Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новый компонент адгезивных контактов: локализация и экспрессия в гладкой мышце

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Новый компонент адгезивных контактов: локализация и экспрессия в гладкой мышце"

всесоюзный кардиологическим научный центр ллш ссср

нии кардиологии имени л. л. мясииковл

На правах рукописи

V

/V

КЛИМАНСКАЯ Ирина Витальевна

НОВЫЙ КОМПОНЕНТ

АДГЕЗИВНЫХ КОНТАКТОВ: ЛОКАЛИЗАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ В ГЛАДКОЙ МЫШЦЕ

Специальность 03.00.25 — клеточная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1991

Работа выполнена в Отделе сердечно-сосудистой патологии человека НИИ кардиологии км. А. Л. Мяснпкова ВКНЦ АМН СССР совместно с группой молекулярных основ клеточной подвижности ИЭК ВКНЦ АМН СССР.

Научные р у к о в о д и т е л и:

доктор биологических наук В. Э. Котелянский, доктор МедИЦИНСКИХнаук, профессор 10. В. Постнов.

Официальные о п п о н ент ы:

доктор биологических наук А. Д. Бершадскин, кандидат биологических наук Р. В. Лацис.

Ведущее учреждение — НИИ физико-химической биологии МГУ им. II. А. Белозерского.

Защита диссертации состоится « /$. » 1991 г.

в « » часов па заседании специализированного ученого совета К 001.22.02 во Всесоюзном кардиологическом центре АМН СССР по адресу: 121552, Москва, 3-я Черепковская ул., дом 15А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного кардиологического центра АМН СССР.

■ff» Uftejpa-

Автореферат разослан « 7?. » . 1991 года.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических ngfyK

И. Венгерова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ <туальнос.ть проблемы ■ Гладкоммивчнив клетки (ГМК)

редставлявт практически единственный тип клеток мымечного слон

i.'

генки сосуда и осуаествлявт разнообразные функции, связанные с удержанием тонуса сосуда и синтезом компонентов кстраиеллолярного матрикса. Эти клетки как in vivo, так и in i tго бывают представлены рядом фенотипов, крайние из которых -ократитет/ныя И секреторный (CUaeley-Campbell et al., 1979, 981). Клетки сократительного фенотипа имеет характерную еретенообразную форму, развитый сократительный аппарат; их итоплазма содержит небольшое количество синтетических органелл. ти клетки характеризуются невысоким уровнем пролиферативной и иосинтетической активности. ГМК.секреторного фенотипа, наоборот, мею'т Фибробластоподобную форму, развитые комплекс Гольджи и ндоплазаматическия ретикулум,- сократительный аппарат таких :леток сильно редуцирован. Им свойственны высокая пролиферативная i синтетическая активности. В ходе формирования сосуда на ранних ¡тагах эмбрионального и постнатального периодов развития в ipouecce дифференцировки свойственный незрелым ГМК секреторный генотип постепенно меняется на сократительный. При -'разовании 1нтимальных утолыений аорты человека и ы условиях культивирования зифферениированные ГНК утрачивают черты сократительного фек гипа 1 приобретают ряд морфо-функииональных особенностей, характерных пля клеток секреторного фенотипа и, далее, могут приступать 'к 7ролиферации. Этот процесс получил название "фенотипическои модуляции" (Chaaley-Canpbell and Caapbell, 1981), При ляде

гердачно-сосудистых заболеваний наблюдаются нарушения клеточного состава сосудистой стенки. Согласно современным представлениям,

одной и« причин »того мления может служить фенотилическ! ыовупятя ГНК, и которой следует поешение их секреторной пролифератиеной активности. (Itoaa at al., 1»7в| Chaelay-Caapbe: et al.. teei; Schwartz at al., 1»6в. В-оэдяи с »тим шнлчигепш интерес приовретмт мучение механнгмое лнффвренцироеки Фенотипическоя модуляции ГИК,

процессы дифференцировки и фенотипическоя модуляции г сопровождается существенной реорганнааииея иитоскелета изменениями в экспрессии цитоскелетимх емко*} По-резному я Г

I

сократительного и секреторного фенотипе репрессируется ивофор актина, миозине, иммунореактианне варианте каляеемома. Эти вег могут служить удобными биохимическими «эркерами фенотипа Гик.

