Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оптимизация этапов приготовления чумных, туляремийных, бруцеллезных иммунобиологических препаратов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Оптимизация этапов приготовления чумных, туляремийных, бруцеллезных иммунобиологических препаратов"

РГБ ОД

На правах рукойнси

КАИТЕЕВА ЕКАТЕРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

ОПТИМИЗ А ЦИЯ ЭТАПОВ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ЧУМНЫХ, ТУЛЯРЕМИЙНЫХ, БРУЦЕЛЛЕЗНЫХ ИММУНОБИОЛОП1ЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Стапрополь -1996

На правах рукооясн

КАНГЕЕВА ЕКАТЕРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

ОПТИМИЗАЦИЯ ЭТАПОВ ПРИГОТОВЛЕНИЯ »ГУМНЫХ, ТУЛЯРЕМИЙНЫХ.

БРУЦЕЛЛЕЗНЫХ НММУНОБИОЛООГЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

Специальность 03.00.07 - мккробиологая

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискание ученой степени кяндндата медицинских наук

Ставрополь -1996

Работ выполнена « Ставропольском научно-кссяедовзтсяьском противочумном кнституи

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Ефремежо В.И.; кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Тюменцсва И.С.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ Самойлова Л .В.

Дсил-ор медицинский наук, старший научный сотрудник Рыбкин B.C.

Ведущая организация - Волгоградский научнр-иссяедователь-ский прот»ше чумный институт

Защита состоится 18 декабря 1996г. в 13-00 часов на заседании диссертационного совета Д 074.32.0 i Российского научно-исследовательского противочумного института "Микроб" по адресу 410005 г .Саратов, уд. Университетская, 46

С диссертацией можно ознакомился в библиотеке института "Микроб"

Автореферат разослан !8 ноября !996г. Учений секретарь диссертационного совета

Корнеев ГЛ.

Актуальность проблемы. Необходимость постоянного наличия специфических препаратов для диагностики особо опасных инфекций с гарантийными длительными сроками хранения в связи с их использованием в экстремальных, зачастую непредвиденных условиях, определяют актуальность этого вопроса в решении проблемы чумы, бруцеллеза и туляремии.

В настоящее время общепринятым способом презервации бкодо-. таческих объектов является лиофильная су1!/ка. Она основана на предварительном замораживании материала, позволяющем сублимировать подавляющую часть воды и избежать губительных воздействий на биологические структуры. В тоже время известно, что замораживание отрицательно влияет на высушиваемый объект. Степень этого воздействия зависит от целого ряда факторов: температуры, схорости охла5вдення защитной среды, природы материала и т.д.

Поскольку, в процессе ллофилизацни свободная вода (94-96%) уваляется путем сублимации, а связанная (3-4%) - испарением, эта два фактора в даггькеншем и определяют воздействие высушивания на качество препарата. Первый из этих факторов чреват повреждением биологических препаратов механическим воздействием удаляющихся с большой скоростью частиц пара, второй - лимитирован температурным порогом денатурации бежа. Интенсифицировать процесс сушки представляется возможным путем максимального сокращения времени удаления свободной и связанной влаги за счет подогрева материала. По мнению А.М.Белоуса н . Ц-ДДветкова (!985), при сублимационном высушивании различные биологические объекты неодинаково переносят этот процесс. Простые биосиотемы (вирусы, макромолекулы и т.д.) способны сохранять свои свойства при замораживании-высушивании, более сложные (клетки, ткани и т.п.) теряют эту способность. Об этом свидетельствуют и первые попытки в консервации антигенов особо опасных инфекций, По мнению Буренина с соавторами (1983), Серо-пгазова с соавторами (1984) фракция ! чумного микроба высушивается без изменения основных свойств при конечной температуре продукта не эыше 16-!8°С при длительности лиофилизацяи 2511 час. П.И.Меньшов (1969) показал, что терминальный подогрев даже до 23°С также не снижает ее качества. Многократное замораживание не алниет на серологическую активность ОСА и Ф! чумного микроба (Буренин с соаат., ¡983). Основной соматический антиген чумного микроба менее чувствителен к температуре подогрева (20-22° С).

' Для'антигенов возбудителей туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы" А .И .Мирошниченко с соавторами (198?) пред лагают режим высушивания в течение 21 ±2 часг яри конечной температуре подогрева антигенов 25-28°С н высоте столбика материала не более 10 мм. Анализ этих данных свидетельствует о том, что слабым эвеном в технологии приготовления диагностических иммунобиологических препаратов продолжает оставаться способ стабилизации антигенов.' 5>ти положения определили цель и задачи наших исследований.

Цель работы. Оптимизировать условия предварительного замораживания и отработать технологически рациональные, экономически более дешевые режимы лнофилизацин антигенов возбудителей чумы, бруцеллеза, туляремии для коммерческого выпуска на их основе диагностических препаратов.

Задачи исследования: ; ' I. Изучить влияние -температуры, скорости к кратности замораживания.на специфическую активность антигенов возбудителей чумы, " бруцеллеза н туляремии,

2. Определить значение указанных факторов яа изменения спёктрофотомстрическнх показателей содержания белка в антигенах (280 им). . ;;. '

3. Оптимизировать режимы яиофнлизацми антигенов; использовав а качестве предварительного замораживания наиболее щадящие условия.

4. Доказать, что антигены возбудителей чумы, бруцеллеза и туляремии, высушенные "жестким'* режимом в минимально короткие сроки, обеспечивают высокие титры специфических антител при иммунизации кроликов-продуцентов.

5. Приготовить на основе опытных гипериммунных сьшороток жсперйментально-производственвые серии чумных, бруцеллезных, туляремийных диагностических люминесцируюшнх иммуноглобулине» и диагностикумов магноиммуносорбентных. Изучить их качество и соответствие ОМБТ. ' '

6. Включить'в НТД на производство диагностихумов магносор-бентных чумного и туляремийного отработанные нами режимы замо-раживания-высушнва ния ¿нтигтнов.

Научная новизна. Отработан щадящий режим замораживания антигенов возбудителей чумь!,' бруцеллеза й туляремии при температуре

-30°С в низкотемпературном холодильнике типа НС 700/50 "Фркгера",

Впервые отработан более дешевый и технологически наиболее удобный режим ииофняизации указанных акгигенов, обеспечивающий сохранение исходных свойств препаратов.

