Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование тканеспецифичности транскрипции генов KLRB1 и PROM1

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование тканеспецифичности транскрипции генов KLRB1 и PROM1"

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М. ШЕМЯКИНА И Ю. А. ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

ПЛЕШКАН ВИКТОР ВИКТОРОВИЧ

Исследование тканеспецифичности транскрипции генов КШВ1 и РЯОМ1

специальность 03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва 2009

14 т т

003469925

Работа выполнена в лаборатории структуры и функций генов человека Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, Т.В. Виноградова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Ю.Б.Лебедев доктор биологических наук, П.М.Рубцов

Ведущая организация:

Институт Биологии Гена

Защита диссертации состоится " \(>1 " 1А\л£)\яй- 2009 года в " \ft-OG " часов на заседании диссертационного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу 117871, ГСП-7, В-437, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан О" ЛЛ^Х^

Учёный секретарь диссертационного доктор физико-математических наук

2009 года.

В.А.Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В данной работе исследовали тканеспецифичность транскрипции и механизмы регуляции генов KLRB1 и PROM1, кодирующих трансмембранные белки CD161 и CD133, соответственно.

Рецептор CD 161, кодируемый геном KLRB1, экспрессируется NK и NKT-клетками. Оба типа клеток обладают цитотоксической активностью и способны узнавать и уничтожать различные виды клеток, в том числе опухолевые, вирус-инфицированные клетки и чужеродные трансплантанты. Биологическая функция рецептора CD 161 человека до сих пор остается неясной, предполагается, что он может участвовать как в регуляции цитотоксических функций клеток, так и в регуляции продукции цитокинов. Механизмы регуляции экспрессии KLRB1 гена до сих пор не изучены.

Основным конечным продуктом гена PROM1 является трансмембранный глнкопротеин CD133. Он является специфическим маркером гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и, с недавнего времени, используется при скрининге ГСК. Отобранные по маркеру CD133 клетки обладают большим пролиферативным потенциалом, нежели при ранее использованных маркерах ГСК, Известно, что метастазы, являющиеся во многом причиной смертности от рака, зачастую обладают фенотипом стволовых клеток, и, в частности, несут на своей поверхности характерные маркеры. Иногда такие клетки называют "раковыми стволовыми клетками", благодаря неограниченной способности к делению, устойчивости к апоптозу и лекарствам. Идентификация таких клеток очень важна при прогнозировании и лечении онкозаболеваний. С другой стороны, многими исследователями было показано, что при возникновении рака изменяется экспрессия некоторых генов, участвующих в эмбриональном развитии. Выявление и изучение таких генов дает возможность выяснить причины болезни, пути ее диагностики и лечения.

Ген PROM1 имеет сложную систему регуляции транскрипции. Известно, что транскрипция гена PROM1 инициируется как минимум с пяти альтернативных промоторов, однако, как правило, транскрипция идет с двух основных промоторов: PI и Р2. Поскольку все промоторы гена PROM1 входят в состав одного CpG-островка, предполагается, что одним из основных механизмов регуляции промоторов является метилирование.

Исследование принципов регуляции маркерных генов, анализ дифференциальной транскрипции генов в нормальных и опухолевых тканях человека, имеет как диагностическое, так и фундаментальное значение. Механизмы, вовлеченные в регуляцию экспрессии генов, вполне могут быть вовлечены в процессы опухолевой прогрессии, и на современном уровне очень важен комплексный подход к изучаемой проблеме, который позволит не только выявить общие принципы регуляции генов, но и предложить эффективные механизмы воздействия на структуры, способствующие развитию опухоли. По этой причине, экспрессируемые на поверхности клеток рецепторные белки, которые могут узнаваться цитотоксическими Т-лимфоцитами и/или моноклональными антителами, являются перспективным объектом для диагностики и для специфически направленной иммунотерапии и иммуномодуляции опухолевых заболеваний.

Цели и задачи работы. Целью данной работы было исследовать тканеспецифичность транскрипции генов KLRB1 и PROMI и определить факторы, влияющие на транскрипцию исследуемых генов in vivo.

Были поставлены следующие экспериментальные задачи: определить тканеспецифичность транскрипции исследуемых генов на панели клеточных линий, в эмбриональных и опухолевых тканях человека.

- определить могут ли гены являться маркерными при раке пищевода и легкого человека.

- определить влияние метилирования, как одного из эпигенетических факторов регуляции уровня экспрессии генов, на транскрипцию генов KLRB1 и PROMI.

Научная новизна и практически« ценность работы. Впервые проведен сравнительный анализ изменений уровней транскрипции гена KLRB1 в опухолевых клетках легкого и пищевода по сравнению с нормальными тканями, полученными от тех же пациентов. Показано, что уровень экспрессии гена KLRB1 в опухолевых тканях у большинства пациентов снижен по сравнению с нормальными как при немелкоклеточном раке легкого, так и при плоскоклеточпом раке пищевода. Таким образом, ген KLRB1 может быть использован как маркер рака легкого и пищевода. Более того, при раке легкого повышенный уровень транскрипции этого гена в опухолевых тканях, возможно, ассоциирован с плохим прогнозом развития онкозаболевания. Показано, что уровень

метилирования исследованных потенциально регуляторных участков гена не коррелирует с его транскрипцией.

На примере Р1 и Р2 промоторов гена PROM1: исследована регуляция транскрипции in vivo на эпигенетическом уровне. Показано, что метилирование промотора Р1 не является тканеспецифичным, и, по-видимому, не играет сколько-нибудь важной роли в регуляции транскрипции гена. Напротив, метилирование промотора Р2 является тканеспецифичным, и гипометилированное состояние этого промотора необходимо для высокого уровня транскрипции гена PROM1. Для высоко эффективной транскрипции гена PROM1 необходима одновременная работа двух промоторов, причем в этом случае промотор Р2 должен быть деметилирован. Достоверного различия в экспрессии гена при плоскоклеточном раке легкого в опухолевых и нормальных тканях не наблюдалось.

Транскрипция генов KLRB1 и PROMJ при развитии изучена недостаточно. Мы исследовали ее на примере легочных тканей эмбрионов человека различного возраста и сопоставили результаты с данными по транскрипции в раковых и нормальных тканях легкого.

Полученные в ходе выполнения работы данные могут быть использованы при исследованиях стволовых клеток, в онкологической практике для диагностики немелкоклеточного рака легкого и плоскоклеточного рака пищевода, а также при проведении фундаментальных исследований в области функциональной геномики.

Публикации и апробация работы. По теме диссертационной работы опубликованы две статьи в отечественном и зарубежном научных журналах. Материалы диссертации были представлены на XIX зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии» 7-9 февраля 2007, Москва.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на .bft.. страницах машинописного текста и состоит из обзора литературы, результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего ссылки.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

По современным представлениям, многие молекулярные системы, участвующие в контроле развития организма, могут быть также вовлечены в процесс онкогенеза. Схожесть молекулярных характеристик стволовых и раковых клеток в определенной степени способствует подтверждению этой гипотезы. Тщательный анализ данных по изучению экспрессии генов в клеточных линиях, являющихся производными раковых клеток, параллельно с определением экспрессии в эмбриональных и раковых тканях может иметь большое значение, как для клинической практики, так и для фундаментальной науки. Нами был проведен анализ уровня транскрипции генов в эмбриональных, нормальных взрослых н раковых тканях, поскольку многими исследователями было показано, что при возникновении рака изменяется экспрессия некоторых генов, участвующих в эмбриональном развитии.

Известно, что при неоплазиях зачастую наблюдаются изменения в метилировании генов. На клеточных линиях, как модельном объекте, мы попытались определить существуют ли корреляции между уровнем метилирования потенциально регуляторных участков и экспрессией генов KLRB1 и PROM1.

