Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональные исследования пептидомиметика N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутамина, поиск молекулярных мишеней

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные исследования пептидомиметика N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутамина, поиск молекулярных мишеней"

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОИ ХИМИИ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.Л. Овчинникова Российской академии наук

(ИБХ РАН)

На нравах рукописи

005537648

Савинов Георгий Владимирович

Структурно-функциональные исследования пептидомиметика К-ацетш1глюкозамннил-^ацетилмурамнл-Ь-аланил-В-изоглутамина, поиск молекулярных мишеней

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 4 НОЯ 2013

Москва - 2013

005537648

Работа выполнена в группе иммунохимии филиала Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Научный руководитель:

кандидат химических наук Ламан Александр Георгиевич, филиал Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, старший научный сотрудник группы иммунохимии

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Шахларонов Михаил Иванович, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, руководитель группы мембранных биоэнергетических систем

кандидат биологических наук Грановский Игорь Эдуардович, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук, заведующий лабораторией энзимологии генетических процессов

Велущая организация:

Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии

Защита состоится «11» декабря 2013г. в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.019.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук по адресу: ГСП-7,117997, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждении науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Автореферат разослан «» 2013 г.

Ученый секретарь />—у-—-- —~~

диссертационного совета, ____________- • ''*-''

доктор физ.-мат. наук ...................... .............Олейников В.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Поиск новых регуляторов иммунной системы (активаторов) и особенно с адъювантной активностью является предметом исследования как представителей фундаментальной науки, чьи интересы лежат в области изучения процессов, связанных с развитием иммунных реакций, в том числе механизмов дифференцировки клеток иммунной системы, так и практических специалистов по вакцинам и аутоиммунным нарушениям. Это направление стало особенно актуальным в связи с созданием нового поколения вакцин, в которых используются не инактивированные бактериальные клетки или вирусные частицы, а полученные методами химического синтеза или молекулярной биотехнологии фрагменты антигенов, узнавание которых иммунной системой хозяина позволяет защитить организм от инфекции и при этом имеет минимальные побочные реакции. Как правило, такие вакцины слабо иммуногенны и требуются молекулы-помощники способные усилить и направить иммунный ответ. Это относится и к ДНК вакцинам.

Необходимо отметить, что в современном понимании адъюванты - это не только соединения, активирующие гуморальный - антительный иммунный ответ, но и вещества, регулирующие клеточный иммунитет, способствуя созданию и возможности реализации пролонгированного ответа на антиген. Такой ответ невозможен без участия Т- и В- клеток памяти [Audibert et al., 2003]. Существующие в настоящее время адъюванты имеют значительные ограничения и недостатки, делающие необходимым поиск новых препаратов направленного действия с минимумом побочных реакций. Такими адъювантами, на наш взгляд, могут быть природные соединения - активаторы дендритных клеток, либо их аналоги, получаемые не только методом перебора структур известных соединений, часто и успешно используемого ранее, но и современными методами включающими поиски миметиков с помощью комбинаторной химии. Во многих лабораториях мира в качестве активаторов неспецифического иммунитета, иммунокорректоров и адъювантных препаратов активно исследуются фрагменты пептидогликана клеточной стенки бактерий и синтетические аналоги этих фрагментов [Cipriano et al., 2003, Steiner, 2004]. В лаборатории иммунохимии ИБХ РАН были получены высокоспецифичные и высоко аффинные моноклональные антитела к ГМДП. Было показано, что один из типов рецепторов ГМДП имеет внутриклеточную локализацию [Golovina et al., 1999]. Используя моноклональные антитела против ГМДП и технику

з <

пептидного фагового дисплея, в нашей лаборатории был найден 15-мерный пептид миметик-ГМДП [Ламан и др., 2007]. Пентадекапептид ЯУРРЯУНАККРМУК (ЯК-пептид) взаимодействует с моноклональными антителами Е6/1.2 против ГМДП и обладает адъювантной, но не пирогенной активностью, в отличие от ГМДП. Он также увеличивает экспрессию антигенов гистосовместимости II класса на поверхности макрофагов. Весьма часто миметики соединений оказываются более узко специфичными и более активными, чем исходное соединение [Мопгау^КагЬавЫ й а1., 2002].

Цели и задачи исследования. Целью диссертационной работы являлся поиск молекулярной мишени ГМДП с использованием его пептидного миметика 1Ш-пептида. Для того чтобы достичь поставленной цели, необходимо было решить следующие задачи:

1. Проанализировать функционально важные аминокислотные остатки пептидного миметика ГМДП (ЯК-пептида).

2. Провести анализ адъювантной активности ЯК-пептида.

3. Исследовать спектр лимфокинов, индуцируемых ЯК-пептидом по сравнению с ГМДП.

4. Клонировать белок, взаимодействующий с ЯК-пептидом.

5. Получить антитела против белка, взаимодействующего с ЯК-пептидом для характеристики связывания.

6. Определить Кс1 комплекса ЯК-пептида с данным белком и провести конкурентный анализ с целью исследовать взаимодействие ЯК-пептида и ГМДП с одним и тем же белком и одним и тем же участком белка.

Научная новизна работы. Впервые были проанализированы функционально важные аминокислотные остатки пептидного миметика ГМДП (ЯК-пептида). Впервые было показано, что спектр лимфокинов, индуцируемых ЯК-пептидом и ГМДП в целом совпадает, но несколько отличается, как отличаются их адъювантные и пирогенные свойства. Впервые был клонирован белок, взаимодействующий с ЯК-пептидом. В результате анализа первичной структуры клонированного белка была показана его идентичность белку УВ-1 позвоночных. Было также показано, что ГМДП и ЯК-пептид конкурируют за связывание с одним и тем же участком белка УВ-1. Впервые к белку УВ-1 получены рекомбинантные антитела с использованием библиотеки всБу человека и мышиные моноклональные антитела. Впервые была показана колокализация ГМДП, N002 и УВ-1 в одном компартменте клетки, что

4

позволяет сделать вывод о том, что белок YB-1 является молекулярной мишенью ГМДП и его пептидного миметика RN-пептида.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях: Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва, 2009); VI Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Уфа, 2013 г).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых научных журналах и 2 в сборниках тезисов научных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 110 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, основных выводов и списка литературы. Диссертация содержит 25 рисунков и 3 таблицы

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

RN-пептид представляет собой пентадекапептид: RVPPRYHAKISPMVN. Он не содержит кислых (Asp, Glu), но богат основными (Arg, Lys) аминокислотными остатками и остатками пролина. Особенно богата основными аминокислотными остатками и остатками пролина N-концевая часть пептида. С-концевая половина содержит гидрофобные и нейтральные аминокислоты.

1. Данные Ala- scan и проверка адъювантной активности

Для подробного выяснения роли отдельных аминокислотных остатков в проявлении адъювантного эффекта и связывания с антителами были синтезированы аналоги RN-пептида с заменами аминокислотных остатков на остаток аланина (Ala-scan) (Рис.1). Для измерения адъювантной активности аланиновых вариантов RN-пептида использовали мышей линии BALB/C. В качестве иммуногена использовался овальбумин. Индекс адъювантности определяли как отношение титра антител против овальбумина после иммунизации животных в присутствии адъюванта к титру антител после иммунизации белком без адъюванта.

