Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Технология интенсивного возделывания виноградников в зоне укрывной культуры Армении

ВАК РФ 06.01.08, Виноградарство

Автореферат диссертации по теме "Технология интенсивного возделывания виноградников в зоне укрывной культуры Армении"

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА .И ПРОДСВОЛЬСТГКЯ РЕСП7ЕЛШ ИШШШ "

АШЯЯСКИЙ .НАУЧНО-ИССЩДСВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВИНОГРАДАРСТВА, ШШОДГЛИЯ И ПЛОДОВОДСТВА

ЕАРСЕПМ ГОЖ ЗАЖЕЕКОБК

ТЕШШ01ИЯ ИНШСИШОГО ВОЗДЕЛЫВАНИЯ ВИНОГРАДНИКОВ В ЗОНЕ УКШБНСЙ КУЛЬТТШ ШШЖ

0,6'010? Спепаальносты 3.0I..05 — Виноградарство

АВТОРЕФЕРАТ

дассврташяг на соисканае ученой стелеЕП доктора сельскохозяйственных .наук

ЕРЕВАН - I9S6

Работа выполнена в научно-исследовательском институте нинотрадарства, виноделия ж плодоводства ЫСХиП РА

Официальные оппоненты: доктор биологических надо, профессор, академик НАН РА пагОСЙН К.С.

доктор биологических наук, профессор, акадешк НАН РА МЕЛКСНЯН 1.1 .В.

дсхгтор тохшгчесгак наук, профессор, ахадешк СХА РА ГРИГОРЯН Ш.М.

Ведпяая организация: Армянская сельскохозяйственная . академия.

Защита состоится " / ' $ё'РмЯс^рЯ, 1996 года в " часов на заседании специализированного совета 015 Армянского научно-исследовательского института виноградарства, виноделия и плодоводства.

■ .Адрес: 376312, Республик Армения, Эчыиадзинский район, поселок Мерцаван. •

С диссертацией мсено ознакомиться в библиотеке Ар.:. НИИ ЗШиП.

Автореферат разослан п jjсг.

Учений секретарь специализированного совета, > д. л кандидат с.-х. наук' D • пМЦ^Щ • МИКАЕШШ В .1.1.

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи УДК 616 056.7.577.151.645

КОВАЛЕВ Леонид Иванович

СИСТЕМНЫЙ ПОДХОД В ИЗУЧЕНИИ ТКАНЕСПЕЦ1ШЧН0СТИ ГЕННОЙ ЭКСПРЕССИИ В ПОПЕРЕЧНОПОЛОСАТОЙ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ ЧЕЛОВЕКА.

03.00.15 "генетика" 03.00.04 "биохимия"

Автореферат• диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 1995

Работа выполнена в Институте генетики человека (директор - профессор С.С Шишкин) Медико-генетического Научного Центра РАИН (директор - академик РАМН, профессор В.И.Иванов).

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор С.С.Шишкин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В С.Баранов

доктор биологических наук, профессор В.А.Сгшцын

доктор биологических наук, профессор А.Я.Николаев

Ведущее учреждение - Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН

Защита состоится "2" октября 1995 г. в " ч. на заседании Специализированного Совета Д. 001.16.01 при Медико-генетическом Научном центре РАМН ( Москва. 115478. ул. Москворечье, д. 1 )

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Медико-генетического научного Центра РАМН.

Автореферат разослан "25'" ч^М 1995 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор биологических наук, профессор

Л.Ф. Курило

ВВЕДЕНИЕ.

Изучение особенностей функционирования генома человека, проявляющегося в виде экспрессии определенного набора генов в разных видах мышечной ткани, и в частности в миокарде, является одной Из интенсивно разрабатывающихся областей биохимической генетики (Na-kanlshl Т. et al., 1988; Scrlver С. et al.,1989; Collins С. et al.,1992), Генетический контроль за синтезом белков мышечной ткани привлекает пристальное внимание многих исследователей вследс-твии того, что на этом уровне обеспечивается образование характерного тканеспецифичного набора белков - своеобразного "белкового портрета" ткани, а нарушения соответствующих процессов могут приводить к появлению различных форм наследственной или врожденной патологии человека.

Высокая частота и тяжесть болезней миокарда, человека при сравнительно малой информированости о молекулярных основах структурно-функциональной организации этой высоко дифференцированной ткани делают весьма актуальными исследования белковых продуктов генной экспрессии (БПГЭ) в сердечной мышце человека и высших эукари-от (Hlrzel 0. et al., 1985; Starr С. et al.,1989; Knecht M. et al., 1994).

Зарубежными и отечественными исследованиями только за последние 5-10 лет достигнут существенный прогресс в изучении метаболизма и функционирования сократительной системы, что нашло отражение в расширении наших знаний о ней начиная от выявления новых белков и генов, и кончая решением некоторых вопросов этиологии и патогенеза ряда наследственных заболеваний мышечной ткани человека, вплоть до разработки подходов к генотерапии. Обнаружение феномена альтернативного сплайсинга и установление его роли в синтезе тканеспецифичных изоформ'сократительных белков (Breitbart М. et al.,1987; Singer М., Berg P..1991) открыло путь к изучению за-

болеваний характеризующихся поражением только отдельных групп мышц, а экспрессия мышечных белков в других тканях позволила приступить к изучению механизмов патогенеза генерализованных поражений на уровне организма.

В целом, благодаря развитию теоретических представлений о механизмах генной экспрессии, о связях между генами и детерминируемыми ими признаками (белками), а также благодаря появлению новых технологий изучения БПГЭ, в 80-тые годы сформулировалось специальное направление в биохимической генетике, которое получило название " молекулярная анатомия" (Anderson N.G..Anderson H.L..1979; Шишкин С.С., 1985). а в дальнейшем системный подход к изучению белковых продуктов генной экспрессии (Anderson N.G.. Anderson К.L..1982; Klose J..1989; Cells J. et al..1990.1991; Шишкин С.С..Калинин В.Н.. 1992; Малыгин А.Г..1993), совершенствование которого продолжается и поныне. Данный подход аккумулирует исследования БПГЭ. конечной целью которых в принципе монет стать формирование подробного каталога всех белков человека. Предполагается, что такой каталог будет содержать сводные данные результатов изучения белковых составов всех имеющихся типов клеток человека. Унифицированная методика, лежащая в основе системного

t

подхода, позволяет параллельно анализировать до нескольких тыся1-белков, что особенно привлекательно для изучения многих генетических вопросов, и представляется существенным в разработке стратегической проблемы - комплексного исследования генома человека, вклэчая проблему дифференциальной экспрессии генов. Системны! подход к изучению БПГЭ позволяет идентифицировать активно транскрибирующееся области генома в дифференцированных клетках и исследовать функционально активные гены.

. На современной стадии развития.системного подхода к изучена БПГЭ значительная часть работ еще посвящена созданию технологических усовершенствований методической базы ( компьютерной обра-

5отке результатов фракционирования, улучшению качества разделения 5елков, способов идентификации и др.). Однако уже. во' многих лабораториях развернулись исследования направленные на непосредствен-юе получение информации о белковых продуктах генной экспрессии. Эти исследования пока сосредоточены на изучении отдельных объектов - а) культивируемых клетках человека, таких как фибробласты, <ератиноциты, лимфоциты. AMA клетки (Cells J. et al., 1984,1990.1991.1993); б) биологических жидкостей - плазмы и спин-юмозговой жидкости (Anderson N., Anderson L., 1991; Golaz 0. ot 31. ,1993; Harrington M. et al. .1985; Merrll C. et al., 1988; Mer-"11 C. et al., 1984) и в) некоторых отдельных тканях и органах че-иовека - печень, мозг и миокард (Sanchez J. et al.,1984; Merrll

et al., 1984; Corbett J. et al.. 1984).

На этой основе в ряде лабораторий мира формируются компьютер-аде белковые банки данных.

Не вызывает сомнений, что получение информации о механизмах, генетического контроля за синтезом белков мышечной ткани человека, об их первичной структуре, об их субклеточном и тканевом эаспределении, онтогенетических особенностях экспрессии генов в юрме, а также об изменениях обусловленных патологией будут спо-зобствовать решению ряда взаимосвязанных проблем медицинской ге-яетики и биохимии. Широкие возможности, открывающиеся при использовании системного подхода в изучении БПГЭ мышечной ткани человека, демонстрируют результаты представленных ниже экспериментов.

Цель и задачи исследования.

Настоящая работа имела целью охарактеризовать комплекс наиболее представленных БПГЭ в сердечной и скелетных мышцах человека (построить "белковые портреты" этих тканей) и изучить изменения 5ПГЭ в ходе некоторых генетически контролируемых процессов, а

также при различных заболеваниях мышцы сердца. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1) изучить комплекс наиболее представленных БПГЗ в миокарде и скелетных мышцах человека на основе системного анализа: разработать общие принципы формирования двумерных белковых карт и построить такие карты для указанных тканей. Полученные данные использовать для создания обощенного компьютерного каталога белков мышц человека;

2) разработать методические подходы и провести идентификацию ряда полипептидных пятен на двумерных картах;

3) изучить особенности генной экспрессии в различных топографических участках сердца и разных скелетных мышцах, определить внутриклеточную локализации ряда белков, осуществить поиск полиморфных вариантов БПГЭ в мышечных тканях;

4) исследовать возрастные и онтогенетические особенности генной экспрессии (на уровне белков) в миокарде в норме и при врожденной патологии;

- 51) оценить тканеспецифичность отдельных белков в мышечной ткани человека;

6) изучить изменения генной экспрессии на уровне белков в миокарде человека при ряде форм сердечно-сосудистой патологии;

7) усовершенствовать методическую базу для использования результатов 2ДЕ фракционирования с целью получения препаратов белков. з интересах последующего создания методов диагностики патологии мышечной ткани.