Фенотипические изменения ГИК протекают не фоне существен* реорганизации экстрацеллюлярного натрикса, состав и структз которого могут влиять не скорость росте и виосинтетичео активность ГИК (Hajack and Bornatfelo. 1684« Majaek «t al.. 1»' Wren et al.. 1986), экспрессию 8 НИХ С'ГАКОЯ иитоскелете (De3 et al., 1982; Ruoslahtl et at., lflSi) *< СКОРОСТЬ перехода ГИК сократительного к секреторному -состояние (filed tn et al.. 1Э8 Таким образом, адгезивные взаимодействия ГНК с нерастворим компонентами микроокружения могут служить источником регулятор сигналов, оказывавших существенное влияние на фенотип и повеле этих клеток- ключевую роль в реализации таких взаимодействий опосредовании соответствующих сигналов играют, соглг существующим представлениям, специализированные клето1 структуры, получившие название адгезивных контакт Экспрессия белков адгезивных контактов, опосреду>

г

1аимодействив цитоскелета и »кстрацеллюлярного метрике», также »нявтея на разных стадиях дифферениировки и фенотипическоя

»дуляции ГНК. В литературе имеются данные об экспрессии при этих

о

хэивссах только трех компонентов адгезивных контактов - - и »та-винкулина (01икЬоуа «I а}., 1990;), уьа-1 интегрина (Ве1 к 1п : аI., шло), а также - вариантов фибронектина ((ПикЬоуа е1 а!., 190). Характер жспреесии »тих белков повволяет отнести их к ¡нотипическим маркерам ГМК, а также свидетельствует о том, что >стояние адгезивных -контактов изменяется при процессах (фференцировки и фенотипическоя модуляции ГНК. В то же время, мгющиеся в литературе такого рода данные не дают достаточно >лного представления о реоргаиишации адгезивных контактов при ¡нотипических изменениях ГМК.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось (учение закономерностей экспрессии в гладкой мышие нового жпонента адгезивных контактов, для которого было предложено «звание "ацикулйн".

В работе были поставлены следувиие экспериментальные задачи: очистка из человеческой гладкомыцечноя ткани данного белка и •о биохимическая характеристика,

получение поликлональннх антител к этому белку, «утриклеточная и тканевая локализация ацикулина,

научение экспрессии ацикулина при развитии и фенотипическои »дуляции сосудистб^ГГНК, 1

Научная норизна и практическая ценность работы. Выделен из гадкой мышцы матки человека и биохимически охарактеризован н зый гтоскелетный компонент - ацикулин. Получены аффинно очищенные »ликлональные антитела к изучаемому белку. Изучена тканевая и

з

клеточная локализация »того белка, установлено, что яанныи вело являетря структурным компонентом адгезивных контактов различна типов. Исследован* вкспрассил данного белка в гладкой мыыце rip яифференцировке и фенотипическоя модуляши, показано, что даннь белок может считаться eue одним биохимическим маркере сократительного фенотипа ГМК. На основании данных о содержат данного белка в субслоях нормальной стенки человеческой аор-п атеросклеротической бляшки, а также » стенке аорты крыс ni спонтанной гипертенэии подтверждена описанная ранее в литерату] фенотипическая неоднородность ГНК различных слоев аорты, а так отсутствие фемотилических отличия ГИК аорты в норме и п указанных патологических состояниях.

Полученные в работе результат позволили расыирк существующие представления о строении адгезивных контактов реорганизации этих структур при дифференцировке и фенотипичео модуляции ГНК. На основании ' полученных данных еысказ. предположение, что формирование характерных для гладкомымеч1 ткани адгезивных структур - "плотных бгяиек" - является одним заключительных этапов дифференцировк* ГМК. Обнаружение нов белка-маркера сократигельного фенотипа ГМК позволит получ дополнительные сведение о механизмах дифференцировки фенотипической иод/ляции ГНК в норме и при различ патологических состояниях сосудистой стенки.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной рае представлены на "Европейском мышечном клубе" (Оксфорд, 1991), j Всемирном конгрессе по молекулярной и клеточной биож (Париж, 1991).

Диссертация апробирована на межлабораторном семинаре ютитута экспериментальной кардиологии ВКНЦ АМН СССР. ■бликации. По материалам диссертации опубликовано 2 работы.

Структура а объем работы. Диссертация состоит из разделов: Зведение",."Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты обсуждение", "Заключение", "Выводы", "Указатель литературы", збота изложена на /^Гстраницах машинописного текста, включая рисунков, 4 таблицы и список цитированной литературы (всего источников).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Очистку ацикулина из глалкой мыииы матки человека проводили о методу Burr-idge and Feramiaco (1980), разработанному для «деления компонентов адгезивных контактов, о некоторыми одификациями. При этом получали препарат ацикулина 95-99% истоты. Аффинную очистку ацикулина проводили на *.олонке с «мобилизованными моноклональныни антителами VJD4,

Определение ' частичное аминокислотной «оследоза rej!.i. ■•■. • ■ мтсулина проводилось в лаборатории Яр. frite ley (Великобритания) to методу {Aetiecsold et ut., 1988). Для анализа был взят 35-кД фрагмент ацикулина, полученный методом ограниченного протеолила с «пользованием протеазы ve из st. »«.reus.

Аналитический одномерный гель-электрофорез клеточных и гканевых лизатов, а также чистых белков, проводили по методу Laeeal» (\9?0>.

Двумерный гель-электрофорез проводили по методу o'Kurreii

{1975).

