Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метаболизм множественно-модифицированных липопротеидов низкой плотности в гладкомышечных клетках непораженной интимы аорты человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Метаболизм множественно-модифицированных липопротеидов низкой плотности в гладкомышечных клетках непораженной интимы аорты человека"

| Л ПОП .-л и

На правах рукописи

НАЗАРОВА ВЯАДА ЛЕОНИДОВНА

МЕТАБОЛИЗМ МНОЖЕСТВЕННО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ЛИПОПРОТ.ЕИДОВ НИЗКОИ ПЛОТНОСТИ В ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ КЛЕТ.КАХ НЕПОРАЖЕННОЙ ИНТИМЫ АОРТЫ

ЧЕЛОВЕКА

03.00.04 - БИОХИМИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1995

Работа выполнена в Институте Экспериментальной Кардиологии Кардиологического Научного Центра РАМН.

Научные руководители:

д.б.н, профессор, Гельдиева Б.С. к.б.н., с.н.с., Тертов В.В.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Панкин. В.З. доктор медицинских наук, профессор Макаров В.А.

Ведущее учреждение: Научно-исследовательский Институт Физико-химической медицины МЗ РФ.

Защита состоится "....."............1995 г.

в "....." час. на заседании диссертационного совета Д 001.45.02.

в Гематологическом научном центре РАМН по адресу: 125167, Москва, Новозыковский проезд, д. 4а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РАМН Автореферат разослан ".....я...........1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Реук В.Д.

ОДШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЕАЕ01Ы

Актуальность проблемы. В последние годы достигнуты значительные успехи в диагностике и лечении заболеваний, причиной которых являются атеросклеротическое поражение магистральных сосудов человека. Однако, несмотря на определенный прогресс в этой области кардиологии, сердечно-сосудистая патология занимает ведущее место в структуре смертности и инвалидности населения высокоразвитых стран. Недостаточная эффективность методов профилактики и терапии атеросклероза объясняются, среди прочего, отсутствием исчерпывающих знаний механизмов атерогенеза на клеточном и молекулярном уровне, что обуславливает необходимость дальнейшего изучения процессов атерогенеза.

Накопление эфиров холестерина в клетках интимы крупных артерий (гладкомышечные клетки, макрофаги) - одно из наиболее ранних проявлений атеросклероза (Cookson, 1971; Geer & Haust, 1972; Pearson, 1976). Однако, несмотря на проведение интенсивных исследований, механизм внутриклеточного отложения липидов остается невыясненым. Показано, что источником накапливающихся в сосудистой стенке липидов ЯВЛЯЮТСЯ липопротеиды НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ (ЛПНП) (Goldstein et al. , 1979; chen et al., 1977). Обнаружено также, что нативные ЛПНП, выделенные из крови здоровых лиц, не вызывают увеличения содержания ЛИПИДОВ В культивируемых клетках (Shechter et al., 1981; Brown et al., 1983,1986). Полученные в различных лабораториях данные свидетельствуют о том, что внутриклеточная аккумуляция липидов наблюдается лишь в случае использования химически модифицированных ЛПНП (Goldstein et al., 1979; Haberland et al., 1984,1987,1988). Однако, несмотря на многочисленные работы, посвященные исследованию клеточного метаболизма таких липопротеидов в настоящее время не существует экспериментально обоснованной теории, объясняющей механизмы отложения липидов в клетках интимы сосудов человека при атеросклерозе. Необходимо учитывать, что ни одна из описанных форм in vitro модифицированных ЛПНП, не встречается в организме человека. С другой стороны, в настоящее время известно несколько видов модифицированных in vivo ЛПНП, а именно,

множественно-модифицированные (Tertov et al., 1992),

- г -

гликозилированные (Lyons et al., 1987), "мелкие, плотные" (Austin et al., 1988), электроотрицательные ЛПНП (Avogaro et al.,1988)], обнаруженных в крови людей. Показано, что все типы модифицированных ЛПНП, встречающиеся в крови человека, вызывают возрастание свободного и этерифицированного холестерина в культивируемых клетках. Таким образом, наиболее актуальным в настоящий момент является изучение in vivo модифицированных ЛПНП, а также особенностей их метаболизма, обуславливающих накопление липидов в клетках интимы сосудов человека.

Представленная работа посвещена исследованию клеточного метаболизма множественно-модифицированных ЛПНП в первичной культуре клеток непораженой « интимы аорты человека.

Множественно-модифицированные ЛПНП являются одной из наиболее изученных форм in vivo модифицированных ЛПНП и обладают выраженной способностью индуцировать возрастание свободного и этерифицированного холестерина в культивируемых клетках, в частности в первичной культуре клеток интимы аорты человека (Tertov et al., 1992). Эти ЛПНП впервые были обнаружены в крови больных ишемической болезнью сердца (Tertov et al.1990,1992). Основной особенностью таких ЛПНП является низкое содержание сиаловой кислоты как в белковой, так и в липидной части липопротеидных частиц (Tertov et ai.,1992). В свою очередь, первичная культура клеток интимы аорты человека представляет особый интерес в связи с важнейшей ролью интимы крупных сосудов в формировании очагов атеросклеротического поражения. Следует отметить, что подавляющее большинство (свыше 87*) клеток, культивируемых из непораженной интимы аорты человека представлены модифицированными гладкомышечными хлетками (Andreeva et al.,1992). Однако, до сих пор неизвестны ни рецепторные пути захвата, ни особенности клеточного метаболизма In vivo модифицированных ЛПНП в гладкомышечных клетках интимы аорты человека.

ЦЕЛЬ. РАБОТЫ: Целью настоящей работы явилось исследование взаимодействия множественно-модифицированных ЛПНП, выделенных из крови пациентов с коронарным атеросклерозом, с В,E-рецепторами и скэвенджер-рецепторами клеток, а также изучение метаболизма множественно-модифицированных ЛПНП, в гладкомышечных клетках непораженной интимы аорты человека.

1ШЗИ:

i. Исследовать взаимодействие множественно-модифицированных и in vitro десиалировашшх ЛПНП с В,Е-рецепторами фибробластов кожи человека.

IX. Изучить взаимодействие множественно-модифицированных и in vitro десиалировашшх ЛПНП со скэвенджер-рецепторами макрофагов линии P388D!-

ill. Провести сравнительный анализ связывания нативных и множественно-модифицированных ЛПНП с гладкомышечными клетками непораженной интимы аорты человека.

IV. Провести сравнительное исслёдование захвата и деградации нативных, множественно-модифицированных и in vitro модифицированных (окисленных и ацетилированных) ЛПНП в гладкомышечных клетках интимы непораженной аорты человека.

