Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Совершенствование биотехнологии производства сибиреязвенного диагностического бактериофага

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Солодовников, Борис Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Биологические свойства возбудителя сибирской язвы и проблемы, связанные с его идентификацией.

1.2. Сибиреязвенный бактериофаг: состояние изученности, применение в лабораторной практике.

1.3. Биотехнология производства сибиреязвенных диагностических бактериофагов.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1» Материалы.

2.1.1. Штаммы микроорганизмов.

2.1.2. Реактивы и питательные среды.

2.2. Методы.

2.2.1. Тесты для идентификации штаммов Bacillus anthracis.

2.2.1.1. Тест с сибиреязвенным бактериофагом.

2.2.1.2. Капсулообразование in vitro у штаммов В. anthracis.

2.2.1.3. Тест "жемчужное ожерелье".

2.2.1.4. Гемолиз эритроцитов барана.

2.2.1.5. Тест на лецитиназу.

2.2.1.6. Тест на щелочную фосфатазу.

2.2.1.7. Определение протеолитической активности.

2.2.1.8. Определение токсинообразования Bacillus anthracis in vitro.

2.2.2. Определение дополнительных питательных потребностей штаммов сибиреязвенного микроба.

2.2.3. Определение плазмидного состава штаммов В.anthracis.

2.2.4. Определения концентрации живых спор сибиреязвенного микроба.

2.2.5. Определение вирулентности почвенных штаммов B.anthracis и их вариантов.

2.2.6. Определение концентрации фаговых частиц.

2.2.7. Определение потери в массе при высушивании препарата.

2.2.8. Методы статистической обработки материала.

3. ВЫБОР ОБЪЕКТОВ БИОТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА СИБИРЕЯЗВЕННОГО ДИАГНОСТИЧЕСКОГО БАКТЕРИОФАГА

3.1. Подбор производственных штаммов бактериофага и сибиреязвенного микроба -«кормилки».

3.2. Оценка диапазона изменчивости природных штаммов возбудителя сибирской язвы.

3.3. Подбор индикаторных штаммов для определения концентрации фаговых частиц в препарате и контроля специфичности литического действия бактериофага Гамма А-26.

4. РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА ДИАГНОСТИ -ЧЕСКОГО СИБИРЕЯЗВЕННОГО БАКТЕРИОФАГА ГАММА А-26 НА ОБОГАЩЕННОЙ И СИНТЕТИЧЕСКОЙ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ.

4.1. Разработка состава жидкой обогащенной питательной среды и определение оптимальных условий культивирования на ней сибиреязвенного бактериофага.

4.2. Разработка состава жидкой синтетической питательной среды и определение оптимальных условий культивирования на ней сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26.

4.3. Оптимизация метода определения концентрации бактериофага

5. СТАБИЛИЗАЦИЯ ЖИДКОГО ДИАГНОСТИЧЕСКОГО СИБИРЕЯЗВЕННОГО БАКТЕРИОФАГА ГАММА А-26 МЕТОДОМ ЛИОФИЛЬ НОГО ВЫСУШИВАНИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА СВОЙСТВ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО - ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ СЕРИЙ ПРЕПАРАТА.

5.1. Отработка параметров лиофилизации сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26, полученного на обогащенной и синтетической питательных средах.

5.2. Разработка ускоренных режимов лиофилизации сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26, полученного на синтетической питательной среде.

5.3. Испытание литических свойств экспериментально - производственных серий диагностического сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Совершенствование биотехнологии производства сибиреязвенного диагностического бактериофага"

Актуальность проблемы. Сибиреязвенный микроб является возбудителем особо опасного инфекционного заболевания. Специфическая особенность возбудителя сибирской язвы (чрезвычайная устойчивость спор) может способствовать внезапной активизации инфекции даже в экономически развитых странах, где животноводство исторически является одной из ведущих отраслей хозяйства. По данным ВОЗ, сибирская язва продолжает регистрироваться среди людей и животных в 158 странах мира. Заболеваемость сибирской язвой в мире составляет от 20 до 100 тыс. случаев в год (Бургасов, Рожков, 1984; Черкасский, 1997; Онищенко, Васильев, Литусов, с соавт. 1999; Бакулов, Гаврилов, Селиве-стров, 2001).

В 1992-1996 гг. заболеваемость людей сибирской язвой регистрировалась на 13 территориях Российской Федерации. Высокая заболеваемость в эти годы была обусловлена вспышками в Карачаево-Черкесской (Агапитов с соавт., 1994; Петрюк с соавт., 1997) и Кабардино-Балкарской Республиках (Буравцева, Яро-щук, Ерёменко с соавт., 1994). Групповые заболевания отмечались также в Астраханской, Белгородской, Воронежской, Тамбовской областях, в Дагестане и Чечне.

В России количество известных стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктов с почвенными очагами этой инфекции превысило 10000 (Черкасский, 1998), причем большинство из них находится на юге России (Хотъко, 1994; Киреев, Прометной, Ковалевский, 1996; Ярощук, Еременко, Банных с соавт.,1996; Агапов с соавт., 1997; Васильев, Садыков с соавт., 1997; Петров, Забудская, Кохов, 1997; Петров» Постовой, с соавт., 1997; Петрюк, Проскурина, с соавт., 1997). В одном только Ставропольском крае их насчитывается 1029 (Буравцева с соавт., 2001)

Прогноз по указанной инфекции в России на ближайшие годы в условиях снижения социально-экономических, санитарно-гигиенических условий жизни, медицинского и ветеринарного обеспечения, при наличии почвенных очагов практически на каждой административной территории, остается крайне неблагоприятным (Монисов, Федоров, с соавт.,1997).

Заболеваемость сибирской язвой последних лет в развитых странах представлена спорадическими случаями среди людей в результате инфицирования при контакте с импортным сырьем или продукцией животноводства, В связи с расширением импорта из неблагополучных по данному заболеванию стран, число подобных случаев может увеличиваться.

Возможность применения спор возбудителя сибирской язвы в качестве биологического оружия массового поражения существует давно (Беляков, Жук, 1988; Смирнов с соавт.,1988). Интерес к возбудителю сибирской язвы, как опасному биологическому агенту, не ослабевает и в настоящее время (Meselson М. et al., 1994). Террористические акты, совершенные в 2001 г. в США с прйме-нением нетрадиционных средств доставки (через почтовую сеть) этого опасного возбудителя, заставили реально взглянуть на возможные глобальные масштабы эпидемического процесса.

В сложившейся обстановке наличие и производство диагностических препаратов, разработка высокоспецифичных тест-систем, экспресс-методов идентификации возбудителя сибирской язвы является актуальной задачей.

В настоящее время для индикации разработаны иммунологические тест-системы и диагностические иммуноглобулины к разным антигенам, наборы для исследования методом полимеразной цепной реакции (ПНР) и праймеры к последовательностям некоторых генов возбудителя сибирской язвы (Жарникова с соавт., 1994; Тюменцева с соавт., 1994, 1995; Куличенко с соавт., 1996; Куты-рев с соавт., 2000; Burans et al., 1996; Ramisse et al 1996; Lee et al. 1998, 1999; Levi et al. 1998; Long et O'Brien, 1998; Patra et al., 1998; Beyer et al. 1999). Предложены методы, основанные на использовании биосенсоров (Long, ОЪпеп, 1998) и ДНК-аптамеров (Bruno, Kiel, 1999), лазерной десорбционной массспектрометрии интактных микроорганизмов (Bright et al., 1998; Mark et al., 1999), технологии микрочипов (Bavykin et al, 1999), проточной цитометрии (Stopa, 2000).

Угроза использования спор В. anthracis в качестве оружия массового поражения и средства биотерроризма поставила перед исследователями задачу разработки портативных устройств для быстрого обнаружения и мониторинга во внешней среде этого возбудителя. P. Belgrader et al. (1999) предложили способ индикации, состоящий в использовании миниатюрного ультразвукового дезинтегратора со специальным картриджем для лизиса, разрушающего споры в течение 30 сек, с последующим быстрым анализом в реальном времени на ПЦР-микрочипе, который позволял получить результаты менее чем за 15 мин.

A.Castro et R.Okinaka (2000) из Лос-Аламосской Национальной Лаборатории в США сообщили о весьма быстром и сверхчувствительном методе для детекции и количественного определения специфических последовательностей ДНК бактериального происхождения в растворе, который основан на обнаружении одной двухцветной флуоресцирующей молекулы.

Такое количество тест-систем говорит о недостаточной их надежности, и продолжающемся поиске наиболее эффективных и высокоспецифичных.

Перспективным является использование сочетанных методов. Например, иммунной магнитной сепарации с ПЦР (Ефременко, Еременко, Абгарян с со-авт., 1998; Афанасьев, Тюменцева, Ефременко с соавт., 2000; Абгарян, 2001; Ефременко, Тюменцева, Жилченко, 2001; Enroth, Engstrand, 1995; Docherty et al, 1996; Li et al., 1996; Roberts, Hirst, 1997; Taylor et al., 1997; Jothikumar et al., 1998). При таком подходе в значительной степени удается преодолеть недостатки каждого из методов.

