Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Диагностическая ценность сибиреязвенных иммуноглобулинов и бактериофага Гамма А-26 при выявлении и идентификации возбудителя сибирской язвы

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Диагностическая ценность сибиреязвенных иммуноглобулинов и бактериофага Гамма А-26 при выявлении и идентификации возбудителя сибирской язвы"

Надравах-рукописи

Лобач Роман Николаевич

ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ СИБИРЕЯЗВЕННЫХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ И БАКТЕРИОФАГА ГАММА А-26 ПРИ ВЫЯВЛЕНИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ

03.02.03 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

I / ЬАР 2014

Москва-2014

005546378

005546378

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Официальные оппоненты: Коровкин Сергей Анатольевич

Кравцов Эдуард Георгиевич

Научный руководитель:

Саяпина Лидия Васильевна доктор медицинских наук, главный

эксперт Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства

здравоохранения Российской Федерации

доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник

Федерального государственного

бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Российской академии медицинских наук

кандидат медицинских наук, доцент кафедры микробиологии и вирусологии медицинского факультета Федерального государственного автономного

образовательного учреждения высшего образования «Российский университет дружбы народов»

Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Волгоградский

научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится Лл^е/Ц 2014 года в /е часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.05 при Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего образования «Российский университет дружбы народов» по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.8.

Ведущая организация:

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке УНИБЦ ( Научная библиотека) ФГАОУ ВО « Российский университет дружбы народов» (117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6) и на сайте www.rudn.ru Автореферат размещен на сайте www.vak.ed.gov.ru.

Автореферат разослан «/3» .. 11(1070- 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент

Гигани Ольга Борисовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Сибирская язва относится к особо опасным инфекциям с острым началом, тяжелым течением и высокой летальностью, которая при несвоевременном лечении, может достигать 90 % (Макаров В.В. и др., 2012; Маринин Л.И. и др., 2008, Swartz М., 2001). Одной из главных причин эпидемического неблагополучия по сибирской язве является способность возбудителя образовывать во внешней среде устойчивые споры, годами сохраняющие свою жизнеспособность и патогенные свойства, что представляет собой опасность для людей и животных (Онищенко Г.Г. и др., 1999, 2009; Черкасский Б.Л., 2004; Ладный В.И. и др., 2009; Кологоров А.И. и др., 2010). Кроме этого, существует возможность завоза инфицированных животных, сырья и продуктов животного происхождения, контаминированных спорами возбудителя, из неблагополучных по сибирской язве стран (Еременко Е.И. и др., 2010).

За последние 5 лет заболеваемость сибирской язвой на территории Российской Федерации несколько стабилизировалась, однако все еще остается на высоком уровне. Эпидемическая ситуация по данному заболеванию на ближайшие годы прогнозируется как неблагополучная (Куличенко А.Н. и др., 2011; Онищенко Г.Г., 2010; Рязанова А.Г. и др., 2011). Учитывая вышеизложенное, своевременное выявление и идентификация возбудителя сибирской язвы, является актуальным.

В системе противоэпидемических мероприятий важное место отводится мониторингу за циркуляцией Bacillus anthracis. Диагностика сибирской язвы включают в себя обнаружение возбудителя в исследуемом материале, выделение и идентификацию культуры. Основными методами индикации сибирской язвы являются метод флуоресцирующих антител (МФА) с помощью флуоресцирующих иммуноглобулинов и ПЦР, а также экспресс-методы (ИФА, РИГА).

Из современных наиболее доступных и надежных сигнальных методов серологической диагностики является МФА в реакции иммунофлуоресценции (РИФ) (Куличенко А.Н. и др., 2010; Саяпина Л.В. и др., 2010). Положительные результаты, полученные в ходе проведения МФА, позволяют сделать предварительный вывод о наличии возбудителя сибирской язвы в исследуемом материале и своевременно начать проведение противоэпидемических и профилактических мероприятий.

Несмотря на совершенствование лабораторной диагностики сибирской

язвы, использование традиционных методов идентификации возбудителя, не утратили своего значения. Важная роль при идентификации типичных и атипичных штаммов Bacillus anthracis, отводится определению их чувствительности к бактериофагам (Рязанова А.Г. и др. 2009; Головинская Т.М. и др., 2011). Одним из направлений улучшения лабораторной диагностики сибирской язвы является использование зарегистрированных препаратов (Порядок организации и проведения лабораторной диагностики сибирской язвы для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней» МУК 4.2.2941-11).

Специалистами Ставропольского научно-исследовательского противочумного института (Ставропольский НИПЧИ) предложены иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие вегетативные и споровые адсорбированные и бактериофаг Гамма А-26, предназначенные для обнаружения и идентификации возбудителя сибирской язвы в объектах окружающей среды и биологическом материале.

В связи с этим, исследования по изучению диагностической ценности сибиреязвенных препаратов, предназначенных для выявления и идентификации возбудителя сибирской язвы, являются актуальными.

Цель исследования - изучить диагностическую ценность сибиреязвенных иммуноглобулинов флуоресцирующих (вегетативные и споровые) адсорбированных и бактериофага Гамма А-26 на этапах индикации и идентификации возбудителя сибирской язвы.

Задачи исследования:

1. Оценить специфическую активность и специфичность иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных адсорбированных в РИФ по сравнению с бактериологическим методом (тест на гемолиз).

2. Охарактеризовать диагностическую ценность (специфическая активность и специфичность) иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных споровых адсорбированных на чистых культурах, в пробах из объектов окружающей среды и биологического материала.

3. В сравнительных испытаниях определить широту диапазона литической активности и специфичности бактериофагов диагностических сибиреязвенных Гамма А-26 и Fah ВНИИВВиМ.

4. Обосновать возможность использования сибиреязвенных препаратов иммуноглобулинов флуоресцирующих (вегетативные и споровые) адсорбированных и бактериофага Гамма А-26 для индикации и идентификации возбудителя сибирской язвы в лабораторной диагностике.

Научная новизна

Впервые установлена высокая специфическая активность иммуноглобулинов сибиреязвенных вегетативных адсорбированных при исследовании мазков из чистых культур, проб из объектов окружающей среды и биологического материала (мясо животного), контаминированных В. аыНгасж. Показано, что иммуноглобулины в разведении 1:64 обеспечивают специфическое свечение 93,8±6,0 % из 16 исследуемых штаммов В. апЛгаЫз в вегетативной форме.

Впервые на представительном материале (объекты окружающей среды, биологический материал, чистые культуры) установлена диагностическая ценность иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных споровых адсорбированных, обеспечивающих в разведении 1:64 специфическое свечение сибиреязвенного микроба в споровой форме в мазках чистых культур, проб из объектов окружающей среды (смывы, корма, вода, почва) и биологического материала и не вызывающих специфического свечения со штаммами близкородственных микроорганизмов.

Доказано преимущество проведения РИФ с помощью иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных и споровых адсорбированных перед бактериологическим методом (тест на гемолиз) при исследовании проб объектов окружающей среды и биологического материала по времени учета результатов — 2,5-3 ч против 40 ч соответственно.