V. Исследовать наличие скэвенджер-рецептора в гладкомыяечпик клетках непораженной аорты человека.

Научная новизна. В представленной работе продемонстрировано, что метаболизм и клеточное связывание множественно-модифицированных ЛПНП, выделенных in vivo из крови больных коронарным атеросклерозом, опосредованы двумя типами ЛПНП-рецепторов - В,Е-рецепторами к нативным ЛПНП и скэвенджер-рецепторами к модифицированным ЛПНП. Показано, что значительную роль во взаимодействии множественно-модифицированных ЛПНП с ЛПНП-рецепторами клеток играет содержание сиаловой кислоты в липопротеидной частице. Так, ЛПНП со сниженнным уровнем сиаловой кислоты, в отличие от нативных- ЛПНП, обладают способностью взаимодействовать не только с В,Е-рецепторами, но и со скэвенджер-рецепторами клеток. При исследовании взаимодействия in vivo выделенных множественно-модифицированных ЛПНП с гладкомышечными клетками интимы аорты человека, накопление липидов в которых, является одним из наиболее ранних признаков атеросклеротического поражения, установлено, что связывание и захват множественно-модифицированных ЛПНП гладкомышечными клетками интикы аорты человека достоверно превышают связывание и захват нативных ЛПНП. Впервые с помощью иммуноцитохимических метов продемонстрировано

наличие скзвенджер-рецептора в гладкомышечных клетках аорты человека, что, в своп очередь, может обуславливать повышенное связывание и захват множественно-модифицированных ЛПНП гладкомышечными клетками интимы аорты человека. Показано, что в гладкомышечных клетках интимы деградация множественно-модифицированных ЛПНП значительно снижена, по сравнение нативными ЛПНП. Представлены данные, свидетельствующие, что причинами внутриклеточного накопления липидов в гладкомышечных клетках интимы аорты человека при атеросклерозе могут быть повышенный захват и низкая деградация циркулирующих в крови больных ишемической болезнью сердца, множественно-модифицированных ЛПНП в вышеуказанных клетках.

Теоретическое и практическое значение. Обнаруженные различия в метаболизме множественно-модифицированных и in vitro

модифицированных ЛПНП в клетках, культивируемых непосредственно из интимы аорты человека, демонстрируют целесообразность использования in vivo модифицированных ЛПНП для изучения клеточных механизмов атерогенеза у человека. Полученные данные, свидетельствующие о наличие скэвенджер-рецептора в гладкомышечных клетках интимы аорты человека расширяют представления о путях поступления модифицированных Форм ЛПНП в клетки указанного типа. Выявленные особенности метаболизма множественно-модифицированных ЛПНП в гладкомышечных клетках интимы непораженной аорты человека - повышенние клеточного связывания и захвата в сочетание со сниженной деградацией таких ЛПНП - позволяют по новому взглянуть на причины накопления нейтральных липидов в клетках интимы сосудов человека. Представленные в работе данные могут найти применение в дальнейших исследованиях механизмов атерогенеза.

Апробация работы. Диссертация апробирована на межлабораторном семинаре Института кардиологии КНЦ РАНН (Москва, 1995). Материалы работы гбыли доложены на 8-м Международном симпозиуме по липидам (Дрезден, 1994), на Конференции по проблемам атеросклероза (г.Воронеж, 1994). Материалы диссертации изложены в 3 публикациях.

Структура и ойьек Работы. Рукопись диссертации состоит из

разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение", "Заключение", "Выводы" и "Список литературы". Общий объем работы составляет 128 страниц машинописного текста, включая 19 рисунков, 4 таблицы, и список цитируемой литературы из 203 названий.

НЛТЕРИЛЛН И НЕШПЫ ИССЛЕДОВАНИЯ^ В работе была использована кровь мужчин в Еозрасте от 35 до 50 лет, больных ишемическоп болезнью сердца (ИБС), со стенокардией напряжения ФК ii-iv [campeau, 1976], и здоровых лиц, у которых отсутствовали признаки ИБС в анамнезе и при медицинском обследовании. Плазму и сыворотку крови получали стандартным способом. Липопротеид-дефицитную сыворотку и фракцию липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) получали методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности NaBr [Lindgren, 1975]. Содержание белка в препаратах липопротеидов и в клетках определяли по методу Lowry [1951] с модификациями. Иммобилизацию агглютинина рицина %20 ,1а ВгС^-актив1юоватюй агарозе проводили по методу Tertov et al. [1990]. Подфракции нативных и множественно-модифицированных ЛПНП разделяли МеТОДОМ аффИННОЙ Хроматографии ПО Tertov et al (1990). ЛПНП, десиалированные in vitro получали путем обработки

нативных ЛПНП, выделенных из сыворотки крови здоровых лвд, агароза-связанной нейраминидаэоЯ по методу Camejo et' ai.(1985). Содержание сиаловой КИСЛОТЫ В ЛПНП измеряли ПО методу Harren (1958) . ЛПНП ацетилировали уксусным ангидридом по методу Basu et al. (1976). Окисленные ЛПНП получали путем инкубирования препаратов ЛПНП в присутствии 10"5М CuS04 по методу Steinbrecher et al. (1999) . Препараты 1251-меченых ЛПНП получали по методу Shepherd et al. (1976) С использованием реактивов фирмы Sigma Chemical Company (St. Louis, СИЛ). Гладкомышечные клетки интимы аорты человека выделяли из аорт мужчин и женщин в возрасте 40-65 лет через 2-3 часа после внезапной смерти. Субэндотелиальные гладкомышечные клетки выделяли из непораженных участков интимы аорты человека с помощью коллагеназы и культивировали в среде 199 в соответствии с методом Орехова и сотр. (1984). Для экспериментов использовали 7-дневную первичную культуру клеток. Фибробласты кожи человека, любезно предоставленные доктором С.Н.Преображенским, культивировали в среде dmem. в экспериментах