Определение тканеспецифичности транскрипции генов KLRB1 и PROM1.

Для определения тканеспецифичности транскрипции генов KLRBS и PROM1 использовали метод ОТ-ПЦР. Используя статистические гексануклеотиды в качестве затравки и высокопроцессивную обратную транскриптазу PowerScript, на матрицах РНК, выделенных из исследуемых тканей, синтезировали кДНК. На полученных смесях кДНК определяли уровень транскрипции генов KLRB1 и PROM1. Праймеры, специфичные для ПЦР амплификации данных генов, были подобраны так, чтобы продукты амплификации кДНК и геномной ДНК имели разную длину. В качестве контролен проводили ПЦР с праймерами к генам GAPDH и ß-актииа, имеющим примерно постоянный уровень экспрессии в различных тканях (т.н. "housekeeping genes"). Каждую ОТ-ПЦР проводили не менее трех раз, отбирая реакционную смесь, начиная с 21-ого цикла ПЦР через 3 цикла вплоть до 39-ого. Это позволило при анализе продуктов ПЦР с помощью агарозного электрофореза достаточно точно детектировать появление продуктов амплификации. Данные считали достоверными при р<0,05, где р - показатель статистической значимости (достоверности) данных.

Транскрипция в клеточных линиях. Результаты ОТ-ПЦР на кДНК разных клеточных линий показали сильную межклеточную вариабельность уровня транскрипции генов КЬЯВ1 и РЯОМ1. Полученные данные приведены в таблице 1.

Таблица 1. Транскрипция генов в различных клеточных линиях. Стандартная ошибка

(SEM) во всех случаях составляла примерно ±0,7

Клеточные линии Гены ^ч. НЕК.29 3 Jurkat NGP Tera-1 Tera-2 HeLa A549 HepG2

PROM1 29 40 - 28 37 37 38 29

KLRBi - 37 - 29 37 37 - -

Цифры соответствуют минимальному количеству циклов ОТ-ПЦР, необходимых для детекции продукта. - : продукт не детектируется к 39 циклу. Использованы клеточные линии человека: НЕК293 - клетки эмбриональной почки, трансформированные ДНК аденовируса Ad5 человека; Jurkat - острая Т-лимфобластоидная лейкемия человека; NGP -нейробластома; Тега-1 - эмбриональная карцинома яичка; Тега-2 - плюрипотентная эмбриональная карцинома яичка; HeLa - аденокарцинома шейки матки человека; А549 -карцинома легкого; HepG2 - карцинома клеток печени.

Транскрипция е эмбриональном легком человека. Ранее, в нашей лаборатории, была продемонстрирована обратная корреляция между изменениями уровней экспрессии ряда генов в процессе канцерогенеза разных тканей и при эмбриональном развитии соответствующих органов. В данной работе мы исследовали, существует ли такая же закономерность для уровней транскрипции генов KLRB1 и PROM1 на примере легочных тканей взятых у эмбрионов 10-12 и 21-24 недель. Это соответствует псевдогранулярной и каналикулярной стадиям развития легкого. Считается, что в это время иммунная система развита слабо, в то же время полипотентные и обладающие большим пролиферативным потенциалом клетки представлены широко. Данные по уровням транскрипции генов KLRB1 и PROM1 суммированы в таблице 2.

Транскрипты гена PROM1, который экспрессируется способными к дифференцировке стволовыми клетками, детектируются на псевдогранулярной стадии развития, их уровень незначительно уменьшается к более поздней стадии развития. Наличие транскриптов гена во взрослом легком, по всей видимости, обуславливается различными циркулирующими в крови С0133+-клетками.

Таблица 2. Транскрипция генов и РЯОМУ при различных стадиях развития

легкого человека.

стадия развития Образцы легкого: Ген:

КЫ*В1 (СШ61) Р1ЮМ1 (С0133)

эмбрион 10-12 недель №107 - 33

№111 - 36

№114 - 39

№115 - 33

21-24 недель | №9 - -

№17 - 39

№21 39 -

№31 - 36

№33 - -

№37 36 36

взрослый центральная локализация №11 33 27

№12 27 27

№13 30 27

№14 30 30

периферич. локализация №11 30 30

№12 33 30

№13 27 27

№14 30 36

Цифры соответствуют минимальному количеству циклов ОТ-ПЦР, необходимых для детекции продукта амплифпкашш. - : продукт не детектируется к 39 циклу. Периферич./центральная локализация - локализация образца в центральном или периферическом легком.

Как и следует ожидать, ген КЬЯВ!, кодирующий рецептор СО 161, экпрессируемый клетками иммунной системы, отсутствует на ранних стадиях развития, и лишь незначительное количество транскриптов появляется на более поздних стадиях. Для исследованных образцов тканей легкого взрослых людей показан довольно высокий уровень транскрипции гена KLR.H1 (табл. 2). Такой уровень транскрипции гена, вероятно, обусловлен хорошо развитой иммунной системой взрослого человека. Таким образом, ген КЫ(В1 может использоваться как один из маркеров состояния иммунной системы человека.

Транскрипция в опухолевых и нормальных тканях легкого и пищевода. Во многих случаях, у больных раком значительно подавлена иммунная система, и, в частности, снижена функция цитотоксических клеток. Можно предположить, что транскрипция гена КЬЯВ1 также может быть супрессирована при неоплазиях.

Для определения уровня транскрипции гена использовали парные образцы опухолевой и прилегающей гистологически нормальной ткани, взятых от одних и тех же пациентов, что позволило исключить индивидуальную вариабельность уровней транскрипции генов. Образцы прилегающих к опухоли тканей рассматривали как условную норму. В качестве дополнительного контроля использовали образцы тканей легких и пищевода людей без патологий этих органов, умерших в результате травм.

Исследование уровня транскрипции гена КШВ1 провели на выборке образцов тканей 60 пациентов. 37 пар образцов были получены от пациентов с диагнозом немелкоклеточный рак легкого (26 - плоскоклеточный рак, 11 -аденокарцинома), 23 пары образцов получены от пациентов с диагнозом плоскоклеточный рак пищевода. Показано, что уровень транскрипции гена КЬЯВ! понижен в 25 опухолевых образцах (р<0,0001) по сравнению с нормой при немелкоклеточном раке легкого (68%) (табл. 3) и 13 образцах (р=0,0003) рри плоскоклеточном раке пищевода (57%) (табл. 4). Одинаковый уровень транскрипции наблюдался в 10 парах образцов легкого (27%) и 10 парах образцов пищевода (43%). Для пищевода не было обнаружено случаев повышенной экспрессии гена КЬЯВ1 в опухолевых образцах по сравнению с нормой, а в случае рака легкого, повышенная транскрипция гена КЬЯВ! детектировалась в 2 случаях (5%). Можно отметить, что в большинстве случаев, количество транскриптов КЫ1В1 было не менее чем в 8-10 раз выше в образцах нормальных тканей, по сравнению с опухолевыми. Поскольку принято считать, что гены могут быть маркерными для того или иного вида опухоли, если изменение уровня их транскрипции наблюдается не менее чем у 50% обследованных пациентов, полученные нами данные позволяют предположить, что ген КШВ1 может быть маркёром при немелкоклеточном раке лёгкого и плоскоклеточном раке пищевода.

Таблица 3. Уровень транскрипции гена КН{В1 в опухолевых клетках легкого по сравнению с нормальными. _

Клинические характеристики Кол-во пар образцов Число (доля) образцов с указанным изменением уровня транскрипции гена К1ЯВ1 в опухолевых клетках легкого по сравнению с нормальными.

