Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние бактерий Yersinia pestis, francisella tularensis и их антигенов на экспрессию Toll-подобных рецепторов (TLR2, TLR4) клетками врожденного и адаптивного иммунитета

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние бактерий Yersinia pestis, francisella tularensis и их антигенов на экспрессию Toll-подобных рецепторов (TLR2, TLR4) клетками врожденного и адаптивного иммунитета"

На правах рукописи

СМОЛЬКОВА ЕЛЕНА АНАТОЛЬЕВНА

ВЛИЯНИЕ БАКТЕРИЙ YERSINIA PESTIS, FRANCISELLA TULARENSIS И ИХ АНТИГЕНОВ НА ЭКСПРЕССИЮ TOLL-ПОДОБНЫХ РЕЦЕПТОРОВ (TLR2, TLR4) КЛЕТКАМИ ВРОЖДЕННОГО И АДАПТИВНОГО ИММУНИТЕТА

03.02.03 - микробиология 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 (ЛАР ¿G>2

Саратов -2012

005010820

Работа выполнена в Федеральном казенном учреждении здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители:

кандидат медицинских наук,

доцент Никифоров Алексей Константинович

доктор медицинских наук,

старший научный сотрудник Щуковская Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты:

Девдариани Зураб Леванович, доктор медицинских наук, профессор, ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора, зав. лабораторией

Елисеев Юрий Юрьевич, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Минздравсоцразвития России, зав. кафедрой

Ведущая организация - Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека _

Защита состоится «21» марта 2012 г. в Э часов на заседании диссертационного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.078.01 при ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб».

Автореферат разослан 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета 1 доктор биологических наук, старший научный сотрудник

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Внедрение патогенных и условно-патогенных микроорганизмов в организм хозяина распознается системой врожденного иммунитета посредством набора генетически детерминированных, так называемых паттсрнраспозпающих рецепторов (ПРР), которые имеют высокий аффинитет к консервативным микробным молекулярным фрагментам, характерным для широкого спектра микроорганизмов (пептидогликапу, липополисахариду, липотейхоевым кислотам, липопротсипам, липопентидам, нентидогликанам, флагеллину, вирусной РНК, бактериальной ДНК, богатой CpolyG-послсдовательностями, белкам теплового шока, поринам, Р-глюкапу, мапнану и др.) и получившим название патогеп-ассоциировапные молекулярные компоненты (PAMPs - pathogen-associated molecular patterns) [Симбирцев А.С., 2005; Takeda К., Akira S, 2003; Uematsu S., Akira S, 2006].

ПРР представляют собой группу различных по строению и происхождению молекул, обладающих способностью взаимодействовать с PAMPs с целью их прямой нейтрализации или запуска каскада провоспалнтельиых реакций, направленных в конечном счете па блокирование жизнедеятельности, дезинтеграцию и удаление патогена из организма [Ehlers S., Bulfone-Paus S., 2004].

Показано, что ключевую роль в распознавании бактериальных и вирусных патогенов играют То11-подобные рецепторы (Toll-like receptors, TLRs), локализующиеся па различных иммунокомпстентных клетках и обеспечивающие проведение внутриклеточного активационпого сигнала. Эволюционная стабильность То11-подобных рецепторов не уступает их микробным лигапдам [Байракова A.J1. и др., 2008; Hallman М. et al., 2001].

В настоящее время идентифицировано 13 То11-подобпых рецепторов. Каждый из TLRs имеет присущий ему сигнальный путь, активация которого индуцирует созревание дендритных клеток, преобразование рекогносцировочного сигнала в растворимые медиаторы (цитокины, хемокины) и последующее взаимодействие их с цитокин/хемокиновыми рецепторами на Ти В-лимфоидпых клетках, развитие адаптивного иммунитета [Хаитов P.M. и др., 2008; Alexopoulou L. et al., 2002; Homung V. et al., 2002; Netea M.G. et al., 2004; Tsan M.F., Gao В., 2004; Golden IC.B. et al., 2005; Herbst-Kralovetz M.M., Pyles R.B., 2006; Paul-Clark M.J et al., 2006].

То11-подобные рецепторы экспрессированы конститутивно на моноцитах/макрофагах, пейтрофильных граиулоцитах, дендритных клетках, различных популяциях лимфоцитов, эндотелиальных клетках, клетках эпителия кишечника, респираторного и урогепитальпого тракта [Becker M.N. et al., 2000; Wong X. et al, 2002; Guillot L. et al, 2004; Sha Q. et al, 2004; Xu D. et al, 2004].

В условиях введения синтетических лигандов для конкретных TLRs показано их важное значение в формировании песпецифической резистентности к представителями рода Listeria, Francisella, М. tuberculosis, возбудителям лейшманиоза и малярии, установлена ключевая роль TLR4 в развитии лептоспирозной инфекции и бруцеллеза [Campos М.С. et al., 2004; Katz J. et al., 2006; Viriyakosol S. et al., 2006].

Имеются единичные сообщения о важной роли TLR4 в патогенезе чумной инфекции и развитии резистентности к чуме [Montminy S.W. et al., 2006; Airhart C.L. et al., 2008], а также возможной роли TLR2 в опосредованной антигенами rLcrV и YopB Y. pestis ингибиции функции макрофагов [Sharma R.K. et al., 2004].

Мало изучено в условиях in vivo влияние клеток Y. pestis, F. tularensis и их антигенов на экспрессию иРНК TLR2 и TLR4 клетками врожденного и адаптивного иммунитета экспериментальных биомоделей и людей. Отсутствуют сведения о сравнительном анализе экспрессии иРНК TLR2, TLR4 и экспрессии генов цитокинов Thl(IFN-y) и Th2 (1Ь-4)-зависимого ответа у биомоделей в ответ на введение вакцинных штаммов Y. pestis, F. tularensis, антигенов чумного и туляремийного микробов. Отсутствуют также сведения о влиянии вакцинации коммерческими живыми чумной, туляремийной вакцинами на экспрессию TLR2 и TLR4 и продукцию цитокинов Till (IFN-y) и Th2 (1Ь-4)-зависимого ответа клетками врожденного и адаптивного иммунитета у людей.

Цель исследования -изучить влияние чумного, туляремийного микробов и их антигенов на экспрессию иРНК TLR2, TLR4 клетками врожденного и адаптивного иммунитета экспериментальных биомоделей и людей.