На основании хомапексного изучения и апробации в условиях освоения производства диагностических люминеецнрующих иммуноглобулинов и диагностнкумов магноиммуносорбенгаьес показано, что разработанные нами режимы лиофнлизацин антигенов возбудителей чумы, бруцеллеза и туляремии обеспечивают в процессе изготовления высокое качество диагностикумов в соответствии с требованиями

нтд.

Полученные результаты могут быть использованы в качестае положительного примера для разработай аналогичных режимов заху-умнон сушки различных антигенов, используемых для прштэтовления диагностических препаратов.

Практическая ценность.

Разработанные нами режимы заморажнвания-высушизання антигенов включены в:

1. Регламент производства N 510-95 диагностикуыа магносор-беитного туяяремийного жидкого для ИФА и РИФ.

2. Регламент производства N 511-95 днггностнкума магносор--беншого-чумного жидкого для ИФА и РИФ.

Апробацвд Материалы диссертации доложены и обсуж-

дены на:

К Научной конференции "Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактика особо опасньсх инфекционных болезней" (Омск, i 993).

2. Межгосударственной научной конференции *Прсфилакглха и меры борьбы с чумой", посвященной 100-летнао открытия возбудителя чумы (Алма-Ата, 1994).

3. Межгосударственной научно-практической конференции "Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных

, заболеваний", посвященной 100-лстию открытия возбудителей чумы (Ставрополь, ¡994).

4. Межлабораторной конференции Ставропольского научно-исследовательского противочумного института (Ставрополь, 1995).

Публикации. Основное содержание работы отражено в опубликованных 6 статьях.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка гаггературы. Работа клмэсхрирована 25 таблицами, 6 рисунками. Библиографический указатель содержит 187 литературных источников, в том числе 130 работ отечественных к 57 зарубежных авторов.

Положения выносимые на защиту: • 1. Оптимальные условия замораживания антигенов возбудителей чумы, бруцеллеза и туляремии.

2. Разработка наиболее экономичных и технологически эффективных режимов яиофипкзации указанных антигенов.

3. Материалы по изучению качества гипериммунных сывороток и приготовленных из них диагностических яюмииесцирующих иммуноглобулинов и диагноешкумов иагноиммуносорбсшных » зависимости от режимов лиофквизации антигенов возбудителей чумы, бруцеллеза и туляремии, используемых при иммунизации животных.

Материал!.! и методы

Для приготовления антигенов использовали: 3 В1фулентных штамма возбудителя бруцеллеза (В-аЬойш 544, В.ше!11епЕ15 !6М, Влшв 1330), 6 вирулентных штаммов возбудителя туляремии (РлЫагепз» 890 Аз, $спи 83, Мшга, 543/6, 325/1765), а также один авнрулентный штамм возбудителя туляремии (живал тудяремийная вакцина Гайского, штамм !5) и вакцинный штамм чумного микроба У .рек! ¡5 БУ линии НИИЭГ.

. Водорастворимый антиген бруцелл и туляремнйный антиген получали по способу, предложенному Е.Н Афанасьевым (1983), фракцию I чумного микроба по М.Е.Вакег« &1. (1952). При оценхе качества антигенов до и после лиофилизации использовали ракетный иммуно-элекрофорез. Количественное определение белка проводили по методу ГА.Кочетова (¡950). Гипериммунные сыворотеи получали, используя схему иммунизации, предложенную С .Н.Тюменцеаым с соавторами (£994).

Анализ качества полученных иммунных сывороток проводили ь реакции преципитации в !% агаровом геле Дифко (США) поОухтер-

лони. Иммуноглобулины фракционировали ПЭГ-6000 (Pobon ct а!., 1964), капрнловой кислотой (Steibuch, Andran, 1969). Конъюгацию иммуноглобулинов с ' флуоресциииом нзотиоунаяатз натрия (ФИТЦ) проводили по H.Storz (1987). При нммунофлуоресцентиом анализе использовал« прямой метод с краски (РИФ) по A.H.Coons, М.Н.Кар!ап (1950), непрямой метол окраски (НРИФ) - по Т.Н. Weiler, A.H.Coors (1959), количественный иммуиофлуорса1«ьгп!ый анализ (КИФА) по К.Г.Огосву с соавторами (198 ä >■ Mnxporpaiiyroipo-ванне полнакриламндных магносорбентоз осуществляли способом эмульсионной полимеризации путем эмульгирования потоком газообразного азота (Пушкарь с соавт,, 1934).

Всего в опытах использовали 50 кроликов породы "Шиншилла", весом 3-3,5 кг, 100 линейных мышей С-57 Bz/бу и беспородных белых мышек, весом 20-25 г, 100 морских евннок, весом 250-300 г.

Материалы исследований подвергнуты статистической обработке по Я.И.Сызраниеау (¡933), И.П Ашмаршгу и АА.Воробьсзу (!962), В.Ю.Урбаяу (¡975).

Результаты исследования

Неотъемлемой частью лиофнлнзацни является предварительное заморажзгоание биообъектов, в целях удаления воды путем сублимации, т.е. перевода ее из твердого в газообразное состояние, минуя жидкую фазу.

Мы изучали влияние режимов замораживания на специфическую активность антигенов с помощью РИЭФ, д также содержание в растворах количества белка. В доступной нам литературе не встроилось такого рода работ, хотя результаты их представляют не только интерес с точки зрения теории лиофииизации, но и имеют чисто практическое значение для коммерческого выпуска диагностических препаратов.

Amwmi, являясь простыми биосистемамн, по своим свойствам стоят ближе к фаговым частицам, чем а клеткам. По данным И.П.Высеканцева (1983), Б.М-Деггярева, В.В.Кадетом (1991), МЛО.Стегний с соавторами (1992) и др., наибольшее влияние на сохранность бактериофагов оказывает скорость охлаждения и гораздо меаее выраженное - скорость отогрева. Исходя из этого положения, мы варьировали температурой замораживания, сохраняя при этом одина-

ховые условия оттаивания в своих опытах (37°С}. Замораживание осуществляли в низкотемпературном холодильнике до минус 30°С, сухим льдом - минус 79°С и в жидком азоте - минус !96°С. Контролем служили образцы, не подвергнутые замораживанию.