Снижение Повышение Без изменений

Всего 37 25 (68%) 2 (5%) 10 (27%)

Пол

Женщины 6 3 (50%) 0 3 (50%)

Мужчины 31 22 (71%) 2 (6,5%) 7 (22,5 %)

Тип рака

ПРЛ 26 20 (77%) 1 (4%) 5 (19%)

Аденокарцинома 11 5 (45,5%) 1 (9%) 5 (45,5%)

Локализация

Центральная 21 17 (81%) 0 4 (19%)

Периферическая 16 8 (50%) 2 (12,5%) 6 (37,5%)

Стадия заболевания

1+П 24 17 (71%) 1 (4%) 6 (25%)

Ш+1У 13 8 (61,5%) 1 (8%) 4 (30,5%)

Размер опухоли

Т1+Т2 12 7 (58,5%) 1 (8%) 4 (33,5%)

ТЗ+Т4 25 18 (72%) 1 (4%) 6 (24%)

Метастазы в регионарных лимфоузлах

N0 23 16 (70%) 1 (4%) 6 (26%)

№+N2 14 9 (64%) 1 (7%) 4 (29%)

Пациенты - 43-75 лет (средний возраст - 61 год).

Корреляций между изменениями уровней экспрессии гена КЬЯВ! и локализацией опухоли, полом больного, стадией заболевания, величиной опухоли, а также и наличием метастазов в регионарные лимфоузлы нами не обнаружено (табл. 3-4). Вероятно, снижение уровня транскрипции гена КЫ1В1 происходит на начальных стадиях развития опухоли независимо от ее локализации и не меняется при прогрессии.

Таблица 4. Изменение уровня транскрипции гена КН1В1 в опухолевых клетках пищевода

по сравнению с нормальными

Клинические характеристики Кол-во пар образцов Характер изменения уровня транскрипции гена КШВ1 в опухолевых клетках пищевода по сравнению с нормальными.

Снижение Повышение Без изменений

Всего 23 13 (57%) 0 10 (43%)

Пол

Женщины 5 4 (80%) 0 1 (20%)

Мужчины 18 9 (50%) 0 9 (50%)

Локализация

Средний отдел 14 9 (64%) 0 5 (36%)

Нижний отдел 9 4 (44%) 0 5 (56%)

Стадия заболевания

1+Ц 12 7 (58%) 0 5 (42%)

Ш+1У 11 6 (55%) 0 5 (45%)

Размер опухоли

Т1+Т2 5 1 (20%) 0 4 (80%)

ТЗ+Т4 18 10 (56%) 0 8 (44%)

Метастазы в регионарных лимфоузлах

N0 12 5 (42%) 0 7 (58%)

N1 11 6 (54,5%) 0 5 (45,5%)

Пациенты - 40-72 года (средний возраст - 56 лет).

Изменение уровня транскрипции гена КШВ1 в опухолевых тканях может быть связано, как со снижением уровня транскрипции непосредственно в опухолевых клетках, так и со снижением общего количества ИК- и ЫКТ-клеток или их цитолитических свойств в опухолевых тканях. Основными компонентами литических гранул цитотоксических клеток, в том числе и С0161+-клеток, являются перфорин 1 (РгП) и гранзим В (ОгтВ). Так как экспрессия перфорина 1 и гранзима В свидетельствует о цитотоксичности, то представляло интерес определить уровни транскрипции этих генов в нормальных и опухолевых клетках. Нами были определены изменения в уровнях транскрипции генов Рг/1 и йгтВ в образцах нормальных и опухолевых тканей легкого и пищевода. В случае рака легкого, уровни транскрипции перфорина 1 и гранзима В меняются так же, как и

гена КЬИВ1. Для пар образцов, где наблюдается снижение транскрипции КЬЯВ1 в опухолевых клетках, наблюдается и снижение уровней транскрипции Рг/1 и СгтВ. В нормальных и опухолевых образцах с одинаковым уровнем транскрипции КЫ1В1 также не менялась экспрессия Рг/1 и йгтВ. При повышении уровня транскрипции КЬЯВ! в опухоли, наблюдалось и повышение уровня транскрипции Рг/1 и ОгтВ. Для плоскоклеточпого рака пищевода уровень транскрипции перфорина 1 и гранзима В был одинаковым в нормальных и опухолевых образцах, вне зависимости от уровня транскрипции гена КЬКВ1 (Рис.1). Данные дают основание предполагать, что механизм изменения уровней транскрипции гена КЬЯВ1 при раке легкого и пищевода различен.

1.-152 и00 ил К 23

Н О Н О Н О II о

Рис. 1. Анализ изменения уровня транскрипции генов АГ1ДВ/, перфорина (Рг/1) и гранзима В (ОгтВ) в опухолевых и нормальных тканях легкого и пищевода методом ОТ-ПЦР.

Показаны результаты электрофоретического разделения в 1,5% агарозе продуктов ОТ-ПЦР, для четырех репрезентативных образцов. Сверху указаны номера образцов: Ъ452 - плоскоклеточный рак легкого, периферическая локализация, стадия 2, Т31Ч0М0; ЬЗОО - плоскоклеточный рак легкого, центральная локализация, стадия 2, ТЗШМО; ЬЗЗ -аденокарцинома легкого, периферическая локализация, стадия 3, ТЗШМО; Е23 -плоскоклеточный рак средней трети пищевода, стадия 3, ТЗШМО.

Цифрами указано количество циклов амплификации. Н - нормальные ткани; О - опухоль.

Параллелизм в изменении уровней экспрессии гена КЫ1В1 и генов Рг/1 и йгтВ более согласуется со снижением количества ЫК и МКТ-клеток и/или их активности. Это подтверждается литературными данными, указывающими на уменьшение общего количества К1К и ИКТ-клеток в опухолях, показанное иммунологическими методами.

Тем не менее, нельзя окончательно исключить, что происходит снижение уровня транскрипции гена в опухолевых клетках. В этом случае подтверждаются данные, что гены, начинающие транскрибироваться на поздних стадиях эмбрионального развития, супрессированы в неопластических тканях, хотя для статистической достоверности количество исследованных образцов эмбрионального легкого не достаточно.

Наши данные показывают, что ген KLRB1 может использоваться как высокоинформативный маркер при диагностике немелкоклеточного рака легкого и плоскоклеточного рака пищевода. Более того, в отличие от большинства предшествующих работ, исследующих роль цитотоксических клеток при разных патологиях иммунологическими методами, использованный нами метод является достаточно простым и быстрым.

Исследование уровня транскрипции гена PROM1 провели на небольшой выборке образцов тканей пациентов с диагнозом рак легкого. Показано, что ген PROMI не проявляет дифференциальной транскрипции в нормальных и опухолевых тканях легкого.

Исследование тканеспецифичности транскрипции в 5'-областях генов PROM1 и KLRB1.

Известно, что транскрипты гена PROMI могут инициироваться с пяти альтернативных промоторов, но в основном, транскрипция идет с промоторов PI и Р2 (Рис. 2). Транскрипты отличаются в 5'-участке, который включает нуклеотидные последовательности 5'-нетранслируемой области (UTR) и первого экзона транскрипта того промотора, с которого был инициирован данный транскрипт. Кроме того, для этого гена характерен альтернативный сплайсинг транскриптов в 5'-области (Рис. 2), приводящий к появлению двух типов изоформ - содержащих, и не содержащих четвертый экзон. Предполагается, что наличие или отсутствие именно этого экзона влияет на детекцию рецептора при помощи моноклональных антител. Для определения уровня транскрипции различных изоформ гена PROMI в нескольких клеточных линиях нами был применен метод ОТ-ПЦР с использованием специфических пар праймеров, указанных на рисунке 2.

n ._п.

