Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика мурамилпептид-связывающих молекул на иммунокомпетентных клетках

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Характеристика мурамилпептид-связывающих молекул на иммунокомпетентных клетках"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА

ргб ОД

V и:.'» и

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

РОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПРОТИВОЧУИНЫК ИНСТИТУТ "МИКРОб"

На правах рукописи

СУМАРОКА МАРИНА ВАДИКОВНА

ХАРАКТЕРИСТИКА МУРАИИЛПЕПТИД-СВЯЗЫВАИЦИХ МОЛЕКУЛ НА ИММУНОКОМПЕТЕВТНЫХ КЛЕТКАХ

03.00.04 - БИОХИМИЯ

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИЙ НА СОИСКАНИЕ УЧЕЯОЯ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА НЕдаЦИЗСЯН:: ВАУК

САРАТОВ 1933

Работа выполнена в Институте Еиоорганической химии им. И М. Шемякина и ЬЛОвчинникова РАН

Научный руководитель:

кандидат химических наук В.-А. Н&смеяноЕ

ОфкцпатьЕыг оппоненты: доктор иэдацкнских наук,профессор Е. ККуляв доктор биологических наук А. А Щербаков

Ведущая организация : Институт иммунологии Минздрава России

Бацкта состоится 7 октября 1933 года в 13 часов на заседании специализированного совета 7. 074.32.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Российском научно-исследовательском противочумной институте "МИКРОБ" по адресу: 410071,г. Саратов, ул. Университетская, 45.

С диссертацией ьскно ознакомиться в библиотеке инсткту-танШкроб".

Ученый секретарь специализированного совета доктор м&дкцивеюи наук

Е. Л ДЕЗДШШШ

ОБЩАЯ XáPAЕЭТШШ РДЕОШ

Дятуалышста проблема

Мурамияпептиды (Ш)- структурные фрагменты пептидогликанз клеточной стенки бактерия иуреина- оказывают разнообразный эффекты на иммунную я нервную системы человека и животных. Способность этих соединений проявлять адионантную активность,повывать яесгкцкфическув резистентность организма к бактериальным, акрусным и паразитарным инфекциям , а также вызывать замедление роста и некроз некоторых опухолей свидетельствует о возможности использования их а качестве компонентов синтетических вакцин и лекарственных препаратов. В токе время мурамил-пептвды обладает рядом побочных эффектов,затрудняющих применение этих соединений а клинической практике.

Минимальной биологически активной структурой бактериального пептидогликана является мурамилдипептид (ЦДЛ) - N-ацетклмура-моил-аланил-О-изоглутаыин. На его основе в ряде лаборатория мира,в том числе и в России , осуществлен синтез многочисленных аналогов , проявляйся: ярко выраженную иммуномодулиругпую активность и не оказывающее побочного действия.

В Институте биоорганической химии им. М, Е Ufe мякина я П. А. Овчинникова подучена серия олигосахаридсодержащих гликопептидов, отличающихся от ЦДЛ обязательным присутствием в молекуле N-аиетилглшозаминильнога остатка,соединенного ^(1-4)-глиюоаид-иой связью с N-ацетилмурамовой кислотой,в проявляющих Солее высокие адъвваятные и противоопухолевые свойства К настоящему времени проведано структурно-функциональное исследование этих соединений,изучено влияние модификации отдельных частей молекулы на иммуномодулирукщиа свойства in vivo н in vitro, налажено в промьшвнном масатабе получение ближайкего в рассматриваемой серии веществ аналога ЬЩП - гдгаезаминидмураиилдипепти-даСГШ ).

Однако,для целенаправленного создания эффективных лекарственных препаратов на базе мурамилпептидов требуется знание механизма их действия,который несмотря на значительное количество исследований ,до настоящего времени остается невыясненным. Суадствупаи» в литератур-:» даннш весьма противоречивы.

Среди вое южных молекулярных механизмов биологической активности бактериальных гликопептидов наиболее вероятным является рецепторный. Доводам в его пользу южет служить стереоспецифич-ность действия ,а также насыщаемый характер зависимости доза-ответ для некоторых биологических аффектов. В то яе время для подтверждения этой модели требуются дополнительные экспериментальные данные, с чем и связана актуальность исследований, направленных на изучение и характеристику мурамилпепетад-связывающих молекул шцунокошетентных клеток.

Даль ш «задачи рз&гш.

Настоящая работа является составной частью проводимых в лаборатории иммунохимии Института биоорганической химии км. II М. Игмяккна и & А. Овчинникова РАН исследований молекулярных и клеточных механизмов биологического действия ыурамшшептидэв.

Цель работы - доказать существование специфических участков связыванияв МП у иммунокомпетенткых клеток, провести первичную биохимическую характеристику ЫЬсвязывавдих ыолекул, оценить влияние кураыилпептидов на процессы клеточой'активации.

Для достижения указанной цели предполагалась решить следузсг С518 задачи: -определить круг клеток-шшекей МП;

-охарактеризовать взаимодействие мурамгшгептидов с клеткаш-мкпенями;

-установить локализацию участков связывания Ш (на клеточной мембране или внутри клетки);

-с помощью фотоаффинного меченая охарактеризовать Ш-связы-вавдие молекулы;

- изучить влияние ГЩП на изменение концентрации внутриклеточного Са++ к величину рН.