Нами установлено, что для антигенов возбудителей чумы, туляремии и бруцеллеза существует общая закономерность. Независимо от температуры, скорости и кратности процесса замораживакня-оттзиваниа происходит статистнчесхи достоверное снижение их специфической активности. Однако степень изменения активности была неодинаковой и определялась рядом конкретных условий. Tax, при 'медленном* замораживании специфическая активность всех изучаемых антигенов бьша в одинаковых пределах. Кз наш взгляд, снижение активности при однократном воздействии холода и стабильное сохранение качества антигенов при последующих цгаслах обусловлено частичным нарушением связей между отдельными фрагментами макромолекулы, получаемых в процессе приготовления антигенов. Эти связи являются наиболее лабильными. При "быстром* и "очень быстром" режимах замораживания устойчивость г воздействиям условий эксперимента связана с природой антигена. Фракция IA н бруцеллезный аотигены оказались более стабильными и дополнительное 10-кратное замораживание-оттаивание не повлияло на их качество. Туля-ремийный антиген заметно снижал свою специфическую активность после 5 и 10 циклов указанного воздействия (табл. !). Более губн-Tej&Hoe действие оказывает "очень быстрое" охлаждение в жидком азоте, а наименее - "медленное" в низкотемпературном холодильнике до минус 30°С н "быстрое" - в сухой углекислоте до минус 79°С. Наибольшее изменение качества происходит при все* используемых режимах у туяяремнйного антигена.

Мнение относотельно влияния скорости замораживания биологических препаратов разноречивы. Существует ряд теорий, объясняющих гибель клеток в процессе замораживания. Одна связана с ме-хагачееким разрушением клеток от внутри- и внеклеточной кристаллизации воды, другая-с увеличением концентрации солен в растворе у, т.д. (Тинкср, 1971). О.Смит (1956) отмечала, что широкое признание получило представление о том, что большие кристаллы, образующиеся при "мед ленном" охлаждении, повреждают клетку сильнее,

Таблица I

Специфическая активность антигенов возбудителей чумы, бруцеллеза и туляремии з РИЭФ {%) в зависимости* от температуры и кратности замораткивання-отганвания

Темпе- ; ратура : замораживания

Коли"

чество

опытов

Элехтрофоргтичссхая подвижность ан-гаггнов, %

доза- I после замораживания-оттаивания (раз) мсражи-_

вамня | ! 5 I !0

Чумной

-30 6 100 84,0±5,2 84,016,0 76,01 ¡0,0

-79 б № 84,0*5.2 76,013,6 72,0+4,4

196 б ¡00 72,0+3,2 72,№,6 60,0+3,6

Бруцеллезный

-30 6 100 87,7±5,2 83,3+1,6 77,8+1,6

-79 6 100 Зб,7±2,9 ВЗДЫ.б • 77,8+1,б

■196 6 ¡00 82,2+4,2 71,1+2.8 63,7*4,3

Т у я я р е м и й н ы й

-30 б 500 80,0+2,7 70,7±9,4 63,3±9,4

-79 6 100 78,б±5,4 66,7±2,7 53,3+2,7

196 6 100 70,71-4,0 56,0+4,0 48,0+2,7

чем мелкие, возникающие при быстром замораживании, но идеальным является отсутствие кристаллизации при сверхбыстрых скоростях охлаждения. В.В.Кадстоз (4993) объясняет повреждения холерных фагов при медленных скоростях охлаждения за счет гидростатического давления и влияния кристаллов льда, но Е.Е.Никиткк к И.В.Звягин (!971) показали, что некоторые виды микроорганизмов лучше сохраняют жизнеспособность при медленном замораживании, чем при быстром.

Ilo сравнению с клетками макромолекуяярная структура антигенов, по-видимому, меньше страдает при "медленном" и "быстром* замораживании в связи с тем, что между крупными и более мелкими кристаллами образуются довольно значительные пространства, в которых а>гтигсны относительно защищены от механических воздействий льда. При очень низких температурах (-19б°С) происходит внхрнфкка-ция, образование стекловидного тела с многочисленными мелкими компактно расположенными кристаллами, которые, сдавливая биополимеры, обусловливают разрыв не только гидрофобных, но водородных и электрических связей.

Поскольку, составной частью всех антигенов является белок, в дальнейших опытах изучали действие режимов замораживания на его содержание в суспензиях.

Установлено, что при "медленном", "быстром" и "очень быстром" замораживаниях уже после однократного воздействия холодом происходит статистически достоверное снижение спектрофотометрическнх показателей белка (280 нм). Увеличение циклов замораживания-оттаивання усиливает его разрушение, о чем свидетельствуют фактические данные, выраженные в мг/мл. Однако при сравнении результатов с данными после 1-го цикла с 3-к> циклами, 1-го и !0-го, 5-го и iO-ro, они вьляядят несколько по-другому. Так, в капсульном антигене при "медленном" замораживании статистически достоверных показателей не было отмечено. Использование сухой углекислоты и жидкого азота показало, что статистически достоверные различия были при сравнении i-ro и »0-ти кратных воздействий на антиген, а 1-го н 5-ти, 5-ти и 10-тк таких различий не обнаруживается. В бруцеллезном антигене многократное воздействие холода способствовало существенному снижению спектрофстометркчесхнх показателей белка, а в туляремийном такая закономерность отсутствовала.

Представляют интерес данные о несоответствии в процессе замораживания-оттаивания степени снижения специфической активности нативного белка антагеной, особенно Ф1 чумного микроба, поскольку указанный антиген почти на 99% состоит из протеина. С нашей точки зрення,этот феномен можно объяснить тем, что молекула белка кап-сульного антигена под влиянием механических воздействий кристаллов льда претерпевает конфсрмационные измени««,в результате которых часть молекул распадается на более мелкие субъединицы. сохра-няюшие свои нммунохимичесхие свойства, но при определении белка

спектрофотометрическим методом показатели резко изменяются. Поэтому в некоторых пробах ь-:ы параллельно определял и белок по Лоурк и получили количество его в мг/мл приблизительно на 30% боиыге, чей спгктрофотокпршгсги. Эхо нкгглирот ало разику между синяг-няем специфической ахпености фракции ¡А и содсржанигы бежа в еасгаерг. Между тгм, четко еъгрзлсно, что процент хонфорлагсюкн!» из:леи:ний бежа у чумного аютггна быт; значительно выше, чем у бруцеллезного н тупарглегёиого антитскои. Это связано с тем, что дг.-а последних ашгиггйа состоят га беяковолиг.ополнеахаригшого кокплс са и снижение активности их определяется не только изменением в структуре белка. По мнению Л.КЛозика-Лозинсхого (1972), основной причиной при замораживании хлгтох является разрушение липо-прогеинового комплекса, что подгаерждяется я нашими опытами с антигенами.