Б 1л—

Ц>1А-Е5(б30по)

В Ч,

Пр1гЕ5(««по)

ORF

г~

~т—ГЕГТ—iЕЖ—£

ES-—С

Д

«и

ш

-ВДВ'-

ЦрЕ17-Е13(127по)

liB-EJ(liOno) Г£.Е5-Е5(143по)

Рис. 2. Схема участков гена РЯОМ1 и соответствующих им амплифицируемых транскриптов.

А. Фрагмент гена РКОМ1, включающий промоторы Р1 и Р2 и пять первых экзонов. Б,В. Приведены структуры транскриптов, инициированных с промоторов Р1 и Р2. Г. Фрагмент гена Р110М1 с 3-его по 5-ый экзон. Приведены структуры возможных сплайс-форм транскриптов, содержащих и не содержащих 4-ый экзон. Д. Участок гена РЯОМ1 с 17-ого по 18-ый экзон и структура транскрипта. Экзоны обозначены прямоугольниками, 5'-иТЯ экзоны выделены серым цветом, альтернативные промоторы Р1 и Р2 обозначены белыми стрелками, интроны обозначены черной прямой линией, ОЯР - точка инициации трансляции, праймеры обозначены стрелками и сокращением - "Пр", указан размер амплифицируемого фрагмента в п.о.

Для идентификации 5'-концевой последовательности транскриптов гена KLRB1 мы провели амплификацию 5'-концов этого гена (5'-Rapid Amplification of cDNA Ends), методом "step-out" ПЦР. Подробно метод изложен в диссертации. Эти эксперименты показали, что длина 1-го экзона гена на 15 п.о. больше указанной в GeneBank. Каких либо транскриптов, инициированных с удаленных промоторов, обнаружено не было.

Транскрипция изоформ гена РЯОМ1, отличающихся по содержанию экзона 4. С помощью ОТ-ПЦР, используя праймеры ЕЗ и Е5, фланкирующие четвертый экзон гена РЯОМ1, показано, что во всех клеточных линиях, где этот ген транскрибируется, присутствовала только одна изоформа гена, не содержащая четвертый экзон (Рис. 3, В).

А Б В

Пр1А-Е5 (630 по) Пр1В-Е5 (642 по) ПрЕЗ-Е5 (143 по)

Г

ПрЕ17-Е18 (12? по)

27 30 33 36 35 М -ОТ 27 30 33 36 39 М -ОТ

шт

27 30 33 36 39 М -ОТ 27 30 33 36 39 М -ОТ

Рис. 3. Результаты ОТ-ПЦР гена PROMJ в клеточных линиях.

А. Пара праймеров 1А/Е5 была использована для амплификации транскриптов, инициированных с промотора Р1 (длина продукта амплификации 630 п.о.). Б. Пара праймеров 1В/Е5 была использована для амплификации транскриптов, инициированных с промотора Р2 (длина продукта амплификации 642 п.о.). В. Пара праймеров ЕЗ/Е5 была использована для амплификации альтернативных транскриптов, различающихся по присутствию 4-ого экзона (длина продуктов амплификации 143 и 170 п.о.). Г. Пара праймеров Е17/Е18 была использована для амплификации З'-концевого участка, общего для всех изоформ транскриптов гена PROMI (длина продукта амплификации 127 п.о.). Слева указаны названия клеточных линий. Под каждой электрофореграмой указаны циклы ОТ-ПЦР, когда была отобрана аликвота. (-ОТ) отрицательный контроль, М - маркер длин ДНК,

Тканеспецифичностъ экспрессии транскриптов, инициированных с промоторов

PI и Р2. Транскрипты, инициированные с промоторов Р1 и Р2, содержат в качестве 5'-UTR экзоны 1А и 1В, соответственно (Рис. 2Б, В). Чтобы различить транскрипты с промоторов Р1 и Р2 были использованы пары праймеров 1А/Е5 и 1В/Е5 соответственно. Во всех случаях длины ПЦР-продуктов соответствовали схеме сплайсинга указанной на рисунке 2. Данные продукты были обнаружены только в линиях НЕК293, НаСаТ, Tera-J и HepG2. Никакие типы транскриптов, инициированных с промоторов PI и Р2, не были детектированы в линиях Jurkat, NT2/D1, А431, NCI-H23, NCI-H460, Hela, А549 и NGP.

Как видно из рисунка 3, в клеточной линии НЕК293 наблюдается очень высокий уровень транскрипции гена PROMI (Рис ЗВ, Г), при этом так же детектируются разные транскрипты, содержащие оба типа 5'-UTR экзонов (Рис ЗА, Б). Структура транскриптов была подтверждена секвенированием. В данном случае, очевидно, что транскрипты гена инициируются с одного из альтернативных промоторов, и в клетках, таким образом, присутствуют как минимум в двух вариантах - с 1А или IB 5'-UTR последовательностью. В случаях низкого уровня транскрипции в линиях Тега-2 и А549 детектированы только ЕЗ/Е5 и Е17/Е18 транскрипты (Рис ЗВ, Т), но нет никаких транскриптов с 5'-UTR (Рис ЗА, Б). Объяснением этого эффекта может служить как слишком низкая представленность этих транскриптов, так и инициация с каких-либо других промоторов.

Определение статуса метилирования участков генов PROM1 и KLRB1.

Промоторы PI и Р2 гена PROMI не содержат TATA боксов, расположены в CG-богатой области непосредственно друг за другом, имеют размер 1100 и 250 п.о., соответственно (Рис. 4). Мы проверили возможность влияния метилирования промоторов гена PROM1 на его транскрипцию. Для этой цели использовали принудительное изменение уровня метилирования при помощи деметилирующего агента 5-азадезоксицптидин (5-Аза). Подробно метод изложен в диссертации. Было показано, что транскрипция гена PROM1 в клетках линии НЕК293-Т увеличивалась при экспозиции с деметнлирующим агентом длительностью не менее трех дней и далее не изменялась. Это может указывать на роль метилирования в активности промотора.

В связи с этим, мы провели анализ уровня метилирования промоторов PI и Р2 в клеточных линиях, для которых ранее была показана дифференциальная транскрипция этого гена: А549, НЕК293, NGP и Jurkat (табл. 1). Уровень метилирования определяли секвенированием продуктов ПЦР амплификации геномных участков ДНК, модифицированной бисульфитом натрия. Этот способ позволяет оценить статус метилирования каждой отдельно взятой CpG -пары. Подробно метод описан в диссертации.

А

" промотор PI првкморИ

4-4-М IS...........1

DisP

46 пэ

Сфт

СО Nil-16 (264 по)

ri-h-

60 во ®?к

•^йШНЬ—

CG №17-49 (335по)

Рис. 4. А. Схема распределения СрО-динуклеотидов во фрагменте гена РЯОМ1, содержащего полные промоторы Р1 (1100 п.о.) и Р2 (250 п.о.), 5'-иТЯ экзоны и прилегающую к ним интронную последовательность.

Б. Фрагмент гена РЯОМ1, для которого было проведено бисульфитное секвенирование. Фрагмент содержит участок промотора Р1 (264 п.о.), промотор Р2 и 5'-иТЯ экзоны. Вертикальными линиями обозначены СрС-динуклеотиды, 5'-иТ11 экзоны выделены серым цветом, промоторы Р1 и Р2 обозначены белыми стрелками. Праймеры для бисульфитного секвенирования обозначены стрелками. Внизу тонкими линиями обозначены фрагменты (с указанием порядковых номеров Срв-динуклеотидов), для которых приведены профили метилирования на рисунках 5 и 6. Остальные обозначения как на рисунке 2.

Для каждой клеточной линии после обработки бисульфитом, ПЦР амплификации и клонирования ампликонов, была определена нуклеотидная последовательность не менее 10 индивидуальных клонов, для определения статуса метилирования каждой Срв-пары в анализируемом участке.