Рис.1. Адъювантная активность аналогов RN-пептида, полученных в результате Ala-scan. За 1 принимали титр сыворотки против овальбумина после иммунизации без адьюванта.

Введение остатка Ala в положения 1, 3, 4, 5, 6, 9, 10 и 11 RN-пептида приводит к значительному снижению или потере адъювантной активности в диапазоне 1-10 мкг/животное. А5-модифицированый пептид проявляет адъювантную активность в дозе 100 мкг/животное. а Аб-производное 10 и 100 мкг/животное. При замене остатка гистидина (Н7) на аланин (А) адъювантная активность сохранялась в дозе 1 мкг/животное, но отсутствовала в больших дозах. Замена остатка валина на аланин (V2 —> А) приводила к сдвигу максимума адъювантности до 10 мкг/животное, aV14—» А и N15 —»А не влияли существенно на биологический эффект (рис. 1).

Белки и пептиды могут быть нестабильными в клетке ввиду быстрого гидролиза, карбоксипептидазами. Исходя из полученных данных, очевидно, что С-концевые аминокислотные остатки RN-пептида можно модифицировать во избежание гидролиза карбоксипептидазами. Когда большая ароматическая группа (FITC) присоединилась к карбоксильному концу RN-пептида через остаток лизина, образовалось высокоактивное соединение проявляющая адъювантный индекс равный 17.7 при дозе 10 mkg/животное. Адъювантной активностью обладает и амидированный по С-концу RN-пептид,

Гораздо более драматично влияние замены остатков аргинина па аланин (R1 —* А и R5 —* А). При замене R1 —* А наблюдалось ингибирование образование антител против овальбумина в диапазоне 1-100 mkg/животное. Это может свидетельствовать о том, что он взаимодействует с мишенью in vivo,

6

но каким-то образом передача сигнала блокируется. Подобный эффект наблюдается для пептидов А5 и А9. Таким образом, можно предположить, что для формирования функционально-активной формы RN-пептида важны взаимодействия Rl, R5 и К9 (положительно заряженные), а также ПО и М13. Таким образом, для проявления адъювантной активности RN-пептида необходимым является область RVPPRYH, а также К.9, НО, Sil и М13. 3. Анализ адъювантной активности RN-пептида

Мы проверили адъювантную активность пептида-миметика ГМДП в диапазоне концентраций от 1 нг до 100 мкг/животное. Полученные результаты продемонстрированы на рис. 2. Оказалось, что пептид обладает двумя пиками колоколообразной зависимости в дозах от 2 нг до 5 нг на животное (мышь весом 20 г) и в дозах от 100 нг до 100 мкг на животное. Наличие двух пиков адъювантной активности позволяет нам предположить, что RN-пептид в разных концентрациях связывается с разными типами рецепторов.

Доза RN-пептида на животное

Рис. 2. Адъювантная активность RN-пептида

4. Индукция секреции лимфокинов лимфоцитами периферической крови человека ГИЧ-пептидом и ГМДП в разных концентрациях

Были проведены эксперименты по стимуляции лимфоцитов периферической крови человека. В опыте использовали Я!\]-псптид в концентрациях 2 нг/мл, 10 мкг/'мл и ГМДП в концентрации 10 мкг/мл.

Выбранные концентрации соответствовали концентрациям анализируемых веществ, в которых они проявляют биологическую активность. Определяли изменение концентраций лимфокинов, принимающих активное участие в гуморальном и клеточном ответе: фактор некроза опухоли альфа (ЮТ-а), гамма-интерферон (у-ЮТ). интерлейкин-1 (1Ь-1), 1Ь-4 и 1Ь-10. Увеличение уровня секреции именно этих лимфокинов характерно для ГМДП. Результаты представлены в таблице 1.

ТКРа пг/мл Г1НР пг/ыя я.-« т/мл И.-Х пг/мя 11.-10 пг/мл Вреия.ч.

<50 <50 <50 <60 <50 0

ГМДП. 130 150 100 90 200 18

Юхшг/мп 120 130 140 90 250 24

120 100 100 120 200 48

<50 <50 <50 <60 <50 0

НЫ-пептид, (Окк/дш 400 400 150 250 160 150 160 180 <50 <50 18 24

120 200 100 130 <50 48

<50 <50 <50 <60 <50 0

2 нг/мл 90 70 150 200 120 120 130 130 <50 <50 18 24

50 100 100 180 <50 48

Табл.1. Уровень секреции лимфокинов лимфоцитами периферической крови человека при стимуляции Ш-пептидом и ГМДП в разных концентрациях.

После 18 часов стимуляции обнаруживалось значительное возрастание концентрации ЮТ-а в случае ГМДП и 1Ш-пептида при концентрации 10 мкг/мл и незначительная продукция в случае концентрации 1Ш-пептида 2 нг/мл. Через 24 часа продукция ЮТ-а увеличивалась при концентрации ГШ-пептида 10 мкг/мл, а при концентрации ЮЧ-пеитида 2 нг/мл уменьшалась до фонового уровня. Через 48 часов ТЫР-а детектировался лишь в случае пептида 10 мкг/мл. Аналогичная картина характерна и для у-ЮТ, за исключением того, что при дозе пептида 2 нг/мл через 24 часа концентрация у-ЮТ составляла 200пкг/мл. Наиболее выраженной оказалась стимуляция 1Ь-4. Через 18 часов его концентрация вырастала до 160 пкг/мл, а к 48 часу снижалась до 100 пкг/мл. В случае ГМДП максимальная концентрация 1Ь-4 составляла 140 пкг/мл. Для ШЯ-пептида, как и для ГМДП характерна стимуляция синтеза 1Ь-1, причем пептид и в дозе 10 мкг/мл и 2 нг/мл вызывает возрастание концентрации 1Ь-1 до 150 пкг/мл, как и ГМДП. Однако, в отличие от ГМДП, 1Ш-пептид и не стимулирует секрецию 1Ь-10.

Таким образом, спектр лимфокинов, индуцируемых ГШ-пептидом и ГМДП, в целом схож, но несколько отличается, как отличаются их адъювантныс и пирогенные свойства.

