Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение тканеспецифичности генной экспрессии структурных белков мышечной ткани человека

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ковалева, Марина Анатольевна, Москва

I ,/ / /

1 7

Л

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи УДК 577. 151.645:616.056.7

КОВАЛЕВА Марина Анатольевна

ИЗУЧЕНИЕ ТКАНЕСПЕЦИФИЧНОСТИ ГЕННОЙ ЭКСПРЕССИИ СТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ ЧЕЛОВЕКА.

03.00.15 - Генетика 03.00.04 - Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Шишкин С.С.

доктор биологических наук,

Ковалев Л.И.

Москва

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ........................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ.....................................................................................6

ГЛАВА 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ИЗУЧЕНИИЕ ИНФОРМАЦИОННОГО СОДЕРЖАНИЯ ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА С.ПОМОЩЬЮ АНАЛИЗА ПРОДУКТОВ ГЕННОЙ

ЭКСПРЕССИИ НА ПРИМЕРЕ МЫШЕЧНЫХ ТКАНЕЙ ЧЕЛОВЕКА..............14

1.1. Системный подход к изучению БПГЭ в биохимической генетике.................................................................14

1.2. Исследования БПГЭ в миокарде, скелетных и гладких тканях человека...........,.............................................31

1.3. Некоторые структурные белки мышечной ткани................38

1.4. Биохимическая и,молекулярная генетика бокового амиотрофического склероза..................................................44

1.5. Молекулярные исследования БПГЭ при некоторых прогрессирующих!;мщечных дистрофиях..............................49

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ....................................................................59

2.1. Реактивы и биологические материалы................................59

2.1.1. Реактивы____............:........................................59

2.1.2. Биологические материалы..................................................59

2.2. Подготовка образцов для проведения двумерного электрофореза.................................................................61

2.3. Фракционирование белков двумерным электрофорезом.. 61

2.4. Иммуноблоттинг........................................................................66

2.5. Денситометрия одномерных и двумерных электрофоре-грамм. Компьютерный анализ результатов и статистическая обработка .„данных......................................................67

2.6. Микросеквенирование белков................................................68

2.6.1. Подготовка белка к микросеквенированию и хрома-

тографическое разделение пептидов..............................68

2. 6.2. N-концевое микросеквенирование....................................69

2.7. Определение концентрации белка........................................69

2. 8. Фотографирование и сушка гелей........................................70

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.......................... 71

3.1. Исследование специфичности экспрессии некоторых структурных белков мышечной ткани человека........71

3.1.1. Идентификация^предсердноспецифичного белка.......77

3.1.2. Выявление редкого варианта белка легкой цепи миозина 1 человека.............................. 81

3.2. Построение двумерной электрофоретической карты и каталога белков ¡ .поперечнополосатой скелетной мышцы человека..................................... 86

3.3. Построение двумерной карты белков гладкой мышцы человека......^-.у................................. 97

3.4. Идентификация белков на двумерной карте поперечнополосатой и гладкой мускулатуры...................100

3.5. Изучение генетических изменений в белках поперечнополосатой мышечной ткани человека.................110

3.5.1. Исследование ¡генетического полиморфизма в ткани

сердца человека.................................110

3.5.2. Исследование генетического полиморфизма в ткани

скелетной мышцы человека........................116

3.6. Изучение изменений спектра белкового состава мышечной ткани человека при различных наследственных нервно-мышечных заболеваниях ................. 116

3.6.1. Изучение белкового состава скелетной мышцы человека при боковом амиотрофическом склерозе...116

3.6.2. Изучение белкового состава скелетной мышцы человека при некоторых формах прогрессирующих мышечных дистрофий..............................121

3.6.3. Анализ изменений белкового состава при патологии гладкой мышцы...................................125

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................127

ВЫВОДЫ.......................................................130

ЛИТЕРАТУРА...................................................132

ПРИЛОЖЕНИЕ...................................................165

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АТФ аденозин-3-фосфат

БАС боковой амиотрофический склероз

БПГЭ белковые продукты генной экспрессии

ГЗФД глицеральальдегид-3-фосфат дегидрогеназа

ИЭФ изоэлектрическое фокусирование

2ДЭФ двумерный электрофорез по О'Фарреллу

КФК креатинфосфокиназа

ЛЦМ легкие цепи миозина

МКАТ моноклональные антитела

ТМ тропомиозин ;;

ТЦМ тяжелые цепи миозина

ПААГ полиакриламидный гель

ПМД прогрессирующая мышечная дистрофия

ПСА персульфат аммония

СВВ Кумасси бриллиантовый голубой й-250

СОД супероксиддисмутаза

ТЕМЕД тетраметилэтилендиамид

ЦНС центральная нервная система

ФАГ фенилаланингидроксилаза

БОБ додецилсульфэт натрия

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы.

