Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клеточный состав, структурная организация и биохимические особенности слоев интимы аорты человека в норме и в атеросклеротических поражениях

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Клеточный состав, структурная организация и биохимические особенности слоев интимы аорты человека в норме и в атеросклеротических поражениях"

>гв од

Т С гЬСП №96РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЦДИЦИНСКИХ НАУК С о ФСи КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи

Андреева Елена Ромуальдовна

Клеточный состав, структурная организация и биохимические особенности слоев интимы аорты человека в норме и в атеросклеротических поражениях

03.00.04. - БИОХИМИЯ 03.00.25. - КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА, 1996

Работа выполнена в Институте экспериментальной кардиологии Кардиологического научного центра РАМН.

Научный руководитель: кандидат биологических наук А.Н. Орехов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук ЕД. Клименко

кандидат биологических наук О.П. Ильинская

Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт физико-химической медицины МЗ РФ

Защита состоится 1996 года в часов на

заседании диссертационного ученого совета К 001.22.02 в Кардиологическом научном центре РАМН по адресу: 121552 Москва, 3-я Черепковская ул.,~15а.

• С диссертацией- можно ознакомиться в-"научной "библиотеке Кардиологического научного центра РАМН.

Автореферат разослан

1996 года.

Ученый секретарь дисертационного совета, кандидат биологических наук Т.Н. Венгерова

ОБШАП КАРАКТСРПСШХЛ РЛБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы достигнуты значительные успехи з области диагностики и лечения заболеваний,. обусловленных атерссклеротическими изменениями магистральных артерий человека. Однако, несмотря на определенный прогресс □ этой области, сердечно-сосудистая патология занимает ведущее место в структура смертности и инвалидности населения развитых индустриальных стран. Недостаточная эффективность методов профилактики и терапии атеросклероза обусловлены, сради прочего, отсутствием исчерпывающих знаний механизмов зтерогенеза на клеточном и молекулярном уровне, - что диктует необходимость дальнейших поисков в этой области исследования атерогекеза.

"Атеросклероз - это заболевание, характерное для человека. Широко используемые в лабораторной практике модели эгеперимонталыюго атеросклероза у животных не позволяют в полной мере имитировать этероскя-фотические изменения сосудистой стенки человека. Неадекватность экспериментальных моделей атеросклероза обусловлена многими причинами, и, в частности, особенностями строения аорты человека, а также особенностями клеточного состава иктимального слоя артерий (Аничков H.H., 1956; Geer &. Haust, 1972: Wisslar, 1S79). Эти факты определяют важность использования биопсийного и аутопсипного материала сосудоз человека при изучении атеросклероза.

Атеросклеротическиз изменения (избыточное внутри- и внеклеточное накоппенио - липидоз, пролиферация иктимоцитоз, а -таске' разрастание -внеклеточного матрккса) происходят, в основном, во внутренней оболочке артерий - интима (Geer & Haust, 1972; Haust, 19БЗ). У взрослого человека интима обычно состоит из двух, иногда из трех слоев: ближайшего к. медии мышечно-зластического (МЭ), следующего к просвету - аласпл-.ко-гиперпластичоского (ЭГ) и но всегда хорошо выраженного слоя - соединительнотканного (CT) (Jores, 1924; Movat et. al., 1958; Geer & Kaust, 1372). Наличие --их слоев s интима р.ртер'лй является чертой, характерной для человека. В г.осп:атат.:;ом онтогенеза они ' формируются постегснно и отличаются друг от друга организацией внеклеточного матрикса и юшточнум составом (Movat et al., 1958; Geer and Haust, 1972; Haust, 1983). Вовлечение отдельных слоев интимы1 g атэросклерсггачесг.ий процесс изучено недостаточна: Прзстичгски кз уделялось внимания изучению гатимь; -как целостной клеточной системы. До настоящего времени таегда полностью на решен вопрос об участии различных клеток интимы в форгирорании атсроскг.еротической бяяшгг.. 3 отли-.иа от средней оболочки сосуда - меди;, б субзндотелиальной интамв кроме типичных тладкокышбчных клеток естречаются так называемые кодифицированные гладкомышечные клетки, клетки

лимфоцитарно-моноцитарного ряда и клетки неясного происхождении (Хавкин, 1950; Завзрзин, Щелкунов, 1954; Geer, 1961; O'Neal ~.t ai., 1977; Go-эг & Haust, 1972; Campbell et a!., 1981, Soboleva et a!., 1994, 193.r).

Морфологические исследования выявили нооднсродность клеточного состгва интимы (Geer & Haust, 1972; Haast, 1983). Прицельное алоюронп.-.-микроскопическоа и^учаниэ ^ .гок икт.:мъ:, раскипающихся на сгетссигическом уровно г.э форме, попало, что между этими клетками существуют ультраетрукгурньш отличия, коррелирующие с их формой (Крушинсхий и др., 1333). По-видимому, клетки, отличающиеся по форма, различаются и по своим функциональным характеристикам, что поднимает вопрос о связи клеточного состава интимы с биохимическими проявлениями атеросклероза.

Цепи и задача исследования. Целью настоящей работы было исследование клеточного состава, структурной организации и биохимических особенностей слоез в непораженной и атеросклеротически изменэнной интима аорты челозека.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

- изучить морфологические особенности слоев интимы аорты человека в неизменной интиме и в атеросклеротнческих поражениях: изменение толщины, качественные и количественные изменения клзточного состава, особенности трехмерной организации клеточкой системы.

- изучить биохимические особенности слоев интимы аорты человека а норме и о атеросклеротически* поражениях, в первую очередь накопление общих липидов и их отдельных классов, а также накопленио коллагена

- выяснить, существует ли зависимость между изменениями клеточного состава интимы аорты человека и основными проявлениями атеросклероза: увеличением толщины интимы, увеличением клеточности интимы, накоплением липидов, накоплением коллагена.

- используя первичную культуру клеток интимы аерты чолобека, изучить возможные механизмы, приводящие к атерссклеротическим изменениям стенки сосудса in situ.

Научная иооизиз работы. В настоящей работе было продемонстрировано, чт,о слои интимы аорты человека по-разному вовлечены в атероекпоротичвехий процесс. Основные изменения, характерные для атеросклероза происходят, глагным образом, во внутреннем - ЭГ слое интимы аорты, тогда кзг: прилежащий к медии - МЭ слой подвержен этим изменением в гораздо меньшей степени. Подробно изучена трехмерная организация клеточной системы з слоях интимы в кормз и в леросклеротичвских порахэнисс Показано, что во внеижз непораженных участках 3 Г слоя имеет место трехмерная клеточная сот о, состоящая из клеток звоздчатой ф^-рмы. В мировых погэсгх в ЗГ слое интимы целостность клеточной сети нарушается. В атеросклеротических бляшках эти нарушения 'приводят к полному разобщению клеток. Б то же время, клетки МЭ

слоя, по морфологии напоминающие гладкомышечныв клетки «един, образуют плотно упаксзкнные ппзсты, которые практически но прэтсрпезгдат изменений при развигии атеросклерожческих поражений. Полученные дЭ1;кые позволяют предположить разную степень вовлечения слоев интимы в атеросклеротический процесс. Этот факт важно учитывать при изучении роли клеточных элементов субзндотелиальной интимы в процессах развития атеросклероза,

В ходе настоящего исследования было установлено, что срэди клеток различной формы наиболээ тесную связь с основные проявлениями атеросклероза имеют клетки звездчзтой формы (Langhans, 1SG6), которые, как было показа но ранее, отличаются по ультраструетурз от типичных глацкомь'шечных кпатск (Крушинский и др., 1983) и, по-видимому, занимают особое место в система функционирования клеток субэндотелиальной интимы. Количество ззездчапък клеток увепичиваетоя наиболее значительно в ртсросклеротичесюгх поражымях, по сравнению с клетками другой формы. Увеличение числа звездчатых клеток тесно коррелирует с утолщением интимы, накоплением липидов и коллагена.