Новыми являются данные сравнительных исследований бактериофагов сибиреязвенных Гамма А-26 и БаИ ВНИИВВиМ (ветеринарного). Испытываемый бактериофаг Гамма А-26 обладает широким диапазоном действия к исследуемым штаммам В. аМкгаск и высокой специфичностью в отношении близкородственных микроорганизмов. Установлено, что сибиреязвенный бактериофаг Гамма А-26 лизировал 97,9±2,1 % типичных и атипичных штаммов В. ап1/1гас1.ч из 47 исследуемых и не лизировал 95,8±2,36 % из 72 штаммов близкородственных микроорганизмов.

Обоснована целесообразность применения в практическом здравоохранении изучаемых иммуноглобулинов сибиреязвенных вегетативных и споровых адсорбированных, а также бактериофага сибиреязвенного

Гамма А-26, предназначенных для индикации и идентификации возбудителя сибирской язвы.

Практическая значимость работы

В результате работы внедрены в практику следующие препараты:

Иммуноглобулины флуоресцирующие сибиреязвенные вегетативные адсорбированные сухие (Регистрационное удостоверение № ФСР 2011/11338);

Иммуноглобулины флуоресцирующие сибиреязвенные споровые адсорбированные сухие (Регистрационное удостоверение

№ ФСР 2011/11339);

Бактериофаг сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий (Регистрационное удостоверение № ФСР 2011/10415).

Внесены изменения в нормативную документацию:

Технические условия (ТУ) 9389-003-01897080-2010 и инструкцию по применению на иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сибиреязвенные вегетативные адсорбированные сухие (Акт внедрения рекомендаций, утвержденный директором ФКУЗ Ставропольского НИ11ЧИ);

Технические условия 9389-005-01897080-2010 и инструкцию по применению на иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сибиреязвенные споровые адсорбированные сухие (Акт внедрения рекомендаций, утвержденный директором ФКУЗ Ставропольского НИПЧИ);

Технические условия 9389-013-01897080-2009 и инструкцию по применению на бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий (Акт внедрения рекомендаций, утвержденный директором ФКУЗ Ставропольского НИПЧИ).

Материалы диссертации используются при чтении лекций на курсах повышения квалификации специалистов по особо опасным инфекциям.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Испытываемые иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сибиреязвенные вегетативные адсорбированные в разведении 1:64 обеспечивают специфическое свечение 93,8±6,0 % штаммов В. аМИгааь в вегетативной форме, что позволяет их использовать для индикации при исследовании чистых культур, объектов окружающей среды и биологического материала в лабораторной диагностике сибирской язвы.

2. Диагностический препарат иммуноглобулины флуоресцирующие сибиреязвенные споровые адсорбированные в разведении 1:64 выявляет

б

93,8±6,0% исследуемых штаммов В. аШкгайя и в 96,9±3,1 % случаев не реагирует со штаммами близкородственных микроорганизмов; в пробах из объектов внешней среды и биологического материала сибиреязвенный микроб обнаруживается в 100 % случаев.

3. Использование иммуноглобулинов сибиреязвенных вегетативных и споровых адсорбированных в РИФ имеет явное преимущество перед бактериологическим методом (тест на гемолиз) при исследовании проб объектов окружающей среды и биологического материала по времени постановки и учету результатов - 2,5-3 ч против 40 ч.

4. Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 обладает широким диапазоном литической активности и специфичностью, что подтверждено наличием лизиса 97,9±2,1 % штаммов В. аШкгаыБ из 47 исследуемых и ее отсутствием в 95,8±2,36 % случаев при исследовании 72 штаммов близкородственных микроорганизмов. При учете результатов установлено, что бактериофаг сибиреязвенный Гамма А-26 превосходит препарат сравнения по четкости лизиса исследуемых штаммов В. апЛгаш.

Работа выполнена на базах лаборатории препаратов против чумы и др. особо опасных инфекций ГИСК им Л.А, Тарасевича, Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб», Иркутского НИПЧИ, Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (п. Оболенск), бактериологической лаборатории ФГКУ 294 ЦСООР МЧС РФ.

Апробация материалов диссертации

Материалы диссертации нашли отражение на Всероссийских и межгосударственных научно-практических конференциях: научно-практической конференции «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов, 2009); XI Межгосударственной научно-практической конференции «Современные технологии в совершенствовании мер предупреждения и ответных действий на чрезвычайные ситуации в области общественного здравоохранения санитарно-эпидемиологического характера» (Саратов, 2012); на 2 научно-практической конференции молодых ученых «Научные подходы к повышению качества экспертизы лекарственных средств: реалии и перспективы» в ФГБУ «НЦЭСМП Минздрава России» (Москва, 2013 г.).

Материалы диссертации вошли в отчеты по законченным техническим и медицинским испытаниям сибиреязвенных препаратов за период 2007 - 2010 гг.

Результаты исследований были использованы при составлении 3 нормативных документов: Технические условия 9389-003-01897080-2010 и инструкция по применению на Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сибиреязвенные вегетативные адсорбированные сухие;

Технические условия 9389-005-01897080-2010 и инструкция по применению на Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сибиреязвенные споровые адсорбированные сухие;

Технические условия 9389-013-01897080-2009 и инструкция по применению на Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий.

Публикации

По теме диссертации опубликованы 4 статьи, 3 из них в изданиях, рекомендованных ВАК Российской Федерации.

Личный вклад автора

Обоснование проблемы, постановка цели и задачи работы, выбор методов исследования, выполнение экспериментальной и аналитической части работы, обобщение и интерпретация полученных данных, подготовка научных публикаций. Соискателем проведен анализ полученных данных, сформулированы основные положения диссертации, составляющие ее новизну и практическую значимость.

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 3 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литеоатуры. Диссертация иллюстрирована 14 таблицами и 7 рисунками. Библиографический указатель включает 168 источников литературы, в том числе 117 отечественных и 51 зарубежных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследования. В работе были использованы экспериментально-производственные серии иммуноглобулинов

диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных адсорбированных, иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных споровых адсорбированных, сибиреязвенного

диагностического бактериофага Гамма А-26, коммерческая серия сибиреязвенного бактериофага Fah ВНИИВВиМ (ветеринарный).

Для определения чувствительности, специфической активности и специфичности иммуноглобулинов сибиреязвенных вегетативных и споровых были исследованы 16 штаммов чистых культур микроорганизмов В. anthracis, 32 штамма близкородственных микроорганизмов В. cereus, В. subtilis, В. megaterium, В. thuringiensis, В. anthracoides; 450 проб из объектов окружающей среды (смывы, вода, почва, корма), биологического материала (мясо животного), контаминированных В. anthracis в концентрациях 10б, 107, 108 м.к./мл и 106, 107, 108 спор/мл и близкородственными микроорганизмами (В. subtilis, В. megaterium, В. cereus, В. thuringiensis, В. anthracoides) - в концентрациях 107 и 108 м.к./мл или спор/мл. Исследуемые штаммы и пробы были зашифрованы, дешифровка проводилась после учета результатов.

При изучении широты спектра литической активности сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26 были исследованы 47 штаммов В. anthracis и 72 штамма близкородственных микроорганизмов. Каждый опыт проводили с соблюдением принципов строго контролируемого эксперимента.

