Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Липопротеид-связывающий 130кДа белок из гладкомышечных клеток сосудов человека

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Липопротеид-связывающий 130кДа белок из гладкомышечных клеток сосудов человека"

РОССИЙСКИЙ КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ КОМПЛЕКС МЗ РФ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ КАРДИОЛОГИИ

Pí t) Ом 2 2 СЕН 1*8

На правах рукописи

СТАМБОЛЬСКИЙ ДМИТРИЙ ВИКТОРОВИЧ

ЛИПОПРОТЕИД-СВЯЗЫВАЮЩИЙ 130 кДа БЕЛОК ИЗ ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ КЛЕТОК СОСУДОВ ЧЕЛОВЕКА: ИДЕНТИФИКАЦИЯ, РАСПРЕДЕЛЕНИЕ В МЕМБРАНЕ И РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ

03.00.25 - Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1998

Работа выполнена в лаборатории молекулярной эндокринологии НИИ жспсримснтальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ

Научный руководитель:

кандидат биологаческих наук В.Н. Бочков

Научный консультант:

член-корреспондент РАН и РАМН, профессор В.А. 1'качук

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор А.Е. Берман

доктор медицинских наук Б.В. Шехонин

Ведущая организация:

Российский государственный медицинский университет

Защита состоится октября 1998 года в 11.00 на заседании диссертационного совета К 074.22.02 в РК НПК МЗ РФ (Москва, 121552, 3-я Черепковская ул., д. 15 а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ

Автореферат разослан ^^ сентября 1998 года

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н.

Т.И. Венгерова

Общая характеристика работы Акгтуальность проблемы. В настоящее время можно считать общепризнанной роль липопротсидов в переносе липидов в организме. Однако накапливаются сведения о их возможной регуляторной функции, не менее важной, чем метаболическая. Так, например, липопротеиды могут повышать тонус сосудов [Jacobs et al., 1990], вызывать агрегацию тромбоцитов [Ardlie, 1989; Aviram and Brook, 1983 J, активировать моноциты [Mohan and Jacobson, 1995], стимулировать пролиферацию и миграцию гладкомышечных клеток [Bjorkerud and Bjorkerud, 1994]. Эти эффекты быстрые, обратимые и сопровождаются активацией систем вторичных посредников. Так, например, в гладкомышечных клетках липопротеиды способны стимулировать фосфоинозиткдный обмен и вызывать повышение цитоплазматичсской концентрации ионов кальция [Scott-Burder et al., 1991]. В отличие от хорошо изученной метаболической функции липопротеидов, механизмы их влияния на системы вторичных посредников до сих пор неизвестны. Ранее в нашей лаборатории было показано, что на поверхности культивируемых гладкомышечных клеток (ГМК) сосудов человека присутствуют участки связывания ЛНП. отличные от всех известных липопротеидных рецепторов, параметры связывания с которыми коррелируют с параметрами активации липопротеидами систем вторичных посредников [Tkachuk et al., 1994]. Методом лигандного блоггинга в мембранах медии аорты, а затем в мембранах культивируемых ГМК были обнаружены два липопротеид-связывающих белка с молекулярными массами 105 и ПО кДа (р 105 и р130), специфически связывающие ЛНП [Kuzmenko et al., 1994]. Лигандная специфичность этих белков отличалась от лигандной специфичности всех известных липопротеидных рецепторов и липропротеид-евязывающих белков [Bochkov ct al., 1996]. Было выдвинуто предположение, что обнаруженные липопротеид-скязынающие белки могут принимать участие в реализации гормоноподобных эффектов липоиротекдов. Белок р105 был очищен до гомогенного состояния и идентифицирован как зрелая форма Т-кадгерина [Tkachuk et al., 1998]. Кадгерины хорошо известны как молекулы клеточной адгезии, опосредующие гомофильное кальций-зависимое распознавание [Buxton and Magee, 1992]. Т-кадгерин - уникальный член этого семейства. Он полностью лишен трансмембранного и цитоплазматического доменов и закреплен на мембране только через

гликофосфоинизитидный (ГФИ-) якорь [Ranscht and Dours-Zimmermann, 1991]. Природа липопротеид-связывающего белка р 130 до настоящего момента оставалась невыясненной.

Целью данной работы была характеристика липопротеид-связывающего белка, имеющего молекулярную массу 130 кДа в ГМК кровеносных сосудов человека. В связи с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи: I Выделить, очистить до гомогенного состояния и идентифицировать путем определения частичной аминокислотной последовательности липопротеид-связывающий белок с молекулярной массой 130 кДа.

2. Изучить влияние сыворотки и ее компонентов на экспрессию белка р 130 и Т-кадгерина в сосудистых ГМК человека.

3. Получить антитела против белка р 130 и с их помощью выяснить его распределение в клеточной мембране.

Научная новизна и практическая значимость работы. В результате данной работы липопротеид-связываюший белок с молекулярной массой 130 кДа (р130) был очищен и идентифицирован как частично процессированный предшественник зрелой формы Т-кадгерина. В работе впервые показана одновременная экспрессия на поверхности культивируемых клеток зрелого Т-кадгерина и его частично процессиро ванного предшественника. Экспрессия Т-кадгерина и его предшественника проявляет одинаковую дозовую и временную зависимость от наличия сыворотки или факторов роста в среде культивирования ГМК: как сынорогка, так и факторы роста подавляют экспрессию Т-кадгерина и его предшественника. В работе впервые описана локализация зрелой формы Т-кадгерина и его предшественника в мембране культивируемых ГМК. Установлено, что в плазматической мембране Т-кадгерин и его предшественник концентрируются в нерастворимой тритоном субфракции мембран низкой плотности, соответствующей кавеолам, участкам мембраны, обогащенным гликолипидами и холестерином.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на межлабораторном семинаре НИИЭК РК НПК МЗ РФ (Москва 1998), на симпозиуме "Липопротсиды и атеросклероз" (Санкт-Петербург, 1995), симпозиуме "Инте1рация механизмов висцеральных функций (Краснодар, 1996), X международном симпозиуме по Атеросклерозу (Париж, 1997).

Публикации. Результаты работы представлены в 8 статьях и в 3 тезисах докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа построена по традиционному принципу и состоит из введения, обзора литературы, описания методов и материалов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 94 листа машинописного текста, 1 схему и 16 рисунхов. Список литературы включает 164 источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Культивирование гладкомышечных клеток (ГМК). Выделение и культивирование гладкомышечных клеток (ГМК) аорты человека проводили по ранее описанной методике [Scott-Burden et al., 1989]. В экспериментах использовали клетки 10-18 пассажей.

Выделение клеточных мембран из тканей человека. Клеточные мембраны и мембраны медии аорты выделяли по методу, описанному в работе [Matlib et al., 1984].