Метилирование промотора Р1. Показано, что уровень метилированния Срб-пар расположенных в промоторе Р1 и 5'-1ЛК экзона 1А во всех клеточных линиях составлял от 90 до 94% (Рис. 5), это говорит о том, что промотор Р1 и 5'-иТЯ экзона 1А находятся в конститутивно гиперметилированном состоянии и степень его метилирования не коррелирует с уровнем транскрипции гена РЯОМ1.

Клетэчкал пюшя Кггпси! Статус Ми илир ования

НЕК 293 1 3.10 2 7 9 о о о о о о ООО о о о 90

А549 2 3 1.« 4,9 3 7.5.10 ООО о о о о о о о о о 91

Лика! 3 2А МД7Д10 о о о о о о о ■ ■ - О О О................. о о 91

КОР 140 о 94

Рис. 5. Профили метилирования участка, содержащего промотор Р1 и 5'-итЯ экзон 1А гена РНОМ1.

В нижней части рисунка указано расположение СрО-динуклеотидов (черные кружки, базовая линия) с их номерами и расстоянием в п.о. от второй Срв-пары. Первая пара исключена ввиду вС^ТТ замены во всех клеточных линиях. Результаты бисульфитного секвенирования 10 клонов для каждой клеточной линии приведены таким образом, что указана только деметилированная Срв-пара (белые кружки), остальные пары метилированы. % - показывает усредненный процент метилирования для всех 10 клонов по каждой клеточной линии. Вертикальными линиями обозначено положение отдельных Срв-пар, 5'-иТЯ экзон 1А гена РКОМ1 обозначен серым прямоугольником. Клоны с одинаковыми номерами на рисунках 5 и 6 являются частями одного и того же клона.

Метилирование промотора Р2. Показано, что уровень метилирования CpG-nap расположенных в промоторе Р2 и 5'-UTR экзоне 1В в исследуемых клеточных линиях сильно варьирует, составляя от 48 до 94% (Рис 6., табл. 5), что говорит о том, что промотор Р2 и 5'-UTR экзона 1В могут находиться как в гипер-, так и гипометилнрованном состоянии. В линии НЕК293 уровень метилирования составляет лишь 48%, что коррелирует с высоким уровнем транскрипции гена PROM1 в этой клеточной линии. В клеточных линиях NGP и Jurkat уровень метилирования составляет 94%, что также коррелирует с низкой транскрипцией гена PROM1 в этих клеточных линиях. Исключение составляет клеточная линия А549, где промотор Р2 метилирован лишь на 54%, однако уровень транскрипции гена низкий и аномальный.

КЛ N! Статус Метилирования •А

н 10 о о о оо о о ООО оооо ООО о о ООО 0 о о о о о о о о о

к 9 о о ООО оооо ооо о о о оо о о о о о о о о о о

г 1 о О о о о ООО оо ооо о о ООО о о о о о о о

» 2 ООО ООО 0 о ООО о 0 0 о о 0 0 0 о -0

> 4.S ООО ООО о 0 0 о в о о о о о 43

3 О о о оо о о ООО 0 оо

7 о о о

i о о

« о о

А 2 о 00 о 0 ООО оооо о ООО о о 0 0 о о о о о о

« £.« О О 00 о 0 О 0 оо о о ООО о о о о о о о 0 0 0

9 5 О О 00 0 о оо о о ООО о о о о о о о 0 о 0

9 О о оо о О о ооо о 0 о о о 0 0 0 о

3 О оо о 00 ООО о 0 0 0 О о 0 0 54

10 0 О о о 0 О о 0 -о о о о

1 л « о

I 1 0 0 0 о 0

* 9 0 о. о

к 6 о 0 о

3 о 0 94

« 2.3 0 0

8 0 о

10 о

4.7 ....

X G 1. 10 о о 94

Рис. 6. Профили метилирования участка, содержащего промотор Р2 и 5'-11Т11 экзон 1В гена РЛОМ1.

КЛ - клеточная линия, № - номер клона. 22-я Срв-пара исключена ввиду СС->ТА замены во всех клеточных линиях. Серыми кружками обозначены СС-^ТА замены. Остальные обозначения как на рисунке 5.

клеточные линии: Участок и % метилирования в нем:

Р1 + 1А Р1 1А Р2+1В Р2 1В Р1+Р2

15 (264по)' 10 (218по) 5 (46по) 32 (335по) 25 (275по) 1 (бОпо) М (599по)

НЕК293 90" 97 76 48 49 44 61

А549 92 92 88 54 59 34 66

,1иг1Ш 91,5 86 100 94 93 98,5 93

94 90 100 94 92 100 93,5

НЕК293 7, 6, 8 98 96,5 100 95 90,5 100 94,5

НЕК293 другие 7 86,5 97 66 28,5 31 20,5 47

А549 1,7,4 94 96,5 93,5 99 96 100 98

А549 другие 7 90,5 90 85,5 34 42 6 48

Jurk.it 4,7,10 100 100 100 99 98,5 100 99

.ГигкаГ другие 7 86,5 80 100 92 90 98 90

- указано общее количество Срв-пар в данном участке, длина которого указана в скобках.

100% - означает, что участок полностью метилирован. Данные представлены для элементов показанных на рисунках 3 и 5. : Р1+1А: промотор Р1 и 5'-иТЯ экзон 1А; Р1: промотор Р1; 1А: 5'-иТ1г экзон 1А; Г2+1В: промотор Р2 и 5'-иТ11 экзон 1В; Р2: промотор Р2; 1В: 5'-иТЯ экзон 1В; Р1+Р2: полный проанализированный участок, включающий в себя промотор Р1, 5'-иТ11 экзон 1А, промотор Р2 и 5'-иТЯ экзон 1В.

Анализ метилирования промотора Р2 метил-специфическим ПЦР. Для

подтверждения результатов бисульфитного секвенирования проведены дополнительные эксперименты на четырех клеточных линиях. Анализируемую ДНК расщепляли чувствительной к метилированию (Нра\\) и не чувствительной к метилированию I) рекстриктазами, с последующим проведением ПЦР

амплификации специфического участка содержащего Нра\\1М$р\ рестриктный сайт. Для амплификации использовались праймеры, комплементарные последовательностям, фланкирующим исследуемый сайт. Прохождение ПЦР возможно только если сайт, лежащий между праймерами, не расщеплён. Таким образом, расщепление рестриктазой АЛр1 всегда должно приводить к уменьшению количества ПЦР-продукта. С другой стороны, метил-чувствительной рестриктазой Нра\1 гидролизуются только неметилированые рестриктные сайты. Поэтому в этом случае количество ПЦР-продукта после расщепления рестриктазой Hpa.ll может быть использовано для определения уровня метилирования выбранного

рестриктного сайта. Мы использовали пару праймеров, расположенных по краям рестриктного сайта Яра11/М5р1, включающем СрО-пару №40, выбранную как наиболее репрезентативную, с точки зрения корреляции её уровня метилирования с уровнем метилирования промотора Р2 в целом. Данные, полученные этим методом, приведены на рисунке 7.

Мене [ акцхфнцео: ая ГОДР

Мети

Л18 1? 2021 23 21 252*21 28253031 323334 35 36 373839 •»0 41 42 »3 « 45 16 Л 48 19

т "^гея

Рис. 7. Статус метилирования сайта НраП (40) внутри промотора Р2 гена Р1ЮМ1. А. Распределение СрС-динуклеотидов и Нра\\ сайтов в участке гена РЯОМ1, содержащем промотор Р2 (открытая стрелка) и 5'-итК экзона 1В (серый прямоугольник). СрС-динуклеотиды обозначены тонкими вертикальными стрелками вместе с соответвующей нумерацией внутри изучаемого участка; жирными вертикальными стрелками обозначены НраП сайты; стрелки обозначают праймеры Р2Р и Р2К использованные в метил-специфическом ПЦР анализе статуса метилирования сайта НраП №40. Б. Результаты метил-специфической ПЦР. Названия клеточных линий и циклов ПЦР указаны вверху и внизу рисунка соответственно. В. Процент метилированных сайтов № 40, определенный бисульфитным секвенированием и метил-специфической ПЦР.