Изучение диагностической ценности (чувствительность, специфическая активность, специфичность, воспроизводимость) иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных и споровых проводили в соответствии с разработанными Программами исследований, включающие выбор метода сравнения, подбор штаммов В. anthracis и близкородственных микроорганизмов; а также подготовку проб (объекты окружающей среды, биологический материал) для исследования в РИФ.

Микроскопию мазков проводили с помощью люминесцентного микроскопа «Carl Zeiss Primo Star» под иммерсионным объективом. Постановку теста на гемолиз со штаммами В. anthracis и близкородственных микроорганизмов осуществляли в соответствии с МУ «Лабораторная диагностика для обнаружения сибирской язвы», 2008.

Диапазон литического спектра сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26 изучали в соответствии с разработанной Программой исследования диагностической ценности бактериофага, включающей выбор препарата сравнения, подбор штаммов В. anthracis (типичные, атипичные) и близкородственных микроорганизмов для определения диапазона литической активности и специфичности действия бактериофага и инструкцией по применению бактериофага сибиреязвенного Fah ВНИИВВиМ.

Статистические методы оценки результатов исследования

В работе использованы стандартные методы вариационной статистики экспериментальных данных (Ашмарин И.П., Воробьев A.A., 1962; Лакин Г.Ф., 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение специфической активности и специфичности иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных адсорбированных

Своевременность проведения противоэпидемических и профилактических мероприятий в очагах сибирской язвы зависит от эффективности лабораторной диагностики. Метод флуоресцирующих антител относится к основным сигнальным методам, так как является достаточно информативным, обеспечивающим быстрое и достоверное обнаружение возбудителя сибирской язвы на ранних этапах диагностики.

Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сибиреязвенные вегетативные адсорбированные представляют собой иммуноглобулиновую фракцию к водорастворимому антигену вегетативной формы В. anthracis, выделенную из гипериммунной кроличьей сыворотки, адсорбированную на основе магноиммуносорбентов водорастворимыми антигенами штаммов В. cereus. Препарат предназначен для обнаружения вегетативной формы В. anthracis в РИФ в мазках из чистых культур, объектов окружающей среды (почва, подстилка, вода, продовольственное сырье, фураж) и биологического материала (продукты животного происхождения).

В ходе работы установлено, что иммуноглобулины по физико-химическим свойствам соответствовали требованиям нормативной документации (НД). Содержимое ампулы представляло собой аморфную пористую массу желто-оранжевого цвета, которая при растворении очищенной водой имела вид прозрачной жидкости желто-оранжевого цвета, значение pH 7,6 (норма 7,5-8,5).

Специфическую активность иммуноглобулинов определяли при просмотре мазков, приготовленных из 16 штаммов В. anthracis в концентрации 1,0x108 м.к./мл и окрашенных препаратом в разведениях от 1:8 до 1:256. Показано, что препарат в разведении 1:128 выявлял только 10 исследуемых штаммов сибиреязвенного микроба, что составило 62,5±12,1 %. Учитывая полученные результаты, за рабочее разведение иммуноглобулинов было принято разведение 1:64, что подтверждено специфическим свечением с

ю

интенсивностью на 3-4 креста у 93,8±6,0% из исследованных штаммов В. anthracis (рис. 1).

Одновременно было показано, что иммуноглобулины вегетативные адсорбированные в разведении 1:64 окрашивали 8 штаммов 25,0±7,65 % других видов Bacillus, из 32 взятых в исследование. Сравнительно невысокую специфичность препарата 75,0±5,6 % можно объяснить генетическим родством сибиреязвенного микроорганизма с другими видами рода Bacillus.

Определение чувствительности реакции иммунофлуоресценции по выявлению иммуноглобулинами в рабочем разведении минимального количества микробных клеток в мазках из штаммов В. anthracis в концентрациях от 1x104 до 1x108 м.к./мл, позволило установить их высокую способность обнаруживать возбудителя сибирской язвы в исследованном материале. При просмотре 30 полей зрения в мазках наблюдали специфическое свечение с интенсивностью на 3-4 креста 1-2 и более микробных клеток В. anthracis в концентрации 5,0x105 м.к./мл.

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 О

ш

—I

В- anthracis

■'Je'

ш

ш°/б выявления штаммов

Блпзкороостеенные

-\!ПКрООр,'(!Ит.\1Ъ1

Рисунок 1 - Результаты специфической активности и специфичности иммуноглобулинов вегетативных адсорбированных

Воспроизводимость совпадения положительных и отрицательных результатов в РИФ с помощью иммуноглобулинов вегетативных составила 100 %. Исследования, проведенные в 10 повторностях, при постановке анализа в разные дни и разными исполнителями показали, что во всех определениях со штаммом В. апвггааз получены совпадающие положительные результаты, в то время как во всех случаях со штаммом В. сегет — результаты были отрицательные. Учитывая назначение сибиреязвенных иммуноглобулинов,

особое внимание уделялось подготовке проб из объектов окружающей среды (смывы, вода, почва, корма) и мяса животного (табл. 1).

Таблица 1 - Обобщенные данные исследований иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных адсорбированных

№ п/п Показатели Количество проб Результаты

иммуноглобулины флуоресцирующие в разведении 1:64 тест на гемолиз

1. Чувствительность (минимальное количество микробных клеток В. anthracis, выявляемое в РИФ) 5 5,0x10s м.к./мл

2. Специфическая активность (выявляемые штаммы В. anthracis), M±m % 16 93,8±6,0 100,0

3. Специфичность (отрицательные результаты с близкородственными микроорганизмами), М±ш % 32 75,0±5,6 100,0

4. Выявляемые штаммы В. anthracis в пробах из объектов внешней среды и биологического материала, М±ш % 225 100,0 -

5. Отрицательные результаты с близкородственными микроорганизмами в пробах из объектов внешней среды и биологического материала М±ш % 225 100,0 -

6. Скорость учета результатов (с учетом подготовки всех материалов), в часах чистые культуры 20 20

объекты внешней среды, биологический материал 2,5-3 40

Примечание: (-) — не предусмотрено методом

В ходе анализа результатов, полученных при исследовании проб из объектов окружающей среды и биологического материала, установлена высокая диагностическая ценность препарата, который в разведении 1:64 выявлял В. аЫкгасгз в вегетативной форме в 100 % случаев.

В процессе работы при оценке качества сибиреязвенных вегетативных иммуноглобулинов на соответствие препарата требованиям проекта НД было выявлено, что иммуноглобулины, даже в разведении 1:16 (норма не менее 1:16), не вызывали специфического свечения близкородственных штаммов.

В ходе проведения наших исследований установлено, что рабочее разведение иммуноглобулинов составило 1:64. Причинами расхождения установленного показателя с паспортными данными явилось не однозначность подходов к методике обеззараживания мазков. Разработчики иммуноглобулинов приготовление мазков из исследуемого материала осуществляли с применением 96 % спирта без добавления 3 % перекиси водорода.

В процессе нашей работы обеззараживание мазков проводили в соответствии с требованиями Санитарных правил «Безопасность работы с микроорганизмами I и II групп патогенности (опасности)» (СП 1.3.1285-03), предусматривающие применение 96 % спирта и 3 % перекиси водорода. Для исключения негативного воздействия перекиси водорода при окраске мазков препаратом было предложено на этапах их приготовления увеличить время промывки очищенной водой до полного удаления перекиси водорода (в течение 5 мин). Полученные результаты послужили основанием для внесения дополнения в проект НД в методику по обеззараживанию мазков, приготовленных из чистых культур В. anthracis, объектов окружающей среды и биологического материала.