использовали культуры между 5-ым и 10-ым пассажами. Культура мышиных макрофагов P388Dlt выделенных из мьпией линии dba/2 была любезно предоставлена доктором via, d.p. из Бэйлоровского медицинского колледжа (Хьюстон, США). Макрофаги P388D} культивировали в среде RPMi 1640. . Экстракцию суммарных липидов из клеток проводили смесью гексан/изопропанол (3:2) по Нага and Radln (1978). Нейтральные липиды разделяли методом тонкослойной хроматографии на пластинах silica gel 60 (Е. Merck, Darmstadt, Германия). Количество липидов измеряли сканирующей денситометрией (Orekhov et al., 1985). Для изучения связывания 1251-меченных ЛПНП клетки инкубировали в течении 2 часов при 4°С с 10 мкг/мл 1251-меченных ЛПНП в присутствии или отсутствии избытка 'конкурирующих немеченных ЛПНП. После промывки клетки растворяли в 0.5 мл 0.1 N NaoH и просчитывали интенсивность гамма-изучения на гамма-счетчике 1272 "Clinigamma" lkb (lkb, Швеция). В экспериментах по изучению захвата и деградации ЛПНП клетки инкубировали в среде, содержащей 10 мкг/мл 1251-меченных ЛПНП, в присутствии или отсутствии избытка конкурирующих немеченных ЛПНП, при 37°С в СОз-инкубаторе. Для измерения количества захваченных ЛПНП клетки отмывали, растворяли в 0.1 N NaOH и измеряли интенсивность гамма-излучения. Количество деградировавших 1251-ЛПНП расчитывали по интенсивности гамма-излучения [1251]монойодтирозина, выделившегося в инкубационную среду. Электрофорез белковых препаратов мембранной фракции макрофагов P388DJ проводили в полиакриламидном геле (ПАЛГ) с использованием буферной системы Laemii (1970). Связыание ЛГОЩ с белками мембранной фракции макрофагов проводили с использованием процедуры иммуноблотинга. Для визуализации рецепторного связывания ЛПНП использовали ABC-метод с пероксидазомеченными антителами. Локализацию скэвенджер-рецептора в гладкомышечных клетках изучали иммуноцитохимически с использованием ABC-метода. Антитела против скэвенджер-рецептора человека были любезно предоставлены доктором via, d.p. из Бэйлорвского медицинского колледжа, США. Для статистической обработки данных использовали параметрические (двусторонний t-тест) и непараметрические (ранговые методы по wiicoxon и wite-Hann-whitey) методы с использованием пакета прикладных статистических программ bmdp (Dixon & Brown, 1977).

РЕЗУЛЬТАТЫ.

гнодийииишаашшх дипотзотеидов низкой платности с й)иГ)Робластов кожи аеложла^. 1. Связывание, захват и деградация обработанных нейраминидазой липопротеидов низкой плотности фибробластами кожи человека.

При инкубировании с 1251-меченными лцнП фибробласты кожи человека связывали равные количества нативных и десиалкрованных

1251-лпкП: за 2-часа инкубации связывание нативных 125х-ЛПНП на мг клеточного белка составляло 5.8 нг, а связывание обработанных нейраминидазой

1251_лпнП - б. О нг, соответственно. 20-кратные

избытки немеченных нативных и обработанных нейраминидазой ЛПНП с одинаковой эффективностью ингибировали связывание нативных 1251_лпнп (Phc.IA). Так, связывание нативных 1251-ЛШШ снижалось на 861 в присутствие 20-кратного избытка немеченных нативных ЛПНП и на 82» - в присутствие ' немеченных

обработанных нейраминидазой ЛПНП (Рисг.1А). Аналогичная хартина была получена при изучении связывания фибробластами 1251~ЛПНП, обработанных нейраминидазой, в присутствие немеченных нативных и обработанных нейраминидазой ЛПНП (Рис.1Б). В присутствие 20-кратного избытка немеченных нативных ЛПНП связывание обработанных нейраминидазой 1251-ЛПНП фибробластами снижалось на 86.5Х, а в присутствие равного избытка немеченных обработанных нейраминидазой ЛПНП - на 82.ОХ (РисДБ).

Соответствующие результаты были получены при изучении захвата и

100Я

п

X 80

с

60

X ,

л к 40

X с;

£ в) о а го

Г t-

о X 0

2 • о X

1Л н

N о 1007.

а) s г? 80

X

га во

а

л 40

а

со го

и 0

в

ОНР

ЛПНП

Конкурирующие ЛПНП Рис.1 Связывание нативных обработанных нейраминидазой фибробластами кожи человека.

Фибробласты инкубировались в течение 2 часов при 4°С с 10 мкг/мл ,351-н-ЛПНП 1РИС.1А) и/нл» с 10 ист/ил т|-смр-ЛПНП (Рис.1Б) в присутствие 200 мкг/ил немеченных конкурирующих н-ЛПНП и/или онр-ЛПНП. За 100% приняты значения связывания т1-ЛПНП в отсутствие конкурентов -5.8 нг/ыг белка для н-ЛПНП и 6.0 чг/иг белка для онр-ЛПНП. Содержание сналовоЛ кислоты « м-ППНП - 27.2 нмоль/мг белка, ■ онр-ЛПНП -8.9 нмоль/мг белка.

деградации обработанных нейраминидазой 1251-ЛПНП фибробластами кожи человека в присутствие немеченных конкурентов.

2. Связывание, захват и деградация множественно-модифицированных липоротеидов низкой плотности фибробластами кожи человека. Как

N

следует из данных, приведенных в Таб.1, связывание фибробластами нативных 1251_лпнп в 2 раза превышало связывание множественно-модифицированных 1251-ЛПШ1. При добавлении в инкубационную среду 20-кратного избытка нативных немеченных ЛПНП связывание 1251-меченных нативных и/или множественно-модифицированных ЛПНП снижалось в 10 раз, в обоих случаях. Тогда как, 20-кратный избыток немеченных множественно-модифицированных ЛПНП подавлял связывание множественно-модифицированных 1251-ЛПНП в 10 раз, а связывание нативных 125Х-ЛПНП только в 4 раза (Таб.1).

ТАБЛИЦА1. ВЗАИМО ДЕЙСТВИЕ 125Х-НЕЧЕННЬК НАТИВНЫХ И МНОЖЕСТВЕННО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ЛПНП С ФИБРОБЛАСТАМИ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА.

Конкурент нЛПНП ммЛПНП 1251-нЛПНП 1251-ММЛ11НП СВЯЗЫВАНИЕ ^25х-ЛПНП (нг/мг белка/2ч) 7.8+0.2 3.5+0.2 0.6+0.1* 0.3+0.1* 2.0+0.1* 0.3+0.1*

Конкурент нЛПНП ммЛПНП Конкурент ЗАХВАТ 1251-ЛШШ (нг/мг белка/5ч) 66.1+7.6 61.5+3.3 4.6+0.5* 14.7+2.8* 45.8+1.2* 30.9+3.3* ДЕГРАДАЦИЯ 1251-ЛПНП (нг/мг белка/5ч)

136.4+9.8 121.4+8.0

нЛПНП 20.0+2.0* 47.6+12.4*

ммЛПНП 86.5±6.7* 60.0+14.4*

нЛПНП - нативные ЛПНП, ммЛПНП - множественно-модифицированные ЛПНП. Контроль - связывание, захват и деградация 1251-ЛПНП в отсутствие конкурирующих немеченных ЛПНП. * - Достоверное отличие от контроля, р<0.05. N = з.

В экспериментах на фибробластах были получены" близкие-значения захвата и деградации 1251-меченных нативных и множественно-модифицированных ЛПНП в отсутствие немеченных ко}1курентов (Таб.1). При этом, 20-кратный избыток немеченных нативных ЛЛШТ в 2 раза эффективнее подавлял захват и деградацио множественно-модифицированных 1251-ЛЛНП (на 76% и на 61*, соответственно), чем избыток немеченных множественно-модифицированных ЛПНП подавлял захват и деградации нативных 1251-ЛПНП (на 31* и 27*).

