steichen et al. 2003]. Также известно, что дегликозилированный белок эффективно узнаётся антителами, что указывает на то, что гликозилирование не защищает иммунодоминантные эпитопы белка, и что олигосахаридный компонент BclA не является иммунодоминантной частью антигена. В силу этого по меньшей мере большинство антител, специфичных к BclA, должны узнавать рекомбинантный негликозилированный белок. Белок получили в рекомбинантной форме.

В рамках разработки диагностикумов для специфической детекции возбудителя сибирской язвы, а также в работах по исследованию иммунодоминантных антигенов, пригодных для создания субъединичной

противосибиреязвенной вакцины, исследователи охарактеризовали целый ряд антигенов, например. sapA, СарА. ЕА1 [Zhang et al, 2008] и ряд других.

Антиген ЕА1 обнаружили достаточно давно и показали, что он является главным компонентом S-слоя [Zhang et al, 2008]. В более ранних исследованиях доказали, что этот антиген не индуцирует протективный эффект при иммунизации [Mesnage et al, 1997]. Вместе с тем, данный антиген является потенциальной мишенью для высокоспецифической диагностики В. anthracis.

В наших исследованиях антиген ЕА1 получили нами аналогично способу получения антигена BclA. Полученные рекомбинантные белки ЕА1 и BclA анализировали иммуноблоттингом на предмет взаимодействия с полученными МКА. В качестве положительного контроля использовали Anti-His antibody, в а качестве отрицательного - сыворотку крови интактной мыши (рис. 5).

Anti-His antibody (К+) МКА 1Е6

Иммуноблотинг МКА 1Е6 с рекомбинантным гликопротеином BclA экзоспориума штамма В. anthracis СТИ-1

Иммуноблотинг МКА JE6 с ре комб ина нтным ЕА1 штамма В. anthracis СТИ-1

ЕА1 — ЕА1

Anti-His antibody (К+)

МКА 1Е6

Рисунок 5 - Определение антигенных мишеней МКА 1Е6

На основании данных иммуноблоттинга можно утверждать, что шесть специфичных МКА, которые были отобраны в качестве кандидатов для разработки диагностических тест-систем, связывались с рекомбинантным ЕА1. Контрольные препараты белка, содержащие Вс1А, не взаимодействовали с указанными МКА.

Оценка диагностической значимости разработанных диагностикумов для детекции вегетативной формы возбудителя сибирской язвы

Несмотря на противоречивую информацию о локализации белка ЕА1, его ассоциация со спорами и наличие эпитопов. уникальных для В. апЛгаЫ5, делает данный белок интересной мишенью для дальнейшей разработки диагностикумов, детектирующих как споровую, так и вегетативную форму патогена.

Провели оценку диагностической значимости сконструированного латексного диагностикума для детекции вегетативной формы В. апЛгас15.

С этой целью поставили РЛА с вегетативными клетками пяти штаммов возбудителя сибирской язвы. В качестве положительного контроля использовали споры штамма В. апМгасй 71/12. Для контроля специфичности детекции

18

применялись три близкородственных штамма рода Bacillus как в вегетативной, так и в споровой форме (рис 6).

В результате проведенной PJIA установили, что сибиреязвенный латексный диагностикум выявляет споры и вегетативные клетки штаммов сибирской язвы в концентрации до 2,0x106 спор(кл.)/мл и не выявляет гетерологичные культуры рода Bacillus в концентрации 1,0х108 спор(кл.)/мл и ниже. Таким образом, он может быть использован в лабораторной диагностике для детекции как споровой, так вегетативной формы возбудителя сибирской

язвы.

1хЮ8м.к./мл 5х107м.к./мл

А-В. амИгаая 71/12 споры В-В. аМИгааз 71/12 клетки С -В. ал!кгаа.ч М-71 клетки О-В. ап/Игас/.ч СТИ-1 клетки Е-В. шиИгаш 220 клетки Р-В. ап1ИгаС1Я 228/8 клетки

С1,Н1 -B.megaterium В-1435 споры

02.Н2 - ВЛИигт&епз18 В-214 споры

03,НЗ - В.сегеих 160 споры

С4.Н4 - В.тг^егтт В-1435 клетки 05,Н5 - В.Итгтфет!! В-214 клетки 06,116 - В.сегеиа 160 клетки С12,Н12 - отрицательный контроль

