Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональная характеристика гена эстеразы S из генома Drosophila virilis

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная характеристика гена эстеразы S из генома Drosophila virilis"

АКАДЕМИЯ НАУК АРМЯНСКОЙ ССР ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

На правах рукописи ХЕЧУМЯН Рубен Константинович

УДК 577.21

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНА ЭСТЕРАЗЫ S

v

ИЗ ГЕНОМА Drosophila viriIis

оз-оо.оз-молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических паук

Ереван - 1990

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта ЛИ СССР

Научные руководители:

доктор биологических наук, академик ГЕОРГИЕВ Г.П. кандидат биологических наук ШИКОПОП® Г.Н.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор НАЛБАНДШ P.M. кандидат биологических наук ВАШАКИДЗЕ Р.П,

Ведущая организация:

Шститут биологии развития АН СССР'

Защита состоится " /7 " ОЬМЛдрЛ 1990 г. в_

на заседании специализированного совета Д 006.15.01 при Институте биохимии АН Арм.ССР' 375044, Ереван-44, ул.П.Се-вака, 5/1 .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии АН Арм.ССР.

Автореферат разослан " 6 "еекП1£$р£ 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета

профессор А.А. Симонлн

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Индивидуальное развитие - это процесс, в ходе которого реализуется программа избирательной экспрессии генов при постоянном генофонде, в результате чего из одной оплодотворенной клетки формируется сложный организм. Важнейший аспект этого процесса - дифференцировка тканей, которая обеспечивает разнообразие и единство взрослого организма.' Даже в отдельной дифферещированной клетке определенная информация может найти выражение в какой-то период времени, оставаясь невыраженной в другой. Шражение ее может меняться при индукции самыми различными стимуляторами - гормонами, митогенами, катаболитами и т.д. Во всех случаях переключение генетической программы клетки вызывает сло:кные изменения в ее метаболизме. Тонко отлаженные регу-ляторные механизмы активируют и инактивируит соответствую?^ участки генома в соответствии с изменением потребностей клетки. Как регулируется активность генов? Существует ли какой-то общий механизм такой регуляции у раз1!ых организмов? Как устроены и функционируют эукариотичсссие гены (КогосЬк1п, 19В1Г Нейфах, Тимофеева, 1978; Рэфф, Кофмен, 1986)?

Актуальность поставленных задач очевидна, ибо их решение прольет свет на такие фундаментальные проблемы, как эмбриональное развитие, дифференцировка, злокачественный рост, действие гормонов, нарушение метаболизма, врожденные дефекты и многие другие.

Бурное развитие методов генной инженерии за последние годы значительно расширило круг подходов к исследованию этих проблем. Сейчас клонировано большое число индивидуальных эукариоигческих генов, интенсивно изучаются их структурные и функциональные особенности.- Такие исследования привели к открытию новых принципов регуляции экспрессии генов, общих черт строения генома эукариот, различных регуляторных элементов генов, что позволило подойти к выявлению факторов диффоренцировки и временной активности генов (Корочкин, 1901; Корочкин, 1983).

Исследование взаимодействия генов в процессе формирования какого-то признака удобнее проводить на модельной системе со строго оргапоспецифическим синтезом какого-либо фермента, появляющегося на определенной стадии развития. Такая модель позволяет детальнее проанализировать этапы формирования данного призна-

ка от активации структурного гена до появления соответствующего фермента в фенотипе и учесть возможное .влияние других генов на его фенотипическую экспрессию.

В настоящей работе в качестве экспериментальной модельной системы мц использовали тканеспецифический синтез изофермента эстеразы 3 у различит: видов ВгоаорЪИа группы у1гШа.

Цель работы. Целью данной работи является изучение структуры клонированного гена, его транскрипции, тканеспецифической экспрессии в ходе индивидуального развития и выяснение общих черт в строении генов эстераз родственных видов Вгозорина.

Научная новизна результатов исследований. Проведена количественная характеристика транскрипции гена органоспецифической эстеразы Б в различных органах и на разных стадиях развития Е.у1г111з, Показано, что семявыносящие луковицы являются основным местом синтеза фермента у зрелых самцов с.у1гШв. Воспользовавшись методом количествешюго з^-анализа, мы определили место инициации транскрипции гена Еа^-З, обнаружив при этом две мажорных точки инициации синтеза ГОК, разделенных пятью парами ну-клеотидов, а также целый ряд подобных точек минорного характера, располагающихся как выше, так и ниже основных.

В настоящей работе мы также определили первичную структуру 3- и 5-фшанкирующих участков генами при помощи компьютерного анализа сравнивали эту область с различными участками контроля транскрипции - энхансерами, длинными концевыми повторами вирусов и мобильных генетических элементов.

Оказалось, что область за 100-300 нуклеотидов перед точкой "инициации транскрипции заполнена областями гомологии с различными энхансерами, а также ретровирусоподобными последовательностями типа мдг (мобильных диспергированных генов, представляющих нестабильный компонент генома).

При поиске последовательностей, гомологичных гену ез^б у разных таксонов было обнаружено, что в геномах крысы, мыши и кролика присутствуют последовательности, гомологичные небольшой транскрибируемой области эстеразного гена в.Было показано также, что в геномах указанных таксонов эти последовательности многократно повторяются, а в геноме крысы - активно транскрибируются во всех исследованных органах.

Исследование структуры гена органоспецифической эстеразы Б л.у1г1118 в пределах группы у1г111в выявили высокий консерва-

тизм гена в пределах птих видов и его дивергенцию у далеких видов, что позволяет сделать вывод о возможности использования гена Еа1;-з дяя уточнения филогенетических отношений между близкими и отдаленными видами организмов.

Исследование полиморфизма локуса Ев1;-3 20-ти линий с.у1г1-Х1з выявило высокую генетическую стабильность локуса и прилежащей области как в отношении точечных замен, затрагивающих рест-рикциошше сайты, так и в отношении крупных изменений типа делений или инсерций. Лишь в одной линии обнаружена инсерция фрагмента ДЖ длиной 3,4 т.п.н. Природа обнаруженной инсерции в линии 140а пока не выяснена.

Практическая ценность. Полученные в данной работе материалы используются в преподавании в МГУ, а предложенные модификации методов могут быть рекомендованы з различных лабораториях страны в области генетики развития.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Международном симпозиуме "Организация и экспрессия ткалеспецифических генов" (Новосибирск, 1982), на УШ Всесоюзном симпозиуме "Структура и функция клеточного ядра" (Пущино, 1984), на ХУ1 конференции Федерации Европейских Биохимических Обществ (Москва, Г984), на Совместном симпозиуме СССР-ФРГ "Структура и функция генома" (Ленинград, 1905), на Совместном симпозиуме СССР-ГДР (Рига, 1985), на УНI Совместном симпозиуме СССР-ФРГ "Организация генома и регуляция активности генов" (Иркутск, 1989), на У1 Международном конгрессе по изоферментам (Тояма, Япония, 1989).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 научных работ.