Нгучкгз шгезш. Впервые с хюьпазю радиоактивно- и флуоресцентно-меченных прозводных ГЩШ обнаружены центры связывания мурашлпептидов внутр:: Т-клеток и макрофагов. Показана специфичность взаиюдей-ствиия мурамилпептидэв с клеткашз шэлоьзоноцитарного ряда,рассчитаны константа диссоциации Е число участков связывания. Определены молекулярные иассы некоторых ГЩШ-связывающее белков путей ковалентного печенка клеток радиоактивным фотоактивируе-

мым соединение« ГМЩ. Щ>и ксслэдозаязд механизма активации мзкрофагоз под действием ГШ зпервш обнаружено его вдияниэ на аелрошу спопгззматкческого pH.

Тесрвткчесиаа я практдаесяаз акач$г.«ста работ

Независимыми методами про демонстрировав Эсакмодзпстзж му-рашглтп-зптидса с цггтоядагыагтееси:;«: структурами клеток мизло-моноцнтзрнсго ряда,что дополняет супастаую'лиэ представления о механизме д^астаяя бактериальных гдкюпепткаов и сЗгясияе? нэ-гсоторьи биологически* эффекты !Л1, з частности, бальную активность липсссмалы-ьк дерм данных соединения.

Устансзлено а&яккв П® на авдтчкну знугрякавточного pH, что укгзызэ-п на акгкзаыио яезл» ¡строганного N¿+/ й+ обмена и мсяет быть связано с модуляцией активности Са++ - нвгазпсгельа пратеинкпнгз.

По материалам экспериментальных исследований .составлены «э-тодическке рексшядаадга "йзполгьгоЕанга метода фотозёфшпой -.э-дификапш белкоз я яэпткяоз ддя идентификация'и кзучвккя ре-цэпторсз антагеаоа нсзбудпт^лзй оссЗо опасных кн^зкшй" ,:íoto-piia ваш одобрены Ученкм созетом РКШШ "КофскУЧ протокол lî ? от 30 ига 1992 гола) утверждены директором ifecTitryra 20 íss-ня 1592 годэ . Даняиз ютод гезвогяет псслэдсзать за колеку-лярнсм урозно гагогзяэгячасяя-э п?хаякгка ззЗох^заяпЗ , зьдздэнных зсвбудит0ляш осссэ опасных иафэкей, Згагодаря всэизхксггз пдекти{ягсирсэзтз я изучать рошятсйа рзадзчккд бколггкадекл зжгхвкчх соядлшкка» з tow чпсд? :.нт:гэксз .татог-зин!/:-; ;та:ро-оргаиизмоз i 2 групп:.

Рээульгага двссертпоя ;агут Сыть кспздггсз^аы врк ::де.зз~ дсзчнли !.;олзкуллрны:: гзэхаюздш S-'-Лстг::.? ^«.^гсюзудятороз з КВХ кг, л. !£. ,'йгакинз. и a А. Озчшшккзза T.'Ci .Пнет,',туте зппде>й-ОДОГКИ ;í ИПКрСбКОДОПИ РАЬД , ОЯКгГОГ5П:ЗСКО!! Цзнтрс» PA'S я ¿группе организациях подобного профглт.

Лшрсйпгяи пайка ft к^йктагз^гг.

Ооноанш результаты яссартацконясй рзеоти были зрэястззлэ-аы и сбсулдэны : яз «адг/зарокаш скмпсентт«» 'Чйгзкудяркнз факторы ггыатопоээа я стнслэеой ¡счэт-сл'ЧНасгсзз, 1930; ; из li-ctî Лгэд<? SaponsScкой Оэдэ pata rit ^лугтдггг^г-с.с« СОгэега ( Sonco, ¿тоиялдга, 1391) ; sa аззчпыг с».гззрзх "i;-

«yitoХИМИЯ H3S (1503 г*, r,lS3i ¡\1SS2 Г

- 4 ~

По тема диссертации опубликовано 4 работы.

Сбвды работ

Диссертационная работа изложена на ^"страницах машинописного текста и состоит из введения,литературного обзора,экспериментальной части, результатов собственных исследований и их обсуждения,выводов и списка цитируемой литературы,состоядего иг 190 наименований. Работа содержит Щ рисунков к 1 таблицу.

Содврэаинэ работы.

Результаты исследований и ах обсуждение . %

Изучение связывания ГЩ1 и его производных с клетками различной этиологии.

К.началу данной работы имевшиеся в литературе сведения о Ш-связыващга молекулах у клеток-мишеней были достаточно противоречивы как в плане самого существования рецепторов Ш,так и относительно их локализации и числа. Поэтому на первом этапе исследований былз проверена способность клеток различной этиологии взаимодействовать с дисахаридсодержащими мурамилпептида-ми (ДЩ>- ГЩЩ и его аналогами, о далью определения типа клеток, несущих максимальное число ДШ-связыващих участков, и установления локализации последних С на клеточной мембране или внутри клетки).