Выделение липопротеидов плазмы крови. Липопротеиды выделяли из плазмы крови здоровых доноров методом препаративного ультрацентрифугирования в растворах NaBr различной плотности по методу [Havel et al., 1955].

Электрофорез белков в полиакрнламидном геле, иммуно- и лигандный блоттинг. Электрофорез белков проводили в 8% полиакрнламидном геле (ПААГ) в присутствии SDS по методу Лэммли [Laemnüi, 1970] в невостанавливающих условиях. Белки переносили из геля на нитроцеллюлозную мембрану методом электроблоттинга [Towbin et al., 1979]. Вестерн-блоты последовательно инкубировали с первыми антителами (в случае лигандного блотгинга с ЛНП) и вторыми антивидовыми антителами, коньюгированными с пероксидазой хрена (в случае лигандного блоттинга с козьими аффинно-очищенными антителами против ЛНП, конъюгированными с пероксидазой хрена). Блоты окрашивали раствором, содержащим 3,3'-диаминобензидин, ионы Ni2' и перекись мочевины [Harlow and Lane, 1988]. Количественную оценку величины связывания проводили, анализируя окрашенные блоты с помощью сканера.

Выделение 130 кДа липопротеид-связывающего белка (р130) из мембран медии аорты человека. Для очистки 130 кДа липопротеид-связывающего белка была применена модификация разработанного нами ранее метода очистки 105 кДа липопротеид-связывающего белка [Tkachuk et а]., 1998].

Определение частичной аминокислотной последовательности белка. Для определения частичной аминокислотной последовательности препарат после дополнительного электрофореза переносили на PVDF-мембрану с помощью электроблоттинга [Towbin et al., 1979]. Ферментативный гидролиз белка до пептидов проводили, обрабатывая мембрану трипсином, после чего полученные пептиды разделяли методом обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии и определяли их аминокислотную последовательность с помощью газофазного секвенатора. Эта часть работы выполнялась сотрудниками профессора Paul Jeno в Лаборатории химии белка Биоцетра г.Базеля, Швейцария.

Определение концентрации белка. Концентрацию белка в растворах определяли по методу Лоури [Lowry, 1951] в присутствии 1% SDS, используя в качестве стандарта БСА.

Получение поликлональных антител против ЛНП и . синтетических фрагментов Т-кадгерина. Козу, кроликов или мышей иммунизировали ЛНП или кокьюгатами синтетических фрагментов Т-кадгерина с гемоцианином [Harlow and Lane, 1988] с адьювантом Фрейнда (полным при первой иммунизации и неполным при последующих) в соответствии со стандартной процедурой [Harlow and Lane, 1988]. Антитела против ЛНП очищали методом аффинной хроматографии на колонке с ЛНП. Антитела против синтетических фрагментов использовали в виде суммарной фракции иммуноглобулинов, полученной методом высаливания сульфатом аммония.

Получение Fab-фрагментов антител. Fab-фрагменты антител получали с помощью пап айн а по методу, описашюму в руководстве [Harlow and Lane, 1988] с незначительными модификациями.

Получение коиъюгатов синтетических пептидов с пероксидазой хрена. Конъюгаты пептидов с пероксидазой хрена получали по методике, описанной в работе [Сидорова и др., 1998].

Получение препарата мембранных доменов низкой плотности нерастворимых в тритоне из клеточных мембран и мембран медии аорты.

Препараты тритон-нерастворимых доменов мембраны низкой плотности получали из ГМК и мембран медии аорты человека ультрацентрифугированием в градиенте сахарозы как было описано ранее [Lisanti et al., 1995].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Очистка р130 из мембран ГМК медии аорты человека. Для очистки р130 была применена модификация разработанного нами ранее метода очистки лилопротеид-связывающего белка р 105, идентифицированного как Т-кадгерин [Tkachuk et al., 1998]. Из медии аорты человека выделяли мембраны [Matlib et al., 1984], которые затем экстрагировали детергентом CHAPS. Липопротеид-связывающая активность обнаруживалась в солюбилизате (40% от мембранного белка). Этот препарат подвергали колоночной хроматографии методами

2+

анионообменнон хроматографии ка DEAE-Toyopearl и Zn -хелатной хроматографии на имидодиацетатном сорбенте. Далее препарат подвергали очистке методом препаративного электрофореза в полиакрил амидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, а затем очищали методом препаративной изоэлектрофокусировкн в геле в диапазоне р! от 3,5 до 9,5. Лгаюпротеид-связывающая активность обнаруживалась в полосе с р! около 5,4, что соответствует ранее определенному методом двумерного электрофореза значению изоэлектрической точки для зрелой формы Т-кадгерина (р105). Всего было получено около 50 ми-препарата 130 кДа лилопротеид-связывающего белка. Результаты очистки р130 проиллюстрированы на рисунке 1.

Определение частичной аминокислотной последовательности р130. Белок р 130 переносили на PVDF (поливинилидендифторидную) мембрану и подвергали ферментативному гидролизу трипсином. После разделения методом обрашеннофазовой ВЭЖХ определяли аминокислотную последовательность полученных пептидов с помощью газофазного секвенатора. В мембранах медии аорты белок р130 присутствует в количестве на порядок меньшем, чем Т-кадгерин (рис. 1), поэтому нам удалось очистить лишь небольшое количество этого белка. Из нескольких триптических пептидов удалось получить только одну информативную аминокислотную последовательность (в других случаях не хватило чувствительности газофазного секвенатора):

ТМН2 -Е-У-х-х-Р-У-Р-СООН Согласно банку данных 8\у155Рго1 этот пептид идентичен участку с 77 по 83 в последовательности полного белкового транскрипта про-Т-кадгерина. Это позволило нам предположить, что 130 кДа лилопротеид-связывающий белок может быть предшественником Т-кадгерина. '>лск-1]1(|фоце1 в ПААГ

окраска кумассн й-250 Лигандный (Д1Ш-) блоттицг

11 * „ ** —т Р'30

- „ —Т-кялге

3 4 5 6 7 8 12 3 4 5 6 7 8

Рисунок 1. Очистка р130 и Т-кадгерин». Количество белка, нанесенное на дорожки, (кроме последних стадий очистки) нормировано по сигналу, который препарат дает при детекции р130 и Т-кадгерина методом лигандного (ЛНП-) блотгинга. Электрофорез в 8% ПААГ в присутствии SDS, окраска кумасси R-250. Лигандный (ЛНП-) блотгинг: ЛНП 100 мкг/мл, окраска с помощью конъюгата антител против ЛНП с пероксидазой хрена, проявление ДАБ в присутствии ионов Ni3* 1 - препарат мембран из аорты; 2 -солюбилизат препарата мембран в детергенте CHAPS; 3 - фракция после DEAE-хроматографии; 4 -препарат после 2п2+-хелатной хроматографии; 5 - препарат Т-кадгерина после препаративного электрофореза; 6 - препарат Т-кадгерина после препаративного 2D-электрофореза; 7 - препарат р1Э0 после препаративного электрофореза; 8 -препарат р130 после препаративной изоэлектрофокусировки.