В настоящее время в литературе нет данных о пептидах, мимикрирующих мурамилпептиды, однако молекулярные механизмы действия последних интенсивно изучаются. На клеточном уровне в ответ на обработку мурамилпептидами происходит стимуляция синтеза ЮТ-а и 1Ь-1 макрофагами и индукция синтеза у-ЮТ Т-клетками [Мопгау^КагЬаБз!, й а1., 2002]. Одновременно синтезируется также 1Ь-12. Далее продуцируется еще ряд лимфокинов, что, в частности, приводит к повышению экспрессии антигенов МНС-Н, созреванию В-клеток и продукции Вероятно, в механизм

адъювантного действия вовлечена активация N002 и №-кВ [МезЬсЬегуакоуа й а1., 2007]. При этом основными субклассами секретируемых ^ является ^01 и 1§С2Ь, как и в случае с 1Ш-пептидом. Под действием мурамилпептидов периферические лимфоциты крови секретируют ТОТ-а, 1Ь-1-(3,1Ь-10 [Веупоп й а1., 2008]. При действии мурамилпептидов на №С-клетки индуцируется синтез у-1Ж, являющегося индуктором синтеза ^02Ь [АЙнё-Мога1ез е1 а1., 2008]. Вообще для мурамилпептидов характерна активация N002 и индукция 1Ь-1-р и ТОТ-а. В случае ЯЫ-пептида по сравнению с ГМДП стимуляция 1Ь-1-Р более выражена, стимуляция у-ЮТ на таком же уровне, а 1Ь-10 вовсе не индуцируется. Видимо, в отличие от мурамилпептидов, в частности ГМДП, имеющего множество мишеней действия, ПЫ-пептид действует более избирательно и активирует не все пути клеточного ответа. Отсутствие пирогенного эффекта у ГШ-псптида в отличие от ГМДП может быть связано с пониженной активацией пирогенных лимфокинов, в частности ЮТ-а, в ответ на обработку клеток пептидом. В целом полученные нами результаты хорошо согласуются с данными мировой литературы. Однако в настоящее время общепризнанным является лишь участие N002 в реализации воздействия мурамилпептидов на клетки. Предполагается, что в дальнейшем в процесс передачи сигнала вовлекается ОТ-кВ.

6. Поиск белка, взаимодействующего с ГМДП

В связи с тем, что биологические свойства ГМДП и 1Ш-пептида близки, мы предположили, что они взаимодействуют с одним и тем же рецептором, и тогда 1Ш-пептид можно использовать в качестве зонда для поиска рецептора ГМДП.

При анализе экспрессирующих библиотек необходимо большое количество рекомбинантных клонов.

Поэтому мы решили сначала обогатить препарат РНК целевыми последовательностями мРНК. Для этого мРНК выделяли из фракции РНП, обогащенной полисомами, синтезирующими предполагаемый рецепторный белок.

Выделение фракции полирибосом из макрофагальной мышиной линии \VEHI 3

Связывание полирибосом с иммобилизованным ШЧ-нептидом

Разрушение комплекса нолирибосом с КМ-пентидом с помощью гуанидинтиоцианата

Рис.3 Схема выделения полисом с использованием аффинной хроматографии

Полисомы выделяли с помощью аффинной хроматографии на сорбенте с иммобилизованным КЫ-пептидом (рис. 3). На рисунке представлена принципиальная схема выделения полисом с использованием аффинной хромато графии.

В основе применения аффинной хроматографии для выделения полисом, синтезирующих рецепторный белок, лежит предположение о том, что белок становится доступным для взаимодействия с КМ-пептидом еще до того, как синтез белковой молекулы на рибосоме будет завершен. Поэтому дополнительным фактором, обеспечивающим успех экспериментов по использованию полисом, было естественное котрансляционное приобретение белком свойственной ему конформации. Данные о том, что модификация С-конца существенно не влияет на биологическую активность пептида, а М-концевая последовательность важна для функционирования, позволило нам

1

Синтез кДНК

проводить аффинную хромотографию полирибосом, выделенных из макрофагальной мышиной линии WEHI3, непосредственно на пептиде, который был синтезирован с использованием гидрофильного носителя TENTA-GEL сразу после снятия защитных групп с боковых остатков аминокислот пептида.

Образовавшиеся комплексы RN-пептида с целевыми последовательностями разрушали с помощью гуанидинтиоцианата.

После аффинной хроматографии мы применили стратегию синтеза кДНК, схематически представленную на рисунке 4.

Эта схема позволяет максимально использовать копированные и полиаденилированные мРНК для поиска лиганда RN-пепгида.

В основе этого подхода лежит удаление кэп-структуры с помощью пирофосфатазы, присоединение «якоря» на место удаленной кэп-структуры и далее синтез кДНК с последующей ее ПЦР-амплификацией.

»i*VAV\A.'VVWVVWVVVVWVVVV^'A^

pSA/W*WWWWWWWVV\Ar

I Уд»«аиа к JH-Cîpyïrïypbï при помотан

X кясяой вдрофосф&гаш КЗ )збпкп

p5V>A/VVWVWWVVWMAAW.!»« р5ЧЛЛЛЛЛЛЛЛЛЛЛЛЛЛЛЛЛЛЛАЛЛЭ'

PF\AAA/VVWWWWVVVWW\A/M*

I при гнэдоши Т4 РИК-лдаа-Чь. р5--VWWWVWVWVWWVVWvVJ'AW

р®-vvwvw\л^^лллл'vvwvvv^з'

J Сактта кДНК с исштзошмшем ojrnro{dT3!

! ПЦГ с

I ояи!чшухлоощза ■■■ еакорв*

ря-W^ЛЛ^ЛЛ/VV^Л^ЛAЛAAЛAЛAЛЛ■3'Л'"

з-vv^vvwvwwvwvvwvvvvs пт

Фрагменты ДНК, кодирующие белок, взаимодействующий с RN-пептидом, были лигированы с вектором pHEN-1 (Pharmacia Biotech) по сайтам рестрикции Sfil и Notl. Условия лигирования подбирались таким образом, чтобы ее эффективность составляла не менее 90% по данным

Рис. 4: Выделение и амплификация кДНК на основе полноразмерных мРНК.

1 - полноразмерная матрица;

2 - матрица у которой отсутствует полиаденилированнный участок;

3 - матрица у которой отсутствует кэп-структура;

4 - матрица у которой отсутствует и полиаденилированнный участок, и кэп-структура.

электрофоретического анализа продуктов. Для клонирования был использован штамм E.coli TGI с эффективностью трансформации не менее 109 к.о.е. на 1 мкг pHEN-1.

Была получена библиотека представленностью 105 клонов. Библиотека была рассеяна на чашки Петри с плотностью 200 колоний на чашку диаметром 9 см.

Был проведен скрининг библиотеки на среде 2xYT, содержащей 1мМ IPTG. После лизиса колоний в парах хлороформа детекцию проводили с использованием биотинилированного по С-концу RN-пептида. Всего было проанализировано 20000 независимых клонов. Клоны, давшие наиболее яркий сигнал, использовались для дальнейшего анализа. Типичная картина скрининга приведена на рисунке 5.

/

f'. ''

\ -■. %

Ч

Рис.5 Иитроцеллюлозный фильтр -реплика, проявленная с помощью биотинилированного RN-nenmuda.

Па рисунке 5 стрелками указаны колонии, давшие наиболее яркий сигнал, которые были отобраны для дальнейшего анализа.

7. Данные анализа первичной структуры.

Были отобраны клоны, дававшие наиболее выраженный сигнал, а также «подозрительные» клоны. По данным секвенирования ДНК оказалось, что около 20% отобранных клонов составляют белки «домашнего хозяйства» и при повторном скрининге не давали положительного сигнала. Оставшиеся клоны кодировали высоко гомологичные или идентичные белковые последовательности.

Исходя из данных структурного анализа кДНК, было показано, что белок, взаимодействующий с RN-пептидом, идентичен Y-box-связывающему белку (YB-1) позвоночных. Один из 5 отобранных клонов кодировал полноразмерный белок YB-1, а остальные - различные укороченные варианты YB-1.

