Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение изменчивости и молекулярных механизмов образования псевдогенов митохондриального происхождения в геноме дрозофил

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение изменчивости и молекулярных механизмов образования псевдогенов митохондриального происхождения в геноме дрозофил"

На правах рукописи

Романов Денис Александрович

Изучение изменчивости и молекулярных механизмов образования псевдогенов митохондриального происхождения в геноме дрозофил

03.02.07- генетика

5 ДЕК 2013

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2013 005542034

005542034

Работа выполнена в лаборатории генетики насекомых Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, г. Москва

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Андрианов Борис Витальевич

Доктор биологических наук,

ведущий научный сотрудник лаборатории генетики насекомых Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук Ким Александр Иннокентьевич Доктор биологических наук,

профессор кафедры генетики

биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Гордеев Михаил Иванович

Доктор биологических наук, профессор, зав. кафедры общей биологии и биоэкологии Государственного

образовательного учреждения высшего профессионального образования

Московского государственного областного университета

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук

Защита диссертации состоится «24» декабря 2013 года в {{'.QQна заседании диссертационного совета Д.002.214.01 в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук по адресу: 119991, ГСП-1 Москва, ул. Губкина, д.З. Тел. (499)135-62-13, факс: (499)132-89-62, e-mail: aspirantura@,vigg.ru. адрес в Интернете: www.vigg.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук.

Автореферат диссертации разослан «ЛО» ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Т.А. Синелыцикова

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования

Митохондриальные последовательности в ядерном геноме выявлены у всех изученных к настоящему времени эукариотических организмов. Впервые их обнаружили с помощью методов гибридизации нуклеиновых кислот и рестрикционного анализа. В течение долгого времени полученные данные рассматривались лишь как частные случаи, которые не имеют общебиологического значения. Ситуация изменилась, когда начались многочисленные работы с митохондриальной ДНК методами ПЦР и были получены первые полные геномы эукариотов. Во-первых, обнаружение множества фрагментов митохондриальной ДНК в составе хромосом не оставило места сомнениям относительно реальности переноса ДНК из митохондрий в ядро. Во-вторых, получила окончательное признание теория симбиотического происхождения эукариотической клетки и, в частности, происхождения митохондрий от альфа-протеобактерий (Lang et al., 1999; Adams, Palmer, 2003). В рамках этой теории закономерен постоянно идущий процесс переноса ДНК из изолированных геномов органелл, лишённых рекомбинации, в ядерный геном. Механизмы возникновения псевдогенов митохондриального происхождения (далее в тексте обозначаемые для краткости «митохондриальные псевдогены») различны. Наиболее вероятно непосредственное встраивание фрагментов митохондриальной ДНК в места двойных разрывов хромосом по механизму негомологичной рекомбинации (Blanchard, Schmidt, 1996), хотя и возможно наличие этапа обратной транскрипции РНК, считанной с митохондриальных генов (Gellissen, Michaelis, 1987). Отсутствие единого механизма возникновения и очевидной клеточной функции позволяет рассматривать митохондриальные псевдогены как молекулярные ископаемые и использовать для филогенетических реконструкций и уточнения систематического статуса близкородственных видов. В последнее время появились данные, позволяющие по-новому взглянуть на феномен псевдогенов митохондриального происхождения. Получены доказательства возникновения новых копий митохондриальных псевдогенов в соматических клетках, причем этот процесс резко активизируется в трансформированных клетках при некоторых вирусных инфекциях, подавлении клеточного дыхания и при действии ионизирующего излучения. Эти открытия позволяют рассматривать динамику формирования митохондриальных псевдогенов как чувствительный генетический маркёр геномной нестабильности, и ставит их изучение в ряд приоритетных биомедицинских исследований.

Многими исследователями отмечалась ассоциация митохондриальных псевдогенов с ретротранспозонами (Hadler et al., 1998; Mishmar et al., 2004; Mularoni et al., 2012; Tsuji et al., 2012). У дрозофил группы vir il is имеется функционально-активное семейство ретротранспозонов Tvl. Tvl относится к суперсемейству gypsy (Andrianov et al., 1999). Ретротранспозон Tvl обладает свойством сайт-специфично встраиваться в область микросателлитных повторов (ТА)П. Спейсерная область между митохондриальными генами atpó и

сохЗ у дрозофил группы virilis содержит такой микросателлитный повтор, что позволит выявлять псевдогены митохондриального происхождения в ядерном геноме, если они маркированы инсерцией ретротранспозона Tvl (Andrianov et al., 2010). Эти данные позволили спланировать и провести более подробное исследование митохондриальных псевдогенов у дрозофил группы virilis.

Группа близкородственных видов дрозофил virilis состоит из 12 видов, морфологически слабо различимых и относимых к четырём филадам: virilis (D. virilis, D. lummei, D. novamexicana, D. americana americana, D. americana texana), montana (D. montana, D. lacicola, D. flavomontana и D. borealis), kanekoi (D. kanekoi, D. ezoana) и littoralis (D. littoralis) (Morales-Hojas et al., 2011). В настоящее время данная группа является активно изучаемым модельным объектом для изучения процессов микроэволюции и видообразования.

В данном исследовании проведено сравнительное изучение псевдогенов митохондриального происхождения мух и клеточной культуры Drosophila virlilis. Изучена ассоциация митохондриальных псевдогенов с ретротранспозрном Tvl и определены возможности использования митохондриальных псевдогенов как филогенетических маркёров у дрозофил.

Степень разработанности темы исследования

Наибольшее внимание привлекают псевдогены митохондриального происхождения млекопитающих (особенно приматов) и насекомых. Большинство исследований митохондриальных псевдогенов основано на биоинформационном анализе полных геномов. Ряд работ сочетают биоинформационный анализ с экспериментальным выделением псевдогенов митохондриального происхождения (Mishmar et al., 2004; Ricchetti et al., 2004; Sawamura et al., 2008; Nergadze et al., 2010). Недавно показана активизация процесса образования митохондриальных псевдогенов при старении и в опухолевых клетках позвоночных (Саго et al., 2010; Muradian et al., 2010). Число исследований, посвященных изучению псевдогенов митохондриального происхождения дрозофил, в настоящее время невелико (Sawamura et al., 2008; Rogers, Griffiths-Jones, 2012). Анализ митохондриальных псевдогенов в клеточной культуре дрозофил проводился впервые. Представленные в работе данные являются оригинальными.

Цели и задачи исследования

1. Изучение псевдогенов митохондриального происхождения как маркёров геномной нестабильности в клеточной культуре.

2. Изучение ассоциаций псевдогенов митохондриального происхождения с ретротранспозоном Tvl, специфичным для дрозофил группы virilis.

3. Изучение возможности реконструкции филогенетических связей у дрозофил на основе анализа изменчивости псевдогенов митохондриального происхождения.

Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

1) изучить состав и особенности псевдогенов митохондриального происхождения в первичной и пересеваемой клеточных линиях D. virilis и в геноме дрозофил, образующих группу virilis;

2) провести in silico анализ псевдогенов митохондриального происхождения на основе полного генома D. virilis и описать ассоциации псевдогенов митохондриального происхождения с ретротранспозоном Tvl;

3) определить характер нуклеотидной изменчивости псевдогенов митохондриального происхождения в группе virilis;

4) уточнить порядок филиации в группе virilis на основе анализа изменчивости последовательности фрагмента гена kl-2 1-beta dynein heavy chain Y-хромосомы;

5) провести реконструкцию филогенетических связей дрозофил группы virilis на основе анализа изменчивости псевдогенов митохондриального происхождения.

Научная новизна

Впервые проанализирована изменчивость псевдогенов митохондриального происхождения у мух, в первичной и в пересеваемой клеточных культурах D. virilis.

Впервые показано возникновение новых копий псевдогенов митохондриального происхождения в пересеваемой клеточной культуре D. virilis.

В данной работе получены данные, указывающие на высокую степень изменчивости псевдогенов митохондриального происхождения после их интеграции в хромосомы, что противоречит представлению о них как о "молекулярных ископаемых".

На основе анализа изменчивости последовательности фрагмента гена kl-2 1-beta dynein heavy chain Y-хромосомы получены данные, позволяющие уточнить филогентическую структуру дрозофил группы virilis. В частности, показано, что D. kanekoi и D. ezoana образуют единый кластер, a D. littoralis имеет более древнее происхождение; получено подтверждение разделения вида D. littoralis на два подвида — D. littoralis littoralis и D. littoralis imeretensis.

Теоретическая и практическая значимость работы

Разработанный метод выделения митохондриальных псевдогенов может быть применён к тем видам животных, которые имеют активно перемещающиеся семейства ретротранспозонов. Полученные результаты вносят вклад в фундаментальные исследования по генетике геномной нестабильности в клеточных культурах животных. Описание и анализ псевдогенов митохондриального происхождения дрозофил группы virilis позволили получить новые данные для изучения эволюции фрагментов митохондриальной ДНК в ядерном геноме. Результаты работы вносят вклад в фундаментальные исследования по молекулярной генетике, разрабатываемые на дрозофиле в качестве модельного объекта. Полученные данные важны для исследований в области изучения стабильности генома и биологии старения.