В качссггЕЭ модели для изучения функций клеток интимы был использован мегод первичной культуры клеток, разработанный ранее в лаборатории, где выполнялась настоящая работа (Орехов и др., 1962). В работе было показано, что с культурах клеток из атеросклеротических поражений по сравнению с клетками из нормальных участков снижена степень межклеточной коммуникации. Впервые продемонстрирована, что индуцированное модифицированными липопротеидами низкой плотности (модЯПНП) анутриклаточноэ накопление лпп.здоа в клетках из непораженной, интимы, сопровождается .снижениям, уроиг.. межклеточной коммуникации чешз щелевые контакты и нарушением физического контакта клеток друг с другом. Подобные изменения в нарушении трехмерной организации интимгцитоз звездчатой формы при накоплении липидов могут иметь место и при развитии атеросклеротичэских изменений интамы аорты in situ. Не исключено, что накопление липидов клетками интимы является основной причиной дальнейшего развития фиброзных изменений в атеросклгротически пораженных участках.

Теоретическое значение работы. Результаты проведенного исследования вносят значительный вклад в развитие современной теории атерогенеаа. Полученные данные свидетельствуют о том, >гго интима аорты человека - сто сложная клеточная система, состоящая из двух морфологически и функционалы« различных слоев. Эти структуры (5Г и МЭ слои) в неодинаковой степени вовлечены в процесс формирования зтеросклеротической бляшки. Звездчатые клетки ЭГ слоя опре.^оля.ст специфику основных феноменов атерогенеза: липоидоза Бкутрекней оболочки артерий и ее создинитальнотканкого разрастания. Эти клетки-образуют сеть, просветы кцторой йалякзтел, по-видимому, каналами транспорта метаболитов через интиму. Возможно, что нарушение клеточных контактов в участках атерюсклеротических поражений rax раз и приводит к

нарушению трофики интимального слоя с последующими дегенеративными изменениями. Клетки мыаюч.. .'^-эластического слоя сходны с клетками ыедми и слабо вовлечены в атеросклероз.

В работе получены данные, детализирующие имевшиеся ранее пред^гаапегь.я о5 особенностях морфогенеза атс-оосклеротичесхой бляшки в артериях человека. >'станоалеьэ, что з »онах овых полос трехмерная сеть, пшлчггя для пззерхноэтгок участков ЭГ ел».;, нарушается, кроме того, происходят су,-;зственпыэ изменения и с самими ?;»,ми кл» ".зми. Такие демые являются дополнительным аргументом в пользу гипотезы о том, что липоидоз является стадией, предшествующей формированию атероскг.еротических г.;.лшак.

Результаты проведенного исследования свидетельствуют об упрощенности концепции, согласно которой повышенный уровень яипопротеидов является г.ишь одним из серии факторов, индуцирующих поврездениз сосудистой стенки. Данные наших исследований существенно дополняют многочисленные факты о ключевой роли липоидоза о атерегенезе. Изучение клеточкой организации ЭГ слоя интимы в норма и в атеросклеротических поражениях позволило получить данные, ставшие основой для убедительного теоретического обоснования концепции, согласно которой накопление липидов является одной из основных причин, вызывающих нарастание атеросклеротических изменений б стенке аорты человека.

Практическое значение работы. В ходе проведенного исследования разработана серия методических приемов, которые могут быть использованы в практике научно-исследовательских работ по изучению механизмов развития морфоггластичесхих изменений стенки артерий человека при различных ее патологических состояниях. Предложенная методика количественной оценки клеточного состава в различных слоях интимы может быть использована для исследования механизмов развития таких заболеваний артерий, как неспецифический артериит Такаясу, коарктация аорты, вазоренальная гипертензия и др. Особую практическую значимость этот методический прием может иметь при анализе последовательности формирования рестенозоа в разные сроки после выполнения реконструктивных оперативных. вмешательств из магистральных артериях."

Полученные данные свидетельствуют в пользу целесообразности использования культур клеток, выделенных из интимы артерий человека, для изучения молекулярных механизмов развития атеросклероза и для оценки эффективности действия антиатерогенньгх препаратов.

Апробация работы. Диссертация апробирогана на межлабораторном с&минарэ Института экспериментальной кардиологии КНЦ РАМН (Москва, 1S9S). Основные результаты работы бьи.я доложены на и Всесоюзном симпозиума "Метаболизм,, структура и функция сердечной клетки" (Ташкент, 1SS3); iV Всесоюзном съезде кардиологов (Москва, 1936); Всесоюзной научной конйаренцми "Человек-охсзн" (Махачкала, 1990); IX Конгрессе Венгерского

л

эбщоства по атеросклерозу (Шопрон, 1990), IX Международном конгрессе по атеросклерозу (Роземонт-Чикаго, 1991), 62 Европейском „ конгрессе по атеросклерозу (Иерусалим, 1993), X Международном конгресса по атеросклерозу (Моирааль, 1594), 8 Международном симпозиума по липопротендам (Дрезден, 1994), научно-практической конференции "Проблемы атеросклероза" (Воронах, 1994), 64 Европейском конгрессе по атеросклерозу (Утрехт, 1995).

Публикации. По теме диссертации опубликоаано^!^рзбот, в том числе23 на страницах международных журналов.

Структура и объем работы. Рукопись диссертации состоит из разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", результаты и их обсуждение в главах III-V, "Заключение", "Выводы" и "Список литературы". Диссертация изложена на 189 страницах, включая список цитированной литературы, содержащий 22В названий, а также 7 таблиц и 50 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материал. Аорты 40-60 летних мужчин, умерших внезапно, были взяты асептически через 1.5-3 часа после внезапной смерти. Тип атеросклеротического поражения определяли согласно классификации, предложенной Smith (1974). Аккуратность отделения интимы от медии и ЭГ слоя от МЭ слоя интимы контролировали микроскопически (Орехов и др., 1984). Клетки из аорты выделяли с помощью коллагеназы и культивировали согласно Орехову (Орехов и др., 1983). Нативкые и мод ЛПНП кз плазмы крови здорозых лиц и пациентоз а коронарным атеросклерозом были охарактеризованы и любезно предоставлены др-ром В.В. Тертовым (Tertov et al., 1992). Для морфологических исследований ткань и клетки культуры фиксировали следующими способами: 1) 4% формальдегидом, 2) смесью 4% формальдегида и 1% птотаральдегида, 3) смесью 4% формальдегида с 0.2% тритоном Х-100, растворы 1-3 на изотоническом фосфатном буфере; 4) метакарном (метанол:хлороформ:лэдяная уксусная кислота - 6:3:1); 5) холодным метанолом или ацетоном (-20°С). Время и условия фиксации, а также условия последующего хранения материала были подобраны в зависимости от экспериментальной задачи.