Поскольку заморазкиванке-оттанвание приводит к довольно значительным зеонформацнонным изменениям белка фрахции !, возникла необходимость изучения влияния криопротекгорсв на этот процесс.

Учнтъшая это, нами была использована в качестве протектора при 10-кратном замораживании-оттаивании антигенов возбудителей чумы, бруцеллеза и туляремии тиомочевиновая среда, обладающая высокими защитными свойствами (Печннкова с соавт., 1967). В зла условиях при всех режимах охлаждения не было отмечено статистически достоверного снижения специфической акгигности бруцеллезного антигена после 10 циклов заыораэкивания-отгаивания. Однако ухазаинь!Й стабилизатор существенно не предохранял туляремииный антиген от аналогичного воздействия и показатель "Iя колебался от 2,8 до (7,5. При использовании в качестве хладагента жидкого азота зашита отсутствовала и с чумным антигеном.

В сравнительном аспекте использовали также ПЭГ-20000 и ПЭГ-6000, а также 10% сахарозу. Изменение спектрофотометрнчесхих показателей белка в растворе антигенов определяли до и после 1-кратного замораживания при минус 30* С. Результаты опытов показали, что 10% сахароза полностью предохраняла белок от указанных изменений при замораживании, а растворы ПЭГ не обладали протективными свойствами. При этом также наибольший процент изменения в структуре белка наблюдали в растворе чумного антигена, наименьший -бруцеллезного (табл. 2). Таким образом, весь комплекс проведенных

и

исследований позволяет заключить, что наиболее перспективным режимом замораживания является "медленное" в низкотемпературном холодильнике до минус 30°С. Оно обеспечивает удовлетворительное сохранение антигенов и хорошую технологичность процесса в связи с доступностью и относительной дешевизной машинного холода в производственных условиях по сравнению с использованием сухой углекислоты и жидкого азота, требующих специального оборудования, промышленных помещений, а при транспортировке специальных емкостей и соблюдение техники безопасности.

Таблица 2

Снижение белка, определяемое спектрофогомефнчсгки при 280 нм, (%) в растворе антигенов возбудителей чумы, бруцеллеза, туляремии, суспензированных в защитных средах, после (-краткого замораживания-оттаивания при -ЗО'С и 37"С

Антигены Количество опытов Снижение белка в суспензиях антигенов в зависимости от защитных сред, %

ПЭГ-20000 ПЭГ-6000 сахароза 10%

Чумной 6 29,0 37,9 1,4

Бруцеллезный 6 8,7 12,9 1,1

Туляршийный 6 1Е,6 28,8 3,4

Высокий защитный эффект криапротекторов обязывает применять соединения, не содержащие в своем составе белок, поскольку в процессе иммунизации животных-продуцентов антигены дозируют по всему показателю белка.

По данным (¡985), при замораживании кристалли-

ческая решетка должна быть такой, чтобы в процессе сублимации льда образовывались каналы, через которые свободно передвигались молекулы пара. Высокие скорости замораживания приводят к хаотически расположенным каналам, часто блокирующим проходы. Это способствует дополнительным многократным сталкиваниям чаетац пара с высушиваемым объектом, что повышает его механическое травмирование.

Эта обстоятельства делают важным вопрос выбора режима замо» ралягзкння, обеспечение дальнейших оптимальных условна высушивания акгогснных препаратов.

Исходя да полученных результатов, евнддаяыгшовйвших о том, что в процессе предварительного замораживания растворов аитятгнов чуыы, бруцеллеза и туляремии в низхотемпературнш зояояияышхах гтри минус 30°С происходило наименьшее снижение ш; активности, в своих окспериментах, связанных с отработкой режимов диофияюации антигенов, мы проводили замораживание з низкотемпературных холо-дкпьтгеая. фирмы "Фрктгра" при температуре от -30°С до -45"С в течение 14'¡6 часов. В указанном; температурном диапазоне скорость охлаждения растворов практически не изменяется.

В целях оценки влияния условий лнофгаизаики нами препзари-телько.бьшо прсведгно изучение качгаиа ксчнср'чгских серий препарата хапсульиого антигена, пр:хотсздащых в экспериыюггалыю-пронзэодствениой лаборатории института, на осяогс биомассы штамма ЕВ чумного микроба, выращенной на среде ЯХАТ при 37±{°С в течение 3 суток.

Пргпарат антигена разливали по ! мл в ампулы ШПВ-б и посте предварительного замораживания, высушивали в аппаратах разной конструкции (ТГ-5 и КС-30) в стамчив от режима, предложенного В-ГЛЗуреннным с соавторами (¡933).

Длительность сушкн в обеих аппаратах ыы сократили до 36 часов. При этом, на время удаления свободной вода приходится 14 часов, затем в камере ТГ-5 подъем до максимально!! температурь} (I б'*С) материала происходил за 10 часов, а в КС-30 - за 7 часов, дтггельность воздействия махеималыюй температуры в камерах, соответственно» равняется ¡2 и 15 часов.

Известно, что с помощью сублимации удаляется основная масса воды (94-96%) в виде мощных газовых потоков бокьшнх объемов пара, образующегося а количестве 10 тысяч литров из I мл лада. В этот период сушки происходит значительная деградация биообъектов за счет физического воздействия молекул пара, интенсивная гибель микробных клеток (Бланков, Клебанов, 1961; Тинхер, 1971 и др.). а также махеимаяышй распад клеточной РНК (Ткговский, !979). При режиме высушивания, отличном от такового па БТ.Буренииу с соавторами (1983), кинетика удаления свобода»» воды быпа почти в 2 раза интенсивнее.

При этом установлено, что активность коммерческих серий кап-сукьного антигена при высушивании" щадящим" режимом остается на уровне препарата, полученного из РНИПЧИ в качестве эталона сравнения. Конструкции, используемой для лнофклшации аппаратуры не влияют на качество продукта, хотя камера ТГ-5 обладает преимуществом, благодаря наличию герметических заслонок между обеими емкостями, позволяющих в конце процесса сушки, при снятии вакуума, предохранить гигроскопичный лиофилизированный материал от поглощения им не успевших сконденсироваться водяных паров над поверхностью дссубли кагора.