Результаты работы могут быть применены в исследованиях, проводимых в учреждениях системы РАН: в Институте Общей генетики РАН, Институте Молекулярной биологии РАН, Институте Биологии развития РАН, Институте Биологии гена РАН. Результаты работы могут быть применены в

исследованиях, проводимых в учреждениях системы РАСХН: Всероссийском научно-исследовательском институте генетики и разведения сельскохозяйственных животных РАСХН, Всероссийском научно-исследовательском институте охотничьего хозяйства и звероводства РАСХН.

Положения, выносимые на защиту:

• В клетках пересеваемой культуры ускоряется перенос митохондриальной ДНК в ядро с образованием псевдогенов митохондриального происхождения.

• Новые инсерции ретротранспозона Tvl в пересеваемой культуре клеток происходят преимущественно, но не исключительно, в последовательности недавно возникших псевдогенов митохондриального происхождения.

• Перенос ДНК митохондриальных генов atp6 и сохЗ в ядро может быть обнаружен по инсерциям ретротранспозона Tvl в область (АТ)П микросателлита, локализованного в межгенном спейсере atpö и сохЗ у дрозофил группы virilis.

Апробация результатов диссертации

Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях:

• Svetlana Y. Sorokina, Denis A. Romanov, Boris V. Andrianov, Ilya A. Zakharov // 54th Annual Drosophila Research Conference Washington, DC April 3-7. 2013. P. 168. 525C.

• Романов Д.А., Горелова T.B., Сорокина С.Ю., Андрианов Б.В. // Актуальные проблемы биологической и химической экологии: сб. М.: Изда-во МГОУ, 2012. С.57-59.

• Svetlana Y. Sorokina, Boris V. Andrianov, Denis A. Romanov, Prohor A. Proshakov, Vladimir G. Mitrofanov // 53rd Annual Drosophila Research Conference. Chicago, IL. March 7 - March 11. 2012. P. 270. 518B.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, заключения, выводов, списка публикаций по теме диссертации, списка цитируемой литературы, в который входит 123 ссылок. Работа проиллюстрирована 1 таблицей и 16 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение тотальной ДНК, проведение ПЦР, клонирование и секвенирование ПЦР фрагментов проводили согласно стандартным методам.

Биоинформационный анализ

Выравнивание нуклеотидных последовательностей и филогенетический анализ проводили при помощи пакета программ Lasergene 97 "DNASTAR" и MEGA 5 (Tamura et al., 2007). Построение статистической парсимониальной сети митохондриальных гаплотипов проводили в программе TCS ver. 1.18 (Clement et al., 2000). В работе использовались следующие интернет - сервисы: http://www.ncbi.nlm.nih.gov: http://genome.ucsc.edu/index.html.

Получение первичной эмбриональной клеточной линии

Культуру получали по модифицированному протоколу (Echalier, 1997). Клеточную суспензию высевали в чашку Петри и культивировали при 26°С.

Рост первичной культуры отмечался через 2 суток и продолжается несколькими волнами до 12 месяцев.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Выделение и характеристика фрагментов митохондриальной ДНК из ядерного генома дрозофил группы virilis и пересеваемой клеточной культуры D. virilis

Метод экспериментального выделения псевдогенов митохондриального происхождения у дрозофил группы virilis основан на сайт-специфичности инсерций ретротранспозона Tvl в сайт микросателлита (АТ)„. Данный микросателлит локализован в спейсерной области между митохондриальными генами atpó и сохЗ у дрозофил группы virilis (Andrianov et al., 2010). Эта особенность митохондриальной ДНК дрозофил группы virilis позволяет детектировать недавние события инсерций митохондриальных псевдогенов, ассоциированных с инсерцией ретротранспозона Tvl в ядерный геном. Инсерции ретротранспозона Tvl метят митохондриальные последовательности в ядерном геноме и позволяют их выделение с помощью ПЦР.

На рисунке 1 приведено сравнение форм atpó псевдогенов митохондриального происхождения, ассоциированных с инсерцией ретротранспозона Tvl в прямой и обратной ориентациях, из генома мух и пересеваемой клеточной культуры 79f7Dv3g D. virilis. ПЦР фрагменты atpó псевдогенов митохондриального происхождения, ассоциированных с инсерцией ретротранспозона Tvl в прямой ориентации, могут быть получены только на матрице ДНК самцов, но не самок, что указывает на их локализацию в Y-хромосоме. Анализ нуклеотидных последовательностей индивидуальных клонов ПЦР фрагментов выявил ожидаемые инсерции Tvl в последовательность микросателлита (АТ)П в область межгенного спейсера atpó и сохЗ. Различия в длине ПЦР фрагментов, наблюдаемые только на матрице ДНК клеточной культуры, определяются различиями в длине длинных концевых повторов ретротранспозона Tvl (рисунок 2). Эти различия в длине связаны с наличием или отсутствием дупликаций длиной от 1 до 40 п.н. (рисунки 16 и За).

•"V

■Ру имаго к 6

аре УУ(дть—[ Д«п |Г

£9_к"

о ¡рб (АТ),-| ДКП 1Г

-Л

Ж^-тЛЖШ]

т6 ^г1"1'-"1 д>

агрб

I

1Г

« 1078

Я"п в........ ТУ1

1062

якп НИМ ТУ1

Рисунок 1. Выделение и структура Мрб псевдогенов митохондриального происхождения из генома мух £>. угп/ю и пересеваемой клеточной культуры.

а - фракционирование ПЦР фрагментов в агарозном геле, образованных Мрб псевдогенами митохондриального происхождения, ассоциированными с инсерцией ретротранспозона 7\>/ в прямой (а1) и обратной (а2) ориентациях. Окрашивание бромидом этидия. На дорожках 1 — 2 и 4 — 5 фракционированы ПЦР фрагменты, полученные на матрицах геномной ДНК самцов и самок линии В9 О. утИз. На дорожках 3 и 6 фракционированы ПЦР фрагменты, полученные на матрице геномной ДНК клеточной культуры 79f7DvЗg. Стрелками указаны ПЦР фрагменты ожидаемого размера, б - карты клонов а1р6 псевдогенов митохондриального происхождения, ассоциированных с инсерцией ретротранспозона 7у/, из генома клеточной культуры и имаго В. утИз. Карта, обозначенная а1-Оу имаго, соответствует хромосомному локусу У-хромосомы, выявленному у всех проанализированных линий мух О. \irilis (ОепВапк ГО: .1X560762 - 1X560765); карты, обозначенные а1-С9, а1-С2, а1-С6, соответствуют разным типам а!рб псевдогенов митохондриального происхождения , ассоциированных с инсерцией ретротранспозона Т\1 в прямой ориентации, выявленным в геноме клеточной линии 79f7DvЗg (ОепВапк ГО: 1X560766, Ж 560767, 1X560769); карты, обозначенные а2-С1, а2-С4, а2-С6, соответствуют разным типам Мрб псевдогенов митохондриального происхождения , ассоциированных с инсерцией ретротранспозона Ту1 в обратной ориентации, выявленных в геноме клеточной культуры (ОепВапк ГО: КР669862-КР669864). Внизу карт отмечены размеры Мрб

псевдогенов митохондриального происхождения и ассоциированных с ними ретротранспозонов Ту1. Тёмными прямоугольниками выделена последовательность длиной 40 п.н., образующая прямые дупликации.

Рисунок 2. Фракционирование ПЦР фрагментов образованных а1рб псевдогенами митохондриального происхождения, ассоциированными с ретротранспозоном 7у/ в агарозном геле. Окраска бромидом этидия.

На дорожках 1 - 5 фракционированы ПЦР фрагменты, полученные на матрицах геномной ДНК самцов из следующих линий мух О. \irilis. В9, Ы60, Оу1, 0у40, Ба96, соответственно. На дорожках 6 — 10 фракционированы ПЦР фрагменты, полученные на матрицах геномной ДНК клеточной культуры 79f7DvЗg, выделенной в 2004, 2005, 2008, 2010 и 2012 годах, соответственно.

-----

Рисунок 3. Изменчивость Шрб псевдогенов митохондриального происхождения .

А — карты клонов Шрб псевдогенов митохондриального происхождения, ассоциированных с инсерцией ретротранспозона Ту], из генома клеточной культуры. Карта обозначенная 0у40, соответствует хромосомному локусу У-хромосомы, выявленному у всех проанализированных линий мух £>. \irilis (вепВапк ГО: 1X560762 - .1X560765 ); карты обозначенные: С-2, С-6, С-8, С-9 соответствуют разным типам Шрб псевдогенов митохондриального происхождения, ассоциированных с ретротранспозоном Ту1, выявленным в геноме клеточной линии 79f7DvЗg (СепВапк ГО: 1X560766 - ХХ560769 ). Стрелками отмечены Нтй сайты. Ожидаемые размеры Нтй фрагментов отмечены внизу карт. Тёмными прямоугольникоми выделена последовательность длиной 40 н.п., образующая прямые дупликации и ответственная за наблюдаемую разницу в длине Нтй фрагментов.

В - Нтй ПДРФ суммарного препарата ПЦР фрагментов Шрб псевдогенов митохондриального происхождения, ассоциированных с инсерцией ретротранспозона Т\1 полученных на матрице ДНК линии мух Иу40 - дорожка 1; клеточной культуры 79í7DvЗg -дорожка 2; и на матрице плазмидной ДНК индивидуальных клонов С-6, С-2, С-9, С-8, на дорожках 3,4,5 и 6 соответственно. Карты представленных клонов даны в секции «А».