Имм!чоблоттинг проводили, используя метод (rowbin .ч ji.. 1979). На гель наносились равные количества (50-100 ыкг) белка

тканевых и клеточных лизатов. В качестве вторых антите; использовали антитела козы к иммуноглобулинам кролика, лив' антитела козы к иммуноглобулинам мыши, меченные 1251. Дл1 количественного . анализа связавшихся антител реплик; автографировали, после чего полоски нитроцеллюлозы соответствующие ацикулину, вырезали и измеряли радиоактивность i гамма-счетчике

* Для получения поликлональных антител к ацикулину кролико иммунизировали 1 мг нативного, либо электрофоретически очишенног белка в полном адьюванте Фреянда подкожно, в нескол! ких местах Через 4 и 6 недель проводили повторные иммунизации (по 0.5 м белка на кролика в неполном адысванте Фреянда). Получении антисыворотки аффинно очищали на иммобилизованном н нитроцеллюлозе гцикулине (Tallan et al., 1983),

Гладкомышечные клетки аорты выделяли по методу (Chamley Campbell et al., 1977). Фибробласты кожи человека были любезн предоставлены О.И.Орнатскоя (ВКНЦ), клетки астроиитомы - Ю.В Балабановым (Институт экспериментальной медицины, Санкт Петербург), клетки гепатомы - • В.Н.Косых (ВКНЦ), человечески керат.шоциты В.М.Белкиным (Институт биологической и медицинскс химии), культур- гладкомышечных клеток аорты кролика - К.Г Бирюковым (ВКНЦ), первичная культура глаакотшечнык клеток аорт человека - Е.Р.Андреевой (ВКНЦ).

Иммунофлуоресцентное окрашивание криостатных срезов тканей (толщина - 3-5 мкм) проводили после предварительной их фиксг ими в течение 1В ацетоном при комнатной температуре и последующе фиксации метанолом при -2о°С.Культивируемые клетки, выращенные *

окровных стеклах, фиксировали метанолом при -20°С 10 мин. Для дновременного выявлений двух антигенов использовали метод войного окрашивания, при этом для усиления ацикулинового крашивания в качестве вторых антител применяли биотинилированные нтитела козы против иммуноглобулинов кролика и стрептавидин, еченный флуоресцентным красителем "Texas Red". Исследование и Фотографирование препаратов проводили во флуоресцентном [икроскопе Photomicroscope til (Opton).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ^деление ацикулина и первичная характеристика

Для очистки аиикулинл быт использован модифицированные метод »чистки компонентов адгезивных контактов, таких как винкулин, ¡ета-ьинкулин, альфа-актинин и филамин, разработанный Feranisco mil Uurridge (ta8Q), и основанный на избирательной экстракции ¡оппонентов мембранного цитоскелета буфером при низкой иоинол :иле и рН 9.0. По результатам иммуноблоттинга, основная части .-одержаиегося в ткани матки ацикулина эффективно экстрагировалась з ^тих условиях. Из полученного экстракта затем осаждали актин и троволили дробное фракционирования суперната>та сульфатом аммония. Полученную таким образом обогащенную ацикуляпом фр_,сцик; экстракта подвергал» ионообменной хроматографии .¡а <}-Ссферозе, что позвоипло допиться значительной очистки исследуемого белка. Никулин элкнровался с колонки при кониентрагчи :i:¡c, равней 120 иН. Основными примесями в полученных на Этой стадии пр<?'иратах 5ыпи актин и филамин Для и:; удаления содержащие зт<жул..н фракции хроматографировапи на колонке с гид'рсксилапалагмтом. Окончательный выход ацикулина эв-99'V чистоты составлял 1-5 «г из 400 г сырей ткани. Полученный препарат ацикулина лсио^ц,-юг.л/.и дли

.юлучения поликлочальных антител.

При электрофорезе в 7.8* или Ю* ПААГ в присутствии ДДС-как в восстанавливавших, так и в невосстанавливаввих услов* очиыенныя белок мигрировал как диффузная полоса с молекуляр» массой 62-м кД (рис. 1). использование градиентных (6-1 акриламида) гелей позволяло добиться разрешения двух бли: расположенных .юлос - 62 и 64 кД (рис. I), При окрашивании го. Кумасси обе эти полосы выявлялись в приблизительно одинако! соотношении. Обе они одинаково хорошо реагировали как моноклонельными, так и с поликлональНыми антителами исследуемому белку (рис. })• Количественное соотношение этих д полос не изменялось ни на различных этапах очистки белка, ни его хранении, что свидетельствует о том, что полипепти! молекулярной массой 62 кД не является продуктом деградации бе с молекулярной массой 64 кЯ. Пока не удалось установить, cocí молекула аиикулина из двух гомологичных субьединиц с мол. мас< бг и 64 кД# или описанные выше две Полосы соответствуют j изоформам ацикулина, которые присутствуют в глаякомышечноя ti и вместе выделяются. Последнее предположение представляется б< вероятным, так как в некоторых тканях и клетках немыыеч происхождения при иммуноелоттинге выявлялась только одна поло мол. массой 6 4 кД.