Рисунок 6 - Результаты РЛА со спорами и вегетативными клетками штаммов возбудителя сибирской язвы и близкородственных микроорганизмов

Несмотря на наличие в ЕА1 участков, антитела к которым крос-реактивны с гомологичными белками из родственных микроорганизмов (В. сегет, В. Миг^етя), методом конкурентного фагового дисплея в ЕА1 исследователи обнаружили эпитопы, присущие только В. аШНгас1я [ЕггеП е1 а1, 1988]. Это означает, что не только в антителах, селектированных методом фагового дисплея из животных иммунизированных ЕА1, но и в достаточно широкой панели МКА к данному белку, полученных стандартным способом, высока вероятность обнаружения таких антител. Поскольку полученные в этой работе данные свидетельствуют об уникальности эпитопов, распознаваемых описанной панелью МКА, данные антитела могут быть использованы для эпитопного картирования ЕА1 с целью локализации антигенных детерминант, уникальных для В. аМИгаЫв и анализа их уникальности на уровне различий в аминокислотной последовательности близкородственных вариантов ЕА1.

выводы

1. Получена и охарактеризована панель МКА к спорам В. anthracis. Определены изотипы антител, константы аффинности, подобраны диагностически значимые пары антител, не конкурирующих за связывание антигена. Показана специфичность взаимодействия МКА с возбудителем сибирской язвы и отсутствие перекрестных реакций с близкородственными микроорганизмами.

2. С применением МКА разработаны диагностические тест-системы на основе ИФА, латексных частиц и магноиммуносорбентов, проведено определение чувствительности и специфичности разработанных тест-систем. Тест-системы успешно прошли комиссионные испытания. Высокоэкспрессная тест-система «Набор реагентов для определения спор Bacillus anthracis в реакции латекс-агглютинации» получила государственную регистрацию.

3. Было показано, что наибольшей эффективностью и чувствительностью обладает тест-система на основе магноиммуносорбентов, способная специфически детектировать споры штаммов сибирской язвы в концентрациях - 1х103 спор/мл. Данная система позволяет проводить селективное концентрирование спор возбудителя сибирской язвы из проб окружающей среды и рекомендована к внедрению в практику работы учреждений санэпиднадзора.

4. Идентифицирована мишень для моноклональных антител, использованных при разработке тест-систем, представляющая собой белок ЕА1, поверхностный антиген В. anthracis. Показано взаимодействие моноклональных антител, примененных при разработке тест-систем, с рекомбинантным белком ЕА1, полученным в гетерологичной системе экспрессии в Е. coli.

По теме диссертации опубликованы следующие работы: а) статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК

1. Хлынцева А.Е., Белова Е.В., Жарникова И.В., Тюменцева И.С., Куличенко А.Н., Дятлов И.А., Шемякин И.Г. Конструирование тест-системы для селективного концентрирования спор Bacillus anthracis на основе магнитных частиц с иммобилизованными моноклональными антителами // Биотехнология. -2010. -№4.-С. 81-88.

2. Кравец Е.В., Дугаржапова З.Ф., Родзиковский A.B., Хлынцева А.Е., Лунева Н.М., Белова Е.В., Колосова Н.В., Рудницкий С.Ю., Соловьев П.В., Баранова Е.В., Бикетов С.Ф. Применение методов латекс-агглютинации и иммунохроматографии для ускоренной идентификации культур Bacillus anthracis при эпидемиологических расследованиях вспышек // Проблемы особо опасных инфекций 2011. - №1 (107). - С. 81 - 82.

3. Хлынцева А.Е., Лунева Н.М., Белова Е.В., Дятлов И.А., Шемякин И.Г. Разработка и испытания диагностикума на основе моноклональных антител для определения спор возбудителя сибирской язвы в реакции латекс-агглютинации // Проблемы особо опасных инфекций 2011. - №4 (110).- С. 71-75.

б) патенты

4. Пат. № 2439148 С1 РФ МПК C12N 5/18, С12Р 21/08, С07К 16/12. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 1Е6 - продуцент моноклональных антител, специфичных к спорам Bacillus anthracis / Белова Е.В.,

Хлынцева А.Е., Дятлов И.А., Шемякин И.Г. - заявлено 21.05.2010; опубликовано 10.01.2012.