множественно-модиФинигюпанннх

_ 100%

80 во

40

20 О

а Ч о

а »-

х о ж

о

10СГ.

во во

40

20 О

_ ЕЯ_ЕЯ.

н

I

онр ац

- в онр ац

Конкурирующие ЛПНП

- •м

- 1 1 25

- 1 1 1 Г'7 Л

Рис.2 Связывание нативных

обработанных нейраминидазой и эцетхлнрованных ЛПНП фибробластами макрофагами Р3880,.

Макрофаг* инкубировались в точение 2 часов при 4°С с 10 мкг/мл ,г5|-н-ЛПНП (Рис.2А). ,!1|-онр-ЛПНП (Рис.2Б) и ,г51-аи-ЛПНЛ (Рис.28) в присутствие 200 мкг/мл иоиеченмых конкурируют« н-ЛПНП, омр-ЛПНП и ац-ЛПНП. За 100% приняты значение связывание 1п1-ЛЛНП в отсутствие конкурентов - 16.2 нг/мг белка для м-ЛГШП. 30.7 иг/иг белка для о'О-ЛПНП м 251.4 иг/мг белка для ац- . ЛПНП. Содержание сиалоеой кислоты в м-ЛПНП и ац-ЛПНП - 27.2 ныоль/мг белка, в онр-ЛПНП - 8.9 иыаль/ыг белкж.

И

НИЗКОЙ плотности с макрофагами линии Р388Д^. 1. Связывание, захват и деградация обработанных

нейраминидазой липопротеидов низкой плотности макрофагами Р388Р!. В течение 2 часовой инкубации макрофаги Р388Р^ связывали 16.2 нг нативных, 30 нг обработанных нейраминидазой и 251.4 нг ацетилированных 1251-ЛПНП на мг клеточного белка. Таким образом, связывание обработанных нейраминидазой 1251-ЛП!Щ было в 8.2 раза ниже, чем связывание ацетилированных 1251-ЛПНП. В тоже время, уровень связывания макрофагами

1251-ЛПНП, обработашшх

нейраминидазой, в 2 раза превышал уровень связывания нативных 1251-ЛПКП.

Немеченные нативные ЛПНП и обработанные нейраминидазой ЛПНП в одинаковой степени

ингибировали связывание

макрофагами нативных 1251-ЛПНП. При этом, эффективность ингибирования достигала 90* при 20-кратной концентрации конкурентов (Рис.2А). Избыток немеченных ацетилированных ЛПНП не влиял на связывание нативных 125х_лпнп рецепторами макрофагов Р388Р! (Рис.2А). Как немеченные нативные, так и немеченные ацетилированные ЛПНП конкурировали за связывание обработанных нейраминидазой 1251-ЛПНП макрофагами Р388Р^. При 20-кратной концентрации немеченных конкурентов нативные ЛПНП ингибировали связывание 1251-ЛПНП, обработанных нейраминидазой, эффективнее (на 63*), чем немеченные ацетилированные ЛПНП (на 48*) (Рис.2Б). Нативные ЛПНП не влияли на связывание ацетилированных 1251_ЛПНП рецепторами макрофагов (Рис.2В). В то же время, 20-кратный избыток немеченных ЛПНП, обработанных нейраминидазой, ингибировал связывание 125х-меченных ацетилированных ЛПНП на 43* (Рис.2В).

Аналогичные результаты были получены при исследовании захвата и деградации обработанных нейраминидазой 1251-ЛПНП макрофагами Р3880^. Обработанные нейраминидазой ЛПНП конкурировали за захват и деградацию макрофагами РЗвви^ как с нативными, так и с ацетилированными ЛПНП. При этом, немеченные обработанные нейраминидазой ЛПНП значительно эффективнее ингибировали захват и деградацию нативных 125х-ЛПНП, чем захват и деградацию ацетилированных 1251-ЛПНП линейными макрофагами Р3880^. В свою очередь, немеченные нативные и ацетилированные ЛПНП эффективно ингибировали захват и деградацию 1251-меченных обработанных нейраминидазой ЛПНП. Нативные и ацетилированные ЛПНП не конкурировали между собой за захват и деградацию макрофагами линии Р388С1.

2. Взаимодействие множественно-модифицированных ЛПНП с макрофагами Р388П1# Уровень связывания множественно-модифицированных 1251-ЛПНП рецепторами макрофагов был в б раз выше, чем уровень связывания нативных 1251-ЛПНП, и в 4 раза ниже, чем уровень связывания ацетилированных 1251-ЛПНП (Таб. 2). Множественно-модифицированные ЛПНП конкурировали за связывание рецепторами макрофагов и с нативными и с ацетилированными ЛПНП. Так, 20-кратный избыток немеченных множественно-модифицировавнных ЛПНП снижал связывание нативных 1251-ЛПНП на 81*, а связывание ацетилированных 1251-ЛПНП - на 33*. В

свою очередь, 20-кратный избыток немеченных нативных ЛПНП иигибиравал связывание множественно-модифицированных 1251-ЛПНП на 219>, а 20-кратный избыток немеченных ацетилированных ЛПНП подавлял связывание множественно-модифицированных 1251-ЛПНП на 52%' (Таб.2).

При изучении захвата множественно-модифицированных ЛПНП рецепторами макрофагов Р388Р! были получены следующие результаты: количество захваченных множественно-модифицированных *251-ЛПНП, в отсутствие конкурирующих немеченных ЛПНП, в 15 раз превышало количество захваченных нативных 1251-лпШ1 и было в 1.8 раз меньше, чем количество захваченных ацетилированных 1251-ЛПНП (Таб.2).

ТАБЛЩА2. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ 1251-МЕЧЕННЫХ МНОЖЕСТВЕННО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ЛПНП С МАКРОФАГАМИ ЛИНИИ РЗввО^

125Х_нЛП2Ц 1251-ммЛПНП 1251-ацЛПНП

Конкурент СВЯЗЫВАНИЕ 1251-ЛПНП (нг/мг белка/2ч)

нЛПНП ммЛПНП ацЛПНП 12.4+1 2.3+0 2.5+0 11.7+0 .8 .2 .2 .5 * * 73.9+2.9 58.4+1.3* 43.4+4.2* 35.4+1.8* 300.8+6.9 286.7+16.5 200.7+16.5* 42.4+4.3*

Конкурент ЗАХВАТ, (нг/мг 1251-ЛПНП белка/2ч)

нЛПНП ммЛПНП ацЛПНП 41+1 7+2* 30+2* 49+5 623+39 485+13* 346+10* 260+25* 1107+50 1080+60 516+28* 295+12*

Конкурент ДЕГРАДАЦИЯ 1251-ЛПНП (нг/мг белка/2ч)

нЛПНП ммЛПНП ацЛПНП 189+15 64+2* 138+5* 158+1 707+83 468+17* 293+17* 113+27* 4477+432 3829+155 2198+115* 1940+194*

нЛПНП - нативные ЛПНП, ммЛПНП - множественно-модифицированные ЛПНП, ацЛПНП - ацетилированные ЛПНП. Контроль - связывание, захват и деградация 1251-лнНП в отсутствие конкурирующих немеченных ЛПНП. * -Достоверное отличие от контроля, р<0.05. и = 3.