В результате проведенных исследований установлена высокая специфическая активность иммуноглобулинов сибиреязвенных, обеспечивающих специфическое свечение штаммов В. anthracis в вегетативной форме в мазках, приготовленных из штаммов сибиреязвенного микроба, из биологического материала и объектов внешней среды в 100 % проб. Чувствительность препарата по результатам всех исследований установлена в диапазоне от 5,0х105 до 1х10б м.к./мл.

При изучении специфичности в отношении близкородственных микроорганизмов установлено, что иммуноглобулины в 75,0±5,6 % случаев не обнаруживали штаммы других видов рода Bacillus в реакции иммунофлуоресценции. При этом использование иммуноглобулинов сибиреязвенных вегетативных в РИФ имело преимущество перед бактериологическим методом (тест на гемолиз) при исследовании проб из объектов окружающей среды и биологического материала по времени постановки и учету результатов - 2,5-3 ч против 40 ч, что особенно важно при оперативном решении вопроса о проведении противоэпидемических мероприятий в очагах сибирской язвы.

В Инструкцию по применению иммуноглобулинов сибиреязвенных вегетативных внесено дополнение: «Ввиду наличия генетического родства

сибиреязвенного микроба с другими представителями рода Bacillus, допускается лизис близкородственных штаммов не более, чем у 10 % от числа исследуемых». Учитывая, что выявление В. anthracis является сигнальным методом индикации и позволяет судить об ориентировочном обнаружении возбудителя, для подтверждения его принадлежности к возбудителю сибирской язвы, необходимо проводить комплексное исследование.

Таким образом, полученные результаты исследований свидетельствуют о высокой диагностической ценности иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных, что позволяет их использовать при исследовании чистых культур В. anthracis, биологического материала и объектов окружающей среды на этапе индикации в лабораторной диагностике сибирской язвы. Учитывая, что стандартизация лабораторной диагностики особо опасных инфекций требует использования в лабораториях территориального, регионального и федерального уровней зарегистрированных диагностических препаратов, несомненно, ценным является обоснование возможности применения иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных при проведении мониторинга за возбудителем сибирской язвы.

Определение диагностической ценности (специфическая активность, специфичность) иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных споровых адсорбированных

Способность возбудителя сибирской язвы образовывать в окружающей среде высокоустойчивые споры обуславливает не только его длительное сохранение в анабиотическом состоянии, но и возможность размножаться и накапливаться в почве, что представляет угрозу заражения сибирской язвой людей и животных (Б.Л.Черкасский, 2004). В связи с этим совершенствование лабораторной диагностики сибирской язвы, направленное на выявление споровой формы возбудителя с помощью стандартных препаратов, обеспечивающих получение достоверных результатов, является своевременной.

Изучаемые иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сибиреязвенные споровые адсорбированные представляют собой иммуноглобулиновую фракцию к водорастворимому антигену споровой формы В. anthracis, выделенную из гипериммунной кроличьей сыворотки, адсорбированную на основе магноиммуносорбентов водорастворимыми антигенами штаммов В. cereus. Препарат предназначен для обнаружения

споровой формы В. аЫкгас'и в реакции иммунофлуоресценции в мазках из чистых культур, объектах окружающей среды (почва, вода, корма, смывы) и биологического материала (мясо).

По внешнему виду и физико-химическим свойствам препарат соответствовал требованиям проекта нормативной документации. В результате проведенных испытаний установлена высокая диагностическая ценность иммуноглобулинов сибиреязвенных споровых по чувствительности РИФ и специфической активности. При просмотре 30 полей зрения в мазках наблюдали специфическое свечение с интенсивностью на 3-4 креста от 10 до 20 и более микробных клеток В. апМгаыз в концентрации 5,0-105 спор/мл.

При изучении специфической активности иммуноглобулинов сибиреязвенных споровых на 16 штаммах В. аткгасЫ в концентрации 1,0x108 спор/мл в разведении 1:64 были выявлены 15 штаммов 93,8±6,0 %, а в разведении 1:128 - 13 штаммов 81,2±9,8%. Это послужило основанием для установления истинного рабочего разведения иммуноглобулинов, которое составило 1:64.

Специфичность иммуноглобулинов изучали на 32 близкородственных штаммах. Показано, что в рабочем разведении 1:64 зарегистрировано свечение на 3 креста только с одним штаммом В. сегеш 688В. Полученные данные свидетельствуют о том, что препарат обладает высокой специфичностью 96,9±3,1 % (рис. 2).

Результаты изучения диагностической ценности иммуноглобулинов сибиреязвенных споровых в профильных учреждениях подтвердили их высокую диагностическую ценность. Установлено, что иммуноглобулины в разведении 1:64 выявляли споровую форму возбудителя сибирской язвы в пробах из объектов окружающей среды и биологического материала в 100 % случаев и специфически не окрашивали близкородственные микроорганизмы. При этом обнаружение штаммов В. аШкгаЫБ с помощью иммуноглобулинов в РИФ и бактериологическим методом были равноценны.

Воспроизводимость результатов с помощью испытываемых иммуноглобулинов изучали в реакции иммунофлуоресценции. Для этого мазки, приготовленные из штамма В. апМгасгз (положительные пробы) и из штамма В. сегеш (отрицательные пробы), окрашивали споровыми иммуноглобулинами. Совпадение результатов наблюдали в 100 % случаев (табл. 2).

Явное преимущество постановки РИФ с помощью флуоресцирующих споровых иммуноглобулинов перед методом сравнения (тест на гемолиз) было установлено по времени учета результатов. Продолжительность проведения

исследований с помощью иммуноглобулинов составила 20 ч при исследовании чистых культур и 2,5-3 ч - проб из объектов окружающей среды и биологического материала.

В. спи)1гас13 Близкородственные

микроорганизмы

Рисунок 2 - Результаты специфической активности и специфичности иммуноглобулинов сибиреязвенных споровых адсорбированных

С помощью теста на гемолиз результаты были получены через 20 ч при исследовании чистых культур и через 40 ч - при исследовании проб из объектов окружающей среды и биологического материала. Приведенные временные затраты в РИФ значительно ниже, чем при проведении исследований бактериологическим методом, что особенно важно при обнаружении споровой формы возбудителя сибирской язвы из объектов окружающей среды и биологического материала, а также при проведении мониторинга за возбудителем сибирской язвы.

Полученные результаты испытаний показали высокую диагностическую ценность иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных споровых адсорбированных, обеспечивающих специфическое свечение штаммов В. апЛгасгз в споровой форме в мазках из чистых культур, биологического материала и объектов окружающей среды. Учитывая трудоемкость и недостаточную стандартность бактериологического метода, использование РИФ имеет перед ним явные преимущества. Аналогично дополнениям, как и на иммуноглобулины сибиреязвенные вегетативные, были внесены изменения (рабочее разведение, обеззараживание мазков, допустимый лизис близкородственных микроорганизмов) в проект нормативной документации на иммуноглобулины сибиреязвенные споровые.