Стр.ут{гура и объем работы. Диссертация состоит из общей характеристики работы (введение), обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуздения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста и включает 24 рисунка. Библиографический указатель содержит 259 ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалы. а) Бактериальные штаммы. В качестве реципиентных клеток использовали штаммы E.coli HBI0I (Boyer, Roulland-Dussoix, 1969) и K802 (Wood, 1966).

б) Препараты ДЖ и РНК. В качестве вектора, для клонирования использовали плазмвды pBR322 (Bolivar et al., 1977) И pUC19 (Vieira, Messing, 1962). РНК выделяли из разных органов Droso-phiia virilia, предоставленных проф. Корочкшым JI.И. и докт. би-ол.наук Кузиным Б.А. (Институт биологии развития АН СССР).

в) Ферменты. Рестриктазы EcoRl, Kpnl, Bgll, Bgill, ЗаиЭА, AluI, BamHI, PvuII, PatI, SalGI, Hpall, HindIII выделяли ПО методу Бойера с некоторыми модификациями (Green et al., 1978). Рестриктаза cial била предоставлена канд. биол. наук Речшским В. (Институт молекулярной биологии АН СССР). Нуклеаза з1 и бактериальная щелочная фосфатаза - производства фирмы "Sigma*1 (США).

г) Коллекция мух, использованных в работе, была предоставлена проф. Корочкиным Л.И., докт. биол. наук Митрофановым В.Г. и канд. биол. наук Бакаевой T.F. (Институт биологии развития АН СССР).

Методы. Плазмиднуга Д1К выделяли по стандартной методике с использованием щелочной экстракции (Marko et al., 1982) с небольшими модификациями. Так, в некоторых случаях, для получения препаративных количеств ДМ, плазмццу очищали ультрацентрифугированием в равновесном градиенте caci с бромистым этидием. Для анализа большого числа клонов использовали метод кипячения (Holmeo, Quigley, 1981).

Геномную ДОК из дрозофилы выделяли модифицированным методом Стаффорда и Блина (Biin, Stafford, 1976), сводящимся к гомогенизации мух в жидком азоте непосредственно в лизирующем буфере (50 мМ NaCl, 0,4 M ЭДГА, 0,1 M трио-HCl» pH 7,6) с добавлением ДЗН до конечной концентрации и 200 мкг/мл протеиназы К, инкубации при 50°С в течение 2 часов, 2-3 кратной экстракции смесью фенол-хлороформ и продолжительному диализу выделенного препарата

дак.

FHK выделяли горячим фенолышм методом, с использованием роданистого гуанидина (chirgvvin et al., 1979).

Поли(А)+РНК получали, используя метод аффинной хроматографии

на олиго (дТ)-целдюлозе (Edmonds et al., 1971; Aviv, Leder, 1972V

Для приготовления радиоактивных зондов для з^анализа транс-криптов фрагменты ДЖ после обработки рестрикционной эндонукле-азой, введения метки и обработки второй рестрикционной эндонук-леазой разделяли электрофорезом в агарозном или полиакркламид- • ном геле. После разделения в полиакриламидном геле материал элю-ировали окстракцпей в течение ночи по стандартной методике (Ма-niutia et al., 1982), а после разделения в агарозном геле меченый материал электрофоретически переносили на ДЕАЕ-бумагу и после отмывки элюировали раствором: 2 MNaCl , 50 мМ трис»НС1, pH 7,5, I мМ ЭДГА. Элюированный материал смешивали с РНК и непосредственно использовали для э^анализа.

Дня анализа транскриптов при помощи нуклеазы s1 (weaver, Weiaamann, 1979) радиоактивные зонды, меченные по 5-концу [^_32р]дТф (Boseley et al., 1980), выделяли элюцией с ДЕАЕ-бумаги после разделения в агарозном геле. Меченые фрагменты ДИК смешивали с препаратами РНК, осавдали этанолом и после растворения в растворе, содержащем 0,4 М HaCi, 0,1 М PIPES, pH 6,4, 5 мМ ЭДГА, 80# формамида и денатурации, отжигали 8-14 часов при 48-49°С. Гибриды РНК-ДНК обрабатывали нуклеазой s1 в растворе, содержащем 0,2 М NaCi, 0,1 М СЯ3С00Но, pH 4,5, I мМ ZnS04, при 18°С в течение I часа. Продукты гидролиза обрабатывали NaOH для разрушения остатков ИМ, переосалдали и после растворения в минимальном объеме 90/5 формамида, содержащего 2 мМ ЭДТА, и по 0,4% красителей ксиленциалола и бромфенолового синего, и инкубации при 95°С в течение 2 мин. разделяли в 5Й-ом полиакриламидном геле_с расширением.

Первичную структуру ДЖ определяли методом Максама-Гилберта в стандартном варианте (Maxnm, Gilbert, 1977) и в его твердофазной модификации (Chuvpilo, Kravchenko,1985)..

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В данной работе речь пойдет о характеристике клонированного . гена эстеразы s D.viriiia. Этот ген представляет собой исключительно перспективную модель для изучения механизмов активации гонов в развитии, т.о. обладает рядом характерных особенностей, суть которых сводится к следующему:

I) ген Eot-з являет собой пример ткане-, время- и полепеци-

- б -

фического гена (Korochkin, 1981» Korochkin, 1980);

2) фенотипическая экспрессия этого гена находится под контролем системы генов-модификаторов, локализованных в Х-хромосоме и в аутосомах, а также под гормональным контролем (Korochkin et el., 1978; Korochkin, 1981; Korochkin, 1980; Корочкин, 1983; Ko-рочкин, 1977);

3) ген вовлечен в модуляцию поведения дрозофилы, в частности ее полового поведения (Richmond et al., 1980; Gilbert et al., 1982; Mane et al., 1983; Scott et al., 1984).

Перечисленные свойства деламт регулирующую систему гена эс-теразы 3 крайне привлекательной для анализа регуляции активности генов у эукариот, поскольку открывают возможность для:

1) Бвделения и характерно гики транскрипциошщх факторов, определяющих активность гена в различных тканях организма и на разных стадиях развития;

2) выделения и характеристики регуляторных элементов гена при помощи in vitro мутагенеза;

3) трансформации целого организма геном эстеразы s с различными регуляторными индуцируемыми элементами в целях модуляции поведения дрозофилы.

Ген Est-S выделен и клонирован в составе фрагмента ДОС pVE9 ДЛИНОЙ В 15 Т.п.н. (Yenikolopov et al., 1983).