Анализ полученного белка с помоыью двумерного злектрофо с последующим иммуноблоттингом (Рис. 1) позволил выя несколько иммунореактивных форм белка с изоточками в диапазон 7.0-7.4. Основная изоформа ацикулина, представляя приблизительно 50-60* от обыего содержания избформ, им^ла pl

А

94 -

67 © в ттттт

43

зо- #

20—® 14*»

А Б 8 Г Д В ЯЗИ К Л

А - стандарты иолекулярных весов

В - тяжелая и легкая

цепи ишуноглобулинов

В - 2С к

Г - частично очи»енный препарат ацикулина

Д - очищенный препарат ацикулина

Е-К - иимуноблоттинг с ионоклональнши антителаии

Я - ииыуноблоттинг о поликлональныии антителами

'исунок- I. Характеристика препарата ацикулина

Белки разделя/л электрофорезом а ПААГ в присутствии |ЛС-На (А, Б) или электрофокусированием <ИЭФ) с последующим 1лектрофорезом {ДДС-Ма> (В).

' А - электрофорез в 10% ПААГ в присутствии ПДС-Ка [репаратов ацикулина.

> электрофорез в градиенте ПААГ 5-?$* в 1фисутствии ДДС-На »чищенного ацикулина (а) и соответствующий ему иммуноолотгинг с >ззными антителами к аци'улику (б ~ е).

Все обнаруженные иммунореактивные формы ацикулина реагировали ка с лоликлональными так и со всеми использованными в настаете работе моноклокальными анти-ацикулиновыми антителами.

Для установления ассоциации ацикулина с цитоскелето проводилась экстракция культивируемых клеток Тритоном Х-100. Был показано, что 60-70* от общего количества содержащегося в клетка ацикулина не экстрагируется детергентом. Распределение аиикулик между растворимои и нерастворимой фракциями в этих эксперимента» было сходно с распределением одного из главных иитоскелетнь компонентов адгезивных контактов - винкулина и свидетельствовал о принадлежности изучаемого белка к компонентам цитоскелета.

Для идентификации исследуемого белка была предприня' попытка анализа его н- концевой аминокислотной последовательное!1! Поскольку N-конец ацикулина оказался блокирован, был провел* ограниченный протеолиз белка с использованием протеазы У8 из ¡3 иигейл. При этом были полуЧены два основых пептида молекулярными массами около 35 и 25 кД. Пептид с молекулярн массой 2 5 кД также имел блокированный N-конец. Секвенирован пептида с молекулярной массой- 3 5 кД позволило получить его концевую последовательность из 17 аминокислот, которая оказала идентична (за исключением одного неидентифииированно аминокислотного остатка) фрагменту аминокислегн

последовательности гликолитического фермента фосфоглюкомутазы скелетных мышц кролика.

Для дальнейшего определения степени сходства ацикулина фосфоглюкомутазы был проведен иммуноелоттинг с антителами аиикулпну коммерческого препарата фосфоглюкомутазы и ацикули! При ¿гом оино обнаружено, что с фосфоглюкомутазой реагируют (

ю

юликлональные. так и : - монжлональные антитела к аникулину. В ■о же время, электрофоретическая подвижность фосфоглюкомутазы 1е<жолько отличалась от электрофоретической подвижности щикулина.

аспоеделение ацикулина в клетках и тканях

Для анализа содержания ацикулина в различных клетках и канях человека соответствующие образцы анализировали при помощи лектрофореза с последующим количественным иммуноблоттингон Табл. 1 и Рис. 2.). Поскольку на авторадиограммах не удавалось

—хл^»—

--вз —

а 6

где* з и

а б

г д о * о

Ткани человека:

- почка

- печень

- иатка

- сердечная ииошч

- скелетная миац*

- мозг

- кожа

- иедил аорты

- интниа аорты

а - коратмиоцити б - кохпио фибрлбласгы в - пирзичнл культура

г - клетки астроцчтони Я - нейроны е - оидотеллй * - гепатома-з - тромбоциты

исунот- 2. Агализ эксгт-эессии ацикулина в различных ткэнпх еповека (А) и в культивируемых клетках (Б) эле-ктрофо ^зом, адиоиммуноблоттингом и последующей радиоавтографиеп.

адежно различать полосы 62 и 64 кД, то полученные резу-чыати

отражают общее содержание ацикулина в исследованных образцах Наиболее высокое содержание ацикулина обнаруживалось в гладки мышцах матки и медии аорты. Сердечная мышца обнаруживал промежуточное содержание ацикулина. В скелетной мышце количеств ацикулина было низким, а в печени, почке, коже и мозге ацикули выявлялся лишь в следовых количествах.

Среди исследованнчх культивируемых клеток (Табл.1, Рис. 2 значительные количества ацикулина содержали только гладкомышечны клетки медии в первичной культуре ранних сроков. Клетк немышечного происхождения, включая кератиноциты, кожнь фибробласты и клеточную линию астроцитомы, содержали значительь меньше ацикулина, чем ГМК. В культивируемых нейрона» эндотелиальных . клетках, клетках гепатомы 4-2, а также тромбоцитах ацикулин выявлялся в следовых количествах. Веськ незначительные количества этого белка обнаруживались также клетках линии моек и в эмбриональных фибробластах крысы (дакш не приводятся). Таким образом, высокий уровень экспресс!