Несмотря на очевидный прогресс в развитии новых методов лабораторной диагностики, использование традиционных методов для идентификации возбудителей ООН (в частности сибирской язвы) не утратило своего значения и в настоящее время. Сведения о применении сибиреязвенного бактериофага для диагностики можно найти не только в отечественной, но и в зарубежной литературе (Васильев, Иванов с соавт.,1998; Ezzel, 1998; Kiel, 1998; Redmon, Henderson, 1998; Turnbull, 1998 и др.).

В руководстве для сети лабораторий, созданной для реагирования на угрозу биотерроризма в США (CDC/APHL Laboratory Response Network to Bioterrorism), лизис В. anthracis бактериофагом «gamma» рассматривается как специфический метод идентификации возбудителя сибирской язвы (Abshire, Brown, Teska et al., 2001; Teska, Allan, Redus et al., 2001). Авторы указывают на высокую аналитическую специфичность бактериофага «Гамма» (> 95%) и рекомендуют его для практического использования.

Использование феномена фаголизиса сибиреязвенных бацилл специфическим сибиреязвенным бактериофагом, согласно "Методическим указаниям по лабораторной диагностике сибирской язвы у животных и людей"(1986), входящего в комплекс опорных тестов ("жемчужное ожерелье", капсулообразование), позволяет поставить предварительный диагноз в достаточно короткие сроки. Основные преимущества этого метода: простота, высокая специфичность, возможность использования в полевых условиях. Для определения фагочуветви-тельности идентифицируемых штаммов до 1991г. использовали коммерческие фаги К ВИЭВ и Гамма МВА, производимые на биофабрике г. Сумы Украинской ССР. В настоящее время эти препараты для медицинских целей в России не производятся.

Помимо фагов К и Гамма, выделены и другие, среди которых, возможно, есть более перспективные для изготовления коммерческого препарата, но сравнительное изучение их литической активности по отношению к штаммам сибиреязвенного микроба и близкородственным сапрофитам не проводилось.

По мере накопления наших знаний об экологии возбудителя сибирской язвы и выделения большого числа атипичных по своим свойствам штаммов

Березкина, 1978; Буравцева с соавт.,1983; Еременко с соавт.,1991; Буравцева с соавт.,1997) все более актуальной становится проблема фагоиндикации и дифференциации таких штаммов от близкородственных спорообразующих сапро-фитов. Изменение патогенности сибиреязвенного микроба проявляется в снижении вирулентности, нарушении синтеза токсина и капсулы, гемолизинов и протеаз, утрате способности к спорообразованию. При этом может иметь место и фагорезистентность, не только у авирулентных, но и отдельных вирулентных сибиреязвенных штаммов. О таких изолятах, выделенных из почвы, сообщают Н.В. Обносова и В.П, Шуляк (1978).

Биотехнология производства сибиреязвенных диагностических бактериофагов для лабораторной диагностики сибирской язвы нуждается в значительном усовершенствовании. Это относится, прежде всего, к подбору перспективного для производства штамма бактериофага, обладающего способностью лизировать как типичные, так и атипичные по ряду свойств штаммы сибиреязвенного микроба. Необходимо подобрать продуктивный штамм - "кормилку" для выращивания фага и оптимальные условия культивирования. Недостаточно отработаны вопросы получения препарата с высокой концентрацией фаговых частиц для надежного обеспечения его специфической активности. Актуальной является стабилизация свойств препарата методом лиофильного высушивания. Для получения четкой реакции фаголизиса необходимы оптимальные условия проявления фагом своих литических свойств, а также наличие индикаторных штаммов для определения концентрации фаговых частиц в препарате и контроля специфичности литического действия.

Таким образом, разработка биотехнологий получения и производство сибиреязвенного бактериофага для восполнения дефицита этого диагностического препарата на Российском рынке, а также удовлетворение нужд отечественного здравоохранения являются насущной необходимостью.

Цель и задачи исследования. Разработка биотехнологии производства высокоспецифичного диагностического сибиреязвенного бактериофага с длительным сроком годности.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи: подобрать перспективные производственные штаммы фага и материнского сибиреязвенного штамма-«кормилки»; изучить диапазон вариабельности природных штаммов сибиреязвенного микроба по ряду признаков, включая фаголизабельность; подобрать индикаторные штаммы для проверки специфичности литического действия фага; разработать обогащенную и синтетическую питательные среды для выращивания фага; определить оптимальные условия культивирования бактериофага (посевное число, фаза роста штамма —«кормилки» для заражения фагом, режим выращивания фага); подобрать среду высушивания и режим лиофилизации фага; изготовить экспериментально-производственные серии диагностического бактериофага; провести лабораторные испытания; оформить НД на разработанный препарат.

Научная новизна. Впервые разработана биотехнология производства диагностического сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26 (жидкого) на обогащенной питательной среде (патент на изобретение №2133273 «Способ выращивания сибиреязвенного бактериофага Гамма» от 20.07.1999 г). Впервые применен в качестве материнского штамма - «кормилки» вакцинный штамм B.anthracis 55. Впервые в результате размножения на данном штамме получена субкультура сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26, обладающая широким спектром литического действия в отношении типичных и атипичных штаммов сибиреязвенного микроба. Экспериментальные серии препарата сохраняли рабочую концентрацию бактериофага (не ниже 2хЮ9 БОЕ/мл) и специфичность литического действия в течение гарантийного срока хранения (1 год) при температуре от 2 до 8° С.

Впервые разработана биотехнология производства диагностического сибиреязвенного бактериофага на жидкой синтетической питательной среде, стабилизированного методом лиофилъного высушивания (патент на изобретение № 2171842 «Способ получения сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26» от 10.08.2001г).

Разработанная биотехнология получения стабилизированного методом лиофилъного высушивания сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26 с применением синтетической среды позволяет экономить дорогостоящие питательные среды, временные и энергетические ресурсы и получать высокоэффективный диагностический препарат. Экспериментальные серии препарата сохраняли рабочую концентрацию (109-Ю10БОЕ/мл) и специфичность литического действия в течение гарантийного срока хранения (3 года) при температуре от 2 до 8° С.

Впервые изучен диапазон вариабельности вызывающих сложности при идентификации природных "почвенных" атипичных штаммов сибиреязвенного микроба по комплексу фенотипических признаков и генотипу, определен состав клеточной популяции штаммов по морфологическим и генетическим критериям, селекционированы стабильные клоны с разным фено- и плазмидоти-пом и выявлена чувствительность всех изученных вариантов атипичных штаммов к бактериофагу Гамма А-26.

Практическая значимость. На разработанную биотехнологию производства диагностического сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26 жидкого (сухого) на синтетической питательной среде составлена нормативная документация, одобренная Ученым советом Ставропольского НИПЧИ и утвержденная директором института (протокол №6 от 27.06.2002г.):

1. Регламент производства бактериофага Гамма А-26 диагностического сибиреязвенного жидкого (сухого).

2. Фармакопейная статья предприятия.

3. Инструкция по применению бактериофага диагностического сибиреязвенного жидкого (сухого).

Налажено экспериментальное мелкосерийное производство бактериофага Гамма А-26.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на научно-практической конференции: «60 лет противочумной службе Кавказа» (Ставрополь, 1995); научно-практической конференции, посвященной образованию противочумной службы России (Саратов, 1997); на юбилейной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МОРФ (Киров, 1998); на межлабораторной научной конференции Ставропольского научно-исследовательского противочумного института (Ставрополь 2002 г.).

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 11 опубликованных статьях.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста, содержит 13 таблиц и 15 рисунков, состоит из введения, 1 главы обзора литературы, 4 глав собственных исследований, включающих описание материалов и методов исследований и экспериментальную часть; заключения; выводов; списка использованной литературы, включающего 139 отечественных и 82 зарубежных источников.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Солодовников, Борис Владимирович

ВЫВОДЫ

1. Подобран производственный вакцинный штамм-«кормилка» Bacillus anthracis 55, позволяющий получать высокоспецифичный бактериофаг Гамма А-26 в высоких концентрациях, обладающий литическим действием в отношении 100% типичных сибиреязвенных бацилл.

2. Диагностический бактериофаг Гамма А-26 также эффективно лизирует атипичные природные «почвенные» изоляты, впервые обнаруженные нами, которые аналогичны по своим характеристикам бескапсульным вакцинным штаммам, но отличаются от них по морфологии колоний, капсуло- и токсино-образованию, по популяцйонному и плазмидному составам, вирулентности для лабораторных животных.

3. Сконструирована обогащенная питательная среда и подобран состав синтетической питательной среды, определены оптимальные условия культивирования на них бактериофага Гамма А-26, которые позволяют получать препарат с концентрацией фаговых частиц в препарате не ниже 2x109 - 2x1010 БОЕ/мл.

4. Подобранные индикаторные штаммы - типичные вирулентные, вакцинные штаммы сибиреязвенного микроба и близкородственных спорообра-зующих сапрофитных бацилл дают возможность достоверно оценить спектр и специфичность литического действия бактериофага Гамма А-26.