I. Физическая карта рУЕ9

Нами била построена физическая карта клона- с использованием большого числа рестриктаз (рис.1). При построении карты мы использовали следующие методы картирования: а)частично.е расщепление немеченой ДШ (Danna et al., 1973)! б)час£ичное расщепление меченной по определенному кощу Д1К (Smith, Blrnatiel, 1976)1 в)множественное энзиматическое расщепление (Danna et al., 1973)»

По физической карте клона можно было предположить, что ген, в основном, не содержит совершенных внутренних повторов. Это предположение было подтверждено нами в опытах по гибридизации отдельных фрагментов с гидролизатами ДЖ, перенесенными на нит-роцеллюлозшй фильтр. Эксперименты по гибридизации меченой Д1К клона и его субфрагментов с геномной Дй показывают, что, во-первых, полосы на' геномном блоте совпадают с фрагментами в клонированном куске, следовательно, ген не претерпел каких-либо

111 11

I 1- *ио

У

/

I

■■ ' / Г1 .'V I

т4

•г

р8*!22

Рис.1. Физическая карта плаз мнды рУБ9, содержащей ген эстеразы п.уЛ-г111а'(в увеличенном виде показана физическая карта субклона рШ?1) >

р»Е9

а

1 тпи

С»«Я»®9

Рис.2. Блот-гибридизация меченной клона рУБЭ» содержащей ген Бst-3 с геномной ДЖ Б.\-1г111я, гидролизованной различными рестрикционнкми эндо-нуклеазами. В кадцута лу!пгу нанесено по 2 мкг тотальной ДП{ Б.у1г111з. I - Н1п<Ш1; 2 - Рэ«; 3 - Бшп111| 4 - БаЮ!; 5 - ЕсоШ.

I

структурных перестроен при клонировании и правильно представляет истинную ситуацию в геноме. Во-вторых, полосы ьыглядят уникальными» т.е. внутри клона рУЕЭ нет повторов (рис.2).

2. Транскрипционная карта гена Ез-Ь-З

Следующей нашей задачей было построение транскрипционной карты эстеразного гена. Для этого мы воспользовались целым рядом методов, включая обратную транскрипцию ШК, метод по анализу

транскриптов с помощью нуклеазы S1 (s^-анализ) и другие.

Результата экспериментов, с использованием обратной транскрипции ГОК, показали, во-первых, что в нашем клоне очень удачно располагается гибридизующаяся зона - почти посередине клона, что дает возможность исследовать не только кодирующую, но и регуля-торные зош. Во-вторых, оказалось, что зона гибридизации намного превышает длину мРНК, равную 1,9 т.п.н., которую мы определили путем гибридизации меченой ДШ клона с фракционированной и иммобилизованной на фильтре РНК. Мы предположили, что это различие является следствием сплайсинга или присутствия в этой зоне и других генов. Последующие наши эксперименты подтвердили это предположение.

Мы провели более точное транскрипционное картирование, используя метод S^анализа, и обнаружили несколько экзонов. При этом выяснилось, что суммарная длина экзонов заметно превышает размер зрелой мРПК гена эстеразы з, что заставляет нас предположить существование дифференциального сплайсинга при транскрипции эстеразного гена или локализации других транскрипционных единиц рядом с геном Eat-S.

Для подробной характеристики инициации транскрипции в разных органах D.virilis мы использовали чрезвычайно чувствительный метод s^-анализа транскриптов гена с использованием внсокоразре-шающего электрофореза в секвенирующем геле.

В большинстве описанных ниже экспериментов в качестве зонда был использован фрагмент ДЖ длиной 400 п.н. из субклона pRPi (рисЛ), покрывающий около 200 нуклеотидов кодирующей РНК зоны гена, а также зону перед стартом транскрипции длиной около 300 п.н. Фрагмент был получен с помощью обработки рестрикционными эндонуклеазами EcoRI и cial и помечен с помощью поли-

нуклеотидкиназы фага Т4 по 5-концу, образованному рестриктазой Clal. После денатурации и гибридизации радиоактивного зонда с • РНК в условиях гибридизации, сводящих к минимуму образование гиб-рвдов ДШ-РНК, гибриды обрабатывали нуклеазой s1 при 18°С. Предварительно были подобраны условия эксперимента - температура гибридизации и ферментативного гидролиза, а также концентрация нуклеазы s1.

Результаты экспериментов по определению числа транскриптов в различных органах дрозофилы и по локализации нуклеотидов, с которых может начинаться синтез мРНК, приведены на рис.3.

Мы определили с помощью этого метода место инициации транскрипции гена Est-s, обнаружив при этом две мажорных точки инициации синтеза РНК, разделенных пятью парами нуклеотидов, расположенных на расстоянии 187 и 192 п.н. от участка расщепления рест-риктазой cio.1, а также целый ряд подоб1щх точек минорного характера, располагающихся как выше, так и ниже основных. Точки, лежащие ниже основных, могут отражать не только истинные места старта транскрипции, но и продукты внутриклеточного созревания РНК и (или) деградации мРНК в процессе жизнедеятельности клетки. Аутентичность мажорных и большинства минорных полос истинным 5-концам меточных молекул мРНК гена эстеразы подтверждается результатами транс!ф:шции ДНК клона in vitro в бесклеточном экстракте из клеток Hela, в которых транскрипция идет с тех же точек. При этом важно отметить, что на соответствующем расстоянии от мажорных точек инициации транскрипции располагаются последовательности ДНК, полностью подходящие под усредненную последовательность ТАТЛ-бокса.

В опыте, отраженном на рис.3, для калдоíi точтси брали строго одинаковые количества ГОК каждого органа (10 мкг тотальной клеточной РНК), но рядом с препаратом РНК, "выделенной из семявыно-сящеП луковицы, нанесены продукты гидролиза гибридов радиоактивного зонда с понижающимися количествами того же препарата ГОК (3, I, 0,3 и 0,1 мкг РНК), что позволило применить денситометршо для количественной оценки эффективности транскрипции гена в раз-mix органах и с различных точек, отображенную в количестве соответствующих ГОК. Оказалось, что разница меэду транскрипцией гена в сеиявшюсящей луковице и в других органах может достигать 2001000-кратной величины (для мальпигиевих сосудов, кишечника, слюнных желез л жировых тел). Для таких органов, как мозг, яичники, имагинальные диски и др., сигналы гибридизации не наблюдались, т.е. эта разница более чем 3000-4000-кратна. При этом обнаруживается, что■в тех органах, в которых наблюдается слабая транскрипция гона, используются точки, соответствующие не мажорным точкам инициации транскрипции гена эстеразы в семявыносящих луковицах, а минорным, расположенным как вышэ, так и ниже основных. Так в мальпигиевих сосудах и слюнных железах РНК начинается с позиций -92, +32, +39 и +81 (по отношению к первому мажорному участку), в кишечнике - +81, в жировых телах - -92. Для прямого сравнения рядом с РНК бульбусов приведена точка, где использова-

/23 ч 5 6109 /0 н 12П1415и Рис.3. Картирование точек

________инициации транскрипции гена

\ ' эстеразы в при помощи нукле-235 ~~ азы 31 в различных органах • С.у1г111в. 1-5 - РНК семя-выносящей луковицы зрелого самца в.у±г111а. 1-0,1 мкг тотальной РНК; 2 - 0,3 мкг; 3-1 мкг; 4-3 мкг; 5-10 мкг; 6 - тело зрелого самца без семявыносящей луковицы; 7 - мальпигиевы сосуды;- 8 - кишечник; 9 -слюнные железы; 10 - жиро__ вое тело; II - имагиналь-

А ше диски; 12 - голова самки; 13 - голова самца; 14 -яичники; 15 - гениталии самки без яичников; 16 - контроль. В опытах, показанных на дорожках 6-16, использовали по 10 мкг тотальной РНК. Слева указаны размеры маркерных фрагментов в нуклеотидах.