Использование антител для идентификации белка р130. Для того чтобы выяснить, является ли белок р130 предшественником Т-кадгерина, были получены антитела против синтетических фрагментов из последовательности про-Т-кадгерина. Пептиды для синтеза, которые выбирались с помощью компьютерной программы по трем параметрам: гидрофильности, поверхностной доступности и статистической антнгенности, были синтезированы в Лаборатории синтеза пептидов НИИЭК РКНПК под руководством Ж.Д. Беспаловой [Сидорова М.В. и др., 1998]. Кролики и мыши

иммунизировались конъюгатами пептидов с гемоцианином по стандартной схеме [Hailow and Lane, 1988]. Кролики иммунизировались конъюгатами с гемоцианином семи различных синтетических пептидов из последовательности Т-кадгерина. Достаточный для детекции методом иммуноблотгинга тигр антител был получен на пептиды 140-160, 161-179 и 260-271. Антитела из этих сывороток окрашивали на блотах препарата р130 и Т-кадгерина точно те же полосы, которые детектировались методом лигандного (ЛНП-) блоггянга. Кроме кроличьих, были получены мышиные поликлональные антитела против пептидов 140-160 и 161-179. Мышиные антисыворотки также окрашивали на блотах препарата р 130 и Т-кадгерина те же полосы, которые детектировались методом лигандного блоттинга. Аналогичная картина наблюдалась при иммуноблоттинге мембран культивируемых ГМК из аорты человека (рис. 2).

I 2 S 4 5 6 7 8 9 10 II 12

Рисунок 2. Окраске методом иммуноблоттингя с помощью кроличьих и мышиных антипептндных антител препаратов: мембран мед ни аорты человека: 1 - ЛНП-блоттинг; 2 - неиммунная сыворотка кролика; 3-9 - кроличьи ангипептидные антисыворотки: 3 - на пептид 51-61; 4 -на пептид 140-160; 5 - на пептид 161-179; 6 - на пептид 260-271; 7 - на пептид 340-352; 8 - на пептид 350-362; 9 - на пептид 370-385; 10 - неиммунная сыворотка мыши; 11,12 - мышиные антипептидные антисыворотки: 11 - на пептид 140-160; 12 - на пептид 161-179; мембран культивируемых ГМК из юрты человека: 1 - ЛНП-блоттинг, 24 - кроличьи антипептидные антисыворотки: 2.-на пептид 140-160; 3 - на пептид 161-179; 4 -на пептид 260-271. На каждую дорожку нанесено по 50 мкг (по белку) препарата мембран. Для окраски использованы антисыворотки в разведении 1:250. Для их детекции использованы коньюгаты антивидовых антител с пероксидазой хрена. Блоты проявляли с помощью ДАБ в присутствии ионов К^1".

Чтобы убедиться в том, что антитела к Т-кадгерину и ЛНИ связываются с одним и тем же белком р130, мы исследовали влияние антител на связывание ЛНП с р 130 и Т-кадгерином. Было показано, что антитела к разным фрагментам Т-кадгерина конкурируют с ЛНП за связывание с р130 и Т-хадгерином. Максимальную конкуренцию с ЛНП проявлял препарат антител против К-концевого пептида зрелой формы Т-кадгерина (рис. 3). Блокирование связывания ЛНП антителами носило

обратимый характер: при повышении концентрации ЛНП в присутствии фиксированной концентрации антител связывание ЛНП с р ]30 и Т-кадгерином

возвращалось к исходному уровню (рис. 3).

—■— ненмунвые шпгМ! А. антитела: ■>•

< 100

\ \ S01 \ (ЛНП]=40 мкг/мл Ч. 60 / fiel ■ 2,5 мг/мл

Ч-1-1-1-1 I-1 I-1-1-1-г

0,0 ОД 0/4 0,6 0,8 1,0 1,2 100 200 300 400 300 Препарат антитал, мг/мл ЛНП, мг/нл

Рисунок 3. Влияние антипептндных антител против Т-кадгерииа на связывание ЛНП с р130 и Т-кадгерином. На каждую дорожку было нанесено по 20 мкг препарата полученного после гп2,-хелатной хроматографии (обогащенного р130 и Т-кадгерином); антнпептидные антититела были использованы в виде общей сульфатной фракции иммуноглобулинов. Для их визуализации применяли кокьюгат антивидовых антител с пероксидазой хрена. Блоты проявляли с помощью ДАБ в присутствии ионов N¡2+. Определяли оптическую плотность полученных полос с помощью сканера. А - блокирование связывания ЛНП (40 мкг/мл по белку) антипептидными антителами; Б - связывание ЛНП в присутствии антител против Т-кадгеринового пептида 140-160 (общая концентрация IgG 2,5 мг/мл); В - обратное вытеснение липопротеидами антител против Т-кадгеринового пептида 140-160.

Помимо того, что антитела против пептидов Т-кадгерина ингибировали связывание ЛНП с р130 и Т-кадгерином, было показано, что и антитела против апо-В|оо (апобелка ЛНП) также препятствовали связыванию ЛНП с этими белками. Нами использовались Fab-фрагменты кроличьих и козьих аффинно очищенных антител против апо-Вюо- Оба препарата Fab-фрагменгов ингибировали связывание ЛНП с белком р130 и Т-кадгерином. Ингибирующее действие анти-ЛНП Fab-фрагментов могло быть преодолено при высоких концентрациях ЛНП (результаты не показаны).

Трипсин превращает белок р130 в Т-кадгерин. Белок р!05 был идентифицирован нами как зрелая форма Т-кадгерина [Tkachuk et al., 1998] Классические кадгерины синтезируются в виде предшественников, содержащих пропептиды, которые впоследствии отщепляются. Отщепление пропептидов является обязательным условием для связывания кадгеринов с лигандами - идентичными молекулами кадгерина, локализующимися на поверхности другой клетки [Ozawa and Kemler, 1990]. Известно, что кальций защищает классические кадгерины от протеолитического расщепления трипсином [Vestal D.J. и Ranscht В., 1992]. Мы обработали культивируемые ГМК из медли аорты человека трипсином в присутствии кальция. При этом связывание ЛНП с р130 и Т-кадгерином (р105) не исчезало, но изменялось соотношение между полосами р130 и Т-кадгерина: р130 исчезал и происходило накопление белка с молекулярной массой 105 кДа. Белки при этом детектировались как иммуноблотгингом, так и лигаидным (ЛНП-) блотгингом. Эти результаты свидетельствуют в пользу того, что р130 является предшественником Т-кадгерина, который после отщепления пропептида превращается в Т-кадгерин (рис.4).