Процент метилирования в случае метил-специфической ПЦР был определен исходя из формулы: ПМ %= 100х2(п1"п2) , где ПМ - процент метилированных сайтов, п 1 и п2 - минимальный цикл при котором детектируется ПЦР-продукт при ПЦР с не гидролизованной (п1) и Нра\\ гидролизованной ДНК (п2). Схожесть данных, полученных разными независимыми методами, дополнительно подтверждает наши результаты по метилированию промоторов и может использоваться как недорогой альтернативный и быстрый метод определения метилирования промотора Р2.

Метилирование и транскрипция. Наблюдаемые характеристики метилирования/деметилирования промоторов Р1 и Р2 предполагают независимое метилирование промоторов, несмотря на то, что оба промотора находятся в одном,

сравнительно небольшом Срв-островке, на близком расстоянии друг от друга. Промотор Р1 гиперметилирован во всех изученных случаях, в то время как метилирование промотора Р2 сильно варьирует. Уровни метилирования б'-иТЯ экзонов 1А и 1В коррелируют с метилированием соответствующих промоторов.

Анализ метилирования промоторов Р1 и Р2 в клеточных линиях показал тканеспецифичность метилирования промотора Р2 и фактически отсутствие таковой специфичности для промотора Р1. Различия в профилях метилирования исследованных промоторов могут служить косвенным доказательством того, что при их регуляции используются различные механизмы. Таким образом, метилирование является лишь одним из факторов, определяющих активность некоторых промоторов.

Определение метилирования в протяженных участках генов КЫ1В1 и РЯОМ1.

Нами были исследованы не только промоторные области генов РЯОМ1 и КЬЯВ1, но и протяженные области обоих генов от первых экзонов в 1-3 т.п.о. в 5'-направлении, до вторых-третьих экзонов этих генов, на предмет наличия Срв-островков и потенциально регуляторных элементов. В этих областях были обнаружены ЬТЯ, А1и8р и прочие вС-богатые элементы. Был проанализирован уровень метилирования 1Л"11 и вС-богатых участков первых интронов генов методом бисульфитного секвенирования (подробнее изложено в диссертации). Во всех случаях было показано, что уровни метилирования исследованных СрО-участков не коррелируют с транскрипционной активностью генов. Это показывает, что в исследованных клеточных линиях степень метилирования данных участков не имеет решающего значения при регуляции экспрессии генов.

ВЫВОДЫ:

1. Показано, что уровень транскрипции гена КЬЯВ! понижен в неопластических тканях легкого (68% пациентов) и пищевода (57% пациентов) по сравнению с соответствующими нормальными тканями. Следовательно, ген КЬЙВ! может использоваться как высокоинформативный маркер при диагностике указанных видов рака.

2. Установлено, что для транскрипции гена РЯОМ1 важно метилирование промоторной области гена, в то время как метилирование других областей гена остается практически неизменным в разных типах клеток и не влияет на транскрипцию.

3. Исследованы эпигенетические изменения двух основных промоторов Р1 и Р2 гена РРОМ1. Показано, что метилирование промотора Р2 является тканеспецифичным и понижение степени метилирования необходимо для эффективной транскрипции гена. В то же время метилирование промотора Р1 конститутивно и, вероятно, не играет существенной роли в регуляции транскрипции гена.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

СТАТЬИ:

1. Плешкан В.В., Виноградова Т.В., Зиновьева М.В., Свердлов Е.Д. "Супрессия транскрипции гена KLRB1 в опухолевых тканях человека" Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, №4, 2007, стр 3-7

2. V.V. Pleshkan, T.V. Vinogradova, E.D. Sverdlov, Methylation of the prominin 1 TATA-less main promoters and tissue specificity of their transcript content Biochim BiophysActa 1779 (2008) 599-605.

ТЕЗИЗЫ НАУЧНЫХ КОНФЕРЕНЦИЙ: 1. Плешкан B.B., Виноградова Т.В., Свердлов Е.Д.

"Исследованине метилирования двух альтернативных промоторов гена CD133 в клточных линиях человека", тезисы XIX зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии» 7-9 февраля 2007, Москва.

Заказ № 87/04/09 Подписано в печать 16.04.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

4:'"--; , ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 649-83-30 {{У^ }) www.cfr.ru; e-mail:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Плешкан, Виктор Викторович

Список сокращений:.

ВВЕДЕНИЕ.

Цели и задачи работы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Метилирование и другие эпигенетические факторы, влияющие на экспрессию генов.

1.1.1 Гистоны и метилирование ДНК.

1.1.2 Петли хроматина и метилирование ДНК.

1.1.3 Метилирование при импринтинге.

1.1.4 Регуляторные белки CTCF и Kaiso.

1.1.5 Тканеспецифичность транскрипции генов обусловленная метилированием.

1.2 Изменения уровня метилирования при различных патологиях.

1.2.1 Гипометилирование ДНК.

1.2.1.1 Активация онкогенов.

1.2.1.2 Метилирование мобильных элементов.

1.2.1.3 Хромосомная нестабильность.

1.2.3 Метилирование ДНК и горячие точки мутаций.

1.3 Особенности транскрипции генов с промоторов не содержащих канонических ТАТА-последовательностей.

1.3.1 Основные свойства инициаторного элемента (Inr).

1.3.2 DPE элемент промотора (Downstream Promotor Element).

1.3.3 Проксимальный (PSE) и дистальный (DSE) промоторые элементы.

1.3.4 МТЕ элемент (Motif Ten Element).

1.3.5 DCE элемент (Downstream Core Element).

1.3.6 Элементы, специфические для he содержащих ТАТА-последовательность промоторов.

1.3.7 CpG островки.

1.3.8 Частные случаи регуляции генов не содержащих ТАТА-последовательность.39 1.3.8.1 Регуляция транскрипции генов NKR-P1 семейства.

1.3.8.1.1 Структура промотора гена Ly49 и тканеспецифичность экспрессии.

1.3.8.1.2 Особенности гена KLRB1.

1.3.8.2 Регуляция транскрипции гена PROM1.

ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

2.1 Определение тканеспецифичности транскрипции генов KLRB1 и PROM1.

2.1.1 Транскрипция в клеточных линиях.

2.1.2 Транскрипция в эмбриональном легком человека.

2.1.3 Транскрипция в опухолевых и нормальных тканях легкого и пищевода.

2.1.4 Исследование тканеспецифичности транскрипции в 5'-областях генов PROM1 и KLRB1.

2.1.4.1 5'-RACE гена KLRB 1.

2.1.4.2 Транскрипция изоформ гена PROM1, отличающихся по содержанию экзона 4.

2.1.4.3 Тканеспецифичность экспрессии транскриптов, инициированных с промоторов Р1 и Р2.

2.2 Определение статуса метилирования участков генов PROM1 и KLRB1.

2.2.1 Использование деметилирующего агента 5-Аза.

2.2.2 Бисульфитное секвенирование промоторов Р1 и Р2 гена PROM1.

2.2.2.1 Метилирование промотора Р1.

2.2.2.2 Метилирование промотора Р2.

2.4.2.3 Характер метилирования промоторов Р1 и Р2.

2.2.3 Анализ метилирования промотора Р2 метил-специфическим ПЦР.

2.2.4 Метилирование и транскрипция.