Таким образом, в результате проведенных испытаний установлена высокая специфическая активность и специфичность иммуноглобулинов сибиреязвенных споровых и выявлено преимущество их использования в РИФ перед бактериологическим методом по времени учета результатов.

Таблица 2 - Результаты исследований иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных споровых адсорбированных

№ п/п Показатели Количество проб Результаты

иммуноглобулины флуоресцирующие в разведении 1:64 тест на гемолиз

1 Чувствительность (минимальное количество спор В. anthracis, выявляемое в РИФ), 5 5,0х105 спор/мл

2 Специфическая активность (процент правильно идентифицированных штаммов В. anthracis), M±m % 16 93,8±6,0 100,0

3 Специфичность (процент отрицательных результатов с близкородственными микроорганизмами), % 32 96,9±3,1 100,0

4 Выявляемые штаммы В. anthracis в пробах объектов окружающей среды, М±ш % 225 100,0 -

5 Отрицательные результаты с близкородственными микроорганизмами в пробах объектов окружающей среды, М±ш % 225 100,0 -

6 Скорость учета результатов (с учетом подготовки всех материалов), часах чистые культуры 20 20

объекты внешней среды, биологический материал 2,5-3 40

Примечание: (—) — не предусмотрено методом

Учитывая вышеизложенное можно сделать заключение, что испытываемый препарат может использоваться для индикации В. аШкгааъ при исследовании проб из объектов окружающей среды и биологического материала в диагностике сибирской язвы лабораторий трехуровневой структуры (территориальная, региональная, федеральная).

Определение диагностической ценности сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26

Известно, что существующие сибиреязвенные бактериофаги различаются по широте диапазона литического спектра в отношении штаммов В аМИтая, а также по специфичности их действия. Феномены чувствительности и фагорезистентности сибиреязвенного микроба представляют интерес не только с точки зрения надежности теста фаголизабельности при идентификации сибиреязвенных культур, но и как основа метода выделения штаммов В. аМкгас'ш с разной чувствительностью к действию бактериофагов (Головинская Т.М. и др., 2010, Рязанова А.Г. и др., 2010). Диагностическая ценность сибиреязвенного бактериофага определяется, главным образом, диапазоном литического спектра, что позволяет оценить возможность его применения для идентификации возбудителя сибирской язвы. С этой целью проведены сравнительные исследования по изучению спектра литической активности и специфического действия сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26 с сибиреязвенным бактериофагом РаЬ ВНИИВВиМ.

Сибиреязвенный бактериофаг Гамма А-26 представляет собой стерильный фильтрат фаголизата бульонной культуры сибиреязвенного штамма В. атИгаск 228/8, содержащий взвесь частиц фага Гамма А-26, обладающих лизирующим действием в отношении типичных и атипичных штаммов В. апЛгас1&- в вегетативной форме. Препаратом сравнения служил бактериофаг сибиреязвенный РаЬ ВНИИВВиМ (ветеринарный), который представляет собой фаголизат сибиреязвенного штамма Шуя-15 в полусинтетической пептонно-дрожжевой жидкой среде.

Материалами для исследования служили музейные и выделенные из различных природных очагов штаммы В. аЫкгас'я, а также штаммы близкородственных микроорганизмов. В результате проведенных сравнительных испытаний выявлено, что бактериофаг Гамма А-26 по диагностической ценности превосходил бактериофаг РаЬ ВНИИВВиМ. С помощью бактериофага Гамма А-26 лизировалось 46 штаммов В. аЫкгаш из 47 исследованных, что составило 97,9±2,1 %. Препарат сравнения лизировал 89,4±4,5 % штаммов В. апЛгаси, устойчивы к бактериофагу были 5 штаммов (р=0,48). Отмечено, что размер литического пятна бактериофага Гамма А-26 со штаммами В. аЫИгасЬ был визуально больше, чем у бактериофага РаЬ ВНИИВВиМ, при этом отмечался более четкий лизис пятна.

Для изучения специфического действия бактериофагов в отношении близкородственных микроорганизмов было изучено 72 штамма других видов рода Bacillus. Выявлено, что из общего числа исследуемых штаммов 69 были резистентны к сибиреязвенному бактериофагу Гамма А-26, а 2 штамма лизировались исследуемым препаратом. Бактериофагом Fah ВНИИВВиМ лизировался только один из 72 штаммов близкородственных микроорганизмов. Диапазон литической активности бактериофага Гамма А-26 составил 95,8±2,36 %, препарата сравнения - 98,6±1,38% (р=0,35). Результаты исследований бактериофагов отражены на (рис. 3, табл. 3).

100 90 80 70 60 SO 40 30 20 10

N-..] ;

. . ... ..

: .: ■ ... ,

-eeili

ш%

идентифицированных штаммов В. ailthracis

* °/о отрицательных результатов с близкородственными микроорганизмами

бяктермофагГамыл А-26 бпьгГериофпг Fall ВНИИВВиМ

Рисунок 3 - Результаты определения литической активности и специфического действия бактериофагов Гамма А-26 и Fah ВНИИВВиМ

Следует отметить, что фаголизабельность не является строго специфичным видовым признаком, так как возбудитель сибирской язвы входит в группу близкородственных микроорганизмов рода Bacillus и имеет ряд общих свойств с другими ее представителями. В связи с этим выделяемые штаммы, не лизирующиеся сибиреязвенным бактериофагом, но по некоторым признакам соответствующие сибиреязвенному микробу, требуют дополнительных исследований в соответствии с методическими указаниями «Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы» (МУК 4.2.2413-08).

У всех выделенных культур, подозрительных на В. anthracis, необходимо определять их видовую принадлежность с применением дополнительных методов (обнаружение капсулы in vitro, тест на гемолиз, тест на чувствительность к пенициллину, подвижность и др.), что позволит

оптимизировать и значительно улучшить диагностику сибирской язвы на этапе идентификации возбудителя.

Проведенные эксперименты подтверждают, что методика изучения чувствительности штаммов В. аЫкгас'м к лизирующему действию сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26 является технически простой, информативной и легко воспроизводимой.

Полученные результаты явились основанием для внесения изменений в НД: включена предложенная нами методика постановки пробы при определении спектра литической активности бактериофага. С этой целью, для получения более четкого литического пятна рекомендовано растирать нанесенную каплю исследуемой культуру до диаметра 1,5 см на агаровой пластинке в чашке Петри.

Таблица 3 — Результаты определения диагностической ценности бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 и бактериофага БаЬ ВНИИВВиМ

№ п/п Показатели Количество штаммов Результаты

бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 сибиреязвенный бактериофаг Fah ВНИИВВиМ Р

1 Процент идентифицированных штаммов В. anthracis к числу исследованных, М±ш % 47 97,9±2,1 89,4 ±4,5 0,48

2 Процент отрицательных результатов при исследовании близкородственных микроорганизмов, М±ш % 72 95,8 ±2,36 98,6 ±1,38 0,35

3 Воспроизводимость - процент совпадений результатов исследования положительных и отрицательных проб, М±т % 20 100,0 100,0

4 Время учета результатов, процент правильности идентификации штаммов, (%) 119 (5±1)ч (предварительный учет), 100,0 5+1) ч предварительный учет), 100,0

(18±2) ч (окончательный /чет), 100,0 (18±2) ч (окончательный учет), 100,0

Полученные результаты явились основанием для внесения дополнений в инструкцию по применению бактериофага Гамма А-26 в отношении лизиса близкородственных штаммов — не более 5 % от числа исследуемых. Для

идентификации возбудителя сибирской язвы необходимо использовать применение сибиреязвенного бактериофага в комплексе с другими методами.