5. Для сохранения исходных свойств бактериофага Гамма А-26 впервые отработан эффективный, экономичный ускоренный режим его сублимации, гарантирующий срок годности не менее 3-х лет.

6. Разработанная биотехнология производства сибиреязвенного диагностического бактериофага Гамма А-26 позволяет удовлетворить потребности в нем практических медицинских и ветеринарных служб Российской Федерации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Сибирская язва является особо опасным инфекционным заболеванием людей и животных, встречающимся повсеместно и имеющим социальную и экономическую значимость для многих стран, включая Россию. Ее возбудитель может быть использован, как эффективное биологическое оружие и служить объектом биотерроризма, что было показано событиями 2001 года в США. Поэтому надежная индикация этого микроорганизма является актуальной задачей.

Определение чувствительности исследуемых культур к сибиреязвенному бактериофагу остается одним из опорных тестов в развернутых схемах идентификации сибиреязвенного микроба в России и за рубежом.

В нашей стране с этой целью до 1991 г. использовали коммерческие фаги К ВИЭВ и Гамма МВА, изготовленные на биофабрике г. Сумы Украинской ССР. В настоящее время эти препараты для медицинских целей в России не производятся.

Для восполнения дефицита этого диагностического препарата необходимо наладить производство сибиреязвенного бактериофага, основанного на эффективной биотехнологии.

Известные биотехнологии производства сибиреязвенного фага и сами препараты не лишены принципиальных недостатков.

Совершенствование биотехнологии производства сибиреязвенного диагностического бактериофага было направлено на различные этапы получения препарата. Отбор перспективных производственных штаммов сибиреязвенного бактериофага и сибиреязвенного штамма-кормилки осуществлялось с учетом их популяционного состава, что не описывалось в ранее разработанных способах.

Были определены оптимальные условия культивирования: сконструирована среда на основе бульона Хоттингера, обогащенная питательными добавками (дрожжевой экстракт и хлористый кальций); подобрана посевная доза штамма-кормилки (B.anthracis 55); определена фаза заражения для штамма кормилки и заражающая доза бактериофага Гамма А-26.

Известно, что существующие сибиреязвенные бактериофаги различаются по широте охвата лизируемых ими типов штаммов возбудителя сибирской язвы, а также по специфичности действия. Проведенные нами исследования показали, что литический спектр бактериофага зависит также от типа штамма В. anthracis, на котором производилось его размножение. После размножения имеющихся бактериофагов (Гамма А-26, К, ВА-9, "Саратов") на бульонной культуре сибиреязвенного вакцинного штамма СТИ-1 была испытана их лити-ческая активность. Для опыта в качестве тестируемых штаммов использовались различные типы культур В. anthracis. У всех тестируемых штаммов В. anthracis в месте нанесения бактериофагов образовывались зоны лизиса, на фоне которых отмечались изолированные фагорезистентные колонии. Только вакцинный штамм В. anthracis 55 не лизировался бактериофагами К и "Саратов". В месте нанесения на газон этого штамма бактериофагов Гамма А-26 и ВА-9 были обнаружены единичные негативные колонии фагов. Эти колонии были отобраны и пассированы на бульонной культуре штамма В. anthracis 55. В результате размножения отобранных колоний указанных бактериофагов были получены их препараты, способные лизировать различные типы сибиреязвенных культур и практически не давать фагорезистентных колоний в месте их нанесения на тестируемые штаммы.

Выбор сибиреязвенного вакцинного штамма 55, являющегося субкультурой II типа, в качестве культуры - «кормилки» обусловлен тем, что субкультура бактериофага Гамма А-26, выращенного на этом штамме, лизировала все использованные в опыте штаммы. При размножении этой субкультуры бактериофага на штаммах СТИ-1 и Ichtiman (культуры I типа) он не лизировал штамм В. anthracis 55.

Таким образом, получение препарата бактериофага Гамма А-26 способного лизировать различные штаммы сибиреязвенных культур (I и II типов) возможно лишь при размножении выделенной нами субкультуры этого фага на сибиреязвенной культуре II типа B.anthracis 55.

Определение специфичности литического действия фагов ВА-9 и Гамма А-26 на 55-ти штаммах близкородственных сибиреязвенному микробу бацилл (B.cereus; В. thuringiensis;В. subtilis;B. megaterium) показало, что бактериофаг ВА-9 обладал более широким спектром неспецифической литической активности в отношении культур близкородственных бацилл, вызывая лизис 4 штаммов, в отличие от фага Гамма А-26, лизировавшего только два штамма из 55.

Таким образом, выбор сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26 и вакцинного штамма 55 в качестве производственных был сделан на основании проведенных экспериментов, показавших способность выращенного на этом штамме фага лизировать все культуры сибиреязвенного культур сибиреязвенного микроба при меньшем, чем у фага ВА-9, неспецифическом лизисе. Дополнительными аргументами в пользу выбора бактериофага Гамма А-26 было регламентированное использование его в схеме идентификации сибиреязвенного микроба, предлагаемой ВОЗ.

Для контроля литических свойств готового препарата (определение концентрации бактериофага, специфичности литического действия) необходимо было отобрать индикаторные штаммы сибиреязвенного микроба и близкородственных спорообразукицих бацилл.

Использованные в описанных опытах культуры сибиреязвенного микроба представляли собой типичные вирулентные или вакцинные штаммы. Однако среди выделенных из разных источников штаммов достаточно часто встречаются атипичные.

Нами были изучен диапазон изменчивости атипичных природных почвенных штаммов сибиреязвенного микроба, вызывающих сложности при идентификации по комплексу фенотипических признаков и генотипу, определен состав клеточной популяции штаммов по морфологическим и генетическим критериям, селекционированы стабильные клоны с разным фено- и плазмидотипом и выявлена чувствительность всех изученных вариантов атипичных штаммов к бактериофагу Гамма А-26. Эксперименты позволили убедиться в том, что отобранная в качестве производственной субкультура бактериофага Гамма А-26 эффективно лизирует, наряду с типичными, все изученные атипичные штаммы и их субкультуры, независимо от их морфологических, биохимических, генетических особенностей и вирулентности для лабораторных животных.

Учитывая данные о диапазоне изменчивости природных штаммов сибиреязвенного микроба и спектре литического действия фага Гамма А-26, мы приступили к отбору индикаторных штаммов. В своем выборе мы руководствовались изученностью, доступностью и стабильностью штаммов.

Для определения специфической активности (титр Грациа) был отобран вакцинный штамм СТИ-1, показавший наивысшую чувствительность к бактериофагу, при определении концентрации фаговых частиц в препарате.

Для контроля специфичности литического действия сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26 в качестве индикаторных штаммов нами было отобрано 5 штаммов В. anthracis, дающих четкий фаголизис (положительный контроль) с бактериофагом. Среди них 1 штамм вирулентный (81/1) и 4 вакцинных (СТИ-1, 34F2 (Sterne), Ichtiman, 228/8. В качестве отрицательного контроля мы отобрали 6 штаммов близкородственных спорообразующих почвенных бацилл

Bacillus cereus 250,96; Bacillus subtilis 83,3; Bacillus megaterium 1,89), не лизи-рующихся бактериофагом Гамма А-26.

Были определены оптимальные условия культивирования бактериофага Гамма А-26: сконструирована среда на основе бульона Хоттингера, обогащенная питательными добавками (дрожжевой экстракт и хлористый кальций); подобрана посевная доза штамма-кормилки (B.anthracis 55); определена фаза заражения для штамма кормилки и заражающая доза для бактериофага Гамма А-26. Разработанная нами технология упрощает и сокращает затраты на получение бактериофага при высоком качестве и специфичности. Уменьшение количества манипуляций с культурой снижает затраты времени по сравнению с прототипом (Ипатенко, 1987) с 68 до 30 ч, объемы питательных сред, возможность контаминации посторонней микрофлорой и обеспечивает стабильное получение специфичного бактериофага с высокой концентрацией фаговых частиц (2x10'012 БОЕ/мл).

Биотехнология производства должна отражать тенденции настоящего времени и позволять получать препарат при эффективном и экономном использованием материальных, энергетических и временных ресурсов. В разработанной нами биотехнологии получения сибиреязвенного фага Гамма А-26 с использованием обогащенной питательной среды большую долю составляют питательные среды, изготовленные на основе дорогостоящего животного сырья, требующие дополнительных временных и энергетических затрат на их приготовление.

Для снижения себестоимости препарата и придания процессу большей технологичности было сокращено использование питательных сред на основе дорогостоящего животного сырья на этапах выращивания и контроля биологических свойств бактериофага.

Альтернативой использованию сред на натуральной основе является применение синтетических питательных сред. Синтетические среды состоят из растворов химически чистых соединений в точно установленных дозировках. В них в качестве источника азота обычно используют различные аминокислоты. В состав синтетических сред входят витамины, минеральные соли, глюкоза.

Преимуществом синтетических питательных сред является их строго определенный состав, что позволяет добиваться стандартных условий эксперимента и воспроизводимости результатов.