Методы. Сззтовая микроскопия. В работе были использованы вертикальные ¿разы аорты человека, приготозленныэ параллельно и перпендикулярно дг.инкей оси сосуда и пленочные препараты, приготозлепиыз по методу Schwartz & Benditt, (1973) в кашей модификации (Rekhter et al., 1991). На срезах сосуда окрашивали эластику по Вергоффу, коллаген по Ван-Гизоку, гликозаминогликаны по Стидмену, липиды по Липли и Асборну. Препараты изучали с помощью микроскопа Optan III (Kart Zeiss, Germany). Электронная микроскопия.

Для изучения лрепарагсз о просвечивающем элеетронном микроскопе образцы roTOsi.ii.i согласно ссщепринятс." методике, среоы коьтр: -тировали уракилацетатом и цитратов свинца (Уикли, 1575). Для изучения трехмерной opte изации интима аорты человека использовали метод сса'".'руюш,:. л электронной микроскоп;:,! (СЗМ). Дта удаления внеклзточ: .ело матр:;:.са £~ir использован кисл-гньи-, гмро.тфиксированной ткани с поспаду ощей обработке" кОАлагеназой (Evan, 1981). Для удаления клеток при изучении экстр .:• .с .io:.-матрикса ткань обрабатывали прототерризинсм (Шахтер, 1976). Посла обработки образцы готовили для СЭМ по стандартней процедура. Имщиоцлгохнм.ю. В работе были использованы антитела к следующим антигенам: мышечный а-актич (HHF-35), макрофагальный антиген (НАМ-56) (антитела любозно предоставлены д-ром Alen M. Gown, University of Washington, USA), общий антиген лиглфоцитов CDLC (Dako, USA). Визуализация связазшихся антигенспецифичных антител проводилась методом непрямой иммунофлюоресценции с использование».", флюоресцентно меченых видоспецифичных антител (Amersham, UK) или иммуноферментным методом (ABC Vectastain • kit, Vector, USA). Спиртово-щелочная диссоциация. Для получения клеточной суспензии фиксированные кусочки слоев интимы диссоциировали в смеси, состоящей из равных объемов 30% КОН и 96° спирта, согласно методике, описанной ранее (Krushinsky et al., 19S3). В полученной суспензии подсчитывали общее число клеток с помощью гемацитомэтра и определяли соотношение клеток различной формы, как описано ранее (Orekhov et al., 1934). Экстракция и опредоленив липидов. Экстракцию липидоа из- ткани проводили -по Folch et al., (1957).- Нейтральные липиды - -разделяли тонкослойной хроматографией (ТСХ). Количество липидоз измеряли сканирующей денситомэтрией (Murawski et а!.,1974). Содержание фосфолипидоз определяли по мэтоду Васькозского и др. (1975). Определенна коллагена. Содержание коллагена в ткани определяли по оксипролину калориметрическим методом по Stogemann & Stalder (1967). Микрононофорэз. Межклеточную коммуникацию через щелевые, контакты изучали с помощью внутриклеточных микроинъекций флюоресцентного красителя кальцеина (Loc.vensíein, 1975).

РЕЗУЛЬТАТЫ П ОЕСУЙ'ЛЕННЕ

I. Морфологическая и биохимическая характеристика интимы аорты человека в ¡юрме и в аторосадеротических поражениях.

1.1. Микроскопическая анатомия внешне непораженной интимы еорты. езрослого человека.

Аорта взрослого человека состоит из трех слоев: наружный слой -здвектиция; средний слой - мадия и ближайший к просвету слой - интима рогев, 1924; Аничков, 1947). Известно, что основные атероскперотические изменения возникают в интимапьном слое аорты (ЬапдПапз, 1856; Аничков, 1947). Интима взрослого человека неоднородна. Установлено, что она состоит из двух, иногда из трех субслоев. Интима отделена от медии внутренней эластической мембраной (ЗЭМ), к которой со стороны просвета сосуда прилежит МЭ слой интимы. Этот слой отделен от прилежащего к просзету ЭГ слоя внутренней пограничной пластинкой (ВПЛ). Иногда в ЭГ слоз можно выделить еще соединительнотканный слой, прилежащий непосредственно к эндотелию, но этот слой обычно не имеет четкой морфологической границы с подлежащим ЗГ слоем, поэтому в данной работа рассмотрены только два четко разделенных слоя: ЭГ и МЭ.

Окраска аластичосшх волокон по Вергоффу и коллагена по Ван-Гизону, а такжэ использование метода СЭМ позволили выявить ориентацию сссдинит^-ьнотканных структур в различных слоях интимы. В МЭ слое волокна и пласгикки гпастинз четко ориентированы вдоль длинной оси сосуда, тогда как в ЭГ слоз ориентацию волокон установить трудно. Количество эластических пласт 1жж и волокон уменьшается по направлению к просвету сосуда. Волокна коллагена в МЭ слое ориентированы, в основном, поперечно, а в ЭГ слое располагаются вдоль динной оси сосуда.

Таким образом, можно заключить, что в непораженной интиме взрослого чалсвека всегда можно различить два слоя, отличающиеся по архитектуре соединительнотканного'матрикса'и имс.ощие четкие морфологические фаницы.

Одной из задач настоящей работы было исследование вовлечэнности различных слоев интимы в атерссклеротическив игмэнения. В настоящее время считается, что основными признаками атеросклеротического поражения являются: накопление липидоа - липидоз, накопление соединительнотканного матрикса -фиброз, увеличение клеточности вследствие пролиферации, а также утолщение интимы.

1.1.1. Толщина интимы в нормальных и атеросклеротческих участках- аорты человека. В зонах атеросклеротических поражений толщина интимы значительно превосходит толщину интимы в непсражэкньех участках. Наибольшей толщины интима достигает в атеросклеротических бляшках. На срезах аорты в участках перехода внешне непораженного участка в атеросклерсгтичесхуга бляшку можно видеть, что толщина. МЭ слоя в норме и атеросклеротических поражениях практически на изменяется. Измерениями большого количеству образцов удалось установить, что толщина МЭ слоя в непораженной интиме составляет в среднем 100.4+2.4 мкм, в жировой полосе МЭ слой интимы имеет такую же толщину как и в •

норме, а в бляшке всего на 11% больше, чем в непораженной интиме. В отличие от МЭ слоя, ЭГ спой резко утолщается в бляшке и составляет собственно ту часть, интимы, которая выпячивается в просвет сосуда, уменьшая его проходимость. В среднем в жировой полосе ЭГ слой почти в 2, а г бляшке - в 4 раза толще, чем п непораженной интиме, где она в среднем состасг«ет 135.2+10.3 мкм. В некоторых ' случаях толщина ЭГ слоя в бляшке в 10-20 раз превосходит толщину ЗГ слоя интимы в норме.

1.1.2. Количество клеток в слоях интимы аорты человека в норме и в атеросклеротических поражениях. С помощью разработанного ранее метода спиртово-щалочной диссоциации (Крушинский, 1983) было определено количество клеток в разных слоях аорты в норме и атеросклеротичесхих поражениях. В ЭГ слое интимы количество клеток в жировой полосе увеличивалось в 1.4 раза, в бляшка в 2 раза по сравнению с нормой, тогда как в МЭ слое атеросклеротических поражений по сравнению с неизмененными участками число клеток практически не изменялось (Табл. 1).