Б работе был использован следующий набор Ш-содержащнх гли-юэпептвдов и их газмпскентов: К-ацетилмурамоил-аданил-1>изоглу-тамкн ( МДП>, N-ацетклг люксэаминил-( р 1-4)-Ь'-ацетилмурамоил-ала-нил-О-изоглутзмин (ГВДП), К-ацетидглюкозаминил-С j^l-4)- К-гцэ-тилыурамэЕая кислота ( GIcNAc-JSurMAc), К -ацетилтлюкозаминил -к-ацэтклыураюид-аланид-Р-иаогдутамин-лизин(ГЮТЬLys), тркпепткд ал,анид-Р-изоглутамин-лизин (Ala-iGln-Lys), К-ацетил-глскогаминид - (ß 1-4) - К -ацетилмурамоил -еланил-изоглутамин (LL-ГЦПП. Указанные соединения были любезно предоставлены нам T. M Андроновой и Е. А. Макаровым.

Исследования выполнены с использованием мышей линий ВALB/с е C57EL/6, полученных из опытно-племенного питомника лабораторных язвоткых при ВМ Виомоделей РАМН ( ст. Столбовая Московской области), и клеточных линий VEHI-3, Jurkat,EL-4,BCL4 иг коллекции клеточных культур лаборатории иммунохимии Института бшорганичгской химии ш. M. IL Шешктаа РАН.

GlcNAc [ р(—~4)ИигНАс

Рис.1. Структура ^аттилглхкоэамгаш-(]И-4)-М-ацетилму-рамоил-аладил-О-изоглутамина ( ГМДП).

При выборе клеток руководствовались имеющимися в литературе сведениями о клетках- мишенях Ш. В виду того ,что основными мишенями мурамилпептидов являются клетки макрофагального ряда, в работе в первую очередь использовз-пгсь перитонеальные мышиные макрофаги и клеточная линия миеломоноцитарной лейкемии мы-ш WEH I- 3. Макрофаги выделяли из гегаток перитонезльного эксу^ дата ¡шшеа EALB/c здгеаией на пластиковых чашках • Штри,клетки WEH1-3 культивировали в полной среде RPMI-ie40.

В связи с неоднозначность*» литературных " данных о взаимодействии Ш с другими клетками иммунной системы, мы также оце-низзлн связывание ГЫДП с нормальными и трансформированными Ти Б-лимфоцитами.

Источником нормальных Т-и В-лимфоцитов в наших: исследованиях служили селезенки мышей C57BL/5. Культуру сплэноцитов,обогащенную 7-клеткаии получали путем специфической адсорбции В-лимфоцитов на пластиковых чалках Штри, сенсибилизированных антителами против иммуноглобулинов кыаи. ССогащгниэ спленоцитов В-клеткаш , довивалась кяыплэкэнт-зависимыы лизисом Т-лимфоцитов анти-Thy-1,2-антителами.

Из имевшихся в нашем распоряжении трансформированных клетск мы остановили свой выбор на Т-лимфобластной лейкозной клеточной дшши человека Jurkat .мьшиной Т-тиюмэ EL-4 и 3-клэточноё лейкозной линии мыши ВСЦ.ПзречислеЕНш клеточнвэ культуры вели а среде RPMI-1640. с добавление и ЮХ FCS.

С цель с установления маубраниоа кш ■внутризйлггочной локализации центров связывания дисаааридсадзргагзтх аурзмклпептидон использовала, соответственно, вагзвньэ 2 перфорированию клэт-

- б -

ки. Последние получали фиксацией клеточных ыгмбран 4% раствором формальдегида в фосфатно-солевок буфере , после чего проводили обработку клеток 0. 2?. раствором бетз-окгклглюксгцда в Буфере того хв состава для создания пор и цктоялазматкческой мембране.

Для предотвращения экдошггоэа и уменьшения неспецяфкческэй сорбции акзлиг свкзьзанкя каткЕНых клеток с лиггндш.с; Еглк при температуре 4*С г прпсутсвп: 0.0:?, ааздг натрия. Инкубацию перфорированных клеток с прокгводньаш ГМЗП осушсгвлагв при £7' С.

5а величину специфического связывание принимали разность между значениями об:ией к нессецкфической сорбции, определяеш-б ккгибиторном анализа.

Лучение ЕзаимэдейстЕин нурал'пигпепткдзв с клетками ¡алчной зкстема бью начато с игпэяьгогаякя радкоредапторвого ыетодв анализа из-за его высокой чухетвктельнэсти, спецкфкчкостг; к относительное простоты разделения свободного к связанного с клетками шченюго лггакда. Б кгвги распоряжений кмздюсь 2 ра-аЕсакпшои аналога ГЦ2П,лв5баяз предоставгеккьх сотрудника лаборатории иве пептидов КБХ га& £ Е Ведак&Еб РАЕ А. Eaf.se-ловьи : Г^СЛ-Ьуа-С ['"З) ВК),сккуег;5рсваккы2 путем Еякгченкя в С- кскцг-есй остаток лкзина радк»8кгвБЕаго изотопе'"2 с вэюгьв реагента Боггэпв-ЗгйтергС у*. рад. - 2003 Кл/нгл) д-^Н-ПЗШ, сзлу-чгншь£: в регулътагс- кзогсдюго обкгнз ходзрода ( рад. -

40 Ки/;Д0 .

с&.-'г а®?- %—^

Рк=.Н Ст.с-.';:; строгш; ЩДг-1л'з-СЕ|г< 12 ЕЧ).