Учитывая этапность биотехнологического процесса (предварительное выращивание штамма-«кормилки» и последующее заражение его бактериофагом), при разработке состава синтетической питательной среды были удовлетворены питательные потребности в различных факторах роста, как штамма-«кормилки», так и бактериофага. Получение экспериментальных серий бактериофага показало возможность замены обогащенной среды синтетической питательной средой. Однако приготовление синтетической питательной среды трудоемкий процесс и использование для производства среды, содержащей дефицитные реактивы, неперспективно.

Учитывая непродолжительность продуктивного литического цикла (в среднем 40-50 минут), данные о независимости размножения некоторых бактериофагов от физиологического состояний бактерии-хозяина, ее способности делиться в продолжение определенного периода, мы предположили, что бактериальные клетки штамма - кормилки, предварительно вырщценные на высокопитательных средах и помещенные в условия жидкой буферной среды (рН 7,27,4), содержащей минимальный набор аминокислот и солей, обладают достаточным запасом пластических веществ необходимых для размножения В них сибиреязвенного бактериофага. Учитывая, что в среднем литический цикл длится, в зависимости от условий, 40-50 минут, предполагаемое время лизиса всей культуры, с учетом асинхронности процесса -3-5 часов от начала заражения. На первой стадии выращивания бактериальной массы штамма - «кормил-ки» мы использовали агар Хоттингера, а стадию специфического лизирования бактериофагом Гамма А-26 осуществляли в обедненных питательными веществами синтетических средах.

Нами был подобран состав минимальных синтетических питательных сред для проведения специфического лизиса.

Для подтверждения наших предположений были изготовлены экспериментальные серии с использованием синтетических сред различного состава. В качестве основы сред и для контроля их эффективности нами была использована среда «М-9» (Адаме, 1961) и среда «SM» (Маниатис, 1984), составы которых были дополнены аминокислотами.

В процессе получения экспериментальных серий на синтетических питательных средах стабильные результаты были отмечены при использовании среды «SM». При выращивании на ней бактериофага мы получили препарат с концентрацией 2х10п БОЕ/мл.

Таким образом, осуществление размножения бактериофага возможно не только в обогащенных средах, но и в средах с минимальным набором питательных веществ. Включение в состав синтетических сред аминокислот сокращало время лизиса культуры, но существенно не повышало титр бактериофага.

Биотехнология получения жидкого сибиреязвенного бактериофага на синтетической питательной среде «SM» была запатентована и принята за основу производственного процесса.

Разработанные ранее биотехнологии производства сибиреязвенных бактериофагов позволяли получать препарат только в жидком виде, что значительно сокращало срок годности препарата и не удовлетворяло современным требованиям к биологическим Препаратам.

Для сохранения биологических свойств препаратов и увеличения срока годности широкое применение в биотехнологической промышленности нашел метод лиофильного высушивания (Бланков, 1961; Vieu, 1966; Долинов, 1969; Демина, 1987). Процесс лиофилизации заключается в предварительном замораживании препарата, соединенного со специальной стабилизирующей жидкостью (защитной средой), в низкотемпературном холодильнике минус (40; 70)°С и непосредственном высушивании в вакууме при температуре, обеспечивающей щадящее удаление из препарата свободной и связанной влаги.

Применение данного метода стабилизации биологических свойств препарата известно в отношении холерных диагностических фагов (Брандзишев-ский, 1973, 1976; Быстрый с соавт.,1981; Македонова с соавт., 1984, 1986, 1987; Кадетов, 1993,1994; Тюлембаев, Разумнова, 1997). Сведений о лиофильном высушивании сибиреязвенных бактериофагов в доступной нам литературе найти не удалось. Были отработаны параметры лиофильного высушивания сибиреязвенного бактериофага (подбор стабилизирующей среды и режима высушивания).

Для выбора наиболее подходящей среды высушивания нами были изготовлены экспериментальные серии препарата. Очищенный фаголизат соединяли с различными средами высушивания в соотношении 1:1 и 1:2 препарат разливали в ампулы П1ПВ-3 по 1 мл и подвергали замораживанию в морозильном столе НС 700/50. Замораживание проводили в течение 6 часов до температуры минус (40 ± 5) °С. Препарат высушивали в лиофильной установке LZ-9c в умеренном 26 часовом режиме.

Лиофилизированный препарат сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26 имел вид пористой массы (таблетки) кремового цвета. Концентрация бактериофага после лиофильного высушивания была на уровне диагностической и составляла для различных серий от 2х109до 10хЮпБОЕ/мл.

По данным опыта, всем требуемым параметрам соответствовала серия препарата, высушенная на сахарозо-желатиновой среде (10% сахароза + 1,5% желатин), с концентрацией бактериофага 10x1011 БОЕ/мл. Временной режим (26ч) и состав стабилизирующей среды были выбраны для применения в технологии производства.

Известно, что выживаемость микроорганизмов в процессе лиофильного высушивания и в дальнейшем при хранении определяются также условиями предварительного культивирования (состав питательной среды, голодание культуры, аэрация и другие). Высушивание сибиреязвенного бактериофага, выращенного на обогащенной питательной среде, показало его резистентность к примененным параметрам умеренного 26- часового режима. При разработке ускоренных режимов лиофильного высушивания необходимо было определить устойчивость бактериофага, выращенного на обедненной питательными веществами среде, к резким температурным переходами на различных этапах сублимационного периода.

На первом этапе был опробован 26- часовой умеренный режим. В качестве среды высушивания использовали испытанную сахарозо-желатиновую среда (15% сахароза + 1,5% желатин). Фаголизат смешивали в соотношении 1:1 с защитной средой.

Определение концентрации бактериофага показало высокую эффективность защитной среды и устойчивость бактериофага к данным параметрам процесса лиофильного высушивания, резистентность бактериофага, выращенного на синтетической среде, к параметрам высушивания и соответствовала таковой у бактериофага, выращенного на обогащенной среде.

На следующем этапе нами были испытаны несколько ускоренных режимов сублимационного высушивания (18; 14; 12; 9ч).

Определение концентрации бактериофага, выращенного на синтетической среде и стабилизированного с применением ускоренных режимов лио-фильного высушивания, показало, что использование "жестких" параметров сушки не отразилось на биологических свойствах сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26 и внешнем виде препарата. Для практических целей может быть использован любой из этих режимов лиофилъного высушивания. Наиболее оптимальным и реально применимым на практике был признан 14-часовой режим высушивания. В результате использования синтетической среды изменились цвет фаголизата и таблетки у лиофилизированного препарата. Фаголизат стал бесцветным, а таблетка у высушенного препарата - белоснежной.

Ампулы с лиофилизированным бактериофагом, полученным на обогащенной и синтетической питательных средах, хранились в холодильнике при температуре 4-6°С (3 года). Каждые 6 месяцев контролировалась концентрация бактериофага в экспериментальных серях препарата. Экспериментальные серии препарата сохраняли рабочую концентрацию (109-Ю10БОЕ/мл) и специфичность литического действия в течение гарантийного срока хранения (3 года) при температуре от 2 до 8° С.

Таким образом, усовершенствование разработанного нами ранее способа: использование синтетической питательной среды на этапе выращивания и контроля (определение концентрации) бактериофага, сокращение сроков лиофилизации (с 26ч до 14ч ), позволяет получать стабильный препарат диагностического сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26 с концентрацией фаговых частиц в препарате не ниже 2x109 - 2x1010 БОЕ/мл, сохраняющего специфическую ли-тическую способность в течение 3 лет хранения при температуре от 2 до 8° С.

После отработки биотехнологии производств были проведены лабораторные испытания литического спектра бактериофага Гамма А-26. Были использованы серии жидкого и лиофильно - высушенного препарата бактериофага Гамма А-26 , полученные соответственно на жидкой обогащенной и синтетической питательных средах. Изучение спектра литической активности проводилось на 55 штаммах В. anthracis и 55 штаммах сапрофитных аэробных спорообразую-щих бацилл рода Bacillus .Результаты испытания показали, что сибиреязвенный бактериофаг Гамма А-26 лизировал (независимо от технологии производства) все (55) - 100% типичных и атипичных по некоторым свойствам штаммов B.anthracis. Среди штаммов сапрофитных аэробных спорообразующих бацилл выявлено 2 штамма, чувствительных к воздействию бактериофага Гамма А-26. Специфическая активность диагностического сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26, полученного нами, составила - 98 %.

Результаты опытов показали полное совпадение результатов воздействия всех серий бактериофага на тестируемые культуры независимо от биотехнологии получения препарата.

По данной технологии изготовлено 6 экспериментально - производственных серий бактериофага Гамма А-26 (3 серии - жидкого и 3 серии сухого). Совместно с сотрудниками ОБТК СтавНИПЧИ проведены производственные испытания серий. Серии бактериофага Гамма А-26 сибиреязвенного диагностического жидкого (сухого) по всем показателям соответствовали нормативной документации и общим медико-биологическим требованиям (ОМБТ).