- наугад новизна:

.Впервые на основе применения системного подхода получены обобщенные данные о комплексе более чем трехсот БПГЭ человека, которые наиболее представлены в миокарде и различных поперечнополоса-

тых мышцах. Этот комплекс БПГЭ может рассматриваться как характерный генетически детерминированный "белковый портрет" исследованных тканей. При изучении БПГЭ составляющих этот "белковый портрет" были выделены 14 белков, фрагменты аминокислотных последовательностей которых удалось просеквенировать и полученные результаты показали, что три из этих белков можно считать новыми. Кроме того, обнаружен новый редкий вариант белка МЬС 1-\//зВ, отличающийся от обычной формы единичной аминокислотной заменой в первичной структуре, а также выявлено 3 группы полиморфных вариантов БПГЭ, частоты встречаемости аллельных вариантов которых соответствовали закону Харди-Вайнберга.

Разработана новая система нумерации белковых пятен, полученных при 2ДЕ анализе, которая может использоваться как универсальная для описания "белковых портретов" различных тканей и клеток, и с использованием этой системы построены уточненные версии двумерных белковых карт для миокарда и некоторых скелетных мышц человека. Все результаты суммированы в виде обобщенного компьютерного каталога БПГЭ мышечной ткани человека.

Получены новые данные' об изменениях генной экспрессии (на уровне белков) в сердечной мышце человека на разных стадиях пре-натального и постнатального развития. Обнаружен ряд изменений в белковых наборах у эмбрионов с аномалиями развития и у лиц, страдавших различными заболеваниями сердечно-сосудистой системы.

Предложен ряд модификаций методов, применяемых при реализации стратегии системного подхода к изучению БПГЭ, совокупность которых образует оригинальную программу анализа БПГЭ, начинающуюся- от фракционирования суммарных белковых экстрактов тканей И завершающуюся выделением высокоочищенных препаратов индивидуальных полипептидных цепей и секвенированием их последовательностей. Эффективность этой программы продемонстрирована в проведенной работе на примере изучения нескольких видов мышечных тканей человека.

Научно-практическая значимость работы.

Выявлен и изучен комплекс из 312 наиболее представленных БПГЭ в поперечнополосатых мышечных тканях человека. На этой основе построен обобщенный компьютерный каталог БПГЭ мышц человека, который отражает особенности функционирования генома при дифферен-цировке по мышечному типу. Таким образом, полученные данные открывают широкие возможности для проведения анализа, и изучения особенностей белкового состава мышечных тканей в норме и при различных видах наследственной патологии человека, а также для выяснения молекулярных механизмов патогенеза и этиологии соответствующих заболеваний.

Изучены закономерности генной экспрессии у нормально развивавшихся эмбрионов (на уровне белков) в ходе формирования мышш сердца человека, а также у эмбрионов с патологией сердечно-сосудистой системы, что позволило выявить группу эмбриоспецифичных белков-маркеров и их особенностей при врожденной патологии миокарда.

Эти данные расширяют современные представления о молекулярных процессах при органогенезе сердца и могут найти применение при изучении врожденных пороков сердечной мышцы.

Проведено сравнительное изучение тканеспецифичности белков в мышечной ткани человека, и выбраны кандидатные белки для разработки специфических тестов на дистрофические процессы в миокарде, его отделах и в скелетных мышцах.

Предложен ряд методических приемов для подготовки образцов к проведению миокросеквенирования и/или получению чистых препаратов белков из.суммарных экстрактов мышечных тканей, фракционированных двумерным электрофорезом. По результатам аминокислотного секвени-рования уточнены первичные структуры нескольких белков в участках, где существовали конфликтные данные по секвенированию соот-

ветствущих кДНК.

На основе разработанного варианта полупрепаративного 2ДЕ выделен ряд чистых белков миокарда, в частности получены препараты ЛЦМ ЬУ/эВ. которые затем были использованы для получения гибридом. продуцирующих моноклональные антитела к этому белку.

Показана принципиальная возможность использования полученных антител к ЛЦМ 1 в разработке диагностического теста на инфаркт миокарда..

Разработанные в ходе проведенного исследования методические приемы и полученные препараты могут найти применение как при реализации стратегии системного подхода на других объектах исследования, так и в биотехнологических целях для создания биопрепаратов из мышечных тканей.

Внедрение результатов работы.

Практические рекомендации, разработанные на основании проведенного исследования применяются в практической работе кафедры биохимии Московской медицинской академии им.И.М. Сеченова, Москва; Институте молекулярной биологии им.В.А. Энгельгардта РАН, Москва; НИИ биомедицинской химии РАМН, Москва; Институте физико-химической биологии им. А.И. Белозерского МГУ. Москва; НИИ наследственных и врожденных заболеваний МЗ Белоруссии, Минск.

Основные положения выносимые на защиту:

1. 312 продуктов генной экспрессии, охарактеризованные по величинам Мм, р1 и представленности в мышечных тканях, составляют специфический . комплекс, отражающий особенности функционирования генома при дифференцировке по мышечному типу.

2. Предложена схема реализации стратегии системного подхода

для изучения комплекса наиболее представленных БПГЭ, которая обеспечивает оригинальное методическое решение задач от фракционирования суммарных экстрактов тканей человека до получения высо-коочищенных препаратов индивидуальных полипептидных цепей, природных для микросеквенирования и применения в биотехнологических целях, а такав включает новую универсальную систему нумерации фракций. Эта система может быть использована как основа для построения совместимых друг с другом компьютерных каталогов БПГЭ.

3. Среди относящихся к основному комплексу БПГЭ мышечных тканей идентифицировано с известными белками 33 фракции, в том числе главные сократительные белки (тропомиозины. легкие цепи миозина и др.). некоторые ферменты (цитохром С оксидаза Уа. глицеральде-гид-3-фосфат дегидрогеназа. аконитат гидратаза. креатинфосфокина-за и др.). а для ряда БПГЭ определена внутриклеточная локализация. 1

4. 3 БПГЭ (4038600. 4298503 и 4905704) по результатам МИКро-секвенирования фрагментов последовательностей, и данным о други* свойствах моено рассматривать как новые БПГЭ человека. Для одного БПГЭ (4602554) впервые по результатам микросеквенирования и другим свойствам устанолена принадлежность £ тропонинаы Т (сердечная изоформа), что впоследующем подтвердилось данными других авторов.

5. Установлены особенности топографического распределения е сердечной мышце белков семейства ЛЦН и ряда других БПГЭ. Выявлен редкий аллель ЛЦМ 1-У/аВ. отличающийся аминокислотной заменой Азг 144 - Н1з 144.

6. Среди основного комплекса БПГЭ мышечных тканей присутствует 3 полиморфных группы белков, частоты встречаемости которых соответствуют ожидаемым, исходя из равновесия Харди-Вайнберга.

7. Из относящихся к основному комплексу БПГЭ мышечных тканей. 2 белка охарактеризованы как специфичные для сердечной мышцы, £

10 для скелетщк мышц; более 15 белков изменяли свою количественную представленность в процессе онтогенетического развития. Отмеченные БПГЭ могут рассматриваться как потенциальные молекулярные маркеры нарушений генетически детерминированных процессов в мышечных тканях.

8. Показана принципиальная возможность использования полученных моноклональных антител к легкой цепи миозина 1 миокарда для диагностики дистрофических поражений миокарда.

Апробация работы.

Материалы диссертации представлялись и обсуждались на II Международной конференции по методам биохимического разделения (ВНР.Кешнели, 1988), на Всесоюзной конференции "Биохимия - медицине" (Ленинград,1988), Международной конференции по двумерному электрофорезу (Вена, Австрия,1988), на Всесоюзном симпозиуме "Проблемы изучения наследственности человека на уровне белковых продуктов генной экспрессии" ( Москва,1989), Международной встрече электрофоретического общества (Мюнхен,ФРГ,1989), VI Всесоюзной конференции по биохимии мышц (Тбилиси,1989). на III Всесоюзном, совещании "Культивирование клеток животных и человека" (Москва. 1990), на I Всесоюзной конференции "Геном . человека"(Перес-лавль-Залесский,1990), на II Всесоюзном съезде медицинских генетиков (Алма-Ата.1990), на международном симпозиуме по генетике, здоровью и заболеваниям (Амритсар. Индия, 1990), Международной конференции по двумерному электрофорезу (Лондон. Англия, 1991), -II Всесоюзной конференции "Геном человека"(Переславль-Залесс- . кий,1991), на 8 Международном конгрессе по генетике человека (США, 1991), на Международной встрече электрофоретического общества (Вашингтон,США,1991), III Конференции "Геном человека"(Черноголовка. 1993), IV конференции " Геном человека"( Черноголов-

ка.1994). Международной конференции по двумерному электрофорезу (Сиена.Италия,1994). 16 Международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Нью-Дели. Индия. 1994), на 1.(3) Российском сьезде медицинских генетиков (Москва.1994), на Ученом Совете МГНЦ РАМН (1990,1992,1993. 1995).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 50 работ в отечественной и «нрубежной печати.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В' работе использовались аутопсийные образцы миокарда и скелетной мышцы человека, от лиц погибших в результате несчастного случая. Образцы миокарда с разными формами патологии были получены из лабораторий патоморфологии Института экспериментальной кардиологии ВКНЦ РАМН и НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ. Образцы миокарда эмбрионов человека предоставлены из НШ нас- • ледственных и врожденных заболеваний МЗ Белоруссии. В работе также Использовались штаммы эмбриональных фибробластов. выведенные в лаборатории клеточной феногенетики наследственной патологии МГНЦ РАМН.

Цитозольную л ядерно-миофибриллярную фракции миокарда получали дифференциальным центрифугированием после гомогенизации образцов ткани в 0.25 Н сахарозе. Фракции митохондрий и внутренних мембран митохондрий получали как описано в статье Константиновой с. А. и

соавт. (1991).

Подготовку образцов для двумерного фракционирования и двумерный электрофорез по О'Фарреллу проводили с некоторыми модификациями (Ковалев Л.И. и др., 1986; Tsvetkova M. N. et al. ,1991), используя как катодный, так и анодный варианты нанесения.