Таблица 1. Количество клеток в слоях непораженной и атеросклеротически измененной иктимы аорты человека (клетки-10 3/0.25 см2, М±т)

Область сосуда ЭГ слой интимы МЭ слой интимы

Норма (11) 157+19 400+26

Жировая полоса (7) 260+40* 650+36"

Атеросклеротичеасая 375+14" 596+31*

бляшка (6) - • ' ■ -

В скобках указано число проанализированных образцов достоверное отличие от нормы, р<0.05

1.1.3. Коллаген а слоях интимы аорты человека в норма и атеросклеротччаских поражениях. Общее содержание коллагена в слоях, интимы было определено колориметрически по содержанию оксипролина (Табл. 2).

Таблица Z Содержание коллагена в слоях интимы аорты человека (мкг/0.25 см2, М±т)

слой интимы исследованная область

норма (5) жировая полоса ¡7) ^ бляшка (6)

ЭГслой 162.2С±8.80 442.01 ±10.60" 621.96±8.70"

МЭ слой 1S7.77±7.00 245.65i6.50 441.68±6.90*

В скобках указано количество проанализированных образцов. "„достоверное отличие от нормы, р<0.05

So внешне непораженных участках содержание коллагена в МЭ и ЭГ слоьх интиьы приблизительно одинаково. В жировой полосе увеличивается содержание

коллагена в обоих слоях, но в МЭ слое всего в 1.5 раза (отличие от нормы статистически незначимо), а в ЭГ слое - в 2.7 раза. В атеросклеротической бляшке содержание коллагена в МЭ и ЭГ слоях интимы возрастает в 2.6 и 3.8 раз, соответственно.

Таким образом, полученные результаты показывают, что утолщение стенки сосуда в областях атеросклзротических поражений происходит за счет преимущественного накопления коллагена в ЭГ слое интимы. • I. 1.4. Липиды в слоях непораженной и атеросклеротической интимы аорты человека. Липиды выявляли на срезах сосудов с помощью жирорастворимого красителя масляного красного О. В непораженных участках интимы липиды представляли собой внеклеточные капли и гранулы, которые локализовались вдоль эластических мембран. Наибольшее их количество выявлялось вдоль ВПЛ й ВЭМ. •При. значительном содержании липидоз в непораженных участках они накапливались в основном в наружной части ЭГ слоя, прилежащей к ВПП. Клетки с внутриклеточными липидами встречались в нормальных участках крайне редко.

В зонах жировых полос выявлялись как внутри- так и внеклеточные липиды, которые локализовались, в основном, в прилежащей к просвету части ЭГ слоя интимы. По направлению к МЭ слою и далее в МЭ слое содержание липидов сильно уменьшалось.

В липофиброзных бляшках основная часть липидов была сосредоточена в ядре бляшки. Крупные липидныэ капли и лилиднагруженные клетки выявлялись также в покрышке и плече бляшки.

■ • Биохимически было определено общее содержание липидоз й их отдельных классов в ЭГ и МЭ слоях ингемы.

Таблица 3. Общее содержание липидов и кх "отдельных классов в слоях непораженной и атеросклерэтмчески измененной интимы аорты человека (мкг/0.25

смг, М+т)

общйе липиды холестерин эфиры холестерина тригляцериды - фосфолипиды

Норма (5)

ЭГ слой 271.1+11.1 14.3+2.9 140.8+8.2 81.2+7.0 30.6+3.9

МЭ слой 140.2+5.2 Жировая полоса (7) 12.3+2.9 64.6+3.1 42.8+3.9 19.1+3.2

ЭГ слой 864.2+16.3* 53.0+5.6* " 421.2+10.5* 319.5+15.2* 55.1+3.1*

МЭ слой 362.5+12.4* 29.6+2.9* Атерссклеротическая бляшка (6) 134.6+7.6* 143.9+10.6* 23.1+3.1*

ЭГ слой 1755.0+22.9" 242.7+8.8" 760.5+10.7* 174.8+11.5" 548.5+18.5"

МЭ слой 509.3+22.4* 82.0+7.8* 233.9+14.8* 67.9+8.1* 122.1 + 12.7*

В скобках указано количзстро'про?нализированных образцов.

*, достоверное отличие от нормы, р<0.05

При атеросклерозе накопление жира в ЭГ слое идет опережающим,! темпами. Общее количество липидов в ЭГ слое больше, чем в норма в жировой полосе в 3.2 раза и в атероскперотической бляшке • в 8 раз, тогда как в МЭ слое содержание лига-1дог, в жировой полосе по сравнению с нормой выше е 2 3 раза, а 8 атероскперотической .:ляшка - в 4.4 раза, соответственно (Т Лл. 3).

Также нэразномери-j по слоям увеличивается и содержание отдельных классов липидов (Табл. 3). причем наиболее значительно увеличивается содержание в ЭГ слое холестерина и его эфироа (Табл. 3).-.

Таким образом, суммируя приведенные выше данные, можно заключить, что два морфологически отличающиеся друг от друга слоя интимы в разной степени вовлечены в процессы, приводящие к атеросклеротичесхим изменениям: увеличению толщины интимы, увеличению клеточности , интимы, накоплению липидов и коллагена.

II. Особенности клеточной организации и клеточного состава слоев интимы аорты человека в нормальных и атеросклеротических участках. '

11.1. Трехмерная организация клеток в слоях интимы внешне неизмененных участков и участков с атеросхлеротичгскими поражениями.

Можно предположить, что описанные выше различия между слоями интимы • связаны с жизнедеятельностью клеток,' населяющих эти слои. Каковы же особенности клеточной организации и клеточного состава в этих слоях в норме и в атеросклеротических поражениях? На вертикальных срезах большинство клеток интимы имеет одинаковую вытянутую форму. Однако, как было описано ранее (Хавкин, 1950; Заварзин, Щелкунов, 1954; Langhans, 1866; Schonfelder, 1969), на срезах, приготовленных параллельно поверхности сосуда клетки субэндотелиальной интимы значительно варьируют по форма и среди них выделяются отростчатые клетки, которые еще в 1B6S году Langtians предложил называть звездчатыми.

Для детального изучения клеточной системы в ЭГ и МЭ слоях интимы в настоящай работе был использован метод целлоидиновых пленок, предложенный Schwartz & Benditt (1973) для получения эндотелиальных монослойных пленок. Этот метод, >.:одифицированны,5 для работы с субандоталиальной " тканью, был применен для получения последовательных интимальных пленок.

На планках, полученных из МЭ слоя интимы было обнаружено, что большинство клеток имеет вытянутую биполярную форму, характерную для гладкомышечных клеток медаи. Клетки МЭ слоя образовывали плотно упакозанкыа

пласты, имеющие разную направленность. Эти пласты накладывались друг на друга, образуя структуру, сходную с черепицей. Структура МЭ слоя практически не изменялась а атеросклеротических поражениях по сравнению с нормальными участками. 1

Клетки ЭГ слоя разительно отличались от вытянутых биполярных клеток МЭ слоя. Клотхи ЗГ слоя были отростчатыми, располагались довольно редко, однако, соприкасались своими боковыми отростками, образуя разреженную клеточную сеть. В промежутках этой клеточной сети можно было видоть круглые или овапьныэ клетки о округлыми или бобовидными ядрами, по морфологии напоминающие моноциты- макрофаги крови.