Рис.4. Анализ транскрип-с ции гена эстеразы э в он-

.. тогенезе 1).у1г111а. 1-ые-

1

ченые маркерные фрагменты ДП< СДНК рВЮ22/Нра1) 2-гКонтрольная РНК; 3 -» о к ш • ш Р® эмбрионов; 4- РНК ли-

' « | ~ ~ " чинок; 5- РНК куколок;

* * • 6-25- РНК имаго (возраст

в днях и пол): 6- 1,^; 7-, 1,о*; 8- 2,^; 9- 2,о»; 10. . 3,?; И- 12- 4,?; г ; 13 - 4,о-; 14- 5,9; 155,0-.; 16- 7,?*, 17- 7,о-; 18- 10,9; 19- 10,о~; 20- 12,?; 21- 12,о*; 22- 16,9; 23- 16, 34- ЗО,^; 25- 20,0-. (По 10 мкг тотальной РНК).

ли РНК из половозрелых самцов, у которых бульбус был удален -видно, что количество молекул мШК эстеразы в бульбусе в 250-300 раз выше, чем во всей остальной массе клеток организма. Таким образом мы можем резюмировать, что ген эстеразы 5 отличается' крайней тканеспецифичностью транскрипции - разница в эффективности меящу тканями может достигать 4000-кратной величины.

• 3. Время- и полспецифичность транскрипции гена ва1;-5

Проявление активности эстеразы о.уз-гШз в процессе онтогенеза хорошо известно и сводится к полному отсутствию ее на стадиях эмбриона, личшюк всех возрастов и куколок (когооИк1п et а1., 1978); Изофермент отсутствует у молодых самцов и лишь на 38 дни (в зависимости от линии) он проявляется у самцов, причем основным местом его локализации является семявыносящая луковица.

Последующие наши эксперименты подтвердили эту точку зрения. Мы применили описанный выше подход для количественной характеристики синтеза мРНК эстеразы Б в развитии р.уХгШа Используя тот же радиоактивный зонд (рис.1), мы провели серию гибрвдизаций с тотальной РНК, выделенной из эмбрионов, личинок, куколок, самок и самцов разных возрастов. Результаты экспериментов, приведенные на рис.4, показывают, что транскрипция гена имеет ярко выраженный время- и ползависимый характер. Ни эмбрионы, ни лшпнки, ни куколки, ни молодые самки и самцы не обнаруживают какой-либо транскрипционной активности в пределах чувствительности предложенного метода. Только на 2-3-ий день после вылета в клетках самцов начинается транскрипция гена; она резко возрастает на 3-7-ой дни и к 9-10-ому дню выходит на плато, слегка понижаясь к 16-20-ому дню. У самок слабая транскрипция обнаруживается лишь на 4-ый день, немного нарастает к 9-ому дню, а затем несколько ; понижается. В целом ее эффективность намного шг*е таковой у самцов и у зрелых мух (12-тидневные самки и самцы) и разница между полами в количестве транскриптов гена эстеразы достигает 50-70-кратной величины. При этом наибольшая часть молекул РНК начинается с позиций, уже отмеченных при рассмотрении транскрипции в семявыносящих луковицах,, и минорные позиции также" не отличаются от таковых в семявыносящих луковицах.

Таким образом, синтез «РНК эстеразы э в ходе развития практически совпадает с накоплением фермента и говорит о транскрип-

ции как об основном уровне регуляции экспрессии гена оргоноспе-цифической остсрази s в онтогенезе D.viriiia.

4. Первичная структура области инициации транскрипции гена Eat-S

Для характернотики области инициации транскрипции ш определили первичную структуру участка, покрывающего область перед и после (по ходу транскрипции) мажорных точек инициации транскрипции. Для секвенирования был выбран субклон pRFl (рисЛ). Последовательность нуклеотидов определяли методом Ыаксама-Гил-берта в стандартном варианте и в его твердофазной модификации, так, что каждая пара нуклеотидов прочитывалась несколько раз по обеим цепям с различных точек. Последовательность нуклеотидов приведена на рис.5.

. Характерные особенности последовательности сводятся к следующему:

1) эа 28-32 нуклеотида от,места старта транскрипции располагается последовательность, сходная с ТАТА-боксами, характерными для подавляющего большинства оукариотических генов, транскрибируемых FHK-полимеразой II;

2) ген не несет в положении -70 - -'80 последовательности, сходной с СААТ-боксом (Breuthnuch, Chomton, 19Q1), характер-'шм для многих, хотя и не всех, эукариотических генов;

3) строение участков инициации транскрипции, выявленное по результатам а.,-анализа, совпадает с усредненными (весьма вырожденными) последовательностями участков инициации синтеза и кэпи-рования мРНК;

4) в секвенированном фрагменте но встречаются усредненные последовательности границ соединений экзон/интрон и интрон/экзон (Mount, 1982), что совпадает с данными транскрипционного картирования гена при помощи s^анализа и элонгации праймера;

5) ген несет относительно короткую (около 35 нуклеотидов) 5-детранслируемую часть мРНК. Область, непосредственно примыкающая к первому инициирующему кодону auq (caccaug), соответствует усредненной последовательности области инициации трансляции генов животных (caucaug) (Kozak, 1984 й уточненной последовательности ДЛЯ генов дрозофилы ((ca)aa(ac)aug) (Cavener, 1ЭВ7)I;

6) при анализе последовательности секвенированного участка

- 13 -

" i J' л, 1 И цид>»ц *U u ui.At fi л: »A: : 11 v. .tr.-iт *

лм1,( 1.1,АДС А Л1 1 HI.AAA IW.f.CAATCA TYfAJ UC. ACU LAfm 1

---------

< 1**1.1 1Д.ГС АЛ( I 1 АА> U ( САААПС TC TíifiCCTC 1 AI АЛААГАЛ ПС l

l.UuAUCTT АЛА 1 П1САА Alt.LACTl TA AITGCCAA f ь ClAACCC'j» С J

AU'CAHUU AUAATCLAA TACCICTCtr tlTtlL'fCAí. C1CAAl\UA

1 ПАГ.ДГКД AULAUAIA AAAAlji.CAliT TCliCTCTCIi" <и1Гп(лТГ

/Juil AAl.TT К.АЫ íl. (LILI OCAL A UAH'.At 1СЛ А<| U ll.l h. 1 Me ( 1 ПгГ.1п 11 rl I »1

1 I I,l|| Ut.l jl.l l< 11,11 | i'i..llrAl»Lt». l«iity»tc. ,1 1 j<;< ACl A t'UMiMi H'AA( U KA MUHIlii 1 serlhrt euScr ч-i.n.W..

