Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Бруцеллезные бактериофаги. Оптимизация технологии производства и способов применения в лабораторной диагностике бруцеллеза

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Бруцеллезные бактериофаги. Оптимизация технологии производства и способов применения в лабораторной диагностике бруцеллеза"

На правах рукописи

ЛЯПУСТИНА Лариса Вениаминовна

БРУЦЕЛЛЁЗНЫЕ БАКТЕРИОФАГИ. ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА И СПОСОБОВ ПРИМЕНЕНИЯ В ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ БРУЦЕЛЛЁЗА

03.00.07 - микробиология 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Ставрополь-2004

Работа выполнена в Ставропольском научно-исследовательском противочумном институте

Научные консультанты: доктор медицинских наук,

старший научный сотрудник Геннадий Иванович Лямкин доктор медицинских наук, профессор Александр Николаевич Куличенко

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Анатолий Васильевич Липницкий доктор медицинских наук, старший научный сотрудник

Лидия Васильевна Саяпина

доктор медицинских наук, профессор Валерий Анатольевич Блинов

Ведущая организация: Ростовский-на-Дону научно-исследова-

тельский противочумный институт

Автореферат разослан «_£_» _ 2004 г.

Защита состоится « 5 » октября 2004 г. в 13.00 ч на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 при Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб»

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Слудский А.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Введение

Актуальность проблемы. Среди более чем 180 нозологических форм зоонозных инфекционных заболеваний бруцеллез по-прежнему не утратил своей значимости в связи с масштабами экономического ущерба животноводству и здоровью населения [Черкасский БЛ., Иванова А.А., 1996; Авилов В.М. и др., 1997; Антоненко АД, 2000; Онищенго ГГ, 2002; WHO, 1997].

Если к настоящему времени во многих странах мира, где раньше регистрировалась высокая заболеваемость людей бруцеллезом (Австралия, Англия, США, Новая Зеландия), наблюдается тенденция к полному его искоренению, то в Российской Федерации ежегодно регистрируются до 500 случаев впервые выявленного бруцеллеза [Онищенко ГГ. и др., 1999]. Наиболее неблагополучными по бруцеллезной инфекции являются СевероКавказский, Поволжский, Сибирский регионы России [Калиновский А.И. и др., 1998], на долю административных территорий Южного Федерального округа приходится до 30 % случаев первично выявляемой заболеваемости данной инфекционной патологией [Таран И.Ф. и др., 1999].

Бруцеллёз, как правило, диагностируется уже при развитии хронического процесса, когда практически у каждого четвёртого заболевшего наблюдается стойкая утрата работоспособности. Учитывая, что инфекция возникает в основном у лиц трудоспособного возраста (20-50 лет), затраты на выплаты по инвалидности, на лечение и реабилитацию оказываются значительными. Несмотря на то, что бактериологическое подтверждение инфицирования бруцеллезом на практике регистрируется лишь в 3-10 % наблюдений, выделение культуры возбудителя является абсолютно достоверным подтверждением диагноза заболевания, а установление видовой принадлежности и биовара штамма-изолята имеет решающее значение при эпидемиологическом расследовании, а также определении тактики и объема необходимых противоэпидемических мероприятий.

Лабораторная диагностика бруцеллеза у людей в России проводится согласно методическим указаниям (МУ 3.1.7.1189-03) «Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза людей» [2003], регламентирующим бактериологический, иммуносерологический, молекулярно-генетический и аллергический методы исследования. Осуществляемая в ходе бактериологического анализа данной инфекции межвидовая дифференциация штаммов бруцеллезного микроба, предусматривает использование в комплексной оценке теста на чувствительность штаммов-изолятов к лизирующе-му действию бруцеллезного бактериофага Тб.

В соответствии с рекомендациями объединенного комитета экспертов ФАО/ВОЗ по бруцеллезу [1986] в числе комплексных тестов дифференциации выделенных штаммов бруцелл применяется определение их чувствительности к литическому действию бруцеллезных диагностических бактериофагов Тб (Тбилиси), Fi (Firenze), Wb (Weybridge), Bk2 (Berkley), R-фага.

В настоящее время в Российской Федерации отсутствует коммерческое производство бруцеллезного диагностического бактериофага Тб, а технология производства бактериофагов Wb, Fi, Bk2 и R вообще не разработана. Данные обстоятельства определяют необходимость разработки нормативной документации и создания современной биотехнологической цепи производства бруцеллезных фагов, налаживания выпуска этих диагностических препаратов, отсутствие которых затрудняет выполнение всего комплекса тестов межвидовой дифференциации штаммов возбудителя бруцеллеза.

В связи с тем, что ни один из описанных бруцеллезных фагов не обладает строгой видовой специфичностью литического действия [Corbel M., Thomas E., 1980] представляется важным изучение возможности получения новых видоспецифических препаратов бруцеллезных бактериофагов с использованием для этих целей индуцированного мутагенеза.

Сложность, длительность и комплексность видового определения выделяемых штаммов возбудителя бруцеллеза определяют актуальность разработки и практического внедрения методических подходов, обеспечивающих идентификацию и межвидовую дифференциацию штаммов бруцелл эпидемически значимых видов (Я melitensis, В. abortus, В. suis), в том числе с использованием диагностических бактериофагов.

Цель исследования. Усовершенствовать схему лабораторной диагностики бруцеллеза путем использования на этапах идентификации и дифференциации штаммов бруцелл оптимального набора бруцеллезных диагностических бактериофагов, разработать эффективную и экономичную технологию производства препаратов бруцеллезных бактериофагов, определить пути ее совершенствования.

Основные задачи.

1. Изучить спектры литической активности различных бруцеллезных бактериофагов.

2 Определить оптимальный набор бруцеллезных диагностических бактериофагов для использования на различных этапах бактериологической диагностики бруцеллеза.

3. Изучить возможность использования индуцированного мутагенеза с применением химических соединений для получения новых видоспеци-фических бруцеллезных бактериофагов.

4. Разработать технологию экспериментально-производственного получения бру-целлезных диагностических бактериофагов Тб, Fi, Wb, Bk2 с использованием сред немясного происхождения, вакцинных штаммов размножения, оптимального консерванта.

5. Разработать нормативную документацию (фармакопейную статью предприятия, инструкцию по применению, экспериментально-производственный регламент) для выпуска препаратов бруцеллезных бактериофагов в производственных условиях.

6. Апробировать возможность применения стандартной синтетической питательной среды для репродукции бруцеллезных бактериофагов.

7. Изучить возможность совершенствования отдельных технологических этапов производства бруцеллёзных бактериофагов путём оптимизации условий размножения бактериофагов и режима лиофилизации.

8. Разработать новые методические приемы для определения фагочув-ствительности штаммов возбудителя бруцеллеза различных видов.

9. Усовершенствовать этапы идентификации и дифференциации Brucellae spp. при лабораторной диагностике бруцеллёза за счёт использования оптимального набора бруцеллезных бактериофагов.

Научная новизна и теоретическая значимость:

Впервые определен оптимальный набор фаговых препаратов для использования на различных этапах бактериологической диагностики бруцеллеза.

Разработан ускоренный способ межвидовой дифференциации эпидемически значимых представителей рода Brucella (В. melitensis, В. abortus, В. suis) с использованием теста фагочувствительности и определения аде-ниндезаминазной активности штаммов бруцелл.

На основе сравнительного изучения биокинетических особенностей одиночных циклов размножения бруцеллезных бактериофагов на штаммах возбудителя бруцеллеза с различным уровнем вирулентности подобраны оптимальные условия, позволяющие осуществлять репродукцию фагов с высокой степенью эффективности и обеспечивающие максимальный уровень биологической безопасности технологического цикла.

На основании сравнительного изучения способности бруцеллезного бактериофага переживать состояние анабиоза в результате воздействия низких температур, удаления свободной и связанной влаги подобраны оптимальные криопротекторы и отработаны режимы лиофилизации, обеспечивающие получение конечного высушенного препарата с высоким показателем уровня выживаемости фаговых корпускул (72,48+1,52 %) и удовлетворяющих нормативным требования показателя потери в массе при высушивании (3 % ).

Разработана оригинальная высокопродуктивная методика размножения бруцеллезных бактериофагов в жидкой питательной среде, включающая установление оптимального соотношения (множественность инфекции) концентрации фага и штамма размножения, равного 0,01-0,001, в репродуктивной среде, в которую для обеспечения необратимости и эффективности адсорбции фаговых корпускул на поверхности бактериальной клетки дополнительно внесены сульфат кальция и магния в концентрации 0,001 М каждого. Методика защищена патентом Российской Федерации на изобретение № 2126833.

Экспериментально установлено, что результатом химического индуцированного мутагенеза является получение h-мутантных линий бактериофагов, характеризующихся измененным спектром активности в сторону внутриродового расширения литических свойств. С применением химических мутагенов нитрозогуанидина и этилметансульфоната впервые получены новые линии бруцеллезного бактериофага Тб, обладающие лити-ческой активностью в отношении штаммов бруцелл вида В. melitensis.

Разработан оригинальный способ идентификации бактерий рода Brucella с различным уровнем чувствительности к лизирующему действию бруцеллезных фагов, для обеспечения которого подобраны условия, повышающие степень адсорбции бактериофага на клеточной стенке бруцелл за счет предварительного смешивания взвеси исследуемых штаммов с фагом в соотношении 1:3-1:4, инкубации в течение 20-30 мин при температуре + 36-38 °С и последующим нанесении смеси на агаровые пластинки. Метод защищен патентами Российской Федерации на изобретение № 2010853 и № 2059722.

Предложен новый способ оценки пороговой чувствительности штаммов бруцелл к действию бруцеллезных бактериофагов, заключающийся в приготовлении градиентных фаговых препаратов на бумажных носителях и позволяющий количественно и качественно оценивать чувствительность бруцеллезного микроба к лизирующему действию бактериофагов. Метод защищен патентом Российской Федерации на изобретение № 2147610.

Практическая значимость:

• Разработана технология экспериментально-производственного получения бактериофагов диагностических бруцеллезных жидких Тб, Fi, Wb, Bk2, обеспечивающая соблюдение максимального уровня биологической безопасности технологического цикла, включающая репродукцию их на культурах вакцинных штаммов с применением сред немясного происхождения.

• Составлена нормативная документация (экспериментально-производственный регламент (ЭПР), фармакопейная статья предприятия (ФСП),

инструкция по применению) на бактериофаги диагностические бруцеллезные жидкие, одобренная Ученым Советом Ставропольского научно-исследовательского противочумного института (СгавНИПЧИ) [протокол № 5 от 28.05.2001 г.].

• Три экспериментально-производственные серии препарата «Бактериофаги диагностические бруцеллезные жидкие» успешно прошли контрольные испытания на базе Государственного института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов (ГИСК) им. Л.А. Та-расевича, нормативная документация (ЭПР, ФСП, инструкция по применению) представлена на Ученом Совете ГИСК им. Л.А. Тарасевича, комитетом МИБП утверждена программа Госиспытаний бактериофагов диагностических бруцеллезных жидких и разрешено их проведение [протокол №4 от 24.06.04 г.];

• Бактериофаги диагностические бруцеллезные жидкие прошли лабораторные испытания на базе Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» при Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» (РосНИПЧИ) [акт лабораторного испытания фагов, утвержденный директором РосНИПЧИ «Микроб» В.В. Кутыревым от 15.04.98 г.], депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» и рекомендованы в качестве маточных производственных [справка о депонировании бактериофагов].

• Бактериофаги диагностические бруцеллезные жидкие апробированы в НИИ микробиологии Министерства обороны Российской Федерации при идентификации и межвидовой дифференциации штаммов возбудителя бруцеллеза [акт внедрения, утвержденный начальником НИИ микробиологии Министерства обороны РФ Е.Пименовым от 27.05.03 г.].

• Материалы диссертации использованы при составлении раздела «Бруцеллез» (подраздел «Лабораторная диагностика») в целевых комплексных программах обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения на территории юга России и в Ставропольском крае:

- «Профилактика особо опасных инфекций и санитарная охрана территории Ставропольского края от завоза и распространения конвенционных инфекционных заболеваний на 1993-1995 гг.». Утверждена постановлением главы администрации Ставропольского края 14.10.93 г.;

- «Обеспечение эпидемиологического благополучия по особо опасным и природно-очаговым заболеваниям и улучшение медико-эпидемиологической обстановки на юге России на 1994-1995 гг.». Одобрена решением Совета Ассоциации социально-экономического сотрудничества республик, краев и областей Северного Кавказа 15.05.94 г.;

- «Обеспечение эпидемиологической безопасности по особо опасным и природно-очаговым заболеваниям в регионе Северного Кавказа на 19992002 гг.». Утверждена решением Ассоциации социально-экономического сотрудничества республик, краев и областей Северного Кавказа 10.12.99 г.

• Материалы диссертации вошли в сборник методических документов «Лабораторная диагностика возбудителей опасных инфекционных заболеваний» [Саратов, 1998]; в дополнение к информационному указателю штаммов, депонированных в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» РосНИПЧИ «Микроб» [Саратов, 1999]; в методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации [Саратов, 2000]; в методические рекомендации по индикации особо опасных инфекционных заболеваний (чума, туляремия, бруцеллез, сибирская язва, холера) в СПЭБ и СНЛК в условиях чрезвычайных ситуаций [Ставрополь, 2003] утвержденные директором Став-НИПЧИ 27.02.03 г. [протокол № 2]; в методические рекомендации «Бруцеллез. Эпизоотолого-эпидемиологический надзор, лабораторная диагностика, клиника, лечение, диспансерное наблюдение за больнымт» [Ставрополь, 2003], утвержденные Первым заместителем министра здравоохранения Российской Федерации, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 12.02.04 г.

• Материалы диссертационной работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий на курсах специализации врачей по особо опасным инфекциям при СтавНИПЧИ.

Диссертационная работа выполнена в рамках государственных тем НИР: «Проблемы зоонозов и пути их решения в современных условиях индустриализации сельскохозяйственного производства» (№ Гос. регистрации 018660004639), «Разработка и усовершенствование лабораторной диагностики бруцеллеза» (№ Гос. регистрации 01910047321), «Совершенствование методов и препаратов, используемых для лабораторной диагностики бруцеллеза» (№ Гос. регистрации 01960001790), «Разработка технологии получения бруцеллезных диагностических бактериофагов» (№ Гос. регистрации 01200109093).

Положения, выносимые па защиту:

• Предлагаемые бактериофаги диагностические бруцеллезные Тб, Wb, Fi, Bk2 позволяют с высокой диагностической точностью определять фа-гочувствительность бактерий рода Brucella

• Ускоренный способ межвидовой дифференциации эпидемически значимых представителей рода Brucella (В. melitensis, В. abortus, В. suis) с

использованием теста чувствительности к бактериофагам Тб и Вк2 и определением адениндезаминазной активности штаммов бруцелл эффективен при выполнении данного этапа лабораторной диагностики бруцеллеза.

• Технология экспериментально-производственного получения бруцеллезных диагностических бактериофагов Тб, ^Ъ, И, Вк2 позволяет осуществлять их репродукцию на вакцинных штаммах с использованием сред немясного происхождения, обеспечивает биологическую безопасность технологического цикла и экономический эффект.

• Предложенные криопротекторы и условия лиофильного высушивания обеспечивают высокий уровень выживаемости бактериофагов.

• Применение разработанных препаратов бруцеллезных бактериофагов на бумажных носителях позволяет существенно упростить постановку теста на фагочувствительность при сохранении точности метода.

Апробация работы:.

Материалы диссертации доложены на научных конференциях СтавНИПЧИ [Ставрополь, 1990-2003 гг.].

Материалам диссертации были представлены на областной научной конференции молодых ученых [Ростов-на-Дону, 1989]; на рабочем совещании «Проблемы и перспективы развития диагностики бактериальных инфекций» [Оболенск, 1989]; на межгосударственной научно-профилактической конференции «Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний», посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы [Ставрополь, 1994]; на научно-практической конференции «Эпидемиологические аспекты краевой патологии Ставрополья» [Ставрополь, 1995]; на научно-практической конференции «60 лет противочумной службы Кавказа» [Ставрополь, 1995]; на научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России [Саратов, 1997]; на V и VI итоговых научных конференциях молодых ученых и студентов [Ставрополь, 1997,1998]; на второй международной конференции, посвященной 75-летию института им. Пастера [Санкт-Петербург, 1998]; на юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ [Киров, 1998]; на второй Всероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» [Саратов, 1998]; на международной конференции «Проблемы биологической и экологической безопасности» [Оболенск, 2000]; на 3-ей международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы разработки и производства диагностических питательных сред и тест-систем» [Махачкала, 2001]; на международной научно-практической конференции «Современный эпидемический

потенциал природных очагов чумы», посвященной 10-летию суверенитета Республики Казахстан и 50-летию Талдыкорганской противочумной станции [Талдыкорган, 2001]; на юбилейной научно-практической конференции «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы», посвященной 50-летию Ставропольского научно-исследовательского противочумного института [Ставрополь, 2002].

Публикации. Основные результаты диссертации изложено в 40 опубликованных работах, из них в журналах рекомендуемых ВАК России для публикации основных научных результатов докторских диссертаций - 6, патентов - 4.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 212 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, восьми глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 162 источника на русском языке и 87 - на иностранных языках. Материалы исследований иллюстрированы 35 таблицами и 16 рисунками.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Материалы и методы

В работе были использованы 7 штаммов бруцеллезных бактериофагов (Тб, Wb, Fi, Bk2, R, JP32A, S706), отличающихся по происхождению, источникам выделения и спектрам литической активности.

Сравнительная оценка литических свойств изученных фагов была проведена на 101 штамме бруцелл, полученных из коллекции СтавНИПЧИ, в числе которых: Brucella melitensis - 31 штамм; В. abortus - 26 штаммов; В. suis - 29 штаммов;В. neotomae-2 штамма; В. canis-3 штамма; В. avis-10 штаммов.

Для размножения бруцеллезных бактериофагов были использованы методы их репродукции на бульонной культуре, в слое полужидкого агара, на агаровой культуре, описанные Corbel M., Thomas E. [1980].

При подборе оптимальных сред размножения бруцеллезных бактериофагов были испытаны: мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ), рН 7,2; мясо-пептонный печеночный агар (МППА), рН 7,2; агар Альбимн (2; 0,7 % % ), рН 7,2; бульон Альбими, рН 7,2; эритрит-агар, рН 7,2; агар «Д», рН 7,2; бульон «Д», рН 7,2.

Все среды готовились в лаборатории питательных сред СтавНИПЧИ и перед использованием подвергались качественной оценке питательности согласно методическим указаниям (МУ 3.1.7.1189-03) «Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллёза людей» [2003].

Для сравнительной оценки структуры ДНК бруцеллезных бактериофагов использовали метод их рестрикционного анализа эндонуклеазами Ват HI и Eco Rl («Sigma»,). При этом концентрирование фагов осуществляли полиэтиленгликолем (ПЭГ) 6000 с последующим осаждением и ресуспен-дированием. Выделение ДНК бруцеллезных бактериофагов проводили по методике, описанной Manniatis T. et al. [1984].

Для изучения возможности индуцированных изменений спектра лити-ческой активности бруцеллезных бактериофагов использовали химические мутагены: нитрозогуанидин, нитрозометилмочевину, этилметансульфонат, ICR 191. Воздействие мутагенами на бруцеллезные бактериофаги осуществляли по методике Bautz E., Freese E. [1960].

Лиофилизацию полученных препаратов бруцеллезных фагов проводили на установке для сублимационной сушки LZ.9C производства фирмы «Фригера» (Чехия), используя различные режимы.

2. Результаты и их обсуждение

Несмотря на то, что бактериологический метод диагностики не является определяющим при постановке диагноза бруцеллезной инфекции, выделение возбудителя, определение его видовой принадлежности не только достоверно подтверждает заболевание, но и позволяет назначить адекватное лечение, установить вероятный источник инфицирования, принять соответствующие противоэпидемические меры. Определение видовой принадлежности и установление биовара выделенных штаммов бруцелл согласно рекомендациям Объединенного комитета экспертов ФАО/ВОЗ по бруцеллезу [1986] и методическим указаниям (МУ 3.1.7.1189-03) «Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза» [2003] предусматривающим использование ряда обязательных тестов, в том числе - чувствительность штаммов-изолятов к бруцеллезным бактериофагам, в числе которых определены бактериофаги: Тб, Fi, Wb, Bk2, R [Объединенный комитет экспертов ФАО/ВОЗ по бруцеллезу, 1986] и фагТб [МУ 3.1.7.1189-03].

В то же время не всегда является оправданным использование всего рекомендуемого набора бруцеллезных бактериофагов. Для обоснования выбора применение тех или иных фаговых препаратов при проведении межвидовой дифференциации выделенных культур бруцелл была проведена сравнительная оценка спектров литической активности различных бруцеллезных бактериофагов, имеющихся в коллекции лаборатории бруцеллеза СтавНИПЧИ.

Фаг Тб был получен из Тбилисского института вакцин и сывороток в 1962 г. Исходные образцы бруцеллезных бактериофагов Fi, Wb, Bk2, R

любезно предоставлены М. Corbel в 1980 г. из Центральной ветеринарной лаборатории Вейбриджа (Англия). Фаги S708 и JP32A, описанные Moreira-Jacob M. [1968], любезно предоставлены Ю.К.Кулаковым и В.Н.Гореловым в 1988 г. (лаборатория бруцеллеза научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН).

Литическое действие данных бактериофагов было оценено на штаммах бруцелл, выделенных на территории Северного Кавказа за последние 20 лет, в числе которых 77 штаммов были в стабильной S-форме и 24 штамма -либо в стабильной R-форме, либо в переходной S-R форме. Представительство по видам распределялось следующим образом: В. melitensis - 25 (6 -не в S-форме) штаммов; В. abortus - 22 (4 - не в S-форме) штамма; В. suis -28 (1 - не в S-форме) штаммов; В. neotomae - 2 штамма; В. ovis - 10 штаммов (R-форма), В. canis - 3 штамма (R-форма). Чувствительность бруцелл к литическому действию определялось для двух концентраций бактериофагов: диагностический рабочий титр (ДРТ) и 104 ДРТ.

Анализ результатов показал, что литическая активность бактериофага Вк2 в отношении штаммов возбудителя бруцеллеза не зависела от его разведения. Все штаммы бруцелл в S-форме были чувствительны к лизирую-щему действию обеих концентраций препарата. В то же время фаг не вызывал лизиса штаммов бруцелл в R- и S-R-формах независимо от их видовой принадлежности.

Фаг Тб, как в ДРТ, так и в 104 ДРТ в 100 % наблюдений лизировал штаммы бруцелл видов В. abortus и В. neotomae, находящиеся в S-форме. Ана-логичными-свойствами по отношению к штаммам данных видов обладал и бактериофаг Fi.

Гораздо более низкая активность указанных фагов была в отношении штаммов бруцелл вида В. suis. Бактериофаг Fi в ДРТ лизировал 8 (28,6 %), а в концентрации 104 ДРТ - 14 (50,0 %) представителей этого вида; фаг Тб в ДРТ не обладал активностью в отношении штаммов В. suis, а в 104 ДРТ вызывал лизис только 3 (10,7 %) изученных штаммов.