Основные задачи исследования

1. Оценить иммунобиологическую активность (токсичность, иммуногеиность, протективпость) препаратов капсульного антигена чумного микроба, выделенного из рекомбинантного штамма Y. pestis КМ 277, вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, протективного антигенного комплекса (ПАК) туляремийного микроба различных подвидов.

2. Изучить влияние вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, рекомбинантного штамма Y. pestis КМ 277, химической чумной вакцины, препаратов капсульного антигена чумного микроба, выделенных из указанных штаммов, на экспрессию паттернраспознающих То11-подобных рецепторов 2 и 4 типов клетками врожденного и адаптивного иммунитета биомоделей.

3. Провести исследование экспрессии генов цитокинов Thl (IFN-y) и Th2 (1Ь-4)-зависимого ответа у биомоделей при введении вакцинного штамма Y.

peslis EV НИИЭГ, рскомбипаптпого штамма Y. pestis KM 277, химической чумной вакцины, препаратов капеулыюго антигена чумного микроба, выделенных из данных штаммов.

4. Исследовать индуцированную вакцинным штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ экспрессию генов паттсрпраспозпающих То11-подобных рецепторов 2 и 4 типов, цитокипов (IFN-y, IL-4) у экспериментальных биомоделей.

5. Сравнить уровень экспрессии иРНК TLR2 и TLR4, цитокипов (IFN-y, IL-4) у биомоделей, индуцируемой протектнвпым антигенным комплексом (ПАК) туляремийпого микроба различных подвидов.

6. Изучить влияние вакцинации против чумы и туляремии на экспрессию и РНК TLR2, TLR4 и продукцию цитокипов клетками врожденного и адаптивного иммунитета у людей. Оцепить возможность применения полученных результатов в качестве показателя эффективности вакцинации против чумы и туляремии.

Научная новизна. Получены новые сведения о характере влияния рекомбинаитпого штамма Y. pestis KM 277 - продуцента капсульного антигена чумного микроба Ф1, выделенного из пего препарата капсульного антигена Ф1, экспериментальной химической чумной вакцины, препаратов протективного антигенного комплекса туляремийпого микроба различных подвидов па экспрессию in vivo иРНК То11-подобпых рецепторов 2 и 4 типов. Показано, что рекомбинаптпый штамм Y. pestis КМ 277, выделенный из него препарат капсульного антигена Ф1, химическая чумная вакцина индуцируют повышение экспрессии иРНК TLR2 уже в первые часы после введения в организм экспериментальных животных с последующим усилением пролиферативпой активности в центральном (тимусе) и периферическом (селезенке) органах иммунной системы и формированием напряженного протективного иммунитета.

Установлено, что введение препарата протективного антигенного комплекса из вакцинного штамма F.tnlarensis 15 НИИЭГ голарктического подвида уже через 4 ч вызывает повышение экспрессии спленоцитами как TLR2, так и TLR4. Препараты протективного антигенного комплекса, полученные из вирулентного штамма голарктического (F.tiilarensis 503/840) и среднеазиатского (F. tularensis А179) подвидов, индуцируют усиление экспрессии только TLR2. Препарат протективного антигенного комплекса из штамма F.tiilarensis В399 A'Cole нсарктичсского подвида, не вызывает изменений экспрессии исследуемых типов То11-подобных рецепторов.

Впервые проведен сравнительный анализ экспрессии TLR2, TLR4 и экспрессии генов цитокипов Thl(IFN-y) и Th2 (1Ь-4)-зависимого ответа у биомоделей, индуцируемой вакцинным штаммом Y. pestis EV НИИЭГ,

рекомбинаитным штаммом Y. pestis KM 277, химической чумной вакциной, капсульмым антигеном чумного микроба, выделенным из Y. pestis КМ 277 и К pestis EV НИИЭГ, вакцинным штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ, протективным антигенным комплексом туляремийкого микроба различных подвидов. Получены новые данные, свидетельствующие о преимущественной экспрессии клетками врожденного и адаптивного иммунитета иРНК TLR2 и IFN-y в условиях in vivo.

Впервые проведено сравнительное изучение влияния вакцинации против чумы и туляремии на экспрессию и РНК TLR2, TLR4 и продукцию цитокинов клетками врожденного и адаптивного иммунитета у людей, оценена возможность применения полученных данных для разработки критериев оценки уровня противочумного иммунитета у людей.

Установлено, что вакцинация людей против чумы и туляремии отечественными живыми вакцинами вызывает различные изменения уровня экспрессии иРНК TLR2 и TLR4 в лейкоцитах периферической крови. Если в гранулоцитах через 3 месяца после вакцинации против чумы и туляремии транскрипционная активность генов TLR2 и TLR4 не была существенно изменена, то в моиопуклеарных клетках введение живой чумной вакцины в противоположность живой туляремийной вакцине приводило к исчезновению детектируемого уровня экспрессии иРНК TLR4, не влияя на уровень синтезируемой иРНК TLR2. Сочетанная вакцинация против чумы и туляремии индуцировала экспрессию иРНК TLR2 и TLR4 как гранулоцитами, так и мононуклеарными клетками вакцинированных доноров.

Выявленные отличия в экспрессии иРНК TLR4 мононуклеарными клетками, активация которого важна для формирования полноценного адаптивного иммунитета, могут быть одной из причин формирования различного по продолжительности поствакципального иммунитета при чуме и туляремии.

На основании полученных новых данных об однотипности митоген- и антигениндуцированпой продукции IFN-y как в смешанной популяции лимфоцитов, так и в культуре клеток крови у вакцинированных против чумы людей, предложено использование параметров индуцированной Т-клеточным митогеном копканавалином А (лигандом TLR2) продукции маркерного цитокина IFN-y в качестве критерия оценки уровня противочумного иммунитета у людей.

Практическая значимость. Результаты исследований были использованы при разработке методических рекомендаций «Определение экспрессии генов Толл-подобных рецепторов 2 и 4 клетками врожденного и адаптивного иммунитета у людей и экспериментальных животных», которые

одобрены Ученым сонетом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол №7 от 16.12.2010г), утверждены директором института и используются в практической деятельности отдела иммунологии, лаборатории прикладной генетики РосНИПЧИ «Микроб». Материалы исследования используются при чтении лекций на курсах первичной специализации по специальностям «Бактериология» и «Эпидемиология» с основами безопасной работы с патогенными биологическими агентами 1 - II групп при ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб».