С помощью моноклональных антител против a-мышечного актина и 110 КД белка макрофагоз (CD68), любезно предоставленных д-ром Alen М. Gown, было продемонстрировано, что звездчатые субэндотелиальные клетки содержат мышечный a-актин, а моноцито-макрофагоподобные клетки экспряссируют макрофэгальный антиген.

При изучении последовательных пленок ЗГ слоя внешне неизмененных участков можно было видеть, что наибольшее число заездчатых клеток находится непосредственно под эндотелием и слой этих клеток очень тонок. При помощи длинных и тонких отростков эти клетки образуют сеть. Клетки располагаются в сети на равномерно, а образуя скопления - кластеры. По мере удаления от просвета сосуда клетки ЭГ слоя становятся белое вытянутыми, однако, клеточная сеть, образованная этими клетками, не прерывается.

С помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) удалось установить, что все клетки ЭГ слоя в непораженных участках интимы контактируют между собой как в горизонтальной, так и в вертикальной плоскости, образуя единую трехмерную структуру.

В зонах жирозых полос в поверхностных участках ЭГ слоя трехмерная сеть, типичная для непораженной интимы, нарушается." Кроме того, происходят существенные изменения и с самими клетками. В жиро сой полосе обнаруживается большое количество клеток, цитоплазма которых заполнена липид^ыми включениями. Это так называемые "пенистые" клетки. Можно выделить пенистыо клетки двух основных типов. Первый тип пенистых клеток - клетки звездчатой формы из тех, что составляют трехмерную сеть в ЭГ слое. Второй тип пенистых клеток - клетки, которых мало в норме, но которыэ характерны для интимаш кой популяции жировой полосы - ¡это круглые или озоиднын клетки, напоминаюшив моноциты крови. Больше всего пенистых клеток находит ч в самых поверхност.ч.« участках, ЭГ слоя. Чем глубже расположены клетки в оточ слое, тем рел? c-s ;ди них встречаются пенистые клетки. На определенной глубине снова можно

обнаружить клеточную сеть, состоящую только из отростчатых клегок, характерную для ЗГ слоя непораженных участков интимы.

При изучении с помощью СЭМ трехмерной организации клеточной системы в жировых полосах можно было видеть, что субэндотелиальные клетки часто имели увеличенное тело с многочисленными выпячиваниями на поверхности, предположительно образованными внутриклеточными липидными каплями. Большое количество круглых и овальных структур с гладкой поверхностью обнаруживалось в непосредственной близости от тел клеток и их отростков. Диаметр этих структур варьировал в очень широком диапазоне от 0.20+0.01 до 4.60+0.30 мкм. На ультратонких срезах можно было видеть покрытые мембраной липидные капли того же размера и формы. Это позволяет предположить, что выявляемые СЗМ структуры - это покрытые мембраной липидные капли. Иногда такие структуры обнаруживались в тесном контакте с поверхностью клеток, что наводит на мысль, что жировые капли отделяются от поверхности клетс:;. С помощью СЭМ в клеточной сети жировой полосы можно было выявить "слепые" клеточные отростки, не имеющие контактов с соседними клетками. По-видимому, подобные "слепые" отростки образуются в результате разрушения межклеточных контактов.

В соединительнспканой покрышке атеросклеротических бляшек среди грубых фибрилл внеклеточного матрикса можно было видеть отростчатые клетки, лежащие по отдельности или группами, а также лимфоцито- и макрофагоподобные клетки. В более глубоких слоях покрышки бляшки количество субэндотелиальных клеток увеличивалось, но общую,сеть они не образовывали. Среди, этих клеток оообо выделялись "гигантские" плоские клетки, описанные подробно Крушинским (1385). Они располагались обычно над ядром бляшки поодиночке или небольшими группами.

ЭГ слой интимы в липофиброзных бляшках отличался от ЭГ слоя чисто фиброзных бляшек. В самой поверхностной -зоне этого слоя можно было видать смесь состоящую из волокон внеклеточного матрикса, дегенерировавших клеток крови, а также одиночных или расположенных группами пенистых субэндотелиальных звездчатых клеток. Более глубокие слои содержали хорошо выраженный внеклеточный матрикс с редко расположенными интимальными клетками, образующими ссть иа отдельных участках, а также большое количество монокуклеарных клеток. Иногда можно было обнаружить группы звездчатых овоидных пенистых клеток. Эти клетки образовывали микрополосы, сходные с обнаруженными в жировых полосах. Над. атероматозным ядром встречались "гигантские" клетки. .

На основании сделанных наблюдений можно предположить, что нарушение клеточной сети, которое начинается в жировых полосах, заканчивается с бляшках

полной изоляцией клеток друг от друга и от клеточной сети, окружающей бляшку. Крайней формой изоляции клетки можно считать "заключение" клетки в капсулу, состоящую из грубых волокон соединительнотканного матрикса. Образование такой капсулы, по-видимому, изменяет и метаболизм клеток, результатом чего является дистрофия интимы.

11.2. Клеточный состав слоев интимы в норме и атеросклеротических поражениях.

Для количественной и качественной оценки клеточных популяций из различных слоез интимы был использован предложенный ранее метод спиртово-щелочной диссоциации фиксированной ткани (Крушинский, 1983). Фиксированную ткань аорты диссоциировали спиртом со щелочью в течение 2 часов. За это время внеклеточный матрикс разрушался полностью, но клетки сохранялись, причем, -сохранялась и форма клеток, которую они имели в момент фиксации. С помощью этой методики получали суспензию клеток с выходом 102+5%.

Как отмеч:шось выше, клеточная популяция интимы, выявляемая на пленочных препаратах и с помощью СЭМ, очень неоднородна и значительно изменяется при удалении от просвета вглубь стенки сосуда. Самую поверхностную часть ЭГ слоя составляют клетки звездчатой формы, далее от просвета чаще встречаются более вытянутые клетки с отростками и без них, а клетки МЭ слоя напоминают по морфологии клетки медии. Если разделить фиксированную ткань интимы по слоям, а затем диссоциировать спиртом со щелочью, бросаются в глаза различия во внешнем виде двух популяций. Популяция МЭ слоя состоит, в основном, из биполярных вытянутых клэток, похожих на клетки медии, в то время как популяция ЭГ слоя представлена клетками варьирующей формы от вытянутой до звездчатой. Следует отметить, что именно в поверхностном ЭГ слое интимы, где, в основном, локализуются звездчатые клетки, происходят глазные событии атэрогенеза.

Ранее было показано (Крушинский, 1983), что основную часть популяции диссоциированных субэндотелиальных клеток (более 95%) непораженной интимы составляют клетки, которые по форме можно разделить на четыре группы: " звездчатые, вытянутые, вытянутые с боковыми отростками и клетки неправильной формы. -

Клеточные формы, которые мы встречаем в суспензии, соответствуют клеточным формам, выявленным на пленочных препаратах сосудистой стенки. Кроме перечисленных выше форм, в суспензии, как и в сосуде, можно встретить • клетки круглой и овальной формы, морфологически;неотличимые от лимфоцитов и 4 моноцитов, циркулирующих в крови. СуСзндстэлиальные клетки, похожйа на лимфоциты и моноциты, составляют небольшую часть общего числа

субзндотелиальных клеток нормальной интимы (менее 5%). В атеросклеротических поражениях встречаются участки локального скопления клеток кровяного происхождения. Поскольку в настоящей работе основное внимание было уделено оседлым клеткам интимы, ниже речь пойдет, в основном, о клетках вытянутой, звездчатой и неправильной формы, составляющих основу популяции субэндотелиальных клеток.