Ш

*■ 1 рп-.ипн_»

« ^ Як

г

р130 ff Т-кщиернн

Б. Лшандпын (Л1Ш-) Окраска

блотгапг аигитмамн

«Да „д,

ш-105-

- |>130

- Т-калгсрнн трипсин - -

Рнсунок 4. Обработка культивируемых ГМК трипсином. А. - Схема ограниченного трипсинолиза белка р130 приводящего к его превращению в Т-кадгерин. Б.- Детекция белка р 130 и Т-кадгерина в тотальном клеточном лизатс до и после обработки клеток трипсином в присутствии кальция (клетки инкубировали 5 минут в растворе Хенкса, содержавшем 0,25% трипсина и 5мМ СаСЬ). На дорожку наносили по 100 мкг белка. Белок детектировали с помощью лигандного (ЛНП-) и иммуноблоттинга.

Белок р130 имеет гликофосфоинозитидный "якорь". Т-кадгерин является уникальным членом семейства кадгеринов: он не имеет трансмембранного домена и

связан с клеточной мембраной через гликофосфоинозитидный (ГФИ)-якорь [Vestal D.J. и Ranscht В., 1992]. Для выяснения того, является ли р130 (также как и Т-кадгерин) ГФИ-заяжоренным белком, мы использовали ГФИ-специфичную фосфолилазу С, которая отщепляет от глюсофосфоинозитидов гликофосфоинозитол и связанные с ним белки [Sundler et al., 1978]. Мы обработали культивируемые ГМК из медии аорты человека ГФИ-специфичной фосфолипазой С, после чего основная часть р130 и Т-кадгерина обнаруживалась не на клетках, а в среде инкубации (рис. 5). Таким образом, эти данные свидетельствуют, что р130, также как Т-кадгсрин, является ГФИ-заякоренным белком. Обработка клеток ГФИ-специфичной фосфолипазой С почти полностью лишала клетки ЛНП-связьшающен активности. При этом ЛНП-связывающая активность в среде инкубации не детектировалась, что может говорить о важности ГФИ-якоря для создания активной липопротеид-

связывающей конформацки Т-кадгерина (данные не показаны).

%

Ш S'

т JSs

9 1 ФИ-фоефолтмм С

---►

А.

1

До обработки ГФИ- После oGpaf>oiKii

специфичной Фл-С ГФИ-сисмнфичнои Фл-С

кД» ВИЯ=ЖЯ

130 — ИНК Éjl — (.1 J0

—Т-кадгсрин

5 ± | £

<2 V ¿У

Рисунок 5. Обработка культивируемых ГМК ГФИ-специфичной фосфолипазой С. А -

Схема действия ГФИ-специфичной фосфолипазы С на ГФИ-заякоренные белки на примере рПО. Б - детекция р130 и Т-кадгерина в тотальном клеточном лизате и в среде инкубации до и после обработки клеток ГФИ-специфической фосфолипазой С. После инкубации ГМК из медии аорты человека в среде с ГФИ-специфичной фосфолипазой С (5 ед/мл) в течение 90 минут среда была собрана и освобождена от нерастворимой материи центрифугированием, после чего сконцентрирована в 50 раз ультрафильтрацией, клетки были сняты с чашек в однократном буфере для образцов. Детектировали белок методом иммуноблоттинга с антителами против Т-кадгерина и антивидовыми антителами коньюгиронаннмми с пероксидазой хрена.

Регуляция экспрессии белков р130 и Т-кадгерина. Характерной чертой некоторых липопротеидных рецепторов, в том числе ЛНП-рецептора, является

зависимость уровня их экспрессии от пролиферативного состояния [Middleton and Middleton, 1990; Nicholson and Hajyar, 1992] и содержания холестерина в клетке [Brown and Goldstein, 1975]. Мы исследовали, нет ли такой закономерности для изучаемых нами белков. Для этого на культивируемых ГМК мы изучили влияние сыворотки, холестерина и факторов роста на экспресию белков р130 и Т-кадгерина. ГМК из медии аорты выращивали в среде с 10% ФБС до плотности 60 % от плотности монослоя, после этого в части флаконов меняли культуральную среду на бессывороточную, а в другой части - на свежую среду, содержащую 10% ФБС. Через 3 дня половине клеток, культивировавшихся без сыворотки, культур альную среду меняли на полную (то есть с сывороткой), а клеткам, культивировавшимся на полной среде - на бессывороточную, после чего их культивировали еще 4 дня. Экспрессию белков р 130 и Т-кадгерина измеряли методом лигандного блоттинга с ЛНП (рис.6).

Т-к»д«рян Т~Т 10% сыворотка

Дни Дни

Рисунок 6. Регуляция экспрессии р130 н Т-кадгерина сывороткой.

Клетки, достигшие 60 % плотности от плотности монослоя, культивировали в течение 3 дней: А. на среде с сывороткой, после чего у половины клеток меняли среду на свежую того же состава, а другую половину переводили на бессывороточную среду с 0,1% БСА; Б. в бессывороточной среде, после чего половину оставляли на свежей среде того же состава, а половину переводили на среду с сывороткой. Каждый день в течение эксперимента часть клеток соскребали, замораживали и выделяли из них мембраны. Анализировали экспрессию pl30 и Т-кадгерина методом лигандного блоттинга с ЛНП (100 мкг/мл), нанося по 100 мкг мембранного белка на дорожку. ЛНП-связывающие белки детектировали козьими антителами против ЛНП и [и51]-мечеиными кроличьими антителами против иммуноглобулинов козы, получали авторадиограммы блотов и определяли оптическую плотность полос с помощью сканера.

Как видно из рис. 6, уровень экспрессии р130 и Т-кадгерина выходил на плато на 3 день, причем на бессывороточной среде экспрессия р130 и Т-кадгерина была примерно в два раза выше. При переводе клеток с бессыворогочной среды на среду с

10% ФБС экспрессия р130 и Т-кадгерииа значительно снижалась. Напротив, удаление сыворотки приводило к возрастанию уровня экспрессии двух этих белков. Таким образом, было показано, что сыворотка негативно влияет на уровень экспрессии и р 130 и Т-кадгсрина. Для того, чтобы выяснить, какой компонент сыворотки влияет на экспрессию этих белков, мы изучили влияние на нее холестерина, липопротеид-дефицитной сыворотки и факторов роста. Добавление к культивируемым клеткам холестерина не влияло на экспрессию р130 и Т-кадгерина, тогда как экспрессия классического ало-В,Е рецептора при этом практически полностью подавлялась. Нам не удалось обнаружить разницы в эффектах "полной" и липопротеид-дефицитной сыворотки на уровень экспрессии р 130 и'Т-кадгерина в ГМК, что говорит о том, что ингибирующее влияние сыворотки на экспрессию этих белков опосредуется факторами роста. Это предположение подтверждается также данными следующего эксперимента (рис.7).