Длина митохондриальных псевдогенов в геноме мух и клеточной линии постоянна и равна длине соответствующей митохондриальной последовательности. Использованные нами праймеры амплифицируют а1рб псевдоген митохондриального происхождения длиной 261 н.п. Все пять линий мух ОМгШя содержат идентичный митохондриальный псевдоген, содержащий 17 точковых нуклеотидных замен по сравнению с соответствующей митохондриальной последовательностью. Отмеченные замены приводят к 6 аминокислотным замещениям, но не приводят к образованию стоп-кодонов. Совпадение сиквенсов сйрб псевдогенов митохондриального происхождения из линий мух 7).уот7и различного географического происхождения указывает на существование данного псевдогена митохондриального происхождения в предковой форме В.мггШэ до её экспансии по современному ареалу.

Все проанализированные клоны из клеточной культуры относятся к одному из четырёх типов (рисунок За). На рисунке 3 приведено сравнение карт индивидуальных клонов ПЦР фрагментов, а также представлен Шпй ПДРФ ПЦР фрагментов, полученных на матрицах плазмидной ДНК клонов, и суммарного ПЦР препарата, полученного на матрице геномной ДНК клеточной культуры. Митохондриальные псевдогены из клеточной культуры идентичны митохондриальной последовательности, за исключением псевдогена митохондриального происхождения типа С-8. В этом клоне обнаружена точковая синонимичная замена Т > С в позиции № 4716 согласно последовательности полного митохондриального генома О.У1гШ.ч (СепВапк ГО: ВК006340.1). Тип С-8 интересен ещё и тем, что специфический только для него Шпй фрагмент не выявляется в суммарном препарате, полученном на матрице

геномной ДНК клеточной культуры (рисунок 36). Эта особенность, вероятно, связана с низкой копийностью типа С-8. Это возможно в случае, если псевдоген митохондриального происхождения С-8 образовался уже после возникновения пересеваемого клона клеток, давшего начало пересеваемой клеточной культуре. Дополнительно данное предположение поддерживается разной длиной микросателлита (АТ)„, который в случае С-8 на один AT динуклеотид длиннее, чем в случае остальных трёх типов (рисунок За). Различия типов С-2, С-6 и С-9 касаются разного числа коротких дупликаций в последовательности длинного концевого повтора 7vi. atpó псевдоген митохондриального происхождения, характерный для генома мух D.virilis, оказался потерян в ходе культивирования пересеваемой клеточной линии. Известно, что в клеточных культурах иногда наблюдается спонтанная потеря некоторых хромосом. Чаще всего теряется Y-хромосома и возникают моносомики по X хромосоме и хромосоме IV (Eshalier, 1997). Потеря Y-хромосомы в пересеваемой культуре D.virilis было подтверждено по потере гена kl-2 1-beta dynein heavy chain, стабильно выявляемого у всех представителей группы virilis.

В установившейся клеточной линии выявлены несколько разных копий atpó псевдогенов митохондриального происхождения, идентичных по сиквенсу с исходной митохондриальной формой. В свою очередь, такие митохондриальные псевдогены не выявляются в геноме мух. Эти факты позволяют предположить их возникновение в клетках пересеваемой культуры. Существуют две возможности возникновения многих копий митохондриальных псевдогенов в геноме. Либо (1) путём нескольких независимых инсерций митохондриальной ДНК в геном, либо (2) путём дупликаций единственного псевдогена митохондриального происхождения. Такие дупликации могут происходить при амплификации отдельных локусов или как результат общей полиплоидизации генома клетки. Анализ нуклеотидной изменчивости ретротранспозона Tvl, ассоциированного с разными копиями псевдогенов митохондриального происхождения, свидетельствует в пользу первого предположения о независимом происхождении разных копий псевдогенов митохондриального происхождения. Следовательно, ядерный геном пересеваемой клеточной культуры подвержен инсерциям фрагментов митохондриальной ДНК, что может служить причиной трансформации первичной клеточной культуры в пересеваемую, и вызывать геномную нестабильность клеток в пересеваемой культуре.

В геноме D. lacicola был обнаружен atpó псевдоген митохондриального происхождения, ассоциированный с инсерцией ретротранспозона Tvl в прямой ориентации, содержащий 8 точковых нуклеотидных замен по сравнению с соответствующей митохондриальной последовательностью D. lacicola (GenBank ID: FJ536200.1), 2 из которых приводят к аминокислотным замещениям.

ПЦР фрагменты atpó псевдогенов митохондриального происхождения, ассоциированных с инсерцией ретротранспозона Tvl в обратной ориентации, могут быть получены только на матрице ДНК пересеваемой клеточной культуры D. virilis. ПЦР продукты ожидаемого размера на матрице ДНК самцов

и самок D. virilis не были получены. Анализ нуклеотидных последовательностей индивидуальных клонов ПЦР фрагментов позволил выявить ожидаемые инсерции Tvl в последовательность микросателлита (АТ)„ в область межгенного спейсера atpó и сохЗ. Длина псевдогенов митохондриального происхождения в клеточной линии постоянна и равна длине соответствующей митохондриальной последовательности. Использованные нами праймеры амплифицируют atpó псевдоген митохондриального происхождения длиной 261 п.н. Все проанализированные клоны из клеточной культуры относятся к одному из трёх типов, карты которых представлены на рисунке 16. Митохондриальный псевдоген типа а2-С4 идентичен митохондриальной последовательности. Митохондриальный псевдоген типа а2-С 1 содержит одну точковую несинонимичную замену А > С в позиции № 4502 согласно последовательности полного митохондриального генома D.virilis (GenBank ID: ВК006340.1), приводящую к аминокислотной замене треонина на пролин. Псевдоген митохондриального происхождения типа а2-С6 содержит одну точковую несинонимичную замену А > С в позиции № 4709 согласно последовательности полного митохондриального генома D.virilis, приводящую к аминокислотной замене серина на аргинин. Ретротранспозоны Tvl, ассоциированные с atpó псевдогенами митохондриального происхождения этих трёх типов, отличаются друг от друга только немногочисленными точковыми нуклеотидными заменами. Размеры микросателлитов (АТ)„ специфичны для каждого типа.

В геноме D. montana был обнаружен atpó псевдоген митохондриального происхождения, ассоциированный с инсерцией ретротранспозона Tvl в обратной ориентации, содержащий 19 точковых нуклеотидных замен по сравнению с соответствующей митохондриальной последовательностью D. montana (GenBank ID: FJ536202.1), 4 из которых приводят к аминокислотным замещениям, одна - к появлению стоп-кодона. Кроме того, в данном митохондриальном псевдогене имеется делеция одного нуклеотида, приводящая к сдвигу рамки.

Для изучения образования митохондриальных псевдогенов de novo, нами была получена первичная клеточная культура из эмбрионов D. virilis. Данная культура представлена клетками двух типов: эпителиально-подобными и нейроно-подобными. Эти клетки плотно прикреплены к субстрату и морфологически заметно отличаются от клеток пересеваемой клеточной культуры 79f7Dv3g.

На рисунке 4 представлено сравнение форм atpó псевдогенов митохондриального происхождения в геноме мух D. virilis, в первичной и пересеваемой клеточных культурах. Из приведённой фотографии электрофореза в агарозном геле видно, что ПЦР продукты, полученные на матрице ДНК из эпителиально-подобных клеток первичной клеточной культуры не отличаются от ПЦР продуктов, полученных на матрице ДНК самцов D. virilis. ПЦР продукты, полученные на матрице ДНК из нейроно-подобных клеток первичной клеточной культуры идентичны ПЦР продуктам, полученным на матрице ДНК из эпителиально-подобных клеток первичной

и

клеточной культуры. Аналогичные результаты были получены при сравнении форм сохЗ псевдогенов митохондриального происхождения в геноме мух D. virilis, в первичной и пересеваемой клеточных культурах. Новые копии псевдогенов выявлены только в клетках пересеваемой культуры.

Рисунок 4. Сравнение форм atp6 псевдогенов митохондриального происхождения в геноме мух D. virilis, в первичной и пересеваемой клеточных культурах.

Фракционирование в агарозном геле ПЦР фрагментов, образованных atp6 псевдогенами митохондриального происхождения, ассоциированными с инсерцией ретротранспозона Tvl в прямой (al) и обратной (а2) ориентациях. Окрашивание бромидом этидия. На дорожках 1 и 4 фракционированы ПЦР фрагменты, полученные на матрице геномной ДНК самцов мух линии В9 D. virilis; на дорожках 2 и 5 фракционированы ПЦР фрагменты, полученные на матрице геномной ДНК эпителиально-подобных клеток первичной клеточной культуры D. virilis; на дорожках 3 и 6 фракционированы ПЦР фрагменты, полученные на матрице геномной ДНК пересеваемой клеточной культуры 79f7Dv3g D. virilis. Стрелками указаны ПЦР фрагменты ожидаемого размера.