Выше отмечалось, что в ЭГ слое интимы в атеросклеротических поражениях клеток больше, чем в непораженной интиме. Интима в области атеросклеротических поражений отличается от непораженной интимы не только числом клеток, но и соотношением клеток различной формы (Табл. 4). Эти изменения затрагивают, главным образом, клетки звездчатой формы. Пропорция клеток неправильной формы и вытянутых клеток с боковыми отростками в норме и при атеросклерозе практически одинакова. С другой стороны, существенно (более чем в 3 раза) увеличивается доля звездчатых клеток. Изменения в клеточном составе связаны с тем, что увеличение числа клеток различной формы идет разными темпами. При увеличении общего числа клеток в 2 раза, число звездчатых возрастает более чем в 6 раз, в то время как число вытянутых увеличивается только в 2 раза.

Таблица 4. Соотношение клеток различной формы в нормальных и атеросклеротически измененных участках слоев интимы аорты человека, % от общего числа клеток

вытянутые звездчатые - Еытянутыа с отростками неправильной формы

Норма (5)

ЭГ слой 47.0+3.1 2.0+3.1 20.8+2.6 30.2±1.9

МЭ слой 57.2+3.0 0.0+0.0 11.2+2.1 31.6+3.2

Жировая полоса (7)

ЭГ слой 44.8+2.2 3.8+1.4- 20.6+2.3 30.5+2.7

МЭслой 56.1±2.2 0.0+0.0 16.9+1.£ 31.1+2.2

Атеросклероичесхая бляшка (6)

ЭГ слой 41.8+1.7 6.1+1.4* 20.8±1.5 31.3±1.7

МЗ слой 51.2+1.8 1.9+0.5* . 16.1+1.5 30.8+1.6

В скобках указано количество проанализированных образцов.

* - достоверное отличие от нормы, р<0.05

Как было описано выше, развитие атеросклэрогоческих поражений сопровождается измека-.иж.-.и клеточной системы интимы, приводящими к почти полному разрушению клеточной сети в участках атеросклеротических поражений.-Олгр-ь^ющеэ увеличение количества клеток звездчатой формы , в

аторосхлеротич^ских участках, о одной стороны, можэт указывать на преимущественное утолщение самого поверхностного слоя интимы, где, как пекззано зышэ, локализуются в основном звездчатые клетки. С другой стороны, можно предположить, что появлэние дополнительного количества клеток звездчатой формы в участках нарушения клеточной сета является возможным компенсаторным механизмом, с помощью которого должна поддерживаться целостность клеточной сети интимы.

В связи с изложенным, представлялось важным проследить наличие связи между увеличением числа звездчатых клеток при развитии атеросхлероза и другими атеросхлеротическими проявлениями: увеличением клеточности интимы, утолщением интимы, накоплением липидов и коллагена.

11!. Спязь между клеточным составом и бмохимичэскими пропапенияют атеросгларсза.

В данной работе была обнаружена прямая и очень теенгл езязь между увеличением числа ззездчзтых клеток и накоплением липидов н зоне атеросхлеротического пора-г.зния (коэффициент корреляции - 0.95), увеличением количества коллагена (О.БО), утолщением интамы (0.73) (Табл. 5). Было также показано, что среди клеток звездчатой формы наиболее часто встречаются клетки с лмпидными включениями. Столь тесная езязь, безусловно, определяется расположением слоя звездчатых таток в нэтиме сосуде з непосредственной близости к проезету. Эти клетки оказываются первым барьером на пути веществ, попадающих в сосудистую стенку из кровеносного'русла. По-видимому, именно таким местоположением в клеточной сети интимы и обуславливается нзибольщзя возлеченность звездчатых "клеток в атеросклэротические изменения в сосудистой стенке.

Таблица 5. Корреляционная зависимость между количеством клеток в интиме и накоплением липидов, коллагена и утолщением интимы

коллаген общие липиды холестерин офиры холестерина три.гл:!-цериды фосфо-липиды тенцчна

звездчатые 0.80 0.95 0.86 0.96 0.94 0.90 0.73

вытямутыв с

тросткаыи 0.73 0.80* 0.67* 0.84' 0.73* 0.70* 0.68

вытянутые 0.54* 0.66* 0.53* 0.72* 0.64* 0.57* 0.50*

нелраемльн.

формы 0.46' 0.73* 0.64* 0.85* 0.70* 0.65* 0.43'

общее «мело

кпетос 0.63* 0.81* 0.68* 0.75* 0.30* 0.72* 0.53*

*- достоверное отличие от коэффициента корреляции для звездчатых р<0.05 ■ •' . -

Происхождение звездчатых клеток привлекало внимание многих исследователей (Аничков, 1947; Хавкин, 1950; Заварзин, Щелкунов, 1954; Langhans, 186S; Altshu), 1944; Schonfelder, 1969; Geer & Haust, 1972; O'Neal, 1977). В настоящее врамя хорошо изучена ультраструстура этих клеток (Крушинский, 19S5; Geer & Haust, 1972; Haust, 1923). Показано, что субэндотелиальные звездчатые клетки практически не содержат или содержат очень редуцированный сократительный аппарат, имеют прерывистую базальную мембрану, не содержат пиноцитозных пузырьков. С другой стороны, в них хорошо развит шероховатый эндоплазматический ретикулюм, что свидетельствует об их высокой синтетической активности. Таким образом, эти клетки существенно отличаются от типичных ГМК и в то же время являются принципиальным клеточным типом, вовлеченным в атеросклероз. В связи с этим особый интерес представляют экспериментальные подходы, позволяющие исследовать особенности функционирования клеточкой системы интимы. Одним -из наиболее признанных в настоящее время является метод первичной культуры клеток аорты человека.

IV. Изучение влияния накопления липидов «а межклеточные контакты в первичной культуре клеток интимы аорты человека.

Звездчатые клетки - это основной клеточный элемент, из которого строится трехмерная клеточная сеть ЭГ слоя интимы. Можно предположить, что увеличение числа звездчатых клеток при атеросклероза - это следствие разрастания трехмерной клеточной сети, результат ее развития. Исходя их этого, молено .предположить, что атеросклеротические проявления в интиме сопровождаются на только разрушением этой сети, как было продемонстрировано зыше, но и ее развитием. О значении и функционировании этой сети в норме и при атеросклерозе практически ничего неизвестно. Для изучения функций клеток ЭГ и МЗ споез интимы, а такжа клеток медик аорты человека, в лаборатории, где выполнялась настоящая работа была разработана мэтодика получения первичных культур клеток соответствующих слоев. >

большая часть клзток, выделенных как из нормальных, так и из атеросклерогических участков интимы человека, зкспрзссировала мышечный а-актин, что подтверждает их гладкогиышечное происхождение. Количество клеток, экспрессировавших макрофагапьнкй антиген, было невелико, однако было почти в 2 раза выше среди клеток, культивируемые из атеросклеротических поражений. Первичная культура клзток аорты была использована для моделирования процессов, происходящих при атеросклерозе. Мы предположили, что физическое нарулвние контактов между клетками, наблюдаемое в атеросклеротических поражениях является следствием нарушения' функционирования аь'соетспецлалиг.ированных клеточных контактов, таких, как щелевые контакты.