Изучение особенностей функционирования генома человека, проявляющегося в виде экспрессии определенного набора генов в разных видах мышечной ткани, поперечнополосатой и гладкой, является одной из интенсивно разрабатывающихся областей биохимической генетики [Nakanlshi Т. et al., 1988; Scrlver С. et al.,1989; Collins С. et al.,1992]. Генетический контроль за синтезом белков мышечной ткани привлекает пристальное внимание многих исследователей вследствии того, что на этом уровне обеспечивается образование характерного тканеспецифичного набора белков - своеобразного "белкового портрета" ткани, а нарушения соответствующих процессов приводят к появлению различных форм наследственной или врожденной патологии человека [Sasaki Т. et а1.,1996].

Высокая частота и тяжесть болезней мышечной ткани человека, при сравнительно малой информированности о молекулярных основах структурно-функциональной ¡организации этой высоко дифференцированной ткани, делают весьма актуальными исследования белковых продуктов генной экспрессии (БПГЭ) в мышечной ткани человека и высших эукариот [Hlrzel 0. -et al.,1985; Starr С. et al.,1989; Knecht M. et al.,1994; Robert H. ,1997].

Зарубежными и отечественными исследованиями только за последние 5-10 лет достигнут существенный прогресс в изучении метаболизма и функционирования сократительной системы, что нашло отражение в расширении наших знаний о ней, начиная от выявления новых

белков и генов [Tiso N. et al.,1997] и кончая решением многих вопросов этиологии и патогенеза ряда наследственных заболеваний мышечной ткани человека, вплоть до разработки подходов к геноте-рапии. Обнаружение феномена альтернативного сплайсинга и установление его роли в синтезе тканеспецифичных изоформ сократительных белков [Breitbart М. et al.,1987; Singer М., Berg P.,1991; Morano I. et al,1997] открыло путь к изучению заболеваний, характеризующихся поражением только отдельных групп мышц, а экспрессия мышечных белков в других тканях позволила приступить к изучению механизмов патогенеза генерализованных поражений на уровне организма.

В целом, благодаря развитию теоретических представлений о механизмах генной экспрессии, о связях между генами и детерминируемыми ими признаками (белками), а также благодаря появлению новых технологий изучения БПГЭ, в 80-тые годы сформулировалось специальное направление в биохимической генетике, которое получило название "молекулярная , ;анатомия" [Anderson N.G.,Anderson N.L.,1979; Шишкин С.С.,1985], а в дальнейшем трансформировалось в системный подход к изучению белковых продуктов генной экспрессии [Anderson N.G., Anderson N.L., 1982,1991; Klose J., 1989,1995; Cells J. et al.,1990,1991,1993,1996; Шишкин С. С., Калинин В.Н., 1992; Малыгин А.Г.,1993], совершенствование которого продолжается и поныне.

Данный подход аккумулирует исследования БПГЭ, конечной целью которых в принципе может стать формирование подробного каталога всех белков человека. Предполагается, что такой каталог будет содержать сводные данные результатов изучения белковых составов всех имеющихся типов клеток человека. Унифицированная методика, лежащая в основе системного;подхода, позволяет параллельно анали-

j

зировать до нескольких тысяч белков, что особенно привлекательно для изучения многих генетических вопросов, и представляется существенным в разработке стратегической проблемы - комплексного исследования генома человека, включая проблему дифференциальной экспрессии генов. Системный подход к изучению БПГЭ позволяет идентифицировать активно транскрибирующиеся области генома в дифференцированных клетках и исследовать функционально активные гены.

На этой основе в ряде лабораторий мира формируются компьютерные белковые банки данных.