< t Jl <.l I.I.AC; J II,«« АЛА 11, lfbV«K.U 1 . i.l'ioA.m.I »1.ААИСЛ i; > t.luiCuAr (.liLAlT.« (.А С lAK'.l.M lil Г U,Arg*»p АЧП1.1Ц!..

MIM А4Л IA ндиимк > i 1 Г r S«l 1 Г Г 1.1 и"ic lile u iMu ic. •го 1 x-i A 1 JC fcACl'lU AM i слили К. S.v и l'roi'iol Jl' Л<|1 l'l • и

ll.l 1 II.I.AAC AAl'( II l,T( 1 4 r*l ■ul.iuClu l'ruAr«l'ro tAIAl Г CAA t ГГ 1 hrl.ln

Рис.5. Первичная структура области инициации транскрипции гена зсте-разы 3 Х).у1г111в. Приведена часть аминокислотной последовательности. .Мажорный участок инициации транскрипции взят в рамку. Подчеркнуты участки гомологии с транскрипционноактив-ными элементами (направление стрелки соответствует- цепи гена) - аютвц-боксом (сплошная линия), длинными концевыми повторили ретровирусов (волнистая линия), длинными концевыми повторами мобильных элементов дрозофилы (штриховая линия).

м

ор

Рис.6. Кяот-гибридизация меченной ° Р-ДЖ рУЕЭ с тотальной РНК, выделенной из разных органов крысы. I - НИ б.у1г111а (10 дней, о-» ); 2 - мозг без гипоталамуса; 3 - гипоталамус; 4 - гениталии самцов; 5 - гениталии самок; б - предсердие; 7 - сердце; 8 - печень; 9 - почки. На дорожку брали по 100 мкг РНК крысы и 10 мкг РНК в.у1г111в. Отмывку фильтра проводили при 65°С в растворе, содержащем 0,IX ДОН - 0,5»330.

были выявлены значимые гомологии последовательностей нуклеотидов обеих цепей участка с энхансерами онкогенных вирусов, длинными концевыми повторами ретровирусов, длинными концевыми повторами мобилышх элементов дрозофилы, регуляторными участками структурных генов эукариот.

5. Эволюционная консервативность гена Eet-s

Мы провели рестрикционный анализ областей генома некоторых представителей таксонов (крысы, мыши и кролика) с целью обнаружения последовательности, комплементарной-ДНК pVE9, содержащей' ген Est-S. Результаты наших экспериментов показали, что в геноме указанных представителей таксонов присутствуют последовательности ДНК, способные к гибридизации с ДШ гона Est-s D.viriiio.

Возникает вопрос - отражает ли данная гибридизация наличие эстераза-подобного гена, транскрибирующегося в геномах крысы, мыши и кролика, или она происходит за счет простых гомополимер-ных последовательностей типа poly [(dG-dT)-(dc-dA)] , poly UdG-dA) • (dG-dT)], poly I(dA)'(<3T)] (Vashakidze et al., 1988) , присутствующих практически во всех исследуемых геномах эукариот?

Последующие наши исследования были посвящены выяснению этого вопроса. В аналогичных экспериментах мы использовали в качестве зонда меченные ник-трансляцией геномные ДНК других представителей таксонов, а именно: курицы, тутового шелкопряда и человека. Никаких сигналов гибридизации обнаружить не удалось.

Далее мы метили уже непосредственно вышеуказанные простые гомополимерные последовательности и опять гибридизовали с теми же гидролизатами ДНК pVE9, перенесенными на нитроцеллюлозный фильтр,и опять сигналы гибридизации не обнаруживались. И наконец, методом блот-анализа мы исследовали транскрипцию эстераза-подобной последовательности в следующих органах кргсы: мозг без гипоталамуса, гипоталамус, печень, почки, сердце, предсердие, гениталии самок и самцов. Результаты данного эксперимента, приведенные на рис.6, показывают, что:

1) последовательность ДНК, подобная гену Eat-s, транскрибируется во всех исследованных органах крысы, т.е. наблюдается полное отсутствие тканеспецифичности гена;

2) относительное содержание молекул мН1К в различных тканях г-эсьма вариабельно;

3) РНК-ДЖ гетеродуплексы достаточно специфичны и сохраняют стабильность при низкой ионной силе.

Наши последующие эксперименты были посвящены рестрикционно-му анализу генов различных представителей рода БговорЫДа на наличие и структуру эстеразного гена. С этой целью мы выделяли геномную ДНК из ядер клеток имаго, обрабатывали ее разными рест-ршсционными эндонуклеазами, переносили на нитроцеллюлозный фильтр после электрофореза в агарозном геле и гибридизовали с шга-транслированной ДНК рУЕЭ.

Результаты наших экспериментов демонетр1груют различную эффективность гибридизации зонда с ДНК генома различных видов в зависимости'от их филогенетического родства и, кроме того, позволяют сделать заключение о высокой консервативности последовательностей, соответствующих гену эстеразы, в пределах группы у1г111а. Это следует из сравнения длины рестрикционных фрагментов Д1К разных видов, многие из которых тлеют одинаковую подвижность. В то же время у отдаленных видов сходных полос не наблюдается ни в одном случае.

Очевидно, что обнаруженное сходство подвшшостей рестрикционных фрагментов ДНК близкородственных видов, отражающее распределение участков узнавания для различных рестрикционных эндонук-леаз, говорит об очень высокой консервативности гена в пределах этих видов и о резкой дивергенции у далеких видов.

Следующий вопрос - транскрипция эстеразного гена у самок и самцов дрозофил, относящихся к группе тЫИз. С этой целью мы выделяли тотальную РНК из зрелых (10-тидневных) мух разного пола, фракционировали ее в агароза-формальдегидном геле, переносили на нитроцеллюлозный фильтр и гибридозовали с меченной ник-трансляцией ДШ ргеэ. Результаты этого эксперимента, представленные на рис.7, показывают, что: I Транскрипция гена Еа^э имеет ярко выраженный ползависишй характер - у всех самцов транс-крипциоштая активность выражена значительно сильнее, чем у самок; 2 )гем не менее, соотношение транскриптов самец/самка очень разное.

На авторадиограмме видно наличие только одного, очень сходного у всех видов, транскрипта длиной 1900 п.н. (исключение составляет в.1ас!ио1а» У которой'появляется дополнительная полоса как у самок, так и у самцов). Однако, вероятно, использоваьие ме-

Ф f • t

• • • •

O O

Рис.7. Блот-гибридизация мечешой Р-ДЖ pVE9 с тотальной FHK 10-ти дневных самок и самцов группы virilis. I - americana, 9 ; 2 - americana, о- ; 3 - novamexicana, ^ "> 4 - no-vamexioana, О-» { 5 - texana, $ J 6 - texana, 0-» ; 7 - virilis, 5; 8 - virilis, O- ; 9 - kanekol, y ; 10 - kanekoi, ; II -ezoana, ^ ; 12 - ezoana, ; 13 - littoralis, 9 ; 14 - litto-ralis, 15 - borealis, ^ ; 16 - borealis, O-» ; IV — flavo-montana, q ! 18 - f lavomontona, o-» ; 19 — lacicibla, ^ » 20 — lacicola, o-» ; 21 - montana, <¡>; 22 - montana, O» . Отмывку фильтра проводили при 65°С в растворе^ содержащем 0,5» ssc -0,1* ДОН.