20-кратный избыток немеченных множественно-модифицированных ЛПНП ингибировал захват нативных 1251-ЛПНП на 27*, а захват

ацетилированных 1251-ЛПНП - на 53* (Таб.2). В присутствие 20-кратного избытка немеченных нативных и/или ацетилированных ЛПНП захват множественно-модифицированных ' 1251-меченных ЛПНП рецепторами макрофагов снижался на 22* и 58», соответственно (Таб.2).

В отсутствие конкурентов макрофаги РЗвво^ деградировали множественно-модифицированные .1251-лПНП в 3.7 раз активнее, чем нативные 125Х-ЛПНП (Таб.2). В тоже время, активность деградации ацетилированных 1251-ЛПНП макрофагами в 7 раз превышала активность деградации множественно-модифицированных 125Х-ЛПНП (Таб.2). Интенсивность деградации 1251-меченных множественно-модифицированных ЛПНП, интернализованных макрофагами, снижалась в присутствие избыточных количеств немеченных нативных и/или ацетилированных ЛПНП (Таб.2). Так, в присутствие 20-кратного избытка немеченных нативных в 3 раза, а в присутствие 20-кратного избытка немеченных ацетилированных ЛПНП - в 6.3 раза (Таб.2). В свою очередь, 20-кратный избыток немеченных множественно-модифицированных ЛПНП ингибировал деградацию нативных 1251_ЛПНП макрофагами в 1.4 раза, а деградацию ацетилированных 1251-ЛПНП - в 2 раза.

Из приведенных данных видно, что множественно-модифицированные ЛПНП связываются, захватываются и деградируют в макрофагах, имеющих скэвенджер-рецептор, более активно, чем нативные ЛПНП. Кроме того, в отличие от нативных ЛПНП, множественно-модифицированные и

ацетилированные ЛПНП являются конкурирующими лйгандами за связывание и захват рецепторами макрофагов РЗввс^.

Следовательно, можно

предположить, что множественно-модифицированные ЛПНП являются лигандамй к скзвенджер- рецептору.

Для подтверждения данного предположения проводили процедуру иммуноблотинга фиксированных на нитроцеллюлозе белков мембранной

А Б В

Рис.3 Иммуноблотинг белков

мембранной фракции макрофагов РЗаао-, с множественно-

модифицированными (А), иативными (Б) и ацетилированными ЛПНП (В).

фракции макрофагов P388Di с нативными, ацетилированными и множественно-модифицированными .ЛПНП. Проявление иммунных комплексов пероксидазомеченными коньюгатами показало, что белки очищенной мембранной фракции специфически связывают ацетилировашше и множественно-модифицированные ЛПНП (Рис.3). Можно видеть наличие окрашенных участков, на полосках нитроцеллюлозы, на которые d качестве лигандов к белкам мембранной фракции макрофагов наносились ацетилированные ЛПНП (Рис.38) и множественно-модифицированные ЛПНП (Рис.ЗА). Не наблюдалось окрашивания на полоске нитроцеллюлозы при использовании нэтиеных ЛПНП, как лигандов к белкам мембранной фракции макрофагов (Рис.ЗБ).

Взаимодействие множественно-модифицированных ЖШП. С глапкокмгечкнми клетками непораженной шшош аоптн неяовекз., Сравнительное исследование связывания нативных и множественно-модифицированных 1251-ЛПНП гладкомышечными клетками непораженной интимы аорты человека показало, что за 2 часа инкубирования гладкомышечные клетки

связывают множественно-модифицированных ЛПНП в 2 раза больше, чем нативных ЛПНП (Рис.4).

Была изучена кинетика захвата и деградации нативных,

множественно-модифицированных, окисленных и ацетилированных 1251-ЛПНП в гладкомышечных клетках непораженной интимы аорты человека в течение 10 часов инкубирования. Анализ результатов показал, что гладкомышечные клетки интимы аорты человека связывают и захватывают модифицированные формы ЛПНП значительно активнее, чем нативные ЛПНП (Рис.5А,Б,В). При этом, захват 125х_неченных модифицированных in vitro ЛПНП - окисленных и ацетилированных - в последние часы инкубирования в 1.5-1.9 раз превышал (Рис.5Б,В) захват множественно-модифицированных 125х-лПНП, выделенных из крови больных ИБС (Рис.5А).

100

т \

а во

х

с;

<и во

VO

U 40

2

\ 20

U

X

- eh

т ЯР

■ ж

н-ЛПНП

мм-ЛПНП

Рис.4 Связывание нативных и множественно-модифицированных ЛПНП гладкомышечными клетками

непораженной интимы аорты человека.

!

о г 4 a a to

Время инкубации (ч)

о г 4 a а ю

Время инкубации (ч)

г 100 ч а до ,251-ац-ЛПНП i

й> во \о и 40 2 Ъ » X 0 - 1 1 1 1 1

0 2 4 В а 10

Время инкубации (ч)

Рис.5 Захват нативных, • множественно-модифицированных, окисленных и ацетилированных ЛПНП гладкомышечными клетками интимы аорты человека. Гладкомышечные клетки интимы аорты человека инкубировались в течение 2-24 часов при 37°С с 10 мкг/мл 1251-меченных н-ЛПНП [О], мм-ЛПНП [•], ок-ЛПНП [V] и ац-ЛПНП [Г].