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о широком диапазоне литического спектра бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 и подтверждают возможность его использования при идентификации штаммов В. аШкгас1.ч в лабораториях территориального, регионального и федерального уровней.

ВЫВОДЫ

1. Установлена высокая специфическая активность иммуноглобулинов сибиреязвенных вегетативных адсорбированных. Показано, что иммуноглобулины в разведении 1:64 обеспечивают специфическое свечение 93,8±6,0 % штаммов В. аШНгайБ в вегетативной форме. При исследовании проб из биологического материала (мясо животного) и объектов окружающей среды (смывы, вода, почва, корма), контаминированных В. аМкгаси, сибиреязвенный микроб с помощью исследуемого препарата выявляется в 100 % случаев.

2. Проведенными исследованиями показано, что иммуноглобулины сибиреязвенные споровые адсорбированные в разведении 1:64 обеспечивают специфическое свечение В. аЫНгася споровой формы в 93,8±6,0 % мазков из чистых культур и в 100% проб из биологического материала и объектов окружающей среды, при этом не вызывают специфического свечения со штаммами близкородственных микроорганизмов.

3. Установлено явное преимущество применения реакции иммунофлуоресценции с использованием испытываемых иммуноглобулинов в сравнении с бактериологическим методом (тест на гемолиз) в отношении временных затрат при индикации возбудителя сибирской язвы.

При исследовании проб объектов окружающей среды и биологического материала в РИФ с помощью иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных и споровых адсорбированных учет результатов проводят через 2,5-3 ч, бактериологическим методом (тест на гемолиз) — через 40 ч.

4. Диагностический препарат бактериофаг сибиреязвенный Гамма А-26 обладает широким диапазоном действия к исследуемым штаммам В. апЛгасгя и высокой специфичностью в отношении близкородственных микроорганизмов. Установлено, что сибиреязвенный бактериофаг Гамма А-26 лизировал 97,9±2,1 % штаммов В. ап1кгасЬ из 47 исследуемых и был не активным в отношении 69 штаммов 95,8±2,36 % близкородственных

микроорганизмов из 72 исследуемых. При учете результатов установлено, что бактериофаг сибиреязвенный Гамма А-26 превосходит препарат сравнения по четкости лизиса.

5. Проведенными исследованиями обоснована возможность использования сибиреязвенных препаратов иммуноглобулинов флуоресцирующих (вегетативные и споровые) адсорбированных и бактериофага Гамма А-26 для индикации и идентификации В. anthracis в лабораторной диагностике сибирской язвы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Саяпина Л.В., Лобач Р.Н., Абдрашитова A.C., Комратов A.B., Малахаева А.Н., Лешова О.Ю., Валова Т.В., Храмов М.В., Гефан Н.Г. Диагностическая эффективность иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных адсорбированных по данным медицинских испытаний // Журнал Проблемы особо опасных инфекций,- 2012.- 4(114).- С. 9296.

2. Лобач Р.Н., Саяпина Л.В., Абдрашитова A.C., Лешова О.Ю., Валова Т.В., Храмов М.В., Гефан Н.Г., Бондарев В.П. К вопросу об индикации возбудителя сибирской язвы иммуноглобулинами флуоресцирующими сибиреязвенными споровыми адсорбированными // Журнал Жизнь без опасностей. Здоровье. Профилактика. Долголетие.- 2013.- 2(VII).- С. 46-51.

3. Саяпина Л.В., Лобач Р.Н., Абдрашитова A.C., Никитюк Н.Ф. Совершенствование лабораторной диагностики сибирской язвы // Военно-медицинский журнал,- 2013.- 8(334).- С. 58-59.

4. Лобач Р.Н., Абдрашитова A.C., Саяпина Л.В. Испытания сибиреязвенных флуоресцирующих иммуноглобулинов, предназначенных для выявления возбудителя сибирской язвы // Журнал Биопрепараты,- 2013.-№4(48).- С. 29-33.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ИФА - иммуноферментный анализ

МФА - метод флуоресцирующих антител ПЦР - полимеразная цепная реакция РИГА - реакция непрямой гемагглютинации РИФ - реакция иммунофлуоресценции

Лобач Роман Николаевич (Россия) «Диагностическая ценность сибиреязвенных иммуноглобулинов и бактериофага Гамма А-26 при выявлении и идентификации возбудителя сибирской язвы»

Диссертационная работа посвящена изучению диагностической ценности (специфическая активность, специфичность, воспроизводимость) сибиреязвенных иммуноглобулинов флуоресцирующих вегетативных и споровых адсорбированных, и бактериофага Гамма А-26. Актуальность работы обусловлена отсутствием зарегистрированных диагностических препаратов. Сложившиеся условия требуют проведения лабораторной диагностики с целью индикации возбудителя сибирской язвы зарегистрированными диагностическими препаратами. Проведенными исследованиями обоснована возможность использования сибиреязвенных диагностических препаратов для индикации и идентификации Bacillus anthracis в лабораторной диагностике сибирской язвы.

Lobach Roman Nikolayevich (Russia) «Diagnostic value of anthrax immunoglobulin and bacteriophage Gamma A-26 in the detection and identification anthrax»

The dissertation research is devoted to the study of diagnostic value (specific activity, specificity, reproducibility) of anthrax immunoglobulin fluorescent vegetative and spore adsorbed, and bacteriophage Gamma A-26 of indication and identification of anthrax. Relevance of the work due to lack of diagnostic products registered. Current conditions require laboratory diagnosis to indicate the anthrax registered diagnostic preparations. Conducted research proved the possibility of using anthrax diagnostic products for indication and identification of Bacillus anthracis in the laboratory diagnosis of anthrax.

Заказ № 21-P/03/2014 Подписано в печать 06.03.14 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,0

000 "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76 '\\-Jyj www.cfr.ru ; e-mail:info@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Лобач, Роман Николаевич, Москва

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации

04201457283 На птвахлзукописи

ЛОБАЧ РОМАН НИКОЛАЕВИЧ

ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ СИБИРЕЯЗВЕННЫХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ И БАКТЕРИОФАГА ГАММА А-26 ПРИ ВЫЯВЛЕНИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ

ЯЗВЫ

03.02.03 — микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель — доктор медицинских наук Саяпина Л.В.