рЕдпзакпзци: алалогог; Г/ИИ1 с каткгк^ли :: п-;-рклетка1-::; г.а:тзгал, >:та оаа.ге а Кгтп^цлфпчгспое аг-^сьзалпе <: .гстс^'лгьауу

ра?тайка кр: аре*;?-::: а «с '¿л: сп:.—

гкапарс-зага. С г. :;;.

по изучению связывания проводились при 30 минутной инкубации клеток с лигандами.

В ходе работы выяснилась нецелесообразность использования '''Н-аналсга ГМДЕ иа-за низкой воспроизводимости получаемых результатов .поэтому все дальнейшие исследования проводились с

tZf

применением I-меченного соединения.

Было показано,что связывание ГЩЩ-Ьуз-(С^ТЗ ВН) с макрофагами и клетками мкеломоноцитзрной линии ШП-3 носит специфический характер,о чем свидетельствует данные ингибиторного анализа. СпосоСиоиь конкурировать с йод-прояэвсднш ГШЫ.уз за участки связывания а наибольшей степени была присуща ГВДП и ГМДГЫуз. Ингкбирутсшзя активность стереоиэомера ГМДП, у которого остаток D-Gln заменен на L-Qln (LL-ЩЩ), была значитель-яо ниже.

Специфической сорбции не наблщалось на клеточных линиях EL-4 и ECL .

Построение графика связывания в координатах Скэтчарда позволило определить константу диссоциации лиганд-рецепторного комплекса и количество участков связывания на кл?тку»Для кагиа-ных макрофагов и клеток VEHI-3 Kd составила 350+120 рМ и 200+90 рМ соответственно. Значения Втах нходились в пределах 500-1000 центров на одну клетку(рйс 3).

Полученные нами данные согласуется с литературными о наличии на плазматической мембране макрофагов небольшого числа участков связывания мурамилпептидов, причем значения Kd и Еггах близки к приведенным а работе SUverrran et al.

При проведении экспериментов с помощью радиорецвпторного анализа был отмечен высокий уровень неспецифической сорбции и нестабильность меченых лигандоа ,чхо при наличии разброса величин м^жду параллельными пробами приводило к необходимости многократного повторенная' экспериментов для получения статистически достоверных результатов. Кроме того,не представлялось возможным отдифференцировать мембранный и внутриклеточный типы связывания без дополнительного субклеточного фракционсро-вания. В силу указанных причин был предпринят поиск альтернативных методов, позволивлих охарактеризовать процесса вззиш-действия ДЫП с клетками я кор^якгно сопоставить полученные данные.

и мл. 6 яын.

те зооо 2000 -юно ■

иля.6 тин

4004

лов

геоо

(ООО

о 4 /г ¿о

*о им о * а го

У"

30

?5

го

(5 а

-V-

ГТт

о НА в> и (БЬ„./>И и

во

N 40 30 го *0

\

\ N

\

\

\

а са с,в {г Х1В„,рМ в

Рис. Э Зависигюсть обтего(1) ,неспецифического(2) и специфи-ческого(З) связывания от концентрации ГВДП-1.уБ-(Г*гП БН) и анализ связывания по Скзтчарду: А -с клетками ШП-3 , В- с мьшиными перитонеальнь&ш макрофагами.

Еьйор был остановлен на флуоресцентном анализе .поскольку он стличается высокой простотой и чувствительностью (до !ОСО молекул флуоресцеина на поверхности исследуемой частицы), стабильностью меченных соединений и возможностью автоматизации процесса.

Для проведения исследований было синтезировано флуоресцентное производное ГМДП-1уз с флуорвсцеиниаоткоцконатной группировкой по £ -аминогруппе лизина (Г1ЩП-1.уз-©3£ГЦ).Кгк и сам ГЩП, ГДШ-Ьуз-ЙГГЦ обладал адъыванткой активностью и бык способен индуцировать экспресс® 1а-антигенов на шзпшых макрофагах.

GfcÁc MurHAc - 9 -

5

II

CH,NU— С — ÍW

* Щ УН ä COOH A(a D-iGtn Lys

Рис. 4 Структура ПЩЫ-уз-ФИТ!

Конъюгацию ГМДП-Lys и Ф1ПЦ выполняли стандартным способом с применением 0.1М Нз-бикарбонатного буфера , pH 9.0 , а течение ночи при 4 С. Очистку полученного соединения проводили с помощью ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой "Zorbax ODS" в градиенте ацетонитрила (£>807.) в О. 05М ацетате аммония. Окрашенные фракции собирали и анализировали методами масс-спектроскопии и аминокислотного анализа. Фракции, содержание ГЩЦЫ.уз-<ЕИТ11, объединяли, лиофилизовали,после чего проводили рехроматогрзфию з той .*э системе ,ко при более пологом градиенте ацетакитри-ла. Концентрация ГЩЩ-!_уз-<ЕИТЦ определяли спектрсфотометрически по поглощению при 495 нм,используя в качестве стандарта раствор <ВИГЦ.

Окрашивание интактныг клеток ГВДП-Ьуз-'ЗЙТД вели 20 минут при 4 С в присутствии 0. DIZ азида натрия. Перфорированные клетки окрашивали а тех да условиях, но без добавления Kaíl-j.