I !

О Е

2 * о. ю

В ■в

5 Е

М X я «»

7,07 -1,Ы -IJI --

Q

ев

_ * Рис.8. Сравнив г> телышй рестрик-

ционшй анализ gg"»» локуса Est-з ли» ний 140а и L9

D.virilis. Слева указаны размеры маркерных фрагментов в Т.П.Н.

! пи i

19

вить дополнительные полосы, наличие которых ш обнаружили при. исследовании транскрипции эстеразного гена у D.virilia в предыдущих экспериментах, а не обнаружили в данном опыте.

Можно заключить, что во всех исследованных видах группы virilia именно кодирующая область гена эстеразы S высококонсервативна, а интроны и прилежащие области гена весьма дивергентны.

б. Исследование полиморфизма области локуса Eat-S Droaophila virilia

Последние наши эксперш.юнты связаны с изучением полиморфиз-' ма локуса Eat-3 ü.virilia, в надежде обнаружить изменения в распределении отдельных рестрикцийнных сайтов или более крупные перестройки генома.

В поисках полиморфизма рестрикционных сайтов мы проверили 20 линий D.virilia из различнее ареалов земного шара и обнаружили устойчивость соответствующих областей к мутациям типа инсер-ций и одиночных нуклеотидшх замен. Такая устойчивость на молекулярном уровне может служить причиной стабильности хромосомной организации D.virilia.

ДНК, выделенную из ядер клеток имаго, расщепляли рестрикти-рующими эндонуклеазами, фракционировали по размерам в агарозном геле, переносили на нитроцеллюлозный фильтр и гибридизовали с меченой ДШ плазмиды pVE9. Таким способом мы проанализировали следующие линии D. virilia: EI,L9 , I, 2, 9, 12, 13, 25, 40, 41, 102, 103, 104, 117, I40a, 147, 160, 167, 180, 323. Использовали рестриктазы EcoRI, Hindin, Patl , Bamiii, Said, узнающие участки ДЖ длиной 6 п.н. и вносящие соответственно 8, 6, 3 и 5 разрывов в изучаемую область ( для некоторых линий применяли дополнительно и другие рестриктазы). За исключением одной линии (140а) мы не смогли обнаружить каких-либо изменений в расположении участков узнавания рестриктаз. Данные анализа линии 140а и контрольной линии L9 приведены на рис.8.

Вцдно, что обработка ДИ линии 140а рестриктазами salGl и Pvuii приводит к появлению новых фрагментов, а суммарная длина фрагментов по всем использованным рестриктазам превышает суммарную длину в контрольной линии на 3,4 т.п.н. Изменение подвижнос-тей фрагментов Hin-A, Вшп-В и Sal-D, но не других, позволило локализовать инссрцию в небольшо(л (550 п.н.) фрагменте Sal-D.

Шсерция фрагмента Д1К длиной 3,4 т.п.н., обнаружешая только в одной линии (140а )из 20 исследованных линий означает очень низкую частоту инсерций в расчете на одну тысячу пар оснований - 0,002, по сравнению с таковой для гена алкогольдегидро-Геназы (D.melanogaster- 0,017 (Aquadro et al., 1986), гена теплового шока 87А D.melanogaster - 0,009 (Leigt Brown, 1983), гена white D.melanogaster - 0,008 (Langley, Aquadro, 1987).

Такш образом, нами показано, что локус Est-s и область генома вокруг него крайне стабильны как в отношении точечных замен, так и в отношении крупных изменений типа делеций или инсерций. Что же касается природы обнаруженной инсерции, то наиболее вероятными причинами могут быть шсерция мобильного генетического элемента или неравный кроссинговер при гомологичной рекомбинации.

Проводящееся сейчас клонирование соответствующего участка из линии 140а позволит определить природу изменения в эстеразном локусе D.viriiis.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Приведена количественная характеристика транскрипции гена органоспецифической эстеразы s в различных органах и на разных стадиях развития Dvirilio . Показано, что семявыпосящие луковицы являются основным местом синтеза фермента у зрелых самцов D.vi-rillo. Эти данные согласуются с результатами по локализации ос-теразы s D.viriiis в семявыносящих луковщах и близкого к ней .< фермента эстеразы 6 D.meionocaster в семявыносящих протоках. Эти ферменты, по видимому, находятся в многочисленшх секреторных гранулах,, содержащихся в ¡эпителиальных клетках, выстилающих се-мявыносящие луковицы (в случае D.viriiis) и семявьпюсящие протоки (в случае D.melanogaster) и резко уменьшающихся в числе после повторных спариваний, что отражает перенос большого числа молекул фермента в половые пути самки. Эти ранние наблюдения указывают на клетки, накапливающие эстеразу, как на место их синтеза; результаты экспериментов по количественной оценке числа молекул мРНК гена эстеразы, приведетгых на рис.3, доказывают, что сомя-выносящие луковицы являются основным местом синтеза соответствующей РНК и транскрипционный уровень является основным уровнем регуляции тканоспецифической экспрессии локуса Est-S.

По-видимому, такое резкое включение тканеспецифической экс-

прессии является ответом на некнй внутренний сигнал и мало зависит от окружения, в котором развиваются клетки семявыносящей луковицы, т.к. ранее было показано, что активность Ез1;-6 и еэ1;-з в гениталиях вылетевших самцов в.теХапоцаагег и в.у3.гИхз, соответственно, появляются, даже когда эти органы пересажены в абдомен самок. Авторами было предположено, что синтез Еа1;-6 и Еаг-Б не зависит от внешних сотналов, но является частью плана развития антериорной области семявыносящих протоков и прилежаших тканей. Эти дашше могут указывать на возможность и необходимость поиска факторов, активирующих транскрипцию, непосредственно в клетках семявыносящих луковиц гл1гШз.

Интригующим является обнаруженный факт использования различных точек инициации транскрипции в различных органах, совпадающих с минорными точками инициации транскрипции в семявыносящей луковице. Эти точки могут располагаться ниже мажорных,как в мальпигиевых сосудах, кишечнике и слюнных железах, или выше, как в жировых телах, мальпигиевых сосудах и слюнных желез. Такое различие в использовании набора альтернативных точек инициации транскрипции связано, по-видимому, с различиями з точной локализации транскрипционных факторов относительно промотора гена эс-' теразы а.