Разработанная технология производства отражена в НД, одобренной Ученым советом Ставропольского НИПЧИ и утвержденной директором института (протокол №6 от 27.06.2002г.): регламенте производства бактериофага Гамма А-26 диагностического сибиреязвенного жидкого (сухого); фармакопейной статье предприятия; инструкции по применению бактериофага диагностического сибиреязвенного жидкого (сухого).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Солодовников, Борис Владимирович, Ставрополь

1. Абгарян, АХ. Совершенствование методов индикации возбудителя сибирской язвы: Автореф. дис. . канд. мед. наук /А.Г. Абгарян. - Ставрополь: Б.и., 2001.-21с.

2. Агапитов, Д.С. Эпизоотолого-эпидемиологическая обстановка по сибирской язве в Карачаево-Черкесской республике в 1993-1994 гг.

3. Азизбекян, P.P. Генетическая система фаг-клетка Bacillus subtittis: Автореф. дис. канд. биол. наук /Р.Р. Азизбекян М.: Б.и., - 1968. - 20 с.

4. Азизбекян, Р,Р. Нестабильности некоторых ауксотрофных маркеров Bacillus thuringiensis /P.P. Азизбекян, Р. А. Белых//Генетика. -1981.- Т. 17, № 11.- С. 1936-1944.

5. Азизбекян, P.P. О механизме УФ- реактивации фагов Bacillus subtilis /Р.Р. Азизбекян, Л.А. Галицкая //Генетика. 1973. - Т.9,№7. - С. 85-89.

6. Александров, Н.И. Усовершенствование питательной среды и изыскание метода очистки защитного сибиреязвенного антигена/ Н.И. Александров, Н.Е. Гефен, В.Ф.Рунова, А.П. Будак и др.//ЖМЭИ. 1963. - №1. - С. 103-107.

7. Африкян, Э.К. Энтомопатогенные бактерии и их значение / Э.К. Афри-кян. Ереван: Изд-во АН Арм. ССР. - 1973. - 418 с.

8. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях /И.П Ашмарин., А.А. Воробьев. Л.: Медгиз, 1962. -180 с.

9. Бакулов, И. А. Сибирская язва (антракс): новые страницы в изучении «старой болезни» /И.А. Бакулов, В.А., Гаврилов, В.В. Селивестров. Владимир: Посад, 200L - С.8-70

10. Беляков, В.Д. Военная эпидемиология /В.Д.Беляков, Е.Р.Жук // Военная гигиена и эпидемиология: Учеб. пособие. Разд. 2. 2-е изд., перераб. и доп. -М., 1988.-С. 173-316.

11. Бендас, Л.Г. Ферментативные гидролизаты кормовых дрожжей основа бактериологических питательных сред: Автореф. дис. канд. биол. наук. /Л.Г- Бендас. - М.: Б.и., 1971. -16 с.

12. Биргер, О.Г. Сибирская язва //Микробиологические методы исследования при инфекционных заболеваниях. М., 1975. - С. 77- 93.

13. Бланков, Б.И. Применение лиофилизации в микробиологии / Б.И. Бланков, Д.И. Клебанов. М., 1961. - С. 57-60, 86-87.

14. Бойков, Ю.И. Влияние сибиреязвенного бактериофага на различные штаммы В. anthracis /Ю.И. Бойков //Проблемы ветеринарной санитарии. Тр. ин-та/ВНИИВС. 1964. - Т.24. - С. 120-124.

15. Брандзишевский, Ю.В. Сублимация как метод стабилизации холерных фагов: Автореф. дис. канд. мед. наук /Ю.В. Брандзишевский. Саратов: Б.и., 1976. - 15 с.

16. Брандзишевский, Ю.В. Влияние различных режимов и сред высушивания на стабильность лиофилизированных препаратов фага 15 при длительном хранении /Ю.В. Брандзишевский // Проблемы ООИ. Саратов. - 1973. - №5. -С. 63.

17. Буланцев, А.Л. О роли фага в рекомбинантных процессах по передаче плазмид В.anthracis /А.Л. Буланцев, А.В. Липницкий, А.М. Барков //Генетика и биохимия вирулентности возбудителей ООИ. Тезисы докл. Волгоград, 1992. -С.29.

18. Буланцев, A.JI. Получение и характеристика фагорезистентных клонов возбудителя сибирской язвы '/АЛ. Буланцев, A.M. Барков, А.В. Липницкий //Генетика и биохимия вирулентности возбудителей ООИ. Тезисы докл. Волгоград, 1992. - С. 12.

19. Буравцева, Н.П. Роль атипичных штаммов сибиреязвенного микроба в эпизоотологии и эпидемиологии сибирской язвы /Н.П. Буравцева, Е.И. Ерёменко, О.Й. Цыганкова //Материалы межрегион, рабочего совещ. ВОЗ/ФАО по сибирской язве. Алма-Ата, 1997. - С. 38-39.

20. Буравцева, Н.П. Ускоренный метод обнаружения возбудителя сибирской язвы в исследуемом материале: Методические рекомендации /Н.П. Буравцева, В.А. Ярощук. М.: Б.и., 1989,- 7 с.

21. Бургасов, П.Н. Сибиреязвенная инфекция /ПН. Бургасов, Г.И. Рожков. М.: Медицина, 1984. - 208 с.

22. Бурденко, Т. А. Серологические методы исследования при сибирской язве /Т.А. Бурденко //Иммунодиагностика и специфическая профилактика инфекционных болезней. Кишинев, 1974. - С. 84 -92.

23. Быкова, З.А. Биологические свойства чумных бактериофагов: Авто-реф. дис. канд. мед. наук/Быкова З.А. Саратов: Б.и., 1964. -15 с.

24. Выделение из почвы атипичных штаммов сибиреязвенного микроба /Н.П. Буравцева, Е.И. Ерёменко, A.M. Ищерякова, Е.Л. Ракитина // «Профилактика природно-очаговых инфекций», всесоюз. науч.конф. Тезисы докл. всесоюз. науч. конф. Ставрополь, 1983. - С. 16-17.

25. Гаврилов С.В. Трансдукция у возбудителя сибирской язвы: Автореф. дис. канд. мед, наук /С.В.Гаврилов. Саратов: Б.и., 1990. - 19 с.

26. Гинсбург, Н.Н. Сибирская язва /Н.Н. Гинсбург. М.: Медгиз, 1975.157с.

27. Гольдфарб, Д.М. Бактериофагия /Д.М. Гольдфарб.- М.: Медгиз, 1961.298 с.

28. Гриднева, Н.И. Конструирование и стандартизация сухих диагностических сред промышленного выпуска: Автореф. дис. канд. биол. наук /Н.И. Гриднева. М.: Б.и., 1979.- 21 с.

29. Груз, Е.В. Изучение действия индикаторного сибиреязвенного бактериофага /Е.В. Груз // «Антигены м/о и ответные реакции», научн. сессия Молдавской ИЭМГ. (3; 1964). Докл. научн. сессии. Кишинев, 1962. - С. 127-130

30. Демина, Н.С. Действие дегидратации на микроорганизмы /Н.С. Демина, G.B. Лысенко //Биол. науки. -1987. №8. - С. 50-52.

31. Долинов, К.Е. Основы технологии сухих биопрепаратов /К.Е. Доли-нов. М.: Медицина, 1969. - С.97-102. 30.

32. Езепчук, Ю.В. Биомолекулярные основы патогенности бактерий /Ю.В Езепчук. Москва: Наука, 1977. - С. 216.

33. Еременко, Е.И. Биологические и популяционные аспекты патогенности B.anthracis: Дис. . д-ра мед. наук / Е.И. Еременко. Ставрополь: Б.и., 1997. - С.81-86.

34. Еременко, Е.И. Потребности сибиреязвенного микроба в факторах роста и новые питательные среды для его культивирования: Дис. канд. мед. наук /Е.И. Еременко. Ставрополь: Б.и., 1986. - 181 с.

35. Земцова, И.Н. Отношение сибиреязвенного фага к действию некоторых физических и химических факторов /И.Н.Земцова //Вопросы микробиологии и лаб. диагностики ООИ. Саратов, 1965. - С. 124-128.

36. Земцова, И.Н. Характеристика сибиреязвенного бактериофага и его применение для лабораторной диагностики сибирской язвы.: Автореф. дис. канд. мед. наук /И.Н. Земцова. Саратов: Б.и., 1965. - 14 с.

37. Зуев, В.А. Литическая активность бактериальных вирусов /В.А. Зуев. -М.: Медицина, 1965. -184 с.

38. Изучение некоторых свойств субкультур сибиреязвенного вакцинного штамма СТИ-1 / О.И. Цыганкова, Т.Н. Фунтикова, Н.П. Буравцева, Е.Н. Еременко //«Иммунология и специфическая профилактика ООИ», Материалы росс, науч. конф. Саратов, 1993. - С. 192-193.

39. Индикация возбудителей особо опасных инфекций с помощью композиционных магноиммуносорбентов /И.С. Тюменцева, В.И. Ефременко, Е.Н. Афанасьев и др. Деп. В ВИНИТИ 25.01.95, № 221 - В. 95.