Представленность мРНК большинства белков, за исключением мРНК, кодирующих белки «домашнего хозяйства», составляет 0,1 - 0,01% от общего репертуара мРНК. В нашем случае предполагаемое обогащение было не менее 200х.

На рисунке 6 показана гомология белка, взаимодействующего с RN-пептидом, с мышиным Y-box-связывающим белком.

YB-1 принадлежат к доменному семейству белков холодового шока и участвуют в контроле транскрипции и трансляции.

1_322 аа

YB1 IwummIv.'CSD ' I CTD I

0.5 1.0 1.5 kb

си-[ . ?тгц$т аэ -(A)n

et 2 1 о 59/100 "- ~j-(A)n

CI3 | ,- ; да/юр |-(A)n

Cl 4 | 99/109» i-(A)„

CI5 | mm "^T!-(A)n

CSD - домен холодового шока в YB1; CTD - С-концевой домен

8. Определение Kd комплекса RN-пептида с белком YB-1 и проведение конкурентного анализа

При определении Kd желательно, чтобы взаимодействие белок-лиганд происходило в растворе. Поэтому для детекции образовавшегося комплекса необходимы антитела против YB-1. С этой целью были получены рекомбинантные scFv с использованием наивной библиотеки scFv человека с репертуаром 6х109 [Ulitin et al., 2005]. После проведения двух раундов аффинной селекции были отобраны положительные клоны, которые были охарактеризованы с помощью иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга (рис.7). Чувствительность полученных scFv в фаговом формате составляла 5 нг YB-1 в миллилитре. В непрямом иммуноферментном анализе чувствительность

13

Рис.6. Структура белка УВ-1 и кДНК, показывающие степень сродства отдельных клонов (С1) и гомологию их нуклеотидов (т) и аминокислотных последовательностей (аа) с кодирующими последовательностями мышиного УВ-1.

А/Р-домен -аланин/пролин-богатый домен;

5 нг/мл является высокой. Работа по получению антител проводилась совместно с группой регуляции биосинтеза белка (Институт белка РАН, г.Пущино).

45 кДа

30 «Да

Рис. 7. Иммуноблоттинг рекомбинантного YB-1

с использованием

20 КДа

При определении константы диссоциации этого белка использовался метод непрямого иммуноферментного анализа ELISA (рис. 8).

YB-1

Комплекс YB-1 - bio RN

bio RN

Рис. 8.

Схема иммуноферментного анализа для определения Kd

Нами было показано, что модификация С-концевой аминокислоты ЯК-пептида не влияет на его биологическую активность. Напротив, модификация Ы-концевой части пептида приводит к потере биологической активности. Поэтому для определения константы аффинности мы использовали биотинилированный по С-концу ЯК-пептид.

Взаимодействие пептида с УВ-1 происходило в растворе, что обеспечивало корректность определения Кё. Далее образовавшийся комплекс взаимодействовал с сорбированным на иммунопланшет стрептавидином. Детекцию комплекса УВ-1-ЯК-пептид осуществляли с использованием моноклональных фаговых бсРу и конъюгата пероксидазы хрена с антителами против фага М13. В качестве хромогена использовался ортофенилендиамин.

После окраски с помощью хромогена интенсивность окраски измеряли при длине волны \=492 нм. Константа диссоциации комплекса оказалась равной 4x10"9 (рис. 9)

А492

Рис. 9: Определение константы связывания Ш-пептида с УВ-1. Концентрация УВ-1 - 150нг/мл Раститровка КЫ-пептида от 50 нг/мл Величина КЫ составила 4x10"9

При проведении исследования конкуренции ГМДП и ЯЫ-пептида за связывание с клонированным белком были получены данные, что при концентрации 2х10"8М ГМДП вытесняет ЯЫ-пептид из комплекса с антителами на 50% при концентрации ЯЫ-пептида 1,6х10"9М (рис. 10). Таким образом ЯЫ-

пептид и ГМДП конкурируют за связывание с белком УВ-1 в молярное соотношении 1:12. Это говорит о том. что ЯМ-пептид и ГМДП конкурируют за связывание с одним и тем же участком белка УВ-1. Такой характер конкуренции дает основания предполагать, что данный белок участвует в реализации биологической активности как ГМДП, так и КЫ-пептида.

А, 92

-lg [ГМДП]

сщт 1

СУ2[ГМДП] ~ 12

Рис. 10. Конкурентный анализ RN-nenmuda и ГМДП. Концентрация пептида - 6 нг/мл Раститровка ГМДП от 150 нг/мл Концентрация YB-1 - 1 мкг/мл

Белок YB-1 участвует в целом ряде клеточных процессов, включая пролиферацию, дифференцировку и ответ на стрессовые воздействия. Нокаут гена YB-1 у мышей приводит к серьезным нарушениям эмбрионального развития и к ранней (пренатальной) гибели животных. YB-1 выполняет свои функции как в цитоплазме, так и в клеточном ядре.

YB-1 - это ДНК- и РНК-связывающий белок, который проявляет свойства шаперона нуклеиновых кислот, а также взаимодействует с большим количеством других белков. Связываясь с нуклеиновыми кислотами, YB-1 принимает участие практически во всех ДНК- и мРНК-зависимых процессах, включая репликацию и репарацию ДНК, транскрипцию, сплайсинг и

трансляцию мРНК. Он упаковывает и стабилизирует мРНК, а также осуществляет глобальную и специфическую регуляцию экспрессии генов на разных уровнях [Eliseeva et al, 2011].

Поскольку содержание YB-1 сильно возрастает в раковых клетках, этот белок рассматривается в качестве одного из наиболее ярких маркеров злокачественных опухолей. Переходя из цитоплазмы в клеточное ядро, YB-1 активирует транскрипцию генов ряда защитных белков, в том числе и белков, обеспечивающих множественную лекарственную устойчивость клеток. Вовлекаясь в процесс репарации ДНК в ядре, YB-1 также повышает устойчивость клеток к ксенобиотикам и ионизирующей радиации. Поэтому ядерная локализация YB-1 является одним из ранних маркеров множественной лекарственной устойчивости раковых клеток.

Повышение концентрации YB-1 в цитоплазме препятствует онкогенной трансформации клеток по PDK/Akt-киназному сигнальному пути, и вместе с тем, оно может способствовать превращению дифференцированных эпителиальных клеток в мезенхямальные, обладающие повышенной миграционной активностью. Это благоприятствует распространению клеток по организму и метастазированию опухолей. Таким образом, YB-1 может служить в качестве маркера метаетазирования раковых опухолей в отдаленные органы.

YB-1 участвует в иммунных процессах. Он способен секретироваться наружу клетки [Frye et at., 2009].

Семейство белков NF-kB (ядерный фактор-каппа В) включает в себя набор факторов транскрипции, являющихся главными регуляторами иммунных и воспалительных процессов в ответ на травмы и инфекции. В латентном состоянии, белки NF-kB находятся в цитозоле в неактивной форме. После стимуляции рецепторов, ответственных за протекание иммунных реакций, таких как То11-подобных рецепторов или NLR-белков (например, NOD2), происходит ряд событий, приводящих высвобождению белков NF-kB для ядерной транслокации и активации транскрипции генов, ответственных за активацию иммунитета [Ghosh et al., 1990].