% У. •/.

Рисунок 7. Подавление экспрессии р130 и Т-кадгерина факторами роста IGF, PDGF и EGF. Конфлюэнтные ГМК инкубировали в течение 2 суток в бсссывороточной среде с 0,1% БСА и затем добавляли в среду факторы роста. Через 12 часов клетки лизировали. Экспрессию pi 30 и Т-кадгерина оценивали методом лигакдного блоттинга. ЛНП-связывающие белки детектировали козьими антителами против ЛНП и [1251]-меченными кроличьими антителами против иммуноглобулинов козы, получали авторадиограммы блотов и определяли оптическую плотность полос с помощью сканера. На рисунке представлены данные по специфическому связыванию ЛНП, выраженные в процентах от связывания ЛНП на препарате клеток, которым в среду инкубации факторы роста не добавляли.

Конфлюэнтные ГМК инкубировали в течение 2 суток в бессывороточной среде и затем добавляли в среду факторы роста. Через 12 часов клетки лизировали и анализировали экспрессию белков методом лигандного блотгинга. Полученные данные свидетельствуют о том, что факторы роста в физиологическом диапазоне

концентраций вызывают значительное снижение экспрессии как р130, так и Т-кадгерина.

Таким образом удалось показать, что сыворотка одинаково снижает экспрессию и белка р130, и Т-кадгерина. Действующим началом этой негативной регуляции являются факторы роста. Сходство в регуляции экспрессии белка р130 и Т-кадгерина подтверждает предположение о том, что р 130 является предшественником Т-кадгерина.

Белок р130 и Т-кадгерин локализованы в тритон Х-100-нерастворимых комплексах низкой плотности, соответствующих кавеолярным доменам мембраны Основная часть ГФИ-белков локализуется в участках мембраны, богатых холестерином и сфинголипидами [Узапй е! а1., 1995]. Показано, что эти участки мембраны при 4*С нерастворимы в 1% тритоне Х-100 и за счет их низкой плотности могут быть отделены от большинства других участков плазматической мембраны ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы [Шап^ а1., 1995]. Мы обнаружили, что в мембранах медии аорты и культивируемых сосудистых ГМК белки р130 и Т-кадгерин концентрируются в нерастворимых тритоном Х-100 комплексах низкой плотности. Вместе с р 130 и Т-кадгерином концентрировались другие ГФИ белки - рецептор урокиназы, регу ля торный белок СБ59, а также такие сигнальные молекулы как а-субъединицы в-белков и киназы из Бгс-семейства. Здесь же присутствовал и маркерный, формирующий структуру кавеол белок кавеолин. При этом в данной фракции отсутствовали другие молекулы клеточной адгезии, присутствующие во фракции мембран ГМК: М-кадгерин и Ргинтегрины а также клатрин, белок, входящий в состав окаймленных ямок - структур принимающих участие в эндоцигозе (рис. 8). Таким образом, в этих участках мембран сконцентрированы молекулы, принимающие участие во внутриклеточной сигнализации. Т-кадгерин, являясь ГФИ-заякоренным белком, лишен трансмембранного домена и для передачи сигнала внутрь клетки нуждается в "адапторном" белке, передающем сигнал либо непосредственно в клетку, либо на трансмембранный белок. Механизм передачи сигнала от Т-кадгерина в клетку до настоящего времени остается невыясненным, но логично предположить участие в ней сигнальных молекул, которые солокализуются с ним в кавеолах (или "плотах").

Т-кядгсрии,

ЛНП-бдот

VI к м к

tu <

Лори» I MK

Кащчушн

м к

ГМК Рецептор

ypOKIIHiUl.i

м к

кДа -60

кДа

-130 - щш-"105 !"*

Т-кадгерки, иммуномло! м к- м К"

Лор га

Ш- - I'IJO """" Т-кадгерин

мк

кДя -22

Клатрин м к

ГМК

CD 59 ■ м к

кДа 180

Gs« м к

Шщвт -

I мк

С-Si r KIIIUI ш м к

кДа -50

к-Дя —20

1сДа - 60

ГМК

I мк

ГМК

Рисунок 8. Белки, «»локализующиеся с белком р130 и Т-кадгерином во фракции мембран низкой плотности нерастворимых в тритоне Х-100. На каждую дорожку наносили по 10 мкг белка. Для детекции кавеолина, клатрина, рецептора урокиназы, CD-59, Gas, киназ Src-семейства, интегрина ßl и N-кадгерина были использованы коммерческие антитела. Для детекции Т-кадгсрина использовали антипептидные антитела и ЛНП-блоттинг. В качестве вторых антител использовали конъюгаты антивидовых антител с пероксидазой хрена. Проявляли блоты с помощью хемилюминисцентной системы детекции, м - препарат плазматических мембран; к - препарат тритон-нерастворимой фракции мембран низкой плотности.

ВЫВОДЫ:

1. Мембранный белок с молекулярной массой 130 кДа (р 130) очищен из ткани медии аорты человека до гомогенного состояния. Определена его частичная аминокислотная последовательность, совпадающая с участком пролептида предшественника Т-кадгерина.

2. Получены антисыворотки против трех синтетических фрагментов Т-кадгернна. Все они распознают как р 130, так и Т-кадгерин и блокируют связывание липопротеидов с Т-кадгерином и р130.

3 Офаниченный трипсинолиз в присутствии Са2+ превращает р130 в белок, го электрофоретнческой подвижности совпадающий с Т-кадгерином. С помощью фосфолипазы С, специфически расщепляющей гликозилфосфоинозитиды. показано, что р!30. как и Т-кадгерин. расположен на поверхности клеток и закреплен на мембране посредством гликозилфосфатщшлинозитольной группы.

4. Экспрессия Т-кадгерина и р 130 проявляет одинаковую дозовую и временную зависимость от наличия факторов роста в среде культивирования гладкомышечных клеток. Содержание этих белков повышается в отсутствие факторов роста и снижается при действии факторов роста.

5 Т-калгерин и р130 обогащены в нерастворимой в тритоне кавсолярной фракции мембран гладкомышечных клеток. В этой же фракции локализованы а-субъединицы О-белков и Бгс-киназы, но отсутствуют [}|-интегрины и !М-кадгерин.