имеющихся между кпотхами в нормальной интима. В первичной культуре клеток ЭГ слоя интимы ич непораженных и атероскперотических участков с помощью метода миррсинъокций флюоресцентного зонда определяли уровень мажклаточной коммуникации через щелесыэ контакты. Оказалось, что, а среднем, уровень контактной коммуникации между клетками из ауеросклеротических поражений в 2 раза ниже, чем между клетками из непораженных участков. Наиболее характерным отличием культ;р из атерссхлеротичесхих поражений было наличие пенистых, нагруженных липидами, клэток. Общепризнано, что источником избыточного жира 8 пенистых клетках являются модифицированные ЛПНП (Orekhov / et al., 1939). Ранее в лаборатории, гдэ выполнялась настоящая работа, было показано, что клзтки ЭГ слоя при инкубировании с модЛПНП накапливают холестерина не меньше, чем макрофаги и значительно больше, чем ГМК медии . ¡Tertov et al., 1909). Это позволяет предположить, что эвездчатыа клетки ЗГ слоя интимы могут обладать макрофапальной активностью и способны захватывать модифицированные ЛПНП. Результаты прозеденкых з данной работе исследований трехмерной организации интимы in situ позволяют сделать предположение, что возможным триггерным механизмом нарушения взаимодействия между клетками в областях атеросклеротических поражений может быть накопление липидов з этих клетках. Для проверки этого предположения в клетках из непораженных участхоз интимы вызывали рнутриклеточное накопление липидов, используя модЛПНП, как было описано ранее (Orekhov et а!., 1987, 19S9; Tertov., 1989). В этих культурах исследовали ' морфологические изменения,' происходящие с клетками с помощью СЗМ и оценивали степень мэжхлетечной контактной коммуникации. Как следует из таблицы 6 2-4-х кратное накопление липидов, индуцированное модЛПНП, приводило к 2-кратному уменьшению степени контактной коммуникации через щелевые контакты.

более того, инкубация культивируемых клеток интимы аорты человека с мод ЛПНП вызывала изменения интимальных. клеток и макрофагов, сходные с изменениями in vivo: округленна макрофагоподобных клеток и образозг.пмэ складок на их поверхности; формирование микроворсинок на поверхности клетох; ' истончение и ветвление отростков клеток, подобных гладкомышечным; исманенио структуры межклеточных контактов и разрыв межклеточных контактов; образование пузырей на поверхности клеток и внутриклеточных округлых структур,

предположительно соответствующих липидкым каплям. *

Таблица 6. Влияние модЛПНП на количество клеток, связанных щелевыми контактами, в первичной культуре клоток непораженной интимы аорты человека

Добавленные липопротеиды (опыт)

число флюоресцентно связанных клеток

Добавленные липопротеиды (контроль)

число флюоресцентно связанных клеток

Агрегированные ЛПНП

Окисленные ЛПНП Десиалированные ЛПНП

12.2+8.0* (60)

9.9±0.9* (52) 8.5+0.6* (59)

Нативныэ ЛПНП

Нативкыэ ЛПНП Нативныэ ЛПНП

20.3+1.2 (47)

18.9+1.1 (51) 18,9+1.1 (51)

разделанные липопротеиды от больного с ИБС Ш степени. Десиалированныз 9.5+1.3" (16) Сканированные 30.0+2.8(15) _ЛПНП_ЛПНП__

Клетки инкубировали в присугсвии 100 мкг алоВ/мл лилолротеидов, указанных в

таблице. В скобках ухазано количество измерений.

" - достоверное отличие от нативных ЛПНП, р<0.05

Таким образом, показано, что накопление липидов приводит к снижению

коммуникационного потенциала в клеточной системе, что может инициировать

весь каскад атеросклероткческих изменений - от усиления пролиферации до

синтеза внеклеточного матрикса.

Результаты проведенного исследования газг-оляют заключить, что интима аорты взрослого человека представлена сложной клеточной.^ системой, формирующей даа принципиально различных по своему вовлечению . в атеросклеротические изменения слоя - ЭГ и МЭ. Именно за счет ЗГ слоя, но не МЭ слоя, происходит утолщение интимы и увеличение ее клеточности; в ЭГ слое, в основном, происходит накопление липидов и коллагена. Различия этих слоое (структурные и биохимические), по-гидимсму, 'обусловлены различиями между клеточными популяциями, населяящими эти слои. Клетки МЭ слоя сходны с юктками медии и слабо вовлечены в атеросклггоз. Клеточная популяция ЭГ слоя отличается от клеток медии к МЭ слоя но только морфологически (большим количеством отростчагых "звездчатых" клеток з ультра структурными признаками синтетической клетки), но также и по своим функциональным особенностям, таким как синтез коллагена, накоппвнмо липидов, пролиферация. С количеством ?тих клеток »еиболае тесно коррелируют основные проявления атероетчероза: накопление липидов, коллагена, увеличений клаточносги интимы и ее толщины. Среди этих аиток самый высокий процент лчпидсодеряэдцих клеток in. situ, они активнее друг/л натапливают липиды in vitro.

Итск, сооздччтые клзтки субондотелиальной интимы - ото особая субпопулпция •клеток, которая принимает активнее угастие в метаболизма интимы в норма и при патологических нарушениях. Возмогло, что именно нарушение клеточных коктзктоз, обнаруженное в настоящей работе в атсросклеротических поражениях и приеодлт к нарушению трофики интималыгаго слоя с последующими дзгекератизными изменениями.

ВЫЕСЯЫ

1. Показано, что ЭГ и МЭ слои интимы аорты человека существенно различаются по клеточному составу, МЭ слой состоит из вытянутых биполярных ГМК, морфологически и фенотипичесхи нэ отличающихся от клеток медии. Для клеточной популяции ЭГ слоя характерно наличие клеток звездчатой формы. Иммуноцитохимически показано,, что основная часть этих клеток имеет маркер гладкомьгшечных кгзток мышечный а-актин. Клатки ЗГ слоя интимы в непораженных учзсткэх образуют трехмерную клеточную сеть.

2. Показано, что в аорта взрослого человека слои ингимы по-рас >ому возлечены в атеросклеротическиГ! процесс. Наиболее существенные изменения происходят в ЭГ слое интимы, где наблюдается увеличение ее толщины, накопление липидоз и коллагена, увеличение количества клеток, изменение соотношения клеток различной формы, нарушение межклеточных контактов. -

3. Биохимические и морфологические нарушения при атеросклерозе наиболее тесно коррелируют с увеличением количества клеток звездчатой формы в ЭГ слое интимы. "

4. 3 зонах жировых полос наблюдается накопление внутри- и внеклеточных липидоз, нарушение межклеточных контактоп, дезинтеграция клеточной сети. В нижележащих слоях ЭГ слоя нарушения сети нв происходит. В атеросклеротичесхих бляшках наблюдается полная изоляция клеток друг от друг? и от окружающей клеточной сети.