приведено сравнение форм сохЗ псевдогенов митохондриального происхождения, ассоциированных с инсерцией ретротранспозона Ту1 в прямой и обратной ориентациях, из генома мух и пересеваемой клеточной культуры 19fTD\'ig £>. virilis. ПЦР фрагменты сохЗ псевдогенов митохондриального происхождения, ассоциированных с инсерцией ретротранспозона Тм1 в прямой ориентации, могут быть получены только на матрице ДНК пересеваемой клеточной культуры В. \irilis. ПЦР продукты ожидаемого размера на матрице ДНК самцов и самок Э. \irilis не были получены. Анализ нуклеотидных последовательностей индивидуальных клонов ПЦР фрагментов позволил выявить ожидаемые инсерции Ту1 в последовательность микросателлита (АТ)П в область межгенного спейсера Шрб и сохЗ. Проанализированные клоны из клеточной культуры относятся к одному из четырёх типов, карты которых представлены на рисунке 56. Митохондриальный псевдоген типа с1-С10 идентичен митохондриальной последовательности. Митохондриальный псевдоген типа с1-С2 содержит одну точковую несинонимичную замену Т > С в позиции № 5211 согласно последовательности полного митохондриального генома О.уггШз, приводящую к аминокислотной замене серина на пролин.

Dv9 CV1 C*i CV1 Cvl

1 г i 4 5 й

SB» mm

д 2 На рисунке 5

». * Ï л s щ . 1

- :

11||1||

cl-СЗ б 1ч

Tvl дкп ЦК

С1-С2

Tvl дкп yj j

cl-CIO s

Tvl ДКП Pli

3 C1-C17 s

Tvl дкп Hl!

os

à

tr"--! >

у 798 820 1270

ДКпД

Рисунок 5. Выделение и структура сохЗ псевдогенов митохондрнального происхождения из генома мух D. virilis и пересеваемой клеточной культуры.

а - фракционирование в агарозном геле ПЦР фрагментов, образованных сохЗ псевдогенами митохондрнального происхождения, ассоциированными с инсерцией ретротранспозона Tvl в прямой (cl) и обратной (с2) ориентациях. Окрашивание бромидом этидия. На дорожках 1 - 2 и 4 - 5 фракционированы ПЦР фрагменты, полученные на матрицах геномной ДНК самцов и самок линии В9 D. virilis. На дорожках 3 и 6 фракционированы ПЦР фрагменты, полученные на матрице геномной ДНК клеточной культуры 79f7Dv3g. Стрелками указаны ПЦР фрагменты ожидаемого размера, б - карты клонов сохЗ псевдогенов митохондрнального происхождения, ассоциированных с инсерцией ретротранспозона Tvl, из генома клеточной культуры D. virilis. Карты, обозначенные cl-C3, cl-C2, cl-CIO, с1-С17, соответствуют разным типам сохЗ псевдогенов митохондрнального происхождения, ассоциированных с инсерцией ретротранспозона Tvl в прямой ориентации, выявленным в геноме клеточной линии 79f7Dv3g (GenBank ID: KF669865- KF669868); карта, обозначенная c2-Cvi, соответствует типу сохЗ псевдогену митохондрнального происхождения, ассоциированного с инсерцией ретротранспозона Tvl в обратной ориентации, выявленной в геноме клеточной культуры 79f7Dv3g (GenBank ID: FJ539165). Внизу карт отмечены размеры сохЗ псевдогенов митохондрнального происхождения и ассоциированных с ними ретротранспозонов Tvl. Тёмными прямоугольниками выделена последовательность длиной 40 п.н., образующая прямые дупликации.

Псевдоген митохондрнального происхождения типа cl-СЗ содержит одну точковую несинонимичную замену Т > С в позиции № 5088 согласно последовательности полного митохондрнального генома D. virilis, приводящую к аминокислотной замене триптофана на аргинин. Митохондриальный псевдоген типа cl-С 17 содержит 13 точковых нуклеотидных замен по сравнению с соответствующей митохондриальной последовательностью, 5 из которых приводят к аминокислотным заменам, и одну делецию размером в 6 нуклеотидов. Длина митохондриальных псевдогенов в клеточной линии постоянна, за исключением типа cl-С 17, и равна длине соответствующей митохондриальной последовательности. Использованные нами праймеры амплифицируют сохЗ псевдоген митохондрнального происхождения длиной 457 п.н. Ретротранспозоны Tvl, ассоциированные с сохЗ псевдогенами митохондрнального происхождения этих четырёх типов отличаются друг от

друга наличием или отсутствием дупликаций длиной от 1 до 40 п.н. Размеры микросателлитов (АТ)„ специфичны для каждого типа.

ПЦР фрагменты сохЗ псевдогенов митохондриального происхождения, ассоциированных с инсерцией ретротранспозона 7\>/ в обратной ориентации, могут быть получены только на матрице ДНК пересеваемой клеточной культуры £>. virilis. ПЦР продукты ожидаемого размера на матрице ДНК самцов и самок £>. тг>г7м не были получены. Карта клона представлена на рисунке 56. Митохондриальный псевдоген типа с2-Слч содержит 11 нуклеотидных замен, приводящих к 3 аминокислотным заменам.

In silico анализ псевдогенов митохондриального происхождения, гомологичных митохондриальным генам atp6 и сохЗ, полного генома D. virilis линии Dv 149

Был выполнен поиск псевдогенов митохондриального происхождения, гомологичных митохондриальным генам atp6 и сохЗ в полном геноме D. virilis, сборка августа 2005 (Agencourt prelim/droVir2), доступного на интернет-ресурсе http://genome.ucsc.edu/. Поиск митохондриальных псевдогенов осуществлялся с помощью Blat-анализа с параметрами поиска, заданными по умолчанию. В качестве поискового запроса использовались полные последовательности митохондриальных генов atp6 и сохЗ. Полученные в результате последовательности скаффолдов, содержащих последовательности, гомологичные митохондриальным, были проанализированы с помощью программы BLAST с параметрами поиска, заданными по умолчанию. Последовательности, имеющие сходство с митохондриальной ДНК D. virilis, равное 99%, из дальнейшего анализа удалялись. Обнаруженные псевдогены

митохондриального

происхождения сравнивались вручную с последовательностями соответствующих митохондриальных генов.

Рисунок 6. Схемы Шрб и сохЗ псевдогенов митохондриального

происхождения в геноме мух £>. \irilis, построенные на основе анализа полного генома £>. уігііії.

I г»'

На рисунке 6 приведена схема аїрб и сохЗ псевдогенов митохондриального происхождения в геноме мух И. virilis. На схеме отражено соответствие обнаруженных митохондриальных псевдогенов с фрагментом митохондриального генома, содержащего гены Шрб и сохЗ, разделённых межгенным спейсером. Из представленной схемы видно, что в полном геноме мух £>. virilis имеется всего два Шрб псевдогена митохондриального происхождения, ассоциированных с ретротранспозоном

Tvl. atp6 псевдоген митохондриального происхождения, обозначенный D-01, является аналогом псевдогена митохондриального происхождения, обнаруженного нами экспериментально в Y-хромосоме мух D. virilis. atp6 псевдоген митохондриального происхождения, обозначенный D-02, не был найден нами экспериментально, поскольку не содержит сайта для отжига использованных праймеров. Митохондриальный псевдоген D-02 предположительно локализован в хромосоме VI, поскольку фланкирующий его участок имеет сходство с последовательностью хромосомы VI, равное 95%. Карты митохондриальных псевдогенов D-01 и D-02 приведены на рисунке 7.

Рисунок 7. Карты atp6 псевдогенов митохондриального происхождения и их генетического окружения в геноме мух D. virilis. (По данным анализа полного генома D. virilis).

Карта фрагмента Y-хромосомы обозначена D-01; карта фрагмента хромосомы VI обозначена D-02. Внизу указаны расстояния (п.н.) от начала длинного концевого повтора ретротранспозона Tvl, принятого за ноль.

Остальные типы митохондриальных псевдогенов, изображённые на рисунке 6, не имеют ассоциаций с ретротранспозоном Tvl и являются составными частями более крупных псевдогенов митохондриального происхождения с неизвестной локализацией в геноме. Исключение из них составляют митохондриальные псевдогены В-01, В-02, В-07, С-01, С-03 и С-5, представляющие собой одиночные фрагменты митохондриальной ДНК с неизвестной локализацией в ядерном геноме. Поскольку анализ всех митохондриальных псевдогенов не входил в задачи исследования, на схеме отражены лишь те фрагменты крупных псевдогенов митохондриального происхождения, которые гомологичны митохондриальным генам atp6 и сохЗ.

Филогенетический анализ псевдогенов митохондриального происхождения На рисунке 8 приведена реконструкция возникновения atp6 псевдогенов митохондриального происхождения в группе дрозофил virilis, выявленных как экспериментально, так и с помощью in silico анализа. Для построения данной филограммы были использованы последовательности митохондриальной ДНК и псевдогенов митохондриального происхождения дрозофил группы virilis длиной 180 п.н. Из приведённой филограммы видно, что atp6 псевдогены митохондриального происхождения D. virilis обладают наибольшим сходством с последовательностью соответствующего митохондриального гена D. virilis и образуют четыре кластера. atp6 псевдогены митохондриального происхождения, найденные в пересеваемой клеточной культуре D. virilis, практически идентичны митохондриальной ДНК D. virilis (их сходство с мтДНК составляет 99 - 100%) и формируют вместе с мтДНК единый кластер. Другой кластер образован сравнительно недавно возникшими

D-01

митохондриальными псевдогенами, не ассоциированными с ретротранспозоном Tvl, - А-05, А-06 и А-07. Отдельный кластер представлен atpó псевдогеном митохондриального происхождения, локализованным в Y-хромосоме мух D. virilis. На филограмме ему соответствуют две последовательности, одна из которых была получена с помощью in silico анализа (D-01), а другая -экспериментально (Dv40-numt). Судя по филограмме, данный atpó псевдоген митохондриального происхождения возник вскоре после дивергенции D. virilis от остальных дрозофил филады virilis, что также подтверждается отсутствием аналогичного псевдогена митохондриального происхождения в геномах D lummei, D. novamexicana, D. americana americana и D. americana texana. В четвёртый кластер вошли более древние митохондриальные псевдогены, не ассоциированные с ретртранспозоном Tvl, - В-01, В-02, А-01, А-03.