Все используемые в эксперименте штаммы возбудителя бруцеллеза видов В. abortus, В. neotomae, В. suis в S-форме были чувствительны к литическому действию бактериофага Wb обеих концентраций.

Бактериофаг S708 в отношении изучаемых штаммов бруцелл обладал активностью почти аналогичной таковой у фага Wb, спектр действия бактериофага JP32A соответствовал таковому у фага Fi.

В проведенных экспериментах не удалось установить наличия лизиру-ющего действия бактериофага R на штаммы возбудителя бруцеллеза, на-

холящихся либо в стабильной R-, либо в переходной S-R-формах. Литические свойства бактериофага проявлялись только в отношении 15 штаммов (68,2 %) бруцелл вида В. abortus в S-форме, а в концентрации 104 ДРТ данный фаг дополнительно лизировал 3 штамма (10,3 %) бруцеллезного микроба вида В. suis также в стабильной S-форме.

Анализ полученных данных позволил сделать заключение о возможности и целесообразности использования пробы на чувствительность к бруцеллезному фагу Вк2 в качестве одного из критериев идентификации микроорганизмов рода Brucella, поскольку этот препарат обладает специфичностью лизирующе-го действия в отношении бруцелл всех видов в стабильной S-форме.

Для межвидовой дифференциации штаммов возбудителя бруцеллеза эпидемически значимых видов (В. melitensis, В. abortus, В. suis) в качестве теста на фагочувствительность остается целесообразным применение только фага Тб, поскольку в ДРТ данный бактериофаг обладает видоспецифич-ностью литического действия в отношении штаммов бруцелл вида В. abortus.

В то же время оценка чувствительности штаммов возбудителя бруцеллеза к лизирующему действию набора бруцеллезных бактериофагов (Тб, Wb, Fi, Bk2) целесообразна для углубленного изучения штаммов при научных исследованиях в специализированных лабораториях.

Поскольку в наших экспериментах не удалось подтвердить данные, описанные Corbel M., Thomas E. [1985], о литической активности бактериофага R в отношении R-штаммов бруцелл, использование данного препарата для межвидовой дифференциации штаммов возбудителя бруцеллеза не представлялось возможным.

Литическая активность бактериофагов S708 и JP32A практически полностью совпадала с таковой у фагов Wb и Fi соответственно, поэтому дополнительное их включение в тест на фагочувствительность является нецелесообразным.

Таким образом, было показано, что в настоящий момент стабильными бактериофагами, применение которых необходимо для идентификации и межвидовой дифференциации штаммов возбудителя бруцеллеза остается набор фагов, включающий бактериофаги Тб, Wb, Fi, Bk2.

Сложность и длительность межвидовой дифференциации представителей рода Brucella определяется отсутствием до настоящего времени единого универсального диагностического теста, что предусматривает применение комплексной оценки по ряду признаков, включая и определение чувствительности к лизирующему действию бруцеллезных диагностических бактериофагов. В связи с этим вопрос о получении или выделении строго видо-специфичес-ких бруцеллезных бактериофагов представляется актуальным.

Одним из подходов, определяющих возможность получения фагов с заданными свойствами, является индуцированный мутагенез с использованием химических соединений [Черник Т.П., Серебряный A.M., 1972; Кривиский А.С. и др., 1973; Петренко В.А и др., 1982; Bautz E., Freese E., 1960; Bautz-Freese E., Freese E., 1961; Corbel M, 1977]. В связи с чем была изучена возможность получения линий фаговых препаратов с измененным спектром литической активности с применением химических мутагенов. Для этих целей были использованы алкилирующие соединения: нит-розогуанидин (НГ), нитрозометилмочевина (НММ), этилметансульфонат (ЭМС) и мутаген типа ICR191. Местом приложения действия данного класса химических препаратов в молекуле ДНК являются N-1,-3,-7 позиции аденина, N-3,-7 и 0-6 позиции гуанина, N-3 и 0-4 позиции тимина. Механизм мутагенного эффекта связан с индуцированием транзиций и трансверсий [Рапопорт И.А. и др., 1980].

Известно, что степень проявления мутагенной активности зависит от концентрации препаратов и длительности их воздействия. При этом наиболее выраженный эффект проявляется при условиях обработки, приводящих к 50-70 % гибели фаговых корпускул [Стрельчук С.Н., 1981]. Используя различные концентрации мутагенов, было установлено, что, независимо от вида бактериофага, оптимальной для ожидаемого мутагенного воздействия является концентрация препаратов, равная 2 мг/мл. Построив кривые выживаемости бруцеллезных фагов от времени их экспозиции с мутагенами, были определены уровни 50-70 % летального эффекта последних. Показано, что НГ обеспечивал данное действие в диапазоне 28-38-часовой экспозиции, ICR191 -22-32-часовой, ЭМС-26-36-часовой, а НММ - 32-54-часовой.

Оценку влияния мутагенов на литические свойства бактериофагов проводили путем определения способности серий фагов, подвергшихся различной длительности воздействия мутагенными агентами, лизировать и размножаться изолированно на штаммах бруцелл вида В. melitensis.

При обработке бактериофагов данными препаратами вероятность индукции фаговых мутантов с новыми свойствами по изучаемому признаку является минимальной. Поэтому для увеличения возможности регистрации появления фаговых клонов с измененным спектром литической активности, мутагенами обрабатывали цельные суспензии бактериофагов. В результате были получены 16 серий бруцеллезных фагов Тб, Wb, Fi, Bk2, подвергшихся обработке НГ, НММ, ЭМС и ICR191. Длительность воздействия мутагенов составляла средние значения в пределах промежутка времени, в течение которого наблюдалась 50-70 % инактивация бактериофагов.

В качестве тестовых были использованы 31 штамм бруцелл вида В. melitensis. Пробу с бактериофагами проводили двуслойным методом. Посевы выдерживали в течение 5 сут при 37 °С с ежедневным контролем наличия негативных колоний. При появлении последних они изолированно отбирались в 1-2 мл бульона Альбими, который инкубировали в течение (12+1) ч при +4 °С, после чего центрифугировали 20 мин при 8000 об/ мин. Полученный супернатант вновь оценивали на литическую активность в отношении тех же штаммов.

Изучение воздействия мутагенов на литические свойства бактериофага Вк2 предусматривало селекцию мутантных линий фага, которые бы обладали активностью изолированно в отношении штаммов бруцелл вида В. melitensis и утрачивали способность лизировать культуры возбудителя бруцеллеза видов В. abortus, В. suis, В. neotomae, находящиеся в стабильной S- форме. Наш интерес в получении бруцеллезного монофага, способного проявлять активность только в отношении штаммов бруцелл ко-зье-овечьего вида, определялся особенностью эпизоотологической ситуации по бруцеллезу в регионе Северного Кавказа, связанной с циркуляцией среди сельскохозяйственных животных в основном штаммов бруцеллезного микроба вида В. melitensis.

Проведенные исследования показали, что независимо от используемого мутагена, все линии бактериофага Вк2 сохраняли спектр своей активности в отношении штаммов В. melitensis, находящихся в стабильной S-форме, а также S-вариантов бруцелл видов В. abortus, В. suis, В. neotomae.

Таким образом, бактериофаг Вк2 в результате воздействия мутагенов сохранил неизвенным спектр своей литической активности в отношении гладких вариантов штаммов бруцеллезного микроба 4-х видов.

В результате воздействия НГ и ЭМС на бактериофаги Тб и Fi были отобраны и в дальнейшем пропассированы на несвойственных хозяинных штаммах (В. melitensis) две мутантные фаговые линии, которые обладали более широким спектром литической активности, чем их исходные варианты. В результате последовательных 10-кратных пассажей получены две стабильные мутантные линии фаговых препаратов: Тб (НГ) и Fi (ЭМС), имеющие достаточную концентрацию ~ 6х105бляшкообразующих единиц (БОЕ)/мл, что позволило оценить их литическую активность в отношении 83 штаммов бруцелл видов В. melitensis, В. abortus, В. suis, В. neotomae в стабильной S-форме.

В результате проведенных исследований было показано, что расширение спектра активности полученных линий бактериофагов проявлялось в

способности последних дополнительно вызывать лизис представителей рода Brucella козье-овечьего вида при сохранившейся активности в отношении штаммов бруцелл видов В. abortus, В. suis и В. neotomae. При этом чувствительность культур бруцелл вида В. melitensis к действию данных фагов составляла порядка 50 %.

Аналогичным образом была проведена селекция линий бруцеллезных бактериофагов, подвергшихся воздействию мутагенов, в отношении штаммов возбудителя бруцеллеза, находящихся в стабильной R-форме. Было отмечено, что наибольшее мутагенное действие в отношении фагов бру-целл имеет НГ, который индуцировал появление линии бруцеллезного бактериофага Тб, обладающей активностью в отношении R-штаммов бру-целл вида В. abortus. Но эти индуцированные свойства бактериофага Тб не проявляли высокой степени стабильности и специфичности и были утрачены в течение 20 дней хранения препарата в условиях холодильника.

На основании полученных результатов следует заключить, что при индуцированном мутагенезе с использованием химических соединений были получены h-мутантные линии бруцеллезных бактериофагов. Однако спектр литической активности этих фаговых препаратов изменялся не в сторону его сужения до видоспецифичности, а характеризовался расширенным диапазона литических свойств за счет штаммов вида В. melitensis, по сравнению с исходными вариантами.

Учитывая морфологические, физические, химические и антигенные свойства, бруцеллезные бактериофаги принадлежат к одному семейству [Попхадзе М.З., Антадзе И. А., 1983; Corbel M., Thomas Е., 1980; Ackerman Н. et al., 1982; Matthews R., 1982]. Тем не менее, каждый из них имеет определенный диапазон литической активности и эффективность размножения на штаммах бруцелл различных видов.

В связи с изложенным представляло научный интерес сравнительное изучение геномов (ДНК) референтных и полученных мутантных линий бруцеллезных бактериофагов для возможной расшифровки механизмов относительной специфичности их литического действия.

Определение размеров ДНК фагов бруцелл показало их абсолютную идентичность: независимо от вида бактериофага размер их генома составлял приблизительно 25,1 мД. Проведенный рестрикционный анализ фаговых ДНК с использованием эндонуклеаз Eco R1 и Bam HI установил их полную идентичность по картине рестрикции.

Независимо от использованной фаговой ДНК при рестрикции эндонук-леазой Bam H1 были получены два фрагмента, размер которых составлял

приблизительно 18 и 7 мД (рисунок 1). Использование рестриктазы Eco R1 установило наличие четырех фрагментов размером 10,0; 8,1; 6,0; 1,0 мД (рисунок 2) при исследовании ДНК каждого из изученных бруцеллезных бактериофагов. В экспериментах также не было определено каких-либо различий в структуре ДНК мутантных линий бактериофагов.

Рисунок 1 - Электрофореграм-ма рестрикции ДНК бруцеллезных бактериофагов с использованием эндонуклеазы BamHI

Рисунок 2 - Электрофореграм-ма рестрикции ДНК бруцеллезных бактериофагов с использованием эндонуклеазы EcoRI

Обозначения: 1 - бактериофаг л Hind III; 2 - бактериофаг Тб; 3 - бактериофаг Wb; 4 - бактериофаг Fi; 5 - бактериофаг Вк2; 6 - бактериофаг Тб (НГ); 7 -бактериофаг Fi (ЭМС)

Полученные данные полностью подтверждают результаты Segondy М. й а1. [1988] и Ш§Ъу С. й а1. [1989] о генетической идентичности бактериофагов бруцелл.

В то же время можно предположить, что относительно специфический хозяинный диапазон бруцеллезных фагов связан или с минимальными различия в структуре участков ДНК, кодирующих синтез белков базальной пластины бактериофагов, или со структурными особенностями фаговых рецепторов бактериальных клеток бруцелл различных видов и различиями в их доступности. Последним, по-видимому, можно объяснить частичный лизис нечувствительных штаммов бруцелл при увеличении концентрации фагов.

Биотехнология производства изучаемых бактериофагов бруцелл являлась одним из главных вопросов, решаемым в нашем исследовании. Этот этап работы включал: выбор питательных сред, определение методов репродукции бактериофагов и возможные пути их оптимизации; подбор штаммов размножения фагов; определение методов консервации, условий и сроков хранения конечного продукта производства.

Факторы, которые влияют на эффективность размножения бруцеллезных фагов на разных хозяевах, включают: рН репродуктивной среды; питательное соответствие среды штамму размножения; наличие двухвалентных и поливалентных катионов и анионов, а также амфотерных соединений - аминокислот.

Первоначально в серии экспериментов осуществлялся подбор сред размножения. В настоящее время в сложившихся экономических условиях постоянно возникает вопрос о возможности применения для производства различного рода диагностических препаратов сред, содержащих немясное сырье. В связи с этим было проведено сравнительное изучение эффективности репродукции бруцеллезных бактериофагов на мясных средах (мясо-пептон-ный печеночный бульон, бульон Мартена) и на средах на основе дрожжевого (бульон Альбими) и рыбного гидролизатов (бульон Д).

В то же время была проведена оценка возможности использования более стандартных синтетических питательных сред для репродукции бруцеллезных диагностических бактериофагов. В качестве таковой была апробирована разработанная нами синтетическая питательная среда (патент Российской Федерации на изобретение № 2148638), которая обеспечивала достаточный рост и выход биомассы представителей всех известных видов бруцелл и в данном случае применялась в жидком виде.

Установлено, что для репродукции бруцеллезных бактериофагов с успехом можно использовать среды немясного происхождения (бульон и агар Альби-ми), при этом среднее значение концентраций фаговых препаратов составляло (2,0+0,4)х10и БОЕ/мл, что сопоставимо с концентрацией бактериофагов, получаемых на средах на основе мясного сырья ((2,13±0Д)х 1011 БОЕ/мл).

В то же время было показано, что в качестве среды выбора для репродукции бруцеллезных бактериофагов можно использовать синтетическую питательную среду, заданного химического состава, которая обеспечивала размножение бруцеллезных бактериофагов с достаточной эффективностью (-1010 БОЕ/мл), но в несколько более поздние сроки (3-5 сут).

При сравнительной оценке способов размножения фагов (на бульонной культуре, в слое агаровой культуры, на агаровой культуре) было установлено,

что наилучший выход конечного продукта производства давала методика репродукции бактериофагов в слое агаровой культуры. Однако, учитывая трудоемкость осуществления данного способа размножения при коммерческом производстве бактериофагов, было определено, что ее применение возможно только для репродукции бруцеллезного фага Вк2, воспроизводство которого в достаточной конечной концентрации (107Б0Е/мл и более) не удалось осуществить двумя другими способами.

Было показано, что в качестве метода выбора для размножения бактериофага Вк2 можно применять метод репродукции его на бульонной культуре штамма-размножения, с использованием в качестве жидкой питательной основы разработанную нами синтетическую питательную среду.

Препарат бруцеллезного диагностического фага Вк2, размноженный указанным образом, имел конечную концентрацию, превышающую таковую у аналогического препарата, полученного на жидких питательных средах мясного и немясного происхождения, что объяснялось стандарти-зованностью условий приготовления среды и ее состава и содержанием в использованной синтетической среде дополнительных источников углерода, минеральных солей, аминокислот и витаминов, обеспечивающих необратимость процесса адсорбции фаговых корпускул и эффективность их репродукции в бактериальной клетке.

Несмотря на то, что процесс приготовления синтетической питательной среды является более трудоемким и дорогостоящим, а получения бактериофага высокой концентрации требует большего времени (до 5 сут), в определенных условиях она может быть рекомендована в качестве среды-выбора для репродукции бруцеллезного фага Вк2.

Согласно используемым в настоящее время методикам [Corbel M., Thomas Е., 1980] размножение фагов Wb и Вк2 осуществляется на вирулентных представителях рода Brncella (В. suis 1330, В. mehtensis Isfahan или В. melitensisIspania соответственно), для воспроизводства бактериофагов Тб и Fi используется вакцинный штамм В. abortus 19.

Технологический цикл получения фаговых препаратов предусматривает ряд процессов (центрифугирование, фильтрация), которые являются небезопасными для персонала, занятого в производстве. В связи с чем была изучена возможность применения для репродукции фагов Wb и Вк2 вакцинных аналогов бруцеллезного микроба (В. suis 61 и В. melitensis Revl) вместо рекомендуемых вирулентных штаммов.

Для обоснования возможности использования при репродукции бактериофагов в сравнительном аспекте были изучены циклы их одиночного

размножения на типичных штаммах-кормилках и на предлагаемых вакцинных культурах. При этом основными сравниваемыми критериями являлись длительность латентного периода размножения и выход фагового потомства на одну инфицированную микробную клетку.

Проведенные исследования показали, что процесс воспроизводства бактериофагов на вакцинных штаммах характеризовался некоторым удлинением латентного периода размножения (до 2,5-3 ч) по сравнению с репродукцией на вирулентных культурах (2-2,5 ч) при достоверном, хотя и незначительном увеличении (4-8 %) выхода фагового потомства.

Предложенные (В. suis 61 и В. melitensis Revl) и регламентированный (В. abortus 19) штаммы были апробированы для размножения бруцеллезных бактериофагов на отобранных нами средах (агар и бульон Альбими) с применением соответствующих методических приемов репродукции: для фагов Тб, Wb, Fi воспроизводство осуществлялось на бульонных культурах, для бактериофага Вк2 - в слое агаровой культуры. В результате были получены фаговые препараты с конечной концентрацией, удовлетворяющей нормативным требованиям (109 11 БОЕ/мл).

Таким образом, использование в технологии производства бруцеллезных фагов при их размножении только вакцинных штаммов возбудителя бруцеллеза (В. abortus 19 - для бактериофагов Тб и Fi, В. suis 61 - для фага Wb, В. melitensis Revl - для бактериофага Вк2) обеспечивало биологическую безопасность технологического цикла, а, следовательно, и снижение вероятного риска заражения специалистов, занятых в производстве.

Одним из важных аспектов биотехнологии получения бактериальных препаратов является обеспечение условий, исключающих контаминацию посторонней микрофлорой конечного продукта. Технологическая схема производства фаговых препаратов не является исключением, так как она многостадийна и в ходе технологического цикла приходится манипулировать с достаточно обогащенными питательными средами и большими объемами жидких препаратов.

В связи с этим в нашу задачу входил подбор химических веществ, которые, препятствуя контаминации фильтрата и обеспечивая надежность его специфического обеззараживания, не оказывали бы влияния на выживаемость и свойства фагов в процессе приготовления и длительного хранения.

В качестве консервантов были испытаны: хлороформ и толуол. Первый из данных препаратов широко применяется для консервации различных бактериофагов [Габрилович И.М., 1968], второй-был рекомендован Corbel М, Thomas E. [1980] в качестве ингибитора посторонней микрофлоры при получении жидких препаратов бруцеллезных бактериофагов.

В наших экспериментах хлороформ и толуол вносили в фаголизаты до этапов центрифугирования и фильтрации, что дополнительно создавало условия биологической безопасности данных стадий технологического цикла. Конечная концентрация консервантов в фаголизатах составляла: 0,25; 0,5; 0,75; 1 %%. При этом первоначально в течение 30 мин обеспечивалось активное взаимодействие консерванта с фаголизатом при энергичном встряхивании, затем смесь инкубировали в условиях холодильника (+ 4 °С) в течение 12-14 ч, после чего фаголизат подвергали дальнейшей очистке путем центрифугирования и фильтрации.

В полученных препаратах бактериофагов оценивали выживаемость фаговых корпускул в зависимости от примененного химического агента и его концентрации в препарате.

В экспериментах были зарегистрированы существенные различия во влиянии использованных консервантов на данный показатель. Выраженное инак-тивирующее действие на фаги оказывал хлороформ. Даже минимальная концентрация препарата (0,25 %) вызывала значительное достоверное (р<0,01) снижение исходных концентраций бактериофагов, обеспечивая в среднем независимо от вида фага выживаемость, равную 51,98+0,5 % от исходной.

Применение толуола не вызывало заметного снижения жизнеспособности фаговых корпускул, среднее значение данного показателя, независимо от концентрации толуола, составляло 94,2+0,65%. При этом определялась незначительная, хотя и достоверная (р<0,01), тенденция к снижению выживаемости бактериофагов при увеличении концентрации толуола до 1 %.

На основании полученных данных для использования в качестве консерванта жидких препаратов бруцеллезных бактериофагов было отдано предпочтение применению толуола до 0,25 % и 0,5 % в препарате.

Использовав подобранные оптимальные условия репродукции, были получены по 3 экспериментальных серии бруцеллезных бактериофагов Тб, И, Ж), размноженных на вакцинных штаммах в бульоне по предложенной методике и по 3 серии бактериофага Вк2, полученных путем репродукции в слое агаровой культуры и на жидкой синтетической питательной среде. Каждая из серий фагов была произведена с использованием различных концентраций консервирующего агента (0,25 % и 0,5 % толуола в конечном продукте).

Препараты бактериофагов были стандартизованы по ряду показателей: количественных (концентрация и ДРТ) и качественных (специфичность и специфическая активность). .

Концентрация серий фаговых препаратов была различна и составляла в среднем, независимо от содержания консерванта, для бактериофага Тб -

(2,7±0,7)хЮ12Б0Е/мл,ДЛЯ фага Fi-(5,2±0,4)х1012БОЕ/мл, Wb-(l,3±0,8)xl0M, Вк2, полученного на синтетической питательной среде,-(7,9+0,5)хЮ8Б0Е/ мл и (1,9±0,8)х10и БОЕ/мл, полученного в слое полужидкого агара. Было установлено, что ДРТ фагов не зависел от серии препаратов и для бактериофагов Тб, Wb, Bk2 составлял 10-4, для фагаFi- 10-5

Специфичность и специфическая активность экспериментальных серий бруцеллезных бактериофагов оценивалась по диапазону литических свойств в отношении штаммов бруцелл 3 видов (В. abortus, В. melitensis, В. suis) в стабильной S-форме. При этом было показано полное соответствие изученных свойств фагов с таковыми у их референтных образцов.

Одним из параметров биотехнологического процесса производства диагностических препаратов является определение сроков их годности и установление оптимального температурного режима хранения. С этой целью по 3 серии стандартизованных препаратов бруцеллезных диагностических бактериофагов (Тб, Fi, Wb, Bk2) были разлиты в ампулы по 2 мл и в запаянном виде хранились в различных условиях: в холодильнике - при температуре + 4 °С; в условиях термостата - при 37 °С; при комнатной температуре - 18-22 °С. Ежегодно в течение 6 лет проводилось определение количественных и качественных показателей препаратов.

Было показано, что выживаемость нативных препаратов бруцеллезных бактериофагов обратно пропорциональна температуре и времени хранения. При этом оптимальными условиями для жидких форм бруцеллезных фагов является температурный режим, равный + 4 °С. Данные условия в течение первых двух лет наблюдения обеспечивали сохранение жизнеспособности препаратов в пределах 90 % от исходной. Другие испытанные температурные режимы хранения (18-22,37 °С) приводили к резкому снижению выживаемости фаговых препаратов (2,5±0,2 %) уже в течение первого года наблюдения.