ацикулина является характерной чертой.^ мышечных тканей, особенности - висцеральной и сосудистой- гладких'мышц. Локализация ацикулина в различных' типах адгезивных контактов

Культивируемые ГМК

Поскольку, наиболее высоким содержанием ацикулина сре, исследованных типов культивируемых клеток отличались ГМК,• д. внутриклеточной локализации этого белка были исполъзова] первичные культуры ГМК, медии в течение первых 5 дней пос выделения. При иммунофлуоресцентном окрашивании ант ацикулиновыми антителами живых, а также фиксированных, но пермеабилизованных клеток антиген не выявлялся, что поэволя

едполагать, что ацикулин является внутриклеточным белком.

При непрямом иммунофлуоресцентном окрашивании этих клеток ликлона.-ьными антителами к ацикулину значительная часть

блица 1. Содержание аиикулина в различных человеческих тканях и льтивируемых клетках по . результатам количественного муноблоттинга с поликлональными антителами к ацикулину.

Образец ацикулин,

им'п/мин х то"4

ани:

почка 0 .42

печень 0 .46

гладкая мышца матки 5'. .10

сердечная мышца 1 .45

скелетная мышца 0, .71

мозг 0, . 10

кожа 0. . 23

медия аорты 3 .60

интима аорты 3, .54

льтивируеиые клетки:

кератиноциты 0, ,32

кожные фиброеласты 0, ,36

первичная культура ГМК

(7-ой день после выделения) I. ,82

Астроцитома (линия Asch-7) 0. 27

нейроны 0. 05

эндотелиальные клетки 0. Об

гепатома (линия Пер о-г) 0. 05

тромбоциты 0. 03

тигена локализовалась в области адгезионных бляшек, выявляемых помоиыо интерференционно-отражательной микроскопии. Двойное мунофлуоресцентное окрашивание ацикулина и актина показало, что икулин локализован, в основном, вдоль терминальных участков ресс-фибрилл. При двойном иммунофлуоресцентном окраииваиии

культивируемых ГМК аиикулина и ряда маркеров адгезивных нтактов! винкулина, талина, интегрина было обнаружено раженное сходство в локализации ацикулина и этих белков. Часть

белка выявлялась также в виде плотных бляшкоподобны! цитоплазматических структур, не ассоциированных с областям: адгезивных клонтактов. Количество и внутриклеточное распре'делени! этих структур сильно варьировали в различных клетках

ъ

зависимости от степени распластанности последних. Кроме того ацикулин не обнаруживался в некоторых фокальных контактах особенно в небольших инициальных контактах, располагавшихся краев клеток, тогда как винкулин, талин И интегрин в эти структурах присутствовали. Помимо адгезивных контактов, бело обнаруживался также в терминальных участках пучко микрофиламентов, часто выявляясь при этом довольно удаленным о фокальных контактов. В некоторых ГМК в первичной культуре, также в эмбриональных крысиных фибробластах. последний ти распределения ацикулина был преобладаюиим,' так что организаш' ацикулина в виде линейных иглоподобных структур близко напоминаг организацию стресс-фибрилл.

МйЫУЫ

Гладкие мышцы

При иммунофлуоресцентнон окраыисэнии криостаткых срезс матки человека поликлональными и моноклональными. анто ацикулиновыми антителами ацикулин выявлялся только в висиеральн! гладкомишечных клетках и в ГИК сосудов и не обнаруживался соединительной ткани. Такой характер распределения ацикулш полностью соответствовал представленным выше результата! полученным с помощью иммуноблоттинга (Рис. г, Табл. 1). В то : время, винкулин о-четлив<" выявлялся в соединительной ткани, хо в гладкой мышце присутствовали существенно большие е

»личества.На поперечных .срезах ГНК матки при большом увеличении (являлись одинаково окрашиваемые антителами к аиикулину и откулину примембранные плотные бляшки, (Geiger et al., 1 эа i). Во 1утрет':ей части цитоплазмы ГНК ацикулин (как и винкулин) при гом не обнаруживался.

Сердечная мышца

Иммунофлуоресцентное окрашивание срезов • сердца человека «тителами к ацикулину и винкулину продемонстрировало сходное определение этих белков в кардиомиоцитах. В индивидуальном ардиомиоците наблюдалось два типа распределения 'ацикулина. 1) аиболее значительные количества антигена обнаруживались в айонах межклеточных контактов - вставочных дисках. 2) аблюдалось также менее интенсивное периодическое окрашивание, ^ответствовавшее костамерам кардиомиоцитов. В обоих этих типах груктур локализация ацикулина совпадала с локализацией Никулина, (СМ. также Pardo et al., 1983b; Geiger et Jl., 1985a).