Взаимодействие (¡ауоресцентно-меченных клеток с ГЦЦП и его производными анализировали :-.»тодами проточной цитсфлуориметрия и поляризации флуоресценции с использованием проточного цитоф-луориыетра EPICS "ELITE" СCoulter,США) и спектрофлуориметра Hitachi-KPE (ЯЬоюет). Измерения были проведены при участии сотрудников Института биоорганической химии к. х. н. С. 3. Байдукова и к. б. н. И. С. Литвинова.

Уело зга проведения опытов зпча двумя методами были максимально сближены для корректного сопоставления полученных данных: к 100 икл кл£гочной суспанает^бхЮ5" кл/мл) добавляли Юмкг ГШЩ-йуз-ФИГЦ а возрзсташиэ колкчастга нелеченого ГЫШ (от

0.01 до 100 ыкг). Б ряде случаев варьировали количествами ГЩЕЫ.уз-ФЮЦ (0.5-50 мкг) , фиксируя концентрацию немеченого соединения . После получасовой инкубации в темноте окрашенную клеточную супензкю анализировали одним из указанных методов. При работе на проточном цитофлуориметре EPICS "ELITE" клетки перед анализом трижды отмывали от несвязавшегося флуорохрома. Флуоресценцию детектировали по логарифмическому каналу с применением отсекающего фильтра 525ВР (505-Б25нм). Полученные гистограммы подвергали математической обработке с использованием программы "Maltуgraph" (Coulter,США).

Оба подхода дали в итоге сходные результата Специфические ДШ- связывающие молекулы были обнаружены как внутри макрофагов, так и внутри клеток УЕН1-3,но не на их поверхности. Для указанных типов клеток был характерен высокий уровень неспецк-фической сорбции флуоресцентно меченного ГМДП-Lys при наличии значительного числа центров,специфически связывающих лиганд. Величина специфического связывания для клеточной линии VEHI-3 составила 35Х, для макрофагов -651.

При работе с нативными клетками отмечался низкий уровень из связывания с ГЦДП-Lys- ФИТЦ, лишь немногим превышающий уровень фонового окрашивания . Этот факт юг быть обусловлен либо отсутствием специфических взаимодействий флуоресцентно меченного лиганда с мембраной .либо наличием неэначительго числа цурамилпептид свяаыЕаюштх молекул на клеточной поверхности, которые могли остаться незамеченными из-за недостаточной чувствительности используемых методов. Последнее предположение подтверждается как существующими в литературе данными об обнаружении ка плазматической мембране макрофагов нескольких сотен рецепторов ЦДЛ ,так и результатами .полученными нами в экспериментах по связыванию радиоактивно меченного лиганда ГВДП-1уз-([а5П ЕН) с клетками макрофаг&льного ряда. Наши результаты o внутриклеточной локализации рецептора согласуются с данными.Tenu et al. (1989. ).показавшими с помощью фотоаффинного меченг-я наличие у альвеолярных макрофагов крысы ЩЪсвязывающих центров: исходя из атих данных имеется внутриклеточный по-лкпептид с молекулярной массой 40-45кДа,способный связывать МЩ.

Результаты, полученные методом поляризации флуоресценции, свидетельствуют о наличии у перфорированных клеток WEHI-3 двух типов центров связывания ГЦЦП,не отличающихся высокая аффин-

носгью: для участков с большим сродством к ГВДП Kd составила 20 нМ, для другой популяции специфических сайтов связывания значение Kd было вше и лекало в области 540 нМ. При исследовании макрофагов наблюдалась аналогичная картина: концентрация центров связывания , гадающих более высокое сродство к лиганду, составила 10+3 нЫ, а число ыест связывания - около 5х10гна од-

Рис. 5 Анализ связывания ГКЦП-Ьуз-ЕИТЦ методом поляризации флуоресценции : А- с перфорированными клетками «ЕНГ-З; В- с перфор!грозанньш перитонеальньш макрофагами мызли На встав-ке-график связывания в координатах Скэтчарда.

Дачные ингибиторного анализа свидетельствуют о специфичности обнаруяенншс участков к интзкгной молекуле ЩЦП : дисаха-рид 61с!.!Ас-ШгМАс и грипептид А1а-01п-1уз хотя и ингибкровади в высоких концентрациях взаимодействие ГМДП-1.уз-ФИТЦ с рецепторами макрофагов и клеток УЕН1-3 ,но в значительно меньшей степени, чем ЩЩ или ГЗДШ-Ьуз. Неродственный трипептид не обладал заметной ингибирутадей активностью. Дня взаимодействия была существенна стереохимия молекулы : так, аналог ГМДП, в молекулу которого вместо остатка 0-01п был включен Ь-Б1п (12.-ГЦЩ1 ), оказался неспособным подавлять связывание . Эти данные коррелируй? с отсутствием бколог;г-:еской активности Ь-51п-содеряагэго производного ГЩП. Езокидакным было отсутствие ваметного юти-

- 12 - -бирования мурамшшептидом, что .по-видимому .говорит о важности остатка 31свАс для связывания лиганда.

С О.СГ 0,/ < Ю ' М С.м/г/м! концентрация ингибитора

Рис. 5 Кнгибирование связывания ГВДП-Ьуз-ФПЦ с мышиными перито-

неагьными макросами (кружи) и клетками №Ш-3 (треугольники)

тршептидом А1а-0-101п-Ьуз, Ц_-ГЩЩ и ГИДЕ.