6. Полученные данные свидетельствуют о том, что липопротеид-связывающий белок р 130 является частично гтроцессированным предшественником Т-кадгерина закрепленным на клеточной мембране через гликозилфосфоинозитидный якорь и содержащим пропептид.

Материалы диссертации изложены в следующих печатных работах:

1. Кучьменко Е С., Бочков В Н., Стамбольский Д.В., Ткачук В.Л. Атипичные участки связывания липопротеидов низкой плотности в гладкомышечных клетках сосудов человека. Биохимия 59: 1340-1348, 1994.

2. Tkachuk V.A., Kuzmenko Y.S., Resink T.J., Stambolsky D.V., Bochkov V.N. Atypical low density lipoprotein binding site that may mediate lipoprotein-induccd signal transduction. Molecular Pharmacology 46:1129-1137, 1994.

3. Bochkov V.N., Tkachuk V.A., Philippova M P., Stambolsky D.V., Resink T.J. Ligand selectivity of 105 kDa and 130 kDa lipoprotein-binding proteins in vascular smooth rnusclc cell membranes is unique. Biochem. J. 317: 297-304, 1996.

4. Tkachuk V.A., Bochkov V.N., Philippova M.P., Stambolsky D.V., Kuzmenko K.S., Sidorova M.V., Molokoedov A.S., Spirov V.G., Resink T.J. Identification of atypical lipoprotein-binding protein from human aortic smooth muscle as T-cadherin. FEBS Letters, 421: 208-212, 1998.

5. Philippova M.P., Bochkov V.N., Stambolsky D.V., Tkachuk V.A. and Resink T.J. T-cadherin and signal-transducing molccules co-localize in caveolin-rich membrane domains of vascular smooth muscle cells. FEBS Letters, 429: 207-210, 1998

6. Kuzmenko Ye.S.. Stambolsky D.V., Kern F., Bochkov V.N., Tkachuk V.A., Resink T.J. Characteristics of smooth muscle ccll lipoprotein binding proteins (pl05/pl30) as T-cadlieiin and regulation by positive and negative growth regulators. Biochem. Biophys. Res. Commun., 246: 489-494, 1998.

7. Stambolsky D.V., Kuzmenko Ye.S., Philippova M.P., Bochkov V.N., Bespalova Zh.D.. Azmuko A., Kashirina N.M., Vlasik T.N., Tkachuk V.A., Resink T.J. Identification of 130 kDa cell-surface LDL-binding protein from smooth muscle cells as a partially processed T-cadherin precursor. Biochim. Biophys Acta, 1998 (submitted).

8. Сидорова M.B., Молокоедов А.С., Азьмуко A.A., Стамбольский Д.В., Каширина Н.М., Бочков В.II., Ткачук В.А., Беспалова Ж.Д. Синтез и изучение аитигенных свойств пептидных фрагментов Т-кад1^рииа. Биоорганическая химия. 1998 (в печати).

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Стамбольский, Дмитрий Викторович, Москва

РОССИЙСКИЙ КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНО -ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ КОМПЛЕКС МЗ РФ НАУЧНО ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ КАРДИОЛОГИИ

Лаборатория молекулярной эндокринологии

На правах рукописи

СТАМБОЛЬСКИЙ ДМИТРИЙ ВИКТОРОВИЧ

ЛИПОПРОТЕИД-СВЯЗЫВАЮЩИЙ 130 кДа БЕЛОК ИЗ ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ КЛЕТОК СОСУДОВ ЧЕЛОВЕКА: ИДЕНТИФИКАЦИЯ, РАСПРЕДЕЛЕНИЕ В МЕМБРАНЕ И РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ

03.00.25 - Клеточная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник НИИЭК РКНПК МЗ РФ В.Н.Бочков

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор, член-корр. РАН В.А.Ткачук

Москва - 1998 г.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений........................................................................................................................................................................................................5

Введение............................................................................................................................................................................................................................................7

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Молекулы клеточной адгезии

1.1. Иммуноглобулиновое суперсемейство................................................................................10

1.2. Интегриновое семейство............................................................................................................................12

1.3. Селектиновое семейство..............................................................................................................................13

1.4. Кадгериновое суперсемейство............................................................................................................14

1.4.1. Классические кадгерины..................................................................................................15

1.4.2. Десмосомальные кадгерины........................................................................................17

1.4.3. Протокадгерины и родственные протокадгеринам

белки....................................................................................................................................................................................18

1.4.4. Родственные кадгеринам белки ..........................................................................19

1.4.5. Участие кадгеринов в сигнализации................................................................19

1.5. Т-кадгерин..............................................................................................................................................................................20

2. ГФИ-белки..........................................................................................................................................................................................................21

2.1. Участие ГФИ-белков в сигнализации........................................................................................23

2.2. Возможное участие ГФИ-белков в реализации

гормоноподобных эффектов липопротеидов..............................................................................23

3. Участки мембраны богатые гликолипидами и холестерином..................................24

3.1. Кавеолы и кавеолин................................................................................................................................................26

3.2. Обнаруженные в составе кавеол сигнальные молекулы..............................28

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Материалы и методы

1.1. Культивирование клеток......................................................................33

1.2. Выделение липопротеидов..........................................................................................................................33

1.3. Получение поликлональных антител на ЛНП..............................................................34

1.4. Получение Fab-фрагментов антител..............................................................................................34

1.5. Получение конъюгатов синтетических пептидов с пероксидазой хрена..............................................................................................................................................................................................................35

1.6. Получение поликлональных антител против пептидов Т-кадгерина

1.6.1. Иммунизация кроликов........................................................................................................35

1.6.2. Иммунизация мышей................................................................................................................36

1.7. Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии додецил -сульфата натрия, лигандный блоттинг и иммуноблоттинг .. 36

1.8. Конъюгирование антител с пероксидазой хрена..................................................38

1.9. Выделение липопротеид-связывающего белка 130 кДа (р130) из медии аорты человека

1.9.1. Выделение мембран медии аорты человека........................39

1.9.2. Солюбилизация белков мембран медии аорты детергентом CHAPS........................................................................................................................................40

1.9.3. Ионообменная хроматография на DEAE-Toyopearl................40

1.9.4. Zn2+ -хелатная хроматография....................................................................................41

1.9.5. Препаративный электрофорез в полиакриламидном

геле в присутствии додецилсульфата натрия........................................................42

1.9.6. Электроэлюция белков из полиакриламидного геля .... 42

1.9.7. Препаративная изоэлектрофокусировка................................................43

1.10. Определение частичной аминокислотной последовательности белка р130............................................................................................... 44

1.11. Определение концентрации белка................................................ 44

1.12. Выделение мембран культивируемых клеток.............................. 45

1.13. Получение препарата тритон-нерастворимых доменов низкой плотности из клеточных мембран и мембран медии аорты................ 45