При инкубировании гладкомышечных клеток непораженной интимы аорты с ^Замеченными лпнп уже в течение 1-го часа инкубирования в инкубационной среде обнаруживались продукты гидролиза нативных и in vitro модифицированных ЛПНП (Рис.бБ.В). Причем, наиболее выражение гидролитическая активность гладкомышечных клеток проявлялась в

,25|-ок-ЛПИП

Г"

г-

lt*

с_I_I'll

с г 4 в а ю

Время инкубации (ч)

о z < е а ю

Время инкубации (ч)

о г 4 а а ю

Время инкубации (ч)

Рис.6 Деградация нативных, множественно-модифицированных, окисленных и ацетилированных ЛПНП гладкомышечными клетками интимы аортычеловека. Гладкомышечные клетки интимы аорты человека инкубировались в течение 2-24 часов при 37°С с 10 мкг/мл 1251-меченных н-ЛПНП [о], мм-ЛПНП [•], ок-ЛПНП [V] и ац-ЛПНП [▼]■

отношении окисленных 125х-ЛПНП (Рис.бБ). Деградация окисленных 125г_ ЛПНП ухе через 1 час от начала инкубации в 2.5 раза превышала деградацию нативных 1251-ЛПНП и в 2 раза - деградацию ацетилированных 1251_лпнП (Рис.бВ). Через 10 часов инкубирования уровень деградации окисленных 1251-ЛПНП (Рис.бБ) в 2.3 раза превышал уровень деградации нативных 125х_лпнп и в 1.2 раза - уровень деградации ацетилированных

1251-ЛПНП (Рис.бВ). В отличие от нативных ЛПНП и in vitro модифицированных 1251-меченных ЛПНП, в первые 2 часа инкубирования с гладкомышечными клетками интимы аорты человека в инкубационной среде не было обнаружено продуктов ферментативного гидролиза множественно-модифицированных 1251-ЛПНЛ (Рис.бА). Продукты

расщепления множественно-модифицированных 125г-ЯПНП обнаруживались в инкубационной среде между 2-м и 4-м часом инкубирования. При этом, на протяжении 10 часов инкубирования, уровень деградации множественно-модифицированных *251-ЛПНП в гладкомьппечных клетках интимы аорты был достоверно ниже, чем уровень деградации 1251-нативных ЛПНП: в последние часы инкубации содержание продуктов гидролиза нативных 1251-ЛПНП в инкубационной среде в 2-2.5 раза превышало содержание продуктов деградации

множественно-модифицированных 125х-ЛПНП (Рис.бА).

На Рис.7 продемонстрировано изменение относительной деградации 1251-меченных ЛПНП в гладкомышечных клетках интимы аорты человека на протяжении 10 часов инкубирования. Относительная деградация - процент деградировавших ЛПНП от общей суммы поступивших в клетку 1251-меченных ЛПНП (захваченных+деградированных). Показано, что значения относительной деградации in vitro модифицированных -

125|-ац-ЛПНП

_1_1_I_и

о 2 < в « ю о 2 4 в а ю о г « в а ю

Время инкубации (ч) Время инкубации (ч) Время инкубации (ч)

Рис.7 Относительная деградация нативных, множественно-модифицированных, окисленных и ацетилированных ЛПНП гладкомышечными клетками интимы аорты человека.

Гладкомышечные клетки интимы аорты человека инкубировались в течение 2-24 часов при 37°С с 10 мкг/мл ,251-мечекных н-ЛПНП [о], мм-ЛПНП [•], ок-ЛПНП [V) и ац-ЛПНЩТ).

окисленных (Рис.7Б) и/или ацетилированных (Рис.7В) 1251-ЛПНП являлись постоянными величинами на протяжении 10 часов инкубирования и, по значениям, соответствовали относительной деградации нативных 1251-ЛПНП (Рис.7А). Последняя составляла около 60% от общего

г

"— га 50

X

С 0) во

VO

ь. 40

-Z

Ч 20

L.

X

,251-ок-ЛПНП

ь- ' '_I_I_L

lOOXf

Г

\ ч 80

¥

с во

\а

U 40

2

ч 20

и

X

0

количества нативных 1251-ЛПНП, поступавших в клетку в течение 10 часов инкубации. В отличие от нативных и in vitro модифицированных 125Х-ЛПНП, в первые 2 часа наблюдались нулевые значения относительной деградации множественно-модифицированных 1251-ЛПНП, а в последующие часы инкубации количество деградировавших 1251-меченных

множественно-модифицированных ЛПНП составляло около 40* от общего количества множественно-модифицированных 1251-ЛПНП, поступивших в клетку (Рис.7А). Таким образом, относительная деградация множественно-модифицированных ЛПНП в гладкомьппечных клетках интимы аорты человека была в 1.5 раза ниже относительной деградации нативных и in vitro модифицированных ЛПНП.

Иммунонитохимическое выявление гг^врнлтрр-ренептора в

гладкомшечнык клетках аорты человека In situ и in vitro.

1.Выявление скзвенджер-рецептора в гладкомышечных клетках на срезах аорты человека. При окрашивании срезов напораженной аорты человека на скэвенджер-рецептор в интиме аорты было обнаружено большое количество интенсивно окрашенных на скэвенджер-рецептор клеток звездчатой формы. Соответствующие участки серийных срезов аорты, окрашивали на мышечный -актин. Сравнение этих участков показало, что клеткам, окрашенным на скэвенджер-рецептор, соответствуют сходные по локализации и форме, с большим количеством отростков клетки, содержащие -актин. При большем увеличении было продемонстрировано, что клетки, экспрессирующие скэвенджер-рецептор, представляют собой звездчатые гладкомышечные клетки, характерные для интимы аорты человека.

При изучении медиального слоя аорты также было обнаружено большое количество клеток, окрашенных на скэвенджер-рецептор. Причем, этим клеткам также соответствовали сходные по форме и локализации клетки на серийных срезах, окрашенных антителами против -актина. Не было обнаружено окрашивания клеток на контрольных серийных срезах, инкубированных с неиммунной кроличьей сывороткой.

2.Выявление скзвенджер-рецептора в клетках первичной культуры интимы аорты человека. Изучение локализации антител против скзвенджер-рецептора проводили на клетках первичной культуры

непораженной интимы аорты человека с использованием ФИТЦ-меченных видоспецифичных антител. На поверхности клеток в местах локализации антител против скзвенджер-рецептора было обнаружено яркое свечение в виде точек. Светящиеся точки неравномерно распределялись по всея поверхности клеточной мембраны, местами образуя кластеры, хаотично разбросанные по поверхности клетки.

Для идентификации клеток, экспрессирующих скэвенджер-рецептор, проводилось двойное окрашивание клеток на скэвенджер-рецептор и -актин. Двойное окрашивание показало, что клетки, взаимодействуюяие с антителами против скэвенджер-рецептора, содержат также -актин, то есть являются гладкомышечкыми клетками.

ОБСУЖДЕНИЕ

Исследования, проводимые на фибробластах кожи человека, не выявили различий между количеством специфически связанных нативннх ЛПНЛ и ЛПНП, обработанных нейраминидазой. Кроме того, избыток нативных ЛПНП ингибировал связывание ЛПНП, обработанных нейраминидазой, с В,Е-рецепторами Фибробластов с той же степенью эффективности, с какой избыток обработанных нейраминидазой ЛПНП ингибировал связывание нативных ЛПНП. Аналогичная картина наблюдалась при изучении захвата и деградации нативных и обработанных нейраминидазой ЛПНП Фибробластами кожи человеха. Таким образом, можно сделать вывод, что десиалирование in vitro не влияет на сродство ЛПНП к В,Е-рецептору.