Проверка наличия специфических пЩМуз-свяаыващих центров у других типов клеток показала, что они имеются у Т-клеточной линии человека Литкам но не мши (ЕЬ-4) ,и локализованы внутри клетки .Возможной причиной таких результатов может быть степень зрелости используемых Т-клеток: линия ,[игка1 соответствует по своим характеристикам 7-хелаерам,а клетки ЕЗ--4 находятся на более ранней стадии дифферендарояки Т-лимфоцитов. Специфической сорбции не наблюдалось и на клеточкой линии ВСЛ-1, причем стимуляция этих клеток ЛГС или небольшими дозами ыурамил-пептидов также ве приводила к ощутимому увеличению связывания в отличие от данных Тепи е1 а1(1989).показавших специфическое взаиюдейстгие ЩЩ с мембранными структурами активированных В-клеток.

Наличие специфических внутриклеточных центров связывания МП у Т-хелперов и отсутствие таковых у В-лимфоцитов было подтверждено для нормальных спленощпов мши с использованием метода проточной цитофлуориыетрии и двойной метки.

Окрашивание 1-клеток проводили одновременным добавлением к клеточной суспензии фяуоресцеин-меченного ГЫДП-лизина и фико-эритрин-меченных антител к 1.3Т 4-маркеру Т-хелперов. В-лимфоциты скрашзали добавлением меченньа родамином кроличьих антител против иммуноглобулинов мыш и ГЫДП-Ьуз-<2511 Д.

В случве неподеленных спленоцитов наблюдалось двойное окрашивание как Т-хелперов, так и В-клеток,однако только у Т-кле-ток связывание инг'ибировалось ГДЦП. Аналогичная картина наблюдалась для популяции селезеночных В-лимфоцитов, из которой Т-клетки были удалены комплемент-зависимым лизисом. .

• Как уде отмечалось выше,эти данные не исключают существование на клеточной мембране небольшого количества рецепторов му-рамилпептидов' .так как. примененные нами методы флуоресцентного анализа позволяют осуществлять детекцию участков связывания лишь в количествах не менее 1000 рецепторов на клетку,в результате чего специфическое связывание, обнаруженное нами у клеток ИЕН 1-3 и макрофагов с помощью радиоактивных лигандов, должно было остаться незафиксированным.

Т-с»||| в-ся1»

А

-П ' ПИВ-' 1Ч11И

.11 Ю 100 ЮОО .1

1 10 100 1000

37-

(пЬЫог

|пыы1си

01

' ; ю со юга ОМОЧу» -ПиТС

0) 1 ю кх) вот

ОМПГ-1у»-ПиТС

С

18

Рис. 7 Цитофлуориметрический анализ связывания 'ПЩЫ-уз-ШТЦ с Т- и В- клетками мышиные спленоцитов! А и В - без добавления» С и 0 - в присутствии немечвнного ГЬЩЬ

По мнении ряда авторов,основная трудность в изучении рецепторов мурамилпептидов кроется в их низкой аффинности,что, по-видимому, приводит к быстрой диссоциации лиганд-рецепторкых комплексов. Ревкние данной задачи требует применения оригинальных методик ,с помощью которых можно было бы зафиксировать возникшее лиганд-рецепторное взаимодействие. Одним из таких подходов к изучении «урашишвптид-саявыьанщж участков является их ковалэнтное мвчэние радиоактивным лигандом с последую-иим анализом образовавшихся комплексов. Для ковапвнтного связывания Ш с рецептором могут бьпь использованы фотоактиькруемые производима и бифункциональные реагенты. В нашей работе мы применили фотоаффкнное мечение клеток для обнаружения и первичной биохимической характеристики участков связывания МП.

Изучение локализации к биохимических свойств Ш-свазывагарос молекул с помощью фотоаф£ишюго нгченкв.

В качестве гетеробифункционального фотоактивируемого реагента мы использовали К-оксисукцинимидный зфир 4-азидссалици-ловой кислоты СNHS-ASA).синтез которого был осуществлен по методике .описанной в работе I. Ji et al(1985). Контроль за качеством продуктов,получаемых в ходе реакции проводили с помощью тонкослойной хроматографии в системе метанол-этилацетат(1:Ю).

Шсле контшгаиии ГЩЩ-Lys с KHS-ASA,которую проводили в течение ночи a Na-фосфатном буфере, рН 7.5,реакционную смесь наносили на колонку с обращенной фазой 7С Nucleosyl и злшровали линейным градиентом ацетояитрила (10-60Х) с 0.05Х трифго-руксусной кислоты Фракции,содержащие ГУДП-Lys-ASA объединяли, высушивали , после чего рехроштографировали в той же система для проверки чистоты полученного соединения. Выход модифицированного лигзадз составил 20Х.

Детекцию продуктов фотоаффинной модификации значительно облегчает мечение юлекулы лиганда радиоактивными изотопами, а при отсутствии выраженных спекральных особенностей и низкой молекулярной массе лиганда введение радиоактивной метки является необходимым условием для последующего анализа образовавшихся [»валентных сшивок.