Детекцию белков после проведения электрофореза осуществляли в нефиксирующих условиях 4 H р-ром ацетата К (Hlgglns R., Dahmua M.,1979),. или окрашиванием кумасси голубым R-250 (Fairbanks G. et al., 1971), азотнокислым серебром (Blum H., 1984), универсальным красителем "Stalns-all" (Green M. et al..1973). Иммунохимическую детекцию белков проводили как описано в статье Towbln H. et àl. (1979). Электроблоттинг белков на инертную матрицу Immobllon Р выполняли по обычной методике (Matsudalra Т., 1987) с некоторыми модификациями (Tsvetkova И.N. et al., 1991). Пептидные фрагменты белков получали трипсинолизом (Cells J. et al.,1990) и Фракционировал! обращенно-фазовой хроматографией (Лаптев A.B. и др. ,1994). Определение И-концевой последовательности белка или внутренних пептидов выполняли на газо-жидкостном сехвенаторе 816 фирмы "Knauer" (ФРГ) по методике и программе фирмы-производителя, совместно с Ц.А.Егоровым и А.X.Мусалямовым. Поиск аминокислотных последовательностей проводили с помощью пакета программ GENEBEE по банку аминокислотных последовательностей SWISSPROT (версия 21).

Концентрацию белка в препаратах определяли по методу Флорес (Flores А. ,1978) и по методу Брэдфорд (Bradford И.,1976).

Денситометрию двумерных электрофореграмм осуществляли'на ла-- • зерном денситометре Ultrascan XL (Pharmacla-LKB, Швеция)¡в комп-' лексе с компьютером IBM РС/АТ-386, используя пакет программ,&elS- : can 2.1 и оригинальную программу обработки видеоизображения Gel-wlev (автор А.С.Ефимочкин).

При статистической обработке использовали общепринятые методы-(Урбах В.Ю..1975).

- н -

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Построение двумерной электроФоретической карты и каталога белков миокарда человека.

Для построения двумерной электрофоретической карты белков миокарда человека было необходимо оптимизировать условия режима фракционирования при проведении изоэлектрического фокусирования (ИЭФ). Считается, что стабилизация сформированного градиента pH в ходе ИЭФ зависит от типа использованного оборудования, длины геля ИЭФ. диаметра геля ИЭФ и ряда других факторов. При проведении исследований с использованием метода двумерного электрофореза по О'Фарреллу обычно используются для ИЭФ величины от 7 500 V/ч до Н ООО V/ч, что превышает количество V/ч необходимое для создания стабильного градиента pH. и соответственно достижения белками равновесного состояния (Bravo R. .1984; Cells J. et al., 1990.1991. 1993; Anderson N.. Anderson L..1988,1991). Как следствие, это часто приводит к потерям из анализа ряда белков, находящихся в щелочной части градиента pH. из-за эндоосмоса. катодного дрейфа и других процессов.

Сравнение серий электрофореграым белков миокарда, полученных при нанесении белкового материала в трубки с катодного и анодного конца геля ИЭФ одновременно, позволило изучить динамику достияе--ния белками равновесного состояния в зависимости от набора В/ч. Было выявлено, что одноименные полипептидные пятна сливаются в одно к моменту достижения 4 ООО В/ч. В дальнейшем они сохраняли стабильное положение в интервале от 4 ООО до 7 ООО В/ч. В последующей работе мы использовали промежуточное значение (5 400 V/ч) из. определенного экспериментально оптимального диапазона величин.

Существенным фактором для увеличения количества детектируемых белков оказался выбор направления фракционирования, то есть вне-

сения образца с катодного или анодного конца геля ИЭФ.

В наших условиях (по данными изучения образцов белков миокарда, скелетной мышцы, фибробластов, лимфоцитов и др.). максималь: ное количество белков на электрофореграммах обеспечивало использование анодного варианта нанесения образца. Обычно этот вариант позволял анализировать примерно на 5055 больше белковых Фракций чем при катодном варианте.

Еще один важный вопрос режима фракционирования - насколько стабильно количественное содержание белкового материала в пятнах в зависимости от использованного варианта фракционирования. В качестве критерия количественной достоверности принимали сохранение пропорциональности содераания белка на электрофореграммах, что оценивали по совпадении количества материала в пятне, как при анодном так и при катодном типе нанесения образцов.

Формирование двумерных • белковых карт и соответствующих баз' данных базируются на методе О'Фаррелла. ведется в системе прямоугольных координат, одна из которых описывает координату молекулярной массы, определяемую традиционным способом с использованием калибровочной кривой, построенной по белкам-маркерам с известными значениями молекулярной массы. Для определения координаты р1 белков не существует к настоящему моменту унифицированного способа определения, поэтому в работе использовалось параллельно несколько методов. В специальной серии экспериментов мы построили калибровочную кривую по белкам-стандартам для неденатурирущего ИЭФ с известными значениями р1, и отобрали стандарты дающие линейное распределение. Далее совместили эти данные с результатами определения значений сформированного градиента рН в зависимости от длины геля при определении градиента контактным микроэлектродом. По результатам определения значений градиента рН различными способами, при приведении их в один масштаб с длиной геля ИЭФ была получена сводная калибровочная кривая, которая представлена на

Рис.1, что позволило оценивать значения pi с точностью до 0.01 еД рН. С помощью построенных калибровочных кривых основныэ (наиболее количественно представленные) полипептиды миокарда, человека были охарактеризованы по координатам молекулярной массы и изоэлектри-ческой точки. В этих экспериментах были проанализированы аутоп-сийные образцы миокарда, полученные от 105 лиц.

При формировании двумерных карт, на электрофореграммах в зависимости от используемого способа детекции белков и количества наносимого материала, можно детектировать от нескольких сот до тысяч индивидуальных полипептидов. В данном исследовании, учитывая возможности компьютерной денситоиетрии. а также необходимость получения высоковоспроизводимых картин распределения белковых фракций на электрофореграммах и последующую работу по идентификации белков, были выбраны условия.. обеспечивающие включение в анализ нескольких сотен наиболее представленных белков. Общее количество этих белков для сердечной мышцы человека оказалось равным 282. Эти белки были внесены в соответствующую двумерную карту, детальное ' описание которой приведено в статье Ковалева Л.-И. и соавт. (Kovalyov L.I. et al.. 1995).

Используя компьютерную денситометрию. по результатам обработки электрофореграмм белков миокарда (образцам полученным от 5 человек). была определена средняя площадь пятен, что позволило учесть при построении двумерной карты дополнительную количественную характеристику - содержание, белка в пятне при анодном варианте ИЭФ. Далее с учетом этих данных было построено схематизированное компьютерное распределение полипептидов левого желудочка сердца человека на двумерных электрофореграммах (Рис.2).

При систематизации полученных данных и формировании белковых каталогов, ввиду того, что большая часть детектируемых белков является неидентифицированной. используют нумерацию белковых пятен. Несмотря на большое число публикаций пока не создано единой сис-

Рио.1. Определэние координаты р! Волков миокарда человека на двумерных алектрофореграымах о использованием калибровочной кривой. Номерами в соответствии с каталогом обозначены идентифицированные пятна.

темы обозначения, унифицированной для разных объектов. Существующие программные продукты характеризуются достаточно произвольным проведением нумерации фракций на электрофореграммах. что требует для использования полученных данных применения только соответствующего пакета программ. В то же время, в наиболее крупных каталогах белков, сформированных на основе систематического подхода, представлены характеристики молекулярных масс и р1 полипептидов, которые по нашему мнению и могут послужить основой для развития единой системы нумерации и формирования соответствующих баз данных.

Реально определяемые значения мол. массы составляют 10 - 250 кД. с точностью определения до 0.1 кД. а р1 4 - 8. с точностью до О,01 еД рН. Таким образом, прямое использование значений мол. ыассы и р! будет приводить к формированию 1фомоздкой системы нумерации. В данной работе предложено применение семизначной системы обозначений, что позволяет сконструировать более удобный вариант. в котором первые 4 знака являются характеристикой мол. массы, а последние 3 - р1. Использование десятичного логарифма мол.массь позволяет перекрыть весь диапазон анализируемых молекулярных масс, не превышая в нумерации 4 знакоз. и обозначать своими номе-раш белки, отличающиеся даже на десятки дальтон по молекулярной массе. Соответствующая база данных может быть построена з привязке к конкретной физической характеристике и в любой другой . ткат человека при этом один и тот же полипептид будет иметь постоянный номер. Полипептиды с р1>10.0 получают восьмизначный номер. чт< избавляет от необходимости формировать отдельные каталог.! для неравновесного ИЭФ. как это обычно осуществляется в настоящее вре ыя. 232 белковых продукта ге.:ной экспрессии выявленных в образца; миокарда человека, обозначенных в соответствии с описанными прин ципами и образующих характерное распределение на двумерной белко вой карте, можно рассматривать как специфичный "белковый портрет

сердечной шины человека. Суммированные результаты определения гаордпиат и количественного содержания основных белковых фракций левого яелудочка сердца человека включают дачныэ по 282 полнлеп-тиднш пятнам и оформлены в виде электронных таблиц.

тэ

*«н»«

«ямл- *****

Ж?«™. «». .««^^^'Г^ЙГ

•дать^^»•^¿^•г^лга

л _____ - _ • « ._________

) V»

го

Рис.2. Схематизированное распределение (двумерная карта) полипептидов левого дедудочка сердца"человека.

67

2.2. Маркеры аутолитичедт изменений в ткани миокарда.

Выявление признаков аутолитической деградации белков в различных тканях представляет, существенный интерес в связи с широким использованием аутопсийных образцов в анализе белков человека, а также в связи с другими проблемами. С этой Целью в данной работе было проведено изучешга данашки аутолитического процесса на образцах мышцы сердца взрослых и плодов человека, от 0 (биоптаты и образцы, полученные через 2 ч после смерти) до 3 суток аутолиза. Наиболее характерным признаком аутолиза в миокарде человека оказалась деградация пятна легкой цепи миозина 2. которая становилась выраженной к 2 сутками аутолиза. как в ткани взрослых лиц. , ток и в эмбрионально« материала. Удалось отметить также на более ранних сроках (к I суткам), появление на эле::трофореграымах дополнительна белков (с мол.массой/р1 22.0/5.01 и 19.0/4.95). которые отсутствуют в исходных образцах. Кроме того, резко увеличивалось количество двух пилипептидов. обычно представленных в незначительной количества - Н 4313685 и Ы 4263672.