в) методические указания

5. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики сибирской язвы для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней: Методические указания МУ 4.2.2941-11 / А.Н. Куличенко, Е.И. Еременко, А.Г. Рязанова, О.В. Малецкая, Н.П. Буравцева, О.И. Цыганкова, Т.В. Таран, Е.А. Цыганкова, Т.М. Головинская, В.В. Кутырев, С.А. Щербакова, Ю.А. Попов, H.A. Осина, И.Н. Шарова, Е.С. Казакова, ЕЕ.А. Плотникова, В.Е. Куклев, С.А. Портенко, C.B. Балахонов, Т.Н. Иннокентьева, З.Ф. Дугаржапова, A.B. Родзиковский, Е.В. Кравец, Ю.М. Ломов, Н.Р. Телесманич, В.И. Прометной, С.Ю. Водяницкая, H.JI. Пичурина, О.С. Бурлакова, В.Е. Безсмертный, С.М. Иванова, А.И. Верещагин, М.В. Зароченцев, В.В. Мордвинова, И.А. Дятлов, Л.И. Маринин, С.Ф. Бикетов, А.Е. Хлынцева, М.В. Храмов, А.И. Борзилов, Борисевич, Саяпина -М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора,2011. — С. 1-55.

г) тезисы научных конференций

6. Хлынцева А.Е., Баранов А. М., Белова Е.В., Шемякин И.Г., Маринин Л.И., Дятлов И.А. Изучение свойств моноклональных антител для разработки иммунохроматографического стрип-теста с целью определения спор возбудителя сибирской язвы // Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников содружества независимых государств: Материалы IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ: (30 сентября - 2 октября, 2008 г., Волгоград) / Под ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева, В.В. Алексеева. -Волгоград, 2008. - С. 140-141.

7. Хлынцева А.Е., Баранов А. М., Баранова Е.В., Белова Е.В., Миронова Р.И., Маринин Л.И., Шемякин И.Г., Дятлов И.А. Моноклональные антитела к спорам возбудителя сибирской язвы, перспективные для создания иммунохроматографической тест-системы // Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология: Материалы Всероссийской научной конференции, посвященная 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ МИНОБОРОНЫ РОССИИ» - Киров, 2008. - С. 147-149.

8. Хлынцева А.Е., Баранов А. М., Белова Е.В., Шемякин И.Г., Дятлов И.А. Получение моноклональных антител для иммунохроматографического определения спор Bacillus anthracis // Биологическая безопасность в современном мире: Материалы научно-практической школы-конференции научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора (21-22 апреля 2009 г., Оболенск, Московская обл.)/ Под ред. Г.Г. Онищенко, И.А. Дятлова. - С. 148-149.

9. Хлынцева А.Е., Белова Е.В., Дятлов И.А., Шемякин И.Г. Разработка латекс-агглютинационной тест-системы для детекции спор Bacillus anthracis // Современные технологии обеспечения биологической безопасности: Материалы научно-практической школы-конференции научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора (25- 27 мая 2010 г., Оболенск, Московская обл.)/ Под ред. Г.Г. Онищенко, И.А. Дятлова. - С. 219-221.

10. Хлынцева А.Е., Белова Е.В., Шемякин И.Г. Усовершенствование методов индикации спор Bacillus anthracis с применением магнитных частиц с иммобилизованными моноклональными антителами // Актуальные вопросы

клинической и экспериментальной медицины: Материалы Юбилейной конференции молодых ученых (СПбМАПО, Санкт-Петербург, 2010. - С. 100-101.

11. Хлынцева А.Е., Белова Е.В., Дятлов И.А., Шемякин И.Г. Разработка латекс-диагностикума на основе моноклональных антител для идентификации спор Bacillus anthracisll Молекулярная диагностика - 2010: Материалы VII Всероссийской научно-практическая конференции с международным участием (Москва, 2010 г.)/Под ред. В.И. Покровского. -С. 448-451.

12. Хлынцева А.Е., Белова Е.В., Козырь A.B., Шемякин И.Г. Оценка диагностической значимости сконструированного сибиреязвенного латексного диагностикума для детекции вегетативной формы возбудителя сибирской язвы // Современные технологии обеспечения биологической безопасности: Материалы III Научно-практическаой школы-конференции СМУиС Роспотребнадзора (31 мая - 2 июня 2011 г., Оболенск, Московская обл.)/ Под ред. Г.Г. Онищенко, И.А. Дятлова. - С. 242-244.