Исходя из данных о том, что YB-1 способен секретироваться наружу клетки, а в ответ на стимуляцию Nod2 происходит индукция ядерного фактора NF-kB, индукция которого и запускает иммунные реакции [Ghosh et al., 2002], мы решили проанализировать изменение уровня экспрессии белков NF-kB 1, NF-kB2 и самого Nod2 в ответ на добавление RN-пептида, ГМДП и YB-1 в культуральную среду.

9. Изменение уровня экспрессии белка NF-kB2 в ответ на добавление RN-пептида, ГМДГ1 и YB-1 в культуральную среду.

Рекомбинантный YB-1 инкубировали с клетками моноцитарно-макрофагальной мышиной линии WEHI3 в присутствии или в отсутствие ГМДП или RN-пептида. ГМДП использовали в концентрации 10 мкг/мл. Концентрации RN-пептида соответствовали пикам адъювантиой активности миметика - 3 иг/мл и 1 мкг/мл. YB-1 добавляли в концентрации 1 мкг/мл. Для определения уровня транскриптов был использован метод ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR).

Оказалось, что ГМДП и RN-пептид не активируют экспрессию мРНК NOD2 и NF-kBl(pl05), но увеличивают уровень экспрессии белка NF-kB2. Необходимо отметить, что активация NF-kB-опосредованного пути довольно быстро приводит к изменению локализации комплексов NF-kB. Но это не всегда связано с синтезом соответствующих мРНК. Кроме того, известно, что реализация альтернативного пути активации клеток иммунного ответа занимает более продолжительное время, нежели реализация классического пути иммунного ответа [Ghosh et al., 2002].

Необработанные клетки слабо экспрессируют мРНК NF-kB2 (рис.11, линии 4 и 5), в то время как и RN-пептид (в обеих концентрациях), и GMDP активируют индукцию синтеза мРНК NF-kB2 (рис. И, линии 2, 6 и 7). Добавление же только YB- 1 не приводило к усилению индукции синтеза мРНК NF-kB2 (рис. 11, линия 3). Важно отметить, что совместное добавление GMDP и YB-1, а также RN-пептида (в концентрации 3 нг/мл) и YB-1 в культуральную среду приводит к заметному увеличению уровня индукции синтеза мРНК NF-кВ2 (рис.11, линия 1 и 8). В случае совместного добавления в культуральную среду RN-пептида (в концентрации 1 мкг/мл) происходит уменьшение уровня мРНК NF-kB2 (рис.11, линия 9).

Совместное действие ГМДП, RN-пептида и YB-1 позволяет утверждать, что образование комплекса между ГМДП и YB- 1, а также между RN-пептидом и YB-1, опосредует биологическую активность ГМДП и RN-пептида.

Рис. П. Индукция NF-kB2 с помощью ГМДП, RN-nenmuda и YB-I

1 - RN (3 нг/мл) + YB-1 (I мкг/мл); 2-RN(3 нг/мл); 3 - YB-1 (1 мкг/мл);

4,5 - контроль; 6 - ГМДП (10 мкг/мл); 7-RN (1 мкг/мл);

8 - ГМДП (10 мкг/мл) + YB-1 (¡мкг/мл);

9-RN (1 мкг/мл) + YB-1 (1 мкг/мл)

Белок NOD2 участвует в активации как врожденного, так и адаптивного иммунитета, а ГМДП и RN-пептид усиливают индукцию синтеза мРНК NF-kB2, отвечающего за активацию адаптивного иммунного ответа. Мы предположили, что ГМДП, RN-пептид и YB-1 могут быть локализованы в одном компартменте клетки. Для подтверждения этого предположения мы решили установить локализацию ГМДП, YB-1 и NOD2 с помощью конфокальной микроскопии.

10. Анализ внутриклеточной локализации ГМДП, YB-1 и NOD2.

Для анализа внутриклеточной локализации ГМДП, YB-1 и NOD2 были получены поликлональные антитела с использованием конъюгатов иммуногенных пептидов Nod2 с альбумином и овальбумином. Пептиды белка NOD2 были подобраны с помощью набора программ Sequilab (http://www.sequilab.org):

1. К15Е - KANGLAAFLLQHVRE

2. К1 ОТ - KAEPHNLQIT

В нашей лаборатории совместно с группой регуляции биосинтеза белка (Институт белка РАН, г. Пущино) были получены моноклональные антитела к белку YB-1. Данные антитела были охарактеризованы с помощью иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга (рис. 12).

Лмзаты М5'ж между собой не урззновеиекы

га —г—J m

az с; ce ь-oc ZL гл а; X m

Pwc. /2 Иммуиоблот-анализ моноклопальных антител против YB-1 RLL, HeLa, 3T3 - лизаты клеток соответствующих линий

Экспозиция пленки 2 мияуг«

3*СГ;ОЗИЦ,«Я плгнки 10 «инуг

Полученные моноклональные антитела и их комбинации обладали высокой специфичностью в иммуноблот-анализе, что позволяет использовать их в иммуноцитохимических исследованиях.

Для установления внутриклеточной локализации "NOD2, ГМДП и YB-1 использовались дендритные клетки, выделенные из костного мозга мыши линии AC57BL/6. Дендритные клетки являются антиген-представляющими клетками (АРС), которые играют важную роль в регуляции адаптивного иммунного ответа. Основной функцией дендритных клеток является презентация антигенов Т-к леткам. Они захватывают антигены, процессируют их и представляют на своей поверхности совместно с главными комплексами гистосовместимости первого и второго класса. Кроме того дендритные клетки контролируют дифференцировку Т-лимфоцитов и регулируют активацию и супрессию иммунного ответа.

С помощью конфокальной микроскопии были получены следующие результаты. С использованием флуоресцентно меченного ГМДП (ГМДП-Lys-F1TC) и поликлональных антител против N0D2 было установлено, что ГМДП и NOD2 находятся в одном и том же компартменте клетки (рис.13, панель А). С помощью флуоресцентно меченных антител против YB-1 и антител против белка NOD2 была показана совместная локализация YB-1 и "NOD2 (рис.13, панель В). Также была показана колокализация ГМДП и YB-1 внутри клетки с использованием флуоресцентно меченных моноклоначьных антител против YB-1 и ГМДП-Lys-FITC (рис.13, панель С). Таким образом, нами было показано, что NOD2, ГМДП и YB-1 локализованы в одном компартменте клетки (рис. 24).

Полученные нами результаты показывают, что УВ-1 является молекулярной мишенью ГМДП. Характер колокализации дает основания предположить, что белок УВ-1 является первичным рецептором ГМДП и передача сигнала сопровождается образованием тройного комплекса между УВ-1, ГМДП и ЖЮ2.

1 2

Ä •Jwr 3 ■ шшш тщ* * 4

5 6 -

%. ! "r 7 T s

9 10 Г

„ r 11 •Ñ-. r 12

Рис. 13. Внутриклеточная колокализация ГМДП, Nod2 и YB-1

(A) ГМДП и Nod2: 1 - Hoechst окраска ядер;

2 - ГМДП-Lys-FITC;

3 - AlexaFluor 555-anti-Nod2;

4 - наложение 1-3.