40. Ипатенко, Н.Г. Профилактика сибирской язвы/ Н.Г. Ипатенко, В.Н. Гущин, А.А. Маничев и др.//Ветеринария.-1992. №2.- С.31-32.

41. Ипатенко, Н.Г. Сибирская язва сельскохозяйственных животных /Н.Г. Ипатенко. -М.: Агропромиздат, 1987. С. 174-175.

42. Испытание сибиреязвенных бактериофагов К ВИЭВ и Гамма МВА /Н.Г. Ипатенко, А.А. Маничев, В.А. Седов, В.Н. Гущин //Ветеринария. 1989, №10.-С. 58-59.

43. Кадетов, В.В. Криоконсервирование и лиофилизация холерных бактериофагов: Автореф. дис. канд. биол. наук /В.В Кадетов. Ростов н/Д: Б.и., 1993.- 18 с.

44. Киреев, Ю.Г. Совершенствование методологии прогнозирования активности почвенных очагов сибирской язвы /Ю.Г. Киреев, Б.Л. Черкасский,

45. B.И. Прометной // «Эпидемиол. и клинико-иммунол. аспекты профилактики важнейших инфекционных заболеваний». Материалы конф. Астрахань, 1996.1. C. 22-23.

46. Клинические и эпидемиологические исследования, проведенные во время эпидемиологической вспышки сибирской язвы /Л.А.Пекова, М.Н. Димитрова, В.И. Цанева, М.А. Лолова // Инфектология. 1995. - 32, № 1. - С. 3637.

47. Консервация вирусов различных групп для целей длительного хранения /Л.Л. Фадеева, Э.В. Халецкая, А.Ю. Селеднева и др. // Методы исследования в молекулярной, общей и медицинской вирусологии. М., 1987. - С. 66-73.

48. Коротич, А.С. Сибирская язва / А.С. Коротич, Л.И. Погребняк. Киев: Урожай, 1976.- 159 с.

49. Крылова М.Д. Фаготипирование бактерий / М.Д. Крылова М.: Мед-гиз, 1963. - 199 с.

50. Куличенко, А.Н. Конструирование молекулярно-генетических систем для детекции возбудителей особо опасных инфекций: чумы, бруцеллеза и сибирской язвы: Автореф. дис. д-ра мед. наук /А.Н. Куличенко. Саратов: Б.и., 1995.-С. 38.

51. Ларина, B.C. Выделение активного бактериофага из бацилл сибирской язвы, обнаруженных в почве /B.C. Ларина, Л.С. Петрова //Микробиологияи иммунология ООИ: Сб. науч. работ противочумных учрежд. страны. Саратов, 1964. - С. 94-95.

52. Левина, Е.Н. Сравнительное изучение сибиреязвенных бактериофагов /Е.Н. Левина, В.Р. Архипова //ЖМЭИ. 1967. - №9. - С. 24-28.

53. Лысенко, A.M. Получение лизата, концентрация и очистка фага. ТЗ /А.М.Лысенко, А.А. Белоусова, Л.К. Карагьозов // Вопр. вирусологии. -1974. -№4.-С.498-500.

54. Македонова Л.Д., Кудрякова Т.А., Кадетов В.В. Способ сохранения холерных бактериофагов. А.С. №12966578. Опубл. 15.11.86 //Открытия. Изобретения. - 1987. - №10. - С.113.

55. Матвеев, В.Е. Научные основы получения чистых микроорганизмов и технологии вакцин /В.Е. Матвеев, В.М. Вадимов, А.А. Воробьев. М.: Медицина, 1980 . - 256 с.

56. Методические указания по лабораторной диагностике сибирской язвы у животных и людей и по обнаружению возбудителя сибирской язвы в сырье животного происхождения, в объектах внешней среды. М.: Б.и., 1986.

57. Методы общей микробиологии. Т.1 /Под ред. Ф. Герхарда. М.: Мир, 1983. - 536 с.

58. Молекулярная биология / С. Бредли, с соавт. М.: Мир, 1977. - 520с.

59. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук М.: Мир, 1984. 497с.

60. Найманов П.И. Потребление in vitro аминокислот клетками Bacillus anthracisl П.И. Найманов, Е.П. Голубинский, Ю.И. Соркин и др.// ЖМЭИ.1986. -№4. -С. 30-34.

61. О вспышке сибирской язвы в Карачаево-Черкесской республике /В.А. Петрюк, В.А. Проскурина, В.И. Ефременко, Т.Н. Фунтикова, Д.С. Агапитов, А.Е. Суворова. Ставрополь: Б.и., 1997. - 9 с.

62. Обносова, Н.В. О патогенных свойствах возбудителя сибирской язвы в разных очагах /Н.В. Обносова, В.П. Щуляк //«Достижения и перспективы борьбы с сибирской язвой в СССР». Тезисы докл. М., 1978. - С. 123-124.

63. Общая вирусология / С.Лурия, Дж. Дарнелл, Д. Балтимор, Э. Кем-пбелл. М.: Мир, 1981, - 680 с.

64. Общность споровых антигенов сибиреязвенного микроба и близкородственных сапрофитов /Н.П. Буравцева, О.Н. Лопаткин, В.Г. Пилипенко, Т.Н.

65. Определение чувствительности сибиреязвенного микроба к антибиотикам для дифференциации от спорообразующих сапрофитов /В.А.Проскурина, Н.П. Буравцева, Н.М. Неляпин, Е.И. Еременко и др. // Антибиотики и химиотерапия. -1992. Т. 37,№ 2. - С. 23-25.

66. Париж, Б.М. Исследование условий повышения качества ряда вирусных препаратов: Доклад по совокупности выполненних и опубл. работ на соиск. уч. степени канд. мед. наук /Б.М. Париж. -М.: Б.и., 1975. 47 с.

67. Перемитина, Л.Д. Сухие бактериофаги и оценка их качества /Л.Д.Перемитина, Э.А. Берилло, В.В. Малышева//Сборник науч. тр. /Моск. НИИВС. 1975. - Вып. 1. - С.190-193.

68. Получение сухой дрожжевой основы (пептона"Д") /В.Н. Милютин,

69. Промышленная микробиология /З.А. Аркадьева, А.М. Безбородов, И.Н. Блохина и др. М.: Высш. шк„ 1989. - 688 с.

70. Раскин, Б.М. Питательные среды: состояние и перспективы разработок /Б.М. Раскин // Разработка и стандартизация бактериологических питательных сред: Сб. тр. М., 1980. - С.3-9.

71. Русалеев, B.C. Взаимодействие сибиреязвенного бактериофага 3-17 со штаммами Bacillus anthracis /B.C. Русалеев // Ветеринария. -1991. №5.1. C.26-28.

72. Русалеев, B.C. Фагочувствительность аэробных спорообразующих бактерий /B.C. Русалеев //Ветеринария. 1990. - №8. - С. 29-31.

73. Русалеев, B.C. Фагочувствительность консервированных культур Bacillus anthracis /B.C. Русалеев //Ветеринария, 1990. - №9. - С. 39-40.

74. Саморегуляция паразитарных систем /В.Д.Беляков, Д.В.Голубев, Г.Д. Каминский, В.В.Тец. М.: Медицина, 1987. - 240 с.

75. Сержантова, JI.B. Очистка бактериофага методом хроматографии /Л.В.Сержантова, Г.В. Гальцева, З.И. Ус // Материалы науч.-практ. конф., по-свящ. образованию противочум. службы России. Саратов, 1997. - Т.2.- С. 219.

76. Сибирская язва: актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики /Г.Г. Онищенко, Н.Т. Васильев, Н.В. Лшусов и др.//ВУНМЦ МЗ РФ. М., 1999. - С. 93-110.

77. Смирнов, Е.И. Войны и эпидемии /Е.И. Смирнов, В.А Лебединский, Н.С. Гарин. М.: Б.и., 1988. - 240 с.

78. Совершенствование экспресс методов индикации возбудителей особо опасных инфекционных заболеваний / Е.Н. Афанасьев, И.С. Тюменцева, В.И. Ефременко, И.В. Жарникова и др. Ставрополь, 2000. -11с.- Деп. В ВИНИТИ 14.02.2000, №362-ВОО.

79. Современные методы диагностики особо опасных инфекций и способы их применения: Методическое пособие /С.Д.Гавенский, В.И. Ефременко, И.М.Климова и др. Саратов: Б.и. - 1991.- С. 213-219.

80. Способ индикации микроорганизмов / В.И. Ефременко И.С. Тюмен-цева, Е.Б. Жилченко, Т.В. Марковаи др.// Патент РФ № 2165081. Бюл.№10.

81. Степанов, А.С. Разработка основ генетического анализа возбудителя сибирской язвы ; Дис. д-ра мед. наук /А.С. Степанов. Саратов: Б.и., 1992.-С.230.

82. Терентьев, Ф.А. Бактериофаг Вас. anthracis /Ф.А.Терентьев //Тр. /ВИЭВ. 1937. - Т.13. - С. 65.

83. Тимошин, В.Б. Конструирование видоспецифического ДНК-зонда для индикации возбудителя сибирской язвы: Автореф. дис. канд. мед. наук /В.Б Тимошин. Саратов: Б.и., 1994.- 22с.