Темпы аутолитической деградации белков миокарда можно оценить как более высокие по сравнению со скелетной цннцей. где по данным Лисаковского С. В. и соазт. (1988). признаки аутолиза выявлялись" посла 4 суток.

Идентификация Ошов на юиюрню электрофрреграммах Ко8 серга человек я детализация двумерной карта.

Для идентификация белков на электрофореграмчах были использо--ваны три основных подхода: микросеквеиирование. иммуноблоттинг и ко?лектрофооез с чистши препаратами белков или другими тканями человека.

Получение препаратов белкоз п- п.чкросеквенирования осущест-

!

влялось несколькими разными способами: либо электропереносом по лкпептидов с двумерных электрофореграмм на инертную матрицу 1гшю-Ы1оп Р. с окрашиванием и сбором одноименных пятен, либо путем детекции полипептидов в геле без использования красителей, с помощью 4 М ацетата калия в нефиксирующих условиях, и элюции белков из геля. Далее проведение М-концевого секвенирования 5 полипептидов (4089626. 4379527, 4625614, 4700682 и 4950704), локализованных на 1шшоЫ1оп-Р оказалось невозможным, по-видимону из-за блокирования й-концевых аминокислот. Однако, для пятна белка 4540492, выделенного элюцией, удалось' секвенировать фрагмент со -ответствующий 10 - 15 позициям в первичной структуре а цепи т^о помиозина. Очевидно, в ходе выделения Н-концевой Фрагмент у анализируемого белка был утерян. Эти данные показали 'ограничение возмошости проведения Н-концевого (шкросеквенирования для идентификации белков после 2ДЕ анализа. Для преодоления данного затруднения в дальнейшем в работе.использовалось триптическое расцепление полипептидов в сочетании с выделт-ипем и секвестрование Фрагментов получаемых пептидов. Для этой цели была разработана кодификация метода подготовки образцов для никросеквенирования, включающая проведение расщепления трипсином в пятнах белка в по-лиакриламидном геле в присутствии БЕС после ацетатного выявления, элюцию результирующих пептидов и их хроматографическое разделение. По результатам секвенирования были идентифицированы 11 белковых фракций. Кроме того, один белок показал полную гомологию с аминокислотной последовательностью аконитазы свиньи (информация по данному белку человека в банке аминокислотных последовательностей БИ^-РИТ,версия 21 отсутствует), а для двух белков ана-< логи по первичной структуре не были найдены (Таблица 1). Полученные результату определения фрагментов (7 пептидов) аминокислотной' последовательности белка легкой цепи миозина 1 желудочков, позволили уточнить его первичную структуру, так как ранее опубликован-

ные данше двух групп исследователей имели расхоздения по 5 аминокислотным остаткам (КигаЬауазШ Ы. еЪ а1.. 1988; НоГГшапп Е. е1 а1.,1988). Наши результаты совпали с данными КигайауазМ по конфликтным позициям 98.99,ц 170. где последовательно определены про-лин. аргинин и лизин. . Аналогично, аминокислотное секвенирование трансфэррина (4900660) позволило устранить конфликт по 264 позиции меаду данными Уапе Г. е1 а1. (1984) и НсСШеугау И. е1 а1. (1983). где был определен глутамин. а не глутаминовая кислота.

Используя коэлектрофорез с чистыми препаратами белков и тканями человека удалось идентифицировать на электрофореграммах шша принадлеаащие ииоп.обину (4250736, 4250703 н 4250630). альбумину (4826608). карбоангидразе I и III (4462382 и 4472687). мономерам а,цепи коллагена (5065725. 5065720. 5065715, 5065710. 5065703. 5065695. 5035688 и ¿035678). р-цоги тропошюзина (4570485) и эмбриональной келудочковой/предсердаой легкой цена юзина (441720).

С поиоэ.ыэ уоноспецлфических поликлолальньк антител против Фз-иилаланингидроксилааы человека шй-'-укоблоттангем были идентифицированы как феаилаланингздроксилаза пятна 4725620 и 4 (25638.

Далее для детализации' двумерной карты проводилось изучение распределения полипеитшшых фракций в соответствии с их субклеточной локализацией (цитозольные. цкофибриллярно-ядерные. мито хондрпалькые) послэ диФферег,.циального центрифугирования гокогсаа-тов. На электрофорегра!35ах соответствующих препаратов удалось дифференцировать ряд полипептидов иыеглда прэ^мущественную субклеточную локализации. В частности", ряд ряд полипептидов обладал преимущественно цитозольной локализацией, в том числе идентифицированные - 4826503 (альбумин). 4900360 (трансферрин). 4950704 (аконитаза), 4570764 (глицеральдегид-3-фосфат дегидрогецаза). 408£226 (белок связусщиГ аирные кислоты). 4089726 (миоглобин). Неидентифицированкые цитозольные полипептиды - 4766719, 4775710, 4637745, 4615638 И 4552665.

Таблиц* 1. Белх», прслсгаалешше на даумсрных элеетрофореграммах ткани того желудочка и подвергнутые имхросеквенироаашоо.

номер Мол. Р1 секвенированные ПОЗИЦИЯ полнбе наименование

ПО масса пептиды в в

катало- «Да однобуквениом цвягтн-фициро-

гу написании ванных бетах

4379527 23.9 5.27 * блок легкая цепь

АРАРАРРР 19-26 миозина,мед-

ЕУЕУОАБ 33-39 ленная ске-

У1Х>0РЯ 94-99 летномышечная/

мстчзт 123-128 желудочковая

УИОК 138-141 изоформа

НУЬАТЬОЕЯ 154-162

ЬТЕОЕУЕК 163-170

4288514 19.4 5.14 РААРРР(Р)У 138-143 регуляторная легкая цепь 2 миозина, желудочковая изоформа

4540492 34.7 4.92 MLKI.DK 10-15 альфа цепь тропомиозина миокарда

4570764 37.2 7.64 У1РЕЬЫО 218-224 глнцеральдегид

УУООТ 240-244 -3-фосфат дегидрогеназа

4318709 20.8 7.09 НИБРЕБЬ 82-88 альфа цепь

ЕЕКРАУТАА 163-171 В кристаплина

Продолжен»'

4089626 12.3 6.26 ' •блок белок связующий

• ОУАХМТКР 30-35 жирны; кислоты,

сердечная изоформа

4602354 40.0 5.54 РМРЫЬУР 70-76 сердечная изоформа

АЬБЫММ 177-182 тропошша Т <

4950704 89.1 7.04 ♦блок РШОЕута-ЕЬААТАОА 118-132 гомология с предшественником - аконитазы • О *

1МЕттк 667-673 свиньи

4700682 50.2 6.82 ♦блок АТФ-синтаза

ТОА1УОУР 190-197 альфа цепь

ЕАУРО 334-338

4425614 26.6 6.14 •блок . , -

4900660 79.4 6.60 , А(5УР 263-266 трансфгррки

БАБОЬ 454-458

Еаууапоо 534-539

РУЕЕУАМ 589-595

4345703 22.1 7.03 « КШЬРШЛ»-УОУОАЬЕ 25-39 митолокдриельная * суперокснддисмутаза

4065508 11.6 5.08 УЛТУРЫ(К)РО ашцГуоу 15-23 32-39 интохром С окендаза субъединица Уа

4038600 ¡¡.о 6.00 УЦ0)1 ОСИНОЕ не найден

4298503 20.3 5.03 СУ(0)Р(Ь) не найден

Изучение главных митохондриальных белков осуществлялось с использованием препаратов митохондрия и Фракции субмитохондриальннх частиц (внутренних мембран) выделенных из сердца быка. Предварительно было показано, что распределение основных белковых пятен в миокарде быка на двумерных электрофореграммах практически идентично распределению в миокарде человека (по координатам и количественной представленности). Комплекс проведенных анализов позволил оценить как мажорные митохондриальные белки следующие 14 полипептидных пятен: 4950704 (аконитаза), 4700682 (а-цепь АТФ-сиитазн). 4570764 (глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа), 4517757 (порин). 4345703 (митохондриальная супероксиддисмутаза). 4055508 (цитохром С оксидаза Va), и неидентифицированные пятна 4715547, 4680536. 4660578, 4570757, 4420614, 4414670 и 4089726. Для пятен 4065508, 4420614 и 4460578 выявлена избирательная представленность на внутренних мембранах гатохондрий. Из отмечен-' пых. вшэ белков для всех идентифицирован!!!™ известно либо наличие митохондриальных изоформ (аконитаза, глицерэльдэгид-З-фосфат дегидрогеназа), либо локализация в матриксе митохондрий (СОД. порин. АТФ-синтаза, цитохром С оксидаза Va).

Тагам образом, совпадение полученных результатов локализации в иитохондриях известных белков, косвенно подтверждает точность определения митохондриальной локализации неидентифицированных белков.

С целью выявления структурных особенностей белков миокарда человека в отдельной серии экспериментов полученные электрофс^ег-раммы-окрашивали универсальным красителем "Stains all", для которого известна способность окрашивать полипептиды метахроматичес-ки. Обычно полипептиды красятся в красный цвет, но в случае фос-форилирования,. гликозилирования или кальций-связующих свойств (Green М. et al.. 1974; Campbell К. et al., 1983; Benchetrlt L. et al.,1977) они красятся ö синий дает..На электрофореграммах белков

миокарда синее окрашивание было отмечено для 13 полипептидов (N 4379527 - ЛЦМ 1. 4417520 - эмбриональная ЛЦМ. 4540492 - а ТМ. 4570485 - А ТИ. 4602554 - тропонин Т. 4288501 - ЛЦМ 2. 4050517, 4091477. 4106477. 4345577. 4572493. 4492517 и 4491516. Все ЭТИ белки, обладающие способность!) краситься в синий цвет характеризовались pi не более 6.0. а идентифицированные - обладают одной из перечисленных вше специфичностей.

2.4. Топографические особенности Целкового состава мышцы серл-

ца человека.