Москва-2014

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВНИИВВиМ РАСН - Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук

ГНЦ ПМБ - Государственный научный центр прикладной микробиологии и бактериологии, п. Оболенск

ГосКПБ «М» - Государственная коллекция патогенных бактерий ФКУЗ

РосНИПЧИ «Микроб»

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИФА - иммуноферментный анализ

ИИХЭ - иммунохроматографический индикаторный элемент КРС - крупный рогатый скот ЛФ - летальный фактор

МИБП - медицинские иммунобиологические препараты

МКА - моноклональные антитела

MPC - мелкий рогатый скот

МУК - методические указания

МФА - метод флуоресцирующих антител

МЧС РФ - Министерство Российской Федерации по делам гражданской обороны, чрезвычайным ситуациям и ликвидации последствий стихийных бедствий

ООИ - особо опасные инфекции

ОСО - отраслевой стандартный образец

ОФ - отечный фактор

ПА - протективный антиген

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РА - реакция агглютинации

РНГА - реакция непрямой гемагглютинации

РИФ - реакция иммунофлуоресценции

ТИФА - твердофазный иммуноферментный анализ

ФКУЗ Иркутский НИПЧИ - научно-исследовательский противочумный

институт

ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора - Федеральное казенное учреждение здравоохранения Российский научно-исследовательский противочумный институт «МИКРОБ»

ФКУЗ Став НИПЧИ - Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт ФСБ - фосфатно-солевой буфер

МЬУА - многолокусный анализ вариабельных областей генома микроорганизма

«294 ЦСООР» - ФГКУ «294 Центр спасательных операций особого риска» МЧС РФ

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 2

ВВЕДЕНИЕ 6

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 15

1.1. Эпидемиологическая ситуация по сибирской язве в мире и на территории Российской Федерации 15

1.2. Современное представление о патогенности возбудителя сибирской язвы... 26

1.3. Современные диагностические препараты, используемые для индикации и идентификации возбудителя сибирской язвы.... 31 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 44 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 44 Глава 3. ИЗУЧЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ И СПЕЦИФИЧНОСТИ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ СИБИРЕЯЗВЕННЫХ ВЕГЕТАТИВНЫХ АДСОРБИРОВАННЫХ 5 5

3.1. Оценка специфической активности иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных адсорбированных 56

3.2. Определение специфичности иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных 63 Глава 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ (СПЕЦИФИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ, СПЕЦИФИЧНОСТЬ) ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ СИБИРЕЯЗВЕННЫХ СПОРОВЫХ АДСОРБИРОВАННЫХ 72

4.1. Определение специфической активности иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных споровых 73

4.2. Изучение специфичности иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных споровых адсорбированных сухих 80 Глава 5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ СИБИРЕЯЗВЕННОГО БАКТЕРИОФАГА ГАММА А-26 88

5.1. Изучение диапазона литической активности сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26 89

5.2. Оценка специфичности сибиреязвенного бактериофага

Гамма А-26 95

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 103

ВЫВОДЫ 110

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 112

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Сибирская язва относится к особо опасным инфекциям (ООИ) со своеобразным инфекционным циклом, который предполагает обязательный внеорганизменный этап споруляции возбудителя. Согласно сведениям Dixon Т. (1999 г.), на протяжении многих веков, болезнь регистрировалась не менее, чем в 200 странах мира, а заболеваемость людей оценивалась от 20 до 100 тысяч случаев в год [126].

По данным ВОЗ, ежегодно в мире от сибирской язвы гибнут около 1 млн. животных и заболевают около 1 тыс людей, в том числе с нередким летальным исходом. Заболеваемость животных и людей регистрируется на уровне 900-1000 случаев в год не только в слаборазвитых странах афроазиатского региона, но и на территориях Америки и Европы, в том числе в США, Канаде, Франции и Финляндии, а также - в Австралии [4, 118, 120, 131]. В России за период с 1900 по 2012 год зарегистрировано более 35 тыс. стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктов и более 70 тыс. вспышек инфекции [52, 88].

Заболевание сибирской язвой, вызываемое возбудителем Bacillus anthracis, характеризуется острым началом и тяжелым течением. При несвоевременной диагностике и отсутствии этиотропной терапии летальность при сибиреязвенной инфекции может достигать 90 % [39, 90]. За последние 5 лет заболеваемость сибирской язвой в России несколько стабилизировалась, однако все еще остается на высоком уровне [52, 91].

По данным МЧС в стране сохраняется негативная динамика роста количества чрезвычайных ситуаций различного характера (землетрясения, цунами, извержения вулканов, засуха, наводнение и т.п.) [60, 94, 95]. Высокой остается угроза завоза животных, сырья и продуктов животноводства, контаминированных спорами возбудителя сибирской язвы на территорию Российской Федерации из стран ближнего зарубежья [78, 91,

109]. Перечисленные факторы способствует осложнению эпидемической ситуации по сибирской язве [12, 36, 54].

В связи с вышеизложенным, совершенствование лабораторной диагностики сибирской язвы на этапах индикации и идентификации В. anthracis, является актуальной [37, 58, 113]. С целью своевременного выявления возбудителя сибирской язвы в различных объектах окружающей среды и биологическом материале возникает необходимость в использовании стандартных диагностических препаратов [83].

Несмотря на разработку новых сибиреязвенных препаратов, эта проблема до сих пор не решена [28, 79]. Недостаточное обеспечение лабораторных служб зарегистрированными препаратами ставит эту проблему для практического здравоохранения в число приоритетных. В России до 2010 г. для индикации возбудителя сибирской язвы применялись только 2 зарегистрированных в установленном порядке препарата: тест-система ГенСИБ и набор реагентов «АмплиСенс®5. anthracis-FKT».

В соответствии с требованиями МУК 4.2.2413-08 «Лабораторная диагностика для обнаружения сибирской язвы» основными методами индикации возбудителя сибирской язвы, являются экспресс-методы (МФА, ПЦР, ИФА, РИГА). При этом лабораторными критериями установления диагноза сибирской язвы являются положительные результаты в МФА, ПЦР, иммуносерологических реакциях, с обязательным выделением и идентификацией культуры сибиреязвенного микроба бактериологическим методом [30, 67, 79, 150].

Из современных методов серологической диагностики сибирской язвы наиболее доступным, быстрым и информативным является метод флуоресцирующих антител, обеспечивающий обнаружение возбудителя сибирской язвы на ранних этапах диагностики [10]. Положительные результаты, полученные в РИФ методом флуоресцирующих антител, позволяют сделать предварительный вывод о наличии возбудителя

сибирской язвы или его антигенов в исследуемом биологическом материале или объектах окружающей среды и своевременно начать проведение противоэпидемических, профилактических и терапевтических мероприятий.

Одним из важных тестов, позволяющих идентифицировать штаммы В. аШкгасгя, является лизабельность бактериофагом. Определение лизабельности выделенных культур специфическим бактериофагом многие исследователи считают одним из наиболее надежных, быстрых и простых методов идентификации штаммов В. аШкгасгв [1,21, 32]. В связи с этим тест с сибиреязвенным бактериофагом является одним из опорных, по которым сибиреязвенный микроб можно отличить от близкородственных бацилл. Особую ценность этот метод приобретает при идентификации атипичных по капсулообразованию, вирулентности и биохимическим свойствам штаммов сибиреязвенного микроба [26, 27].

Специалистами Ставропольского научно-исследовательского противочумного института (Ставропольский НИПЧИ) предложены иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сибиреязвенные вегетативные и споровые адсорбированные, а также сибиреязвенный бактериофаг Гамма А-26, своевременная регистрация которых в установленном порядке в Российской Федерации позволит улучшить лабораторную диагностику на этапах индикации и идентификации возбудителя сибирской язвы.