Основные положения, выносимые па защиту

1. Рскомбипантпый штамм Y. pestis КМ 277 - продуцент капсульного антигена чумного микроба Ф1, выделенный из него капсульный антиген Ф1, а также химическая чумная вакцина индуцируют повышение экспрессии иРНК TLR2 в первые часы после введения в организм экспериментальных животных с последующим усилением пролиферативпой активности в центральном (тимусе) и периферическом (сслсзспке) органах иммунной системы и формированием напряженного протективного иммунитета.

2. Протсктивный антигенный комплекс, полученный из вакцинного штамма голарктического подвида F. tularensis 15 НИИЭГ, вызывает повышение экспрессии клетками адаптивного (спленоцитами) иммунитета как TLR2, так и TLR4, в отличие от препаратов протективного антигенного комплекса, полученных из вирулентного штамма F.tularensis 503/840 голарктического подвида и штамма F. tularensis А179 среднеазиатского подвида, которые индуцируют повышение экспрессии только TLR2. Препарат протективного антигенного комплекса, полученный из штамма F.tularensis В399 A'Cole псарктического подвида, не вызывает изменений экспрессии исследуемых типов То11-подобиых рецепторов.

3. Препараты капсульного антигена, выделенного из рекомбинантного штамма Y. pestis КМ 277, вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, препараты протективного антигенного комплекса туляремийного микроба различных подвидов защищают экспериментальных животных (аутбредных мышей) от гибели в условиях моделирования чумной и туляремийной инфекции, в дозе 100 мкг не оказывают токсического действия и не вызывают по данным проточно-цитофлуориметрического мониторинга повреждения иммупокомпетептпых клеток по тину аноптоза.

Протективиая активность капсульного антигена, выделенного из рекомбинантного штамма Y. pestis КМ 277, в 3 раза выше по сравнению с препаратами капсульного антигена, выделенного из вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ.

4. Вакцинация людей против чумы и туляремии живыми вакцинами вызывает различные изменения уровня экспрессии иРНК ТЫ12 и ТЫ14 в лейкоцитах периферической крови. Введение живой чумной вакцины в противоположность живой туляремийной вакцине приводит к исчезновению в мононуклеарных клетках привитых детектируемого уровня экспрессии иРНК Т1Л4, не влияя на уровень синтезируемой иРНК ТЬЯ2. Сочетапная вакцинация против чумы и туляремии индуцирует экспрессию иРНК ТЫ12 и ТЫ14.

5. Сравнительная оценка спонтанной, митогеи- и аитиген-индуцировапной продукции 1РМ-у и ІЬ-4 в культуре клеток крови людей, вакцинированных живой чумной вакциной, живой туляремийной вакциной указывает на преимущественное развитие ТЫ-зависимого иммунного ответа. Параметры индуцированной лигапдом ТЬЯ2 Т-клеточным митогеном конкаиавалипом А продукции маркерного цитокина 1РМ-у предложены в качестве критерия оценки уровня противочумного иммунитета у людей.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены и представлены на Всероссийской паучно-практической конференции с международным участием «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2008); IX Межгосударственной научно-практическая конференции государств -участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств - участников содружества независимых государств» (Волгоград, 2008); Международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» (Санкт-Петербург, 2010); научно-практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб» «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2009-2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, из них статей в рекомендованных ВАК изданиях -4.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 85 отечественных и 195 зарубежных источников. О бьем диссертации составляет 177 страниц машинописного текста. Работа иллюстрирована 25 рисунками и 18 таблицами.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы

В работе использовали: 1) Штаммы микрооргапизмон - рскомбипаптпый штамм Y. pestis КМ 277 (EVI lMpFSK3) Kmr -продуцент капсульного антигена; вакцинный штамм Y pestis EV МИИЭГ (Pgm", pFra+, pCad+, pPst+); вакцинный штамм F. tularensis )5 НИИЭГ; вирулентный штамм Y. pestis 231 (Pgm+, pFra+, pCad+, pPst+); вирулентный штамм F. tularensis 503/840. Все указанные штаммы получены из Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб». 2) Антигены - убитые нагреванием клетки вакцинного штамма Y. pestis EV ЫИИЭГ; коммерческий препарат «Тулярин» производства ГУП НПО «Млкрогсп», Россия, представляющий собой взвесь убитых нагреванием клеток вакцинного штамма Francisella tularensis 15 НИИЭГ; Т-клеточпый митоген конканавалип A (Con A; "Sigma", США); капсульпый антиген (Ф1), выделенный из рекомбипантпого штамма Y. pestis КМ 277 и вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV НИИЭГ; экспериментальная химическая чумная вакцина (серия 2), состоящая из Ф1 чумного микроба и основного соматического антигена (ОСА) возбудителя псевдотуберкулеза; протективпые антигенные комплексы туляремийпого микроба, полученные из вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ subsp. holarctica, вирулентных штаммов F. tularensis 503/840 subsp. holarctica, F. tularensis B399 A'Cole subsp. nearctica, F. tularensis A-l 79 subsp. mediasiatica.

Препараты капсульного антигена, выделенного из вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV НИИЭГ любезно предоставлены доктором биологических наук, профессором Т.М. Тараиенко (лаборатория биохимии и протсомики РосНИПЧИ «Микроб»). Все препараты протективного антигенного комплекса туляремийпого микроба, капсульный антиген (Ф1), выделенный из рекомбипантпого штамма Y. pestis КМ 277, получены из лаборатории экспериментальной биотехнологии РосНИПЧИ «Микроб».

Экспериментальная часть выполнена с использованием в качестве биомодслей 600 аутбредных и 250 ипбредных мышей линии BALB/c массой (18+2) г, полученных из отдела экспериментальных животных с виварием РосНИПЧИ «Микроб».

В ходе выполнения работы были обследованы 38 вакцинированных волонтеров и 8 не привитых доноров в качестве группы сравнения. Вакцинацию отечественными коммерческими живой чумной вакциной производства ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора» и живой туляремийной вакциной производства ГУП НПО «Микрогеп» проводили накожным способом в

плановом порядке согласно приказу Минздрава России от 27.07.2001 №229 «О национальном календаре профилактических прививок и календаре прививок по эпидемическим показаниям» и в строгом соответствии с утвержденными инструкциями по применению вакцин. Клинические лабораторные исследования проводились согласно лицензии на медицинскую деятельность №ФС-64-01-001191 от 03.09.2010г. выданной Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития па осуществление медицинской деятельности РосНИПЧИ «Микроб».