В результате проведенной серии экспериментальных исследований были предложены биотехнологические схемы (рисунки 3,4) экспериментально-производственного получения бруцеллезных диагностических бактериофагов (Тб, Wb, Fi, Bk2). При этом основополагающими технологическими моментами производства фагов являлись следующие: репродукция бактериофагов Тб, Wb, Fi осуществляется на бульонных культурах соответствующих вакцинных штаммов размножения с использованием сред немясного происхождения (бульон Альбими); размножение бруцеллезного бактериофага Вк2 в технологической схеме производства предусматривает его репродукцию на вакационном штамме в слое агаровой культуры также с использованием сред немясного происхождения (агар Альбими).

Рисунок 3 - Биотехнологическая схема экспериментально-производственного получения бруцеллезных диагностических бактериофагов Тб, ШЬ, К.

Рисунок 4 - Биотехнологическая схема экспериментально-производственного получения бруцеллезного диагностического бактериофага Вк2 эффективную репродукцию фага в ней.

В связи с тем, что в ряде случаев (генетические исследования) имеется необходимость наработки фаговых препаратов, имеющих более высокие значения конечных концентраций, нами была предложена и апробирована оригинальная методика оптимизации условий размножения бруцеллезных бактериофагов. При разработке данного способа осуществлялись: подбор состава среды размножения; определение оптимального соотношения количества фаговых корпускул и бактериальных клеток при воспроизводстве и условий репродукции, обеспечивающих необратимую адсорбцию бактериофага на поверхности бактериальной клетки и

Поскольку доступность получения бруцеллезных бактериофагов Тб, ^Ъ, И обеспечивалась их репродукцией на бульонных культурах штаммов размножения, отработка методики репродукции первоначально осуществлялась для указанных фаговых препаратов.

Согласно литературным данным [Гольдфарб Д.М., 1961; Адаме М., 1961] одним из главных этапов взаимодействия бактериофагов с микробной клеткой является адсорбции фаговых корпускул на поверхности клетки. Обратимость процесса адсорбции, а также его скорость во многом зависит от присутствия в среде катионов одновалентных и двухвалентных металлов и в дальнейшем определяет возможность размножения бактериофага в инфицированной микробной клетке. При этом оптимальным является концентрация одно- и двухвалентных катионов, равная 0,01 М и 0,001 М соответственно [Веишег I. й а1., 1957; Веишег-1осЬшаш М.-Р. й а1., 1959]. Было показано, что добавление в среду катионов Са2+ усиливает адсорбцию фага на поверхности бактериальной клетки, способствует переходу обратимой фазы адсорбции в необратимую и позволяет осуществлять быструю пенетрацию фага в клетку [Гольдфарб Д.М., 1961; Веишег-ТосЬшаш М.-Р. е! а1., 1959]

В качестве катионных добавок одновалентных ионов нами были использованы соли: хлорид натрия и калия, двухвалентных - сульфат магния и кальция, которые вносились в концентрации 0,1 М - 0,001 М (интервал 0,05 М) в бульон Альбими (рН 7,2), как изолированно, так и в парном сочетании.

Было показано, что дополнительное внесение в среду размножения сульфатов кальция и магния в концентрации 0,001 М каждого, обеспечивало получение фаговых препаратов с конечной концентрацией на 1-2 порядка превышающей для образцов, полученных по традиционной методике.

При репродукции бактериофагов количественный выход потомства во многом определяется множественностью инфекции, т.е. количеством фаговых корпускул, приходящих на одну микробную клетку. Как показали исследования Бе1Ъшск. М. [ 1940], если на одну микробную клетку приходится

около 200 частиц фага, палочковидные бактерии относительно быстро приобретают овальную или сферическую форму, а затем совсем исчезают. Последний процесс, названный «лизисом извне», никогда не сопровождается освобождением жизнеспособных частиц фага. При средней множественности инфекции часть популяции бактерий лизируется с нормальным выходом фага, тогда как остальная часть популяции претерпевает непродуктивный «лизис извне».

В экспериментах были апробированы следующие значения показателя множественности инфекции: 0,1; 0,01; 0,005; 0,001; 0,0001. Обеспечение данного показателя достигалось путем добавления к 0,1 мл взвеси культуры штамма размножения (концентрации 1хЮ9 микробных клеток (м.к.)/мл) бактериофага в количестве 0,1 мл в концентрации 1x10е, ШО^хЮ6,1Х106, ШО'БОЕ/мл.

Проанализировав полученные результаты, было установлено, что наибольший выход бактериофага независимо от изучаемой системы фаг-бактерия наблюдался при множественности инфекции, равной 0,01; 0,005; 0,001. Повышение или снижение значения данного показателя хотя и приводило к репродукции бактериофага, но давало более низкий выход фагового потомства.

Суммировав полученные результаты, была предложена оригинальная методика оптимизированного размножения бруцеллезных бактериофагов на бульонных культурах [патент Российской Федерации на изобретение № 2126833]. Взвесь штамма-размножения готовили до концентрации 1х109 м.кУ мл в бульоне, содержащем дополнительно сульфат кальция и магния в количестве 0,001 М каждого, и инкубировали ее в течение 4-6 ч при 37 °С. К 0,1 мл этой взвеси добавляли гомологичный бактериофаг в количестве, обеспечивающем множественность инфекции, равную 0,01 - 0,001 (т.е. приблизительно 1х107- 1х106 БОЕ/мл). Смесь прогревали в течение 30 мин при 37 °С, после чего разбавляли 100 мл бульона и инкубировали 24-36 ч при 36 °С. Фаголизат центрифугировали в течение 20 мин при 8000 об/мин и фильтровали через мембранные фильтры с размером пор 0,45 мкм.

Оптимизация репродукции бактериофага Вк2 предполагала не столько обеспечение выхода продукта производства высокой конечной концентрации, но и отработку, в отличие от размножения данного фага в слое полужидкого агара, более простой технологии его воспроизводства, что включало применения методики репродукции бактериофага на культуре штамма-размножения с использованием в качестве среды размножения жидкой синтетической питательной среды заведомо известного состава с дополнительным обогащением ее сульфатом кальция в количестве 0,001 М

при описанных выше показателях множественности инфекции (0,01 -0,001).

При этом были получены препараты данного фага с высоким уровнем конечной концентрации ((7,3±0,6)х108 БОЕ/мл) и отмечено сокращение сроков репродукции до 4 сут по сравнению с использованием базовой методики размножения бактериофага Вк2 на жидкой синтетической питательной среде.

Описанная оригинальная методика размножения была оформлена в виде заявки на предполагаемое изобретение «Способ репродукции бруцеллезного бактериофага» [заявка № 2003118164 от 23.06.03 г.].

В настоящее время одним из наиболее эффективных способ сохранения исходных свойств микробиологических объектов является метод лио-фильного высушивания, основанный на предварительном их замораживании и непосредственном высушивании при температуре, обеспечивающей щадящее удаление свободной и связанной влаги [Никитин Е.Е., Звягин И.В., 1971; Фадеева Л Л., 1977; Белоус A.M., Гриценко В.И., 1994].

Было показано [Перемитина Л.Д., 1972; Брандишевский Ю.В., 1976; Шиганова Л.Б., 1982; Фадеева Л Л. и др., 1987], что при правильной подготовке к высушиванию бактериофагов обеспечивается минимальная потеря активности препарата, что способствует длительному сохранению их биологических свойств.

При этом основными условиями, которые необходимо определить при разработке данного способа стабилизации диагностических препаратов, являются подбор криопротекторов и режимов лиофилизации.

В проведенных экспериментах были испытаны 5 описанных и наиболее эффективно используемых для лиофилизации фаговых препаратов стабилизирующих систем: 5 % раствор бессолевого пептона; 20 % раствор лактозы; 10 % раствор глютамата натрия; пептоно-желатиновая и сахаро-зо-желатиновая среды.

Критериями отбора апробируемых криопротекторов служили показатели выживаемости и потери в массе в лиофилизированных препаратах. Независимо от вида бруцеллезного бактериофага для их лиофильного высушивания по критерию выживаемости, было отдано предпочтение использованию 20 % раствора лактозы и пептоно-желатинового стабилизатора, которые обеспечивали сохранение 70-75 % жизнеспособных фаговых корпускул в сухом фаговом препарате.

Одним из важных критериев, определяющих свойства лиофилизирован-ных форм, является показатель потери в массе при высушивании. Для бруцеллезных бактериофагов было установлено преимущество применения

пептоно-желатинового криопротектора в качестве стабилизатора процесса лиофилизации. Оцениваемый показатель в сухих препаратах фагов составлял 2,73+0,17 %, что удовлетворяло нормативным требованиям (не более 3 %).

С целью снижения себестоимости производства и оптимизации процесса лиофилизации обычно осуществляют ряд последовательных сушек с различными режимами прогрева плит и контролем качество продукта на выходе. Исходя из того, что для каждого бактериофага и защитной среды оптимальный режим высушивания может иметь различающиеся параметры, были испытаны три режима лиофилизации, которые отличались, в основном, диапазоном температурных колебаний, а, следовательно, и скоростью высушивания препаратов.

Во всех наблюдениях предварительное замораживание препаратов проводили в течение 6 ч при температуре -40 °С. В дальнейшем были использованы: 18-часовой режим лиофилизации, при котором сублимация материала (как процесс удаления основной влаги) проходила 10 ч, а процесс досушивания составлял 8 ч при конечной температуре подогрева, равной 27 °С; 14-часовой -процесс удаления основной влаги осуществлялся в течение 8 ч, удаление связанной влаги при температуре нагрева, равной 45 °С, - в течение 6 ч; 12-часовой, при котором удаление основной влага проводили за 6 ч, удаление связанной влаги при температуре нагрева, равной 65 °С, - в течение 6 ч.

Влияние примененных режимов лиофилизации на бруцеллезные бактериофаги оценивали по степени сохранения жизнеспособных фаговых корпускул в сухих фаговых формах.

Выживаемость фаговых корпускул прямо пропорционально зависела от конечной температуры досушивания препарата. Установлено, что 18-часовой режим лиофилизации обеспечивал наилучшие результаты по показателю выживаемости фагов в конечном продукте производства (72,48+1,52 %). Использование обеих сред высушивания (лактоза, пептоно-желатиновая) давало практически равнозначные результаты. Более жесткий из примененных режимов, при котором досушивание препаратов осуществлялось при температуре 45 °С, обеспечивал также получение сухих форм в определенной степени удовлетворяющих требованиям производства: средняя выживаемость бактериофагов, независимо от используемого стабилизатора, составляла 46,52+2,14 %, при некотором преимуществе применения 20 % раствора лактозы.

Следует отметить, что при таком режиме лиофилизации улучшался показатель потери в массе при высушивании для лактозного стабилизатора, составляя 2,96+0,16 %, и стал удовлетворять нормативным требованиям.

Применение самого жесткого режима лиофилизации (продолжительность 12 ч, досушивание при 65 °С) показало неудовлетворительные результаты: выживаемость составляла около 3 % в сухих препаратах бактериофагов.

Оценка использования различных концентраций толуола (0,25 и 0,5 %%) в качестве ингибитора посторонней микрофлоры при проведении лиофи-лизации препаратов бруцеллезных бактериофагов продемонстрировала преимущество 0,5 % раствора толуола, обеспечивающего стерильность конечного продукта производства при сохранении исходных свойств препаратов на достаточно высоком уровне. Более низкая концентрация консерванта не исключала возможности контаминации конечного продукта посторонней микрофлорой.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов был установлен оптимальный режим лиофилизации бруцеллезных бактериофагов, при котором в качестве стабилизирующей системы использовался пептоно-же-латиновый стабилизатор, весь процесс получения сухой формы препаратов составлял 24 ч, из которых 6ч- это процесс предварительного замораживания, а 18 ч - процесс непосредственного лиофильного высушивания.

В то же время показана возможность применения в качестве метода выбора более жесткого 14-часового режима лиофилизации (досушивание при 45 °С) с применением лактозного или пептоно-желатинового стабилизаторов, обеспечивающего удовлетворительные показатели выживаемости фаговых корпускул и потери в массе при высушивании (менее 3 %).

Определение сроков годности сухих препаратов фагов проводилось для форм, которые были получены при первом (18-часовой цикл) и втором (14-часовом цикл) режимахлиофилизации для температур: +4 °С, +18-22 °С, + 37 °С.

Анализ полученных результатов показал, что сухие препараты бруцеллезных бактериофагов, независимо от способа их получения, в процессе длительного хранения прямо пропорционально утрачивали свою жизнеспособность в зависимости от температурного режима содержания. При этом было установлено, что в обоих наблюдениях оптимальным являлось хранение фагов при температуре + 4 °С.

В данных условиях препараты, высушенные в первом режиме, в течение практически 5 лет сохраняли свою жизнеспособность на уровне 50 % от исходной. Препараты бруцеллезных фагов, лиофилизированные во втором режиме, исходно обладая более низким уровнем жизнеспособности (около 45 %), при выдерживании в оптимальном температурном режиме (+ 4 °С) прогрессивно снижали свои показатели, сохраняя через год 36,1+1,6 % жизнеспособных фаговых корпускул.

Таким образом, оптимальным для сухих препаратов бруцеллезных бактериофагов, как и для жидких форм, является температура хранения + 4 °С. В данных условиях в течение трех лет жизнеспособность препаратов остается в пределах 50 % от исходной, что позволяет увеличить срок их годности как минимум до 3 лет.

Являясь обязательной в тестах межвидовой дифференциации штаммов возбудителя бруцеллеза, проба на чувствительность к бруцеллезным диагностическим бактериофагам в своем классическом варианте [Методические указания (МУ 3.1.7.1189-03) «Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллёза людей», 2003], а также предлагаемые варианты постановки данного теста [Габрилович М.С., 1973; Corbel М, Thomas E., 1980] отличаются определенной трудоемкостью и длительностью, особенно при исследовании большого количества штаммов. В связи с этим нами были разработаны новые методические приемы постановки теста на фагочув-ствительность, а также предложены новые подходы проведения межвидовой дифференциации бактерий рода Brucella

Одним из путей оптимизации постановки пробы с бактериофагом явилось получение стерильных препаратов бруцеллезных диагностических фагов на бумажных дисках.

Известно применение бумажных носителей, пропитанных бактериофагами, для определения фагочувствительности бактериальных культур кишечной группы, стафилококков, сибирской язвы [Mora E., Eisenstark A., 1958; Matz К., 1964]. Киселева В И. [1968] описала получение бумажных дисков, импрегнированных бактериофагом Тб, с последующим их использованием для определения чувствительности штаммов возбудителя бруцеллеза к литическому действию данного фага.

В наших экспериментах бумажные диски готовили из фильтровальной бумаги пробойником диаметром 5 мм, помещали их в чашки Петри и стерилизовали путем автоклавирования при 0,5 атм в течение 30 мин. Импрегнацию бумажного носителя осуществляли нанесением не менее 10 мкл фаговых препаратов. При этом конечная концентрация бактериофагов, наносимых на диски, снижалась, как минимум, в 100 раз от исходной.

Диски, с импрегнимрованными на них бактериофагами, помещали в термостат при температуре 37 °С на 24 ч до полного подсыхания, после чего асептически переносили в стерильные пенициллиновые флаконы, герметично закрывали и хранили в условиях холодильника при температуре + 4 °С.

Поскольку стандартным для определения чувствительности штаммов бруцелл к литическому действию бруцеллезных бактериофагов является

использование последних в ДРТ, в ходе экспериментов были определены оптимальные концентрации препаратов фагов для импрегнации дисков, которые составили для бактериофагов: Тб - 1х108 БОЕ/мл, МЪ - 1х107 БОЕ/ мл, К - 1х1010 БОЕ/мл, Вк2 - 1х10)9 БОЕ/мл. Применение указанных концентраций обеспечивало получение сопоставимых результатов с традиционными методами постановки пробы на фагочувствительность.

Методика постановки пробы с бактериофагом с использованием фаговых дисков была аналогична таковой для определения чувствительности культур к действию антибиотиков на плотных питательных средах. Лити-ческую активность фаговых дисков оценивали по способности последних формировать зоны лизиса культуры бруцелл вокруг дисков.

Было установлено, что фаги, импрегнированные на бумажные диски, в результате диффузии в агар способны вызывать лизис бруцелл. Размер зон лизиса, формируемый вокруг фаговых дисков, колебался в пределах 3,5±0,3 - 2,0±0,1 мм и зависел от активности бактериофагов и видовой принадлежности бруцелл.

Полученные фаговые препараты на бумажных носителях были апробированы при проведении межвидовой дифференциации штаммов бруцелл. Диагностика проводилась по традиционной методике с использованием всех тестов, необходимых для установления их видовой принадлежности, с той лишь разницей, что в контроле проба с бактериофагом ставилась методом дорожки, а в опыте были использованы фаговые бумажные диски. В обеих сериях экспериментов по определению видовой принадлежности изученных штаммов были получены полностью совпадающие результаты.

Показав возможность применения фаговых дисков для определения чувствительности штаммов бруцелл к литическому действию бруцеллезных бактериофагов, был разработан тест для одномоментной оценки чувствительности исследуемой культуры к фагам, как в качественном (в отношении различных препаратов бактериофагов), так и в количественном (в зависимости от концентрации препарата) отношениях.

Для этих целей была предложена оригинальная методика приготовления градиентных препаратов бруцеллезных бактериофагов на бумажном носителе [патент Российской Федерации на изобретение № 2137610]. Приготовление последних складывалось из нескольких этапов.

Из фильтровальной бумаги готовили индикаторы в форме полосок шириной 5 мм и длиной 5 см, помещали их в чашки Петри и стерилизовали путем автоклавирования при 0,5 атм в течение 30 мин. Полученные стерильные бумажные индикаторы пропитывали бруцеллезными бактери-

офагами различной концентрации (от ДРТ до цельной) в объеме 1,0±0,1 мл и высушивали в течение 24 ч при 37 °С. Полоски с импрегнированны-ми фагами различной концентрации помещали на лист бумаги, покрытый нейтральным клеящим составом (2 % раствор расплавленного крахмала), в градиентной последовательности и высушивали. Лист разрезали на полоски шириной 5 мм перпендикулярно приклеенным.

На агаровых пластинках готовили газоны исследуемых культур. Приготовленные градиентные полоски размещали на агаровые пластинки таким образом, чтобы край полоски с наибольшим разведением бруцеллезного бактериофага был обращен к центру в одном из 4 секторов чашки Петри. Посевы инкубировали при 37 °С в течение 36 ч. Учет проводили по ширине максимальной зоны лизиса и оценивали пороговую чувствительность по началу градиента зоны лизиса штаммов бруцелл.

Было показано, что начало зоны лизиса, т.е. пороговая чувствительность исследуемых штаммов была отмечена у фрагмента градиентной полоски с наибольшим разведением фагов, что соответствовало ДРТ каждого из бактериофагов при пересчете на изменение их конечной концентрации в результате импрегнации фагами бумажных индикаторов.

Наибольшая ширина зон лизиса регистрировалась у фрагментов градиентных полосок с цельными бруцеллезными бактериофагами, составляя в среднем, независимо от используемого бумажного индикатора 15,0±0,7мм.

Возможность применения градиентных бумажных фаговых индикаторов для определения фагочувствительности штаммов возбудителя бруцеллеза была продемонстрирована на представителях рода Brucella как референтных, так и выделенных из различных источников и находящихся в коллекции СтавНИПЧИ, в сравнении с традиционно применяемыми методами.

Использование полученных препаратов бруцеллезных бактериофагов на бумажных носителях определило необходимость оценки условий и сроков их хранения. Проведенные эксперименты показали, что срок годности фаговых препаратов на бумажных носителях составляет 1 год при их содержании в условиях холодильника (+ 4 °С). В течение этого времени сохраняется специфическая активность препаратов и при использовании последних для определения фагочувствительности штаммов возбудителя бруцеллеза формируются зоны лизиса, которые хорошо визуализируются при учете результатов.

Для оптимизации и унификации методики постановки пробы с бактериофагом, обеспечивающей большую производительность, снижение

материальных и временных затрат, был предложен способ постановки пробы с фагами с использованием матрицы и репликатора [патенты Российской Федерации на изобретения № 2010853 и № 2059722], при котором взвесь исследуемых штаммов смешивали с бактериофагом в соотношении 1:3 - 1:4, инкубировали в течение 20-30 мин при температуре 36-38 °С и наносили смесь на агаровые пластинки репликатором. При этом чувствительность штаммов к лизирующему действию бактериофагов определялась по наличию или отсутствию роста в месте нанесения смеси.

Было показано, что предварительная инкубация оптимальных соотношений фага и исследуемого штамма обеспечивала наилучшую адсорбцию бактериофага на клеточной стенке чувствительных клеток бруцелл, что повышало вероятность выявления штаммов возбудителя бруцеллеза, проявляющих различный уровень чувствительности к лизирующему действию бруцеллезных фагов. Использование данной методики позволило значительно интенсифицировать процесс межвидовой дифференциации штаммов бруцелл за счет возможности одномоментного тестирования большого количества штаммов.

В связи с тем, что в настоящее время основная заболеваемость людей бруцеллезом обусловлена штаммами бруцелл видов В. melitensis, В. abortus, В. suis, имел практическое значение подбор минимального набора тестов, позволяющий проводить межвидовую дифференциацию представителей рода Bmcella указанных видов, имеющих эпидемиологическое значение.

С целью сокращения сроков выполнения данного этапа нами проведены исследования, направленные на обоснование минимального набора тестов, позволяющего осуществлять межвидовую дифференциацию бру-целл в возможно более короткие сроки. Анализ литературных данных и собственных исследований по вопросам межвидовой дифференциации бруцеллезного микроба позволил выделить две группы дифференциальных тестов, совмещающих в себе быстроту получения результата и видовую специфичность. К ним относятся: тест на лизис бруцеллезными бактериофагами Тб, Wb, Fi, Bk2 и тест агглютинации моноспецифическими сыворотками anti-abortus и anti-melitensis.

Следует отметить, что агглютинабельность моноспецифическими сыворотками не является строго специфичным видовым признаком, так как существуют различия по данному признаку в зависимости от биовара изучаемых штаммов бруцелл.

Результаты проведенного исследования спектра литического действия четырех бруцеллезных фагов показали, что для межвидовой дифференциации

зз| ^¿JOJMbH«!

штаммов бруцелл наиболее оптимальным является использование бактериофагов Тб и Вк2, позволяющих дифференцировать штаммы возбудителя бруцеллеза видов В. melitensis и В. suis от бруцелл вида В. abortus.

Известно, что ряд возбудителей особо опасных инфекций обладает адениндезаминазной активностью и возможна их дифференциация по этому признаку [Майский В.Г., 1988]. В работах Меринова СП. и др. [1975], Цыганковой Р.Е. [1991] показаны различия по способности к дезаминиро-ванию аденина у представителей разных видов рода Brucella.