Не вызывает сомнений, что получение информации о механизмах генетического контроля за синтезом белков мышечной ткани человека, об их первичной структуре, об их субклеточном и тканевом распределении,а также об изменениях, обусловленных патологией будут способствовать решению ряда взаимосвязанных проблем медицинской генетики и биохимии [Epstein Ch.J., 1997].

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы явилось изучение комплекса наиболее представленных БПГЭ в сердечной, скелетной и гладкой мышцах человека (с уточнением и/или-построением "белковых портретов" этих тканей). На полученной базеспроведено исследование изменений БПГЭ в ходе некоторых генетически контролируемых процессов, а также при различных заболеваниях мышечной ткани. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1) изучить комплекс структурных и наиболее представленных БПГЭ в скелетных и гладких мышцах человека на основе системного анали-

за. Построить/дополнить двумерные белковые карты указанных тканей. Полученные данные использовать для создания обобщенного компьютерного каталога белков мышечной ткани человека;

2) разработать методические подходы и провести идентификацию ряда полипептидных пятен на двумерных картах анализируемых мышечных тканей;

3) изучить особенности генной экспрессии в различных видах скелетных мышц, миокарде и„гладкой мышце, и осуществить поиск полиморфных и редких вариантов БПГЭ в мышечных тканях;

4) оценить тканеспецифичность структурных белков в различных видах мышечной ткани человека;

5) изучить изменения генной экспрессии на уровне белков в скелетной и гладкой мышце человека при ряде форм наследственной и ненаследственной мышечной патологии;

Научная новизна:

Впервые на основе применения системного подхода получены обобщенные данные о комплексе более четырехсот БПГЭ человека, которые наиболее представлены в мышечной ткани человека (миокарде, скелетной и гладкой мышцах). Данный комплекс БПГЭ может рассматриваться как характерный, генетически детерминированный "белковый портрет" исследованных тканей. Все результаты суммированы в виде обобщенного компьютерного каталога (версия 4.0) БПГЭ мышечной ткани человека. ,-:а-;

Получены новые результаты в идентификации белков на двумерных картах изученных тканей. Для сердечной мышцы по результатам определения фрагментов аминокислотной последовательности идентифици-

ровано 7 белков и три фракции идентифицированы с помощью комигра-ции. Кроме этого, определены фрагменты последовательности пред-сердноспецифического белка 4310504, которые не были найдены в банках данных аминокислотных последовательностей, но проявляли гомологию с семейством легкой цепи 1 миозина, и, соответственно, его можно считать новым представителем этого семейства. Для ткани скелетной мышцы с использованием комиграции было идентифицировано положение 43 полипептидов, ,_а для ткани гладкой мышцы идентифицировано положение 6 полипептидов.

Впервые обнаружен новый редкий вариант белка ЛЦМ 1-Ч/зЪ, как в ткани миокарда, так и в скелетной мышце человека, отличающийся от обычной формы единичной аминокислотной заменой в первичной структуре.

Выявлено 3 белка, как в.миокарде, так и в скелетной мышце, проявляющих генетический полиморфизм. Частоты встречаемости ал-лельных вариантов данных Щелков соответствовали распределению Харди-Вайнберга.

Получены новые данные об изменениях генной экспрессии (на уровне белков) в ткани скелетной мышцы при боковом амиотрофичес-ком склерозе и одной из форм прогрессирующих мышечных дистрофий, а также в миоматозной гладкомышечной ткани.

Научно-практическая значимость работы

Выявлен и изучен комплекс; 474 наиболее представленных БПГЭ в мышечных тканях человека. На этой основе построен обобщенный компьютерный каталог (версия. 4.0) БПГЭ мышц человека, впервые дополненный информацией по гладкой мышечной ткани, который отражает

- и -

особенности функционирования генома при дифференцировке по мышечному типу.

Таким образом, полученные данные (новая версия каталога) открывают широкие возможности изучения особенностей белкового состава мышечных тканей в норме и при различных видах наследственной патологии человека, а также для выяснения молекулярных механизмов патогенеза и этиологии соответствующих заболеваний.

Проведено сравнительное,.,, изучение тканеспецифичности распределения белков в различных видах мышечной ткани человека, что позволяет выбрать кандидатные белки для разработки специфических тестов на дистрофические процессы в миокарде, его отделах, в скелетных и гладких мышцах,; ¡а также проведении прицельного поиска изменений в тканеспецифичных белках при тканеспецифичных поражениях.