Микробиологические и биологические методы. Для культивирования чумного микроба использовали агар Хоттингера рН 7,2±0,1, для культивирования туляремийного микроба - РТ-агар с глюкозо-витамипной добавкой (ГНЦ ПМБ, г. Оболенск). Штаммы У. рыН.у ЕУ НИИЭГ, У. рехИя КМ 277 и У. рез^э 231 выращивали при температуре 28°С в течение 48 ч. Штаммы К 1и1агеп.ч1х 15 НИИЭГ, Р. Ыагепш 503/840 - при 37°С в течение 48 ч.

Для последующей работы (приготовление иммунизирунощих и заражающих доз, убитых клеток) с плотных питательных сред визуально и под малым увеличением микроскопа отбирали колонии чумного и туляремийного микробов, типичные по своим культуральпо-морфологическим свойствам.

Одновременно контролировали бактериоскопически морфологические и типкториальные свойства клеток в мазках, окрашенных по Граму.

Убитые клетки К реМ/'х ЕУ НИИЭГ использовали в качестве индуктора экспрессии изучаемых То11-подобных рецепторов и продукции цитокипов. Для их получения из двухсуточной культуры чумного микроба готовили взвесь клеток в стерильном физиологическом растворе по стандартному образцу мутности ОСО 42-28-59-85П 10 единиц, эквивалентному I к 109 м.к. в 1 мл. Полученную взвесь прогревали при 60°С в течение 1 ч 20 мин [Павлова Л.П., 1964].

Необходимые концентрации культур чумного и туляремийного микробов для иммунизации экспериментальных биомоделей и определения напряженности иммунитета в тесте активной защиты мышей готовили методом серийных разведений в соответствии с МУ 3.3.1.1113-02 «Основные требования к вакцинным штаммам чумного микроба» и МУ 3.3.1.2161-07 «Основные требования к вакцинным штаммам туляремийного микроба».

Для определения напряженности противочумного иммунитета при иммунизации вакцинным штаммом чумного микроба У. ре.чИэ ЕУ НИИЭГ проводили расчет ЬО50 заражающего вирулентного штамма У.рейШ 231. Для оценки протективных свойств антигенных препаратов чумного и туляремийного микробов применяли метод определения 1т05о при заражении высоковирулентными штаммами У.рехИэ 231 и Я ////яге«.?/^ 503/840 дозами 400

LD5o и 100 LD5o соответственно. Гибель от чумной или туляремийной инфекции подтверждалась наличием соответствующей патологоапатомической картины и результатами высевов из органов павших животных па питательные среды. Величину LDj0 или ImDí0 рассчитывали по методу Ксрбера в модификации И.Г1. Лшмарина (1962).

Молскулярно-биологичсскис методы (определение экспрессии генов TLR2, TLR4 п генов цитокпнов IFN-y, IL-4). Для определения экспрессии иРНК TLR2 и TLR4 применяли полимеразпую цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-Г1ЦР). Выделение нуклеиновых кислот проводили методом аффинной сорбции на частицах силикагсля с помощью комплекта «РИБО-сорб» (ИЛС, РФ) в соответствии с инструкцией производителя. Для получения препарата чистой РЫК без примеси ДНК полученную смссь РНК/ДНК обрабатывали ДНКазой, свободной от РНКаз «DNase I, RNase-free». («Fermentas», Литва) в соответствии с приложенным протоколом. Обратную транскрипцию осуществляли с использованием комплекта «РЕВЕРТА» (ИЛС, РФ). Для проведения ПЦР применяли специфические праймеры (таблица 1, 2).

Таблица 1 - Олигопуклеотидные праймеры, использованные в работе для определения экспрессии TLR2 и TLR4 у людей

Экспрессия генов Названия нраПмеров Последовательность (5' - 3')

GAPD11 GAI'DH-f GAI'DH-r GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT TGG GAT TTC САГ TGA TGA CA

TLR2 TLR2h-f TLR21i-r GCC AAA GTC TTG ATT GAT TGG TTG AAG TTC TCC AGC 'ГСС TG

TLR4 TLR4h-f TLR4h-r TGG ATA CGT TTC CTT ATA AG GAA ATG GAG GCA CCC CTT С

Таблица 2 - Олигопуклеотидные праймеры, использованные в работе для определения экспрессии TLR2, TLR4, IFN-y, 1L-4 у биомодельных мышей

Экспрессия генов Названия праПмсров Последовательность (5' - 3')

P-Aclin P-acl-f P-act-r TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA С TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G

TLR2 tlr2m-f Ilr2m-r CAG CTT AAA GGG CGG GTC AGA G TGG AGA CGC CAG CTC TGG CTC A

TLR4 iHm-f (lr4m-r AGT GGG TCA AGG AAC AGA AGC A CTT TAC CAG CTC ATT ГСТ CAC С

1L-4 il4-f il4-r CGA AGA ACA CCA CAG AGA GTG AGC T GAC TCA ТГС ATG GTG CAGCTT АТС G

IFN-y ifny-f ifny-l- AGC GGC TGA CTG AAC TCA GAT TGT AG GTC ACA GTT TTC AGC TGT ATA GGG

ПЦР проводили на амплификаторе «МС-2 Терцик» (ДНК-технология, РФ). Для анализа продуктов амплификации использовали электрофорез в 2% агарозпом геле с маркером молекулярных масс по 100 п.п. «PCR marker with Loading Dye» (Amresco, США). Продукты амплификации визуализировали при помощи системы «Gel Doc» («BioRad», США). Учет результатов ПЦР-анализа проводился по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфических полос амплифицированной ДНК.

Иммуносерологические методы. Для определения концентрации суммарного иммуноглобулина Е (IgE) в сыворотке крови, цитокииов 1L-4 и IFN-y в сыворотке крови и супернатантах клеток применяли твердофазный иммуноферментпый анализ с использованием коммерческих тест-систем производства ООО «Цитокин» (г. Санкт-Петербург) и ЗАО «Вектор-БЕСТ» (п. Кольцово). Оптическую плотность измеряли при длине волны 450 им на микропланшетном фотометре для иммуноферментного анализа StatFax-3200 (Awareness Technology, США).

Иммунологические методы. Перитонеальпые макрофаги, клетки селезенки, тимуса биомоделей получали общепринятым методом [РД 42-28-1090]. Мононуклеарные клетки выделяли из гепарииизированной крови путем центрифугирования в градиенте плотности 1,077 г/мл с применением Lymphocyte Separation Medium (Flow Laboratories, Великобритания). Жизнеспособность выделенных клеток оценивали с применением красителя трипанового синего. Реакцию лейкоцитолиза проводили в соответствии с МУ 3.1.2007-05 «Эпидемиологический надзор за туляремией». В качестве антигена использовали коммерческий препарат «Тулярип». Оценку внутриклеточного кислородзависимого метаболизма перитонеальпых макрофагов осуществляли методом спонтанного НСТ-теста [Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001].