1.14. Материалы..................................................................................... 46

2. Результаты исследования

2.1. Очистка белка р130 и его идентификация

2.1.1. Очистка р130 из мембран медии аорты............................ 47

2.1.2. Определение частичной аминокислотной последовательности белка р130.................................................................. 51

2.2. Использование антител для идентификации белка р130

2.2.1. Выбор аминокислотных последовательностей для получения антител против синтетических фрагментов про-Т-кадгерина..................................................................................... 54

2.2.2. Иммуноблоттинг препарата из мембран медии аорты человека, обогащенного р130 и Т-кадгерином и мембран культивируемых ГМК с использованием полученных антипептидных антител.............................................................. 56

2.2.3. Влияние кроличьих поликлональных антител против синтетических фрагментов Т-кадгерина на связывание ЛНП с кадгерином и р130 при лигандном (ЛНП-) блоттинге............. 56

2.2.4. Влияние Fab-фрагментов антител против апо-В100 на связывание ЛНП с р130 и Т-кадгерином................................... 58

2.3 Использование ферментативной обработки культивируемых ГМК из сосудов человека для идентификации белка р130

2.3.1. Обработка клеток, экспрессирующих р130 и Т-кадгерин, трипсином в присутствии кальция........................ 61

2.3.2. Обработка клеток, экспрессирующих р130 и Т-кадгерин, ГФИ-специфичной фосфолипазой С..................... 61

2.4. Влияние сыворотки и факторов роста на экспрессию р130 и Т-кадгерина в культивируемых ГМК из медии аорты человека

2.4.1. Влияния сыворотки на экспрессию р130 и Т-кадгерина

в культивируемых ГМК из медии аорты человека.................... 63

2.4.2. Влияния холестерина на экспрессию р130 и Т-кадгерина в культивируемых ГМК из медии аорты человека .. 65

2.4.3. Влияния липопротеид-дефицитной сыворотки на экспрессию р130 и Т-кадгерина в культивируемых ГМК из медии аорты человека................................................................ 67

2.4.4. Влияния факторов роста на экспрессию р130 в культивируемых ГМК из медии аорты человека...................... 67

2.4.5. Индивидуальный анализ экспрессии р130 и Т-кадгери-на в культивируемых ГМК из медии аорты человека под действием сыворотки и факторов роста.................................... 69

2.5. Локализация р130 и Т-кадгерина в кавеолярных мембранных доменах

2.5.1. Локализация р130 и Т-кадгерина в нерастворимых в тритоне Х-100 мембранных комплексах низкой плотности..... 69

2.5.2. Колокализация р130 и Т-кадгерина в кавеолярных

мембранах с молекулами, участвующими в сигнализации....... 74

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Очистка и определение частичной аминокислотной последовательности белка р130.......................................................................................................... 77

2. Специфичность антител, полученных на синтетические пептиды из последовательности про-Т-кадгерина.............................................................. 78

3. Обработка культивируемых ГМК трипсином в присутствии кальция и ГФИ-специфичной фосфолипазой С................................................................ 78

4. Влияние сыворотки и ее компонентов на экспрессию р130 и Т-кадгерина 79

5. Локализация р130 и Т-кадгерина в клеточной мембране............................ 79

ВЫВОДЫ................................................................................................................... 82

Список литературы..................................................................................................... 84

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГМК - гладкомышечные клетки

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

кДНК - комплементарная ДНК

ЛВП - липопротеиды высокой плотности

ЛНП - липопротеиды низкой плотности

ЛОНП - липопротеиды очень низкой плотности

ПААГ - полиакриламидный гель

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

ВНТ - butylated hydroxytoluene (бутилированный гидрокситолуен)

2,6-бис(1,1 диметил-этил)-4-метилфенол

САМ - cell adhesion molecule

СЕА - carcino-embrionic antigen

CHAPS - 3-[(3-[холамидопропил)диметиламмоний]

-1 -пропансульфонат

CSF - colony-stimulating factor, колонии стимулирующий фактор

EGF - epidermal growth factor, эпидермальный фактор роста

FGF - fibroblast growth factor, фактор роста фибробластов

GDNF - glial-cell-line derived neurotrophic factor - нейротрофный фактор

секретируемый глиоцитами

HSP - heat shock protein, белок теплового шока

IGF - insulin-like growth factor, инсулиноподобный фактор роста

MOPS - морфолинопропансульфоновая кислота

N-CAM - neural cell adhesion molecule, молекула клеточной адгезии,

описанная в нервной ткани

NTN - neuroturin - нейротурина

PAF - platelet activating factor, фактор активации тромбоцитов

PBS - phosphate buffered saline, фосфатный солевой буфер

PDGF - platelet-derived growth factor, тромбоцитарный фактор роста

PMSF - фенил мети л сульфонил фторид

PVDF

SDS

SRE

TBS

TEMED

VCAM

polyvinylidene difluoride, поливинилиден дифторид додецилсульфат натрия

sterol-regulated elements; элементы генома, регулируемые холестерином

tris buffered saline, трисовый солевой буфер ]Ч[,М,М',К'-тетраметилэтилендиамин

vascular cell adhesion molecule, молекула клеточной адгезии, описанная в сосудах

Введение.

Долгое время липопротеиды плазмы крови рассматривались только как транспортная система для переноса липидов в организме.

Однако к настоящему времени накопилось много данных о действии липопротеидов на клетку, которое не может быть объяснено только переносом липидов. Было показано, что липопротеиды влияют на тонус сосудов, действуя как непосредственно на гладкомышечные клетки [Galle et al., 1990; Kugiyama et al., 1990], так и на эндотелий [Cohen at al., 1988; Jacobs et al., 1990; Tomita et al. 1990], активность тромбоцитов [Beitz and Mest, 1986; Ardlie et al., 1989] и моноцитов [Quinn et al., 1987; Kelley et al., 1988; McMurray et al., 1993], образование активных метаболитов арахидоновой кислоты [Triau et al., 1988; Pomerantz et al., 1984; Buhler et al., 1991], секрецию сурфактанта альвеолоцитами [Voyno-Yasenetskaya et al., 1993], синтез супероксид-радикала макрофагами [Mohan and Jacobson, 1995]., метаболизм фактора активации тромбоцитов (PAF) [Stafforini et al., 1987; Ostermann et al., 1989], иммунный ответ [Kiessling et al., 1991; Huang et al., 1995; Hui et al., 1980] и электрофизиологическую активность сердца [Adamantidis et al., 1991], деление клеток [Ozer et al., 1993; Weisser et al., 1993; Bjorkerud and Bjorkerud, 1994; Libby et al., 1985], синтез ДНК и экспрессию различных белков [Oikawa et al., 1987; Scott-Burden et al., 1989; Hahn et al., 1991; Ко et al., 1995].