(B) YB-I и Nod2: 5 - Hoechst окраска ядер;

6 - FITC-anti- YB-1;

7 - AlexaFluor 555-anti-Nod2;

8 - наложения 5-7.

(C) ГМДП и YB-I: 9 - Hoechst окраска ядер; 10-ГМДП Lys-FITC;

11 -AlexaFluor 555-anti-YB-l;

12 - наложения 9-11

Наши результаты хорошо сочетаются с результатами, описанными в мировой литературе. В сентябре 2013 г. вышла статья, в которой YB-1 называется ранним и центральным медиатором бактериального и стерильного воспаления in vivo [Hanssen et al., 2013].

ВЫВОДЫ:

1. Проанализированы функционально важные аминокислотные остатки пептидного миметика ГМДП (RN-пептида). Для проявления адъювантной активности RN-пептида необходимыми компонентами являются область RVPPRYH, а также лизин (К-9), изолейцин (1-10), серин (S-11) и метионин (М-13). Модификация С-концевой аминокислоты не влияет на биологическую активность.

2. RN-пептид стимулирует синтез лимфокинов в культуре клеток периферической крови человека. Спектр лимфокинов, индуцируемых RN-пептидом и ГМДП, в целом совпадает, но несколько отличается, как отличаются их адъювантные и пирогенные свойства.

3. Был клонирован белок, взаимодействующий с RN-пептидом. В результате анализа первичной структуры клонированного белка была показана его идентичность белку YB-1 позвоночных.

4. К YB-1 получены рекомбинантные антитела с использованием библиотеки scFv человека и мышиные моноклональные антитела.

5. Определена Kd RN-пептида по отношению к YB-1, величина Kd составила 4x10"9. Показано, что ГМДП и RN-пептид конкурируют за связывание с одним и тем же участком белка. Была показана колокализация ГМДП, NOD2 и YB-1 внутри клетки.

6. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что белок YB-1 является молекулярной мишенью ГМДП и его пептидного миметика RN-пептида.

Публикации автора по теме диссертации

Статьи:

1. Ламан А.Г., Шепеляковская А.О., Бозиев Х.М., Савинов Г.В.. Бровко Ф.А.; Метод получения адъювантно активных пептидов-миметиков GMDP с использованием моноклональных антител и комбинаторных библиотек пептидов в формате фагового дисплея // БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2010, том 36, № 1, с. 141-148

2. Laman A.G., Shepelyakovskaya А.О., Boziev Kh.M., Savinov G.V., Baidakova L.K., Chulin A.N., Chulina LA., Korpela Т., Nesmeyanov V.A., Brovko F.A.; Structural modification effects on bioactivities of the novel 15-mer peptide adjuvant.//Vaccine. 2011 Oct 13;29(44):7779-84.

3. Shepelyakovskaya A.O., Laman A.G., Lomonosova A.V., Fursova K.K., Savinov G.V. Vertiev Y.V., Brovko F.A., Grishin E.V.; Effect of the format of antibodies on their specificity. // Mol Immunol. 2011 Dec;49(3):433-40

Тезисы конференций:

4. Ламан А.Г., Шепеляковская А.О., Бозиев Х.М., Савинов Г.В., Бровко Ф.А., Несмеянов В.А.; «Поиск пептидомиметиков с помощью комбинаторных пептидных библиотек в формате фагового дисплея» // Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва, 2009)

5. Ламан А.Г., Савинов Г.В.. Шепеляковская А.О., Бозиев Х.М., Бровко Ф.А., Родионов И.Л., Чулин А.Н., Елисеева И.А., Гурьянов С.Г., Овчинников Л.П., Лябин Д.Н., Свирщевская Е.В., Иванов В.Т. ; «Пептидный миметик ГМДП и его молекулярные мишени» // VI Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Уфа, 2013 г.)

Подписано в печать:

06.11.2013

Заказ № 8952 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Савинов, Георгий Владимирович, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН)

0420136529? На правах рукописи

Савинов Георгий Владимирович

Структурно-функциональные исследования пептидомиметика К-ацетилглюкозаминил-К-ацетилмурамил-Ь-аланил-О-изоглутамина,

поиск молекулярных мишеней

03.01.03 - молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: к.х.н. Ламан А.Г.

Москва-2013

Содержание

1. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..............................................................................4

2. ВВЕДЕНИЕ.......................................................................................................6

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ОСНОВНЫЕ СЕНСОРЫ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ РЕАКЦИЙ И РЕАКЦИЙ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА...........................8

3.1 TOLL-ПОДОБНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ..............................................................9

3.1.1 Структура.................................................................................................9

3.1.2 Лиганды TLR.........................................................................................10

3.1.3 Экспрессия TLR и чувствительность к стимуляции лигандами TLR различных субпопуляций мышиных В-клеток...........................................14

3.1.4 Клеточные мишени стимуляции TLR в человеческих В-клетках.... 16

3.1.5 TLR-индуцированная секреция цитокинов В-лимфоцитами...........16

3.1.5 Влияние на дифференцировку Т-клеток посредством TLR активации в антиген-презентирующих клетках (АРС)..............................17

3.1.6 Прямая активация TLR в CD4+ Т-эффекторных клетках индуцирует

констимуляцию...............................................................................................19

3.1.7Влияние направленной TLR-активации на регуляционные Т-клетки

(Treg)................................................................................................................21

3.1.8 Адъювантная активность......................................................................22

3.2 БЕЛКИ СЕМЕЙСТВА NLR........................................................................24

3.3 БЕЛОК YB-1.................................................................................................35

3.3.1 Структура белка YB-1...........................................................................35

3.3.2 Участие белка YB-1 в воспалительных заболеваниях......................37

3.3.3 Участие белка YB-1 в онкогенезе........................................................39

4. МЕТОДИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ...........................................................................41

4.1 Реактивы и реагенты................................................................................41

4.2 Среды и растворы.....................................................................................43

4.3 Структура праймеров...............................................................................43

4.4 Штаммы Е. coli и клеточные линии.......................................................44

4.5 Методика тестирования адъювантной активности RN-пептида.........44

4.6 Выделение мононуклеарных клеток......................................................45

4.7 Измерение продукции лимфокинов лимфоцитами периферической крови человека................................................................................................45

4.8 Выделение РНП........................................................................................46

4.9 Выделение полисом, синтезирующих белки с высоким сродством к RN-пептиду.....................................................................................................46

4.10 Синтез кДНК...........................................................................................47

4.11 Амплификация ДНК..............................................................................47

4.12 Рестрикция кДНК и лигирование с вектором.....................................48

4.13 Лигирование............................................................................................48

4.15 Получение электрокомпетентных клеток Е. coli................................48

4.16 Электропорация......................................................................................49

4.17 Первичный анализ библиотеки методом скрининга на чашках........49

4.18 Выделение плазмиды.............................................................................50

4.19 Рестрикция..............................................................................................51

4.20 Получение одноцепочечных Fv фрагментов антител (scFv) против YB-1.................................................................................................................51

4.21 Определение Kd......................................................................................52

4.22 Конкурентный анализ связывания RN-пептида и ГМДП с YB-1.....52

4.23 Western блот............................................................................................53

4.24 Выделение РНК с помощью Trizol.......................................................53