5. В модельной системе in vitro показано, что накопление липидов, вызванное модифицированными ЛПНП приводит к нарушениям клеточных контактов, аналогичным . нарушениям in situ. Предполагается, что нарушение клеточных контактов, может быть одним из возможных механизмов, приводящих к усилению синтеза внеклеточного матрикез и образованию атероскларстичэскнх бляшек.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО Т£М2 .айССВРТАШТН

1. Андреева ЕР., Тертов В.В., Мухин Д.Н., Орохоа А.Н. Клеточный состт>,з и биохимические особенности- аорты неловека. // Бюллетень ВКНЦ АМН СССР 1985,8(2)63-71.

2. Рехтер М.Д., Андреева ЕР., Алимов Г.А., Миронов А.А., Орехов А.Н. Использование замораживания-схалызания в комплексе со светосой, сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопией для исследования структуры нормальной и атеросклеротически измененной интимы аорты человека. // Цитология 1990,32(11)1102-1105.

3. Рехтер МД, Андреева Е.Р., Миронов А.А., Орэхоз А.Н. Изменения трехмерной организаций клеточной системы ишгимы аорты человека при атеросклерозе. // Арх патол 1991,53(5)104-110

4. Oreknov A.NM Andreeva Е.Я., Tertov V.V., Krushhsky A.V. Dissociated calls from different layers of adult human aortic wall. // Acta Anat 1384,119(2)39-105.

5. Orekhov A.M., Karpova 1.1., Tertov V.V., Rudchenko S.A., Andreeva ER., Krushinsky A.V., Smirnov V.N. // Cellular composition of atherosclerotic and uninvolved human aortic subendoihelial intima. Light-microscopic; study of dissociated aortic cells. Am J Pdthol 1984,115(1)17-24.

6. Orekhov A.N., Andreeva ER., Krushinsky A.V., Smimov V.M. // Primary cultures of enzyme-isolated cells from normal and atherosclerotic human aorta. Med Biol 1984,62(4)255-259.

7. Orekhov A.N., Andreeva E.R., Krushinsky A.V., Novikov I.D., Tertov V.V., Nsstaiko G.V., Khashimov Kh.A., Repin V.S., Smimov V.N. // Intimal celis and atherosclerosis: relationship between the number of intimal cells and major manifestations of atherosclerosis in human aorta. Am J Pathol 1986,125(2)402-415.

8. Orekhov A.M., Andreeva E.R., Tertov V.V. // The distribution of celis and chemical components in the intima of human aorta. Soviet Medical Reviews, Section A: Cardiology Reviews, Human Atherosclerosis, Vol. 1. El Chazov, VN Smimov (eds). harwood Academic Publishers GmbH, Chur (Switzerland), 1937. pp. 75-100.

9. Mukhin D.N., Orekhov A.N., Andreeva E.R., Schir.dler EM., Smimov V.N. // Lipids in cells of atherosclerotic and uninvolved human aorta, ill. Lipid distribution in intimal sublayers. Exp Mol Pathol 1991,54(1)22-30.

10. Rekhter M.D., Andreeva ER., Mironov AA, Orekhov A.N. // Three-dimensional cytoarchltscture of normal and atherosclerotic intima of the human aorta. Am J Pathol 1991,138(3)569-580.

11. Andreeva ER., Orekhov A.N., Emimov V.N. // Quantitr.iive estimation of lipid-laden cki.'is in atherosclerotic lesions of the human aorta. Acta Anst 1991,141(4)316-323.

12. Andreeva ER., Rekhtsr M.D., Romanov Yu.A., Antonova G.M., Anioncv A.S., Mironov A.A., Orekhov A.N. // Striate cells of aortic intima: II. Arborization of intimai cells in culture. Tissue Cell 1992, 24(5)697-704. "

1". Rekhior M.D., Tertov V.V., Andreeva ER., Kclpakov V.A , Mironov A.A., Orekhov A.N. Ц Ij.rd accumulate. in the subendoU-i=vi:.. calls of human aortic intima impairs csll-to-

cell contacts: a comparative study in'situ and in vitro. Cardiovasc Pathol 1993, 2(1) 53-GZ

14. Andreeva ER., Serebryakov V.N., Orekhov A.N. // Gap junctional communication in primary culture of cells derived from human aortic intima. Tissue Cell 1995, 27(5),591-597. . .

15. Orekhov A.N., Andreeva ER., Krushinsky АЛЛ, Smimov V.N. // Primary cultures of enzyme-isolated cells from normal and atherosclerotic human aorta. Med Biol 1984,£2(4)255-259.

16. Орехов АН., Андреева ЕР., Тернов В.В. Распределение клеток и химических компонентов в интиме аорты человека. // Атеросклероз человека. ЕИ Чазов, ВН Смирнов (ред.). Москва, "Наука", 1989. стр. 33-54.

17. Orekhov AN., Tertov V.V., Novikov I.D., Krushinsky A.V., Andreeva ER., Lankin V.2., Smimov V.N. // Lipids in cells of atherosclerotic and uninvoived human aorta, i. Lipid composition of aortic tissue and enzyme isolated and cultured cells. Exp Mol Pathol 1985,42(1)117-137. •

18. Rekhter M.Dl, Andreeva ER., Mironov A.A., Orekhov A.N. // Three-dimensional network in human aortic intima. Arteriosclerosis 1989,2(5),759a.

19. Rekhter M.D., Andreeva ER., Andrianova I.V., Mironov A.A., Orekhov A.N. // Stellate cells of aortic intima: I. Human and rabbit Tissue Cell 1992,24(5) 689-696.

20. Andreeva ER., Serebryakov V.N., Orekhov A.N. // Influence of modified LDL on gap junctional communication between human aortic intimal cells. Atherosclerosis, 1 994ДЩ( 1 /2), 193.

21. Mironov A.A., Rekhter M.D., Kolpakov VA., Andreeva ER., Polishchuk R.S., Bannykh S.I., Rlippov S.V., Peretjatko LP., Kulida LV., Orekhov A.N. // Heterogeneity of smooth muscle cells in embryonic human aorta. Tissue' Cell 1995, 27(1) 31-38.

22. Andreeva ER., Serebryakov V.N., Orekhov A.N. Ц Gap junctional communication in primary culture of human aortic intimal cells. Atherosclerosis, 1995JJ5.S60.

23. Orekhov A.N., Andreeva ER., Krushinsky A.V., Smimov V.Hf // Primary cultures of enzyme-isolated cells from normal and atherosclerotic human aorta. Med Biol 1984,52(4)255-259.

24. Orekhov AN., Krushinsky A.V., Andreeva ER., Repin V.S., Smimov V.N. // Adult human aortic cells in primary culture: heterogeneity in shape. Heart and Vessels 1986.2(4)193-201.

25. Orekhov A.M., Andreeva ER., Tertov V.V., Khubulova I.M. // Cellular lipidosis and proliferation in human aorta. Atherosclerosis, 1995J15,S62.

26. Andreeva ER., Tertov V.V., Orekhov AN. // Intracellular lipids and proliferative activity in human aorta. 8th International Dresden Symposium on Lipoproteins and Atherosclerosis, Dresden, Qsrmany, June 10-12, 1994.

27. Andreeva ER., Serebryakov V.N. // The influence of modified LDL on intracellular communications via gap junctions in primary culture of human aortic cells. 62nd EAS Congress, Jerusalem, Israel, September 5-9,1993.