Оценка адениндезаминазной активности бруцелл основана на качественном определении аммиака, образующегося в результате дезамини-рования аденина до гипоксантина клетками возбудителя бруцеллеза. При этом штаммы бруцелл видов В. abortus и В. melitensis не обладают адениндезаминазной активностью, а у представителей вида В. suis таковая определяется.

Видовые различия по дезаминазной активности штаммов возбудителя бруцеллеза позволили использовать этот тест в качестве дополнительного критерия, позволяющего проводить межвидовую дифференциацию бру-целл указанных видов.

Таким образом, для целей межвидовой дифференциации эпидемически значимых штаммов возбудителя бруцеллеза было предложено использование стандартных тестов родовой специфичности с последующим определением их видовой принадлежности при постановке трех тестов, выполняемых параллельно: определение чувствительности штаммов к лизирующему действию бруцеллезных бактериофагов Тб и Вк2 и определение адениндезами-назной активности изучаемых штаммов. При этом указанные тесты укладывались в упрощенную схему межвидовой дифференциации (таблица 1).

Апробация предлагаемой методики была проведена на 75 штаммах бруцелл в S-форме из коллекции СтавНИПЧИ, относящихся к видам В. abortus (22 штамма), В. melitensis (25 штаммов) и В. suis (28 штаммов).

Первоначально для подтверждения родовой принадлежности данных штаммов были использованы стандартные критерии: агглютинация поливалентной бруцеллезной агглютинирующей сывороткой; микроскопия мазков, окрашенных по Граму; реакция иммунофлуоресценции (РИФ). В дальнейшем все штаммы были изучены на наличие адениндезаминазной активности и чувствительности к бруцеллезным диагностическим бактериофагам Тб и Вк2. Параллельно штаммы были протестированы на видовую принадлежность с использованием стандартного набора тестов межвидовой дифференциации.

Таблица 1.

Упрощенная схема межвидовой дифференциации штаммов возбудителя бруцеллеза эпидемически значимых видов

Используемые тесты: Видовая п ринадлежность штаммов:

В. abortus В. melitensis В. suis

агглютинация сывороткой диагностической бруцеллезной поливалентной для реаекции агглютинации + + +

микроскопия мазков, окрашенных по Граму г • Г Г

РИФ + + +

чувствительность к лизирующему действию бактериофага Тб в ДРТ + - -

чувствительность к лизирующему действию бактериофага Вк2 в ДРТ + + +

адениндезаминазная активность - - +

Обозначения: (+) - наличие признака;

(-) - отсутствие признака;

РИФ - реакция иммунофлуоресценции;

ДРТ - диагностический рабочий титр

Проведенный анализ показал, что штаммы бруцелл вида В. melitensis были чувствительны к лизирующему действию бруцеллезного бактериофага Вк2, не чувствительны к бактериофагу Тб, не обладали адениндеза-миназной активностью. Штаммы вида В. suis были чувствительны к бруцеллезному бактериофагу Вк2, не чувствительны к фагу Тб и обладали адениндезаминазной активностью. Штаммы вида В abortus были чувствительны к лизирующему действию бруцеллезных бактериофагов Вк2, Тб и не обладали адениндезаминазной активностью.

Полученные результаты межвидовой дифференциации изученных представителей рода Brucella с применением предлагаемой схемы полностью соответствовали данным тестов стандартной методики.

Описанные тесты дифференциации штаммов бруцелл, являются технически простыми и информативными, легко воспроизводимыми и обеспечивают быстроту получения результата (48 ч), что позволяет рекомендовать ж для практического внедрения.

Выводы

1. На основании впервые проведенных сравнительных экспериментальных исследований спектров литической активности различных фагов бруцелл предложены для практического использования бруцеллезные бактериофаги Тб, Wb, Fi, Bk2, позволяющие с высокой диагностической точностью определять фа-гочувствительность бактерий рода Brucella, при этом для лабораторной диагностики бруцеллеза на этапе идентификации и дифференциации штаммов-изолятов оптимально применение набора бактериофагов - Тб и Вк2.

2. Разработанный ускоренный способ межвидовой дифференциации эпидемически значимых представителей рода Brucella (В. melitensis, В. abortus, В. suis) с использованием теста чувствительности к бактериофагам и определением адениндезаминазной активности штаммов бруцелл эффективен при выполнении данного этапа лабораторной диагностики бруцеллеза.

3. Впервые разработанная биотехнология производственного получения бруцеллезных диагностических бактериофагов Тб, Fi, Wb, Bk2, включающая их репродукцию с использованием сред немясного происхождения и применение вакцинных штаммов размножения, обеспечивает биологическую безопасность технологического цикла и экономическую эффективность.

4. Впервые предложенный и апробированный в экспериментально-производственных условиях способ стабилизации свойств бруцеллезных диагностических бактериофагов методом лиофильного высушивания с применением пептоно-желатиновой среды при 18-часовом режиме лио-филизации обеспечивает высокое качество конечного продукта по нормативным показателям выживаемости и потери в массе при высушивании.

5. Разработанная оригинальная методика репродукции бруцеллезных бактериофагов, основанная на подборе оптимального соотношения бактериофага и бруцеллезного микроба в реакционной смеси, позволяет добиться необратимости процесса адсорбции на поверхности бактериальной клетки и эффективности его репродукции.

6. Сконструированная синтетическая питательная среда для репродукции бруцеллезных диагностических бактериофагов отличается возможностью ее стандартизации и может быть использована в качестве метода выбора на этапе размножения бактериофагов.

7. Экспериментально доказана возможность получения линий бруцеллезных бактериофагов с измененным спектром литической активности методом индуцированного мутагенеза с применением химических соединений. Получены две новые линии бруцеллезных бактериофагов Тб и Fi, обладающие дополнительной активностью в отношении штаммов бруцелл вида В. melitensis.

8. Предложенная оригинальная методика определения фагочувствитель-ности бактерий рода Brucella, основанная на предварительной инкубации оптимальных соотношений фага и исследуемого штамма и использовании репликатора, увеличивает производительность метода и обеспечивает повышение его чувствительности за счет создания условий для необратимой адсорбции фаговых корпускул на поверхности микробной клетки.

9. Разработанная технология получения бруцеллезных фаговых препаратов на бумажных носителях и способ определения пороговой чувствительности бруцелл к лизирующему действию бруцеллезных бактериофагов с помощью градиентных фаговых полосок позволяют оптимизировать (существенно упростить) постановку теста на фагочувствительность с фагами Тб и Вк2, что дает возможность рекомендовать применение этой модификации метода для практического использования, в первую очередь, в полевых условиях.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ляпустина Л.В. Изучение летального и мутагенного действия алки-лирующих агентов на бруцеллезный бактериофаг Тб // Эпидемиология, микробиология и иммунология бактериальных и вирусных инфекций: Тез. докл. обл. науч. конф. молодых ученых (17-20 окт. 1989 г.).- Ростов н/Д., 1989.-С.30-32.

2 Ляпустина Л.В., Таран И.Ф. К вопросу о литической активности бактериофагов Тб, Wb, Fi, Bk2 в отношении культур возбудителя бруцеллеза // Материалы рабочего совещания «Состояние проблемы и перспективы развития диагностики бактериальных инфекций» (1-2 нояб. 1989 г.).-Обо-ленск, 1990.-С. 105.

3. Ляпустина Л.В., Проценко С.Л. К вопросу о фаготипровании культур рода бруцелла // Материалы межгосударственной научно-практической конференции «Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний», посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы. - Ставрополь, 1994- С. 196.

4. Способ идентификации бактерий рода Brucella с использованием бактериофага: Патент РФ № 2010853, МКИ5С12Ш/00, C12Q1/04 / Л.ВЛя-пустина, С.Л.Проценко // Опубл. 15.07.94- Бюл. № 7.

5. Ляпустина Л.В., Таран И.Ф., Лямкин Г.И. К вопросу о разработке технологии получения бруцеллезного бактериофага Тб // Материалы научно-практической конференции «Эпидемиологические аспекты краевой патологии Ставрополья»: Сб. второй.-Ставрополь, 1995.-С.133-134.

6. Ляпустина Л.В., Таран И.Ф., Проценко С.Л. Изучение характера специфичности действия бруцеллезных бактериофагов и возможности его изменения // Там же. - С. 124-126.

7. Ляпустина Л.В., Таран И.Ф., Лямкин Г.И. Совершенствование технологии получения бруцеллезного бактериофага Тб // Актуальные вопросы профилактики особо опасных инфекций и других инфекционных заболеваний: Материалы научно-практической конференции «60 лет противочумной службы Кавказа» (24-25 окт. 1995 г.).-Ставрополь, 1995.-С. 188-189.

8. Ляпустина Л.В., Лямкин Г.И., Щедрин В.И., Цыганкова Р.Е., Майский В.Г., Таран И.Ф., Дальвадянц В.Г., Луканина Л.М. К вопросу совершенствования лабораторной диагностики бруцеллеза // Там же. - Ставрополь, 1995.- С.186-188.

9. Способ идентификации культур рода Yersinia с использованием бактериофага: Патент РФ № 2059722 МКИ6 C12N7/00 / Л.В Ляпустина, СЛ.Про-ценко // Опубл. 10.05.96-Бюл. № 13.

10. Ляпустина Л.В., Цыганкова Р.Е. Сравнительная характеристика лити-ческой активности бруцеллезных диагностических бактериофагов. - Став-рополь,1997.-11 с-Деп в ВИНИТИ 14.03.97.-№ 796- В97.

11. Ляпустина Л.В., Таран И.Ф., Лямкин Г.И. Разработка способа идентификации бактерий рода Brucella с использованием бактериофага.- Ставрополь, 1997.-12 с-Деп. в ВИНИТИ 14.03.97.-№797-В97.

12. Ляпустина Л.В., Кучмаева В.Г. Изучение литического действия бруцеллезных диагностических бактериофагов по отношению к культурам возбудителя бруцеллеза в R-форме // Материалы V итоговой научной конференции молодых ученых и студентов.-Ставрополь, 1997.- С. 191-192.

13. Ляпустина Л.В., Лямкин Г.И., Таран И.Ф. Свойства бруцеллезных диагностических бактериофагов в зависимости от длительности их хранения // Материалы науч.-практич. конф., посвящ. 100-летию образования противочумной службы России (16-18 сент. 1997 г.)-Саратов, 1997.-Т.2.- С.267.

14. Ляпустина Л.В. Бруцеллезные бактериофаги: история изучения, характеристика, применение.- Ставрополь, 1997.- 27 с- Деп в ВИНИТИ 13.11.97,№3310-В97.

15. Ляпустина Л.В, Таран И.Ф., Лямкин Г.И., Дальвадянц В.Г, Малец-кая О.В., Майский В.Г, Щедрин В.И., Цыганкова Р.Е., Проценко С Л., Кату-нина Л.С. Бруцеллез // Лабораторная диагностика возбудителей опасных инфекционных заболеваний.-Т. 1-Саратов, 1998.-С.90-110

16. Ляпустина Л.В., Лямкин Г.И., Цыганкова Р.Е. Характеристика стадий размножения бруцеллезных бактериофагов // Диагностика, лечение

и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария: Материалы юбилейной науч. конф., посвящ. 70-летию НИИ микробиологии МО РФ 30 нояб.-1 дек. 1998 г.-Киров, 1998.-С.144-145.

17. Ляпустина Л.В., Таран И.Ф., Лямкин Г.И., Проценко С.Л. Изучение структуры ДНК бруцеллезных бактериофагов // Там же. - С. 145-146.

18. Кальной СМ., Ляпустина Л.В., Кальная Е.О., Онацкая Т.Г., Швецова Н.М., Сурова В.В. Метод оценки чувствительности бактериальных культур к биологическим и химическим препаратам // Там же.- С.108-109

19. Ляпустина Л.В., Цыганкова Р.Е., Лямкин Г.И., Таран И.Ф. Упрощенная схема межвидовой дифференциации культур возбудителя бруцеллеза // Вторая международная конф., посвящ. 75-летию ин-та им. Пастера «Идеи Пастера в борьбе с инфекциямш: Материалы конф. (СПб., 2-4 сент. 1998 г.).-СПб., 1998.-С.161.

20. Ляпустина Л.В., Цыганкова Р.Е., Кучмаева В.Г. Использование дисков, ипрегнированных фагами для дифференциации культур бруцелл // VI итоговая науч. конф. молодых ученых и студентов: Тез. докл.-Ставрополь, 1998.- С. 166-167.

21. Ляпустина Л.В., Лямкин Г.И., Таран И.Ф., Цыганкова Р.Е. Бруцеллезные диагностические бактериофаги: получение, характеристика, применение // Материалы Второй Всероссийской конф. «Гомеостаз и инфекционный процесс» (20-21 мая, 1998 г.)-Саратов, 1998.-С.45.

22. Способ получения бруцеллезного бактериофага: Патент РФ № 21266833, МПК6 С12Ш/00 / Л.В.Ляпустина, Г.И.Лямкин, И.Ф.Таран // Опубл. 27.02.99.- Бюл. № 6.

23. Ляпустина Л .В., Лямкин Г.И., Таран И.Ф. К истории открытия и изучения бруцеллезных бактериофагов//Журн. микробиол.- 1999.-№6.-С.123-124.

24. Ляпустина Л.В., Лямкин Г.И., Таран И.Ф. Основные этапы изучения и характеристика бруцеллезных диагностических бактериофагов // Пробл. особо опасных инфекций: Сб.науч.трудов.-Вып.79-Саратов, 1999.-С.21-25.

25. Ляпустина Л.В., Лямкин Г.И., Малецкая О.В., Соколова И.А., Цыганкова Р.Е. Совершенствование биологической безопасности в производстве бруцеллезных диагностических препаратов // Проблемы биологической и экологической безопасности: Международная конф. (22-25 мая).-Оболенск, 2000.-С.64-65.

26. Ляпустина Л.В., Лямкин Г.И., Таран И.Ф., Соколова И.А. Набор бруцеллезных диагностических бактериофагов // Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране Российской Федерации: Рефератный сб.- Саратов, 2000.- С.20.

27. Способ оценки пороговой чувствительности бактериальных культур на биологические и химические препараты: Патент РФ № 2147610, МПК7 C12Q1/02; 1/04; G01N 33/544,33/569 / СМКальной, Л.ВЛяпустина, ЁА.Каль-ная, Т.Г.Онацкая // Опубл. 20.04.00- Бюл. №11.

28. Ляпустина Л.В., Лямкин Г.И., Таран И.Ф., Малецкая О.В., Соколова И.А К вопросу использования некоторых химических мутагенных агентов для получения бруцеллезных бактериофагов с новым спектром литичес-койактивности-Ставрополь, 2000.-8 с- Деп. в ВИНИТИ 7.05.01, № 1171.

29. Ляпустина Л .В., Лямкин Г.И., Таран И.Ф., Цыганкова Р.Е., Малецкая О.А., Дальвадянц В.Г. Совершенствование межвидовой дифференциации культур возбудителей бруцеллеза-Ставрополь, 2001.-7 с- Деп в ВИНИТИ 7.05.01, № 1172.

30. Ляпустина Л.В., Лямкин Г.И., Малецкая О.В., Соколова И.А. Экспериментальное обоснование выбора питательных сред для размножения бруцеллезных диагностических бактериофагов // Актуальные вопросы разработки и производства диагностических питательных сред и тест-систем: Материалы 3-й Международной науч.-практич. конф. (20-22 июн. 2001 г.).-Махачкала, 2001.- С.69.

31. Ляпустина Л. В., Лямкин Г.И., Малецкая О.В., Соколова И.А, Жарникова И.В. Оценка возможности использования лиофильного высушивания препаратов бруцеллезных бактериофагов в качестве метода их консервации // Природ-но-очаговые особо опасные инфекции на юге России, их профилактика и лабораторная диагностика (Сб. науч. трудов).- Астрахань, 2001.- С202-203.

32. Ляпустина Л .В., Лямкин Г.И., Таран И.Ф. К вопросу разработки технологических основ получения бруцеллезных диагностических бактериофагов // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане. Вып.4: Материалы Международной науч.-практич. конф. «Современный эпидемический потенциал природных очагов чумы», посвященной 10-летию суверенитета Республики Казахстан и 50-летию Талдыкорганской противочумной станции (г.Талдыкорган, 1-2 авг. 2001 г.).-Алматы, 2001.-С-206-209.

33. Lyapustina L.V., Lyamkin G.I., Taran I.F., Maletskaya O.V., Sokolova LA. To the question of the use of some chemical mutagens for the production of Brucella bacteriphages with new spectra of lytic action // «Байгалийн голом-тот халдварт овгин» (Эрдэм шинжилгээний бага хурлын илтгэлийн хураан-гуй).- 2001 оны 12-р сарын 6. «Natural infections diseases» (Abstracts of scientific conference).- 6 December, 2001.- Ulaanbaatar, 2001.- P.40-44.

34. Ляпустииа Л.В., Лямкин Г.И., Таран И.Ф., Дальвадянц В.Г., Соколова И.А., Малецкая О.В., Цыганкова Р.Е. Совершенствование межвидовой

дифференциации культур возбудителя бруцеллеза // Пробл. особо опасных инфекций-Вып. 2 (82)- Саратов, 2001.- С. 116-122.

35.Ляпустина Л.В. Жарникова И.А. Оценка возможности использования различных режимов лиофилизации для консервации бруцеллезных бактериофагов // Актуальные проблемы эпидемиологической безопасности: Материалы юбилейной науч.-практич. конф. «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы», посвящ. 50-летию Ставропольского науч.-исслед. противочумного ин-та (15-16 окт. 2002 г.).- Ставрополь, 2002 - С. 154-156.

36. Ляпустина Л.В., Лямкин Г.И., Цыганкова Р.Е. Дифференциация эпидемически значимых штаммов возбудителя бруцеллеза ускоренным способом // Там же.- С. 156-158.

37. Ляпустина Л. В., Лямкин Г.И., Таран И.Ф., Жарникова И.В., Соколова И.В., Малецкая О.В. Лиофильное высушивание как способ консервации бруцеллезных бактериофагов // Пробл. особо опасных инфекций.-Вып.1(83).- Саратов, 2002.- С.159-165.

38. Ляпустина Л.В. К вопросу разработки технологических основ производства бруцеллезных диагностических бактериофагов // Там же.- С. 153-159.

39. Лямкин Г.И., Ляпустина Л.В., Малецкая О.В., Соколова И.А., Таран И.Ф., Ткаченко Л.И., Тамбовцев А.В. Состояние и перспективы лабораторной диагностики бруцеллеза // Клиническая лабораторная диагностика.-2002.-№12.-С.46-49.

40. Ляпустина Л.В., Лямкин Г.И., Лямкин Г.И. Изучение возможности использования синтетической питательной среды для репродукции бруцеллезных бактериофагов // Сб. науч. трудов, посвящ. 75-летию НИИ микробиологии МО РФ-Киров, 2003.-С. 156.

Подписано в печать 23.08.2004 Формат 60x84 1/16 Усл.печ.л. 2,44 Уч.-изд.л. 2,27 Бумага офсетная Тираж 100 экз. Заказ №191

Отпечатано в ООО "Искра" Ставрополь, ул.Ленина, 417 "А"

»15605

Содержание диссертации, доктора медицинских наук, Ляпустина, Лариса Вениаминовна

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, 6 СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1 Характеристика бактериофагов, используемых для бактериоло- 18 гической диагностики особо опасных зоонозных инфекций (обзор литературы)

1.1 Чумные диагностические бактериофаги

1.2 Сибиреязвенные диагностические бактериофаги

1.3 Бруцеллезные диагностические бактериофаги 29 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2 Материалы и методы исследования

Глава 3 Характеристика свойств штаммов бруцеллезных бактериофагов, используемых для лабораторной диагностики бруцеллеза

Глава 4 Экспериментальное получение бруцеллезных бактериофагов с 61 новым спектром литической активности

4.1 Определение оптимальных условий воздействия мутагенов на бру- 62 целлезные бактериофаги

4.2 Изменение спектра литического действия бруцеллезных бактериофа- 66 гов под влиянием химических мутагенов

4.2.1 Характеристика свойств мутантных линий бруцеллезных бакте- 71 риофагов

4.2.2 Свойства мутантных линий бруцеллезных фагов при длительном 72 хранении

4.3 Использование химических мутагенов для получения R-бруцеллез- 74 ных бактериофагов

Глава 5 Изучение структуры ДНК бруцеллезных бактериофагов

5.1. Выделение ДНК бруцеллезных бактериофагов

5.2. Рестрикционный анализ ДНК бактериофагов бруцелл

Глава 6 Разработка технологических схем экспериментально-производ- 82 ственного получения бактериофагов диагностических бруцеллезных жидких

6.1 Экспериментальное обоснование выбора питательных сред для раз- 82 множения бактериофагов

6.2 Изучение возможности использования синтетической питательной 85 среды для размножения бактериофагов

6.3 Экспериментальное обоснование выбора метода размножения бакте- 87 риофагов

6.4 Экспериментальное обоснование выбора штаммов размножения бак- 90 териофагов

6.4.1 Одиночный цикл размножения бруцеллезных бактериофагов

6.4.2 Изучение возможности использования вакцинных штаммов бру- 95 целл для репродукции бактериофагов

6.5 Подбор консервантов, препятствующих микробной контаминации 97 препаратов бруцеллезных бактериофагов

6.6 Стандартизация свойств экспериментально-производственных серий 99 бруцеллезных диагностических бактериофагов

6.7 Определение условий хранения и сроков годности жидких форм пре- 102 паратов бруцеллезных диагностических бактериофагов

Глава 7 Оптимизация технологии репродукции бруцеллезных бакте- 111 риофагов

7.1 Оптимизация условий размножения бруцеллезных бактериофагов Тб, 111 Wb,Fi

7.2 Оптимизации условий репродукции бруцеллезного бактериофага 119 Вк

Глава 8 Разработка оптимальных условий стабилизации бруцеллезных диагностических бактериофагов 8.1 Подбор криопротекторов для проведения лиофильного высушивания бруцеллезных бактериофагов

8.2 Потеря в массе при высушивании в лиофилизированных препаратах 130 бруцеллезных бактериофагов

8.3 Оценка возможности использования различных режимов лиофилиза- 132 ции для стабилизации свойств бруцеллезных бактериофагов

8.4 Определение оптимальной концентрации консерванта для получения 141 лиофилизированных форм бруцеллезных бактериофагов

8.5 Жизнеспособность бруцеллезных фагов в сухих препаратах при хра- 142 нении в различных температурных режимах

8.6 Специфическая активность и специфичность сухих препаратов бру- 144 целлезных диагностических бактериофагов

Глава 9 Разработка ускоренных методических приемов и новых спосо- 147 бов идентификации и дифференциации бактерий рода Brucella с использованием бактериофагов

9.1 Совершенствование методики постановки пробы с бактериофагами 148 путем использования бумажных носителей

9.1.1 Получение препаратов бруцеллезных бактериофагов на бумажных 148 дисках

9.1.2 Апробация фаговых препаратов на дисках для определения фаго- 154 чувствительности штаммов бруцелл

9.2 Получение градиентных препаратов бруцеллезных бактериофагов на 155 бумажном носителе

9.2.1 Способ количественной и качественной оценки чувствительности 157 штаммов бруцелл к действию бруцеллезных бактериофагов

9.3 Влияние различных условий хранения на активность фаговых препа- 159 ратов на бумажных носителях

9.4 Разработка способа постановки пробы с бактериофагом для межви- 161 довой дифференциации штаммов возбудителя бруцеллеза

9.5 Разработка теста ускоренной дифференциации бруцелл эпидемиче- 165 ски значимых видов с использованием бактериофагов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Бруцеллезные бактериофаги. Оптимизация технологии производства и способов применения в лабораторной диагностике бруцеллеза"

Актуальность проблемы

Среди более чем 180 нозологических форм зоонозных инфекционных заболеваний бруцеллез по-прежнему не утратил своей значимости в связи с масштабами экономического ущерба животноводству и здоровью населения [Черкасский Б.Л., Иванова А.А., 1996; Авилов В.М. и др., 1997; Антоненко А.Д., 2000; Онищенко Г.Г., 2002; WHO, 1997].