Скелетная мышца

Двойное иммунофлуоресцентное окрашивания антителами к дикулину и к винкулину поперечных . срезов скелетной мышцы эодемонстрироеало ярко выраженное сходство локализации этих двух глков. Как и винкулин, ацикулин, в основном присутствовал в ровеносных сосудах, однако, некоторое анги-аиикулиноваое крашивание обнаруживалось и в сарколемме, В то же время аблюдалось интенсивное, колокализуюшеес.1 с окрашиванием инкулина, окрашивание ацикулина на концах фибрилл скелетных ышц, в участках мышечно-сухожильных соединений. Таким обра-он, омимо талина Cridball et al., 1986) и винкулина (slm.tr и Blur.ii,

1985) адгезивные контакты этого типа содержат также значителы-количества ацикулина.

Таким образом, особенности внутриклеточной локализаш

поведение при экстракции клеток • детергентом, а также

V

селективная экстракция исследуемого белка из гладкомышечной т'к* в условиях, обеспечивающих экстракцию основных компонен' мемранного цитоскелета свидетельствуют о том, что он являв' компонентом адгезивных контактов различных типов, таких : фокальные контакты культивируемых клеток, примембранные плот бляшки гладких мышц, ГавсХа ийЬегеЩе» вставочных дис кардиомиоцитов и мымечно-сухожильные соединения в скелет мышце.

8 Экспрессия ацикулина при рифферениировке и фенотипичес модуляции ГМК

Экспрессия ацикулина в развивающейся гладкой МШШ аорты

Содержание ацикулина в образцах гладкомышечной ткани ас человека определяли с помощью радиоиммуноблоттинга авторадиографии. Результаты этих экспериментов представлены Рис. див Табл. 2). Содержание ацикулина в гладкоьшшечнои т> аорты на разных стадиях ее формирования заметно различалось аорте ю-12-недельного эмбриона выявлялись едва заметные количества. В .юрте 24-х недельного плода содержание содержа ацикулина несколько повышалось, но оставалось еще весьма низ( 8 раннем постнатальном периоде содержание ацикулина в ткани а продолжало увеличиваться, и только к б месяцам после рожд достигало уровня, соатветствуюыего его содержанию а зрелой ме Таким оапазоы, наиболее значительное увеличение содерж ацикулина в человеческой сосудистой гладкомыщечнои т

троисходит а позднем пренатальном и раннем постнатальном периодах зазвития.

Экспрессия ацикулина в эмбриональных сосудистой и ' эисцеральнод гладких мыицах

Для сравнительной оценки содержания ацикулина в сосудистых и , висцеральных гладких мышцах эмбриона человека проводили двойное иммунофлуоресцентное окрашивание кр'иостатных '.тканевых срезов антителами к ацикулину и к винкулину. В стенке аорты ю-недель'ного эмбриона аорты ацикулин, в отличив от винкулина, при помоии иммунофлуоресиенции не выявлялся, что ' находится в соответствии с данными иммунобяоттинга (см. выше). В то же время, трахея и пиыевод, а также матка на аналогичных срезах ярко окрашивалась антителами как и ацикулину, тек и к винкулину. Таким образом, в ходе эмбрионального развития висцеральные ГМК начинают экспрессировать ацикулин значительно раньше, чем ГМК кровеносных сосудов.

Распределение ацикулина в слоях* взрослой аорты

Распределение ацикулина в различных слоях стенки аорты взрослого человека исследовали с помощью иммунофлуоресиенции и количественного йммуноблоттинга, По результатам иммунобяоттинга содержание ацикулина в медии и в мышечно-эластической интиме было высоким и практически не различалось (Рис. 3, Тасл. 2). Однако, в экстрактах субэндотелиальной интимы его содержание было в 6-7 раз ниже, чем в медии и в мыиечно-эластической интиме Л ля подтверждения этих данных проводили двойное иммунофлуоресцентное окрашивание сегментов стенки взрослой аорта антителами к ацикулину и винкулину. При этом ГЛК медии и мыиечно-эластической

интимы ярко окрашивались обоими антителами. Винкулин выявлялся ГМК всех трех гладкомышечных слоев стенки аорты, тогда ке субэндотелиал-->ная ингима почти не содержала аиикулин-позитивнь клеток, и лишь некоторые клетки этого слоя проявляли слабс аиикулиновое окрашивание. Как известно, ГМК интимы По ряду морфе

а <5 в г д llopuim .ад культура ЮТ ир'...и«а: а -'мидия

б - fuioruart кулыгура, 2 дня о - редкая культура. 2 дни г - плотная культура, 10 дней д - редкая культура, 10 дней

1

Рисунок з. Анализ экспрессии ацикулнна в аорте человека (А) и первичной культуре ГМК аорты кролика (Б) электрофорезе радиоиммунодлоттингом и последующей радиоавтографией.