Дальнейшее изучение выявленного нового предсердноспецифическо-го белка, возможно, позволит обнаружить новый ген, кодирующий данный продукт. Также, такие результаты отмечают значимость исследований первичной структуры БПГЭ, полученных с помощью 2ДЭФ для поисков новых генов, и, соответственно, изучения информационного содержания генома человека. :

Предложен ряд методических приемов для подготовки образцов к проведению миокросеквениррвания белков из суммарных экстрактов мышечных тканей, фракционированных двумерным электрофорезом.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Охарактеризованы особенности генной экспрессии во всех трех основных типах мышечной ткани (скелетной мышце, мышце сердца и

гладкой мышце ) человека, выражающейся в формировании определенными белкрвыми продуктами различных тканеспецифичных фила-ментов.

2. Создана новая обобщенная версия компьютерного банка данных GEP - НМ 4.О ( gene expression products - human muscle ), содержащая информацию о 474 белковых продуктах генной экспрессии и включившая сведения об особенностях генной экспрессии в гладкой мышце человека. В основном комплексе белковых продуктов генной экспрессии мышечных тканей идентифицировано с известными белками для ткани миокарда 10 полипептидов, для скелетной мышцы 43 полипептида и для гладкой мышцы 7 поЛипецтй'дов.

3. Среди основного комплекса белковых продуктов генной экспрессии мышечных тканей выявлены 3 полиморфных белка, частоты встречаемости которых соответствуют ожидаемым, исходя из равновесия Харди- Вайнберга.

4. При исследовании патологических образцов обнаружено:

а) в скелетной мышечной ткани от больных боковым амиотро-фическим склерозом выявлено специфичное исчезновение 3 ске-летноспецифичных полипептидов. Для белка 4330795 отмечена корреляция между изменением в количестве и клинической формой заболевания.

б) при исследованной форме ПМД, предположено, что дефект свя-

зан с одним из генов, экспрессирующих дистрофин-ассоциированные белки;

в) при изучений образцов миом мишетрия обнаружено исчезновение до 12 БПГЭ, идентификация которых может способствовать лучшему пониманию механизмов патогенеза заболевания.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. ИЗУЧЕНИИЕ ИНФОРМАЦИОННОГО СОДЕРЖАНИЯ ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ АНАЛИЗА ПРОДУКТОВ ГЕННОЙ ЭКСПРЕССИИ НА ПРИМЕРЕ МЫШЕЧНЫХ ТКАНЕЙ ЧЕЛОВЕКА.

1.1. Системный подход в биохимической генетике.

Одной из наиболее интенсивно разрабатываемых областей современной генетики человека является исследование информационного содержания генома [Баев A.A., 1990; Fields S. et al., 1994, 1997], что в настоящее время реализуется в виде международной научной программы "Геном.человека", включающей в себя ряд национальных программ. Кроме этого, в последние годы начаты активные работы, являющиеся важным;дополнением этой программы по изучению белковых продуктов генной экспрессии и обозначаемые как программа "Протеом человека" [Cells J. et al.,1989, 1991, 1996; Sanchez J. et al.,1994; Appel R. et al.,1996].

Последняя программа базируется на выявленных закономерностях реализации генетической информации [Айала Ф., Кайгер Дж., 1987; Фогель Ф., Мотульски А. 1990], т.е. прямого детерминирования генами структуры продуктов генной экспрессии - белков [Anderson N.G. and Anderson N.L.,1982; Bravo R. and Celis J.,1984; Шишкин С.С., Калинин В.Н.,1992]. Расшифровка генетического кода, и, следовательно, механизмов биосинтеза белков и ряда других межмолекулярных процессов дали -возможность рассматривать данные о генной экспрессии и образующихся в .результате белках, как подход к изучению особенностей функционирования генетического аппарата во

Л I

всех биологических объектах [Duncan R., McConkey Е.,1982; Anderson N.G., Anderson N. L., 1984; Шишкин С. С., 1985; Klose J. ,1989]. Второй компонент этой программы - системный подход, позволяющий параллельно изучать тысячи БПГЭ практически любого биологического обьекта [Klose J., 1989, 1995; Cells J. et al. ,1989,1991,1996; Leffers H. et al., 1996;. Anderson L., Seilha