2.2.5 Определение метилирования в протяженных участках генов KLRB1 и PROM1.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1 Материалы.

3.1.1 Ферменты и реактивы.

3.1.2 Оборудование.

3.1.3 Расходные материалы.

3.1.4 Буферные и другие растворы.

3.1.5 Микробиологические среды.

3.1.6 Клеточные линии.

3.1.7 Праймеры, последовательность нуклеотидов.

3.2 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.2.1 Выделение РНК и геномной ДНК.

3.2.1.1 Выделение РНК.

3.2.1.2 Определение концентрации РНК.

3.2.1.3 Анализ выделенной РНК методом гель электрофореза.

3.2.1.4 Выделение геномной ДНК.

3.2.1.5 Высаживание.

3.2.2 Обработка ДНКазой.

3.2.3 Синтез первой цепи кДНК.

3.2.3.1 Построение первых цепей кДНК для ОТ-ПЦР.

3.2.3.2 Контроль на наличие примесей ДНК, "-ОТ" контроль.

3.2.3.3 Построение первых цепей кДНК для 5-RACE.

3.2.4 ПЦР.

3.2.4.1 ОТ-ПЦР.

3.2.4.2 Геномная ПЦР.

3.2.4.3 Электрофорез.

3.2.5 Определение первичной структуры клонированных фрагментов ДНК и ПЦР фрагментов.

3.2.6 Нуклеотидные последовательности и их анализ.

3.2.7 Бисульфитное секвенирование.

3.2.7.1 Секвенирование CG-богатых областей генов PROM1 и KLRB1.

3.2.7.2 Секвенирование промоторного участка гена PROM1.

3.2.8 Молекулярное клонирование.

3.2.8.1 Лигирование.

3.2.8.2 Клонирование.

3.2.8.3 Трансформация.

3.2.8.4 Выращивание ночной культуры клеток.

ВЫВОДЫ:.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование тканеспецифичности транскрипции генов KLRB1 и PROM1"

Онкологические заболевания являются второй по частоте причиной смертности в развитых странах. При неоплазиях нарушаются механизмы контроля процессов дифференцировки и пролиферации клеток, связанные с нарушением генетического аппарата клеток. Одним из принципиальных моментов в борьбе с опухолью является ранняя диагностика. Для повышения эффективности диагностирования рака на ранних стадиях и выбора путей лечения необходимо выявление общих для большинства опухолей данного типа генов, изменение экспрессии которых сопровождает появление и развитие опухоли. Такие гены называют маркерными. Не всегда эти маркерные гены играют существенную роль в процессах образования и развития опухоли, и ни один из множества исследованных молекулярных маркеров в отдельности не обладает значительной клинической ценностью при анализе гетерогенных опухолей. Однако использование группы характерных генов-маркеров может значительно повысить надежность ранней диагностики заболевания.

С другой стороны, изучение основ регуляции генов, и, в особенности, маркерных, может иметь важное значение для терапии опухоли.

Одной из характеристик определяющих функциональный статус гена является метилирование. Метилирование ДНК вносит свой вклад в механизмы контроля экспрессии генов и играет важнейшую роль в клеточной физиологии. Всё больше данных говорит в пользу того, что определённый характер метилирования генома важен для нормального функционирования клеток и целых органов. Определенный характер метилирования ДНК устанавливается во время эмбрионального развития организма, и его изменения могут привести в дальнейшем к нарушениям развития, преждевременному старению, прогрессии опухолевых заболеваний, подавлению экспрессии онкосупрессоров (гены, подавляющие развитие опухолей). На данный момент накоплено много данных об аберрантном метилировании в различных опухолях, о его корреляции с уровнем экспрессии, стадией развития и происхождением опухоли. Подобное влияние метилирования вероятно проистекает из того, что при его помощи происходит регуляция транскрипции генов. Считается, что метилирование регуляторных элементов генов, таких как промотор, энхансер и инсулятор обычно приводит к супрессии функции гена. Метилирование района интрона - наоборот, может обеспечить активность гена, поскольку в этом случае, метилирование интрона может препятствовать взаимодействию с белками-репрессорами. Неактивное состояние гена так же может быть обусловлено особой компактной структурой хроматина (гетерохроматина), которая образуется в результате взаимодействия ДНК со специфическими хромосомными белками. В некоторых случаях образование такой структуры хроматина объясняют метилированием ДНК и, напротив, деметилирование ДНК может сопровождаться активацией гена.

Обычно уровень метилирования генов сохраняется в процессе развития организма. Однако в зависимости от множества факторов, он может меняться при его взрослении. Подобные изменения могут являться, как нормальным ответом клетки на действующие на нее внешние стимулы, так и происходить в результате неправильной работы каких-либо клеточных систем.

Исследование принципов регуляции маркерных генов, анализ дифференциальной транскрипции генов в нормальных и опухолевых тканях человека, имеет как диагностическое, так и фундаментальное значение. Механизмы, вовлеченные в регуляцию экспрессии генов, вполне могут быть вовлечены в процессы опухолевой прогрессии, и на современном уровне очень важен комплексный подход к изучаемой проблеме, который позволит не только выявить общие принципы регуляции генов, но и предложить эффективные механизмы воздействия па структуры, способствующие развитию опухоли. По этой причине, экспрессируемые на поверхности клеток рецепторные белки, которые могут узнаваться цитотоксическими Т-лимфоцитами и/или моноклональными антителами, являются перспективным объектом для диагностики и для специфически направленной иммунотерапии и иммуномодуляции опухолевых заболеваний.

Рецептор CD161, кодируемый геном KLRB1, экспрессируется NK и NKT-клетками. Оба типа клеток обладают цитотоксической активностью и способны узнавать и уничтожать различные виды клеток, в том числе опухолевые, вирус-инфицированные клетки и чужеродные трансплантанты. Биологическая функция рецептора CD 161 человека до сих пор остается неясной, предполагается, что он может участвовать как в регуляции цитотоксических функций клеток, так и в регуляции продукции цитокинов. Механизмы регуляции экспрессии KLRB1 гена до сих пор не изучены.

Основным конечным продуктом гена PROM1 является трансмембранный гликопротеин CD 133. Он является специфическим маркером гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и, с недавнего времени, используется при скрининге ГСК. Отобранные по маркеру CD 133 клетки обладают большим пролиферативным потенциалом, нежели при ранее использованных маркерах ГСК. Известно, что метастазы, являющиеся во многом причиной смертности от рака, зачастую обладают фенотипом стволовых клеток, и, в частности, несут на своей поверхности характерные маркеры. Иногда такие клетки называют "раковыми стволовыми клетками", благодаря неограниченной способности к делению, устойчивости к апоптозу и лекарствам. Идентификация таких клеток очень важна при прогнозировании и лечении онкозаболеваний. С другой стороны, многими исследователями было показано, что при возникновении рака изменяется экспрессия некоторых генов, участвующих в эмбриональном развитии. Выявление и изучение таких генов дает возможность выяснить причины болезни, пути ее диагностики и лечения.

Ген PROM1 имеет сложную систему регуляции транскрипции. Известно, что транскрипция reuaPROMl инициируется как минимум с пяти альтернативных промоторов, однако, как правило, транскрипция идет с двух основных промоторов: Р1 и Р2. Поскольку все промоторы гена PROM1 входят в состав одного CpG-островка, предполагается, что одним из основных механизмов регуляции промоторов является метилирование.