а б и г д е * а и

Рмщщающлси .89В1Й1 а - эибрион, 3-10 недель в - плод,- '¿4 ««доли в - ребенок, а иосица г - ребенок, 6 иеощив д - ребенок, 1.6 года о - ребенок, 12 лег. ыедия Слои взрослой аорт: ж - исдик

з - шмечно-иластическая ингима и - субиндотшшальная интима

Ллица 2. Экспрессия ацикулина в человеческой аорте и в -льтивируемых кроличьих ГМК (данные количественного муноблоттинга)

Источник гладкой мыицы

ацикулин, имп/мин х 1 о

-4

Развивающаяся человеческая аорта 12-ти недельная эмбриональная аорта 24-х недельная эмбриональная аорта 3-х месячная детская аорта 6-и месячная детская аорта 1.5-летняя детская аорта 12-ти летняя детская аорта, медия Слои стенки взрослой аорты медия

мышечно-эластическая интима субэндотелиальная интима Культивируемые ГМК аорты кролика, первичная культура: интактная медия

культура с высокой плотностью,. 2 дня культура с низкой плотностью, 2 дня культура с высокой плотностью, 10 дней культура с низкой плотностью, 10 дней

21 65

1.18 3.02

57 72

02 69

0.58

3.95 3.60 3 . 73 3.18 О.36

нкчиональных признаков напоминают культивируемые ГМК креторного фенотипа. Сходный фенотип присуи недифферениирован-м ГМК на ранних стадиях формирования сосуда. Данные луноблоттинга и иммунофлуоресценции свидетельствуют о том, что ;окое содержание ацикулина является- характерной чертой ГМК <ратительного фенотипа.

Экспрессия ацикулина в культивируемых ГИК Экспрессия ацикулина при модуляции фенотипа медиальных ГМК эти человека в первичной культуре

Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание ГМК мьдии вскоре :ле их прикрепления и распластывания (2-3 дни культивирования использованием антител к ацикулину и винкулину показало, что з эти белка присутствуют в фокальных контактах клеток. На

стадии ГНК в первичной культуре характеризовались высоким содержанием ацикулина. После качала пролиферации клеток (10-12 дни культивирования) наблюдалось резкое падение содержания в ни» ацикулина. Фокальные контакты ГНК таких клеток не окрашивали« антителами к ацикулину, либо содержали следовые количества этог< белка. Яркость винкупинового окрашивания фокальных контактов ГМ1 оставалась одинаково высокой на протяжении всего данного период) культивирования, В пассируемых ГМК содержание ацикулина был крайне низким, а при иммунофлуоресцентном окрашивании клеток о не выявлялся. -

Известно, что в условиях культивирование, аналогичны использованным в описанных выше экспериментах, происходи модуляция фенотипа ГМК, приводящая к утрате клетками признаке сократительного' фенотипа и преходе их в секреторное состояние Анализ изменений содержания ацикулина в ГМК в этих услови( показывает, 470 для. ГНК сократительного фенотипа^ характер« высокий уровень экспрессии ^того белк_, резко снижающийся щ переходе клеток к секреторному фенотипу. , " '.'

Регулируемая плотностью культуры экспрессия ацикулина культивируемых ГНК •

Приводимые в литературе данные свидетельствуют, что скорое фенотипической модуляции ГИК в первичнои культуре, зависит-исходно^ Плотности посадки клеток (СаврЬеИ ег а!.., 1968). , I исследования уровня экспрессии ацикулина в . первичных куяьту% ГНК различной плотности исполь^зовались ГМК аорты кроли»

5 2 '' •

посаженные с высокой (1,5x1 о клеток/см ) и низкой <0.гх

2 ' -клеток/см ) плотностью. Содержание и локализации ацикул:

пределяли методами количественного иммунобло-гтинга и иыунофлуоресиениии а культурах ГШ на г-я и ю-я дни после >садки (Рис.. 3 и Тавл. 2). Независимо от исходной плотности »садки экспрессия ашкулина на 2-й день культивирования была акоя же, как и В интектноя медии аорты кролика (Рис. з, Табл.2). *реэ »0 дней культивирования в культуре с исходно» низкой потностъю посадки, как и в культурах ГМКмедии человека зблпдалось значительное снижение уровня экспрессии ацикулина. В ('льтурах с внсокоя плотностью посадки уровень экспрессии Никулина за это время практически но изменялся.! При двойном *мунофлуоресцентном окрашивании ю-дневных редкой и густой

лпьтур ГНК аорты кролика антителами к аиикулину и винкулину было

!

жазано, что аникулин исчезает из фокальных контактов клеток в !Дкоя культуре и, наоборот, сохраняется в клетках культур с гсокой плотностью посадки. В иелом, эти данные позволяют зедположить. что уровень экспрессия ацикулина в культивируемых «С зависит от фенотипического состояния клеток и может !гулироваться межклеточными взаимодействиями. Таким

¡разом, высокий уровень экспрессии ацикулина в «фференцированных ГМК сократительного фенотипа, представленными тетками медии и мымечно-эластической интимы, пониженное ¡держание этого белка а ГИК секреторного фенотипа, а также ;зкое снижение его экспрессии при фенотипическоя модуляции ГМК >зволяют отнести ацикулин «е Оелкам-маркерам сократительного ¡нотипа этих клеток.