84. Тюлембаев, М.А. Стабилизация литической активности холерных типирующих монофагов 1-7 методом сублимации /М.А. Тюлембаев, В.Ф. Разумнова // Материалы науч. практ. конф., посвящ. образованию противочум. службы России. Саратов, 1997. - Т.2. - С. 277.

85. Черкасский, Б.Л. Сибирская язва /Б.Л. Черкасский // Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней. М.: Медицина, 1993. - Т.2. - С. 416432.

86. Шиганова, Л.Б. Усовершенствование диагностических Холерных монофагов ХДФ-3, ХДФ-4, ХДФ-5: Автореф. дис. . канд. мед. наук/Л.Б. Шиганова. Саратов: Б.и., 1982. - 19 с.

87. Эпидемиологическая обстановка по сибирской язве в Российской Федерации / А.А. Монисов, Ю.М. Федоров, Н.Я. Жилина, О.С. Хадарцев // Материалы межрегион, рабочего совещания ВОЗ/ФАО по сибирской язве. Алма-Ата, 1997. - С. 27-29.

88. Эпидемиология, эпизоотология и профилактика сибирской язвы в бывшем СССР /Б.Л.Черкасский, А.Г. Кноп, Ю.М. Федоров, В.А. Седов, В.А. Ведерников, П.И. Пыталев // ЖМЭИ. 1993. - № 5. - С. 7-12.

89. Эпизоотологическая и эпидемиологическая характеристика сибирской язвы в Чеченской республике /Е.И.Еременко, В.А.Ярощук, В.А.Банных, Н.М. Неляпин и др. // ЖМЭИ. 1996. - № 3. - С. 48-52.

90. Andersen, G.L. Identification of a region of Genetic variability among Bacillus anthracis strains and related species/G.L Andersen, J.M.Simchock, K.H. Wilson // J Bacterid.-1996 Jan;178(2) p.377-384.

91. Anderson, T. Activation of the bacterial virus T4 by L-tryptophan /Т. Anderson // J. Bact. 1948. - Vol.55, № 5. - P.637.

92. Anderson, T. Role of tryptophane in the adsorption of two bacterial viruses on their host E. coli /Т. Anderson // J. Cell сотр. Physiol. 1945. - Vol. 25,№1. - P.17.

93. Association of the encapsulation of Bacillus anthracis with a 60 megadat-ton plasmid / J. Uchida, J. Sekizaki, K. Hashimoto, N. Terakado //J. Gen. Microb. -1985. Vol.131.- P. 363-367.

94. Bacillus anthracis but not always anthrax / P.C.B. Turnbull, R.A. Hutson, M.J. Ward, M.N. Jones, C.R.Quinn, N.J. Finnie, C.J. Duggleby, J.M. Kramer, J.Melling // J. Appl. Bact.-1992. №72. - P. 21-28.

95. Bacillus anthracis S Layer / A. Fouet, S. Mesnage, E. Tosi-Couture, P. Gounon, M. Mock // Abstract Book 3-rd International Conference on Anthrax University of Plymouth. - 1998. - 7-10 Sept. - P. 16.

96. Barry, G. Effect of chemical and physical agents on the phage receptor of phase 2 Shigella sonnei IG. Barry, W. Goebel // J. exp. med. -1951. Vol.94, №5. -P. 387.

97. Beumer, J. Importance de l'hote bacterien pour leslesoins en calcium d'un bacteriophage /J.Beumer, M.P. Beumer-Jochmans// Ann. Inst. Pasteur. 1955. -Vol. 89, №4.-P. 395.

98. Beyer, W. Polymerase chain reaction-ELISA to detect Bacillus anthracis from soil samples-limitations of present published primers /W, Beyer, S. Pocivalsek, R. Bohm// J. Appl. Microbio.l. 1999. - Aug. 87(2). - P. 229-236.

99. Bradaric, N. Cutaneous anthrax due to penicillin-resistant Bacillus anthracis , transmitted by an insect bite /N. Bradaric, V. Punda-Polic // Lancet, 1992. -Vol. 340. - P. 306-307.

100. Bruno, J.G. In vitro selection of DNA aptamers to anthrax spores with electrochemiluminescence detection /J.G. Bruno, J.L. Kiel // Biosens Bioelectran. -1999.-31 May 14(5), P. 457-464.

101. Castro, A. Ultrasensitive, direct detection of a specific DNA sequence of Bacillus anthracis in solution /А. Castro, RT. Okinaka // Analyst. 2000. - Jan. 125(1).-P. 9-11.

102. Chatterjee, B.R. Formation of spheroplasts from Bacillus anthracis / B.R. Chatteijee, R.P. Williams //Journal of Bacteriology. 1965. - Vol. 89. - P. 1128- 1133.

103. Cohen, S. Molecular bases of parasitism of some bacterial viruses /S. Cohen // Science. 1956. - P.123, 3199,653.

104. Delbriik, M. Biochemical mutants of bacterial viruses /М. Delbriik // J. Bact.- 1948. Vol 56,Ks 11. -P.10.

105. Demonstration of capsule plasmid in Bacillus anthracis. IB.D. Green, L. Bathisti, Koehler, C.B. Tome, B.C. Ivins //Infect. Immun. -1985. Vol.49. - P.291-297.

106. Doganay, M. Antimicrobial susceptibility of Bacillus anthracis /М. Doganay, N. Aydin // Scand. J. Infect. Dis. 1991 .-Vol. 23.- P. 333-335.

107. Enroth, H. Immunomagnetic separation and PCR for detection of Helicobacter pylori in water and stool specimens /Н. Enroth, L. Engstrand // J. Clin. Microbiol. 1995. - Aug. 33 (8). - P. 2162-2165.

108. Evidense for plasmid-medited toxin production mBacillus anthracis /R. Mikessel, B.E. Ivis, J.D. Ristroph, T.M. Dreier //Infect, and Immun. -1983. Vol.39. - P.371-376.

109. Fellows, P.F. A survey of worldwide strains of Bacillus anthracis /P.F. Fellows // Proc. Inter. Workshop on anthrax. Winchester, England. 1996. - 19-21 September № 87. - P. 33.

110. Fildes, P. Function of tryptophan in the adsorption of bacteriofage /Р. Fildes, D. Kay// Brit. J. Exp. Path. 1959, - Vol.40,№ 1. -P.71-79.

111. Fildes, P. Роль двухвалентных металлов в образовании фагов /P.Fildes, D. Kay// Природа размножения вирусов. -М. 1956. - С. 237.

112. Fluorescent detection techniques for real-time multiplex strand specific detection of Bacillus anthracis using rapid PCR /М.А. Lee, G. Brightwell, D. Leslie, H. Bird, A. Hamilton // J. Appl. Microbiol. 1999. - Aug. 87(2). - P. 218-223

113. Fowler, C. Chemical studies in host-virus interactions. 4. A method of determining nutritional requirements for bacterial virus multiplication. /С. Fowler, S. Cohen // J. Exp. Med. 1948. - Vol.87,№ 4. - P.259.

114. Genetic variability among Bacillus anthracis strains and related species /GL. Andersen, JM Simchock, KH. Wilson // J. Bacteriol. 1996. - Jan. 178(2). -P.377-384.

115. Gladstone, G.P. Inter-relationships between amino-acid in the nutrition of Bacillus anthracis /GJP.Gladstone // Brit. J. Exp. Path. 1939. - Vol.20, №2 - P. 189200.

116. Gross, S. Nutritionel requirements for the reproduction of coliphage. T2 in strain of Esherichia coli /S. Gross // J. Bact.- 1954. Vol.68,№ 1. - P.43.

117. Haan, P. Phage reproduction in relation of bacterial growth rate /Р. Haan, K. Winkler// Ant. Leeuwenhoek J. micr.serol. 1955. - Vol.21,№ 1. - P.103.

118. Holt, J.G. The Shorter Bergeys Manual of Determinative Bacteriology /J.G. Holt. Baltimore, 1980. - 495 p.

119. Identification of Bacillus anthracis by API tests /N. A. Logan, J. A. Carman, J. Melling, R.C.W Berkeley //J. Med. Microbiol. 1985. - Vol.20. - P.75-85.

120. Identification of Bacillus anthracis by using monoclonal antibody to cell wall galactose-N-acetylglucosamine polysaccharide / J.W. Jr Ezzell, T.G. Abshire, S.F. Little, B.C. Lidgerding, C. Brown// J. Clin Microbiol. 1990. - Feb. 28(2). -P.223-31.

121. Identification of Bacillus anthracis Using MIDI Whole Cell Fatty Acid Analysis / J. D. Teska, С. M. Allan, S. L. Redus, S.R. Coyne, J. W. Ezzel // 4th International Conference on Anthrax. Annapolis, Maryland, USA. 2001. - June 10 -13. -P.30.

122. Identification of Bacillus anthracis: an overview / J.W. Ezzell, T. Abshire, S. Ibrahim, J. Teska, S. Coyne, F. Knauert, C. Allen, D. Nash // Abstract Book. 3-rd international Conference on Anthrax, Plymouth, England. 1998. - 7-10th September. - P.47.