Определение апоптотических и пролиферирующих клеток проводили методом проточной цитофлуориметрии. Окраску ДНК иммупокомпетептпых клеток митрамицином (Serva, Германия; Sigma, США), бромидом этидия (Serva, Германия) проводили по методу В. Barlogie et al. (1976). Измерения проводили на импульсном проточном цитофлуориметре ICP-22 PHYWE (Германия), оснащенным 2048 канальным амплитудным анализатором импульсов Ortho Instruments (USA) модели 2102 для автоматической сортировки клеток и построения гистограмм.

Статистические методы. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета программ Microsoft Excel. Определяли среднее значение (М), стандартную ошибку (ш). Достоверность различий оценивали с использованием t-критерия Стыодента. Результаты считали достоверными при значении р < 0,05.

Результаты исследований и их обсуждение

Для объективной интерпретации полученных результатов по действию изучаемых штаммов и антигенов па экспрессию TLR2 и TLR4 на первом этапе наших исследований была проведена оценка иммунобиологической активности (токсичности, иммуногенности, протективпости) препаратов капсульпого антигена чумного микроба, выделенных из рекомбинантпого штамма У. pestis КМ 277, вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, а также протективного антигенного комплекса (ПАК) туляремийного микроба различных подвидов.

Согласно полученным данным все указанные препараты защищают экспериментальных животных (аутбредных мышей) от гибели в условиях моделирования чумной и туляремийной инфекции, не оказывают в дозе 100 мкг, используемой на последующих этапах исследованиях, токсического действия и не вызывают по данным проточпо-цитофлуориметрического мониторинга повреждения иммупокомпетентпых клеток по типу апоптоза.

Установлено, что протективная активность капсульпого антигена (Ф1), полученного из рекомбинантпого штамма Y. pestis КМ 277, в 3 раза выше (р< 0,05) по сравнению с препаратами капсульпого антигена, выделенного из вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ (Ф1 серия 32 и Ф1 серия 44).

Значения I1T1D50 (ImDS0 mm + [mD5o"lax) для Ф1 из штамма Y. pestis КМ 277 и Ф1 серии 32, Ф1 серии 44 составили 8,3 (3,8+19,0) мкг и 29,0 (26,2+34,3) мкг, 28,94 (20,1+32,5) мкг соответственно.

В ходе дальнейших исследований установлено, что введение штаммов Y. pestis с различной генетической характеристикой, вакцинного штамма голарктического подвида F.tularensis 15 НИИЭГ, а также антигенов чумного и туляремийного микробов (капсульпого антигена из рекомбинантпого штамма Y. pestis КМ 277, вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, протективного антигенного комплекса туляремийного микроба различных подвидов) оказывает влияние на уровень и кинетику экспрессии иРНК TLR2, TLR4 в клетках врожденного (перитонеальные макрофаги) и адаптивного (спленоциты) иммунитета биомоделей, степень выраженности которых зависит от вводимого антигена и вида возбудителя, из которого он был выделен.

Подкожное введение рекомбинантпого штамма Y. pestis КМ 277 (EV1 lMpFSK.3) Km' - продуцента капсульпого антигена чумного микроба Ф1, препарата Ф1 из штамма Y. pestis КМ 277, а также экспериментальной химической чумной вакцины индуцирует уже в первые часы повышение экспрессии иРНК TLR2 в спленоцитах мышей линии BALB/c (рисунок 1) с последующим усилением пролиферативной активности в центральном (тимусе) и периферическом (селезенке) органах иммунной системы и формированием напряженного протективного иммунитета (рисунок 2).

Спленоциты Макрофаги К 4ч. 1с. Те. К 4ч. 1с. Те.

У.реик КМ 27"

<Н» «

Ф1 г.ре$Н5 км гп

■ хчв

Рисунок 1 - Уровни иРНК ТЬЯ2 при иммунизации мышей ВАЬВ/с рекомбимантным штаммом К рейю КМ 277, препаратом Ф1 У. КМ 277 и химической чумной вакциной

Рисунок 2 - Относительное содержание (в %) пролиферирующих (I 12 С ДНК) спленоцитов мышей линии ВАЬВ/с в условиях введения Ф1 У. реяНя КМ 277, Ф1 серии 32, Ф1 серии 44 Примечание: * - р < 0,05

Уровень экспрессии ТЫ<2, ТЫ14 в спленоцитах во все исследуемые сроки после иммунизации вакцинным штаммом У. резИя ЕУ ЫИИЭГ ^т", рРга+, рСас1+, рРэ^), препаратами капсульного антигена, выделенного из агаровой культуры вакцинного штамма У. реяНэ ЕУ НИИЭГ (Ф1 серия 32), из бульонной культуры У. ре,чИ,<; ЕУ НИИЭГ (Ф1 серия 44) практически не отличался от показателей в контроле. В перитонеальиых макрофагах

биомоделей зарегистрировано кратковременное (через 4 ч) повышение экспрессии TLR4 в ответ на введение углеводсодержащего препарата Ф1 серии 32 в отличие от Ф1 серии 44, являющейся чистым белком, которое исчезало через 24 ч после иммунизации инбредпых мышей.

В результате проведенного сравнительного анализа экспрессии TLR2, TLR4 и экспрессии генов цитокипов Thl(lFN-y) и Th2 (1Ь-4)-зависимого ответа у биомоделей, индуцируемой вакцинным штаммом Y. pestis EV НИИЭГ, рекомбинаптным штаммом Y. pestis КМ 277, химической чумной вакциной, капсульпым антигеном чумного микроба, выделенным из Y. pestis КМ 277 и Y. pestis EV НИИЭГ, вакцинным штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ, ПАК туляремийпого микроба различных подвидов получены новые данные, свидетельствующие о преимущественной экспрессии клетками врожденного и адаптивного иммунитета иРНК TLR2 и IFN-y в условиях in vivo.

Экспрессия иРНК IL-4 сплепоцитами и перитонеальпыми макрофагами инбредных мышей, иммунизированных штаммами чумного микроба Y. pestis КМ 277, Y. pestis EV НИИЭГ, препаратами капсульного антигена, выделенного из указанных штаммов, была ниже детектируемого уровня в течение всего периода наблюдения, что свидетельствует о превалировании Thl-зависимого ответа в процессе формирования специфической резистентности к чуме.