Тщательный сравнительный анализ режимов лиофклизацни Ф1 чумного микроба показал, что сокращение периода удаления свободной воды почти вдвое не влияет на специфическую активность фракции I после сушки. Это явилось основанием для разработки режима с ускоренным периодом лиофнлизацни, но не только времени удаления свободной воды, но и связанной влаги.

Указанные серии антигена в дальнейшем были нами использованы для получения гиперимиунных кроличьих сывороток с целью приготовления диагностических препаратов.

На основе исследований нами были предложены параметры сутки: "умеренный* и "жесткий".

При "умеренном" режиме длительность удаления свободной воды - 14ДЫ час, связанной влаги - 10,5± \ час, при конечной температуре подогрева 25±1*С. Этот режим можно сч!ггать таковым, принимая во внимание общее время процесса и температуру подогрева материала.

При "жестком" - скорость удаления водяных паров и температура продукта максимально увеличиваются, но и одновременно уплотняются по времени. Так, длительность периода сублимации и изотермического отторжения влаги предусмотрены в течение 8 часов с подогревом материала в последующие 2,0x0,5 часа до значительных температур - 47,5±2,5°С, при общей длительности лиофнлизацни равной, 16 часам.

В соответствии с указанными режимами в дальнейшем высушивали антигены возбудителей чумы, бруцеллеза н туляремии. В камере КС-30 период сублимации продолжался в течение 14+1 час, а в ТГ-5 -13±2,5 часа. Отторжение связанной воды происходило за 24±0,5 часа при тек пературе 16±!,5аС. Параметры лиофнлизацни "щадящим" режимом были близки к расчетным данным.

Специфическая активность антигенов возбудителей чумы, бруцеллеза и туляремии до и после лиофилизации и в процессе хранения (через год) в рефрижераторе при 4£1аС в зависимости от режимов сушки после яиофшмзации "умеренным" и "жестким" режимами, осталась на уровне исходной (табл. 3). Через пять лет содержания антигенов бруцеллеза и ту.тяреккн в холодильнике отмечено статистичесхи достоверное снижение их специфической активности по сравнению со свеже-высушеннымн.

Таблица 3

Специфическая активность антигенов возбудителей чумы, бру-

цьйлеза и туляремии в РИЗФ (%) в зависимости филизаынн от режимов лио-

! Наименование антигенов |К-во серий { 1 ! Эяекфофоретическая подвижность антигенов, % Т

до замораживания после высушивания

"Умеренный режим"

Чумной б Бруцеллезный б Туляремийнын 6 100 1 00 100 9б±2 99+ 1,6 96+3,2 1,68 0,36 1,25

"Жесткий режим"

Чумной 6 Бруцеллезный 6 Туляремийный 6 100 100 100 96±2 99+1,6 96±3,2 1,68 0,36 1,25

Установлено, что спектрофотометрические показатели белка у антигенов всех трех возбудителей ни в процессе вакуумной сушки, ни при годичном хранении в рефрижераторе не изменились. Однако, изменение указанных показателей наблюдается через гепъ лет хранения у

антигенов бруцепп н туляремии, что совпадало с данными специфической их активности.

Таким образом, в заключении можно отметить, что ашиг«ны возбудотеяей чумы, бруцеллеза и 1упяремин, несытрй на нмггощнеся химические различия» являются шсокосгзбильпымн структурами, сохраняющими свою специфическую ахпшнояь а процессе довольно Жестких" зкетремаяьньа воздействий, имеющих ¿«сто при лкофилгаа-ции. Эги данные согласуются с вывода«» ГJÍАпарина и Б Л .Голуби некого (¡989), согласно которым пятиминутное кна?ченнс не разрушает полностью Ф i, активность, ее не снижается при действии ■температуры 56 С в течение 30 мкнуг, и, что хапсульмый антиген относительно устойчив к действию трипсина.

Результаты наших исследований подгаерясдают тазгже законе-' мерность, отмеченную А.И.Бокдзрсшсо (\995)в эксперимента; с чумной вакциной. По его данный одшш, из наиболее логрскдаклцнх факторов яяияется процесс штанганкя заыороженкок суспензии, который исключается, благодаря удалению подавляющего большинства водь; за счет сублимации. Нами отмечено снижение специфической активности и спектрофогомехрическкх показателей белка в антигенах при заморажизании-оттакваняи, но полное сохранение ид в процессе пнофипизацгш,

Пояучгиньк результаты позволили нам рекомензокш. применение в производстве нымуногеясв относительно дгшевый и удобный в технологическом отношении "жеоский* ргхаш лкофилюацни, с общей длительностью процесса не более sacos.

Для окончательного суждения об оптимальных режимах высушивания требовалось изучение иммунохкмнчесхой эффективности злгшге-нов, сохранения ими а полкой мере возможности реализовать гуморальный ответ лабораторными жаотаьши.

В соответствии с этим, в наши задачи входило изготовление лю-мпкгецирующих i i м му> ¡ огяобу.та новых и иммуносорбентных днагно-стнкумов чумы, бруцеллеза и туляремии. Специфические иммуноглобулины готовили иа основе гкпериммунизации антигенами, приготовленными с учетом оптимального режима высушивания. Крояиков-продуценгоа иммунизировали по единой схеме. Специфическая активность пшериммунных сывороток в НРИФ достигала !:5I2-Í:204S, а ъ РИД - 1:16-1:64, вне зависимости от режима сути использованных антигенов. Количество антигелообрааующих кроликов-

продуцентов с подобными титрами составляло 95%. На основе полученных сывороток изготовлено по 10 серий чумных, бруцеллезных и туяяремийных люминеецирующих иммуногаобуяинов к соответствующим антигенам, высушенным различными режимами.

Оценка физико-химических свойств люминеецирующих иммуноглобулинов, приготовленных на основе антигенов, лиофкяизиро-ваиных разными режимами (внешний вид, растворимость, прозрачность, цветность, щелочность, остаточная влажность, концентрация белка, количественное соотношение ФИТЦ/бедок), свидетельствуют о соответствии их ОМБТ, предъявляемым к люиинеецкрующим диагностическим препаратам.