Благодарности

Приношу искреннюю благодарность научным руководителям моей кандидатской диссертации д.б.н., проф. И.Г. Шемякину (ГНЦ ПМБ) и к.б.н. A.B. Козырь (ГНЦ ПМБ), осуществлявшим научное руководство и оказывавшим методическую помощь на всех этапах работы.

Считаю своим долгом выразить искреннюю благодарность моим соавторам, принимавшим участие в планировании и проведении экспериментов и обсуждении их результатов.

Выражаю благодарность за помощь в проведении испытаний сконструированных тест-систем сотрудникам ФГУН ГНЦ ПМБ: зав. лабораторией микробиологии сибирской язвы к.м.н. Маринину Л.И., н.с. Мироновой Р.И.; сотрудникам ФГУЗ ВолгоградНИПЧИ зав. лабораторией иммунодиагностики и биотехнологии д.м.н., проф. Храповой Н.П., с.н.с. лаборатории сибирской язвы к.м.н. Баркову A.M., с.н.с. к.м.н. Барковой И.А.; сотрудникам ФГУЗ СтавНИПЧИ зав. научно-производственной лабораторией препаратов для диагностики особо опасных и других инфекций д.м.н., проф. Тюменцевой И.С., в.н.с. д.б.н. Жарниковой И.В., с.н.с. к.б.н. Ждановой Е.В.; сотрудникам ФКУЗ ИркутскНИПЧИ Сибири и ДВ н.с. отдела зоонозных инфекций к.б.н. Кравец Е.В и н.с. отдела зоонозных инфекций к.б.н. Дугаржаповой З.Ф.

Приношу искреннюю признательность ведущей организации, официальным оппонентам и всем рецензентам настоящей работы за высказанные замечания, заданные вопросы и сделанные поправки, которые, по возможности были учтены.

Подписано в печать 11.04.2012 г.

Заказ № 7120 Тираж: 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499} 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хлынцева, Анна Евгеньевна, Оболенск

61 12-3/784

ФЕДЕРАЛЬНОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ «ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ПРИКЛАДНОЙ МИКРОБИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ» ФЕДЕРАЛЬНОЙ СЛУЖБЫ ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА РФ

РАЗРАБОТКА КОМПЛЕКСА ИММУ НО ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ

СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ

На правах рукописи

ХЛЫНЦЕВА

Анна Евгеньевна

03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор

Шемякин Игорь Георгиевич кандидат биологических наук Козырь Арина Владимировна

Оболенск- 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр

v7 гп

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ..............................................................................................................7

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................................................................8

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................................17

1.1. Введение..........................................................................................................................................17

1.2. Таксономия возбудителя сибирской язвы............ ..................................17

1.3. Эпидемиологическая характеристика сибиреязвенной 17 инфекции.........................................................................

1.4. Источники инфекции..........................................................................................................18

1.5. Пути, механизмы передачи и восприимчивый организм..................21

1.6. Роль спор B.anthracis в эпидемиологическом процессе......................24

1.7. Микробиологическая и биохимическая характеристика 25 возбудителя сибирской язвы.................................................

1.8. Процесс спорообразования......................................................................................27

1.9. Структура споры................................................................................................................31

1.10. Антигенный состав спор и вегетативных клеток..................................36

1.11. Методы детекции спор и вегетативных клеток В. anthracis.... 42

1.12. Моноклональные антитела как основа современных методов 50 иммуноанализа..................................................................

1.12.1. Получение моноклональных антител..........................................................51

1.12.2. Свойства моноклональных антител............................................................53

1.12.3. Области применения моноклональных антител..............................54

1.13. Заключение..............................................................................................................................55

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ..........................................57

2.1. Штаммы микроорганизмов..........................................................................................57

2.1.2. Определение концентрации спор........................................................................59

2.1.3. Подготовка проб почвы и воды, искусственно зараженных 59 спорами микроорганизмов рода Bacillus..................................

2.2. Получение гибридом............................................................................................................60

2.2.1. Иммунизация мышей линии ВALB/c............................................................60

2.2.2. Определение уровня специфических антител у 61 иммунизированных мышей...................................................