4.25 Измерение уровня экспрессии NF-KB2...............................................54

4.26 Получение поликлональных антител против NOD2..........................54

4.27 Получение мышиных моноклональных антител к белку YB-1........55

4.28 Подготовка дендритных клеток костного мозга.................................56

4.29 Определение внутриклеточной локализации YB-1 hNOD2.............56

5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ...............................................................58

5.1 Определение структур RN-пептида, необходимых для проявления биологической активности с помощью укороченных вариантов RN-пептида ..............................................................................................................................61

5.2 Данные Ala-scan и проверка адъювантной активности...........................62

5.3 Анализ адъювантной активности RN-пептида.........................................66

5.4 Индукция секреции лимфокинов лимфоцитами периферической крови человека RN-пептидом и ГМДП в разных концентрациях...........................67

5.5 Поиск белка, взаимодействующего с ГМДП............................................69

5.6 Данные анализа первичной структуры......................................................73

5.7 Определение Kd комплекса RN-пептида с белком YB-1 и проведение конкурентного анализа......................................................................................76

5.8 Изменение уровня экспрессии белков NFkBl, NFkB2 и NOD2 в ответ на добавление RN-пептида, ГМДП и YB-1 в культуральную среду.................82

5.9 Анализ внутриклеточной локализации ГМДП, YB-1 и NOD2...............84

6. ВЫВОДЫ:.......................................................................................................88

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................89

1. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

anti-PC - антифосфохолиновый

ASC - апоптоз-ассоциированный крапчато-подобный белок CpG - 2'-дезоксирибоцитидин-фосфат-гуанозин CpG-ODN - CpG-содержащие олигодезоксинуклеотиды С SR — переключение субкласса иммуноглобулинов dsRNA - двухцепочечные РНК

GPI-mucin — гликозилфосфатидилинозитол-связывающий муцин-подобный гликопротеин

HIV - вирус иммунодефицита человека (ВИЧ)

IgM - иммуноглобулин M

INF-y - интерферон-у

LBP - LPS-связывающий белок

LPS - липополисахариды

LRR - лейцин-богатые повторы

LTA — летальный токсин Bacillus anthracis

MD-2 - лимфоцитарный антиген 96

MDP - мурамилдипептид

meso-DАР - y-D-глутамил-мезо-диаминопимелиновая кислота

MyD88 - белок первичного ответа дифференцировки миелоидных клеток

MZ В-клетки - B-клетки краевой зоны селезенки

NBD - нуклеотид-связывающий домен

NK-клетки - натуральные киллеры

NLR - нуклеотид связывающие домены, содержащие лейцин-богатые повторы

NOD2 - нуклеотид-связывающий домен олигомеризации 2 PGN - пептидогликаны РКВ - протеин киназа В

PRR - образраспознающие рецепторы

PYD - пириновый домен

TIR - То11/интерлейкин-1 рецепторный домен

TLR - То11-подобные рецепторы

TNF - фактор некроза опухоли(ФНО)

VSV - вирус везикулярного стоматита

РАМР - патоген-ассоциированными молекулярными структурами CD 14 - гликозилфосфатидилинозитол-связывающий белок

2. ВВЕДЕНИЕ

Изучение явления молекулярной мимикрии весьма актуально в последние годы, поскольку помимо своей фундаментальной значимости открывает возможности для решения многих прикладных задач. Так, в частности, получение пептидных миметиков - аналогов важных (с точки зрения выработки протективного иммунного ответа) антигенов возбудителей инфекционных заболеваний, уже сейчас позволяет разрабатывать безопасные пептидные вакцины [1-6]. Вместе с этим актуальной является задача повышения эффективности вакцин нового поколения - генно-инженерных, пептидных. Одним из путей решения этой задачи является использование агентов, обладающих адъювантными свойствами. Уже более полувека для усиления иммунного ответа у лабораторных животных исследователи используют полный адъювант Фрейнда. Тем не менее, в медицинской практике из-за побочных эффектов, вызываемых введением полного адъюванта Фрейнда, для вакцинации людей в качестве адъюванта разрешено использовать лишь гидроокись алюминия. Ранее в лаборатории иммунохимии ИБХ РАН с использованием комбинаторных библиотек пентадекапептидов был обнаружен пептид, воспроизводящий адъювантные свойства природного лиганда (ГМДП), но не обладающий пирогенной активностью. Весьма актуальным представляется создание на его основе фармацевтического препарата. Необходимым этапом на этом пути является изучение и улучшение фармакокинетических характеристик. Для решения подобного рода задач в мировой практике применяются различные подходы. В частности было показано, что замена К- и С-концевых аминокислотных остатков на модифицированные аминокислоты может делать такие видоизмененные пептиды нечувствительными к действию экзопептидаз [7-9]. Существуют примеры, когда значительного увеличения стабильности пептида в кровотоке удавалось достичь благодаря введению в различные участки последовательности Э-аминокислот [10]. Практически полностью

неметаболизируемые варианты биологически активных пептидов удавалось получить путем синтеза энантио и ретроэнантио аналогов [11-13]. Помимо исследований, направленных на увеличение стабильности RN-пептида, нами запланирован поиск его внутриклеточных белковых мишеней. Поскольку RN-пептид является аналогом ГМДП, а тот в свою очередь миниамальным повторяющимся звеном пептидогликана клеточной стенки бактерий, с его помощью удобно осуществить поиск мишеней действия молекулярных структур (мурамоилпептидов), ассоциированных с клетками патогенных микроорганизмов, и индуцирующих возникновение первичной реакции макроорганизма в ответ на атаку патогена. К настоящему времени нет ясности с клеточными мишенями мурамоилдипептидов. Очевидно только, что имеется более одного типа рецепторных молекул и что они есть на клеточной поверхности и внутри клеток. Существует семейство мембраносвязанных рецепторов, названных Toll-like (TLR)[14], а также семейство внутриклеточных белков (Nod, Nalp, Ipaf, Naip, СИТА), распознающих структурные элементы клеточной стенки бактерий и ответственных за возникновение воспалительных реакций в ответ на проникновение патогена, однако только для NOD2 белка показана способность связывать МДП [15-17]. Получены данные о связывании ГМДП с гистонами HI [18]. Использование RN-пептида, который может быть легче модифицирован радиоактивной или флуоресцентной меткой, позволит получить ценные сведения о рецепторных белках мурамилпептидов.

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ОСНОВНЫЕ СЕНСОРЫ

ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ РЕАКЦИЙ И РЕАКЦИЙ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА

Основополагающими молекулярными компонентами врожденной

системы неспецифического иммунного ответа являются образ распознающие рецепторы (pattern recognition receptors - PRR). PRR узнают характерные только для микроорганизмов консервативные молекулярные структуры, которые были названы патоген-ассоциированными молекулярными структурами (pathogen-associated molecular patterns — PAMP).

Наиболее известными PAMP являются липополисахариды (LPS), представляющие собой структурные компоненты внешней мембраны грамотрицательных бактерий; тейхоевые и липотейхоевые кислоты, которые являются мембранными компонентами преимущественно

грамположительных бактерий; пептидогликаны (PGN) грамположительных и грамотрицательных бактерий; липоарабиноманноза микобактерий; зимозан грибов; двуспиральные вирусные РНК; бактериальные ДНК.