Введение экспериментальным биомоделям препарата протективного антигенного комплекса из вакцинного штамма F.tularensis 15 НИИЭГ голарктического подвида уже через 4 ч вызывало повышение экспрессии сплепоцитами как TLR2, так и TLR4. Однако препараты протективных антигенных комплексов, полученные из вирулентного штамма голарктического {F.tularensis 503/840) и среднеазиатского (F. tularensis А179) подвидов, индуцировали усиление экспрессии только TLR2 в сочетании с IFN-y. Препарат протективного антигенного комплекса из штамма F. tularensis В399 A'Cole иеарктического подвида, не вызывал изменений экспрессии исследуемых типов То11-подобпых рецепторов, однако индуцировал па ранние сроки усиление экспрессии IFN-y и IL-4.

Важным результатом работы является проведенное впервые сравнительное изучение влияния вакцинации против чумы и туляремии на экспрессию иРНК TLR2, TLR4 и продукцию цитокипов клетками врожденного и адаптивного иммунитета у людей и оценка возможности применения полученных данных для разработки критериев оценки уровня противочумного иммунитета у людей.

Полученные в ходе выполнения работы данные о конститутивной экспрессии у людей гранулоцитами и мононуклеарными клетками крови иРНК TLR2 и TLR4 полностью согласуются с результатами других исследователей

[Ногпигщ V. и др., 2002; 2агетЬег К.А., Godowski РЛ., 2002], определивших с применением ПЦР-анапиза в режиме реального времени уровни экспрессии различными субпопуляциями клеток периферической крови людей иРНК десяти То11-подобных рецепторов, первые позиции среди которых по количеству синтезируемой иРНК заняли Т1Л2 и ТЬЯ4.

Впервые показано, что вакцинация людей против чумы и туляремии отечественными живыми вакцинами вызывает неоднозначные изменения уровня экспрессии иРНКТЫ12 и ТЫ14 в лейкоцитах периферической крови.

Если в гранулоцитах через 3 месяца после вакцинации па фоне сформировавшегося адаптивного иммунитета транскрипционная активность генов ТЬЯ2 и ТЬГ14 не была существенно изменена, то в мопонуклеарных клетках введение живой чумной вакцины, по не живой туляремийиой вакцины, приводило к снижению до недетектируемого уровня экспрессии иРНК Т1Л4, не влияя па уровень синтезируемой иРНК ТЫ12. Сочетаниая вакцинация индуцировала экспрессию иРНК ТЫ12 и ТЫ14 как грапулоцитами, так и моноиуклеарными клетками вакцинированных доноров. Зарегистрировано появление в результате одновременного введения живой чумной и живой туляремийиой вакцин выраженной экспрессии иРНК ТЬЯ2 и ТЬЯ4 грапулоцитами у волонтера с недетектируемым до вакцинации уровнем экспрессии иРШС данных (рисунок 3).

Выявленные отличия могут быть связаны со структурно-функциональными особенностями синтезируемого при разных температурных условиях липополисахарида (ЛПС) чумного микроба - основного лиганда ТЬГМ. Возбудитель чумы при температуре 37°С синтезирует тетра-ацилированный липид А (эидотоксический компонент ЛПС) с очень слабо стимулирующей Т1Л4 активностью и одновременно обладающий свойствами антагониста для гекса-ацилированпой структуры ЛПС с более выраженным стимулирующим действием, синтезируемым при температуре 28°С. Данный феномен связывают с потерей К раНз ЬрхЬ, одной из «последних» ацилтрансфераз в цепочке биосинтеза липида А [МопЬтнпу ЙДУ. а1., 2006; АйаЛ С.Ь. й а!., 2008], со способностью тетра-ацилироваппого ЛПС снижать экспрессию костимулирующих молекул С040, С 1)86, молекул главного комплекса гистосовместимоети II класса на поверхности моноцитов и дендритных клеток человека [Те1ерпсу М.У. е1 а1., 2009], ингибировать сигнальные пути активации транскрипционного фактора №-кВ [Ое1тап А.С. е1 а1., 2004], а также регулируемую через Т1Л4 продукцию 1Ь-12(р40)2, необходимого для реагирования дендритных клеток на индуцированные чумным микробом хемокины, их последующей миграции и имеющего важное

значение в инициации формирования антибактериального адаптивного иммунитета [Cooper A.M., Khader S., 2007; Robinson R.T. et al., 2008].

і 2 З M M і 2 3

До вакцинации Послевакцішащпі

М - Маркер молекулярных масс по 100 п.и.; 1 - TLR2; 2 - TLR4; 3 - GAPDH. Рисунок 3 - Экспрессия То11-подобпых рецепторов и GAPDH гранулоцитами крови у волонтера до и спустя 3 мес после сочетаиной вакцинации ЖЧВ и ЖТВ

ЛПС туляремийного микроба в основном так же имеет тетра-ацилированную структуру, обладает очень слабой стимулирующей активностью и не взаимодействует с TLR4 [Gunn J.S., Emst R.K., 2007]. В то же время, синтезируемый F. tularensis белок теплового шока DnaK способен активно связываться с TLR4 и инициировать высокий уровень продукции цитокинов дендритными клетками [Ashtekar A.R. et al., 2008], что, по-видимому, и обуславливает зарегистрированную выраженную экспрессию иРНК TLR4 в мопоиуклеарных клетках у всех обследованных как после вакцинации живой туляремийной вакциной, так и после сочетаиной вакцинации против чумы и туляремии.

Выявленные различия в экспрессии TLR4 мононуклеарными клетками крови вакцинированных против чумы и туляремии могут быть одной из причин формирования различного по продолжительности поствакцинального иммунитета при чуме и туляремии.

Следующим этапом наших исследований было проведение сравнительной оценки спонтанной, митоген- и антигениндуцированной продукции IFN-y, IL-4, в культуре клеток крови людей, вакцинированных живой чумной вакциной, живой туляремийной вакциной и возможности использования данного показателя для оценки функциональной активности Till и Th2 клеток в зависимости от напряженности противочумного и противотуляремийпого иммунитета. В качестве неспецифического индуктора использовали стандартный коммерческий Т-клеточный митоген конканавалин

А, являющийся лигандом TLR2 [Sodhi A. et al., 2007]. В качестве специфических индукторов применяли убитые нагреванием клетки вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV НИИЭГ и коммерческий препарат «Тулярин», представляющий собой взвесь убитых нагреванием клеток вакцинного штамма F. lularensis 15 НИИЭГ.