• Имеются данные, что существенные морфо-физиологические отличия кардиомиоцитов. основного компонента ткани миокарда, в разных отделах сердца проявляются в частности и наличием тканеспецифичес-ких белков (Румянцев П.. 1982; Gorza I. et al..1984; Emerson С.. Bernstein S..-1987; Jougasakl M. et al.,1989), что обусловило необходимость проведения сравнительного 2ДЕ анализа разных отделов сердца. При сравнении белков предсердий, желудочков, межжелудочковой и межпредсердной перегородок, на образцах от 10 человек, удалось отметить, что одноименные образцы практически не различались между собой. По анализируемому спектру белков (более 300) отличия выявлялись только между тканью предсердий и межпредсердной перегородкой, о одной стороны, и желудочков с ыежжлудочковой -перегородкой, с другой. Основные различия сводились к изменениям по 5 белкам, из которых 2 белка оказались специфичными для предсердий (4298503 И 4310503). Пятна 441520. «402544 И 4900660 имелись и в ткани желудочков, но в значительно меньших количествах. Кроме указанных изменений, у большинства обследованных лиц в предсердиях выявлялись 3 дополнительных белка, иногда имеющихся в минорных количествах в ткани желудочков (4635585. 4645595 и 4650610). Их наличие и количественная представленность коррелиро-

вали с увеличением возраста обследованных лиц. что дает основание думать о возможной связи с избирательными изменениями в предсердиях вследствии нарушения обменных процессов. По полученным результатам изучения топографических различий в белковом составе Предсердий и желудочков, можно отметить, что потенциальный интерес в плане разработки диагностических тестов на дистрофические процессы предсердий у человека представляют только белок соответствующий предсердной ЛЦМ 1. а также два других белка (4298503 И 4310503).

8.5. Онтогенетические особенности генной экспрессии в ниокардз человека.

Необходимость проводить дифференцировку изменений, обусловленных регенеративными процессами и сопровождающихся появлением эмбриональная изоформ белков и/или изменениями в количестве, от изменений первичных для патологии требует получения информации о Динамике генной экспрессии в миокарде и выявлении групп белков-маркеров определенных стадий органогенеза миокарда, изучения закономерностей появления/исчезновения полипептидов.

На основе 2ДЕ изучения образцов левого желудочка сердца эмбрионов и плодов человека (п-95). полученных на разных сроках развития, о 15 стадии по классификации Института Карнеги (0'ЯаШ1у Я..1979) был проведен анализ онтогенетических изменений в спектра белков миокарда. Помимо ряда выраженных количественных менениЯ белков миокарда в ходе развития удается также детектировать и некоторые белки, специфичные для определенных стадий развития. Так. на сроках до 21 недели развития, детектируется белок с координатами 4502493. возможно являющийся представителем семейства тропо-миозинов. экспрессия которого по-видимому координирована с экс-

прессией а цепи тропомиозина. Также до 21 - 23 недели развития отмечается выраженная экспрессия белка 4900660 {трансферрина). Спектр изменений белков миокарда стабильно воспроизводится для каждой из исследованных стадий. На всех стадиях можно было выделить по 10 наиболее представленных белковых пятен, но только 5 из них являются мажорными белками миокарда взрослых (4379527 - ЛЦМ 1. 4950704 - гомолог аконитазы, 4700682 - а цепь. АТФ-синтазы, 4540492 - а тропомиозин и 4634537 - актин). Сводные данные изменений наиболее представленных белков миокарда суммированы в виде соответствующей таблицы.

По результатам изучения особенностей экспрессии в органогенезе . миокарда можно отметить, что одним из критических периодов в развитии миокарда человека является срок 15 - 23 нед, когда происходит выраженное изменение экспрессии большой грувиы генов (миокарда. По результатам изучения пре- и постнатального развития миокарда человека 2ДЕ анализом также можно отметить, что взрослый тип полипептидного состава формируется к 2 - 3 годам жизни. Используя таблицу наиболее крупно представленных белков миокарда, и с учетом стадиоспецифичных белков можно с точность» до + 1 нед установить срок развития анализируемого образца.

а. е. Изучение генетнчеокогд шширфнэт в обшшх ткш левого желудочка сердиа человека,

При 2ДЕ анализе более чем 250 образцов сердца человека, было выявлено, что из 282 полипептидных фракций, представленных в каталоге, имеются электрофоретические варианта.по молекулярной массе и/или изоэлектрической точке для 6 фракций. Для еще двух белков отмечена выраженная количественная изменчивость, а два полипептида были представлены только у части обследованных лиц. Таким образом, индекс гетерозигогности составил для белков миокарда.

- га -

если учитывать вое навденныэ варианты 3.5*, а, если Срать только варианты коррелирующие о двухаллельным состоянием.-- 1.4Х. Эти величины сопоставимы о результатами других авторов, полученными при изучении разных тканей человека (Эп1М1 Б. е1 а1.,1980; ТакасЬазЫ N. е1 а1. ,1986; ИаШп^ег й. е1 а1., 1988).

Три из найденных пар вариантов модно объяснить в рамках гипотезы о двухазлельном состоянии генов, ответственных 'за синтез данных по'-отсптидов (Рис.3). Для проверки такой гипотезы мы провели изучение соответствия данных вотречаеыооти этих электрофоре-тических вариантов той частотам, которые следует ожидать из равновесия Хардк-Вайнберга методом хи-квадрат (Таблица 3). Расчеты показали, что определение частоты встречаемости выбранных трех

Л---■—— ' Ф Г ' т V О <

б ---— . 8 " л * * • . .¿А 1 * .т

В

Рис.3. Фрагменты двумерных элоктрофореграмгл миокарда

человек с полныорфныни вариантами соответствующий дяухаллельно-иу состоянию. А - пятка 451664? и 451£<:30, Б - пятна 433759В и 4337610, В - 4414665 и 4396Е4. Крайние столбцы соответствуют гомозиготны.) фенотипам, средние гетерозиготным. стрепк^/:: отмечены чналнзируецые белки.

Таблица 3. Фенотипы л аллельные частоты вариантов белков коррелирующих с двухаллельным состоянием.

наблюдаемый фенотип, номер пятна количество случаев генные частоты X*

4518647 64 Г1 - 0,785

4518647 4518630 29 о 0.386

4518630 7 f2 =■ 0.215

43875Э8 78 ti.' 0.860

4387598 4387610 16 • 0.847

4387610 6 f2 - 0.14

4414665 33 f1 - 0.535

4414665 , . 4391654 41 0.937

4391654 I 26 I Ге - 0.465

ажеаак«*8авасс*вяа*к8яьквижх11мкв8в9«всае8сякаяеая«амаакакввъ>«

пар вариантов соответствовали ожидаемым исходя из равновесия Хар-ди-Вайнберга, Однако, для подтверждения молекулярных основ выявленного полиморфизма необходимо проведение дополнительных иссле-

дований по изучения первичной последовательности белков.

Для пятен 4462682 и 4472687 отмечена количественная вариабельность. По результатам идентификации пятно 4462682 соответствует ыьшечной нзоформе карбоаигидразы III. а пятно 4472687 - карбоан-гидразе I. У 67 обследованных встретился вариант преобладания по количеству в 3-5 раз пятна 4462682. а у 37 - 4472687, что очевидно является отражением уровней дифференциальной экспрессии генов карбоангидраз в миокарде. Для пятна а цепи ATí^-синтазы выявлено три дискретных фенотипа, различающихся по pi. В 80 случаях имелось пятно с координатами 4700682, в 13 пятно 4700670 и в 7 ~ 4700697. Кроне этого вариабельность детектировалась для пятен ' 4263572 - 4263698 И 4520511 - 4525510.

В 1 слу.ао из более чем 300 обследованных лиц выявлен в зоне ЛШ дополнительный белок (4379542). наличие хоторого коррелировало (по результата!! компьютерной денситонетрии) со снижением в количественной представленности на 30 - 50% пятна ЛЦМ 1 (4379527). Используя полученные коноклональные антитела к ЛЦМ 1 (Ковалев Л. к соавт.. 1990) иммуноблоттннгом удалось показать соответствие дополнительного пятна белка ЛЦМ 1. Далее при изучении молекулярной природы д-лного варианта (перекос зоны ЛЦМ на инертную матрицу, трипсииолиз белка-варианта и ЛЦМ 1 V/sB. хроиатографичес.кое разделение полученных пептидов, сравнение полученных хроматограм) -был найден среди триптических пептидов дополнительный пик у вари акта белка, а при проведении микросеквенирования в дополнительном пике обнаружена аминокислотная замена в 144 позиции аспарагина на гистидин. Другие пептиды оказались идентичные по опреле«кым аминокислотным 1,зследовате..ьностям (Laptev А.V. et al.. 1993).

При анализе белков миокарда спонтанных абортусов, выкидышей и плодов с множественными пороками развития (п-50) не было найдено увеличения частоты встречаемости редких электрофоретических вариантов белков, что может быть объяснено функциональной ва^юстыо

сократительной системы миокарда и отбору таких случаев на более ранних сроках развития, чем те которые анализировались, т.е. до 7 недель беременности.

. 2.7. Формирование-комплексного белкового каталога миокарда человека».

Полученные данные об особенностях экспрессии белковых • продуктов в миокарде человека при ряде физиологических и патологических состояниях были обобщены и суммированы в виде сводного каталога белков миокарда человека. При формировании каталога использовались следующие характеристики: координаты пятен (номер, включающий Lg молекулярной массы и pi), результаты идентификации, субклеточная локшизация (цитозольные и митохондриадоные белки), специфичность по окрашиванию красителем "Stains all", наличие полиморфных или электрофоретических вариантов и эмбриоспецифичность. Всего, оформленный.в виде электронных таблиц каталог включал информацию по 312 полипептидным пятнам. Далее полученные данные использовались для анализа и поиска изменений белков миокарда человека при сердечно-сосудистой патологии разного генеза.

2.8. Сравнительный анализ белкового состава миокарда при сердечнососудистой патологии, человека,'

Используя полученные биопсийные и аутопсийные образцы миокарда человека (п-40) от лиц с выраненной сердечно-сосудистой патологией был проведен анализ особенностей полипептидного состава миокарда при патологии. Из анализировавшихся образцов в 12 случаях имелся диагноз дилятационной кардиомиопатии (ДКМП). у 16 - ишеми-ческая болезнь сердца (ИБС), у 6 - миокардит, 4 случая были с гипертрофией миокарда, обусловленной патологией клапанов, и в.2

случаях гипертрофической кардиомиопатии (ГШП).