Рисунок 8. Филогенетическая реконструкция возникновения atpó псевдогенов митохондриального происхождения в группе дрозофил virilis.

Последовательности митохондриапьной ДНК разных видов дрозофил группы virilis обозначены двухбуквенным кодом (Во - Drosophila borealis, Vi - Drosophila virilis, Ez -

Drosophila ezoana, Fl - Drosophila flavomontana, Ka - Drosophila kanekoi, La - Drosophila ladeóla, Lt-N- Drosophila littoralis North population, Lt-S

- Drosophila littoralis South population, Lu -Drosophila lummei, Mo - Drosophila montana, No

- Drosophila novamexicana, Tx - Drosophila americana texana, Am - D. americana americana). В качестве внешней группы использовалсь митохондриальная ДНК D. melanogaster линии oregonR - Dm и D. yakuba -Dy.

Митохондриальные псевдогены, выделенные в данном исследовании из мух и пересеваемой клеточной культуры D. virilis, обозначены четырёхзначным обозначением через тире. Первые два знака обозначают тип опыта (см. рисунок 1), вторые два знака обозначают уникальный номер клона. Митохондриальные псевдогены, выделенные из мух D. lacicola и D. montana, обозначены La-numt и Mo-numt, соответственно.

" -мо-numt Митохондриальные псевдогены, выявленные

с помощью in silico анализа полного генома D. virilis, обозначены трёхзначным обозначением через тире (см. рисунок 6).

atpó псевдогены митохондриального происхождения, выявленные в геномах дрозофил D. montana и D. lacicola, оказались близки к соответствующим последовательностям митохондриальной ДНК этих видов. Скорее всего, они возникли вскоре после дивергенции D. montana и D. lacicola от ближайших видов D. borealis и D. flavomantana.

al-C2

— а2-С6

— а1-С8 Э1-С9 a1-C6 а2-С1 а2-С4

Vi

А-05 А-06 311 А-07

991 P-OI

I Dv40-numt -B-Ol

i А-01 9S1A-03

-Г

«П_Ia

771N

Интересно отметить, что указанные atp6 псевдогены митохондриального происхождения значительно различаются между собой в отличие от последовательностей митохондриального гена atpô, что позволяет предположить наличие ускоренной эволюции фрагментов митохондриальной ДНК в ядерном геноме дрозофил.

На рисунке 9 приведена реконструкция возникновения сохЗ псевдогенов митохондриального происхождения в группе дрозофил virilis, выявленных как экспериментально, так и с помощью in silica анализа. Из данной филограммы видно, что сохЗ псевдогены митохондриального происхождения D. virilis обладают наибольшим сходством с последовательностью соответствующего митохондриального гена D. virilis и образуют пять кластеров. Интересно отметить, что некоторые сохЗ псевдогены митохондриального происхождения, ассоциированные с ретротранспозоном Tvl в клеточной культуре (cl-17 и с2-01), оказались сходны с сохЗ псевдогенами митохондриального происхождения мух, не маркированными инсерцией ретротранспозона Tvl (А-05 и А-07). Это указывает на способность активно экспрессирующегося в пересеваемой

клеточной культуре D. virilis ретротранспозона Tvl маркировать не только недавние события интеграции митохондриальной ДНК в ядерный геном, но и более древние.

Рисунок 9. Филогенетическая реконструкция возникновения сохЗ псевдогенов

митохондриального происхождения в группе дрозофил virilis.

Последовательности митохондриальной ДНК разных видов дрозофил группы virilis обозначены двухбуквенным кодом (см. рисунок 8). В качестве внешней группы использовалась митохондриальная ДНК D. melanogaster линии oregonR - Dm.

Митохондриальные псевдогены, выделенные в данном исследовании, обозначены

четырёхзначным обозначением через тире. Первые два знака обозначают тип опыта (см. рисунок 5), вторые два знака обозначают уникальный номер клона.

Митохондриальные псевдогены, выявленные с помощью in silico анализа полного генома D. virilis, обозначены трёхзначным обозначением через тире (см. рисунок 6).

001

Идентификация транспозиционно-активного подсемейства

ретротранспозонов Ту1 в геноме О. утШ

На рисунке 10 приведено сравнение форм ДКП ретротранспозонов из геномов мух и пересеваемой клеточной культуры О. \irilis, полученных как с помощью т бШсо анализа, так и выявленных экспериментально по ассоциации с псевдогенами митохондриального происхождения, гомологичными митохондриальным генам Шрб и сохЗ. Ретротранспозон Ту1, ассоциированный с а1р6 псевдогеном митохондриального происхождения, локализованным в У-хромосоме мух уп-Шб, является одной из наиболее древних форм Ту1, обнаруженным в геноме Б. уЬШб. Выявленный в геноме пересеваемой клеточной культуры активно идущий процесс образования новых митохондриальных псевдогенов, ассоциированных с инсерциями ретротранспозона Ту1, позволяет выявлять транспозиционно-активные формы Т\1. Из 12 независимых инсерций Т\1, ассоциированных с псевдогенами митохондриального происхождения, 11 вызваны транспозицией только одной формы ретротранспозона, которая формирует молодое подсемейство ретротранспозонов. Все новые инсерции ретротранспозонов Т\1, за исключением двух, произошли в молодые митохондриальные псевдогены, возникшие в пересеваемой клеточной культуре, и только в двух случаях инсерция 7у7 произошла в микросателлит (АТ)„, ассоциированный со старыми сохЗ псевдогенами митохондриального происхождения, существующими в

Рисунок 10. Сравнение форм ДКП ретротранспозона Т\1 в геноме мух и пересеваемой клеточной линии £>. \irilis.

Название ДКП ретротранспозонов, ассоциированных с псевдогенами митохондриального происхождения,

включает обозначение экспериментально полученного клона с пометкой ЬТИ.. Разные формы ДКП ретротранспозонов Т\1, найденные в геноме О. чтШ с помощью анализа ¡и эШсо, обозначены как ЬТЯ с цифровой пометкой. Стрелками отмечены два типа длинных концевых повторов ретротранспозона 7\>/, соответствующих транспозиционно активным копиям 7\>/ в пересеваемой клеточной культуре.

Интересно отметить, что в одном из этих двух случаев это была инсерция одной формы 7\>/ из 11 родственных друг другу, а в другом случае произошла инсерция иной формы 7у/. Возникновение новых митохондриальных псевдогенов и транспозиции Ту1 выявлены только в пересеваемой клеточной культуре, но не обнаружены в первичной культуре

геноме мух, но без ассоциации с Ту1.

аІ-ві-ІТК т Ш-10-Ш «.'«-ОТ

«І-СШ» ЛІ-ЄШ»

им

аі-сі-т

сі-ЯШХ іШІЯ Ы-17Л2*

асІПкі

м—ш-о

-іт-г т-4 -ІЯМ

т-м

аІ-ІММЯЯ

клеток. Полученные данные позволяют сделать вывод об ослаблении контроля за ретротранспозицией в трансформированной культуре клеток D. virilis с неограниченным ростом. Специфические прямые дупликации длиной 40 п.н. в структуре промотора транспозиционно активного подсемейства ретротранспозонов Tvl, характерны для сайтов связывания стероидных гормонов. Наличие таких сайтов, возможно, определяет повышенный уровень транскрипции данного подсемейства Tvl в клетках пересеваемой культуры и определяет его способность к ретротранспозиции.

Сравнительный анализ фрагмента гена kl-2 1-beta (lynein heavy chain Y-хромосомы у дрозофил группы virilis и филогенетическая реконструкция порядка филиации в группе

С целью доказать потерю Y-хромосомы в трансформированной клеточной линии, мы выбрали и тестировали ген kl-2 1-beta dynein heavy chain в клеточной культуре и в геномах 12 видов дрозофил, образующих группу virilis. Виды дрозофил группы virilis представляют собой одну из хорошо изученных моделей видообразования и микроэволюции (Morales-Hojas et al., 2011). В настоящей работе была впервые изучена изменчивость последовательности ДНК Y-хромосомы у 12 видов дрозофил группы virilis для разрешения неопределённых аспектов филогенеза группы. Благодаря отсутствию рекомбинации генов, локализованных на Y-хромосоме, изучение изменчивости этих генов, обеспечивает особые возможности для определения порядка дивергенции в группе. Ген kl-2 1-beta dynein heavy chain был приобретён Y-хромосомой предка рода Drosophila перед разделением его на подроды Drosophila и Sophophora, произошедшего между 260 и 63 млн. лет назад (Koerich et al., 2008). У всех секвенированных видов Drosophila kl-2 ген остался связанным с Y-хромосомой за исключением D. pseudoobscura (Koerich et al., 2008). Был выполнен сравнительный анализ ПЦР фрагментов гена kl-2 всех 12 видов дрозофил группы virilis.