Если к настоящему времени во многих странах мира, где раньше регистрировалась высокая заболеваемость людей бруцеллезом (Австралия, Англия, США, Новая Зеландия), наблюдается тенденция к полному его искоренению, то в Российской Федерации ежегодно регистрируются до 500 случаев впервые выявленного бруцеллеза [Онищенко Г.Г. и др., 1999]. Наиболее неблагополучными по бруцеллезной инфекции являются Северо-Кавказский, Поволжский, Сибирский регионы России [Калиновский А.И. и др., 1998], причем на долю административных территорий Южного Федерального округа приходится до 30 % случаев первично выявляемой заболеваемости данной инфекционной патологией [Таран И.Ф. и др., 1999].

Бруцеллёз, как правило^ диагностируется уже при развитии хронического процесса, когда практически у каждого четвёртого заболевшего наблюдается стойкая утрата работоспособности. Учитывая, что инфекция возникает в основном у лиц трудоспособного возраста (20-50 лет), затраты на выплаты по инвалидности, на лечение и реабилитацию оказываются значительными. Несмотря на то, что бактериологическое подтверждение инфицирования бруцеллезом на практике регистрируется лишь в 3-10% наблюдений, выделение культуры возбудителя является абсолютно достоверным подтверждением диагноза заболевания, а установление видовой принадлежности и биовара штамма-изолята имеет решающее значение при эпидемиологическом расследовании, а также определении тактики и объема необходимых противоэпидемических мероприятий.

Лабораторная диагностика бруцеллеза в России у людей проводится в соответствии с методическими указаниями (МУ 3.1.7.1189-03) «Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллёза людей» [2003], регламентирующими бактериологический, иммуносерологический, молекулярно-генетический и аллергический методы исследования. Принятая схема межвидовой дифференциации штаммов бруцелл предусматривает использование в комплексной схеме определение чувствительности бруцелл к лизирующему действию бактериофага Тб.

В соответствии с рекомендациями объединенного комитета экспертов ФАО/ВОЗ по бруцеллезу [1986] в числе комплексных тестов дифференциации выделенных штаммов возбудителя бруцеллеза применяется определение чувствительности изолятов к литическому действию бруцеллезных диагностических бактериофагов Тб (Тбилиси), Fi (Firenze), Wb (Weybridge), Bk2 (Berkley), R-фага.

В настоящее время в Российской Федерации отсутствует коммерческое производство бруцеллезного диагностического бактериофага Тб, а технология производства бактериофагов Wb, Fi, Bk2 и R вообще не разработана. Данные обстоятельства определяют необходимость разработки нормативной документации и создания современной биотехнологической цепи производства бруцеллезных фагов, налаживания выпуска этих диагностических препаратов, отсутствие которых затрудняет выполнение всего комплекса тестов межвидовой

Ч» дифференциации штаммов возбудителя бруцеллеза.

В связи с тем, что ни один из описанных бруцеллезных фагов не обладает строгой видовой специфичностью литического действия [Corbel М., Thomas Е., 1980] представляется важным изучение возможности получения новых ви-доспецифических препаратов бруцеллезных бактериофагов с использованием для этих целей индуцированного мутагенеза.

Сложность, длительность и комплексность видового определения выделяемых штаммов возбудителя бруцеллеза определяют актуальность разработки и практического внедрения методических подходов, обеспечивающих идентификацию и межвидовую ' дифференциацию штаммов бруцелл эпидемически значимых видов (В. melitensis, В. abortus, В. suis), в том числе с использованием диагностических бактериофагов.

Цель исследования

Усовершенствовать схему лабораторной диагностики бруцеллеза путем использования на этапах идентификации и дифференциации штаммов бруцелл оптимального набора бруцеллезных диагностических бактериофагов, разработать эффективную и экономичную технологию производства препаратов бруцеллезных бактериофагов, определить пути ее совершенствования.

Основные задачи

1. Изучить спектры литической активности различных бруцеллезных бактериофагов.

2. Определить оптимальный набор бруцеллезных диагностических бактериофагов для использования на различных этапах бактериологической диагностики бруцеллеза.

3. Изучить возможность использования индуцированного мутагенеза с применением химических соединений для получения новых видоспецифиче-ских бруцеллезных бактериофагов.

4. Разработать технологию экспериментально-производственного получения бруцеллезных диагностических бактериофагов Тб, Fi, Wb, Bk2 с использованием сред немясного происхождения, вакцинных штаммов размножения, оптимального консерванта.

5. Разработать нормативную документацию (фармакопейную статью предприятия, инструкцию для применения, экспериментально-производственный регламент) для выпуска препаратов бруцеллезных бактериофагов в производственных условиях.

6. Апробировать возможность применения стандартной синтетической питательной среды для репродукции бруцеллезных бактериофагов.

7. Изучить возможность совершенствования отдельных технологических этапов производства бруцеллёзных бактериофагов путем оптимизации усю ловий размножения бактериофагов и режима лиофилизации.

8. Разработать новые методические приемы для определения фагочув-ствительности штаммов возбудителя бруцеллеза различных видов.

9. Усовершенствовать этапы идентификации и дифференциации Brucellae spp. при лабораторной диагностике бруцеллёза за счёт использования оптимального набора бруцеллезных бактериофагов.

Научная новизна и теоретическая значимость

Впервые определен оптимальный набор фаговых препаратов для использования на различных этапах бактериологической диагностики бруцеллеза.

Разработан ускоренный способ межвидовой дифференциации эпидемически значимых представителей рода Brucella (В. melitensis, В. abortus, В. suis) с использованием теста фагочувствительности и определения адениндезаминаз-ной активности штаммов бруцелл.

На основе сравнительного изучения биокинетических особенностей одиночных циклов размножения бруцеллезных бактериофагов на штаммах возбудителя бруцеллеза с различным уровнем вирулентности подобраны оптимальные условия, позволяющие осуществлять репродукцию фагов с высокой степенью эффективности и обеспечивающие максимальный уровень биологической безопасности технологического цикла.

На основании сравнительного изучения способности бруцеллезного бактериофага переживать состояние анабиоза в результате воздействия низких температур, удаления свободной и связанной влаги подобраны оптимальные криопротекторы и отработаны режимы лиофилизации, обеспечивающие получение конечного высушенного препарата с высоким показателем уровня выживаемости фаговых корпускул (72,48±1,52%) и удовлетворяющих нормативным требования показателя потери в массе при высушивании (3%) .

Разработана оригинальная высокопродуктивная методика размножения бруцеллезных бактериофагов в жидкой питательной среде, включающая установление оптимального соотношения (множественность инфекции) концентрации фага и штамма размножения, равного 0,01 - 0,001, в репродуктивной среде, и в которую для обеспечения необратимости и эффективности адсорбции фаговых корпускул на поверхности бактериальной клетки дополнительно внесены сульфат кальция и магния в концентрации 0,001 М каждого. Методика защищена патентом Российской Федерации на изобретение № 2126833.

Экспериментально установлено, что результатом химического индуцированного мутагенеза является получение h-мутантных линий бактериофагов, характеризующихся измененным спектром активности в сторону внутриродового расширения литических свойств. С применением химических мутагенов нитро-зогуанидина и этилметансульфоната впервые получены новые линии бруцеллезного бактериофага Тб, обладающие литической активностью в отношении штаммов бруцелл вида В. melifensis.

Разработан оригинальный способ идентификации бактерий рода Brucella с различным уровнем чувствительности к лизирующему действию бруцеллезных фагов, для обеспечения которого подобраны условия, повышающие степень адсорбции бактериофага на клеточной стенке бруцелл за счет предварительного смешивания взвеси исследуемых штаммов с фагом в соотношении 1:3-1:4, инкубации в течение 20-30 мин при температуре + 36-38 °С и последующим нанесении смеси на агаровые пластинки. Метод защищен патентами Российской Федерации на изобретение № 2010853 и № 2059722.

Предложен новый спосрб оценки пороговой чувствительности штаммов бруцелл к действию бруцеллезных бактериофагов, заключающий в приготовлении градиентных фаговых препаратов на бумажных носителях и позволяющий количественно и качественно оценивать чувствительность бруцеллезного микроба к лизирующему действию бактериофагов. Метод защищен патентом Российской Федерации на изобретение № 2147610.

Практическая значимость

• Разработана технология экспериментально-производственного получения бактериофагов диагностических бруцеллезных жидких Тб, Fi, Wb, Bk2, обеспечивающая соблюдение^максимального уровня биологической безопасности технологического цикла, включающая репродукцию их на культурах вак

12 цинных штаммов с применением сред немясного происхождения.

• Составлена нормативная документация (экспериментально-производственный регламент (ЭПР), фармакопейная статья предприятия (ФСП), инструкция по применению) на бактериофаги диагностические бруцеллезные жидкие, одобренная Ученым Советом Ставропольского научно-исследовательского противочумного института (СтавНИПЧИ) [протокол № 5 от 28.05.2001 г.].

• Три экспериментально-производственные серии препарата «Бактериофаги диагностические бруцеллезные жидкие» успешно прошли контрольные испытания на базе Государственного института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов (ГИСК) им. JI.A. Тарасевича, нормативная документация (ЭПР, ФСП, инструкция по применению) представлена на Ученом Совете ГИСК им. JI.A. Тарасевича, комитетом МИБП утверждена программа Государственных испытаний бактериофагов диагностических бруцеллезных жидких и разрешено их проведение [протокол № 4 от 24.06.04 г.].

• Бактериофаги диагностические бруцеллезные жидкие прошли лабораторные испытания на базе Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» при Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» (РосНИПЧИ) [акт лабораторного испытания фагов, утвержденный директором РосНИПЧИ «Микроб» В.В. Кутыревым от 15 апреля 1998 г.], депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» и рекомендованы в качестве маточных производственных [справка о депонировании бактериофагов].

• Бактериофаги диагностические бруцеллезные жидкие апробированы в НИИ микробиологии Министерства обороны Российской Федерации при идентификации и межвидовой дифференциации штаммов возбудителя бруцеллеза [акт внедрения, утвержденный начальником НИИ микробиологии Министерства обороны РФ Е. Пименовым от 27 мая 2003 г.].

• Материалы диссертации использованы при составлении раздела «Бруцеллез» (подраздел «Лабораторная диагностика») в целевых комплексных программах обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения на территории юга России и в Ставропольском крае:

- «Профилактика особо опасных инфекций и санитарная охрана территории Ставропольского края от завоза и распространения конвенционных инфекционных заболеваний на 1993-1995 гг.». Утверждена постановлением главы администрации Ставропольского края 14.10.1993 г.;

- «Обеспечение эпидемиологического благополучия по особо опасным и природно-очаговым заболеваниям и улучшение медико-эпидемиологической обстановки на юге России на 1994-1995 гг.». Одобрена решением Совета Ассоциации социально-экономического сотрудничества республик, краев и областей Северного Кавказа 15.05.1994 г.;

- «Обеспечение эпидемиологической безопасности по особо опасным и природно-очаговым заболеваниям в регионе Северного Кавказа на 1999-2002 гг.». Утверждена решением Ассоциации социально-экономического сотрудничества республик, краев и областей Северного Кавказа 10.12.1999 г.

• Материалы диссертации вошли в сборник методических документов «Лабораторная диагностика возбудителей опасных инфекционных заболеваний» [Саратов, 1998]; в дополнение к информационному указателю штаммов, депонированных в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» [Саратов, 1999]; в методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации [Саратов, 2000]; в методические рекомендации по индикации особо опасных инфекционных заболеваний (чума, туляремия, бруцеллез, сибирская язва, холера) в СПЭБ и СНЛК в условиях чрезвычайных ситуаций [Ставрополь, 2003], утвержденные директором СтавНИПЧИ 27/02.03 г. [протокол № 2]; в методические рекомендации «Бруцеллез. Эпизоотолого-эпидемиологический надзор, лабораторная диагностика, клиника, лечение, диспансерное наблюдение за больными» [Ставрополь, 2003], утвержденные Первым заместителем министра здравоохранения Российской Федерации, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 12.02.04 г.

• Материалы диссертационной работы используются при чтении

14 лекций и проведении практических занятий на курсах специализации врачей по особо опасным инфекциям при СтавНИПЧИ.

Диссертационная работа выполнена в рамках государственных тем НИР: «Проблемы зоонозов и пути jjx решения в современных условиях индустриализации сельскохозяйственного производства» (№ Гос. регистрации 018660004639), «Разработка и усовершенствование лабораторной диагностики бруцеллеза» (№ Гос. регистрации 01910047321), «Совершенствование методов и препаратов, используемых для лабораторной диагностики бруцеллеза» (№ Гос. регистрации 01960001790), «Разработка технологии получения бруцеллезных диагностических бактериофагов» (№ Гос. регистрации 01200109093).

Положения, выносимые на защиту

• Предлагаемые бактериофаги бруцеллезные диагностические Тб, Wb, Fi, Bk2 позволяют с высокой диагностической точностью определять фа-гочувствительность бактерий рода Brucella.

• Ускоренный способ межвидовой дифференциации эпидемически значимых представителей рода Brucella (В. melitensis, В. abortus, В. suis) с использованием теста чувствительности к бактериофагам Тб и Вк2 и определением адениндезаминазной активности штаммов бруцелл эффективен при выполнении данного этапа лабораторной диагностики бруцеллеза.

• Технология экспериментально-производственного получения бруцеллезных диагностических бактериофагов Тб, Wb, Fi, Bk2 позволяет осуществлять их репродукцию на вакцинных штаммах с использованием сред немясного происхождения, обеспечивает биологическую безопасность технологического цикла и экономический эффект.

• Предложенные криопротекторы и условия лиофильного высушивания обеспечивают высокий уровень выживаемости бактериофагов.

• Применение разработанных препаратов бруцеллезных бактериофагов на бумажных носителях позволяет существенно упростить постановку теста на фагочувствительность при сохранении точности метода.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на научных конференциях СтавНИП-ЧИ [Ставрополь, 1990-2003].

Материалам диссертации были представлены на областной научной конференции молодых ученых [Ростов-на-Дону, 1989]; на рабочем совещании «Проблемы и перспективы развития диагностики бактериальных инфекций» [Оболенск, 1989]; на межгосударственной научно-профилактической конференции «Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний», посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы [Ставрополь, 1994]; на научно-практической конференции «Эпидемиологические аспекты краевой патологии Ставрополья» [Ставрополь, 1995]; на научно-практической конференции «60 лет противочумной службы Кавказа» [Ставрополь, 1995]; на научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России [Саратов, 1997]; на V и VI итоговых научных конференциях молодых ученых и студентов [Ставрополь, 1997,1998]; на второй международной конференций, посвященной 75-летию института им. Пастера [Санкт-Петербург, 1998]; на юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию научно-исследовательского института микробиологии МО РФ [Киров, 1998]; на второй Всероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» [Саратов, 1998]; на международной конференции «Проблемы биологической и экологической безопасности» [Оболенск, 2000]; на 3-ей международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы разработки и производства диагностических питательных сред и тест-систем» [Махачкала, 2001]; на международной научно-практической конференции «Современный эпидемический потенциал природных очагов чумы», посвященной 10-летию суверенитета Республики Казахстан и 50-летию Талдыкорганской противочумной станции [Талдыкорган, 2001]; на юбилейной научно-практической конференции «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы», посвященной 50-летию Ставропольского научно-исследовательского противочумного института [Ставрополь, 2002].

Публикации.

Основные результаты диссертации изложено в 40 опубликованных работах, из них в журналах рекомендуемых ВАК Российской Федерации для публикации основных научных результатов докторских диссертаций - 6, патентов -4.

Структура диссертации.

Диссертация изложена на 212 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литераторы, восьми глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 162 источника на русском языке и 87 - на иностранных языках. Материалы исследований иллюстрированы 35 таблицами и 16 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Ляпустина, Лариса Вениаминовна

выводы

1. На основании впервые проведенных сравнительных экспериментальных исследований спектров литической активности различных фагов бруцелл предложены для практического использования бруцеллезные бактериофаги Тб, Wb, Fi, Bk2, позволяющие с высокой диагностической точностью определять фагочувствительность бактерий рода Brucella, при этом для лабораторной диагностики бруцеллеза на этапе идентификации и дифференциации штаммов-изолятов оптимально применение набора бактериофагов - Тб и Вк2.

2. Разработанный ускоренный способ межвидовой дифференциации эпидемически значимых представителей рода Brucella (В. melitensis, В. abortus, В. suis) с использованием теста чувствительности к бактериофагам и определением адениндезаминазной активности штаммов бруцелл эффективен при выполнении данного этапа лабораторной диагностики бруцеллеза.

3. Впервые разработанная биотехнология производственного получения бруцеллезных диагностических бактериофагов Тб, Fi, Wb, Bk2, включающая их репродукцию с использованием сред немясного происхождения и применение вакцинных штаммов размножения, обеспечивает биологическую безопасность технологического цикла и экономическую эффективность.

4. Впервые предложенный и апробированный в экспериментально-производственных условиях способ стабилизации свойств бруцеллезных диагностических бактериофагов методом лиофильного высушивания с применением пептоно-желатиновой среды при 18-часовом режиме лиофилизации обеспечивает высокое качество конечного продукта по нормативным показателям выживаемости и потери в массе при высушивании.

5. Разработанная оригинальная методика репродукции бруцеллезных бактериофагов, основанная на подборе оптимального соотношения бактериофага и бруцеллезного микроба в реакционной смеси, позволяет добиться необратимости процесса адсорбции на поверхности бактериальной клетки и эффективности его репродукции.

6. Сконструированная синтетическая питательная среда для репродукции бруцеллезных диагностических бактериофагов отличается возможностью ее стандартизации и может быть использована в качестве метода выбора на этапе размножения бактериофагов.

7. Экспериментально доказана возможность получения линий бруцеллезных бактериофагов с измененным спектром литической активности методом индуцированного мутагенеза с применением химических соединений. Получены две новые линии бруцеллезных бактериофагов Тб и Fi, обладающие дополнительной активностью в отношении штаммов бруцелл вида В. melitensis.

8. Предложенная оригинальная методика определения фагочувстви-тельности бактерий рода Brucella, основанная на предварительной инкубации оптимальных соотношений фага и исследуемого штамма и использовании репликатора, увеличивает производительность метода и обеспечивает повышение его чувствительности за счет создания условий для необратимой адсорбции фаговых корпускул на поверхности микробной клетки.

9. Разработанная технология получения бруцеллезных фаговых препаратов на бумажных носителях и способ определения пороговой чувствительности бруцелл к лизирующему действию бруцеллезных бактериофагов с помощью градиентных фаговых полосок позволяют оптимизировать (существенно упростить) постановку теста на фагочувствительность с фагами Тб и Вк2, что даёт возможность рекомендовать применение этой модификации метода для практического использования, в первую очередь, в полевых условиях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В Российской Федерации бруцеллез продолжает оставаться серьезной проблемой здравоохранения и ветеринарии. Ежегодное выявление до 500 «свежих» случаев заболевания людей бруцеллезом свидетельствует об активной циркуляции возбудителя среди сельскохозяйственных животных.

Причиняя значительный ущерб экономике, бруцеллез затрагивает не только сферу животноводства, но и социальную сферу. Нарушение репродуктивных функций животных, вынужденный убой скота, затраты на дезинфекцию, а также лечение и пенсионное обеспечение заболевших работников животноводства в случае возникновения инвалидности нередко сводят к нулю рентабельность хозяйств.

Все это определяет необходимость вложения сил и средств в изучение проблемы бруцеллеза. Одним из возможных путей ее решения является расширение знаний в области микробиологии возбудителя заболевания, а также совершенствование средств и методов его лабораторной диагностики, от чувствительности и специфичности которых зависит быстрота и своевременность постановки диагноза и, как следствие, определение объема и характера проведения противобруцеллезных мероприятий, а также разработка тактики лечения больных.

Несмотря на то, что бактериологический метод не является определяющим при постановке диагноза бруцеллезной инфекции, выделение возбудителя бруцеллеза, установление его видовой принадлежности не только достоверно подтверждает диагноз, но зачастую позволяет установить вероятный источник инфекции, давность заболевания, выбрать наиболее эффективное средство антимикробной терапии.

Межвидовая дифференциация штаммов бруцелл, предусматривающая использование ряда обязательных тестов, включает определение фагочувстви-тельности выделенного штамма. До настоящее время в Российской Федерации отсутствовало коммерческое производство бруцеллезных диагностических фаговых препаратов, что определило необходимость разработки биотехнологии их получения, определения сроков годности и методов стабилизации.

Процесс межвидовой и^внутривидовой дифференциации штаммов возбудителя бруцеллеза с использованием традиционных схем и методических приемов является относительно длительным и трудоемким, поэтому важно было разработать методики оптимизации определения фагочувствительности бруцелл, а также отобрать тесты, обеспечивающие ускоренную и достоверную дифференциацию эпидемически значимых штаммов возбудителя бруцеллеза видов В. melitensis, В. abortus, В. suis.

В качестве исходных моделей были использованы штаммы бруцеллезных бактериофагов, имеющихся в коллекции лаборатории бруцеллеза СтавНИПЧИ. Фаг Тб был получен из Тбилисского института вакцин и сывороток; исходные образцы бруцеллезных диагностических бактериофагов Fi, Wb, Bk2, R-фага были получены из Центральной ветеринарной лаборатории Вейбриджа (Англия) и любезно предоставлены М. Corbel; бруцеллезные фаги S708 и JP32A, описанные Moreira-Jacob М. [1968] были любезно предоставленных Ю.К. Кулаковым и В.Н.Гореловым

Для тестирования были использованы штаммы бруцелл, выделенные на территории юга России за последние 20 лет, в числе которых 77 штаммов были в стабильной S-форме и 23 штамма - в стабильной R-форме либо в переходной S-R форме. Представительство по видам распределялось следующим образом: В. melitensis - 25 (6 - не S-штаммов) штаммов; В. abortus - 22 (4 - не S-штамма) штамма; В. suis - 28 (1 - не S-штамм) штаммов; В. neotomae - 2 штамма; B.ovis - 10 штаммов, B.canis - 3 штамма. При этом виды В. ovis и В. canis были представлены только штаммами в стабильной R-форме. Литическая активность бактериофагов в отношении штаммов возбудителя бруцеллеза определялась для двух концентраций: ДРТ и 104ДРТ.