Также было показано, что липопротеиды, подобно гормонам активируют системы вторичных посредников. Липопротеиды активируют фосфоинозитидный обмен [Bochkov et al., 1993; Voyno-Yasenetskaya et al., 1993; Mendez et al., 1990] и вызывают выход кальция из внутриклеточных депо [Bochkov et al., 1991b; Bochkov et al., 1992] и вход кальция извне в клетку [Tan et al., 1993]. Липопротеиды негативно влияют на синтез циклических нуклеотидов [Parhami et al., 1993 Schmidt et al., 1990

Bruckdorfer et al., 1984]. Было показано, что в реализации гормоноподобных эффектов липопротеидов принимают участие G-белки [Бочков и др., 1994 Sachinidis et. al., 1997 Pian and Dobbs, 1997]. Показано, что липопротеиды стимулируют активацию киназных каскадов [Sachinidis et. al., 1997; Kusuhara et al., 1997].

Таким образом было показано, что липопротеиды стимулируют фосфоинозитидный обмен, вызывают повышение внутриклеточной концентрации кальция, как за счет выхода из внутриклеточных депо, так и за счет входа кальция в клетку, влияют на синтез циклических нуклеотидов. Также было продемонстрировано, что в некоторых случаях эффекты липопротеидов опосредуются G-белками. Было показано участие в реализации эффектов липопротеидов различных киназных каскадов, что позволяет объяснить влияние липопротеидов на экспрессию различных белков и клеточную пролиферацию.

Механизм проведения сигнала от липопротеидной частицы в клетку до сих пор не описан. В частности, не известен рецептор, опосредующий гормоноподобные эффекты ЛНП.

Ранее нами был описан новый участок связывания для ЛНП на сосудистых ГМК. Параметры связывания ЛНП с которым, хорошо коррелировала с параметрами активации липопротеидами систем вторичных посредников [Tkachuk et al., 1994]. Методом лигандного (ЛНП-) блоттинга мы обнаружили два ЛНП-связывающих белка [Kuzmenko et al., 1994] и показали, что их лигандная специфичность отличается от таковой известных липопротеидных рецепторов [Bochkov et al., 1996]. В дальнейшем мы очистили до гомогенного состояния липопротеид-связывающий белок массой 105 кДа и идентифицировали его как Т-кадгерин - член кадгеринового суперсемейства [Tkachuk et al., 1998]. Природа 130 кДа ЛНП-связывающего белка до настоящего момента оставалась невыясненной. In vitro в искусственной конструкции (на клетках

хомячка, трансфецированных Т-кадгерином курицы) была показана одновременная экспрессия зрелой формы и предшественника Т-кадгерина [Verstal and Ranscht, 1992]. Мы предположили, что это возможно и in vivo, и 130 кДа ЛНП-связывающий белок из ГМК медии аорты человека может оказаться предшественником зрелой формы Т-кадгерина. Известно, что Т-кадгерин является молекулой клеточной адгезии, прикрепленной к мембране с помощью гликозилфосфоинозитидного (ГФИ)- якоря. К настоящему времени показано участие многих молекул клеточной адгезии [Rosales et al., 1995] и предполагается участие некоторых ГФИ-белков (рецептора урокиназы и CD 14) [Petty and Todd III, 1995] в процессах внутриклеточной сигнализации. Механизмы этих процессов до настоящего времени достаточно полно не описаны. Мы предполагаем, что 130 кДа липопротеид-связывающий белок может быть предшественником зрелой формы Т-кадгерина и что Т-кадгерин возможно принимает участие в передаче сигнала от липопротеидов в клетку.

Целью данной работы была характеристика мембранного липопротеид-связывающего белка, имеющего молекулярную массу 130 кДа в ГМК кровеносных сосудов человека. В связи с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Выделить, очистить до гомогенного состояния и идентифицировать путем определения частичной аминокислотной последовательности липопротеид-связывающий белок с молекулярной массой 130 кДа.

2. Изучить влияние сыворотки и ее компонентов на экспрессию белка р130 и Т-кадгерина в сосудистых ГМК человека.

3. Получить антитела против белка р 130 и с их помощью выяснить его распределение в клеточной мембране.

Обзор литературы

1. Молекулы клеточной адгезии

Описанный и очищенный нами липопротеид-связывающий белок был идентифицирован как Т-кадгерин - уникальный член кадгеринового семейства, связанный с клеточной мембраной через гликофосфоинозитидный якорь [Tkachuk et al., 1998].

В многоклеточных организмах каждая клетка связана с другими клетками и межклеточным матриксом как физически, так и функционально. Эти взаимодействия опосредуются рядом молекул. Большинство таких молекул в настоящий момент может быть отнесено к одному из четырех семейств молекул адгезии: иммуноглобулиновому, интегриновому, селектиновому или кадгериновому [Albelda, 1993]. Схематически строение молекул клеточной адгезии четырех перечисленных семейств представленно на схеме 1.

По последним данным, функции молекул клеточной адгезии не ограничиваются формированием контактов между клетками, они могут принимать участие в проведении сигнала в клетку [Rosales et al., 1995].

1.1. Иммуноглобулиновое суперсемейство.

Иммуноглобулиновое суперсемейство включает в себя целый ряд молекул, общей чертой которых является наличие иммуноглобулиновых доменов - структур, содержащих от 70 до 110 аминокислот, организованных в 7-9 Р-складчатых слоев. Каждая субъединица стабилизирована дисульфидной связью. Большинство членов

Мембрана

< < о и

Иммуноглобулиновое суперсемейство

Классический кадгерин

Интегрины Селектины

Кадгерины

Схема 1. Структура молекул клеточной адгезии. Иммуноглобулиновое суперсемейство включает множество членов. В структуру всех членов этого суперсемейства входят несколько иммуноглобулиновых доменов, стабилизированных дисульфидными связями. Интегрины - гетеродимерные рецепторы, состоящие из нековалентно-связанных а и |3 субъединиц. Все субъединицы имеют трансмембранный и (за исключением р4) короткий цитоплазматический домены, а-субъединица образует глобулярный домен, содержащий участок связывания кальция важный для связывания лиганда Некоторые интегрины через цитоплазматический домен взаимодействуют с белками фокальных контактов (такими как талин и а-актин) и через них с цитоскелетом. Селектины имеют Т\[-концевой домен гомологичный животным кальций-зависимым лектинам, домена подобного рецептору ЕОБ, нескольких подобных регуляторным компонентам комплимента доменов, трансмембранного домена и короткого цитоплпзматического домена. Основной характерной чертой кадгеринов является наличие в их структуре нескольких кадгериновых повторов имеющих некоторую структурную го