В связи с этим возникла необходимость проведения исследований по изучению качества и диагностической ценности иммуноглобулинов сибиреязвенных вегетативных и споровых адсорбированных, и бактериофага Гамма А-26, с использованием разработанных Программ, включающих выбор препаратов или метода сравнения, подбор штаммов В. апОпгаай с различным плазмидным профилем и близкородственных микроорганизмов, проб объектов окружающей среды и биологического материала, контаминированных В. апЖгаЫя и близкородственными микроорганизмами.

Цель исследования

Изучить диагностическую ценность сибиреязвенных

иммуноглобулинов флуоресцирующих (вегетативные и споровые) адсорбированных и бактериофага Гамма А-26 на этапах индикации и идентификации возбудителя сибирской язвы.

Задачи исследования

1. Оценить специфическую активность и специфичность иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных адсорбированных в РИФ по сравнению с бактериологическим методом (тест на гемолиз).

2. Охарактеризовать диагностическую ценность (специфическая активность и специфичность) иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных споровых адсорбированных на чистых культурах, в пробах из объектов окружающей среды и биологического материала.

3. В сравнительных испытаниях определить широту диапазона литической активности и специфичности бактериофагов диагностических сибиреязвенных Гамма А-26 и ГаИ ВНИИВВиМ.

4. Обосновать возможность использования сибиреязвенных препаратов иммуноглобулинов флуоресцирующих (вегетативные и споровые) адсорбированных и бактериофага Гамма А-26 для индикации и идентификации возбудителя сибирской язвы в лабораторной диагностике сибирской язвы.

Научная новизна

Впервые установлена высокая специфическая активность иммуноглобулинов сибиреязвенных вегетативных адсорбированных при исследовании мазков из чистых культур, биологического материала (мясо) и проб из объектов окружающей среды, контаминированных В. агйкгаыв. Показано, что иммуноглобулины в разведении 1:64 обеспечивают

специфическое свечение 93,8±6,0 % из 16 исследуемых штаммов В. аЫкгасгз в вегетативной форме.

Впервые на представительном материале (объекты окружающей среды, биологический материал, чистые культуры) установлена диагностическая ценность иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных споровых адсорбированных, обеспечивающих в разведении 1:64 специфическое свечение сибиреязвенного микроба в споровой форме в мазках чистых культур, из объектов окружающей среды (смывы, корма, вода, почва) и биологического материала и не вызывающих специфического свечения со штаммами близкородственных микроорганизмов.

Доказано преимущество проведения РИФ с помощью иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных и споровых адсорбированных перед бактериологическим методом (тест на гемолиз) при исследовании проб объектов окружающей среды и биологического материала по времени учета результатов - 2,5-3 ч против 40 ч соответственно.

Новыми являются данные сравнительных исследований бактериофагов сибиреязвенных Гамма А-26 и БаЬ ВНИИВВиМ (ветеринарного). Испытываемый бактериофаг Гамма А-26 обладает широким диапазоном действия к исследуемым штаммам В. аЫкгаых и высокой специфичностью в отношении близкородственных микроорганизмов. Установлено, что сибиреязвенный бактериофаг Гамма А-26 лизировал 97,9±2,1 % типичных и атипичных штаммов В. аЫкгаыз из 47 исследуемых и не лизировал 95,8±2,36 % из 72 штаммов близкородственных микроорганизмов.

Обоснована целесообразность применения в практическом здравоохранении изучаемых иммуноглобулинов сибиреязвенных вегетативных и споровых адсорбированных, а также бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26, предназначенных для индикации и идентификации возбудителя сибирской язвы.

Практическая значимость работы.

В результате работы внедрены в практику следующие препараты:

- иммуноглобулины флуоресцирующие сибиреязвенные вегетативные адсорбированные сухие (Регистрационное удостоверение № ФСР 2011/11338);

- иммуноглобулины флуоресцирующие сибиреязвенные споровые адсорбированные сухие (Регистрационное удостоверение № ФСР 2011/11339);

- бактериофаг сибиреязвенный Гамма А-26 (Регистрационное удостоверение № ФСР 2011/10415).

Внесены изменения в нормативную документацию на:

- иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сибиреязвенные вегетативные адсорбированные сухие «Технические условия 9389-003-01897080-2010» и «Инструкция по применению» (Акт внедрения рекомендаций, утвержденный директором ФКУЗ Ставропольского НИПЧИ);

- иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сибиреязвенные споровые адсорбированные сухие «Технические условия 9389-005-01897080-2010» и «Инструкция по применению» (Акт внедрения рекомендаций, утвержденный директором ФКУЗ Ставропольского НИПЧИ);

- бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий «Технические условия 9389-013-01897080-2009» и «Инструкция по применению» (Акт внедрения рекомендаций, утвержденный директором ФКУЗ Ставропольского НИПЧИ).

Материалы диссертации используются при чтении лекций на курсах повышения квалификации специалистов по особо опасным инфекциям.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Испытываемые иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сибиреязвенные вегетативные адсорбированные в разведении 1:64 обеспечивают специфическое свечение 93,8±6,0 % штаммов

В. аЫЪгаст в вегетативной форме, что позволяет их использовать для индикации при исследовании чистых культур, объектов окружающей среды и биологического материала в лабораторной диагностике сибирской язвы.

2. Диагностический препарат иммуноглобулины флуоресцирующие сибиреязвенные споровые адсорбированные в разведении 1:64 выявляет 93,8±6,0 % исследуемых штаммов В. аШкгаЫя и в 96,9±3,1 % случаев не реагирует со штаммами близкородственных микроорганизмов; в пробах из объектов внешней среды и биологического материала сибиреязвенный микроб обнаруживается в 100 % случаев.

3. Использование иммуноглобулинов сибиреязвенных вегетативных и споровых адсорбированных в РИФ имеет явное преимущество перед бактериологическим методом (тест на гемолиз) при исследовании проб объектов окружающей среды и биологического материала по времени постановки и учету результатов — 2,5-3 ч против 40 ч.

4. Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 обладает широким диапазоном литической активности и специфичностью, что подтверждено наличием лизиса 97,9±2,1 % штаммов В. аШкгас1з из 47 исследуемых и ее отсутствием в 95,8±2,36 % случаев при исследовании 72 штаммов близкородственных микроорганизмов. При учете результатов установлено, что бактериофаг сибиреязвенный Гамма А-26 превосходит препарат сравнения по четкости лизиса исследуемых штаммов В. апЖгаЫз.

Работа выполнена на базах лаборатории препаратов против чумы и др. особо опасных инфекций ГИСК им Л.А. Тарасевича, Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб», Иркутского НИПЧИ, Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (п. Оболенск), бактериологической лаборатории ФГКУ 294 ЦСООР МЧС РФ.

Апробация работы

Материалы диссертации нашли отражение на Всероссийских и межгосударственных научно-практических конференциях: научно-практической конференции «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов, 2009); XI Межгосударственной научно-практической конференции «Современные технологии в совершенствовании мер предупреждения и ответных действий на чрезвычайные ситуации в области общественного здравоохранения санитарно-эпидемиологического характера» (Саратов, 2012); на 2 научно-практической конференции молодых ученых «Научные подходы к повышению качества экспертизы лекарственных средств: реалии и перспективы» в ФГБУ «НЦЭСМП Минздрава России» (Москва, 2013 г.).

Материалы диссертации вошли в отчеты по законченным техническим и ме