Известно, что ферментативная активность эстеразы 5 0.у±г111а не выявляется у эмбрионов, личинок, куколок и молодых самцов, и фермент обнаруживается в семявыносящих луковицах самцов в зависимости от линии лишь' на 3-8-ой день после вылета имаго. У девственных самок фермент, практически, не обнаруживается, но переносится в половые пути самки при копуляции. При этом межвозрастные и межлинейнне различия в ферментативной активности эстеразы объясняются количеством молекул белка, присутствующего в тканях мух, но не модификациями, влияющими на его каталитическую активность» Из данных рис.4 следует, что изменение транскрипционной активности в ходе развития с.у1гИ1в, практически совпадает с изменениями й содержании изозима эстеразы э в организме. Отсутствие и транскрипционной и ферментативной активностей наблюдается на всех стадиях до вылета имаго и ген начинает транскрибироваться лишь на 2-3-ий день после вылета. Активность транскрипции, так же, как и активность фермента, резко нарастает за последующе дни (3-7-ой )и к 9-10-ому дню выходит на плато, далее несколько пони-

жаясь. Интересно, что сходные изменения наблюдаются и в половой активности самцов D.virilio, что дает дополнительные доказательства важной физиологической роли эстеразы s в половом поведении и фертильности мух. В то же время заметим, что медленное нарастание активности говорит против облигатной роли эстеразы в процессах оплодотворения, т.к. известно, что самцы 15-20-тичасового возраста могут быть фертильны. Это может либо отражать различия в половом поведении мух, либо, что более вероятно, указывать на возможную адаптивную роль обнаруженного в многочисленных исследованиях полиморфизма по активности фермента и времени его проявления для лабораторных линий и естественных популяций D.virilio.

Необходимо отметить, что в ходе развития D.virilis расположение и соотношение интенсивностей мажорных и минорных полос, . отражающих инициацию транскрипции гена с различных участков, не меняется; при этом транскрипция гена у самок, проходящая на очень низком уровне, тем не менее начинается с тех же мажорных позиций, что и у самцов. Единственным исключением является семейство транскриптов, практически одинаковых по интенсивности у самцов и у самок,чье количество постепенно нарастает в ходе развития и чей 5-конец располагается после инициирующего кодона AUGJ тем самым трансляция этих РНК может приводить к появлению измененных молекул белка.

Приведенные выше данные позволяют заключить, что как тканевая локализация фермента, так и его проявление в ходе онтогенеза, полностью отражены в транскрипционной активности клонированного гена эстеразы 8,и что стадия транскрипции является основным уровнем регуляции экспрессии гена эстеразы s, обеспечивающим ткано-специфичность его проявления и изменения в онтогенезе D./iriiia.

В настоящей работе ш также определили первичную структуру 3- и б^-фланкирующих участков гена и при помощи компьютерного анализа сравнивал.! эту область с различными участками контроля транскрипции - энхалсерами, длинными концевыми повторами вирусов и мобильных генетических элементов.

Оказалось, что область за 100-300 нуклеотидов перед точкой инициации транскрипции заполнена областями гомологии с различными энхансерами, а также рстровирусоподобными последовательностями типа цдг (мобильных диспергированных генов, представляющих нестабильный компонент генома). На рис.5 отмечены некоторые из обнаруженных участков, сходных с блоками онхапсеров - так пазы-

ваемый тйтооблок, характерный для практически всех известных знхансеров, область, сходная с активирующими элементами длинных концевых повторов онкогенных ретровирусов, области, сходные с последовательностями из длинных концевых повторов мобильных генетических элементов дрозофилы вдг1 и мдгЗ,

При поиске последовательностей, гомологичных генуЕэ1;-з у разных таксонов было обнаружено, что в геномах крысы, мыши и кролика присутствуют последовательности, гомологичные небольшой транскрибируемой области эстеразного гена б.ушИз. Было показано такхе, что в геномах указанных таксонов эти последовательности многократно повторяются, а в геноме крысы - активно транскрибируются ео всех исследованных органах.

Насыщенность повторами тлеет исключительно ва-шое эволюционное значение, т.к. обеспечивает основу для изменчивости геномов в форме различных перестроек ДНК-одиночных и множественных нуклеотидных замен, делеций и вставок фрагментов ДШ, а также более слошых процессов: неравного кроссинговера, межгенной конверсии и т.д., а эволюционный консерватизм является важнейшим свойством функционально значимых структур макромолекул. Чем меньше функциональная важность отдельных участков генов, тем больше они имеют тенденцию к эволюционной изменчивости. Таким образом, можно утверждать, что исключительно высокая эволюционная консервативность фрагмента ртеэ отражает его функциональную важность в жизнедеятельности клетки.

Исследования структуры гена оргалоспецифпческой зстеразы 3 и. у1г111з в пределах группы умна выявили высокий консерватизм гена в пределах этих видов и его дивергенцию у далеких видов, что позволяет сделать вывод о возможности использования гена БаЬ-З для уточнения филогенетических отношений мо:*ду близкими и отдаленными видами организмов. Выявленная высокая консервативность гена в пределах группы у!гШз тем более интересна, что последние исследования говорят о важной роли органоспецифической эстеразы в репродуктивной приспособленности мух,и консервативности гена и соответствующего белка,может обеспечивать уникальную возможность получения фертильных межвидовых гибридов, характерных для группы у1г111э.

Исследование полиморфизма локуса Еа1-3 20-ти линий 1>^1г11а.а выявило высокую генетическую стабильность локуса и прилежащей области как в отношении точечных замен, затрагивающих рестршщион-

ные сайты, так и в отношении крупных изменений типа делеций или инсерций. Лишь в одной линии обнаружена инсерция фрагмента ДШ длиной 3,4 т.п.н. Природа обнаруженной инсерции в линии 140а пока не ясна. Клонирование и снквенс соответствующего участка из линии 140а позволяет определить пр!гроду обнаруженной инсерции.

Важно, что в пределах изученного фрагмента ДЖ р\ГЕ9 локализуется, помимо гена Ез1;-з, по крайней мере еще три гена и несколько транскрипционных единиц (за счет альтернативного сплайсинга и использования альтернативных промоторов). Это дает основание полагать, что высокая стабильность не ограничена эстеразным геном (например, из-за его важности в жизнедеятельности и размножении дрозофилы), а является свойством генома находящим свое отражение на хромосомном уровне в отсутствие пр!грод-ных перестроек. Возможно, устойчивость генома по отношению к ин-серциям мобильных элементов н к нуклеотидным заменам обуславливается различными защитными мехшшзмами. На молекулярном уровне возможными объяснениями отсутствия нуклеотидных замен у с,у1гШз могут быть повышенная точность копирования матрицы ДЖ-полимера-зами или высокая эффективность репарационных систем; причинами низкой частоты инсерций могут быть резистентность .к инфекции рет-ропозонами и ретротранспозонами или работа репарационных систем.

вывода

1) Проведено физическое и транскрипционное картирование гена остеразы Б.

2) Исследована специфическая инициация транскрипции в ходе онтогенеза и в различных тканях в.уШНо. Показано, что транскрипция является основным уровнем регуляции экспрессии гена эстеразы б, а семявыпосящие луковицы - основным местом синтеза фермента у зрелы:;, самцов

3) Локализованы точки инициации транскрипции гена и показано различие в использовании альтернативных точек инициации транскрипции в различных органах в.уМНа.