2.2.3. Культивирование миеломной клеточной линии....................................61

2.2.4. Подготовка макрофагального фидерного слоя......................................61

2.2.5. Выделение спленоцитов гипериммунных мышей..............................61

2.2.6.Гибридизаци я........................................................................................................................62

2.2.7. Селекция гибридных клеток....................................................................................62

2.2.8. Скрининг гибридных клеток - продуцентов МКА..............................62

2.2.8. Клонирование гибридных клеток........................................................................63

2.2.9. Масштабирование гибридом..................................................................................64

2.2.10. Культивирование гибридом in vivo................................................................64

2.2.11. Криоконсервация............................................................................................................64

2.3. Выделение и очистка МКА..........................................................................................64

2.4. Характеристика моноклональных антител......................................................65

2.4.1. Определение подклассовой принадлежности МКА..........................65

2.4.2. Определение молекулярной массы легкой и тяжелой цепей 65 МКА...............................................................................

2.4.3. Определение аффинности МКА..........................................................................66

2.4.4. Определение специфичности МКА..................................................................66

2.4.4.1. Дот-блот анализ..............................................................................................................66

2.4.4.2. Иммуноблотинг..............................................................................................................67

2.5. Конструирование иммунодиагностических тест-систем..................67

2.5.1. Разработка тест-системы на основе иммуноферментного 67 анализа............................................................................

2.5.1.1. Биотинилирование МКА........................................................................................68

2.5.1.2. Двухсайтовый дот-блот анализ................ ........................................68

2.5.1.3. «Сэндвич»-ИФА............................................................................................................68

2.5.2. Конструирование латексного диагностикума на основе МКА 69 для выявления спор возбудителя сибирской язвы.......................

2.5.2.1. Иммобилизация МКА на латексных частицах....................................69

2.5.2.2. Постановка реакции латекс-агглютинации..........................................70

2.5.2.3. Лиофильное высушивание латексных суспензий с 71 иммобилизованными МКА...................................................

2.5.3. Конструирование тест-системы для селективного концентрирования спор Bacillus anthracis на основе магнитных

частиц с иммобилизованными МКА..............................................................................у^

2.5.3.1. Получение иммунопероксидазных конъюгатов у ^ сибиреязвенных...............................................................

2.5.3.2. Активация магносорбента (МС)..................................................................У2

2.5.3.3. Получение магноиммуносорбентных диагностикумов 72 (МИС)...........................................................................

2.5.3.4. Постановка ИФА с использованием МИС........................................72

2.6. Идентификация мишени для МКА, использованных при 73

разработке тест-систем......................................................

2.6.1. Реакция прямой иммунофлуоресценции..................................................73

2.6.1.1. Приготовление флуоресцеин (ФИТЦ) - меченных МКА.. 73

2.6.1.2. Приготовление мазков бактериальных суспензий 74 препаратов спор...............................................................

2.6.1.3. Проведение прямой иммунофлуоресценции....................................74

2.6.2. Получение рекомбинантного белка ЕА1 В. ап^тыБ и 75 рекомбинантного Вс1А экзоспориума В. аМкгаЫя.....................

2.6.2.1. Выделение ДНК..........................................................................................................75

2.6.2.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)....................................................75

2.6.2.3. Рестрикция......................................................................................................................76

2.6.2.4. Лигирование..................................................................................................................76

2.6.2.5. Электротрансформация бактериальных клеток............................76

2.6.2.6. Выделение плазмидной ДНК........................................................................77

2.6.2.7. Секвенирование........................................................................................77

2.6.2.8. Получение продуцента Вс1А и ЕА1........................................................77

2.6.2.9. Выделение Вс1А и ЕА1......................................................................................77

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ............................................................................79

3.1. Получение и отбор наиболее перспективных клонов 79 гибридомных клеток, продуцентов МКА..............................

3.1.1. Иммунизация....................................................................................................................79

3.1.2. Получение гибридомных клонов-продуцентов МКА..................80

3.2. Характеристика МКА....................................................................................................82

3.2.1. Определение подклассовой принадлежности МКА........................82

3.2.2. Выделение и очистка МКА....................................................................................82

3.2.3. Определение констант аффинности МКА............................................83

3.2.4. Определение специфичности МКА..............................................................83

3.3. Разработка иммунодиагностических тест-систем................................86

3.3.1. Разработка тест-системы для выявления и идентификации 86

спор методом иммуноферментного анализа............................