Каждая патоген-ассоциированная молекулярная структура является маркером достаточно больших групп микроорганизмов, поэтому процесс их распознавания PRR носит неспецифический характер.

По функции PRR можно разделить на две группы: эндоцитозные и сигнальные. Эндоцитозные PRR экспрессированы на поверхности антиген-представляющих клеток (фагоцитов). После распознавания соответствующего РАМР они опосредуют поглощение и доставку к лизосомам патогена, где впоследствии происходит его разрушение с образованием антигенных детерминант, которые в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости класса II представляются клеткам адаптивной иммунной системы и запускают адаптивный иммунный ответ. Очевидно, что именно через эндоцитозные PRR преимущественно реализуется ответ на антигены вакцин.

Среди сигнальных рецепторов центральное место занимают так называемые Toll-like (толл-подобные, TLR) и NOD рецепторы.

3.1 TOLL-ПОДОБНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ.

3.1.1 Структура

Семейство человеческих TLR включает в себя около 11 разных видов трансмембранных рецепторов. Все они состоят из трех общих структур [19] (рис.1):

1. дивергентного лиганд-связывающего внеклеточного домена, обладающего лейцин-богатыми повторами (LRR);

2. короткого трансмембранного участка;

3. высокогомологичного цитоплазматического То11/интерлейкин-1 рецепторного (TIR) домена, необходимого для инициации последующих сигнальных каскадов.

TLR4

Узнавание м— LRR

Ш.

Ilk:

D299G

T399I

дд

«Ь A4» » >. i

Активация «я— TIR

Рис. 1. Структура ТоП-подобныхрецепторов на примере TLR4

То11-подобные рецепторы (TLR) играют важную роль в инициации естественного иммунного ответа на действие патогенов. В процессе узнавания молекулярных мотивов, характерных для молекул

микроорганизмов, ТЪК является связующим звеном между секрецией цитокинов и повышением представленности антигена.

В В-клетках ТЪИ. способствуют стимуляции секреции иммуноглобулинов и рекомбинации, связанной с переключением класса. Так как лиганды ТЫ1 проявляют адъювантные свойства, они могут являться составными частями противомикробных вакцин, хотя на данный момент очень мало информации о прямых эффектах воздействия ТЬЯ на функции В-лимфоцитов.

Среди образ распознающих рецепторов Т1Л представляют собой важное семейство рецепторов, которые участвуют в узнавании молекулярных структур, специфичных для микробных патогенов [19-21].

Т1П могут быть разделены на две основные группы:

1) Рецепторы на поверхности клетки;

2) Рецепторы, расположенные внутри клетки.

Поверхностные ТЫ1 рецепторы связываются с такими молекулами, как бактериальные липопептиды (ТЫ12) или липополисахариды (Т1Л4), в то время как эндосомальные ТЬЯ активируются микробными нуклеиновыми кислотами и не так легко доступны. Такое разделение во внутриклеточной локализации приводит к разделению функций в процессе противомикробного иммунного ответа.

3.1.2 Лиганды ТЬИ

Как уже было сказано, разные РАМР избирательно активируют различные ТЬЯ (т.е. каждый ТЫ1 связывает специфичную «молекулярную структуру» различных классов микроорганизмов или индивидуальные структуры, характерные для различных комменсалов или патогенов) [19] (Табл.1).

PRR (структура) Адаптеры (структура) РАМР / Активаторы Виды

TLR TLR1-TLR2 (LRR—TIR) MyDSS (TIR-DD), TIRAP (TIR) Триациллипопетиды Бактерии

TLR2-TLR6 {LRR—TIR) MyDSS TIRAP Диа циллипопептиды Легальный токсин Bacillus anthracis Зимозан Микоплазма Бактерии Грибы

TLR2 (LRR—TIR) MyDSS TIRAP Пептидогликан Липоарабиноманнан Порины tßPI-муцин белок НА Бактерии Микобакгерии Бактерии (Neisseria) Паразиты (Tripanosoma) Вирусы (вирус кори)

TIR3 (LRR—TIR) TRIF (TIR) dsRNA Вирусы

TLR4 (LRR—TIR) MyDSS, TIRAP, TRIF, Липополисахариды Бактерии

TRAM (T!R) Белки оболочки Вирусы

TLR5 (LRR—TIR) MyDSS Флагеллин Бактерии

TLR7 (LRR—TIR) MyDS8 ssRNA РНК-вирусы

hTLRS (LRR—TIR) MyDSS ssRNA РНК-вирусы

TLR 9 (LRR-TIR) MyDS8 CpG DNA DNA малярийный гемозоин Бактерии ДНК-вирусы Паразиты

mTLRll (LRR-TIR) MyDSS неоп редел ены Профилин-подобные молекулы Бактерии (уропатогенныебактерии) Паразиты (Toxoplasma gondii)

Табл. 1 Лиганды TLR

TLR, расположенные на поверхности клеток.

TLR4 необходим для ответов на LPS, главных компонентов наружной мембраны грамотрицательных бактерий. LPS являются сильнодействующими иммуностимулирующими молекулами и вызывают септический шок. TLR4 прочно ассоциирован с MD-2 на поверхности клетки. Такой комплекс необходим для индукции секреции воспалительных цитокинов [22]. В ответ на LPS вовлечен также и LPS-связывающий белок (LBP) и CD 14. LBP представляет собой растворимый белок или белок плазмалеммы, связывающий LPS. CD14 - гликозилфосфатидилинозитол-связывающий белок, содержащий LRR и связывающийся с LBP. Он доставляет комплекс LPS-LBP к TLR4-MD-2 комплексу [22].

TLR2 узнает большое разнообразие РАМР, являющихся составными частями различных патогенов бактерий, грибов, простейших и вирусов [23]. Такими лигандами являются триациллипопептиды бактерий и микобактерий, диациллипопептиды микоплазм, пептидогликаны (PGN) и липотейховая кислота грамоположительных бактерий, порин из Nesseria, липоарабидоманнан микобактерий, зимозан (содержащий ß-глюкан, маннаны, хитин, жиры и белки) грибов, GPI-муцин Trypanosoma (tGPI-mucin) и гемаглютинин вируса кори. TLR2 обычно образует гетеродимер с TLR1, TLR6, либо не относящимися к TLR молекулами, такими как CD36, CD 14 и

дектин-1, для распознавания молекулярных структур лигандов. ТЬЮ-ТЬЯб распознает диацилированные липопептиды, ЬТА и зимозан. Комплекс ТЫ12-ТЬЫ1 узнает бактериальные триацилированные липопептиды.

ТЬЯ5 распознает флагеллин (составляющую часть бактериального жгутика) [24]. Т1Л15 узнает высоко консервативный центральный сайт флагеллина, который необходим для формирования протофиламентов и обеспечения бактериальной подвижности. Было показано, что ИЛ15 экспрессируется на поверхности кишечных эпителиальных клеток, а не на макрофагах и дендритных клетках селезенки. Это доказывает роль ТЫ15 в детекции инвазивных ж