Активность выше перечисленных днатностикумов испытывали из нативных свежеприготовленных взвесях четырех - пяти гомологичных штаммов каждого вида возбудителя в пяти повторностях в хондапра-ции 500 млн. м.х. по ОСО мутности ГИСК им. Л А.Тарасевича.

Установлено, что специфическая активность препаратов всех приготовленных серий характеризуется красящим титром, равным разведению 1-32-!:128 при исследовании мазков гомологачных возбудителей, рабочее разведение препаратов -

Для определения чувствительности люминеецирующих иммуноглобулинов использовали гомологтные цггзммы в следующих концентрациях: 5 млн., 1 млн., 500 тыс., 250 тыс., 100 тыс., 50 тыс. мае. в 1 мл. Рабочее разведение испытанных серий препаратов дает возможность обнаруживать микробы в мазкая, приготовленных из 500 тые. и более микробных тел в $ мл.

Диагностическую ценность люминеецирующих антител определяли в имитированных пробах внешней среды (смывы с предметов обихода, фильтраты воздуха, пробы воды, почвы). При этом использовали по 5 нативных взвесей гомологичных штаммов в концентрациях, равных чувствительности препаратов (500 тыс, м-кУмл), Установлено, что в мазках, пр»сготовленных из проб внешней среды, содержащих в 1 да 500 тыс. м.х., обнаруживаются единичные клетки с интенсивным специфическим свечением.

Специфичность подученных нами люминеецирующих нммуногаобулиновых препаратов проверяли на 40 штаммах культур гетеродогичных микроорганизмов (У.ртеийо1иЬегсик»15 М. серовары, У.емегосоЦпса, Е.со!!, ВшсеНа, Р.ЫагегшЕ, У. режцз). В

результате констатировано отсутствие иммунофлуоресценцин со всеми ггтерологичнымм т :.'фоорга и изш а и,

Таким образом, нами изготовлены высокоспецнфичкые экспериментальные серия иг.:¡.¡умогаобулино::ък диагностических шомкне2ци-рукзийгх препаратов (чуклые, бруцеятскые, туляреминные) на основе пшер:;м;„унных ¡фолг.чькх сьлюротсг; при использовании аяпгтенов, высушенных разными ренетами. Все полученные серии диагносппсу-ког. отвечали ОМБТ, предъявляемым к комииесцирукнцим препаратам. Следовательно, нами доказана возможность использования "жесткого" режима сушки антигенов (16 часов) в производстве МИБП.

Независимо от используемых нами режимов яиофилнзашш антигенов их качество было идентичным. Специфические антитела в сыворотках крови животных, полученный к разньш антигеиаа,имели одинаковые титры. Приготовленные на их основе люминесцирующие иммуноглобулины, по своим свойствам (внешний вид, растворимость, прозрачность, цветность, концентрация белка, количественное соот-иог.с ,;ие ФИТЦ/беяозс, специфическая акттшность и специфичность) были равноценны. Это позволяет рекомендовать включить в нормативно-техническую документацию на выпуск указанных препаратов "жесткий" режим лнофилизаиии антигенов, как наиболее экономичный, обеспечивающий высокое качество нммуногенов.

В настоящее время для избирательного концентрирования и обнаружения антигенного материала, в том числе бактериальных клеток, широко примешает различные нммуносорбционкые методы (Шаханина с соавт., 1969; Сербезоз с соавт., 1973; Закревский, 1980 и др.). Среди них известны способы селективного концентрирования микроорганизмов иммуносорбснтамн, которые представляют собой антитела, приведенные в нерастворимую форму, но сохраняющие специфическую активность (Незяин, 1972). Дополнительные удобства и значительные преимущества перед общепринятыми методами появились с началом использования сорбентов с магнитными свойствами, используемыми в качестве твердой фазы для селективного концентрирования антигенов и микроорганизмов (Smith, 1977; Lea et а!., 1985).

Для получения диапиостихумов магносорбентных мы использовали способ получения МИС, рекомендованный В.И.Ефремекко с соавторами (1986). Лигандом служили igG, выделенные с помощью ПЭГ-6000 по A.Polsori et al. (1964) из высококачественных спецнфиче-

еких гиперимлп-нных кроличьих сывороток, полученных нами на основе антигенов возбудителей чумы, бруцеллеза и туляремии, высушенных разными режимами. Иммобилизацию на магнитные полиа-криламидные гранулы проводили путем их ковалентного присоединения с использованием гаутарового альдегида.

Приготовлено по 7 серий препарата для диагностики возбудителей чумы, бруцеллеза и туляремии. Их оценка проводилась по следующим критериям: форма и размер гранул, подвижность в магнитном поле, специфическая активность и специфичность в иммуноферментном анализе (ИФА) и методе количественной иммунофлуоресцеицнн (КИФА),

Для проведен!« ИФА и КИФА с использованием днагностику-мов магносорбентных нами разработаны методические приемы,. оформленные в виде методических рекомендаций "Использование мгпгоиммуносорбентов в иммунологических методах выявления корпускулярных и водорастворимых антигенов возбудителей инфекцион- " ных заболеваний (бактернолоппсский, иммуноферментный, иммуно-флуоресцешгньгн)", одобренные Ученым Советом СНИПЧИ и утвержденные директором института (протокол N10 от 23 декабря 1994 года).

йммуноферментиый анализ проводит! с использованием поли-егкроловых мккропланшет (предварительной сенсибилизации не требуется) и пульта "Электроника*.

Все испытанные серии диагмосгикумов представляли собой гранулы сферической формы н имели размеры от 20 до ! 00 мхм. Время сепарации 10 мг магнитных сорбентов из объема ! мл под действием постоянного магнита было не более 3 секунд.

Чувствительность диагноста кумов испытывали на 3-5 типичных гомолопмных штаммах каждого вида возбудителя в пята повторно-стах при разведении микробных взвесей с 1x10". м.кЛм до 1x10^. мосЛи: (корпускулярные антигены). Установлено, что специфическая V активность препаратов обеспечивает определение соответствующих микробных клеток обоими методами анализа (ИФА и КИФА) в концентрации м-к/мл возбудителей чумы, бруцеллеза и туляремии, в том числе в пробах*имитирующих объекты внешней среды.

Специфичность препаратов, оцененная на гегерологичкых штаммах в этих же методах, позволяет провопить анализ без перекрестных реакций с исследованными гетеролотичными микроорганизмами. Чувствительность и специфичность у диагностнкумов, получен-

ных на основе антигенов, высушенных разными режимами, равноценны.