Известно, что у привитых против чумы лиц напряженный иммунитет наиболее выражен в первые месяцы после введения живой чумной вакцины [Самойлова Л.В. и др., 1973]. Установлено, что в этот период митоген-индуцировапная продукция IFN-y в группе вакцинированных в 5 раз превышала уровень спонтанной продукции данного цитокипа, что свидетельствует о высокой функциональной активности Т-хелперов 1 тина. По истечению года после вакцинации интенсивность синтеза IFN-y в культуре клеток крови под действием митогена значительно снижалась.

При культивировании клеток крови вакцинированных против чумы людей с Т-клеточным митогепом Con А отмечалось статистически достоверное повышение продукции IL-4 через 3 месяца после прививки, которое уже не определялось через год с момента вакцинации. Полученные данные свидетельствуют о повышении функциональной активности также и Т-хелперов 2 типа и участии ТИ2-клеток в формировании противочумного иммунитета у людей при вакцинации живой чумной вакциной, что согласуется с результатами экспериментальных исследований S.J. Elvin и E.D. Williamson [2004] в условиях аэрозольного заражения Y. pestis мышей Stat4"/', Stat6v" и заключением авторов о возможном смешанном типе Т-клеточного иммунного ответа при чуме со значительным превалированием Thl-зависимого ответа.

Для подтверждения связи выявленных изменений цитокинового профиля у лиц, вакцинированных против чумы, с повышением функциональной активности цитокинсекретирующих мопопуклеарных клеток в ответ на введение живой чумной вакцины через 3 месяца после вакцинации был проведен сравнительный анализ уровня митоген- и антигениндуцированной продукции IFN-y, IL-4 в смешанной популяции лимфоцитов крови, выделенных в градиенте плотности, при культивировании со специфическим (убитые клетки Y. pestis EV НИИЭГ) и неспецифическим (Con А) индукторами (таблица 3).

В отличие от не привитых допоров, у вакцинированных живой чумной вакциной лиц зарегистрировано достоверное повышение функциональной активности цитокинсекретирующих клеток, в первую очередь Thl-клеток. Сравнительный анализ продукции IFN-y (маркера Thl-клеток) в ответ на митогениую и антигенную стимуляцию выявил однотипность как по вектору, так и по амплитуде в реализации цитокинсекретирующей функции Т-хелперами 1-го типа. Статистически достоверное повышение продукции 1L-4 (маркера

Т112-клеток) в смешанной популяции лимфоцитов отмечалось только при активации клеток Т-клеточиым митогеном Соп А. При антигенной стимуляции также наблюдалась тенденция к повышению продукции 11,-4, однако значения не были статистически достоверными.

Таблица 3 - Митоген- и аптигспиндуцированпая продукция ШЫ-у, 1Ь-4 мононуклеарными клетками крови людей, через 3 месяца после вакцинации коммерческой живой чумной вакциной

Показатель Время инкуба -ции лимфоцитов без / с индукторами Не вакцинированные (группа сравнения) Вакцинированные

Лимфоциты Лимфоциты

Без индуктора Соп А У. раНя ЕУ НИИЭГ Без индуктора Соп А У. рев! 15 ЕУ НИИЭГ

М ± т М ± 111 М± 111 М ± 1п М±т М±ш

ШЫ-у пг/мл 2 ч 13,3 ±0,9 15,6 ±0,4 22,9± 8,9 12,2 ± 1,7 16,9±3,7 35,7±4,7*

24 ч 11,5 ±0,4 17,6 ±3,4 15,3 ± 1,4 15,3 ± 1,4 22,9±2,2* 23,5±5,0

1Ь-4 пг/мл 2 ч 0,53 ± 0,3 0,6 ±0,5 0,63 ±0,4 0,3 ±0,1 0,83±0,15* 0,5 ±0,2

24 ч 0,26 ± 0,2 0,43 ± 0,3 0,55 ±0,3 0,11± 0,05 0,5 ±0,46 0,37±0,31

Примечания: п- везде 8; * - р < 0,05 при сравнении с уровнем спонтанной (без индуктора) продукции цитокипа

Таким образом, результаты исследования однозначно указывают на преимущественное развитие ТЫ-зависимого иммунного ответа организма людей на введение живой чумной вакцины, что подтверждается также отсутствием у обследованных лиц положительной сероконверсии (в соответствии с международными стандартами это 4-х кратное повышение титров антител) при определении в системе реакций РИГА и РТНГА антител к капсулыюму антигену Ф1 чумного микроба.

Полученные данные об однотипности митоген- и антигенинду-цировапной продукции 1РЫ-у как в смешанной популяции лимфоцитов, так и в культуре клеток крови у вакцинированных против чумы людей, дают основание считать возможным использование параметров митогеп-индуцированной продукции маркерного цитокипа 1Р1М-у в качестве критерия оценки уровня противочумного иммунитета у людей.

выводы

1. Установлено, что препараты капсульпого антигена, выделенного из рекомбинаитпого штамма У. pestis КМ 277, вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, протективного антигенного комплекса туляремийпого микроба различных подвидов защищают экспериментальных животных (аутбредных мышей) от гибели в условиях моделирования чумной и туляремийной инфекции, в дозе 100 мкг не оказывают токсического действия и не вызывают по данным проточно-цитофлуориметрического мониторинга повреждения иммунокомпетентных клеток по типу апоптоза. Капсул ьиый антиген, полученный из рекомбинаитпого штамма У. pestis КМ 277, по своей протективпой активности значительно эффективнее (в 3 раза) препаратов капсульпого антигена, выделенных из вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ.

2. Выявленные особенности экспрессии иРНК TLR2, TLR4 в клетках врожденного (перитоиеальпые макрофаги) и адаптивного (спленоциты) иммунитета биомоделей в ответ на введение штаммов У. pestis с различной генетической характеристикой, вакцинного штамма голарктического подвида F.tularensis 15 НИИЭГ, а также антигенов чумного и туляремийпого микробов (капсульный антиген из рекомбинаитпого штамма Y. pestis КМ 277, вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, протективный антигенный комплекс туляремийпого микроба различных подвидов), по уровню и кинетике зависят от вводимого антигена и вида возбудителя, из которого он был выделен.