В полученном комплекте сиквенсов фрагментов гена kl-2 число нуклеотидных замен на сайт при попарном сравнении колеблется в десять раз от 0,005 в паре D. americana americana и D. americana texana до 0,051 в паре D. americana americana и D. borealis. Общая средняя дистанция для всей группы равна 0,036. Основываясь на этих данных, была построена медианная сеть гаплотипов Y-хромосомы группы virilis, с помощью программного обеспечения TCS (рисунок 11). TCS осуществляет оценку генных генеалогий на основе полиморфных последовательностей ДНК и строит медианную парсимониальную сеть взаимопревращений гаплотипов (Clement et al., 2000). Результаты, представленные на рисунке II, в общем соответствуют полученным ранее, основанным на сравнении мультилокусных данных (Morales-Hojas et al., 2011), в выявлении четырёх главных кластеров группы: филады D. virilis, филады D. montana, филады D. kanekoi и филады D. littoralis. Самый интересный момент касается определения порядка филиации филад. Мультилокусный анализ, основанный на 6 ядерных генах и 2

митохондриальных генах, показал, что последний общий предок группы имел голарктическое распространение, от которого североамериканские и евразийские линии эволюционировали от 7,5 до 8,9 млн лет назад. Были предложены и сравнены две конкурирующие эволюционные гипотезы (Morales-Hojas et al., 2011). Первая, простая консенсусная модель дерева для анализа мультилокусных данных, приводит к заключению, что D. kanekoi и D. ezoana образуют один кластер, a D. littoralis имеет более древнее происхождение. Более сложный метод, использующий многовидовую модель выравнивания (BEST), приводит к альтернативному заключению: D. kanekoi - это первый вид, отделившийся от общего предка этих трех видов. Это заключение подтверждается локализацией древнего ретротранспозона oíd Мбо-подобного ретроэлемента без ДКП, который имеется у D. littoralis и D. virilis, но отсутствует у D. kanekoi (Reis et al., 2008). Полученные в настоящей работе данные надёжно подтверждают первую эволюционную модель и показывают, что D. kanekoi и D. ezoana образуют один кластер. Кроме этого, ясно, что скорость фиксации нуклеотидных замен сильно отличается у разных видов, возможно, из-за различий в численности популяций. Маленькие островные популяции D. kanekoi из Японии эволюционируют значительно быстрее, чем большие континентальные популяции D. littoralis.

Рисунок 11. Медианная сеть гаплотипов Y-хромосомы дрозофил группы virilis, построенная с помощью программы TCS (Clement et al., 2000).

Реконструкция основана на нуклеотидном полиморфизме

фрагмента гена kl-2 (GenBank ID: KF600714 - KF600726). Длины ветвей пропорциональны

минимальному числу нуклеотидных замен, являющихся необходимыми для трансформации одного гаплотипа в другой. Если гаплотипы синонимичны, то указывается лишь один из них.

Различий между последовательностями kl-2 у разных лабораторных линий D. virilis не было выявлено. Это не удивительно, поскольку D. virilis представляет собой почти мономорфный вид (Mirol et al., 2008). Напротив, последовательности kl-2 двух линий D. littoralis из южно-кавказской популяции и из североевропейской популяции (Andrianov et al., 2010) отличаются. Южная популяция является предковой по отношению к северной популяции. Эти данные поддерживают сделанное ранее заключение о том, что южная популяция D. littoralis представляет собой отдельный вид - D. imeretensis.

Также не было обнаружено различий между последовательностями kl-2 D. borealis East population и D. flavomontana. Линии мух из D. borealis West

population были для нас недоступны. D. borealis включает в себя две разных формы: East population и West population. D. borealis East population является более близким родственником D. flavomontana, чем D. borealis West population (Morales-Hojas et al., 2011). Полученные данные позволяют предположить гибридное происхождение D. borealis East population. Эта форма может быть результатом гибридизации самца D. flavomontana с самкой D. borealis.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Псевдогены митохондриального происхождения, маркированные инсерцией ретротранспозона Tvl, выявлены у D. virilis, D.montana и D. lacicola. Все эти митохондриальные псевдогены менее сходны между собой, чем с предковой митохондриальной последовательностью гена своего вида. Согласно современным данным систематики (Morales-Hojas et al., 2011), формирование вида D. virilis и общего предка D.montana и D. lacicola от других видов группы происходило в миоцене: D. virilis — 4.1 млн. лет, D.montana и D. lacicola — 4.9 млн лет. Следовательно, возраст выявленных псевдогенов митохондриального происхождения не может быть больше этих цифр. Есть основания предполагать что он им равен, так как массовые перемещения ретротранспозонов обычно маркируют события видообразования (Sverdlov 2000; Evgen'ev et al., 2000). Если принять эти допущения, скорость накопления нуклеотидных замещений в митохондриальных псевдогенах равна 1.5% за миллион лет, что больше чем для соответствующих митохондриальных генов. Сравнительный анализ данных представленных на рисунке 8 также приводит к выводу о большей скорости накопления нуклеотидных замен в псевдогенах митохондриального происхождения в сравнении с соответствующим митохондриальным геном. В геноме D. virilis помимо древних форм псевдогенов митохондриального происхождения, некоторые представители которых маркированы инсерциями Tvl, существует ещё одна группа митохондриальных псевдогенов более недавнего происхождения, но уже без ассоциированных инсерций Tvl. Можно заключить, что фиксация инсерций Tvl происходит редко. Наличие свободных сайтов интеграции для ретротранспозона Tvl не лимитирует транспозиций Tvl. Стабильность генома мух резко контрастирует с геномом клеток пересеваемой культуры, в котором обнаруживается множество новых событий образования митохондриальных псевдогенов и массовая транспозиция Tvl в возникшие сайты интеграции. Интересно, что несмотря на наличие подходящих сайтов интеграции у старых копий псевдогенов митохондриального происхождения, инсерции Tvl проходят почти исключительно в новые сайты. Нам удалось детектировать только два случая инсерции Tvl в сайт вблизи старой копии сохЗ псевдогена митохондриального происхождения. Причины такой избирательности в настоящее время неизвестны. Для дальнйших исследований перспективным представляется изучение связи между образованием митохондриальных псевдогенов и трансформацией первичной культуры в пересеваемую. Сами по себе стрессовые условия в культуре клеток, вероятно, не приводят к возникновению новых псевдогенов митохондриального

происхождения. В наших экспериментах длительное, до года, существование первичной культуры с сохранением признаков дифференцировки у клеток, не приводит к возникновению новых митохондриальных псевдогенов, маркированых инсерциями Tvl.

С целью доказать потерю Y-хромосомы в трансформированной клеточной линии, мы выбрали и тестировали ген kl-2 1-beta dynein heavy chain в клеточной культуре и в геномах 12 видов дрозофил, образующих группу virilis. Помимо успешного решения поставленной задачи, выяснилось, что данный ген идеально подходит для реконструкции филогений у дрозофил. Универсальность одних и тех же праймеров для разных видов, чистота полученного ПЦР продукта, позволяющая секвенирование без клонирования и даже без очистки фрагмента ДНК, и удобный размер нуклеотидной изменчивости между видами дрозофил, делает этот ген перспективным дополнением Barcode видовой диагностики дрозофил.

ВЫВОДЫ

1. В геноме мух D. virilis обнаружен atpó псевдоген митохондриального происхождения локализованный в Y-хромосоме, идентичный у всех изученных линий мух D. virilis из природных популяций. Псевдогены митохондриального происхождения, маркированные инсерцией ретротранспозона Tvl, выявлены у D. virilis, D.montana и D. lacicola.

2. В пересеваемой клеточной культуре D. virilis возникли новые копии псевдогенов митохондриального происхождения, гомологичные генам atpó и сохЗ, в ассоциации с ретротранспозоном Tvl в прямой и обратной ориентациях. Вследствие утраты Y-хромосомы клеточной культурой в ходе культивирования, atpó псевдоген митохондриального происхождения, характерный для генома мух, в культуре клеток отсутствует.

3. Новые инсерции ретротранспозона Tvl в пересеваемой клеточной культуре маркируют не только недавно возникшие atpó и сохЗ псевдогены митохондриального происхождения, но и аналогичные более старые псевдогены митохондриального происхождения, общие у мух и у клеток пересеваемой культуры. В геноме мух эти псевдогены митохондриального происхождения не ассоциированны с ретротранспозоном Tvl.

4. Филогенетический анализ инсерций ретротранспозона Tvl в псевдогены митохондриального происхождения выявил два функционально активных подсемейства ретротранспозонов Tvl.

5. Последовательность гена kl-2 1-beta dynein heavy chain Y-хромосомы является удобным маркером для филогенетических реконструкций. Построенная на его основе филогения дрозофил группы virilis позволила уточнить порядок филиации в группе. D. kanekoi и D. ezoana образуют один кластер, D. littoralis имеет более древнее происхождение. Последовательности гена kl-2 двух линий D. littoralis из южно-кавказской

популяции и из североевропейской популяции отличаются, что подтверждает предположение о том, что южная популяция D. littoralis представляет собой подвид D. littoralis — D. littoralis imeretensis.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 . Романов, Д. А. Митохондриальные последовательности в ядерном геноме животных / Д. А. Романов, Б. В. Андрианов // Успехи современной биологии. — 2013. - Т. 133. - № 3. - С. 254—268.