На основе полученных специфических, высококачественных иммуноглобулинов н полиакрияашщных магносорбентов нами сконструированы диагносгихумы магносорбентные для И ФА и КИФА чумной, бруцеллезный и туляремййный. Изготовлено несколько десятков лабораторных и производственных серий указанных диагиости-кумов, характеризующихся высокой чув ста иге ль н е сгь ю (1х1(Г uжJыл) и специфичностью, независимо от режима сушки антигенов, используемых в дальнейшем для получения гилериммунных сывороток.

. Проведены Государственные приемочные испытания диагности-кунов магноссрбелтных чумных и туляремии ных. Составлена и утверждена НТД: регламент производства N510-95, ВФС 42/Д-014ВС-95, инструкция по применению даахиоегихума магносорбентно-го туляремийного жида ого для ИФА н РИФ: регламент производства N511-95, ВФС 42/Д-015ВС-95, инструкция по применению диагно-стихума матаосорбгнтного чумного жидкого для ИФА и РИФ, в которой в технологическую схему производства на этапе лиофилъной сушки антигенов заложен оптимальный "жестки!!" режим сушки (16 часов).

- Заключение

Для сохранения потребительской стоимости иммунобиологических препаратов необходимо постоянное совершенствование их технологии. Это полностью относится как к люминесцентным диагноста-кумам, так и к разрабатываемым в настоящее время магносорбснгтым с использованием иммуноглобулинов к антигенам возбудителей особо опасных инфекций. Существенным пробелом в этом отношении остается способ презервации антигенов чумы, бруцеллеза, туляремии. Несмотря на огромное количество работ, посвященных этому вопросу, вакуумному высушиванию антигенов почти не уделяли внимания.

Известно, что решение данного вопроса складывается из трех взаимосвязанных этапов: изучение влияния предварительного замораживания, непосредственного высушивания н оценка антигенов в зависимости от свойств конечного продукта.

В соответствии с этим нами и были поставлены задачи исследования.

Анализ литературных источников показал, что наиболее хорошо изучена фракция i чумного микроба, которая почти на 99% состоит из белка. Полученные вокносолевые экстракты антигенов возбудителей бруцеллеза н туляремии характеризуются как ботеоволипополисаха-ридные комплексы. По мнению ряда авторов, наибольшее влияние на сохранность бактериофагов, которые по своим свойствам, по-видимому, стоят ближе к простым биосистемам, оказывает скорость охлаждения и гораздо менее выраженное - скорость отогрева. В связи с этим в наших опытах мы варьировали температурой замораживания, а условия оттаивания всегда были одинаковые (37°С). Замораживание осуществляли в низкотемпературном холодильшже (-30е С), сухим льдом (-79'С) и в жидком азоте (-196°С). Результаты многократно повторенных опьглов показали, что для всех антигенов существует общая закономерность: независимо от температурь!, скорости и краткости в процессе замсрзживатэд-отгаивания происходит статистически достоверное снижение специфической активности антигенов. Однако степень ее из?ленення была неодинаковой. При "медленном" охлаждении активность всех изучаемых антигенов не отличалась ках после одно-, так и десятикратного заморажквания-оттаивания. При "быстром" и "очень быстром" режимах наиболее стабильной оказалась Ф1, поскольку дополнительное десятикратное замораживание-оттаивание не влиядо на ее качество. Бруцеллезный и туяяремийный антигены снижали свою специфическою активность после 5 и 10 циклов указанного воздействия! Наиболее губительным было "очень быстрое" охлаждение в жидком азоте, з наименьшее -"медленное" в низкотемпературном холодильнике. Механизм этого явлен™ теоретически можно представить следующим образом. При "медленном" замораживании образуются крупные кристаллы с довольно значительными пространствамн между ними, в которых антигены относительно защищены от механических воздействий льда. "Очень быстрое замораживание" приводит к нитрификации структуры льда, с многочисленными мелкими кристаллами, которые, сдавливая полимеры, обусловливают разрывы нх фрагментов. Это предположение подтверждают наши опьггы. Добавление защтных сред, содержащих сахарозу, желатин и т.д., предохраняет антигены от губительного действия замораживания-оттаивания, от механических разрушений биоструктуры. В процессе замораживания-оттаивания происходили конформациокные изменения белка в растворах антигенов. При

этом процент разрушения белка у чумного антигена был зкачэтельно выше, чем у бруцеллезного и туляремийного, что объясняется белхово-лнпополисахаридиой природой двух последних иммуногенез». Весь комплекс проведенных исследований позволяет сделать выводы о том, что наиболее перспективным режимом предварительного замораживания антигенов является "медленное" - в низкотемпературном холодильнике. Оно обеспечивает высокое их качество, технологичности процесса и экономическую эффективность за счет дешевизны получаемого холода по сравнению с сухой углекислотой и жидким азотом.

На основе использования только "медленного" предвар}ггеяьного замораживания нами предложено два режима лиофияизации: •умеренный", при котором длительность удаления свободной воды равнялась 14,5±1 час, связанной влаги - 10,5±1 час, а конечная температура подогрева не превышала 25,0+!"С, к "жесткий" режим, который характеризуется максимально интенсивным удалением свободной и связанной воды (по 8,0 час каждый период). Специфическая активность и с л ектрофото м етр ячеек ие показатели белка у агггитенов ни в процессе вакуумной сушки, ни при годичном хранении в рефрижераторе при 4±2°С (срок наблюдения) не изменились. При анализе нераз-рьшно связанных этапов лиофнлюации (ззмораживание-высушивание) был отмечен чрезвычайно интересный факт, подтверждающий преимущество вакуумной сушки перед криохонсервацкей биообъектов. Установлено, что оттаивание замороженного блока является наиболее повреждающим фахтором, ибо удаление воды путем сублимации, т.е. перехода ее из твердого б газообразное состояние, сохраняет качество препаратов на исходном уровне.

Высокое качество антигенов, высушенных указанными выше режимами, после яиоф:шиза(Ц!Я подтверждается получением гипернм-яунных сывороток к возбуюггслям чумы, бруцеллеза и туляремии и приготовленными из них иммуногпобулиновых люмннеецгнтныл и аагносорбентньи. диагностикумов, Специфическая активность сывороток в НРИФ достигала 1:512-1:2048, а в РИД 1:16-1 -.64. Сыворотки были использованы для приготовления экспернмеитальио-пронзводственных 30 серий шоминесцирующих чумных, бруцеллезных н тудяреминных иммуноглобулинов (по !0 серий).