Анализ результатов показал, что активность бактериофага Вк2 не зависела от используемой концентрации препарата. Все штаммы в S-форме были чувствительны к его лизирующедоу действию. Фаг не проявлял активность в отно

173 шении штаммов возбудителя бруцеллеза в R- и переходной S-R-формах.

Фаг Тб, как в ДРТ, так и в 104ДРТ в 100% наблюдений лизировал штаммы видов В. abortus и В. neotmae, находящиеся в S-форме. Аналогичным действием в отношении штаммов данных видов обладал и бактериофаг Fi.

Гораздо более низкая активность указанных фагов была в отношении штаммов вида В. suis. Бактериофаг Fi в ДРТ лизировал 8 штаммов (28,6%), а в концентрации 104ДРТ - 14 штаммов (50,0%) этого вида; фаг Тб в ДРТ не обладал активностью в отношении штаммов В. suis, а в 104ДРТ вызывал лизис только 3 (1 0,7%) изученных штаммов.

Все используемые в эксперименте штаммы видов В. abortus, В. neotomae, В. suis в S-форме были чувствительны к литическому действию бактериофага Wb обеих концентраций.

Бактериофаг S708 в отношении изучаемых штаммов возбудителя бруцеллеза обладал активностью почти аналогичной таковой у фага Wb, спектр литической активности бактериофага JP32A соответствовал таковому у фага Fi.

В проведенных экспериментах не удалось установить наличия активности бактериофага R в отношении штаммов возбудителя бруцеллеза, находящихся либо в стабильной R-, либо в переходной S-R-форме. Литические свойства фага проявлялись только в отношении 20 штаммов (71,4%) бруцелл вида В. abortus в S-форме и 2 штаммов вида В. neotomae, а в разведении 104ДРТ бактериофаг дополнительно лизировал еще и 3 штамма (10,3%) вида В. suis также в стабильной S-форме.

Установленные данные позволили рекомендовать использование бруцеллезного фага Вк2 в качестве-дополнительного теста для идентификации культур рода Brucella, поскольку он обладал способностью вызывать лизис штаммов бруцелл всех видов, находящихся в стабильной S-форме. Считаем целесообразным применение фага Тб для межвидовой дифференциации штаммов бруцелл эпидемически значимых видов (В. melitensis, В. abortus, В. suis), т.к. в ДРТ бактериофаг обладал видоспецифичностью литического действия в отношении штаммов вида В. abortus. Оценка чувствительности штаммов возбудите

174 ля бруцеллеза к лизирующему действию набора фагов (Тб, Wb, Fi, Bk2) необходима для углубленного изучения штаммов при научных, исследованиях в специализированных лабораториях.

В наших экспериментах не было установлено литической активности бактериофага R в отношении штаммов возбудителя.бруцеллеза в R-форме, описанной Corbel М, Thomas Т. [1985]. Поэтому не представлялось возможным рекомендовать использование данного фага, для межвидовой дифференциации штаммов возбудителя бруцеллеза.

Литическая активность ^бактериофагов S708 и JP32A практически полностью совпадала с таковой у фагов Wb и Fi соответственно, поэтому дополнительное их применение для определения фагочувствительности штаммов возбудителя бруцеллеза являлось нецелесообразным.

Сложность и длительность межвидовой дифференциации штаммов возбудителя бруцеллеза определяется отсутствием до настоящего времени единого универсального дифференциально-диагностического теста, что предусматривает применение комплексной оценки по ряду признаков, включая и определение фагочувствительности. В связи с чем вопрос о получении строго видоспецифи-ческих бруцеллезных бактериофагов остается актуальным.

Использование индуцированного мутагенеза с применением химических соединений является одним из подходов, определяющих возможность реализации данной задачи [Гольдфарб Д.М., Беляев Д.Л., 1966; Черник Т.П., Серебряный A.M., 1972; Кривиский А.С. и др., 1973; Петренко В.А. и др., 1982; Loveless А., 1958; Freese Е., 1959; Tessman I., 1959; Bautz Е., Freese Е., 1960; Bautz-Freese Е., Freese Е., 1961; Corbel M.J., 1977].

В связи с этим для получения линий фаговых препаратов с измененным спектром литической активности нами были использованы алкилирующие мутагенные агенты - нитрозогуанидин, нитрозометилмочевина, этилметансуль-фонат, ICR191.

Степень проявления мутагенного действия химических препаратов зависит от их концентраций и длительности применения. При этом наиболее выра

175 женный эффект проявляется при воздействии препаратов, обеспечивающих 5070% летальный эффект на микробные клетки или фаговые корпускулы [Стрель-чукС.Н., 1981].

В экспериментах на бруцеллезных бактериофагах при использовании различных концентраций мутагенов было установлено, что, независимо от вида бактериофага, оптимальной для ожидаемого мутагенного воздействия является концентрация препаратов, равная 2 мг/мл. Построив кривые выживаемости бруцеллезных фагов от времени их экспозиции с мутагенами, были определены уровни 50-70% летального эффекта последних. Было показано, что НГ обеспечивал данное действие в диапазоне 28-38-часовой, ICR191 - 22-32-часовой, ЭМС - 26-36-часовой, а НММ - 32-54-часовой экспозиций.

В результате воздействия НГ ЭМС на бруцеллезные бактериофаги были получены две мутантные линии фагов Fi и Тб, которые обладали более широким спектром литической активности, чем исходные варианты. Расширение спектра активности проявлялось в способности данных линий фагов вызывать лизис представителей рода Brucella козье-овечьего вида. При этом приобретенные свойства препаратов стабильно сохранялись в течение 12 месяцев.

Аналогичным образом была проведена селекция линий бактериофагов в отношении штаммов возбудителя бруцеллеза, находящихся в стабильной R-форме. Было отмечено, что наибольшей мутагенной активностью на бруцеллезные бактериофаги обладал НГ, который индуцировал появление линии бруцеллезного бактериофага Тб, обладающей активностью в отношении R-штаммов бруцелл вида В. abortus, но эти свойства мутантных линий бактериофага Тб не обладали высокой степенью стабильности и специфичности.

Результаты проведенных исследований подтвердили ранее опубликованные данные [Габрилович М.С., 1973], свидетельствующие о том, что исходом индуцированного мутагенеза с использованием химических соединений является появление h-мутантных линий бактериофагов, характеризующихся измененным спектром активности не в сторону его сужения до видоспецифичности, а внутриродовым расширением литических свойств по сравнению с исходными

176 вариантами.

Согласно морфологическим, физическим, химическим и антигенным свойствам бруцеллезные бактериофаги принадлежат к одному семейству [Corbel М., Thomas Е., 1980; Ackerman Н. et al., 1982; Matthews R., 1982]. В то же время проведенные исследования показали, что изученные бруцеллезные бактериофаги обладают относительной специфичностью литического действия в отношении штаммов возбудителя бруцеллеза различных видов. В связи с этим были проведены эксперименты по изучению структуры ДНК референтных бруцеллезных бактериофагов, а также полученных мутантных линий бактериофагов Тб и Fi.

Определение размеров ДНК фагов показало их абсолютную идентичность: независимо от вида бактериофага размер генома составлял приблизительно 25,1 мД. Проведенный рестрикционный анализ фаговых ДНК с использованием эндонуклеаз Eco R^h Ваш HI установил их полное сходство по картине рестрикции как у референтных, так и у мутантных линий бактериофагов. Полученные нами данные полностью подтверждают результаты Segondy М. et al. [1988], Rigby C.L. et al. [1989]

Установленная идентичность геномов бруцеллезных бактериофагов не позволила объяснить относительную специфичность их литического действия в отношении штаммов бруцелл различных видов. Учитывая изложенное можно предположить, что относительная специфичность активности бруцеллезных фагов связана либо с минимальными различиями структуры участков ДНК, кодирующих синтез белков базальной пластины фагов, либо с особенностями фаговых рецепторов бруцелл отдельных видов или различиями в их доступности. Поэтому увеличение концентрации фагов обеспечивает частичный лизис нечувствительных штаммов бруцелл.

Таким образом, в настоящий момент стабильными бактериофагами, применение которых целесообразно для межвидовой дифференциации штаммов возбудителя бруцеллеза, являются фаги Тб, Wb, Fi, Bk2.

Разработка биотехнологических основ производства этих бактериофагов

177 один из главных вопросов, решаемых в нашем исследовании. Этот этап работы включал: подбор питательных сред, определение методов репродукции бактериофагов; подбор штаммов размножения фагов; установление методов консервации, условий и сроков хранения конечного продукта производства.

При выборе питательных сред, используемых для размножения бруцеллезных бактериофагов было показано, что для их репродукции с успехом можно применять среды немясного происхождения (бульон и агар Альбими), при этом среднее значение концентраций получаемых фаговых препаратов составляло

2,0 ±0,4)х10п БОЕ/мл, что сопоставимо с концентрацией бактериофагов, получаемых на средах на основе мясного сырья. В то же время в качестве среды выбора для репродукции бруцеллезных бактериофагов можно использовать стандартизованную по своим показателям синтетическую питательную среду [патент Российской Федерации на изобретение № 2148638].

При сравнительной оценке методик размножения фагов (на бульонной культуре, в слое агаровой культуры, на агаровой культуре) было показано, что наилучший выход конечного продукта производства давала методика размножения бактериофагов в слое агаровой культуры. В то же время в виду трудоемкости ее осуществления при коммерческом производстве бактериофагов было определено, что применение указанного способа размножения возможно только для репродукции бруцеллезного бактериофага Вк2, воспроизводство которого не удалось осуществить двумя другими способами. В качестве метода выбора для репродукции данного фага можно применять методику размножения на бульонной культуре, однако в качестве жидкой питательной среды использовать разработанную нами синтетическую питательную среду, которая за счет стандартизованного состава обеспечивала получение бактериофага Вк2 в концентрации, удовлетворяющей нормативным требованиям.

Биотехнология производство фагов предусматривает ряд последовательно осуществляемых процессов (центрифугирование, фильтрация), которые в определенной мере являются небезопасными для персонала, занятого в технологическом цикле. В связи с этим для обеспечения биологической безопасности

178 отдельных этапов процесса производства была изучена возможность применения для размножения фагов Wb и Вк2 вакцинных штаммов В. suis 61 и В. melitensis RevI соответственно вместо стандартно используемых вирулентных культур (В. suis 1330, В. melitensis Ispania).

Для обоснования возможности осуществления репродукции бактериофагов на указанных вакцинных штаммах в сравнительном аспекте были изучены одиночного циклы их размножения на типичных кормилках и на предлагаемых нами вакцинных аналогах.

Проведенные исследования показали, что процесс размножения фагов на вакцинных штаммах характеризуется некоторым удлинением латентного периода по сравнению с репродукцией на вирулентных культурах, но в то же время незначительным увеличением выхода фагового потомства.

Предложенные штаммы (В. suis 61 и В. melitensis RevI) были апробированы в качестве штаммов размножения бруцеллезных бактериофагов. Репродукция бруцеллезных фагов Wb и Вк2 в данных условиях позволила обеспечить воспроизводство бактериофагов с конечной концентрацией и показателя ДРТ, удовлетворяющими нормативным требованиям.

Одним из важных аспектов биотехнологии производства бактериальных препаратов является обеспечение условий, исключающих возможность контаминации посторонней микрофлорой конечного продукта. В связи с этим для разработки технологических основ производства бруцеллезных бактериофагов было испытано применение в качестве консервирующих агентов различных концентраций хлороформа и толуола. При этом показано, что оптимальным является применение толуола до 0,25% и 0,5% концентрации в конечном препарате, который обеспечивал стерильность препарата и не влиял на его концентрацию.

С использованием подобранных оптимальных условий репродукции, были получены по 3 экспериментальных серии бруцеллезных бактериофагов Тб, Fi, Wb, размноженные на вакцинных штаммах в бульоне по предложенной методике и по 3 серии бактериофага Вк2, полученные путем репродукции в слое

179 агаровой культуры и на жидкой синтетической питательной среде. Каждая из серий фагов была произведена с использованием различных концентраций консервирующего агента (0,25%-и 0,5% толуола в конечном продукте).

Препараты бактериофагов были стандартизованы по количественным свойствам (концентрация и ДРТ) и по качественным показателям (специфичность и специфическая активность).

Полученные серии бруцеллезных бактериофагов имели достаточно высокую конечную концентрацию, обеспечивающую высокие значения ДРТ, что вполне удовлетворяло требованиям производства. Спектр их литической активности полностью соответствовал таковому у исходных образцов бактериофагов.

Важным этапом производства диагностических' препаратов является определение условий и сроков их годности. С этой целью были апробированы различные температурные режимы (+ 4 °С, 18-22 °С, 37 °С) и сроки хранения (1 -6 лет) фаговых препаратов

Было показано, что выживаемость нативных препаратов бруцеллезных фагов обратно пропорциональна температуре и времени хранения. При этом оптимальными условиями для жидких препаратов бруцеллезных диагностических бактериофагов является температурный режим, равный + 4 °С. Данные условия в течение первых двух лет наблюдения обеспечивали сохранение жизнеспособности препаратов в пределах 90% от исходной.-Другие испытанные температурные режимы хранения (18-22 °С, 37 °С) приводили к резкому снижению выживаемости (2,5±0,2%) фаговых препаратов уже в течение первого года наблюдения.

В результате проведенной серии экспериментальных исследований были предложены биотехнологические схемы экспериментально-производственного получения бруцеллезных диагностических бактериофагов (Тб, Wb, Fi, Bk2) При этом основополагающими технологическими моментами производства фагов являлись: репродукция бруцеллезных бактериофагов (Тб, Wb, Fi) осуществляется на бульонных культурах^вакцинных штаммов размножения {В. abortus 19,

180

В.suis 1330, В. abortus 19 соответственно) с использованием сред немясного происхождения (бульон Альбими); размножения бруцеллезного бактериофага Вк2 в технологической схеме производства предусматривает его репродукцию на вакационном штамме (В. melitensis RevI) в слое агаровой культуры также с использованием сред немясного происхождения (агар Альбими).

Предложенные технологические схемы легли в основу составленной нормативной документаци (ЭПР, ФСП, инструкций по применению) на бактеЧ риофаги диагностические бруцеллезные жидкие, одобренная Ученым Советом Ставропольского научно-исследовательского противочумного института (СтавНИПЧИ) [протокол № 5 от 28.05.2001 г.].

Разработанная нормативная документация (ЭПР, ФСП, инструкция по применению), три экспериментально-производственные серии препарата «Бактериофаги бруцеллезные диагностические жидкие» и проект программы Госиспытаний препарата представлены на экспертизу и контроль в Государственный институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов (ГИСК) им. JI.A. Тарасевича Ч

Бактериофаги диагностические бруцеллезные жидкие апробированы в НИИ микробиологии Министерства обороны Российской Федерации при идентификации и межвидовой дифференциации штаммов возбудителя бруцеллеза [акт внедрения, утвержденный начальником НИИ микробиологии МО РФ Е.Пименовым от 27 мая 2003 г.].

В ряде случаев имеется необходимость наработки фаговых препаратов, имеющих более высокие значения конечных концентраций, для чего нами была предложена оригинальная методика оптимизации условий размножения бруцеллезных бактериофагов Тб, Wb, Fi [патент Российской Федерации на изобре

Ч. тение № 2126833]. Для этого'были подобраны оптимальные соотношения концентрации фага и штамма размножения (множественность инфекции) в репродуктивной среде, равные 0,01-0,001, и предложено дополнительное внесение в среду размножения сульфатов кальция и магния в концентрации 0,001 М каждого, что обеспечивало выход бактериофага с конечной концентрацией на 1-2 порядка превышающей образцы, полученные по традиционной методике. Было также показано, что для оптимизации процесса размножения бруцеллезного фага Вк2 возможно использование указанной оригинальной методики, но с применением синтетической питательной среды, в которую дополнительно вносится только сульфат кальция в концентрации 0,001 М.

В настоящее время одним из наиболее эффективных способов сохранения исходных свойств микробиологических объектов является метод их лиофиль-ного высушивания, основанный на предварительном замораживании объектов и непосредственном высушивании при температуре, обеспечивающей щадящее удаление из объекта свободной и связанной влаги [Никитин Е.Е., Звягин И.В., 1971; Фадеева Л.Л.,1977; Белоус A.M., Гриценко В.И., 1994].

При этом основные условия, которые необходимо определить при разработке данного способа стабилизации диагностических препаратов является подбор криопротекторов и режимов лиофилизации.

В проведенных экспериментах были апробированы 5 описанных и наиболее эффективных для фаговых препаратов стабилизирующих систем: 5% раствор бессолевого пептона; 20% раствор лактозы; 10% раствор глютамата натрия; пептоно-желатиновая ихахарозо-желатиновая среды.

Оценивая возможность применения тех или иных стабилизаторов для лиофильного высушивания бруцеллезных диагностических бактериофагов по критерию выживаемости, было отдано предпочтение 20% раствору лактозы и пептоно-желатиновому стабилизатору, которые обеспечивали сохранение 7075% жизнеспособных фаговых корпускул в сухом препарате.

Одним из важных критериев, определяющих свойства сухих препаратов, является показатель потери в массе при высушивании. Для бруцеллезных бактериофагов показано преимущество пептоно-желатинового криопротектора в качестве стабилизатора процесса высушивания, который обеспечивал потерю в массе при высушивании в фаговых препаратах - 2,73±0,17%, что удовлетворяло нормативным требованиям (не более 3%).

Исходя из того, что для каждого бактериофага и защитной среды оптимальный режим высушивания может иметь различающиеся параметры, нами были испытаны разные режимы лиофилизации, которые отличались, в основном, диапазоном температурных колебаний, а, следовательно, и скоростью высушивания препаратов.

При этом была апробировано три режима лиофилизации бруцеллезных бактериофагов. Во всех наблюдениях предварительное замораживание препаратов проводили в течение 6 ч при температуре - 40 °С. В дальнейшем были использованы: 18-часовой режим лиофилизации, при котором сублимация материала (как процесс удаления основной влаги) проходила в течение 10 ч, а процесс досушивания составлял 8 ч при конечной температуре подогрева 27±2,5 °С и температуре биоматериала 25 °С; 14-часовой режим - процесс удаления основной влаги проходил в течение 8 ч, удаление связанной влаги при температуре нагрева, равной 45 °С, - в течение 6 ч; 12-часовой режим, при которой удаление основной влаги проводили за 6 ч, удаление связанной влаги при температуре нагрева, равной 65 °С, - в течение 6 ч.

Установлено, что применение 18-часового режима лиофилизации обеспечивало наилучшие результаты выживаемости бруцеллезных бактериофагов в конечном продукте производства (72,48+1,52%). При этом использование обеих сред высушивания (лактоза, пептоно-желатиновая) давало практически равнозначные результаты.

Более жесткий из примененных режимов, при котором досушивание препаратов осуществлялось при температуре 45°С, обеспечивал также получение препаратов в определенной степени удовлетворяющих требованиям производства: средняя выживаемость бактериофагов независимо от используемого стабилизатора составляла 46,52+2,14%, при некотором преимуществе использования в качестве стабилизатора 20% раствора лактозы. Следует отметить, что при таком режиме лиофилизации улучшался показатель потери в массе при высушивании, который при использовании в качестве стабилизатора 20% раствора лактозы составлял 2,96+0,16% .

7 —

Применение самого жесткого режима лиофилизации (продолжительность 12 ч, досушивание при 65 °С) дало неудовлетворительные результаты: выживаемость составила около 3% в сухих препаратах бактериофагов.

Оценка использования различных концентраций толуола в качестве ингибитора посторонней микрофлоры при проведении лиофилизации препаратов бруцеллезных бактериофагов показала преимущество использования 0,5% раствор толуола, обеспечивающего стерильность конечного продукта производства при сохранении исходных свойств препаратов на достаточно высоком уровне.

Таким образом, рекомендуемым режимом лиофилизации бруцеллезных бактериофагов следует считать 18-часовой режим с применением пептоно-же-латинового стабилизатора. В качестве метода выбора может быть использован 14-часовой режим лиофилизации с применением 20% раствора лактозы или пептоно-желатинового стабилизатора.

•ч,

Полученные лиофилизйрованные формы бруцеллезных бактериофагов были испытаны на возможность длительного хранения в различных температурных режимах (+ 4 °С, 18-22 °С, 37 °С). При этом было установлено, что оптимальным как и для жидких форм является их хранение при + 4 °С. В данных условиях концентрация препаратов и литическая активности в течение трех лет наблюдения оставалась практически на исходном уровне.

Таким образом, стабилизация препаратов бруцеллезных бактериофагов методом лиофильного высушивания позволила увеличить срок их годности до трех лет, что обеспечивает больший экономических эффект производства.

Совершенствование методики постановки теста на фагочувствительность связано с тем, что в ряде случаев приходится проводить межвидовую дифференциацию большого количества штаммов возбудителя бруцеллеза. Работа в этом направлении осуществлялась путем приготовления препаратов бруцеллезных диагностических бактериофагов Тб, Bk2, Wb, Fi на бумажных носителях (фаговые диски, градиентные полоски). Были подобраны оптимальные условия, дозы и концентрации имперегнируемых бактериофагов. Способ приготовления

184 градиентных фаговых препаратов для оценки пороговой чувствительности штаммов бруцелл защищен патентом Российской Федерации на изобретение № 2137610.

Использование фаговых препаратов на бумажных носителях значительно упрощало постановку теста на фагочувствительность штаммов бруцелл по сравнению с традиционными методами, обеспечивая те же достоверные результаты теста.

Сравнительная оценка .^охранения свойств фаговых препаратов на бумажных носителях в зависимости от условий и сроков хранения показало, что срок их годности составляет 1 год при содержании образцов в условиях холодильника при температуре + 4 °С.

Возможность применения фаговых дисков и градиентных фаговых препаратов для определения фагочувствительности штаммов возбудителя бруцеллеза была апробирована на микроорганизмах рода Brucella как референтных, так и выделенных из различных источников и находящихся в коллекции Став-НИПЧИ в сравнении с традиционно применяемыми методами. При этом было установлено полное совпадение полученных результатов.

Для оптимизации и унификации методики постановки пробы с бактериофагом был предложен способ, при котором на агаровые пластинки репликатором наносится смесь, приготовленная в соотношении 1:3—1:4, взвеси исследуемого штамма в фосфатном буфере и бактериофага, предварительно проинкубированная в течение 20-30 мин при 37 °С. При этом чувствительность штамма к лизирующему действию бактериофага определялась по наличию или отсутствию роста в месте нанесения смеси на агаровую пластинку. Использование данной методики позволило значительно интенсифицировать процесс межвидовой дифференциации штаммов бруцелл за счет возможности одномоментного тестирования большого количества штаммов. Предложенных способ защищен патентами Российской Федерации на изобретение № 2010853 и № 2059722.