Множественно-модифицированные ЛПНП, полученные из крови больных ИБС, также как и ЛПНП, обработанные нейраминидазой, связывались, захватывались и деградировали посредством В,Е-рецептора. В наших экспериментах специфическое связывание нативных ЛПНП в 2 раза превышало связывание множественно-модифицированных ЛПНП В,Е-рецепторами фибробластов. При этом, избыток немеченных нативных ЛПНП более эффективно (на 2СН) конкурировал с множественно-модифицированными ЛПНП за связывание фибробластами, чем избыток множественно-модифицированных ЛПНП с нативными ЛПНП. При равных значениях захвата и деградации нативных и

множественно-модифицированных ЛПНП фибробластами, избыток немеченных нативных ЛПНП в 2 раза эффективнее подавлял захват и деградацию множественно-модифицированных ЛПНП, чем избыток немеченных множественно-модифицированных ЛПНП - захват и деградацию нативных ЛПНП. Таким образом, можно заключить, что ЛПНП, подвергшиеся десиалированию in vivo - множественно-модифицированные ЛПНП, не теряют способности взаимодействовать с В,Е-рецептором. Однако, сродство этих ЛПНП к данному рецептору несколько ниже, чем сродство нативных и in vitro десиалированных (обработанных нейраминидазой) ЛПНП. Последнее возможно обусловлено наличием множества сопутствующих модификаций в структуре anoВ множественно-модифицированных ЛПНП, выделенных из крови больных ИБС.

Исследования, проводимые на культуре макрофагов Р3880^, позволили проследить взаимодействие in vitro и in vivo десиалированных ЛПНП одновременно с В,Е-рецептором и скэвенджер-рецепторами к ЛПНП. В экспериментах на макрофагах P388Di контрольный уровень специфического связывания обработанных нейраминидазой ЛПНП в 2 раза превышал контрольный уровень связывания нативных ЛПНП. Обработанные нейраминидазой ЛПНП конкурировали за связывание макрофагами данной клеточной линии и с нативными и с ацетилированными ЛПНП, в то время как нативные и ацетилированные ЛПНП не конкурировали между собой за связывание рецепторами макрофагов. Отмечено, что ЛПНП, обработанные нейраминидазой, активнее конкурировали с нативными ЛПНП, чем с ацетилированными ЛПНП. При этом, связывание нативных ЛПНП рецепторами макрофагов снижалось в присутствие обработанных нейраминидазой ЛПНП значительно эффективнее, чем связывание обработанных нейраминидазой ЛПНП - в присутствие нативных ЛПНП. Аналогичная картина наблюдалась при изучении захвата и деградации in vitro десиалированных ЛПНП макрофагами P388D!. Таким образом, можно предположить, что ЛПНП со сниженным содержанием сиаловой кислоты связываются и метаболизируются макрофагами дополнительным (помимо В,Е-рецепторного) путем. Наиболее вероятным дополнительным путем захвата обработанных нейраминидазой ЛПНП макрофагами является скэвенджер-рецепторный путь, опосредующий метаболизм подавляющего большинства химически модифицированных ЛПНП. Об этом свидетельствует способность обработанных нейраминидазой ЛПНП конкурировать с

ацетилированными ЛПНП за связывание, захват и деградацию макрофагами линии Р388В!. Обработанные нейраминидазой ЛПНП, связывание, захват и деградация которых снижались с присутствие избыточных количеств ацетилированных ЛПНП, в свою очередь, достаточно эффективно ингибировали связывание и метаболизм ацетилированных ЛПНП. Однако, значения связывания, захвата и деградации для обработанных нейраминидазой ЛПНП были значительно ниже контрольных значений этих показателен для ацетилированных ЛПНП.

Похожая картина наблюдалась при изучении взаимодействия множественно-модифицированных ЛПНП, выделенных из крови больных ИБС с макрофагами Р3880^. При этом, значения связывания, захвата и деградации множественно-модифицированных ЛПНП были в 1.8-7 раз ниже соответствующих значений для ацетилированных ЛПНП и в 3.7-15 раз выше соответствующих значений для нативных ЛПНП. То есть, множественно-модифицированные ЛПНП в несколько раз активнее, чем ЛПНП, обработанные нейраминидазой, связывались, захватывались и метаболизировали в клетках линии Р388П}.

Множественно-модифицированные ЛПНП, также как и обработанные нейраминидазой ЛПНП, конкурировали за связывание и метаболизм в макрофагах Р388И^ и с нативными и с ацетилированными ЛПНП, но в отличие от обработанных нейраминидазой ЛПНП,

множественно-модифицированные ЛПНП более эфективно конкурировали с ацетилированными ЛПНП, чем с нативными ЛПНП. Таким образом, учитывая что: множественно-модифицированные ЛПНП/обработанные нейраминидазой ЛПНП связываются, захватываются и деградируют в макрофагах, имеющих скэвенджер-рецептор, более активно, чем нативные ЛПНП г множественно-модифицированные ЛПНП/обработанные нейраминидазой ЛПНП и ацетилированные ЛПНП являются конкурирующими лигандами за связывание рецепторами макрофагов, можно предположить, что

множественно-модифицированные ЛПНП и обработанные нейраминидазой ЛПНП связываются со скэвенджер-рецептором.

Способность множественно-модифицированных ЛПНП взаимодействовать со скэвенджер-рецептором была подтверждена результатами иммуноблотинга белков очищенной мембранной фракции макрофагов линии Р3880^ с нативными, множественно-модифицированными и ацетилированными ЛПНП. Об этом свидетельствует наличие окрашивания на апобелок

человека на тех полосках нитроцеллюлозы, где в качестве лиганда к белкам мембранной фракции использовались ацетилированные и множественно-модифицированные ЛПНП, и отсутствие такового на полоске нитроцеллюлозы с нативными ЛПНП - в качестве предполагаемого лиганда к белкам мембранной фракции макрофагов. Специфическое связывание ацетилированных ЛПНП с белками мембранной фракции макрофагов свидетельствует о том, что в составе данной фракции присутствует схэвенджер-рецептор, известный ранее как рецептор к ацетилированным ЛПНП. Таким образом, результаты иммуноблотинга являются дополнительным свидетельством того, что множественно-модифицированные ЛПНП, также как и ацетилированные липопротеиды, специфично взаимодействуют со скэвенджер-рецептором. Учитывая вышеизложенные результаты, можно сделать вывод, что тожественно-модифицированные ЛПНП являются природным лигандом к скэвенджер-рецептору.

Клеточное связывание и метаболизм множественно- модифицированных ЛПНП, обуславливающие индукцию внутриклеточного накопления липидов в клетках интимы, непосредственно вовлеченных в развитие атеросклеротического процесса, изучали на первичной культуре клеток непораженной интимы аорты человека, подавляющее большинство которых представлено модифицированными гладкомышечными клетками звездчатого типа.