3.3.1.2. Двухсайтовый дот-блот анализ....................................................................86

3.3.1.3. Проверка чувствительности и специфичности 87 подобранных пар МКА в «сэндвич-ИФА»..............................

3.3.1.4. Изготовление экспериментальных образцов тест-системы для выявления и идентификации спор возбудителя ^д сибирской язвы методом иммуноферментного анализа (ИФА)....

3.3.1.5. Проведение испытаний иммуноферментной тест- 89 системы.........................................................................

3.3.2. Конструирование латексного диагностикума для 91 определения спор В. anthracis.............................................

3.3.2.1. Иммобилизация и подбор оптимальной нагрузки МКА

на твердом носителе - латексных микрочастицах (получение ^ латексных суспензий с иммобилизованными МКА)..................

3.3.2.2. Проверка чувствительности и специфичности полученных латексных суспензий с иммобилизованными МКА при помощи панели штаммов спор сибирской язвы и гетерологичных микроорганизмов в реакции латекс-агглютинации.................................................................. 93

3.3.2.3. Лиофильная сушка латексных суспензий с иммобилизованными МКА, проверка чувствительности и специфичности высушенных латексных реагентов в реакции латекс-агглютинации........................................................ 94

3.3.2.4. Изготовление экспериментальных образцов латексных диагностикумов для определения спор возбудителя сибирской ^ язвы..............................................................................

3.3.2.5. Проведение межлабораторных и комиссионных испытаний экспериментальных образцов латексных диагностикумов для определения спор возбудителя сибирской язвы.............................................................................. 97

3.3.3. Конструирование тест-системы для селективного концентрирования спор Bacillus anthracis на основе магнитных jqq частиц с иммобилизованными моноклональными антителами....

3.3.3.1. Определение рабочего титра иммунопероксидазных

конъюгатов..................................................................... ЮО

3.3.3.2. Оценка чувствительности и специфичности сконструированной иммуноферментной магноиммуносорбентной тест-системы для выявления возбудителя сибирской язвы в споровой форме....................... ^

3.3.3.3. Оценка возможности применения тест-системы для селективного концентрирования возбудителя сибирской язвы на ^ МИС из проб окружающей среды........................................

3.3.3.4. Изготовление экспериментальных образцов 104 иммуноферментной магноиммуносорбентной тест-системы......

3.3.3.5. Проведение комиссионных испытаний экспериментальных образцов тест-системы магноиммуносорбентной для определения спор возбудителя сибирской язвы............................................................... ^

3.4. Идентификация мишени для МКА, использованных при 107 разработке тест-систем......................................................

3.4.1. Исследование взаимодействия моноклональных антител с 108 поверхностью спор...........................................................

3.4.2. Идентификация мишеней для моноклональных антител, 109

примененных при разработке тест-систем..............................

3.4.2.1. Вс1А и ЕА1............................................................ 110

3.4.3. Оценка диагностической значимости разработанных диагностикумов для детекции вегетативной формы возбудителя сибирской язвы...............................................................

ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................................................................................114

ВЫВОДЫ................................................................................................................................................................119

БЛАГОДАРНОСТИ......................................................................................................................................120

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ.............................. 121

ПРИЛОЖЕНИЯ

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

БСА - бычий сывороточный альбумин

ГАТ - гипоксантин, аминоптерин и тимидин

ГГФТ - гипоксантингуанинфосфорибозилтрансфераза

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДПК - дипиколиновая кислота

ИФА - иммуноферментный анализ МИС - магноиммуносорбенты

МКА - моноклональные антитела

МС - магносорбенты

МФА - метод флуоресцирующих антител

ПНР - полимеразная цепная реакция РЛА - реакция латекс-агглютинации РИГА - реакция непрямой гемагглютинации

РНК - рибонуклеиновая кислота

ТИФА - твердофазный иммуноферментный анализ

ТК - тимидинкиназа

ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцианат

ФСБ-Т - фосфатно-солевой буфер, содержащий 0,5% твин-20 ЕБ - отечный фактор и - летальный фактор РА - протективный антиген 8Т - соматический антиген

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность.

Разработка современных диагностических систем для детекции возбудителя сибирской язвы представляет собой одну из наиболее актуальных задач борьбы с сибиреязвенной инфекцией. Сибирская язва является острым инфекционным заболеванием людей и животных, вызываемым аэробным спорообразующим грамположительным микроорганизмом Bacillus anthracis.