По современным представлениям, многие молекулярные системы, участвующие в контроле развития организма, могут быть также вовлечены в процесс онкогенеза. Схожесть молекулярных характеристик стволовых и раковых клеток в определенной степени способствует подтверждению этой гипотезы. Тщательный анализ данных по изучению экспрессии генов в клеточных линиях, являющихся производными раковых клеток, параллельно с определением экспрессии в эмбриональных и раковых тканях может иметь большое значение, как для клинической практики, так и для фундаментальной науки. Нами был проведен анализ уровня транскрипции генов в эмбриональных, нормальных взрослых и раковых тканях, поскольку многими исследователями было показано, что при возникновении рака изменяется экспрессия некоторых генов, участвующих в эмбриональном развитии.

Известно, что при неоплазиях зачастую наблюдаются изменения в метилировании генов. На клеточных линиях, как модельном объекте, мы попытались определить существуют ли корреляции между уровнем метилирования потенциально регуляторных участков и экспрессией генов KLRB1 и PROM1.

Цели и задачи работы.

Целью данной работы было исследовать тканеспецифичность транскрипции генов KLRB1 и PROM1 и определить факторы, влияющие на транскрипцию исследуемых генов in vivo.

Были поставлены следующие экспериментальные задачи: определить тканеспецифичность транскрипции исследуемых генов на панели клеточных линий, в эмбриональных и опухолевых тканях человека, определить могут ли гены являться маркерными при раке пищевода и легкого человека. определить влияний метилирования, как одного из эпигенетических факторов регуляции уровня экспрессии генов, на транскрипцию генов KLRB1 и PROM1.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Плешкан, Виктор Викторович

ВЫВОДЫ:

1. Показано, что уровень транскрипции гена KLRB1 понижен в неопластических тканях легкого (68% пациентов) и пищевода (57% пациентов) по сравнению с соответствующими нормальными тканями. Следовательно, ген KLRB1 может использоваться как высокоинформативный маркер при диагностике указанных видов рака.

2. Установлено, что для транскрипции гена PROM1 важно метилирование промоторной области гена, в то время как метилирование других областей гена остается практически неизменным в разных типах клеток и не влияет на транскрипцию.

3. Исследованы эпигенетические изменения двух основных промоторов Р1 и Р2 гена PROM1. Показано, что метилирование промотора Р2 является тканеспецифичным и понижение степени метилирования необходимо для эффективной транскрипции гена. В то же время метилирование промотора Р1 конститутивно и, вероятно, не играет существенной роли в регуляции транскрипции гена.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Тканеспецифичность метилирования геномной ДНК является важным механизмом в регуляции экспрессии генов и играет важную роль в комплексе генетических и эпигенетических факторов, обеспечивающих нормальную жизнедеятельность клеток и всего организма в целом. Метилирование ДНК и модификации гистонов, определяющие компактизацию хроматина, рассматриваются как два основных механизма эпигенетической регуляции экспрессии генов. Накоплены различные свидетельства изменения уровней транскрипции генов и метилирования при различных патологиях и в различных тканях, однако до сих пор нет четкой картины механизмов лежащих в основе этих процессов. Очевидно, что для поддержания нормального функционирования клеток и систем органов важно взаимодействие всех клеточных систем. Исследование принципов регуляции маркерных генов, анализ тканеспецифичности транскрипции генов в нормальных и опухолевых тканях человека, имеет как диагностическое, так и фундаментальное значение. По последним представлениям, многие молекулярные системы, участвующие в контроле развития организма, могут быть также вовлечены в процесс онкогенеза. Подтверждению этой гипотезы в определенной степени способствует схожесть молекулярных характеристик стволовых и раковых клеток. На современном уровне очень важен комплексный подход к изучаемой проблеме, который позволит не только выявить общие принципы регуляции тканеспецифичной экспрессии генов, но и предложить эффективные механизмы воздействия на структуры, способствующие развитию опухоли.

ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.1 Определение тканеспецифичности транскрипции генов KLRB1 и PROM1.

Для определения тканеспецифичности транскрипции генов KLRB1 и PROM1 использовали метод ОТ-ПЦР. Используя статистические гексануклеотиды в качестве затравки и высокопроцессивную обратную транскриптазу PowerScript ("GibcoBRL", США), на матрицах РНК, выделенных из исследуемых тканей, синтезировали кДНК. На полученных смесях кДНК определяли уровень транскрипции генов KLRB1 и PROM1. Праймеры, специфичные для ПЦР амплификации данных генов, были подобраны так, чтобы продукты амплификации кДНК и геномной ДНК имели разную длину. В качестве контролей проводили ПЦР с праймерами к генам GAPDH и актина, имеющим примерно постоянный уровень экспрессии в различных тканях (т.н. "housekeeping genes"). Каждую ОТ-ПЦР проводили не менее трех раз, отбирая реакционную смесь, начиная с 21-ого цикла ПЦР через 3 цикла вплоть до 39-ого. Это позволило при анализе продуктов ПЦР с помощью агарозного электрофореза достаточно точно детектировать появление продуктов амплификации. Данные считали достоверными при р<0,05, где р - показатель статистической значимости (достоверности) данных.

2.1.1 Транскрипция в клеточных линиях.

Результаты ОТ-ПЦР на кДНК разных клеточных линий показали сильную межклеточную вариабельность уровня транскрипции генов KLRB1 и PROM1. Полученные данные приведены в таблице 1.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Плешкан, Виктор Викторович, Москва

1. Shames, D.S., J.D. Minna, and A.F. Gazdar, DNA methylation in health, disease, and cancer. Curr Mol Med, 2007. 7(1): p. 85-102.

2. Costello, J.F. and C. Plass, Methylation matters. J Med Genet, 2001. 38(5): p. 285-303.

3. Bestor, Т.Н., The DNA methyltransferases of mammals. Hum Mol Genet, 2000. 9(16): p. 2395-402.

4. Jaenisch, R. and A. Bird, Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat Genet, 2003. 33 Suppl: p. 245-54.

5. Li, E., Т.Н. Bestor, and R. Jaenisch, Targeted mutation of the DNA meihyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell, 1992. 69(6): p. 915-26.

6. Bird, A.P., CpG-rich islands and the function of DNA methylation. Nature, 1986. 321(6067): p. 209-13.

7. Gardiner-Garden, M. and M. Frommer, CpG islands in vertebrate genomes. J Mol Biol, 1987.196(2): p. 261-82.

8. Versteeg, R., et al., The human transcriptome map reveals extremes in gene density, intron length, GC content, and repeat pattern for domains of highly and weakly expressed genes. Genome Res, 2003. 13(9): p. 1998-2004.

9. Marahrens, Y., X-inactivation by chromosomal pairing events. Genes Dev, 1999.13(20): p. 2624-32.

10. Jain, P.K., Epigenetics: the role of methylation in the mechanism of action of tumor suppressor genes. Ann N Y Acad Sci, 2003. 983: p. 71-83.

11. Bestor, Т.Н., The host defence function of genomic methylation patterns. Novartis Found Symp, 1998. 214: p. 187-95; discussion 195-9, 228-32.

12. Iguchi-Ariga, S.M. and W. Schaffner, CpG methylation of the cAMP-responsive enhancer/promoter sequence TGACGTCA abolishes specific factor binding as well as transcriptional activation. Genes Dev, 1989. 3(5): p. 612-9.

13. Tate, P.H. and A.P. Bird, Effects of DNA methylation on DNA-binding proteins and gene expression. Curr Opin Genet Dev, 1993. 3(2): p. 226-31.

14. Ng, H.H., et al., MBD2 is a transcriptional repressor belonging to the MeCPl histone deacetylase complex. Nat Genet, 1999. 23(1): p. 58-61.

15. Nan, X., S. Cross, and A. Bird, Gene silencing by methyl-CpG-bindingproteins. Novartis Found Symp, 1998. 214: p. 6-16; discussion 16-21, 46-50.

16. Bird, A.P. and A.P. Wolffe, Methylation-induced repression—belts, braces, and chromatin. Cell, 1999. 99(5): p. 451-4.17.