В качестве радиоактивной метки использовали'^!,который был введен в молекулу ГЖЕ-Lys-ASA с помощью Хлорамина Т.

Предварительный синтез нерадноактивкых йодпроизводньк ГШШ-Lys с последующим разделением продуктов реакции методом B3SX дел возможность оценить по профилю злеции время выгода с ¡солонки соединений, принимавшее участие или вновь образуемых в процессе синтеза. Было показано , что фракции , содержащие FI-SDI-Lys-ASAI элюируатся с коленки позднее ,чем исходные вещества, т. е. при более высокой концентрации ацегонктрила.

Для получения производного с высокой удельной радиоактивность;:- использовался неразбавленный препарат Ма,к1 (40 1Шк). Зракгзш, содержав» Г1.ЩП-Lys-, обнаруживали путем измерения радиоактивности аликвох из каздзй яроСярки и сопоставления Brine дакккх с профилем здадя , подучеянш при "холодном" йодировании фзтоактквкруешго прегзюдвего ГНЯП-Lys. В результате Ска получен препарат nmi-Lys-ASA'^l с улешкэЗ радиоактивность..; 200 Kii/Jií

ï.'viV; CHsSf/

"VI /Vt

V

m ff m% OOkA "

M ' >

0

•œ—na—ù cêcn

ÛN ""J

M

on H 'г

Гсзг^пзрсгсннкя rvO^:rr'CP.a;:i;¡;n nposcj:;::::: "" спосс-5-

k3ctí. с !с?7гл).'й. зою псксз^яо, KSO полу-х-гнсс- соз-

дккгзк'? ( г:'£5?-Lys-as/,'*!) cceawïsr-œcks сгяздз&иссь с перфзрз-рсвйкнхгд: f-'S;Tpoísra:.ii' ;; клее::»:?! VEHI-3. S.f?CïÇ с тек при 2К-теснеяхк холодна! ГИЗН-уз урогень сгягызЕЮЕ? оставался сч&яь эксэкзк ( £0";,':то icît »ктзезсти, объяскя<*тея ссрйцпей на ¡w-iTns:-: зз с:?-? гз^з^лдоса^лклахкой грушжрокез.

^ллдхпц';"'::;:::?:) сорб-пэ слоссСпость f греглггедкего FI-Tü-Lys ^г-ггтргрог^га с а

с г л л.-:~л?эп "то ггео рем хс-с-

ггг г с титл:: го гглгелзнтче^у "''Г.1- с. г- : г г .

Эксперименты по фотоаффинноыу шчекип были выполнены на мышиных перитонеальных макрофагах и клетках линий УЗД 1-3 и ВО. . Использовались как нативные.гак и дигитонин-обработанные (перфорированные) клетки указанных типов. Шдифицированный лиганд ГВД1-1.уз-АБА|гг1 (5 х10* зшп/мин/мл) добавляли к клеточной суспензии и инкубировали в темноте а течение 1 часа. С целью дифференциации неспецифического и специфического связывания в контрольный образец одновременно с йодированным лигандом добавляли 1000-кратный избыток намеченного ГЫДП-Ьуз.

Для образования ковалентных сшвок опытный и контрольный образцы подвергали фотолизу с помощью ртутной лампы с расстояния 15 см в течение 10 минут.

Идентификацию молекул, связавших ДШ, проводили с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии доде-цидсульфата натрия с последующей радиоавтографией.

Сравнительный анализ радиоавтограмм и соответствующих им пластинок шлиакриламидного геля опытных и контрольных образцов показал,что специфическое включение радиоактивности в.белки клеточных лизатов отсутствует у всех видов исследованных нами интактных клеток. Однако, несколько сотен мембранных рецепторов данным методом обнаружить практически невозможно, поскольку уровень фонового включения радиоактивности в гель достаточно высок.

Что касается дигитонин-перфорированных образцов то здесь мы наблюдали ксвалентное мэчеше нескольких полипептидов,причем лишь в случае макрофагов и клеточной линии УЕН1-3 оно быао специфическим «так как ингибкровалось в присутствии голодного заместителя.

Данные относительно молекулярной массы белков клеточных лизатов специфически ассоциированных с радиоактивным лигандом неоднозначны. В первой серии экспериментов,выполненных на клеточной линии УЕН1-3 мы кабдвдзли ко валентное мечение полшгеп-тядов с молекулярной кассой 70 и 90 кДа .которое заметно подавлялось в присутствии избытка "холодного" ГМДГЫуз.В ходе дальнейших исследований на радиоавтограшах клеточных лизатов макрофагов и клеток ЮП-З помимо указанных полос было зафиксировано фатоаффианое мечание белков с шньшей молекулярной массой (20-30 кДа), связывание с которыш косшю специфический характер.

S0*4*

Say it si Ша-3200 Radia - TLC Ana(ys*r

Рис.9 Авторадиоградаа злектрофореграммы клеток V/ЕШ-З.после инкубации с nWbLys-A5¿JrI и облучения УФ-светом (а)-без добавления ,( Ъ)-з присутствии ГОДИ.

Работа по идентификации и установлению структуры ДШ-овязы-ваадих белков на иммунакомпегеятных клетках только начата. Дальнейшие исследования могут дать более погнув и ясную картину молекулярной организации рецепторов цурамилпептидов.