По классификации ВОЗ Россия относится к зоне спорадического проявления инфекции. Однако, в последние годы в стране отмечается неуклонный рост территорий, неблагополучных по сибирской язве, таким образом, службы надзора Российской Федерации оценивают санитарно-эпидемиологическую обстановку по этому заболеванию как напряженную [22].

Возбудитель — Bacillus anthracis представляет собой грамположительную палочку длиной 6-10 мкм и шириной 1-2 мкм. Она неподвижная, образует споры и капсулу. Хорошо растет на различных питательных средах. Вегетативные формы быстро погибают без доступа воздуха, при прогревании, под воздействием различных дезинфицирующих средств. Споры сибирской язвы весьма устойчивы во внешней среде, они могут сохраняться в почве несколько десятков, а возможно, и сотни лет, формируя устойчивые природные очаги инфекции.

Источником В. anthracis считают больных домашних и диких животных, организм которых предоставляет естественные условия для развития и размножения этого патогена [14]. При этом источником могут быть и животные-бациллоносители, с атипичным или бессимптомным течением заболевания [28]. Заражение может наступать при уходе за больными животными, убое скота, обработке мяса, а также при контакте с продуктами животноводства (шкуры, кожи, меховые изделия, шерсть,

щетина), обсемененными спорами сибиреязвенного микроба. Заболеваемость носит преимущественно профессиональный характер. Основным резервуаром В. агЛЬгасгБ считается почва [14]. К тому же, почва может быть и непосредственным источником инфекции сибирской язвы - известны случаи заболевания людей и животных, возникшие в результате контакта с заражённой почвой. [24]. Споры попадают в кожу через микротравмы; при алиментарном инфицировании (употребление зараженных продуктов) возникает кишечная форма. Передача возбудителя может происходить воздушно-капельным путем (вдыхание инфицированной пыли, костной муки). В этих случаях возникают легочная и генерализованная формы сибирской язвы. В странах Африки допускается возможность передачи инфекции посредством укусов кровососущих насекомых. Заражения человека от человека обычно не наблюдается. Сибирская язва широко распространена во многих странах Азии, Африки и Южной Америки. В США и странах Европы наблюдаются единичные случаи заболеваний сибирской язвой.

Основными факторами вирулентности возбудителя сибирской язвы являются капсула и бинарный экзотоксин. Однако, в конечном итоге, вирулентность бактерии определяется суммой факторов, которая до конца не изучена.

Капсульные антигены кодируются генами, расположенными на плазмиде рХ02, а токсинный комплекс и некоторые ферменты, необходимые для синтеза капсулы - на плазмиде рХ01. Роль капсулы при инфекции заключается в защите вегетативной формы патогена от фагоцитоза макрофагами. Вместе с бинарным токсином, состоящим из протективного антигена, связывающегося с недавно идентифицированными клеточными рецепторами и двух эффекторных белков - летального и отёчного факторов, первичными мишенями которых являются, соответственно, макрофаги и

нейтрофилы, капсула практически полностью защищает патоген от ранних стадий иммунного ответа организма-хозяина.

Однако, действие сибиреязвенного токсина не ограничивается блокировкой иммунного ответа и реакции макрофагов и нейтрофилов. При развитии лёгочной, кишечной, и септической форм инфекции, действие токсинов становится системным, и приводит к гибели организма. Механизм интоксикации до конца не ясен, однако очевидно, что при определённой концентрации токсина в крови, наступает так называемое «состояние невозврата», при котором любая терапия существующими в настоящее время методами, оказывается неэффективной.

Важнейшую роль играет ранняя диагностика инфекции и необходимость детекции низких концентраций возбудителя сибирской язвы в окружающей среде и продуктах питания. К настоящему времени в нашей стране и за рубежом разработан целый ряд экспериментальных иммунодиагностических тест-систем, предназначенных для выявления возбудителя сибирской язвы и его антигенов [31]. Однако, экспериментальные разработки зачастую не завершаются внедрением результатов в практику на уровне сертифицированных препаратов, как правило, из-за несоответствия принятым параметрам специфичности (неспецифическое взаимодействие с близкородственными видами, такими как В. сегет и др.).

Таким образом, для разработки эффективных средств имм