При миокардите, клапанной патологии и ГКМП существенных отличии среди анализируемого спектра белков выявлено не было. ^

Как при ДКЫП, так и при ИБС удалось выявить у большинства иа обследованных пациентов выраженное увеличение количества белка к 'пятнах 4900660 (трансферрина) и 4263593. Более выраженное усиление ваблвдалось у больных с ДЮШ (Рис.4). Увеличение количества трансферрина в «иокарде модно оценить как обусловленное ыетайоли-

Ркс.4. Зоны двумерных электрофореграш белков миокарда человека о изменениями при сердечно-сосудистой патологии. А - изменения в количестве трансферрина (последовательно норма, ДКШ, ИБС); Б -усиление белка 4263593 (норма, ДЮШ); В - усиление фетальной ЛЩ.< (норма,ИБС). Отмечены стрелками меняющиеся пятна.

ческими сдвигами, а не ^экспрессии гена трансферрина в миокарде, поскольку других маркеров эмбриогенеза не отмечалось. Количество фетальной ЛЦМ желудочков у больных с ДКМП варьировало в пределах нормы и увеличения ее содержания в отличие от данных Hlrzel IHlr-zel Н. et al.,1985,1987) в нашей выборке не наблюдалось.

В группе больных ИБС у одного из пациентов (семейный случай) было выявлено явное усиление пятна фетальной ЛЦМ (Рис.4), но б?з признаков других эмбриональных белков, что по-видимому монет являться свидетельством нарушений в регуляции экспрессии гена фетальной ЛЦМ.

2.9. Изучение • специфичности белкового состава мышечной ткашг человека.

Изучение тканеспецифичности белкового состава поперечнополосатых мышц человека проводилось с использованием полученной двумерной белковой карты миокарда человека. Так как скелетная мышца человека имеет сложную структурную организацию, обусловленную наличием разных типов мышечных волокон в одних и тех же мышцах, и соответственно дифференциальной экспрессией изоформ мышечных белков, на первом этапе сравнение проводилось на образцах m.gastrocnemius, для которой по литературным данным характерным является преобладание мышечных волокон медленного типа (Prince F. et al., 1981; Язвиков В.В., Невзоров В.И./1990). Двумерная электро-фореграмма белков m.gastrocnemius представлена на Рис.5. Внутренняя гетерогенность полипептидного состава внутри образцов m.gastrocnemius (п=5) отмечалась только по 2 полипептидам, один из которых соответствует пятну ЛЦМ 3(4267514). Другой белок'(4673702) остался неидентифицированным. Можнч предположить, что вариабельность у данных белков отражает увеличение содержания волокон быстрого типа в мышцах доноров. Это предположение подтвердилось

при изучении образцоз различных скелетных мышц. В других скелетных шшцах была отмечена дополнительно гетерогенность по пятнам 4332507 л 4352503. При сравнешш серий электрофорэграмм и результатов коэлектрофореаа белков ыиокарда и т.даБ1госпет1из человека (о иэнящтшзя количествами наносимого материала) удалось выявить, что к тканеспецифичнш для миокарда относятся фракции 4В02Е54 (сердечная изоформа тропошша Т) и 4417520 (эмбриональная жэлудочковая/прэдоерднач иэоформз ЛЩЛ).

[-•у

• -О ■

• ..г~ '

■ X*- ■i

-•«—«¿»о I

.. ' I* 1

■ ■ I >

- «Ъ»

Рло.Б. Двумерная электрофореграмма белков скелетной шшци (ш.gastrocnemius). Стрелками отиечекы белки специфичные для скелетной мышцы.

Кроме того, специфичными для скелетной ышцы были определены 11

полипептидов. Из них 7 были характерны как для мышц с преобладанием быстрого так и медленного типа мышечных волокон: 4434683. 4434700. 4434716, ' 4500524, 4514625, 4555576 И 4555583, а четыре белка коррелировали с увеличением содержания мышечных волокон быстрого типа: 4267514 <ЛЦМЗ). 4673702, 4332507 и 4352503. Особо можно отметить белок 4434716, который относится к 10 наиболее представленным белкам скелетной мышцы, и проявляет специфичность для данного типа дифференцировки. По результатам секвенирования одного из .триптических пептидов указанного белка была определена последовательность: SVSYDGGOA. Анализ банка амю.,.кислотных последовательностей показал, что она соответствует 65-73 позициям мышечной карбоангидразы III человека (К.Ф.4.2.1.1)., В целом, по результатам сопоставления скелетной и сердечной поперечнополосатой мышечных тканей оказалось, что 211 пятен идентичны по своим координатам, а отличия выявлены по 13 белкам, что составляет около 65?. Помимо качественных различий наблюдались и различия количественные. Существенно выше в миокарде оказалось содержание таких белков как трансферрин, гомолог аконитазы, 4426614, а-цепь АТФ-синтазы и а-цепь В кристаллит. По результатам денситометрии их содержание в скелетной мышце составило от уровня в миокарде 25, 31. 45. 50 и 6335' соответственно. Количество белка 438761 (скелетномышечной карбоангидразы) в скелетной мышце было оценено величиной в 6 раз выше по сравнению с миокардом. По полученным результатам к мажорным скелетномышечным белкам относится и ß-цепь тропомиозина, экспрессирующийся в незначительных количествах и в миокарде.

Анализ тканеспецифичности генной экспрессии в миокарде и скелетной мышце человека (9 наименований мышц) позволил выделить группы тканеспецифических белков, перспективных для использования при диагностике дистрофических процессов в поперечнополосатой мышечной ткани. Такого рода иммунологические тесты могут включать

определение комплекса наиболее представленных тканеспецифичных структурных, цитозольных и имеющих смешанную локализацию белков. Для миокарда человека, по-видимому, тест может включать определение миоглобина, сердечной изоформы тропонина Т и аконитазы. Аналогичный набор для скелетномышечных дистрофий может включать ми-оглобин. скелетномышечную карбоангидразу III и ß-цепь тропомиози-на. Кроме этого, возможна и разработка теста на дифференциальную диагностику поражений разных отделов сердца. Например, для предсердий дополнительно может использоваться определение уровня предсердной ЛЦМ" 1, а для желудочков - желудочковой ЛЦМ 1.

2.Юг Применение данных и методов системного изучения белков миокарда человека для использования в биотехнологических

»елях,,

Результаты работы показывают, что метод 2ДЕ позволяет в один этап выделить и получить препараты белков высокой степени чистоты. которые в дальнейшем могут использоваться в качестве антигена для получения поли- и моноклональных антител.

С помощью разработанной модификации способа детекции белков (в нефиксирующих- условиях 4 И ацетатом калия) из двумерных электро-фореграмм были получены 7 разнородных идентифицированных нами белков, а именно: ЛЦМ 1 и 2 желудочков, ЛЦМ 1 предсердий, сердечную изоформу белка связующего жирные кислоты, а-цепь тропомиози-на. а-цепь В кристаллина и аконитазу. Эти белки, находящиеся в нефиксированных фрагментах ПААГ эффективно элюировались г выходом 28.8% + 6.6*.

Далее, один из полученных таким способом белков - ЛЦМ 1 желудочков, который может представлять особый интерес для дифференциальной диагностики пораженйя предсердий - желудочков, был использован как антиген для иммунизации мышей и создания гибридом, про-

аудирующих моноклональкг.: антитела (МКАТ) к ЛЦМ 1. Полученные МКАТ (создание гибридом было осуществлено к.м.н.А.Ю. Волгиным, которому выражаю сердечную благодарность) характеризовались высокой специфичностью по результатам ИФА и иммуноблоттинга о разными белками и тканями человека и животных.

С помощью метода ИФА в сэндвич - варианте (первые антитела МКАТ, вторые - кроличьи поликлоналъные против ЛЦМ 1 желудочков) была проведена г. оверка возможности определения ЛЦМ 1 в сыворотке больных о инфарктом миокарда, и выявлено что антиген в плазме больных детектировался в концентрациях 1.5 - 7 чг/мл (Рио.б).В контроле антиген не детектировался. Этот раздел работы выполнялся в сотрудничестве о к.б.н. Е.В.Пуляевой.

Н / 2 3 4

Рис.6. Концентрация антигена'ЛЦМ 1 в.плазме крови здоровых доноров (к) и больных с инфарктом миокарда (1-4).

Таким образом, данный раздел работы показал возможность полу-

-

чения МКАТ к белкам, которые можно выделить из грубых экстрактов тканей фракционированием 2ДЕ и элюированием из пластин ПААГ. и в последующем использовать для иммунизации. Далее результаты анализа белков и полученные препараты МКАТ к ЛЦМ 1 желудочков в принципе могут найти применение в диагностике дистрофических процессов в миокарде и. в частности инфаркта миокарда.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

За последние десятилетия в биохимической генетике наметился определенный качественный прорыв в изучении продуктов генной экспрессии у человека в связи с формированием системного подхода, развитого на основе метода О'Фаррелла. Данный подход обеспечивает возможность формирования "белковых портретов" дифференцированных клеток, тканей и биологических жидкостей, включающих практически все БПГЭ экспрессирующиеся в клетках (Klose J..1989; Cells J. et al..1990,1992,1993,1994), что логически приводит к идее о создании обобщенных белковых каталогов (Anderson N.G.. Anderson H.L. ,1979,1982; Bravo R., Cells J., 1984; Шишкин С. С.. 1985.1989; Cells J. et al., 1988,1990,1990). а в дальнейшем к развитию положений и подходов использования результатов исследований в поиске новых белков и выявлении новых генов, а также объединении результатов исследования генома человека и БПГЭ (Klose J.,1989; Celia J. et al., 1990. 1991. 1992; Шишкин С.е., Калинин В. Н.. 1992; Human Gene Happing 10.5).