В связи с тем, что в настоящее время основная заболеваемость людей бруцеллезом обусловлена штаммами бруцеллезного микроба видов В. melius tensis, В. abortus, В. suis имелась необходимость подбора минимального набора тестов, позволяющих проводить межвидовую дифференциацию данных представителей рода Brucella.

В результате проведенных исследований для этих целей было предложено использование стандартных тестов родовой специфичности с последующим определением их видовой принадлежности с использованием трех тестов, выполняемых параллельно: определение чувствительности штаммов к лизирую-щему действию бруцеллезных бактериофагов Тб и Вк2 и определение аденин-дезаминазной активности. Использование предложенных тестов позволяло сократить сроки дифференциации выделяемых штаммов возбудителя бруцеллеза с 6 до 2 сут.

Предлагаемые тесты для дифференциации возбудителя бруцеллеза являлись технически простыми и информативными, что наряду с легкой воспроизводимостью и быстротой получения результата (48 ч) позволяло рекомендовать их для использования при предварительной дифференциации штаммов бруцелл в бактериологических лабораториях отделов особо опасных инфекций центров ГСЭН всех уровней.

Библиография Диссертация по биологии, доктора медицинских наук, Ляпустина, Лариса Вениаминовна, Саратов

1. Абрамов B.C., Агафонов Л.М. Разработка оптимальных условий сушки противогриппозной вакцины // Специфическая профилактика инфекционных заболеваний: Тр. Ленингр. науч.-исслед. ин-та вакцин и сывороток М., 1959 — Т.2.- С.403-409.

2. Авилов В.М., Селиверстов В.В., Пылинин В.Ф., Шумилов К.В., Калмаков В.В. Бруцеллез животных и его специфическая профилактика // Ветеринария.-1997-№7-С.3-13.

3. Адаева Н.Ф. К вопросу о специфичности чумных и псевдотуберкулезных бактериофагов // Тр. науч.-исслед. ин-та микробиол. и эпидемиол. Юго-Восто-ка СССР.- Саратов, 1951.- Вып. 1.- С.260-264.

4. Антоненко А.Д. 'Эпидемиологические особенности современного бруцеллеза // Здоровье и болезнь как состояния человека Ставрополь, 2000.-С.704-708.

5. Аркадьева З.А., Безбородов A.M., Блохина И.Н. Промышленная микробиология-М.: Высшая школа, 1989.-688 с.

6. Арутюнов Ю.И. Биологическая характеристика чумных и псевдотуберкулезных бактериофагов // Журн. микробиол.— 1970 №8 - С. 187-193.

7. Балахонов С.В., Белькова С.А., Гремякова Т.А., Шайхутдинова Р.З. О возможности внутривидового типирования Yersinia pestis бактериофагами•ч

8. FP1 и FP3 // Актуальные аспекты природно-очаговых болезней: Материалы межрегиональной науч.-практич. конф. 16-17 окт. 2001 г., посвящ. 80-летию Омского НИИПИ Омск, 2001.- С. 170-172.

9. Белоус A.M., Гриценко В.И. Криобиология Киев: Наукова думка, 1994.-431 с.

10. Белоус A.M., Цветкова Ц.Д. Научные основы технологии сублимационного консервирования Киев: Наукова думка, 1985 - 208 с.

11. Бессонова А.А., Молодцова П.Ф., Мосолова О.П. О дифференциации В. pestis и В. pseudotuberculosis rodentiun Pfeufera при помощи чумного•чбактериофага // Вест, микробиол., эпидемиол. и паразитологии- 1938-T.XYII Вып.3-4- С.228-232.

12. Бибикова А.Д. О сущности и значении бактериофагии. Сооб.8. О методике и результатах применения антифаговой сыворотки // Тр. Ростов. н/Д. гос. науч.-исслед. противочумного ин-та — 1946-Т.5.— С.12-19.

13. Бланков Б.И., Клебанов Д.И. Применение лиофилизации в микробиологии-М., 1961.— С.57-60, 86-87.

14. Брандзишевский Ю.В. Сублимация как метод консервации холерных фагов: Автореф. дисс. . канд. биол. наук-Саратов, 1976 15 с.

15. Брандзишевский Ю.В., Остроумова Н.М., Павлов В.А., Лискина И.В., Заболотная О.С. Технология изготовления лиофилизированного препарата холерных диагностических фагов // Пробл. особо опасных инфекций-1974 Вып.1(35).- С.78-81.

16. Брандзишевский Ю.В., Остроумова Н.М., Филиппов А.Ф., Павлов В.А. Метод ускоренной лиофилизации холерных диагностических фагов // Пробл. особо опасных инфекций 1973-Вып.6(34).- С.100-102.

17. Брандзишевский Ю.В., Усленская J1.B., Павлов В.А., Остроумова Н.М. Опыт лиофилизированного высушивания холерного диагностического фага // Пробл. особо опасных инфекций 1972 - №4.- С.201-204.

18. Бургасов П.Н., Рожков Г.И. Сибиреязвенная инфекция.- М.: Медицина, 1984.-208 с.

19. Быкова З.А. Взаимодействие чумного бактериофага с бактериями // Тр. Арм. противочумной станции 1964.- Вып.З - С. 187-193.

20. Волосивец А.И. Изучение фагов и фагоустойчивых мутантов чумных бактерий: Автореф. дис. канд. мед. наук.-Саратов, 1964 18 с.

21. Высеканцева И.П. Биологические свойства криоконсервированных бактериофагов: Автореф. дисс. . канд. мед. наук-Харьков, 1983.-23 с.

22. Гайский Н.А. Инфекция и иммунитет у животных, залегающих в спячку // Изв. Иркутского науч.-исслед. противочумного ин-та Сибири и Дальнего Востока.- 1944.- Т.2.- С*82-83.

23. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия М.: Медицина, 1961.- 299 с.

24. Гольдфарб Д.М., Беляев Д.Л. Мутагенез фага Т2 при комбинированном действии химических мутагенов // Генетика 1966- № 6.- С. 113-117.

25. Гремякова Т.А. Структурно-функциональная вариабельность антигенов Yersinia pestis и методология конструирования противочумных иммуно-профилактических препаратов // Автореф. дисс. . докт. мед. наук М., 2004.— 37 с.

26. Груз Е.В. Испытание специфического бактериофага «ВА-9» для идентификации бацилл антракса // Антракс. (Вопросы иммунологии, клиники и лабораторной диагностики).- Кишинев: Картя Молдовеняскэ, 1964 С.152-156.

27. Дегтярев Б.М., Кадетов В.В. Электронномикрскопическое изучениеструктуры холерных фагов 455, 8556. 3119, замороженных до 196 °С с различными с различными скоростями // Областная науч.-техн. конф.: Тез. докл.-Ростов на/Д., 1991.- С.44-45.

28. Доброхотова Н.Д. Течение чумной инфекции в организме малых сусликов // Тр. Всесоюз. науч.-исслед. противочумного ин-та «Микроб».-1959- Вып.З.- С. 126.

29. Долинов К.Е. Основы технологии сухих биопрепаратов М.: Медицина, 1969.-С.97-102.

30. Дрожевкина М.С. Бруцеллезный бактериофаг. Явление бактериофагии в бруцеллезных культурах и выделение первых штаммов бактериофага //ч

31. Журн. микробиол- 1951.-№ 11.-С.34-37.

32. Дрожевкина М.С. Проба с бактериофагом как метод идентификации нетипичных бруцеллезных культур // Журн. микробиол 1953.- № 6 - С. 7-11.

33. Дрожевкина М.С. Поливалентный бруцеллезный бактериофаг, его специфичность и валентность // Тр. Ростов. н/Д. гос. науч.-исслед. противочумного ин-та.- 1957.- T.XII.- С.392-402.

34. Дрожевкина М.С. Бактериологическая диагностика бруцеллеза в свете новейших данных по микробиологии возбудителя // Тр. Ростов. н/Д. гос. науч.-исслед. противочумного ин-та 1957а —Т.ХИ.— С.З54-361.

35. Дрожевкина М.С. Результаты изучения лизогении у бруцелл // Генетика, биохимия и иммунохимия особо опасных инфекций.- Изд-во Ростов, ун-та, 1967-Вып. 1.-С. 43-53.

36. Дрожевкина М.С. Попытка использования бактериофага для определения вида бруцелл, выделенных от оленей // Диагностика особо опасных инфекций Изд-во Ростов, ун-та, 1968.— С.155-160.

37. Дрожевкина М.С., Кирицева А.Д. Опыт применения бруцеллезного бактериофага для идентификации культур, выделенных от абортированных ягнят // Тр. Ростов. н/Д. гос. науч.-исслед. противочумного ин-та 1955.- T.IX1. С.130-132.

38. Дрожевкина М.С., Киселева В.И. Новый поливалентный фаг для идентификации бруцелл // Диагностика особо опасных инфекций Изд-во Ростов. ун-та, 1968-С.150-154.

39. Дрожевкина М.С., Киселева В.И., Кудрякова Т.А. Вирулентные фаги культур вида melitensis // Генетика, биохимия и иммунохимия особо опасных инфекций.- Изд-во Ростов, ун-та, 1967 Вып.1.- С.54-59.

40. Дрожевкина М.С., Мишнаевский М.Н., Уралева B.C. Специфический бактериофаг в организме бруцеллезных больных // Тр. Ростов. н/Д. гос. науч.-исслед. противочумного ин-та- 1957-T.XII -С.403- 423.

41. Дрожевкина М.С., Толстокорова В.И. Выделение бруцеллезного бактериофага из абортированных плодов сельскохозяйственных животных // Тр. Ростов. н/Д. гос. науч.-исслед. противочумного ин-та- 1957- T.XII-С.424-427.

42. Дрожевкина М.С., Уралева B.C., Черченкова Н.А. Опыт применения бруцеллезного бактериофага для идентификации гемокультур, выделенных от больных бруцеллезом людей // Тр. Ростов. н/Д. гос. науч.-исслед. противочумного ин-та.- 1955-T.IX-С.133-140.

43. Дрожевкина М.С., Харитонова Т.Н. Лизогения у бруцелл // Вопросы вирусологии 1958 - № 2.- С.93-97.

44. Дружинина И.П., Наумшина М.С., Князевская Э.С. К вопросу о специфичности чумного поливалентного бактериофага // Тр. Всесоюз. науч.-исслед. противочумного ин-та «Микроб».- I960 Вып.4 - С.235-240.

45. Елфимова А.С. О бактериофаге гладких желтых вариантов чумного микроба // Тр. Ростов. н-Д.гос. науч.-исслед. противочумного ин-та- 1959-T.XV Вып.1-С.161-163.

46. Земцова И.Н. Характеристика сибиреязвенного бактериофага и его применение для лабораторной диагностики сибирской язвы: Автореф. дис. . канд. мед. наук Саратов, 1965 - 14 с.

47. Зенкова Н.Ф. Бактериофагия у бруцелл, выделенных в Казахстане // Бруцеллез в Казахстане.: Тр. Казахского ин-та краевой патологии Алма-Ата, 1965.-T.XIII.-С. 17-24.

48. Ипатенко Н.Г. Испытание сибиреязвенных бактериофагов // Ветеринария- 2000 №6 - С.22-23.

49. Ипатенко Н.Г., Маничев А.А., Седов В.А., Гущин В.Н. Испытание сибиреязвенного бактериофага К ВИЭВ и Гамма МВА // Ветеринария.- 1989-№10 С.58-59.

50. Каганова Л.С., Щукина Т.А. К вопросу о специфичности чумных и псевдотуберкулезных бактериофагов // Журн. микробиол- 1947 № 7 — С.62-66.

51. Кадетов В.В. Криоконсервация и лиофилизация холерных фагов: Автореф. дисс. . канд. биол. наук Саратов, 1994.- 24 с.

52. Кадетов В.В., Кубрякова Т.А., Терентьев А.Н., Качкина Г.В., Бородина Т.Н., Саямов С.Р. Технология лиофильной консервации чумных фагов // Биотехнология.- 1998 №3- С.63-67.

53. Калиновский А.И., Иннокентьева Т.И., Лемешко Р.А., Гордеев П.П. Современные аспекты эпидемиологии и профилактики бруцеллеза // Журнал инфекционной патологии 1998 - Т.5, №.4 - С.6-11.

54. Киселева В.И. Выделение вирулентного фага из штамма В. suis 1330II Биохимия, генетика и иммунология (особо опасные инфекции).- Ростов н/Д., 1968.-С. 121-125.

55. Киселева В.И. Проба фагом для идентификации бруцелл с использованием бумажных дисков // Диагностика особо опасных инфекций Изд. Ростов, ун-та, 1968.-С.147-149.

56. Ковалева Р.В. Монгольские расы чумного бактериофага // Тр. Ростов. н/Д. гос. науч.-исслед. противочумного ин-та 1960-С. 115-116.

57. Коляков В.Я., Байрак В.А. Об индикаторных сибиреязвенных бактериофагах //Материалы 8-й науч. конф. Московской ветеринарной академии-М., 1962.-С. 12-14.

58. Кондратьева О.В., Степанов В.И. К изучению питательных потребностей бруцелл. Сообщ.1 // Микробиология и иммунология особо опасных инфекций-Саратов, 1968-С.335-336.

59. Кондратьева О.В., Степанов В.И. К изучению питательных потребностей бруцелл. Сообщ.2 // Пробл. особо опасных инфекций Саратов, 1969-С.154-155.

60. Коробкова Е.И. Действие бактериофага на R- и S-варианты чумы и появление авирулентных мутантов // Вестник микробиол., эпидемиол. и паразитологии.- 1937.-T.XYI.-Bbin.l-2.-C.3-12.

61. Коробкова Е.И., Павлова Л.П. О влиянии лизогении, обнаруженной в одной из субкультур чумного вакцинного штамма ЕВ Girard & Robic // Журнал гигиены, эпидемиол., микробиол. и иммунол Прага, I960 - Т.4, № 3-С.3-30.

62. Кривиский А.С., Белых Р.И., Будовский Э.И. Мутагенное и инактивирующее действие О-метилгидроксиметана на бактериофаг % 174 и его инфекционную ДНК//Генетика 1973-№8- С.105-1'14.

63. Кудрякова Т.А. Выделение вирулентных мутантов умеренных фагов бруцелл // Генетика, биохимия и иммунохимия особо опасных инфекций,-Изд. Ростов, ун-та, 1968-Вып. 1 -С.65-72.

64. Кудрякова Т.А. Опыт лизогенизации бруцелл умеренными бактериофагами // Биохимия, генетика и иммунология (особо опасные инфекции).— Ростов. н/Д, 1968а.-С.110-116.

65. Лабораторная диагностика сибирской язвы у животных и людей, обнаружение возбудителя в сырье животного происхождения и объектах внешней среды: Методические указания М.: ВО Агропромиздат, 1989 - 32 с.

66. Лакин Г.Ф. Биометрия.- М., 1990.- 352 с.

67. Ларина B.C. Лиззгения чумного микроба // Материалы межинст. конф. по генетике «Внехромосомные факторы наследственности у бактерий».-М., 1969 С.43-54.

68. Ларина B.C. Об умеренном бактериофаге возбудителя чумы // Пробл. особо опасных инфекций 1970 - № 2 - С. 65-68.

69. Ларина B.C. Характеристика чумных умеренных фагов и их мутантов, выделенных из диких лизогенных клонов чумного микроба // Теоретич. и практич. вопросы бактериофагии-Тбилиси, 1974.-С.241-243.

70. Левина Е.Н., Архипова В.Р. Сравнительное изучение сибиреязвенных бактериофагов // Журн. Микробиол.- 1967 №9 - С.24-28.

71. Лешкович Н.Л. Новые данные о лизогении у возбудителя чумы // Пробл. особо опасных инфекций Саратов, 1974.- Вып.5 (39).- С.40-44.

72. Ломов Ю.М. Биологическая характеристика вирулентных бактериофагов Br. abortus. Сооб.2. О специфичности бруцеллезных бактериофагов // Биохимия, генетика и иммунология (особо опасные инфекции).- Ростов. н/Д, 1968 С.95-100.

73. Ломов Ю.М. Устойчивость фагов Br. abortus к воздействию физических и химических факторов // Пробл. особо опасных инфекций— 1969 — Вып.5.-С.194-198.

74. Ломов Ю.М. Некоторые биологические свойства бруцеллезных фагов //Журн. микробиол 1969а.-№1.- С. 117-121.

75. Майский В.Г. Простой метод определения аденозиндезаминазы у бактерий //Лаб. дело.- 1988.-№12-С.71-72.

76. Мамацашвили Э.Г. Получение бруцеллезного бактериофага и установление его свойств // Бактериофагия Тбилиси, 1957 - С.327-332.

77. Марьина Ю.И. О некоторых свойствах чумных бактериофагов, выделенных из организма животных и чистых культур // Тр. Ростов. н/Д гос. науч.-исслед. противочумного ин-та Наркомздрава СССР Росиздат, 1939 - Т.1.— С.68-78.

78. Меринов С.П., Широков В.А., Репина Л.П. Вопросы обмена пури-новых и пиримидиновых оснований у бруцелл // Международные и национальные аспекты эпиднадзора при чуме Иркутск, 1975- Ч.П.- С.166-170.

79. Методические рекомендации по профилактике и лабораторной диагностике бруцеллеза людей М., 1980 - 54 с.•ч

80. Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям: Методические указания (МУК 4.1/4.2.588-96).- М., 1998 -128 с.

81. Михалева В.Я. Новый носитель чумы — пищуха Прайса // Изв. Иркутского противочумного ин-та Сибири и Дальнего Востока- 1949.- Т.7.-С.78-81.

82. Мремлишвили Г.М. Термодинамические свойства биополимеров в спиральном и клубковом состоянии в интервале температур 4-400 0 С // Биофизика.- 1977 Вып.22, № 1.- С. 180-190.7 -ч.

83. Никитин Е.Е., Звягин И.В. Замораживание и высушивание биологических препаратов-М.: Колос, 1971.— 184 с.

84. Новосельцев Н.Н. О выделении умеренных фагов чумного микроба // Генетика, биохимия и иммунохимия особо опасных инфекций Ростов н/Д., 1967.- Вып. 1.-С.91-98.

85. Новосельцев Н.Н. К характеристике умеренного чумного Н-фага // Проблемы особо опасных инфекций 1970.-Вып.5 —С.74-80.

86. Новосельцев Н.Н. Умеренный фаг чумного микроба: Автореф. дис. . д-ра мед. наук Саратов, .1-973.- 44 с.

87. Новосельцев Н.Н., Арутюнов Ю.И. Некоторые закономерности взаимодействия умеренных и вирулентных фагов с микробом чумы // Пробл. особо опасных инфекций Саратов, 1970 - Вып.6 (16).- С.82-86.

88. Новосельцев Н.Н., Арутюнов Ю.И., Токарев С.А., Кирдеев В.К. Электронномикроскопическое исследование фагов чумного микроба // Журн. микробиол.-1971.-№3.-С. 16-19.

89. Новосельцев Н.Н., Марченков В.И. Фаг Y. pestis нового серовара // Журн. микробиол 1990 - №10 - С.9-12.

90. Онищенко Г.Г., Монисов А.А., Гульченко Л.П., Федоров Ю.М. Заболеваемость зооантропонозными и природноочаговыми инфекциями и меры по их профилактике // Журн. микробиол 1999 - №4.- С. 14-17.

91. Организация и проведение эпидемиологического надзора в природных очагах чумы на территории Российской Федерации: Методические указания (МУ 3.1.1098-02).-М., 2002.-103 с.

92. Орлова В.А. Выделение фагов из инагглютинабельных штаммов бруцелл // Актуальные вопросы профилактики бруцеллеза и организации медицинской помощи больным: Тез. докл. Всесоюз. конф. (Новосибирск, 24-25 окт., 1989 г.).- М., 1989.- С.65-66.

93. Основы бактериофагии / Под ред. И.М.Габриловича.— Минск: Вышейшая школа, 1973.-224 с.

94. Островская Н.Н. Распространение бруцеллезного бактериофага в культурах бруцелл и характеристика последних // Изменчивость микроорганизмов.-М., 1957.-Т.2.-С.88-102.

95. Островская Н.Н. Бруцеллезный бактериофаг и некоторые его свойства // Тез. второй межинститутской конф. по проблеме бактериофагии, созываемой в г.Тбилиси при науч.-исслед. ин-те вакцин и сывороток (18-21 нояб. 1959 г.).-Тбилиси, 1959.- С.39-41.

96. Островская Н.Н. К характеристике бруцеллезного бактериофага Тб // Журн. микробиол.- 1961.-№6.- С.70-78.

97. Островская Н.Н. Бруцеллезные бактериофаги и их значение в изменчивости бруцелл: Автореф. дисс. докт. мед. наук Москва, 1969 — 32 с.

98. Островская Н.Н., Кайтмазова Е.И. Проба фагом «Тб» как дополнительный тест для дифференциации видов бруцелл // Журн. микробиол — 1966-№3- С. 75-79.

99. Островская Н.Н., Толмачева Т.А. Динамика адсорбции антибруцеллезного фага Тб на клетках Br. abortus, melitensis и suis II Журн. микробиол — 1968 № 9.- С.79-83.

100. Островская Н.Н., Чистякова Ф.В. Распространение бруцеллезного бактериофага среди культур бруцелл и характеристика последних // Изменчивость микроорганизмов- М., 1957 —Т.2.-С.88-101.

101. Павлова И.И. Изучение морфологии и биохимических свойств фагов Вас. anthracis и Вас. cereus II Журн. микробиол 1971.- №7 - С. 147.

102. Париж Б.М. Исследование условий повышения качества ряда вирусных препаратов // Доклад по совокупности выполненных и опубликованных работ на соиск. уч. степени канд. мед. наук М., 1975.- 47 с.

103. Перемитина Л.Д^ Методическое руководство по лабораторной оценке качества бактериальных и вирусных препаратов М., 1972 - С.265-269.

104. Петренко В.А., Гусев В.А., Семенова Л.Н. Инактивация и мутагенез фага лямбда под действием О-метилгидроксиламина и О-аминооксибутилгид-роксиламина// Мол. биология 1982-Т. 16-№3 -С.637-643

105. Печникова И.В., Тинкер А.И. Влияние сред высушивания на способность чумной вакцины ЕВ вызывать продукцию антител в организме экспериментальных животных // Пробл. особо опасных инфекций. Саратов, 1977 — Вып.З.- С.32-34.

106. Покровская М.П. Чумной бактериофаг в трупах сусликов // Гигиена и эпидемиология- 1929-№1*2-С.31-37.

107. Покровская М.П. К изучению чумного бактериофага // Журн. эпид. и микробиол 1933 - №6- С. 1-17.

108. Попхадзе М.З. Использование бруцеллезного бактериофага Тб для дифференциации бруцелл // Журн. микробиол 1968 - №2 - С.119-124.

109. Попхадзе М.З. Бруцеллезные фаги. Выделение, биологические свойства, практическое применение): Доклад, представленный на соискание ученой степени канд. мед. наук по совокупности опубликованных работ.- Тбилиси, 1974.-47 с.