Экспрессия ацикулина „, ща сердечно-сосудистых патологиях

Содержание ацикулина в ГИК атеросхлеротической бляшке аорты треде ляли методом радиоиммуноблотдата. В субэндотелиальнои

интиме иа атеросклеротической сляшки количество ацикулин» бил заметно, ниже, чей в медии и В мыыечно эластическое интиме Пр этом не наблюдалось отличии в содержании аиикулина в субслоя

иэрналъного сосуда и участка атеросклеротической бляшки. »

Сходные данные о содержании других иитоскелетних еелкос .маркеров сократительного фенотипа ГНК в опасное атеросклеротическоя бляшки . и нормальной стенки сосуда бы/ получены Глуховой с соавт. <с1ик(юуа ее а!., 1ввО}: содержание субслоях атеросклеротической бляшки мета-винкулина и 160-« калдесмона было таким . же, как в нормальной стенке аорт) отличалось ' лишь содержание гладкомыыечного «¿-актина: субэндотелиальной интиме атеросклеротическоя бляшки «I содержание было существенно ниже в сравнении с нормальн участком аорты. Полученные данные с учетом данных Глуховой соавт. не позволяют пока однозначно ответить на вопрос происхождении, клеток атеросклеротической бляшки, тем не мене отсутствие изменений в содержании аиикулина . в субсло атеросклеротической бляшки в сравнении с нормальной стенк сосуда свидетельствует в пользу предположения, что Г атеросклеротической бляшки фенотипически не отличаются, от Г сс ветствуюиих субслоев нормальной стенки сосуда,

При исследовании экспрессии аиикулина в стенке а£>р71(1 -к| со спонтанной гипертонией (йши отличий в содержании этого бе^ от крыс контрольной группы (НКУ) обнаружено не было. Так наблюдалось отсутствие различий в содержании мета-винкулина 150-кД-калдесмона. Отсутствие видимой разницы а содержании в белков в нормальной крысиной аорте и в ее утолщенной стенке

понтанно-гилертензивных крыс подтверждает описанное а литературе тсутствие фенотипичеекой модуляции к пролиферации ГМК в крупных осудах при этом заболевании.

ВЫВОДЫ

Из обогаменной белками мембранного цитоскелета фракции ладкомыыечнои ткани матки человека выделен не. описании» ранее итоскелетныя белок с кажущейся молекулярной массой - 62-64 кя^ редстаеленныя несколькими иммуноревктиаными формами с pt в иапазоне рН 7.0 - 7.4 и обнаруживающий структурное и ммунологическое родство с гликолитическим ферментом

осфоглюкомутазоя. Предложено название обнаруженного белка -

t

цикулин.

Локализация ацикулииа в тканях и культивируемых клетках видетельствует о том, что этот белок является компонентом пгезивных контактов, таких как fascla adhérentes и костамеры ардиомиоиитов, мышечно-сухожильные -соединения фибрилл скелетных ыиц, плотные бляшки гладкомышечных клеток и фокальные контакты ультивируемых клеток.

. Анализ содержания ацикулина в тканях и культивируемых клетках эказывает, что высокий уровень его экспрессии является арактерным .свойством мышечных тканей. Наиболее высоким эдержанием ацикулина отличаются клетки зрелой гладкомышечной кани сократительного фенотипа.

. Особенности экспрессии ацикулина в культуре гладкомышечных петок и в клетках формирующейся сосудистой стенки позволяет гнести его к маркерам сократительного фенотипа гладкомышечных петок.

гз

5. Характер распределения аиикулина в сосудистой стенке отража фенотипическую неоднородность гладкомышечных клеток различных

слоев и является дополнительным подтверждением имеющихся *

литературе данных о близости фенотипа клеток субэндотелиальн >

интимы к секреторному фенотипу. Содержание ацикулина в сусслс аорты в атеросклеротической бляшке и в аорте крыс со спонтан» гиперотониеи подтверждает данные литературы о том, что феноч ГНК при этих состояниях сосудистой стенки не меняется.

6. В целом, результаты проведенного исследования свидетельству! что изменение фенотипического состояния гладкомышечных кле1 сопровождается существенной реорганизацией структ обеспечивающих взаимодействие этих клеток с микроокружением позволяют предполагать, что формирование характерных гладкомышечной ткани адгезивных контактов - "плотных бляшек" является одним из завершающих этапов дифференцирс гладкомышечных клеток.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. И.Е. LuKasliev, A.M. Relkln, I.V. K1luanskayu, and 1

Koteliansfcy. rtciculin: a novel developmentatiy regulated pri>

' st

associated with adherens junctions, l World Congress C. lular and Molecular Biology (1991), Paris. Abstracts, p.20 2: A.M. Belklh, I.V. К1Imanskaya, M.E. Luklashev, Kotellansky, and E.P. Ogryzko. Aclculin: a nen component adherertS junctions. European Muscle Club, XX Annual Meet (1991), Oxford, UK. Abstracts, p.94