Изучение БПГЭ миокарда на основе системного подхода, как и других органов и тканей человека. ■ началось несколько позже чем биологических жидкостей и отдельных культивируемых видов клеток ( Kovalyov L. et al.. 1990; Tsvetkova И. et al.. 1991; Baker С. etal.,1992; Jungblut P. et asi.. 1994). Малое количество информа-

ции по использованию системного подхода в анализе БПГЭ миокарда человека, открывало широкие возможности в создании и разработке подходов и методологии анализа.

В результате проведенных исследований удалось построить' двумерную белковую карту и каталог белков миокарда с идентификацией ряда полипептидных фракций, что в основном хорошо коррелирует с данными, недавно полученными другими авторами (Baker С. et al.. 1992; Jungblut P. etal., 1994; Corbett J. et al. ,1994). Особо можно отметить, что результаты идентификации белков миокарда на 2ДЕ находятся примерно на одном уровне, с данными двух наиболее активно работающих групп западных авторов. В некоторых разделах представленного исследования можно отметить отечественный приоритет. в частности при изучении полиморфизма, онтогенетических изменений и аутолитической деградации. По всей видимости лучше проработано направление на получение чистых препаратов белков, использующее в качестве метода очистки двумерное Фракционирование, что' уже в настоящее время позволяет вести разработки иммунологических диагностических тестов.

Определенные, достаточно интересные перспективы исследования, просматриваются в создании подхода к формированию обобщенного международного каталога белков тканей и органов человека на предложенной основе.

Одно из важных продолжений исследований может быть связано с дальнейшей идентификацией белков на двумерных электрофореграммах мышечных тканей, что как предполагается будет способствовать вы1 явлению новых белков человека, в частности, возможно из семейства легких цепей миозина, тропомиозина и других. На этой основе, после проведения исследований по определению аминокислотной последовательности новых белков, традиционными молекулярно-биологически-ми методами планируется выделять и картировать новые гены человека.

. Не менее перспективной, и имеющей практическую значимость, представляется работа, по выявлению тканеспецифичесжих белков-маркеров дистрофических поражений, с выделением отмеченными выше методами интересующих белков и разработкой иммунологических тестов, а также при изучении аутоиммуных заболеваний человека, через выявление аутоантигенов и прицельную работу с выделенными белками.

Таким образом, представленная работа включает разные этапы реализации системного подхода к изучению мышечной ткани человека,и с точки зрения набора используемых методов, и по этапам исследования. и по решениям научных задач. В целом, можно считать, что создано новое перспективное научное направление в изучении белковых продуктов генной экспрессии в мышечных тканях человека и. в частности, в сердечной мышце.

ВЫВОДЫ.

1. Разработаны принципы одностадийного двумерного электрофоре-тического анализа образцов тканей человека с целью выявления комплекса наиболее представленных БПГЭ и построения двумерной белковой карты ("белкового портрета ткани") с использованием новой универсальной системы обозначения фракций.

2. Построены двумерные белковые карты БПГЭ разных топографических участков сердечной мышцы человека и 9 групп скелетных мышц, и на этой основе сформирован обобщенный компьютерный банк данных. включаюпцш сведения о 312 белках человека.

3. Проведена идентификация 33 белковых фракций из включенных в компьютерный банк, в результате обнаружено 3 новых белка человека

и уточнена первичная структура нескольких известных белков с помощью микросеквенирования.

4. Анализ электрофоретических и других свойств около 300 БПГЭ миокарда человека позволил выявить ряд полиморфных вариантов, частоты встречаемости которых соответствовали ожидаемым из равновесия Харди-Вайнберга. Индекс гетерозиготности для вариантов коррелирующих с двухаллельным состоянием оценен в 1.4$. Обнаружен новый редкий аллель МЬС и показано, что он отличается от обычного аминокислотной заменой 144 асп - гис.

5. Исследования изменений БПГЭ миокарда в ранкзм онтогенезе и у взрослых позволило выявить до 10 групп маркерных белков, особенности распределения которых коррелируют с определенными стадиями развития.

6. Проведено изучение изменений в белковоу.составе миокарда при сердечно-сосудистой патологии и для нескольких белковых фракций отмечена корреляция с развитием различных форм патологии человека.

7. Разработана унифицированная методика и подход к получению чистых препаратов белков миокарда человека. На основе выделенного белка ЛЦМ 1 желудочков были получены гибридомы, продуцирующие МКАТ и с их использованием разработан иммунохимический тест, позволяющий идентифицировать антиген в крови больных с инфарктом миокарда.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шишкин С.С., Ковалев Л.И. 'Исследования молекулярных механизмов патогенеза миодистрофий и систематический подход к изучению белков человека. - Журн. невропат, и психиатр., 1988, N3. с.119-123.

2. Ковалев Л. И., Пуляева Е.В.. Шишкин С. С.. Киррилова А. И.. Фещенко С.П. Белки сердечной мышцы человека: двумерный электрофо-ретический анализ у эмбрионов. - Мол. генет.. микробиол., вирус., 1988. N8. С. 28-32.

3. Shlshkln S.S.. Gromov P.S.. Kovalev L. I.. Zakharov S.F., 'Pulyaeva E.V. Two-dimensional gel electrophoresis of human proteins from erythrocyte membranes and heart. - Proc. 2 Int. Conf. Blochen. Separ. .Kesztneiy, Hungary. 1988. P. 435

4. Shlshkln S.S.. Pulyaeva Y. V.. Kovalyov L. I. Characterization of topographical peculiarities and ontogenetic changes of human heart proteins. Electrophoresis'., 1988, V.9, N 10. P.636.

5. Пуляева E.B.. Цветкова H.H.. Ковалев Л.И.. Шишкин С.С. Поиски тканеспецифичных белков сердечной мышцы. Перспективы использования в диагностике. Тез. докл. научн. конф. "Биохимия - медицине". Л. 1988. С. 162-163.

6. Shlshkln S.S., Pulyaeva Е. V., Kovalyov L.I. Characterization of topographical peculiarities and ontogenetic changes of human heart proteins. Proc. Int. Conf., Two-dimensional electrophoresis". Vienna. Austria, 1988, P. 236.

7. Ковалев Л. И., Пуляева Е. В.. Цветкова М.Н., Шишкин с. С. Систематический подход в изучении белков миокарда человека. , Двумерная карта белков левого аелудочка человека. Тез. докл. Всес. симп."Проблемы изучения наследственности человека на уровне белковых продуктов генной экспрессии". М.. 1989, С. 34.

8. Pulyaeva Н.V.. Kovalyov L.I.. Shlshkln S.S. Two-dimensional map of human heart proteins as a basis a building a d tabase. Proc. Int. Meet, on Electroph. München, FRG, 1989, P. 56-59.

9. Ковалев Л.И., Пуляева E.В., Цветкова И.Н., Наумов В.Г., Самко А.Н., Шишкин С. С. Топографические и онтогенетические особенности белкового спектра мышцы сердца человека. Изменения в составе белков сердца при кардиомиопатиях. Тез. докл. VI Всес.

конф. по биохимии мышц. Тбилиси. 1989, С.64-65.

10. Волгин А. Ю., Ковалев Л. Й.. Конорова А. А,,. Пуляева Е.В., Цветкова М.Н.. Шишкин С.С., Певницкий Л.А. Использование метода двумерного электрофореза в целях получения гибридом секретир'ующих МКАТ к ЛЩ сердечной-мышцы человека. Тез. докл. III Всес. совещ. " Культивирование клеток животных и человека". М.. 1990. С.18.

11. Пуляева Е.В., Ковалев Л.И., Цветкова М.Н., Шишкин С.С,, Болдырев Н.И. Двумерная карта белков' левого желудочка сердца человека. БИОХИМИЯ. 1990, Т. 55, Н 3. С. 489-498.

12. Ковалев Л. И.. Пуляева Е. В.. Ильинский Р. В.. Фещенко С. П.. Шишкин С.С. Изучение топографических особенностей и изменений в онтогенезе легких цепей миозина в миокарде человека. Онтогенез. 1990. Т. 21. Н 2. С. 218-222.

13. Kovalyov L. I.. NaumovC.G., Samko A.M..,. Tsvetkova М.N.. Slilshkln S.S., Mukharlyamov N.M. Two-dimensional electrophoresis of heart muscle proteins In human cardiomyopathies. Electrophoresis. 1990. V. 11. N4. P. 333-336.

14. Ковалев Л.И.. Цветкова М.Н., Пуляева Е.В.. Лаптев А.В. Получение высокоочищенных белков, пригодных для микросеквенирова-ния. Тез. докл. I Всес. конф." Геном человека". 1990, Н., С. 84-85. ,

15. Шишкин С.е., Егоров Ц.А.. Ковалев Л.И., Лаптев А.В.. Цветкова М.Н., Пуляева Е.В., Барбашов С.Ф. Альфа-тропомиозин миокарда человека: идентификация на двумерной карте с помощью.секвенирова-ния. Тез. докл. I Всес. конф. " Геном человека", 1990, М.. С.194-195.

16. Ковалев Л. И.. Пуляева Е. В.. Цветкова М.Н.. Фещенко С. П., Шишкин С.С. Систематический подход в изучении генетически детерминированных процессов в миокарде человека. Топографический и онтогенетический аспекты. - Подходы к изучению патогенеза кардиомио-патий. Тез. докл. II Всес. съезда мед. генет.. М., 1990. С.199..

17. Волгин A. D.. Конорова А. Л.. Ковалев Л. И., ПуляеваЕ.В.. Цветкова М.Н.. Певницкий Л.А., Шишкин С.С. Получшме МКАТ к белкам миокарда человека; очищенных методом двумерного электрофореза. Тез. докл. II Всес. сьезда мед. генет.. И.. 1990. С.80.

18. Ковалев Л.И., Волгин A.D.. Конорова А.Л.. Цветкова М.Н.. Пуляева Е.В., Певницкий Л.А,. Шишкин С.С. Идентификация легкой цепи 1 миохина из нелудочков сердца человека на двумерных элект-рофореграммах с помощью моноклональных антител. Биохимия, 1990. Т. 55. N 10. С. 1911-1913.