(Romanov, D. A. Studies of Mitochondrial Sequences in the Naclear Genome of Animals / D. A. Romanov, В. V. Andrianov // Biology Bulletin Reviews. - 2013. -Vol. 3. - No. 6. - P. 439-450.)

2 . Андрианов, Б. В. Перенос митохондриальной ДНК в ядерный геном клеток пересеваемой клеточной линии Drosophila virilis / Б. В. Андрианов, Д. А. Романов, Т. В. Горелова, С. Ю. Сорокина, И. А. Захаров-Гезехус // Генетика. -2013. - Т. 49. -№ 6. - С. 788-792.

(Andrianov, В. V. Transfer of Mitochondrial DNA to Nuclear Genome of Cells of Passaged Cell Line of Drosophila virilis / В. V. Andrianov, D. A. Romanov, Т. V. Gorelova, S. Yu. Sorokina, I, A. Zakharov-Gezekhus // Russian Journal of Genetics. - 2013. - Vol. 49. - No. 6. - P. 685-689.)

3. Sorokina, S. Y. Transfer of mitochondrial DNA fragments into the nuclear genome in flies and cell line of D.virilis / S. Y. Sorokina, D. A. Romanov, В. V. Andrianov, I. A. Zakharov // 54th Annual Drosophila Research Conference Washington, DC. -April 3-7.-2013. - P. 168. - 525C.

4. Романов, Д. А. Изучение полиморфизма фрагментов митохондриальной ДНК в ядерном геноме Drosophila virilis / Д. А. Романов, Т. В. Горелова, С. Ю. Сорокина, Б. В. Андрианов // Актуальные проблемы биологической и химической экологии. — сб. М.: Изда-во МГОУ. — 2012. — С.57-59.

5. Sorokina, S. Y. Intraspecific structure of D. littoralis Meigen (Diptera: Drosophilidae) / S. Y. Sorokina, В. V. Andrianov, D. A. Romanov, P. A. Proshakov, V. G. Mitrofanov // 53rd Annual Drosophila Research Conference. - Chicago, IL. -March 7 - March 11.-2012.-P.270.-518B.

Публикации, отмеченные ( ) опубликованы в журналах, соответствующих перечню ВАК.

Подписано в печать 12 ноября 2013 г. Объем 1,0 усл. п. л. Тираж 100 экз. Отпечатано в типографии «Реглет». Заказ № 250 119526 г. Москва, пр-т Вернадского, д. 39 www. reglet. Ru, тел. +7 495 363 78 90

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Романов, Денис Александрович, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук

На правах рукописи

04201451656 Романов Денис Александрович

ИЗУЧЕНИЕ ИЗМЕНЧИВОСТИ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ ОБРАЗОВАНИЯ ПСЕВДОГЕНОВ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ В ГЕНОМЕ ДРОЗОФИЛ

по специальности 03.02.07- генетика Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

научный руководитель работы:

доктор биологических наук / Б.В. Андрианов /

Москва - 2013

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА

Сокращения:

мтДНК - митохондриальная ДНК

сохЗ - митохондриальный ген субъединицы цитохром с оксидазы atpó - митохондриальный ген субъединицы АТФ-синтазы gag - ген белка капсида вирусоподобной частицы pol - ген белка полимеразы

env - ген белка оболочки вирусоподобной частицы ДКП - длинные концевые повторы ВПЧ - вирусоподобные частицы

Numt - аббревиатура выражения (nuclear mitochondrial DNA) ПДРФ - полиморфизм длин рестриктных фрагментов

Ключевые слова:

Митохондриальная ДНК, митохондрии, имт/-последовательности, видообразование, ДНК-маркеры, группа утШ, ОгоБоркПа, ретротранспозоны, молекулярная филогения.

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА.....................................2

1. ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................6

1.1 Актуальность темы исследования........................................................................6

1.2. Степень разработанности темы исследования...................................................9

1.3. Цели и задачи исследования...............................................................................10

1.4. Научная новизна..................................................................................................11

1.5. Теоретическая и практическая значимость работы.........................................12

1.6. Положения, выносимые на защиту....................................................................13

1.7. Апробация результатов диссертации................................................................13

1.8. Объем и структура диссертации........................................................................14

1.9. Благодарности......................................................................................................14

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................................15

2.1. Открытие митохондриальных последовательностей в ядерном геноме методом гибридизации нуклеиновых кислот..........................................................15

2.2. Терминологическое отступление.......................................................................19

2.3. Исследования пит1-последовательностей методами ПЦР..............................21

2.4. Изучение ишя/-последовательностей в постгеномную эру............................28

2.5. Изменчивость яит^-последовательностей у позвоночных и насекомых......31

2.6. Избирательная ПЦР амплификация nwmí-последовательностей и современная систематика..........................................................................................33

2.7. Старение млекопитающих связано с инсерциями numt-последовательностей в соматических клетках.............................................................................................36

2.8. Инсерции ««^-последовательностей вызывают наследственные заболевания у человека..............................................................................................38

2.9. Вирусные инфекции и активность ретротранспозонов могут индуцировать инсерции ««/^/-последовательностей.......................................................................40

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.....................................................................................46

3.1. Объекты исследования........................................................................................46

3.2. Выделение тотальной ДНК из имаго дрозофил...............................................47

3.3. Выделение плазмидной ДНК.............................................................................47

3.4. ПЦР амплификация и клонирование ДНК.......................................................48

3.5. Биоинформационный анализ..............................................................................50

3.6. Получение первичной эмбриональной клеточной линии...............................51

4. РЕЗУЛЬТАТЫ............................................................................................................52

4.1. Выделение и характеристика фрагментов митохондриальной ДНК из ядерного генома дрозофил группы virilis и пересеваемой клеточной культуры D. viril is.............................................................................................................................52

4.2. In silico анализ иит^-последовательностей, гомологичных митохондриальным генам atp6 и сохЗ, полного генома D. virilis линии Dv 149.75

4.3. Филогенетический анализ иитМгоследовательностей...................................79

4.4. Идентификация транспозиционно активного подсемейства ретротранспозонов Tvl в геноме!), virilis.................................................85

4.5. Сравнительный анализ фрагмента гена kl-2 1-beta dynein heavy chain Y хромосомы у дрозофил группы virilis и филогенетическая реконструкция порядка филиации в группе.......................................................................................88

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..............................................................................................................93

ВЫВОДЫ........................................................................................................................98

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ..........................................................100

СПИСОК ЦИТИРУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ............................................................102

ПРИЛОЖЕНИЕ............................................................................................................120

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1 Актуальность темы исследования

Митохондриальные последовательности в ядерном геноме выявлены у всех изученных к настоящему времени эукариотических организмов. Впервые их обнаружили с помощью методов гибридизации нуклеиновых кислот и рестрикционного анализа. В течение долгого времени полученные данные рассматривались лишь как частные случаи, которые не имеют общебиологического значения. Ситуация изменилась, когда начались многочисленные работы с митохондриальной ДНК методами ПЦР и были получены первые полные геномы эукариотов. Во-первых, обнаружение множества фрагментов митохондриальной ДНК в составе хромосом не оставило места сомнениям относительно реальности переноса ДНК из митохондрий в ядро. Во-вторых, получила окончательное признание теория симбиотического происхождения эукариотической клетки и, в частности, происхождения митохондрий от альфа-протеобактерий (Lang et al., 1999; Adams, Palmer, 2003). В рамках этой теории закономерен постоянно идущий процесс переноса ДНК из изолированных геномов органелл, лишённых рекомбинации, в ядерный геном. Фрагменты митохондриальной ДНК в ядерном геноме получили название "numts"

(nuclear mitochondrial DNA), или ««//^-последовательности. Numt-последовательности в геномах эукариотов встречаются с различной частотой: от нескольких единиц до нескольких тысяч на геном (Hazkani-Covo et al., 2010). Кроме того, размер ««///¿-последовательностей также различен, и варьирует от нескольких десятков до нескольких тысяч п.н. У медоносной пчелы {Apis mellifera) ««////-последовательности имеют суммарную длину 172 т.п.н., в то время как у арабидопсиса (.Arabidopsis thaliana) имеется ««/^/-последовательность, представляющая собой частично дуплицированный митохондральный геном. Её размер составляет 620 т.п.н. (Hazkani-Covo et al., 2010). Механизмы возникновения ««////-последовательностей различны. Наиболее вероятно непосредственное встраивание фрагментов митохондриальной ДНК в места двойных разрывов хромосом по механизму негомологичной рекомбинации (Blanchard, Schmidt, 1996), хотя и возможно наличие этапа обратной транскрипции РНК, считанной с митохондриальных генов (Gellissen, Michaelis, 1987). Отсутствие единого механизма возникновения и очевидной клеточной функции позволяет рассматривать ««////-последовательности как молекулярные ископаемые и использовать для филогенетических реконструкций и уточнения систематического статуса близкородственных видов. В последнее время появились данные, позволяющие по-новому взглянуть на феномен ««mi-последовательностей. Получены доказательства возникновения новых копий ««////-последовательностей в соматических клетках, причем этот процесс резко активизируется в трансформированных клетках при некоторых вирусных

инфекциях, подавлении клеточного дыхания и при действии ионизирующего излучения. Эти открытия позволяют рассматривать динамику формирования тгт/-последовательностей как чувствительный генетический маркёр геномной нестабильности, и ставит изучение иши/-последовательностей в ряд приоритетных биомедицинских исследований.