3. Рекомбинаитный штамм У. pestis КМ 277, полученный из пего препарат капсульпого антигена Ф1, а также химическая чумная вакцина, в отличие от вакцинного штамма У. pestis EV НИИЭГ и выделенных из пего препаратов Ф1, индуцируют повышение экспрессии иРНК TLR2 и lFN-y уже в первые часы после введения в организм экспериментальных животных с последующим усилением пролиферативиой активности в центральном (тимусе) и периферическом (селезенке) органах иммунной системы и формированием напряженного протективного иммунитета.

4. В ответ на введение экспериментальным биомоделям препарата протективного антигенного комплекса (ПАК) из вакцинного штамма голарктического подвида F.tularensis 15 НИИЭГ, зарегистрировано повышение экспрессии сплепоцитами как TLR2, так и TLR4. Напротив, препараты протективиых антигенных комплексов, выделенные из вирулентного штамма голарктического (F.tularensis 503/840) и среднеазиатского (F. tularensis А179) подвидов, индуцировали усиление экспрессии только TLR2 в сочетании с IFN-у. Препарат протективного антигенного комплекса, полученный из штамма

F. tularensis A'Cole иеарктического подвида, не вызывал изменений экспрессии исследуемых типов То11-подобных рецепторов.

5. Выявлены отличия уровней экспрессии иРНК TLR2 и TLR4 лейкоцитами периферической крови у людей, вакцинированных живой чумной и живой туляремийной вакцинами. Если в гранулоцнтах через 3 месяца после вакцинации против чумы и туляремии транскрипционная активность генов TLR2 и TLR4 не была существенно изменена, то в мопопуклеарных клетках введение живой чумной вакцины в противоположность живой туляремийной вакцине приводило к исчезновению детектируемого уровня экспрессии иРНК TLR4, не влияя на уровень синтезируемой иРНК TLR2. Сочетанная вакцинация против чумы и туляремии индуцировала экспрессию иРНК TLR2 и TLR4 как граиулоцитами, так и моиоиуклеарными клетками вакцинированных доноров.

6. Результаты проведенной сравнительной оценки спонтанной, митоген- и антигеп-индуцированной продукции IFN-y и IL-4 в культуре клеток крови людей, вакцинированных живой чумной вакциной, живой туляремийной вакциной свидетельствуют о преимущественном развитии Thl-зависимого иммунного ответа организма людей. Выявленная однотипность митоген- и антигениндуцированной продукции IFN-y как в смешанной популяции лимфоцитов, так и в культуре клеток крови у вакцинированных против чумы людей дают основание считать возможным использование параметров индуцированной лигандом TLR2 Т-клеточным митогеном конканавалином Л продукции маркерного цитокина IFN-y в качестве критерия оценки уровня противочумного иммунитета у людей.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Щуковская Т.Н., Козлова Е.А.*, Саяпипа J1.B., Барулина И.С., Майоров Н.В., Степанов A.B., Осина H.A., Кугырев В.В. Экспрессия иРНК То11-подобных рецепторов-2,4 лейкоцитами крови людей вакцинированных против чумы и туляремии//Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств -участников СНГ: Матер. IX Межгосуд. пауч.-практ. копф. - Волгоград, 2008. -С. 156- 157.

2. Щуковская Т.Н., Козлова Е.А.*, Саяпина JI.B.. Осина H.A., Попова П.Ю., Кутырев В.В. Оптимизация экстренной и специфической профилактики особо опасных инфекций: новые перспективы// Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней: Тезисы Всеросс. науч.-практ. копф. - Москва, 2008. - С. 129.

3. Саяпина Л.В., Барулина И.С., Щуковская Т.Н., Кравцов А.Л., Козлова Е.А.*, Бессонова O.J1. Цитофлуориметрический мониторинг реактивности лейкоцитов крови людей вакцинированных туляремийной вакциной, индуцированных тулярином и Кои А. //Вакцинология 2008.

Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней: Тезисы Всеросс. науч.-практ. конф. - Москва,2008.-С. 109.

4. Щуковская Т.Н., Смольковя Е.А., Шмелькова Т.П., Клюева С.Н. Митоген-индуцированная продукция II*N7 и IL-4 в культуре цельной крови людей в различные сроки после вакцинации живой чумной вакциной//Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями: Матер, междунар. конф./ Под ред. А.Б. Жебруна. - СПб.: ФГУН НИИЭМ имени Пастера Роспотребнадзора, 2010. - С. 42.

5. Смолысова Е.А., Щуковская Т.Н., Кравцов А.Л., Кузнецова Е.М., Волох O.A., Никифоров А.К. Апоптоз и пролиферативная активность иммунокомпстептпых клеток биомоделей при иммунизации С-комплексом туляремийиого микроба различных подвидов// Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения стран-участников СНГ: Матер. X Межгосуд. науч.-практ. конфер. государств-участников СНГ. -Ставрополь, 2010. - С. 269-270.

6. Смолысова Е,А., Щуковская Т.Н., Кравцов А.Л., Кузнецова Е.М., Волох O.A., Никифоров А.К. ДНК-цитометрия иммуиокомпетентных клеток биомоделей в условиях иммунизации препаратами «С»-комплекса туляремийпого микроба различных подвидов// Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. - Вып. 1 (107). - С. 74-76.

7. Кузнецова Е.М., Волох O.A., Смолысова Е.А., Щуковская Т.Н., Шепелев И.А., Авдеева 11.Г., Кравцов А.Л., Никифоров А.К. Иммунобиологические свойства антигенных комплексов туляремийиого микроба// Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. - Вып. 3 (109). - С. 46-49.

8. Кравцов АЛ., Шмелькова Т.П., Клюева С.Н., Смолысова Е.А. Применение проточной цитометрин при разработке вакцин против особо опасных инфекций: современные достижения и

перспективы//Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2011. - Вып. 4 (59).-С. 53-60.

9. Щуковская Т.Н., Смолысова Е.А., Шмелькова Т.П., Клюева С.Н., Бугоркова С.А. Индуцированная продукция IFN-y и IL-4 как показатель функциональной активности ТЫ- и Th2-ioieToic у вакцинированных против чумы людей// Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2011. - Вып. 6 (61). - С. 78 - 83.

*- фамилия автора Козлова Е.А. изменена на Смолысову Е.А.

Подписано к печати 17.02.2012 Формат 60x84 1/16 Печать лазерная Бумага офисная Объем 1,0 усл. п. л. Тираж 100 экз. Отпечатано на полиграфическом оборудовании ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» 410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46