4) Определена первичная структура области инициации транскрипции гена и показано наличие в ней последовательностей, характерных для эукариотических промоторов.

5) Показана консервативность гона в пределах группы у1г111.л и его дивергенция в других рцдах.

6) Показана высокая генетическая стабильность гена как в

смысле инсерций, так и одиночных нуклеотидных замен.

СПШОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТИЛЕ ДШСЕРТАЦИИ

1. Екиколопов Г.Н., Кузин Б.А., Евгеньев М.Б., Хечумян. Р.К., Людвиг М.Э., Корочкин Л.И., Георгиев Г.П. Организация гена тканеспецифической эстеразы s D.viriiis. - Тезисы сообщений Международного симпозиума "Организация и экспрессия ткане-специфических генов". Новосибирск, 1982, с.26.

2. Хечумян Р.К., Ениколопов Г.Н. Структура функциональных участ-' ков гена эстеразы з D.viriiis. - Тезисы сообщений Мевдународного симпозиума "Организация и экспрессия ткане-специфических генов". Новосибирск, 1982, с.83.

3. Ениколопов Т.Н., Хечумян Р.К., Бакаева Т.Г., Кузин Б.А., Корочкин Л.И. Молекулярная организация локуса эстеразы S Dro-sophiia virilis. - Тезисы сообщений vin Всесоюзного симпозиума "Структура и функция клеточного ядра". Пущино, 1984,

с.206-207.

4. Хечумян Р.К., Вшколопов Г.Н., Кузин Б.А., Бакаева Т.Г., Корочкин Л.И. Молекулярный анализ гена эстеразы S Droaophila virilis. - Тезисы докладов 16-ой конференции Федерации Европейских Биохимических обществ. Москва, 1984, с.257.

5. Вппгалопов Г.Н., Хечумян Р.К., Кастильо Х.Э., Пеунова Н.И. Тамарина Н.И., Бакаева Т.Г., Кузин Б.А., Корочкин Л.И. Регуляция экспрессии гена эстеразы s Droaophila virilis. - Тезисы докладов VI симпозиума СССР-ФРГ "Структура и функция генома". Ленинград, 1985, с.]>' 26.

6. Вшколопов Г.Н., Хечумян Р.К., Кастильо Х.Э. Сигналы транскрипции гена эстеразы s Droaophila virilis. - Тезисы сообщений Совместного симпозиума СССР-ГДР, Рига, 1985.

7. Хечумян Р.К., Вшколопов Г.Н., Бакаева Т.Г., Корочкин Л.И. "Структурно-функциональная характеристика гена эстеразы s D.viriiis. - Тезисы сообщений Республиканской конференции "Макромолекулы и функционирование клетки". Ереван, 1986, с.52.

8. Yenikolopov G.H., Malevanchuk О.A., Khecliumyan R.K., Georgiev G.P., Bakaeva T.G., Korochkin L.I. The esterase S gene f D.virili3 is higly conserved within the virilis group. -Iaoz. Bull., 1987, v.20, p.30.

9. Yenikolopov G.N., Khechumyan R.K., Georgiev G.P., Kuzin Б.А., Korochkin L.I. A set of alternative transcription initiation points is used during tissue-specific transcription of the D.virilis esterase S isozyme. - Isoz. Bull., 1987, v.20, p.37.

10. Вшколопов Т.Н., Хечумян P.К., Кастильо Х.Э., Георгиев Г.П. Первичная структура области инициации транскрипции гена эс-теразы s Drosophila virilic. - Биоорг. химия, 1988, T.I4, PI2, с.1671-1677.

11. Вшколопов Г.Н., Хечу1.шн Р.К., Кузин Б.А., Корочкин Л.И., Георгиев Т.П. Тканеспецифичная экспрессия гена эстеразы s DroBophila virilis. - Генетика, 1989, t.xxv, IK3, с.406-416.

12. Хечумян Р.К., Мнджоян Е.О., Малеванчук О.А., Корочкин Л.И., Вшколопов Г.Н. Исследование полиморфизма области локуса Est-S Drosophila virilis. - Генетика, 1989, т. XXV, W7,

с.1325-1329.

13. Корочкин Л.И., Вшколопов Г.Н., Людвиг М.З., Тамарина Н.А., Копанцева М.Р., Кузин Б.А., Евгеньев М.Б., Хечумян Р.К., Малеванчук О.Н., Успенский И.И. Молекулярно-генетические аспекты экспрессии генов в гениталиях дрозофилы. - Тезисы докладов vil симпозиума СССР-ФРГ "Организация генома и регуляция активности генов". Иркутск, 1989, с.16-17.

14« L.Korochkin, M.Ludwig, G.Yenikolopov, IJ.Tamarilla, П.Khechumyan, I.Uspensky, M.Kopontzeva, M.Evgeniev, B.Kuzin, T.Balca-yeva, E.Mndjoyan, O.llalevonchuk. Molecular genetic mechanisms of tissue speoific esterase isozims and protein expres-cion in Drosophila. - Abstracts of 6 International Congress on Isosymeo. Tooyama, Japan, 1989, h.HL-3*

15. Korochkin L., Ludwig M., Yenikolopo* G., Tamarina N., Khe-chu.nyan R., Uspensky 11., Kopantseva M., Evgeniev M., Kuzin В., Bakaeva Т., Mndjoyan E. and Malevanchuk 0. Molecular genetic mechanisms of tissue spesific esterase isosymes and protein expression in drosophila. - Isoz. Bull., 1989, v.22,

P.14.

16. Хечумян Р.К., Мнджоян Е.О., Малеванчук О.А., Корочкин Л.И., Гэлоян А.А., Вшколопов Г.Н. Высокая генетическая стабильность локуса Est-s Drosophila virilis. - Генетика, 1990.

IT. Khechumyan R.K., Mndjoyan E.O., Galoyan /..A., Bakayeva T.G., Korochkin,L.I., Malcvsnchuk O.A., Yenicolopov O.K. Evolu-

tionary conservation of the esterase 3 gene of D.virillB. -Dros. Inform. Serv., 1989, V.69.

18. Khechumyan R.K., Mndjoyan E.O., Galoyan A.A., Korochkin L.I., Malevonchuk O.A., Yenikolopov Q.N. The very high stability of the Est-S locus of D.virilis. - Dros. Inform. Serv., 1989, V. 69.

19. Korochkin Tj. , Ludwig M., Yenicolopov G., Tamarlna N., Khe-'chumyan n., Uspeneky I., Kopantzeva M., Evgeniev M., Kuzin

B., Bakaeva T., Mndjoyan E., Malevanoliuk 0. Molecular as-peots of tissue- specific genes expression in Drosophila. -ins Progress in Enzymes biology. Alan Lisa, New York, 1990.

ВФ 03.946 Заказ 27 Тиран 100

Отпечатало на ротоприитном участке Центра научной информации и Фундаментальной библиотеки АН Арм.ССР Ереван,375001,ул.Абовяна,15.