19. Шишкин С.С.. Егоров Ц.А.. Ковалев Л.И., Лаптев А.В.. Цветкова М. Н., Пуляева Е. В.. Барбашов Z. Ф. Идентификация альфа-тропо-миозина сердечной мышцы человека двумерным электрофорезом и сек-венированием. Биохимия. 1991. Т.56, N 1, С. 136-139.

20. Shlshkln S.S., Gromov P.S.. Kovalyov L. I., TsvetKova M. N. A systematic analysis of human proteins: for the study of human genome organization. Proc. Int. Symp. on genetic,, health and disease. Amrltsar, India, 1990. N53.

21. Tsvetkova M. N., Kovalyov L. I., Laptev A.V., Shlshkln S.S. Production of high'purity proteins by elutlon of Individual fractions from two-dimensional gels. Electrophoresis. 1991, V. 12. N 7-8. P. 576-578.

22. Kovalyov L.I.. Tsvetkova H.N.. Pulyaeva H. V., Shlshkln S.S. Two-dimensional gel electrophoresis for protein purification from human heart. Proc. Int. Meet, on Two-dimensional Electrophoresis. London. England. 1991. P.256.

23. Konstantlnova S.A., Kovalyov L. I.. ZorovD. B., hlshkln S.S., Skulachev V.P. 2D PAGE of polypeptides from bovine heart mitochondria. Evidence for the tight binding of porln with the Inner membrane. Proc. Int. Meet, on Two-dimensional Electrophoresis. London. England. 1991, P.274-275.

24. Шишкин С. С.. Громов П. С.. Ковалев Л. И.. Кухаренко 3. И..

Гиндилис В.П.. Агеев С А. Генетическое картирование на основе анализа продуктов генной экспрессии в гибридных и других клетках. Тез. докл. II Всес. конф. "Геном человека", М.. 1991, с.62-63.

25. Ковалев Л.И.. Галюк М.А., Волгин A.D. Обнаружение редкого аллеля легкой цепи Г миозина желудочков сердечной мышцы человека. Тез. докл. II Всес. конф. "Геном человека", М., 1991, С.115-116.

26. Shlshkln S.S.. Laptev А.V.. Kovalev L. I., Pulyaeva H.V. Systematic analysis of protein products of gene expression as an approach to reveal of new human genes. Proc. 8th Int. Congr. Hum. Genet., J. Human Genet., 1991. suppl..V.49. N4, P116.

27. Kovalev L.I.. Tsvetkova M.N., Feschenko S.P., Shlshkln S.S. The study of gene expression regulation In proteins or ontogenesis by means of analysis of human heart muscle. Proc. 8th Int. Cong. Hum. Genet.. J. Hum. Genet., 1991, §uppl.. V.49, N4, P. 395.

28. Ковалев Л.И., Галюк М.А., Шишкин С.С. Новый вариант легкой цепи 1 миозина, обнаруженный в сердечной мышце человека. Мол. ге-' нет., микробиол.. вирус., 1991, Н 11, С.29-32.

29. Константинова С.А., Зоров Д.Б., Ковалев Л.И., Шишкин С.С. Изучение свойств митохондриального порина из сердца быка. Биохимия, 1991, Т.56, N 11, С.2042-2051.

30. Пуляева Е.В., Конорова А.Л., Ковалев Л.И., Волгин A.D., Шишкин С.е., Певницкий Л.А. Использование моноклональных антител против миозиновых легких цепей 1 для обнаружения соответствующего антигена в крови больных инфарктом миокарда. Бюлл. эксп. биол. и медиц., 1991, N10, С. 416-417.

31. Volgln A.Y., Kovalyov L. I., Konorova A. L., Tsvetkova M. N., Pulyaeva H.V.. Pevnltsky L.A.,' Shlshkln S.S. Two-dimensional electrophoresis for preparing monoclonal antlbodyes (antigen purification and hybtldoms selection ) to myosin light chain 1 In the human heart ventricles. Proc. Int. Meet. Electroph. Soc.,

Washington. USA. 1991. P. 40.

32. Kovalyov L. I.. Tsvetkova M. N.. Pulyaeva ;H. V.. Feshenko S.P.. Shlshkln S.S. Analysis ontogenetic changes in protein of human heart ventricles by two-dimensional electrophoresis technique. Proc. Int. Meet. Electroph. Soc.. Washington, USA, 1991, P. 40.

33. Цветкова M.H.. Ковалев Л.И., Фещен)<о С.П.. Шишкин С.С. Изучение "мажорных" белков миокарда в онтогенезе. Онтогенез, 1992, Т. 23. N 4. С. 351-363.

34. Спитковский Д. М.. Лунга И. Н., Шишкин С. С.. Ковалев Л. И.. Талызина Т.А. Генетические эффекты от действия малых доз ионизирующих излучений. Проблема клеточного ответа и подходы к их изучению. Вестник РАМН, 1992, Н 4. С. 39-46.

35. Шишкин С.С., Ковалев Л.И.. ГалюкН. А.. Ефимочкин А.е., Егоров Ц.А., Мусалямов А.X. Использование системного подхода в изучении белковых продуктов генной экспрессии в исследованиях генома человека.I. Двумерный электрофорез и секвенирование белков сердечной мышцы. Тез. докл. III конф."Геном человека". М.. 1993. С. 105.

36. Цветкова М.Н.. Ковалев Л.И.. Шишкин С.С. Изучение аутоли-тических изменений белков ыиокарда человека методом двумерного электрофореза. Вопр. мед. химии. 1993, N 4, С.31-34.

37. Laptev А.V.. Shlshkln S.S.. Kovalyov L. I.. GalyukH.A., Musalyamov A.Kh., Egorov Ts.A. Identification of an allelic variant of lsoform KLC-l - V/sB (human myosin light chain). Blochem. Genet. .1993. V.31. H 516. P. 253-258.

38. Лаптев А.В.. Шишкин С.С., Егоров Ц.А., Ковалев Л.И.. Цветкова М.Н.. Галюк М. А., Мусалямов А. X., Ефимочкин А. С. Поиск новых продуктов генной экспрессии в сердечной мышце человека, микросек-венирование белков после двумерного электрофореза. Молекулярная биология, Т.28, N 1, С.52-58.

39. Егоров Ц. А.. Ковалев Л. И.. Вербина И.. Мусалямов А.Х. Идентификация белков кодируемых' экспрессирующимися генами. Тез. докл. IV конф."Геном человека", М., 1994, С.33.

40. Ковалев Л.И.. Худайдатов А.И.. Ефимочкин А.С., Р'адько С.П., Шишкин С.С., Лукашова И.В. Анализ продуктов генной экспрессии в мышечных тканях человека с целью их идентификации и использования для поиска новых генов. Тез. докл. IV конф."Геном человека", Н.. 1994. С. 49.

41. Шишкин С.С.. Ковалев Л.И.. Радько С.П., Волгина В.В.. Худайдатов А. И.. Честков В.В. Анализ продуктов ггчной экспрессии для диагностики наследственных миодистрофий. Тез. докл. IV конф. "Геном человека". М., 1994, С.105-106.

42. Лукашова И.В.. Ковалев Л.И.. Ефимочкин А.С.. Шишкин С.С. Изучение белков лимфоцитов человека с помощью двумерного электрофореза. Биохимия. 1994. Т.59. N 5. С. 663-674.

43. Ковалева М.А.. Ковалев Л.И.. Худайдатов А.И., Ефимочкин А.С.. Шишкин С.С. Сравнительный анализ белкового состава скелетной и сердечной мышцы человека двумерным электрофорезом. Биохимия, 1994, T.59. N5. С. 675-681.

44. Shlshkln S.S.. Kovalyov L.I., Lucashova I.V.. Ershova E.S.. Chudaldatov A.I., 'Musalyamov A.Kh.. Egorov Ts.A.. Shllov A.G., Kucharenko V.I. Two-dimensional electrophoresis and micro-sequence analysis of proteins In Russian Human genome project. Proc. Int. Conf. "2D Electrophoresis:from protein map to genomes", Siena, Italy. 1994. P.65.

45. Kovalyov L.I.. Shlshkln S.S., Khaslgov P.Z., Rubachev P.G.. Khudaidatov A.L., Obelchuk L.I., Grachev S.V.. Egorov Ts.A. Human genome analysis based different human tissues and cultured human cells. Proc. 16th Int. Congr. Blochem.. Hoi. Biol., New Delhi. India, 1994, V.II, P. 122.

46. Ковалев Л. И., Ершова Е.С., Ковалева М.А., Худайдатов А. И..,

Егоров Ц. А.. Мусапямов А.Х., Шишкин С. С. Изучение продуктов генной экспрессии в разных видах мышечной ткани у -человека. Тез. докл.КЗ) Рос.сьезда мед. генет., П., 1994, 4.1. С.30-31.

47. Шишкин С.С.. Ковалев Л.И., Ковалева М.А.. Ершова Е.С., Ху-дайдатов А.И.. Волгина В. В. Теоретические и прикладные аспекты изучения тканевой, специфичности генной экспрессии у человека. Тез. докл. 1(3) Рос. съезда мед. генет.. И.. 1994, 4.1. С.68.

48. Ковалев Л.И., Худайдатов А.И., Галюк М.А., Шишкин С.С.. Ниязбекова A.C.. Гелашвили H.H.. Завалишин И.А. Изучение белкового состава скелетной мышцы человека при боковом амиотрофическом склерозе. Вопр. мед. химии. 1994. Ii 5. С. 42-44.

49. Ершова Е.С., Ковалев Л.И., Шишкин С.С. Быстрый метод полупрепаративного выделения высокоочищенных белков из миокарда человека на основе фракционирования экстрактов двумерным электрофорезом. Биотехнология. 1994. N6. С.17-19.

50. Kovalyov L. I.. Shlshkln S. S.. Eflmochkln A.S.. Kovalyova M. A.. Ershova E.S.. Egorov T.A.. Musalyamov A. K. The major protein expression profile and two-dimensional protein database of human heart. Electrophoresis. 1995. V. 16. P.

ytACTQ:{ окояитспьндй rexHHitH венц, дин eeep

подл, к л et at 4.7.95 mkas |2| пГрай (oöÜT