123. Inal, J.M. Phi 20, a temperate bacteriophage isolated from Bacillus anthracis exists as a plasmidial prophage. /J.M. Inal, К.V. Karunakaran // Curr Microbiol.

124. J. Bacterid. 1996. - Jan. 178(2). - P. 377-384.

125. Jacob, F. Influence du regime carbone sur le developpement des bacteriophages /F. Jacob //Ann. De l'Inst. Pasteur. 1953. -Vol. 84.- P.254.

126. Induction of motility in Bacillus anthracis by mens of bacteriophage ly-sates /E.R. Brown, M.D. Moodi, M.A Gordon, et al. //J. Bact. 1955. - Vol.69. - P. 590-602.

127. Jvanovics, G. Phenocopy of resistence to phage in Bacillus antracis /G. Jvanovics, L. Lantos ft Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung. 1962. -Vol. 9. - P. 237246.

128. Jvanovics, G. Problems concerning the phylogenesis of Bacillus anthracis /G. Jvanovics, J. Foldes // Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung. 1958. - Vol. 5. - P. 89109.

129. Kaneko, T. Deoxyribonucleic acid relatedness between Bacillus anthracis, Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis /Т. Kaneko, R. Mozaki, K. Aizawa // Microbiol. Immunol. 1978. - Vol. 22. - P. 639-641.

130. Kay, D. Effect of divalent metals on the multiplication of coli bacteriophage T5 st. /D. Kay //Brit. J. exp. Path. 1952. - Vol.33, №3. - P. 228.

131. Knisely, R.F. Selective medium for Bacillus anthracis /R.F. Knisely // J. Bacteriol. 1966. - Vol. 92,№3. - P. 784-786.

132. Lanni Y. Invasion by bacteriophage T5 1. Some basic kinetic features /Y. Lanni // Virology. 1960. - Vol. 10, №4. - P. 501.

133. Lanni Y. Invasion by bacteriophage T5 2. Dissociation of calcium-dependet process /Y. Lanni //Virology. 1960. - Vol.10, №4. - P. 514.

134. Lantos, J. Characterization of anthrax phages. /J. Lantos, I. Varga, G. Jvanovics // Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung. 1960. - Vol. 7. - P. 30-42.

135. Long G.W., O'Brien T. Antibody based system for the detection of Bacillus anthracis in environmental samples // Abstract Book. 3-rd International Conference on Anthrax Plymouth, England. 1998. - 7-lOth, September - P.7.

136. Magnetic immuno capture PCR assay (MIPA): detection of Leptospira borgpetersenii serovar hardjo / M.J .Taylor, W.A. Ellis, J.M. Montgomery, K.T. Yan, S.W. McDowell, D.P. Mackie // Vet. Microbiol.- 1997. May 56(1-2). - P. 135-145.

137. Mc Clou, E.W. Studies on a lysogenic Bacillus strain. A bacteriophage specific for Bacillus antracis /E.W. Mc Clou //J.Hyg. Camb. 1951. - Vol.49. -P.l 14-125.

138. Meynell, G. Экспериментальная микробиология /G. Meynell, E. Meynell. M.: Мир, 1967. - 347c.

139. Molecular characterization and protein analysis of the cap region, which is essential for encapsulation in Bacillus anthracis / S. Makino, I. Uchida, N. Terakado, C. Sasakawa, M. Yoshikawa // J. of Bacteriolgy. 1989. - Vol. 171. - P. 722-730.

140. Molecular detection of Bacillus anthracis spores in commercial samples of wool and cashmere / K. Levi, J.L. Highham, P.F. Hamlyn, D. Coates// Abstract Book. 3-rd International Conference on Anthrax Plymouth, England. 1998. - 7-10th September. - P. 58.

141. PCR based characterization of Bacillus anthracis as mean for ecological studies / G. Patra, J. Vaissaire, M. Mock, V. Ramisse // Abstract Book. 3-rd International Conference on Anthrax Plymouth, England. -1998. 7-10th September. - P. 10.

142. Perlac, F.I. Converting Bacteriophage for sporulacion and cristel formacion in Bacillus thuringiensis /F.I. Perlac, C.L. Mendelson, C.B. Thome // J. Bact. -1979. -Vol. 140,№2.-P. 699-706.

143. Phage from different strains of Bacillus anthracis / C. Redmon, I. Henderson, J. Turnbull Bowen // Salisburi Medical Bulletin. 1996. - Special Supplement/ June №87. - P. 60-63.

144. Phage isolated from Lysogenic Bacillus anthracis /С.А. Buck, R.L. Anacker, F.S. Newman, A.Eisenstark //J.Bact. 1963. - Vol. 85. - P.1423-1430.

145. Plasmid-Related differences in capsule production by Bacillus anthracis / T.M. Koehler, R.E. Ruhfel, B.D.Green, C.B. Thorne //Abstr. Ann. Meet. Amer. Microbiol.-1986.-P.l 57

146. Rapid detection of Mycobacterium avium in stool samples from AIDS patients by immunomagnetic PCR /Z. Li, G.H. Bai, C.F. von Reyn, P. Marino, M.J.

147. Brennan, N. Gine, S.L. Morris// J. Clin. Microbiol. 1996. - Aug. 34(8). - P. 19031907

148. Ristroph, J. D. Elaboration of Bacillus anthracis antigen in a new, defined culture medium /J.D. Ristroph, B.E. Ivins // Infect. Immun.- 1983. Vol. 39, № 1. - P. 483-486

149. Roberts, B. Immunomagnetic separation and PCR for detection of Mycobacterium ulcerans /В. Roberts, R. Hirst II J. Clin. Microbiol. -1997. Oct. 35(10). -P. 2709-2711.

150. Spizizen, J. Biochemical studies on the phenomenon of virus reproduction.

151. Amino acids and the multiplication of bacteriophage /J. Spizizen // J. Inf. Dis. -1943. Vol.73,№3.-P.212.

152. Spizizen, J. Biochemical studies on the phenomenon of virus reproduction.

153. Studies on the influence of compounds of metabolic significance on multiplication of bacteriophage /J. Spizizen // J. Inf. Dis. 1943.- Vol.73.-№ 3. - P.222.

154. Stamatin N. et Leonie Mintzer-Morgenstern. Antagonisme entre certaines variantes de B. Anthracis et surtout entre les variants sensibles et resistantes a la streptomicine. // Archives roum de Patolog. exp. et de microb. 1962. - T.21, №4. -P.783-793.

155. Stopa P.J. The flow cytometry of Bacillus anthracis spores revisited /P.J. Stopa // Cytometry. 2000. - 1 Dec. 41 (4). - P. 237-244.

156. The biochemical,morphological and virulence profiles of Bacillus anthracisisolated in the Kruger National Park / M. W. Odendaal, P.M. Pieterson, V. Vos de, A.D. Botha // Onderstepoort J Vet Res. 1991. - Mar.58 (1). - P.21-26.

157. The magnetic immuno-polymerase chain reaction assay for the detection of Campylobacter in milk and poultry / L.Docherty, M.R. Adams, P. Patel, J. McFadden // Lett. Appl. Microbiol. -1996. Apr. 22(4). - P. 288-292.

158. The Sverdlovsk anthrax outbreak of 1979 / M. Meselson, J. Guillmin, M. Hugh-Jones, A. Langmuir, I. Popova, A. Shelokov, O. Yampolskaya // Sciens. 1994. -Vol. 266,№5.-P. 188.

159. Thorne, C.B. Biochemical properties of virulent and avirulent strains of Bacillus anthracis /С.В. Thorne // Ann. N.Y.Acad. Sci. 1960. - Vol. 88, N 6.- P. 1024-1033.

160. Transposon Tn-916 mutagenesis in B.anthracis /В.Е. Ivins, S.L. Welkos, G.B. Knudson, D.J Leblanc //Infect. Immun, -1988. Vol.56. - P.176-181.

161. Turnbull, P.C.B. Definitive identification of Bacillus anthracis /Р.С.В. Turnbull // Abstract Book. 3-rd International Conference on Anthrax University of Plymouth. 1998. - 7-10th September. - P. 12.

162. Uchida, I. Virulence and immunogenicity in experimental animals of Bacillus anthracis strains harboring or lacking 110 Mda and 60 Mda plasmids /I.Uchida, K. Hashimoto, N. Terakado // J. Gen. Microbiol. 1986. - Vol.132. - P.557-559.

163. Validation of the Use of Gamma Phage for Identifying Bacillus anthracis / T. G. Abshire, J. E. Brown, J. D. Teska, C. M.Allan, S. L. Redus, J. W. Ezzel// 4th International Conference on Anthrax. Annapolis, Maryland, USA. 2001. -June 10 -13.-P.-30.

164. Vieu, J.F. et Dauguent C. Lyophilisation des bacteriophages et morpholo-gie du virion / J.F. Vieu, C. et Dauguent //Ann. Jnst.Pasteur. 1966. - Vol.110, №3. -P.447-453.160