110. Попхадзе М.З., Абашидзе Т.Г. Характеристика бруцеллезного бактериофага, выделенного в ТбилНИИВС // Тез. докл. межинститутской конференции по проблеме бактериофагии (Тбилиси, 1955 г.).-Тбилиси, 1957.- С.40.

111. Попхадзе М.С., Антадзе И.А. Сравнительное изучение свойств фагов, выделенных из разных видов бруцелл // Бактериофаги: Теоретические и практические вопросы-М., 1983-С.58-63.

112. Практическое пособие по бактериофагии / Под редакцией И.М. Габриловича-Минск, 1968 156 с.

113. Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллёза людей: Методические указания (МУ 3.1.7.1189-03).- М., 2003.- 59 с.

114. Рапопорт И.А., Шигаева М.Х., Ахматуллина Н.Б. Химический мутагенез (проблемы и перспективы).- Алма-Ата: Изд-во «Наука» КазССР-1980.-319 с.

115. Русалеев B.C. Взаимодействие сибиреязвенного бактериофага 3-17 со штаммами Bacillus anthracis II Ветеринария 1991- №5.- С.26-28.

116. Сагатовский В.Н., Кирдеев В.К. Простой аппарат для высушивания живой чумной и туляремийной вакцины // Тр. Ростов. н/Д гос. науч.-исслед. противочумного ин-та 1959 - Т. 16 - С.89-95.

117. Сергиенко Ф.Е., Шульц В.М., Натович А.Л. Выделение бактериофагов из культур бруцелл // Микробиологический журнал.- 1940 Т.7.- №1-2-С.175.

118. Сидякина Т.М. Консервация микроорганизмов // Консервация генетических ресурсов Пущино: Изд-во ОНТИ НЦ ВИ АН СССР, 1985.- 63 с.

119. Синтетическая питательная среда для выращивания бруцелл: Патент РФ № 2138638 МКИ7 C12N1/20, А61К30/10, C12Q1/04 / Р.Е. Цыганкова, В.Г. Майский, Г.И. Лямкин, Л.В. Ляпустина // Опубл. 10.05.2000.- Бюл. № 13.

120. Солодовников Б.В. Совершенствование биотехнологии производства сибиреязвенного диагностического бактериофага: Автореф. дисс. . канд. биол. наук — Ставрополь, 2002,- 21 с.

121. Солодовников Б.В., Цыганкова О.И., Тюменцева И.С., Ефременко В.И. Оптимизация условий культивирования сибиреязвенного бактериофага // Материалы науч.-практич. конф., посвящ. образованию противочумной службы России — Саратов, 1997 Т.2.- С.273.

122. Солодовников Б.В., Цыганкова О.И., Тюменцева И.С., Ефременко В.И. О технологии получения сибиреязвенного бактериофага // Материалы науч.-практич. конф., посвящ.образованию противочумной службы России.- Саратов, 1997а.-Т.2.-С.274.

123. Способ выращивания сибиреязвенного бактериофага Гамма: Патент РФ, МКИ 6 C12N1/20 / О.И. Цыганкова, Б.В. Солодовников // Опубл. 20.07.99,- Бюл. №20.

124. Способ получения сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26: Патент РФ № 2171842, МПК7£12Ы1/20 / Б.В. Солодовников, И.С. Тюменцева, В.И. Ефременко, Е.Н. Афанасьев // Опубл. 10.07.01- Бюл. №22.

125. Стегний М.Ю. Влияние криоконсервации на сохранение и биологические свойства вируса // Успехи современной криобиологии: Тез. докл. 2-ой междунар. конф-Харьков, 1992-С.168.

126. Стрельчук С.И. Основы экспериментального мутагенеза- Киев, 1981.-215 с.

127. Таран И.Ф. Занина В.М., Лямкин Г.И., Цыбин Б.П., Тихенко Н.И. Сравнительное изучение спектра литического действия бактериофагов Тб, Wb, Fi, Bk2 и R // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол 1983 - №2 — С.48-52.

128. Терентьев Ф.А. Бактериофаг Вас. anthracis II Тр. Всесоюз. ин-та экспериментальной ветеринарии 1937.— Т. 13.— С.65.

129. Тинкер А.И. Влияние температуры предварительного замораживания на число жизнеспособных микробов в сухой противочумной вакцине ЕВ // Особо опасные и природноачаговые инфекции 1962 - С. 192-197.

130. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий- М., 1968215 с.

131. Толмачева Т.А. Изучение процесса адсорбции бактериофага «Тб» на JI-клетках бруцелл // Актуальные вопросы иммунодиагностики особо опас1. Ч,ных инфекций: Тез. докл. Всесоюз. науч.-практич. конф. (26-27 мая 1986 г.).-Ставрополь, 1986.-Ч. II.-С.137-139.

132. Туманский В.М., Ромашева Е.А. К вопросу о выделении бактериофага из блох, собранных в естественных условиях // Тр. Всесоюз. науч.-исслед. противочумного ин-та «Микроб».- I960 Т.4 - С.414-417.

133. Туманский В.М., Ящук А.П. К вопросу применения чумного бактериофага для диагностики чумной палочки // Вестн. микробиол., эпидемиол. и паразитологии.- 1938.- T.XYII.- Вып.3-4.- С.232-234.

134. Тюлембаев М.А., Добрица В.П., Бекетов Б.И., Пазылов Е.К., Мед•ч.веденко Н.П., Хапилина Т.Ю. К вопросу применения бруцеллезных бактериофагов в диагностике // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане Ал-маты, 1999.-Вып. 1.-С.235-237.

135. Тюлембаев М.А., Разумнова В.Ф. Стабилизация литической активности холерных типирующих монофагов 1-7 методом сублимации // Материалы науч. практич. конф., посвящ. образованию противочумной службы России-Саратов, 1997.- Т.2.-С.277.

136. Фадеева Л .Л. Общая вирусология М., 1977.- С. 108-114.

137. Фадеева Л.Л., Халецкая Э.В., Селеднева А.Ю. Консервация вирусов различных групп для целей длительного хранения // Методы исследования в молекулярной, общей и медицинской вирусологии-М., 1987-С.66-73.

138. Харис М.М. Применение замораживания высушивания в биологии.-М., 1956.-273 с.

139. Цыганкова Р.Е. Усвоение предшественников нуклеиновых кислот бактериями рода Brucella: Автореф. дисс. . канд. мед. наук Саратов, 1991.— 16 с.

140. Черкасова К.И. К усовершенствованию диагностики чумы // Журн. микробиол 1945 - №12- С. 90-91.

141. Черкасский Б.Л., Иванова А.А. Эпидемиологическая ситуация по зоонозам в России // Эпидемиология и инфекционные болезни 1996 - №2-С.12-15.

142. Черник Т.П., Серебряный A.M. Мутагенное действие нитрозоалки-дов на внеклеточные фаги и бактериальную трасформирующую ДНК // Гене-тика.-1972.- №9.- С. 127-139.

143. Шашаев М.А. Биологическая характеристика чумных бактериофагов // Журн. микробиол 1964 - Т. 12 - С.32-35.

144. Шашаев М.А. Дифференциальная характеристика фагов чумного и псевдотуберкулезных микробов: Автореф. дисс. . канд. мед. наук — Алма-Ата, 1965.-27 с.

145. Шашаев М.А. Биология чумного и близкородственных ему бактериофагов: Дисс. канд. мед.наук- Алма-Ата, 1971 -205 с.

146. Шиганова Л.Б. Усовершенствование диагностических холерных монофагов ХДФ-3, ХДФ-4, ХДФ-5: Автореф. дис. .канд. мед. наук.- Саратов, 1982.- 19 с.

147. Abshire T.G., Brown J.E., Teska J.D., Allan C.M., Redus S.L., Ezzel

148. J.W. Validation of the use of Qamma phage for identifying Bacillus anthracis II 4th International conference on anthrax.- Annapolis, Maryland, USA, June 10-13, 2001.- P.30.

149. Ackerman H.W., Simon F., Verger J. A survey of brucellaphages and morphology of new isolates // Intervirology.- 1981.- Vol.16.- P. 1-7.

150. Адаме M. Бактериофаги: Пер. с англ.- М.: Иностранная литература, 1961.- 528 с.

151. Advier М. Characteres d'un principe lysant le bacille pasteur ritire du sand human // Сотр. rend. soc. Biol.- 1932.- Vol.110.- P.161-163.

152. Allardet-Servent A% Bourg G., Ramuz-M., Pages M., Bellis M., Roizes G. DNA polymorphism in stains of the genus Brucella // J.Bacterid., 1988.-Vol.170.- №10.- P.4603-4607.

153. Anghelesco S., Stamatin S. II test fagico nella/tipizzazione die ceppi B. anthracis е. B. cereus II Estratto de Zooprofilasci.-1965.- Vol.19.- №1.- P.177-185.

154. Bautz E., Freese E. On the mutagenic effect of alkylating agents // PNAS.-1960.- Vol.46.- P. 1585-1594.

155. Bautz-Freese E., Freese E. Induction of reverse mutations and reactivation of nitrous acid-treated phage T4 // Virology.- 1961.- Vol.13.- P.19-30.

156. Beumer-Jochmans M.-P., Dizkx J., Oleffe-Koopmansch S. Effect du calcium sur la penetration d'un phage dans certaines bacteries sensible // Ann.Inst.Past.- 1959.- T.96.- №6.- P.771 -780.

157. Bredley D.E.J. Phade typing // Roy. Microscop. Soc.- 1965.- Vol.8.-P.257-261.

158. Bridley-Morgan W.J., Kay D., Bradley D.E. Brucella Bacteriophage // Nature.-1960.- Vol.188.- P.74-75.

159. Brown E., Cherry W. New phage for identification of Вас. anthracis II J. Infect. Dis.- 1955.- Vol.96.- P.34-39.

160. Brucellosis // Fact Sheet №173.- Wld. Hlth. Org., 1997.

161. Calderone J.G., Pickett J. Characterisation of Brucella phage // J. Gen. Microbiol.- 1965.- Vol.39.- P. 1-10.

162. Corbel M.J. Examination of two bacterial strains designated Brucella suis biotype 5 //J. Hyg. Camb.- 1973.- Vol.71.- P.271-286.

163. Corbel M.J. Production of a phage variant lytic for non-smooth Brucella strains //Annali Sclano.-1977.-Vol.19.-P.99.

164. Corbel M.J. Recent advances in Brucella-phage // Veterinary Bulletin.-1984.- Vol.54.- P.65-74.

165. Corbel M.J. Brucella phage: advances in the development of a reliable phage typing system for smooth and non-smooth Brucella isolates // 2-nd Forum in Microbiology. Ann. 1st. Pasteur / Microbiol., 1987.- Vol.138.- P.70-75.

166. Corbel M.J., Thomas E.L. Properties of some new Brucella phage isolate: evidence for lysogeny within the genus // Develop. Biol. Standard.- 1976.-Vol.31.-P. 38-45.

167. Corbel M.J., Thomas E.L. Description of a new phage lytic for several Brucella species // J. Biol. Standard.- 1976a.-Vol.4.-P. 195-201.

168. Corbel M.J., Thomas E.L. The Brucella-phage: their properties, characterization and applications.- New Haw, Weybridge,1980.- 106 p.

169. Corbel M.J., Thomas E.L. Use of the phage for the identification of Brucella canis and Brucella ovis culture // Res. Vet. Sci.- 1985.- Vol.3.-P.35-40.

170. Corbel M.J., Tolari F., Yadava V.K. Characterization of a new phage lytic for both smooth and non-smooth Brucella species // Res. Vet. Sci.-1988.- Vol. 44.- P.45-49.

171. Corry J.E.L. Sungar and polyol permeability and osmophilia yeast cell membranes measured by turbidimetry and its relation to heat resistance // J. Appl. Bacterid.- 1976.- Vol.40.- №3.- P.277-284.

172. Couvy L. Le bacteriophage du bacille de Yersin, son comportament in vivo // Сотр. rend. soc. Biol. 1932.- Vol.110.- P.38-40.

173. Couvy L., Lamdert L., Dufour V. Le principe lytique transmissble dit «bacteriophage» du bacille d'Yersin // Ann. Inst. Pasteur.- 1932.- Vol.48.- P.541-543.

174. Delbruck M. The growth of bacteriophage and lysis of the host // J. Gen. Physiol.- 1940.- №23.- P.643-647.

175. Douglas J.T. The isolation and characterization of the Berkeley group of Brucella melitensis phage // The University of California at Berkeley, 1978.- Dissertation Abstracts International.- B39.- S.560.

176. Douglas J.T., Elberg S.S. Isolation of Brucella melitensis phage of broad biotype and species specificity // Infection and Immunity.- 1976.- Vol.14.- P.306.

177. Douglas J.T., Elberg S.S. Properties of the Berkeley phage lytic for Brucella melitensis and other species // Annali Sclavo.- 1978.- Vol.20.- P.681.

178. Drimmelen G.C. van Bacteriophage typing of Brucella organism // S. Afric. J. Sci.- I960.-Vol.56.-№8.-P.187-191.

179. Drozevkina M.S. The present position in Brucella phage research. A review of the literature // Bull. WId. Hlth. Org.- 1963.- Vol.29.- P.43-57.

180. Feesey C., Parnas J.Z. Ein neuer Brucellaphage «Weybridge» von Brucella suis 1 isoliert//Zbl.Vet.Med.- 1975.- B22.-№10.-S.866-867.

181. Flu P. Die natur des bacteriophagt // Zbl. f. Bact. I. Orig.- 1929.-Vol.l 13.- S.284-289.

182. Freese E. The Specific mutagenic effects of base analogues on phage T4 // J. Mol. Biol.- 1959.- Vol.1.- R.87-105.

183. Gargani G. Phage-typing of Brucella stains collected in Italy during 1982-83 //Arch. Inst. Psateur Tunis.- 1983.- Vol.60.-№3-4.- P.327-336.

184. Girard G. Presence d'une bacteriophage antipesteux chez la Xenopsylla cheopis au coure d'une petite epidemic de peste a Tananarive // Nature.- 1935.- Vol. 17.- P.16-18.

185. Gratia A. Des relations numeriques entrebacteries lysogenes, et par-ticules de bacteriophage // Ann.Inst.Pasteur, 1936.- Vol.57.- P.652-667.

186. Grimont F., Verger J.M., Cornelis P., Limet J., Lefevre M., Grayon M., Regnault В., Van Broeck J., Grimont P.A.D. Molecukar typing of Brucella with cloned DNA probes // Res. Microbiol.- 1992.- Vol.143.- P.55-65.

187. Hall W.H. Epidemic brucellosis in beagle // J. Infect. Dis.- 1971.-Vol.124.- P.615-618.

188. Hauduroy P., Chalib A. Presrnce du bacteriophage antipesteur a Paris // Сотр. rend. soc. Biol.- 1929.- yd. 13.- P. 1085-1087.

189. Jones L.M., McDuff C.R., Wilson J.B. Phenotypic alterations in the colonial morphology of Brucella abortus due to a bacteriophage carrier stain // J. Bacterid.-1962,- Vol.83.- P.860-865.

190. Jones L., Mertz G.S., Wilson J.B. Phage typing reaction on Brucella species// Appl. Microbiol.- 1968.-Vol.14.-P.l 179-1190.

191. Leise T.M., Carter C.H., Freidlander H. Criteria for the identification of Bacillus anthracis И J. Bacterid.- 1959.- Vol.77.- №5.- P.655-660.

192. Loveless A. Increased rate of plaque-type and host-range mutation following treatment bacteriophage in vitro with ethyl methan sulphonate // Nature.-1958.-Vol.181.- P.1212-1213.

193. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование: Пер. с англ.- М.: Мир, 1984.- 480 с.

194. Matthews R.E.F. Classification and nomenclature of virus. Fourth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses // Intervirology.- 1982.-Vol.17.- P.23-199.

195. Matz K. New method for antimicrobial activity // Z. Hyg., 1964, B.150, S. 103-107.

196. Mc Cloy E.W. SWdies on a lysogenic Bacillus stain. A bacteriophage specific for Bacillus anthracis II J. Hyg. Camb.-1951.- Vol.49.- P.l 14-125.

197. Meyer M.E., Morgan W.J.B. Metabolic characterization of Brucellastrains that show conflicting .identity by biochemical and serological methods // Bull. Wld. Hlth. Org.- 1962.- Vol.26.- P.823-827.

198. Meynell E.W. Character of a group of Bacillus // J. Gen. Microbiol.-1962.-Vol.28.- P.153-164.

199. Mora E.S., Eisenstark A.J. Form of bacterial activities // Lab. Clin. Med.- 1958.- Vol.51.- P.802-804.

200. Moreira-Jacob M. New group of virulent bacteriophage showing differential affinity for Brucella species // Nature.- 1968.- №219.- P.752-753.

201. Morgan W.J. The examination of Brucella culture for lysis by phage // J. Gen. Microbiol.- 1963.- Vol.3 ON P.43 7-443.

202. Morris J.A., Corbel M.J. Properties of a new phage lytic for Brucella suis II J. Gen. Virol.-1973,- Vol.21.- P.539-544.

203. Morris J.A., Corbel M.J., Phillip J.I. Characterization of three phage lytic for Brucella species // J. Gen. Virol.- 1973,- Vol.20.- P.63-73.

204. Moyer N.P., Holcomb L. A. Brucellosis // Laboratory Diagnosis of Infectious Diseases. Principle and Practice / Ed. Balows A., Hausker W.J., Ohashi Jr. M., Turano A.- Springer-Verlag, New York, 1988.- Vol.1.- P. 143-154.

205. Moyer N.P., Holcomb L.A., Hausler W.J. Brucella // Manual of Clinical Microbiology.- Fifth Edition.- Washington, D.C., 1991.- P.457-462

206. Munter W. Uber das Wirkungspectrum einiger Brucellaphagen // Zblatt. Bakt. Parasit. Kdel (Orig).- 1963.- B.190.- S.348-352.

207. O'Hara M.J., Collins D.M., De Lisle G.W. Restriction tndonuclease analysis of Brucella ovis and other Brucella species // Vet. Microbiol.-1985.-Vol.l 0.-№5.-P.425-429.

208. Parnas J.Z. Differentiation of Brucella by the aid of phage // J. Bacte-riol.-l961Vol.82.- P.319-325.

209. Parnas J.Z. New Brucella phage // Arch. f. Hyg. u. Bact.- 1961a.-B.145.-№3.- S.167-183.

210. Parnas J.Z. Brucella phage // Zentralbl. Bacteriol. Parasitenkd. Infektionskr. Hyg. Abt. Ref.- 1963.- B.187.- S.601- 640.

211. Parnas J.Z. Brucella phages, property and application // Biblioteca Mi-crobiologica. S.Karger; Basel, New York, 1963a-РЛ6-82.

212. Parnas J.Z., Feltynowski A., Bulikowski W. Antibrucella phage // Na-ture.-1958.- Vol.182.- P.1610-1611.

213. Pickett M.J., Nelson E.L. Brucella bacteriophage // J. Hyg.- 1950.-Vol.48.- P.500-503.

214. Pons R., Dyrieux C. Existence dans le bubon d'un pesteux convalescent d'un agentde la lyse transmissible en dehors de sa presence dane l'intestin // Сотр. rend, seances de l'Academie des Sciences.- 1932.- Vol.194.- P. 1399-1403.

215. Ramyar Y., Fran T. Lyophilizing foot-and-mouth disease virus at low drying temperature // Arch. Inst. Buri.- 1962.- Vol.29.- P.97-100.

216. Report. Joint FAO/WHO Expert Committee on Brucellosis. Fifth Report. Wld. Hlth. Org. Techn. Rept. Ser. 1970.- №464.- 65 p.

217. Rigby C.E., Cerqueira-Campos M.-L., Kelly H.A., Surujballi O.M. Properties and partial genetic characterization of Nepean phage and other lytic phage of Brucella species // Can. J. Vet. Res.- 1989.- Vol.53.- P.319-325.

218. Sanderson E.S. Bacteriophage tests on the meconium of aborted fetuses // J. Exp. Med.- 1925.- Vol.42.- P.561.

219. Segondy M., Allardet-Servent A., Caravano R., Ramuz M. Common physical map of four Brucella,bacteriophages genomes // FEMS Microbiology Let-ters.-1988.- Vol.56.- P.177-182.

220. Seidel G. Die aeroben sporenbilder.- Leipzig, 1963.-156 p.

221. Simon F. Contribution a l'etude des bacteriophage du genre Brucella: phage Tb, BM29 et Bk // Thesis.- University of Paris, 1979.- P.41

222. Smith D., Burrows T. Phage investigations with Pasteurella pestis and other bacteria // Nature.-1962.- Vol.193.- № 4813.- P.397-398.

223. Stableforth A.W., Jones L.M. Report of the subcommitee on taxonomy of the genus Brucella. II Int. Bull. Bacteriol. Nomencl. Taxon.- 1963.- Vol. 13.1. Р.145-158.

224. Stamatin N.A. Folosirea bacteriofagului pentry diagnosticul rapid al tulpinilor de B. anthracis //Probl. zootehn. si veterin., 1959.- №7.- P.38-42.

225. Teska J.D., AllanC.M., Redus S.L., Coyne S.R., Ezzel J.W. Identification of Bacillus anthracis using MIDI whole cell fatty acid analysis //4th International conference on anthrax.- Annapolis, Maryland, USA, June-10-13, 2001.- P.30.

226. Tessman I. Mutagenesis in phage x 174 and T4 and properties of the genetic material // Virology.- 1959.- Vol.9.- P.375-385.

227. Thomas E.L., Corbel M.J. Isolation of a phage lytic for several Brucella species following propagation of Tbilisi phage in the presence of mytomycin С // Archs. Virol.- 1977.- Vol.54.- P.259-261.

228. Thomas E.L., Corbel M.J. Differentiation of Brucella suis biotype 4 from other biotypes by Firenze phage //Br. Vrt. J.- 1982.- Vol.138.- P. 11-17.

229. Thome C.B. Biochemical properties of virulent and avirulent stains of Bacillus anthracis И Ann. N. Y^Acad. Sci.- I960.- Vol.88.- №6.- P. 1024-1033.

230. Verger J.M., Grimont F., Grimont P.A.D., Grayon M. Brucella a monospecific genus as shown by deoxyribonucleic acid hybridization // Int. J. Syst. Bacterid." 1985.- Vol.35.- P.292-295.

231. Vizcaino N., Clockaert A., Verger J., Grayon M., Fernandes-Lago L. DNA polymorphism in the genus Brucella II Microbes Infect.- 2000.- Vol.2.- №9.-P. 1089-1096.

232. Worsley В., Goodwin S., Janas K., Atallah C. First report of a stain of Brucella melitensis that was widely sensitive to brucellaphage isolated in the United Arab Emirate // Clin. inf. Dis.-1996.-Vol.22.- №1.- P. 190-191.

233. Wundt W. Ergebnisse neuerer bakteriklogischer ud serolo-gischer Untersuchungen an Brucellen // Wiss. Z. Karl-Marx Univ. Leipzig Math.- Natur-wiss,1966.- Reihe 3.- S.561-567.