Одновременно бьою приготовлено по 7 экспериментально-производственных серий магноиммуносорбентньк диагностикумов, которые также бьши идентичны но качеству. На все опытные днагно-

стшсумы, в технологии которых использованы "жесткие* режимы сушки антигенов, получено положительное заключение ЛСК ГИСК им. Л Л, Тарасевича, что послужило основанием для создания и последующего утверждения нормативно-технической документации: регламента произЕодсггга N510-95, ВФС 42/Д-014ВС-95, инструкции по применению диашостикума магносорбентного туля ремизного жидкого для И ФА и РИФ, регламента производства N511-95, ВФС 42/Д-015 ВС-95, инструкции по применению диагносгакума мзгносорбентного чумного Ж)щкого дога ИФА и РИФ.

Комплекс проведенных исследований убедительно показал, что "жесткие" режимы высушивания в сочетании с оптимальными условиями предварительного замораживания антигенов могут быть использованы в процессе производства иммуногпобуяиновых диагностических препаратов. Указанные режимы экономичны, технологичны и обеспечивают высокое качество диагноегккумов. Длительное сохранение исходных свойств лиофшхизированных антигенов способствует стандартизации существенного этапа технологии получения гнлернм-мункых сывороток за счет применения одной партии высококачественных антигенов.

ВЫВОДЫ

Î. Разработан универсальный режим лиофнлизацик чумного, бруцеллезного и тудареминвого антигенов. Он предусматривает замораживание материала в низкотемпературном холодильнике при -30°С в течение 2-х часов, удаление свободной н связанной воды за !б часов (по 8 часов для каждого периода) и подогрева материала в конце процесса сушки до 47,5±2.5вС (2 часа). Режим обеспечивает равноценную активность препаратов по сравнению с "щадящим" и "умеренным" (36 и 24 часа общая продолжительность процесса), но экономически более дешевый за счет снижения расходов электроэнергии, воды, амортизации оборудования и тл.

2. Установлено, что при "медленном" охлаждении антигенов чумы, бруцеллеза и туляремии в низкотемпературном холодильнике НС 700/50 "Фригера" до -30СС происходит наименьшее снижение их специфической активности, определяемое в РИЭФ, по сравнению с замораживанием в сухой углекислоте до -79°С и жидком азоте до -! 96 ГС. Оно обеспечивает экономическую эффективность за счет авто-

номного получения холода агрегатом низкотемпературного стопа и не требует сложных зазодских установок для выработки сухой углекислоты и жидкого азота, а также особых условий их транспортировки и хранения.

3. Показано, что тномочевиновый стабилизатор (10% сахарозы, 1% желатины и 1% тиомочевины) существенно защищает указанные антигены в процессе десятикратного замораживания-опаивания. Наилучший эффект отмечен при "медленном" и "быстром" охлаждениях и наиболее слабый при "сверхбыстром". Туляремийный антиген бьт значительно лабильнее чумного и бруцеллезного.

4. Установлено, что одним га наиболее повреждзгощих фаггоров является процесс оттаивания замороженного антигенного материала, который отсутствует при сублимационной сунпсе.

5. Специфическая активность кроличьих пшериммунных сывороток имела высокие титры при определении в НРИФ и РИД и не зависела от режима сушки чумных» бруцеллезных и туяяремийньа антигенов, используемых для иммунизации животных-продуцентов.

6. Доказано, что иммуноглобулины диагностические люмннес-цирующие чумные, бруцеллезные, туляреминные, диагностикумы магноиммуносорбектнь 1с, приготовленные на основе соответствующих антигенов, высушенных "щадящим", "умеренным" и "жестким" режимами, по всем свойствам (физико-химическим, специфической активности, чувствительности и т.д.), были равноценными.

7. Разработан универсальный "жесткий" режим, яиофилнзации антигенов, обеспечивающий высокое качество препаратов при относительно малых затратах на процесс замораживания-высушивания, который включен в утвержденные РП N510-95 диагностикума магно-сорбенпюго туляреыийного жидкого для ИФА и РИФ и РП N511 -95 диагностикума магносорбентного чумного жидкого для ИФА и РИФ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Влияние многократных замораживаний-оттаиваний на активность Ф1А чумного микроба. (Тюменцева И,С., Нудыка ДА., Галекко Г.Н. и др.) - // Сб. Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций. Материалы Российской научной конф. - Саратов, 1993.-С.73-74.

2. Отработка режимов лиофилизацин антигенов возбудителей особо опасных инфекций, применяемых для производства иммуногяо-булнновых диагностических препаратов. (Тюменцева И.С., Тинкер А.И., Жданова Е.В. и др.)/ Ставропольский н.-и. противочумный ии-т. -Ставрополь, 1993.-Деп. ВИНИТИ 27.07.93.N2129-В93.'

3. Оптимизация режимов лиофжгизации антигенов возбудителен чумы, туляремии, бруцеллеза, используемых для производства имму-нотлобулиновых диагностических препаратов. (Тюменцева И.С., Тий— хер А.И., Бингтова В.В. и др.)// Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особо опасных инфекционных болезней. Тез. докл. науч. хонф. (октябрь 1993 г., Омск). - Ставрополь, 1993. - С.299-30!.

4. Влияние многократных замораживаний-оттаиваний на активность Ф1А чумного микроба. (Тюменцева И.С., Жданова Е.В., Тинкер А.й. и др.)// Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний. Материалы .межгосударственной науч.-практнч. конф., посвящ. ! 00-летию открытая возбудителя чумы. Ставрополь, 1994 г. - С .93-94.

5. Сравнительное изучение способов замораживания антигенов возбудителе!) чумы, туляремии и бруцеллеза, используемых в производстве иммунобиологических препаратов. (Тюменцева И.С., Тинкер

A.И., Жданова Е.В.)//Там же. - С.51-52.

6. Влияние условий замораживания на активность антигенов возбудителей чумы, бруцеллеза и туляремии (Тюменцева И.С., Ефременко

B.И., Тинкер А.И.У Ставропольский н.-и. противочумный ин-т. Ставрополь, ¡995. - Деп. ВИНИТИ 10.07.93. Н2073-В95.

!" £ о., '.чц