Многими исследователями отмечалась ассоциация шш?/-последовательностей с ретротранспозонами (Hadler et al., 1998; Mishmar et al., 2004; Mularoni et al., 2012; Tsuji et al., 2012). У дрозофил группы virilis имеется функционально-активное семейство ретротранспозонов Tvl. Tvl относится к суперсемейству gypsy (Andrianov et al., 1999). Ретротранспозон Tvl обладает свойством сайт-специфично встраиваться в область микросателлитных повторов (ТА)П. Спейсерная область между митохондриальными генами atpó и сохЗ у дрозофил группы virilis содержит такой микросателлитный повтор, что позволит выявлять ш*т/-последовательности в ядерном геноме, если они маркированы инсерцией ретротранспозона Tvl. (Andrianov et al., 2010). Эти данные позволили спланировать и провести более подробное исследование numt-последовательностей у дрозофил группы virilis.

Группа близкородственных видов дрозофил virilis состоит из 12 видов, морфологически слабо различимых. Согласно современным данным, эта группа разделяется на четыре филады: virilis (.D. virilis, D. lummei, D. novamexicana, D. americana americana, D. americana texana), montana (D. montana, D. lacicola, D. flavomontana и D. borealis), kanekoi (D. kanekoi, D. ezoana) и littoralis (D. littoralis)

(Morales-Hojas et al., 2011). В настоящее время данная группа является активно изучаемым модельным объектом для изучения процессов микроэволюции и видообразования.

В данном исследовании проведено сравнительное изучение numt-последовательностей мух и клеточной культуры Drosophila virlilis. Изучена ассоциация ««/«/-последовательностей с ретротранспозрном Tvl и определены возможности ««////-последовательностей как филогенетических маркёров у дрозофил.

1.2. Степень разработанности темы исследования

Наибольшее внимание привлекают ««»//-последовательности млекопитающих (особенно приматов) и насекомых. Большинство исследований numt-последовательностей основано на биоинформационном анализе полных геномов. Ряд работ сочетают биоинформационный анализ с экспериментальным выделением ««/«/-последовательностей (Mishmar et al., 2004; Ricchetti et al., 2004; Sawamura et al., 2008; Nergadze et al., 2010). Недавно показана активизация процесса образования ««////-последовательностей при старении и в опухолевых клетках позвоночных (Саго et al., 2010; Muradian et al., 2010). Число исследований, посвященных изучению ««/^/-последовательностей дрозофил, в настоящее время невелико (Sawamura et al., 2008; Rogers, Griffiths-Jones, 2012). Анализ numt-

последовательностей в клеточной культуре дрозофил проводился впервые. Представленные в работе данные являются оригинальными.

1.3. Цели и задачи исследования

1. Изучение «^/-последовательностей как маркёров геномной нестабильности в клеточной культуре.

2. Изучение ассоциаций ««^-последовательностей с ретротранспозоном Ту1, специфичным для дрозофил группы VтШ.

3. Изучение возможности реконструкции филогенетических связей у дрозофил на основе анализа изменчивости ««/^/-последовательностей.

Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

1) изучить состав и особенности ««/^/-последовательностей в первичной и пересеваемой клеточных линиях £>. уМИб и в геноме дрозофил, образующих группу virilis;

2) провести т яШсо анализ ««//^-последовательностей на основе полного генома £). утШ и описать ассоциации ««/^-последовательностей с ретротранспозоном Ту1;

3) определить характер нуклеотидной изменчивости ««/^/-последовательностей в группе virilis;

4) уточнить порядок филиации в группе virilis на основе анализа изменчивости последовательности фрагмента гена kl-2 1-beta dynein heavy chain Y-хромосомы;

5) провести реконструкцию филогенетических связей дрозофил группы virilis на основе анализа изменчивости ««////-последовательностей.

1.4. Научная новизна

Впервые проанализирована изменчивость ««////-последовательностей у мух, в первичной и в пересеваемой клеточных культурах D. virilis.

Впервые показано возникновение новых копий ««/^/-последовательностей в пересеваемой клеточной культуре D. virilis.

В данной работе получены данные, указывающие на высокую степень изменчивости ««////-последовательностей после их интеграции в хромосомы, что противоречит представлению о них как о "молекулярных ископаемых".

На основе анализа изменчивости последовательности фрагмента гена kl-2 1-beta dynein heavy chain Y-хромосомы получены данные, позволяющие уточнить филогентическую структуру дрозофил группы virilis. В частности, показано, что D. kanekoi и D. ezoana образуют единый кластер, a D. littoralis имеет более древнее происхождение; получено подтверждение разделения вида D. littoralis на два подвида - D. littoralis littoralis и D. littoralis imeretensis.

1.5. Теоретическая и практическая значимость работы

Разработанный метод выделения ««/^/-последовательностей может быть применён к тем видам животных, которые имеют активно перемещающиеся семейства ретротранспозонов. Полученные результаты вносят вклад в фундаментальные исследования по генетике геномной нестабильности в клеточных культурах животных. Описание и анализ ««/^/-последовательностей дрозофил группы у/п/« позволили получить новые данные для изучения эволюции фрагментов митохондриальной ДНК в ядерном геноме. Результаты работы вносят вклад в фундаментальные исследования по молекулярной генетике, разрабатываемые на дрозофиле в качестве модельного объекта. Полученные данные важны для исследований в области изучения стабильности генома и биологии старения.

Результаты работы могут быть применены в исследованиях, проводимых ,в учреждениях системы РАН: в Институте Общей генетики РАН, Институте Молекулярной биологии РАН, Институте Биологии развития РАН, Институте Биологии гена РАН, Институте комплексного освоения природных ресурсов РАН. Результаты работы могут быть применены в исследованиях, проводимых в учреждениях системы РАСХН: Всероссийском научно-исследовательском институте генетики и разведения сельскохозяйственных животных РАСХН, Всероссийском научно-исследовательском институте охотничьего хозяйства и звероводства РАСХН.

1.6. Положения, выносимые на защиту:

• В клетках пересеваемой культуры ускоряется перенос митохондриальной ДНК в ядро с образованием «ига/-последовательностей.

• Новые инсерции ретротранспозона Tvl в пересеваемой культуре клеток происходят преимущественно, но не исключительно, в последовательности недавно возникших «wrai-последовательностей.

• Результат переноса фрагментов митохондриальной ДНК, содержащих гены atp6 и сохЗ, в ядро может быть обнаружен по инсерциям ретротранспозона Tvl в область (АТ)П микросателлита, локализованного в межгенном спейсере atp6 и сохЗ у дрозофил группы virilis.

1.7. Апробация результатов диссертации

Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях:

• Svetlana Y. Sorokina, Denis A. Romanov, Boris V. Andrianov, Ilya A. Zakharov // 54th Annual Drosophila Research Conference Washington, DC April 3-7. 2013. P.168. 525C.

• Романов Д.А., Горелова T.B., Сорокина С.Ю., Андрианов Б.В. // Актуальные проблемы биологической и химической экологии: сб. М.: Изда-во МГОУ, 2012. С.57-59.

• Svetlana Y. Sorokina, Boris V. Andrianov, Denis A. Romanov, Prohor A. Proshakov, Vladimir G. Mitrofanov // 53rd Annual Drosophila Research Conference. Chicago, IL. March 7 - March 11. 2012. P. 270. 518B.

1.8. Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, заключения, выводов, списка литературы по теме диссертации, списка цитируемой литературы, в который входит 123 ссылок. Работа проиллюстрирована 1 таблицей и 16 рисунками.

1.9. Благодарности

В заключение я хочу поблагодарить Андрианова Бориса Витальевича, который споспешествовал моему научному развитию. Я весьма признателен рецензентам Блехман Алле Вениаминовне и Евгеньеву Михаилу Борисовиичу, а также Захарову-Гезехусу Илье Артемьевичу и Сорокиной Светлане Юрьевне за их ценные советы и указания. Я также благодарен всем сотрудникам лабораторий сравнительной генетики животных и генетики насекомых за оказание разносторонней помощи и поддержки.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Открытие митохондриальных последовательностей в ядерном геноме методом гибридизации нуклеиновых кислот

Первые данные о существовании собственной ДНК у митохондрий разных организмов стали накапливаться с 60-х годов XX века (Rabinowitz et al., 1965; Schneider, Kuff, 1965; Dawid, 1965; Dawid, 1966; Kroon et al., 1966; Clayton et al:, 1968; Villa, Storck, 1968; Brunk, Hanawalt, 1969). Вскоре после обнаружения собственной ДНК в митохондриях появились первые работы, в которых изучалась перекрёстная гомология между митохондриальной и ядерной ДНК (du Buy, Riley, 1967; Dawid, Wolstenholme, 1968; Kung et al., 1972; Storti, Sinclair, 1974). В этих исследованиях было показано наличие гомологичных участков в ДНК митохондрий и ядер. Сделанное открытие интерпретировалось по-разному. В одних работах был сделан вывод о наличии в ядре коротких нуклеотидных последовательностей, представленных большим количеством копий в ДНК хромосом, которые в некоторой степени комплементарны митохондриальной ДНК (du Buy, Riley, 1967). В других работах было сделано предположение о возможном присутствии в ядерной ДНК "оригинала" ("master сору") митохондриальной ДНК (Dawid, Wolstenholme, 1968; Storti, Sinclair, 1974).

Впервые предположение о существовании переноса генов из митохондрий в ядро было высказано ван де