Результаты показали, что количество множественно-модифицированных ЛПНП, сеязыывающихся с рецепторами гладкомышечных клеток интимы аорты человека в 2 раза превышает количество связывающихся нативных ЛПНП. Аналогично в наших экспериментах гладкомышечные клетки интимы аорты человека в 1.5-2 раза активнее захватывали множественно-модифицированные ЛПНП по сравнению с нативными ЛПНП. При этом деградация множественно-модифицированных ЛПНП в гладкомышечных клетках интимы непораженной аорты человека была ниже, чем деградация нативных ЛПНП. Особенно ярко выражены различия в значениях относительной деградации нативных и

множественно-модифицированных ЛПНП в гладкомышечных клетках интимы аорты человека: в первые 2 часа инкубирования не было обнаружено продуктов гидролиза множественно-модифицированных ЛПНП в инкубационной среде, то есть величина относительной деградации множественно-модифицированных ЛПНП была равна нулю; в последующие

часы относительная деградация множественно-модифицированных ЛПНП не превышала 40Х, в то время как, относительная деградация нативных ЛПНП была не ниже 60$, начиная с 1-го часа инкубации. Следовательно, можно предположить, что причинами накопления липидов в гладкомышечных клетках интимы аорты человека при атеросклерозе являются: во-первых, повышенное связывание и интернализации in vivo модифицированных ЛПНП клетками и, во-вторых, сниженая деградация таких ЛПНП.

Иная картина взаимодействия гладкомышечных клеток интимы аорты человека с модифицированными ЛПНП наблюдалась в экспериментах с In vitro модифицированными ЛПНП. Т.ак, в гладкомышечных клетках интимы аорты наблюдалась повышенная активность захвата in vitro модифицированных ЛПНП, по сравнению с нативными и множественно-модифицированными ЛПНП и высокая эффективность деградации этих ЛПНП, в 2-2.5 раза превышающая деградацию нативных и в 4-5 раз - деградацию множественно-модифицированных ЛПНП. При этом, значения относительной деградации in vitro модифицированных ЛПНП соответствовали значениям относительной деградации нативных ЛПНП. Такое выраженное отличие метаболизма in vitro модифицированных ЛПНП от метаболизма множественно-модифицированных ЛПНП в клетках интимы аорты человека позволяет сделать вывод, что исследования, проводимые с использованием in vitro модифицированных ЛПНП, не дают результатов, адекватно отражающих реальные клеточные механизмы атеросклероза in

vivo.

Полученные нами результаты свидетельствуют, что гладкомышечные клетки интимы аорты человека способны связывать, захватывать и метаболизировать модифицированные формы ЛПНП. Причем связывание и захват модифицированных ЛПНП в 2 и более раз превышает связывание и захват нативных ЛПНП. Последнее позволяет предположить, что гладкомышечные клетки интимы аорты человека помимо В,Е-рецептора к нативным ЛПНП экспрессируют скэвенджер-рецептор к модифицированным ЛПНП. Данное предположение было подтверждено иммуноцитохимически с использованием поликлональных антител кролика против

скэвенджер-рецептора человека. Наличие скэвенджер-рецептора продемонстрировано in vitro в первичной культуре клеток интимы аорты человека и подтверждено in vivo на срезах аорты человека.

ЗМИВЧЕНИЕ

Таким образом, появление патологических

множественно-модифицированных ЛПНП в организме человека влечет за собой нарушения метаболизма ЛПНП в клетках интимы сосудов. В частности, изменяется соотношение между захватом и деградацией ЛПНП в гладхомышечных клетках интимы. Низкая скорость деградации вновь образованных множественно-модифицированных ЛПНП сочетается с повышенным (В,Е- и скэвенджер-рецептор-опосредованным) поступлением таких липопротеидов в гладкомышечные клетки. Такое нарушение метаболизма ЛПНП в клетках интимы сосудов несомненно может быть одной из причин развития атеросклеротического поражения в сосудах людей, страдающих ишемической болезнью сердца.

ВЫВОДЫ,

1. Десиалирование нативных ЛПНП приводит к появлению у них способности взамодействовать со скзвенджер-рецепторами клеток.

2. Множественно-модифицированные (десиалированные) ЛПНП, выделенные из крови пациентов с коронарным атеросклерозом, являются лигандами к В,Е-рецептору и скзвенджер-рецептору клеток.

3. Гладкомышечные клетки интимы аорты человека экспрессируют два типа рецепторов к ЛПНП: В,Е-рецептор и скэвенджер-рецептор.

4. Связывание и захват множественно-модифицированных ЛПНП гладкомьшечными клетками интимы непораженной аорты человека достоверно превышает связывание и захват нативных ЛПНП.

5. Уровень деградации множественно-модифицированных ЛПНП в гладкомьшечных клетках интимы аорты человека значительно ниже, чем уровень деградации нативных ЛПНП.

6. Низкий уровень деградации множественно-модифицированных ЛПНП, циркулирующих в крови больных ИБС, и повышенный клеточный захват таких ЛПНП в гладкомышечных клетках интимы аорты человека являются причинами, обуславливающими внутриклеточное накопление липидов в культивируемых гладкомышечных клетках интимы аорты человека.

СПИСОК РАБОТ., ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Назарова В.Л., Т.ертов В. В. Иммуноцитохимическое выявление скзвенджер-рецептора в гладкомышечных клетках аорты человека.// Тезизы конф. Проблемы атеросклероза г.Воронеж, 1-3 декабря 1994 г. -с.72

2. Назарова В.Л., Андреева Е.Р., Т.ертов В.В., Гельдиева Б.С., Орехов А.Н. Иммуноцитохимическое изучение локализации скзвенджер-рецептора в гладкомышечных клетках интимы аорты человека.//Бюлл.Эксп.Биол.Нед. -1995. - N.8 - С.195-198

3. Орехов А.Н., Тертов В.В., Назарова В. Л. Множественные модификации липопротеидов низкой плотности в крови больных атеросклерозом.//Бюлл.Эксп.Биол.Мед. - 1995. - н.8 - с.118-121

4. Тертов В.В., Собенин И.А., Назарова В.Л., Гельдиева Б.С., Виа Д.П., Орехов А.Н. Взаимодействие множественно-модифицированных (десиалированных) липопротеидов низкой плотности, выделенных из крови больных атеросклерозом, с клеточными рецепторами.//Бел.Эксп.Биол.Мед. - 1994. - N.1 - с.53-55

5. Tertov V.V., Nazarova V.L., Orekhov A.N. Naturally occurlng

modified low density lipoprotein of atherosclerotic patients.//In Proceedings of the Bth International Dresden Lipid Symposiuja - 1994. - pp.89-91

Автор выражает глубокую благодарность своему руководителю Тертову В.В. за умелое и чуткое руководство и огромное личное участие в судьбе диссертации, а также всем сотрудникам группы клеточной патологии атеросклероза КНЦ РАМН за всестороннюю помощь в работе.