Шетипэ Г?.*ДЯ ргшшлэ ззкыш юэточтЯ аятавацин.

Известно, что большинство иммуномодуяяторов .усиливающих пролиферацию , запускает механизмы, приводяшие к изменении Taran вакных параметров,как концентрация ионов кальция и водорода s шгтозалэ клеток.

Б данной работе с помощью флуоресцентных зондов изучалось влияние ГНДП на величину щггоплаэматичесго рН и концентрацию ионов Са-н- перктонеальных шпиных макрофагов и клеток VEH1-3.

Исследования проводились в Институте биофизики РАН (г. Дзщи-ко, Московской области) совместно с В,&2шченко.

Изменение внутриклеточной концентрации ионовСа++ оценивала после 33 минутной еткубзцш; вагругюнных флуоресцентным красителем ( QUIN-2AM ааи FUR/.-ЗАМ) клеток с различными концентрациями ШС1 Достоверных и? изданий содериания Са++ во всем интервале использованных колцентраций ГВДП (о? D. 1мкг до 100ыкг) стмечено не было.

Для измерения концентрации ионов водорода а цитоплазме ns-

рятснеальныз: макрофагов и клеток WEHI-3 использовали флуо-

ресцэктвый рК-чувствительный зонд 5CECF.

рН{ V

Mi

pH,

i

i

S.C'r

Pkc. IQ Елшяие ГЩЩ на Essriajy вдггоплаашгачвского pK.

Б первые 1-2 минуты пэелэ добазд&шк ГЩЩ (1С акт /«л) к суспензий окрашенных клеток наблюдалась небольшое аакксланпе цитослаэш, после- чего отмечалась практически линейное аэв--растакиэ щггоплазматичэского рК. В течение 10 икну? происходило задрдачизанш цитоплазмы с В. 8 до 8. а. ед. pH. 3 отсутствия изменений концентрации внутриклеточного Са-н-вабаддаймаэ сдвиги ци-тсслаа;латичэского pH иогут бить связаны с работой кезлэктро-генного Ка+/Н+ сб&эвяикг. Это предположение было подтверждаю в опита с ивгкбигорои N3+/K+ сбдака - EIFA,который полностью подавляя индуцируемое ГМДП вадэлачивааие цитоплазма. В го i'ä врем» фаза Еебольгого{ 0. 02-0. 03 ед. pH) обрага-эго за-кислания цитоплазма сталовигса. необратимой. Как кзззстко ев литературы .кндукдая Na+/H+ -сб^гкника контролируется иротеинкааззой С и/ила тщзозгшкх-шазога Предварительная инкубация исслэдуеыцх клеток с ингиЗнтором; зтих шшаз - К-7 з мзнцэЕтрацшг IQ »seil яракхтчэска сэлазстх-а подавляла дайа-тЕпэ

+£1РА

гО /тин.

6,3

е.? SS

и

t-H-r

3 4 5 5 7 3 1

ГЫДП на величину цитоплазыатичесгого рН в клетках. Этот факт может свидетельствовать об участии кальций-независимых протеинкиназ в реализации действия ГЦЩХ

ВаСЭЭДЫ.

1. Впервые показано наличие специфических центров связывания цурамилпептидов у макрофагов и Т-хелперов и отсутствие таковых у Б-лимфоцитов.

2. Подтверждено наличие небольшого числа выбранных рецепторов на клетках миелоионоцитаркого ряда.

3. Определены константы диссоциации комплексов глкозаыинплму-ршлидипептид-макрофагальный рецептор для мембранных п внутриклеточных центров связывания лкганда.

-4. По.лзано, что ыурамилпептиды специфически связывается внутри макрофагов с более^чем одним белком. Два из этих белка охарактеризовано по ьЕлекулярной массе.

5. Впервые продемонстрировано, что связывание глшоэадашлмура-глилдшептида вызывает иэюнекнз величины рН цитоплазмы клетки.

teres ргйот, спуйжшзЕгшьа га jjKEcepxsspsa

1. M.V. Sumaroka, I.S. Litvinov, S.V. Khaidukov, Т.Н. Golovina, 114. Kanras, R.L. Komal'eva, T. It Andronova, £. A. Makarov, V. A. Kssneyanov and V. T. Ivanov. ШгалгД peptid-bindmg sites are located mside target calls. //FEES Lett. - 1991. - v. 295. - N 1, 2, 3. - p. 48-EO.

2. S.V. Khaidukov, R.L. Kpmal'eva, M.V. Sumaroka, V.A. Nssrreyanov. The study of mechanism of muramyl peptid biological activity.//11-th European Immunology Meeting. -1991. - Abstracts. - N 135-19.

3. T.N. Golovina, Li V. Sumaroka, I.S.. Litvinov, S.V. Khaidukov, V. A. Nesreyanov. Intracellular imramyl peptide-bmding nnlscules of macrophages. //11-th Europsan Immunology Kfeetinsf. - 1991. - Abstracts. - N 136-18.

4. V, A. Nesneyanov, S. V. Khaiducov, R.L. Komal'eva, M.V. Sumaroka. The study of molecular mechanism cf rurarylpeptide biological activity. /.-Synposium cf molecular factors of Reratopoiesis and Stem c-ell. - iicskov. - 1990. - Abstracts. -p. 155.