Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Поиск изоформы церулоплазмина человека, способной локализоваться в митохондриях
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Поиск изоформы церулоплазмина человека, способной локализоваться в митохондриях"
САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
ПОИСК ИЗОФОРМЫ ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБНОЙ ЛОКАЛИЗОВАТЬСЯ В МИТОХОНДРИЯХ
03 00 04 — биохимия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
На правах рукописи
КЛОТЧЕНКО
Сергей Анатольевич
САНКТ-ПЕТЕРБУРГ
2008
Работа выполнена в Отделе молекулярной генетики НИИ экспериментальной медицины (НИИЭМ РАМН) и на кафедре биофизики физико-механического факультета Санкт-Петербургского государственного политехнического университета (СПбГПУ)
Научный руководитель
доктор биологических наук, доцент Надежда Васильевна Цымбалснко
Научный консультант
кандидат физико-математических наук, Алексей Николаевич Скворцов
Официальные оппоненты
доктор биологических наук, профессор Владимир Николаевич Кокряков
доктор биологических наук, профессор Вадим Петрович Комов
Ведущее научное учреждение
Петербургский институт ядерной физики имени Б П Константинова (ПИЯФ РАН)
Защита состоится «А9 » Щция 2008 г в ■(£ часов на заседании совета Д 212 232 09 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу 199034 Санкт-Петербург, Университетская набережная, д 7/9
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им А М Горького Санкт-Петербургского государственного университета (199034 Санкт-Петербург, Университетская набережная, д 7/9)
Автореферат разослан « / 7 » МлЛ 2008 г
Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук
Л С Курилова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Нарушения обмена меди как экологического, так и наследственного характера приводят к развитию тяжелых заболеваний К ним, помимо болезней, связанных с врожденными ошибками обмена меди, относятся ацерулоплазминемия, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, сердечнососудистые заболевания, остеопороз, рак, прионные болезни (Llanos&Mercer, 2002, Brown, 2003, Bush et al, 2003, Gaggelh et al, 2006, Tôrsdottir et al, 2006) При всех этих заболеваниях наблюдают дисфункцию митохондрий, природа которой остается неизвестной В последнее время было обнаружено, что избыток или недостаток {Pang&Chau, 1999, Gybina&Prohaska, 2003) ионов меди в клетке вызывает апоптоз, опосредованный митохопдриальными белками семейства Bcl-2 (Wei et al, 2001) Показано, что медь-индуцированный апоптоз связан с внутриклеточным перераспределением меди (Pang&Chau, 1999), то есть с ее транспортом, который осуществляют пока не идентифицированные переносчики Выявление этих белков и установление их биологической роли должно способствовать пониманию механизма медь-индуцированного апоптоза, который, с одной стороны, вызывает гибель нейронов и приводит к развитию нейродегенеративных заболеваний, а с другой — осуществляет санитарную функцию в отношении клеток с нарушенной системой сигнальной трансдукции, у которых, вероятно, повышена чувствительность к изменению статуса меди На последнее указывают факты, демонстрирующие, что медь-органические комплексы в наномолярных концентрациях специфично индуцируют митохондрий-опосредованный апоптоз в линиях клеток, полученных из опухолей, но не в их нормальных гомологах ( Viola-Rhenals et al, 2006)
Ранее в Отделе молекулярной генетики НИИЭМ РАМН было показано (Васин и др, 2005), что в митохондриях крысы присутствует церулоплазмин-подобный белок, который образуется в результате транскрипции с промотора, расположенного в З'-области интрона 2 гена церулоплазмина (ЦП), основного медьсодержащего белка плазмы крови позвоночных, обладающего свойствами ферроксидазы и также являющегося донором меди для клеток негепатоцитарных рядов По своим структурным свойствам митохондриальная изоформа ЦП (мтЦП) крысы могла бы участвовать в локальном метаболизме железа и/или распределении меди между цитозолем и митохондриями (Huang et al, 2006) В хромосомном гене ЦП человека ,
информация для формирования мтЦП путем альтернативной транскрипции нами не обнаружена По современной концепции структурно-функциональной организации геномов высших эукариот белок, выполняющий важную функцию, сохраняется у всех видов, при этом допускается, что он может образовываться различными путями (ОеШет с/ о/, 2007) Поэтому до изучения биологической роли мтЦП мы считали необходимым убедиться, что он есть более чем у одного вида млекопитающих
Представленная работа посвящена поиску и характеристике мтЦП человека Она запланирована и выполнена с учетом актуальности изучения механизмов, обеспечивающих гомеостаз меди у млекопитающих, и определения потенциальной роли мтЦП в локальном метаболизме меди и железа, нарушение которого является причиной многих тяжелых заболеваний ЦНС
Цель работы состояла в поиске и характеристике изоформы ЦП человека, способной локализоваться в митохондриях
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи
1) создать алгоритм для компьютерного поиска последовательностей, потенциально кодирующих ЦП митохондриальной локализации, и осуществить поиск и анализ таких последовательностей в геноме человека,
2) провести внутрипопуляционный анализ изменчивости участка псевдогена ЦП (уСр) человека, кодирующего вычисленный мтЦП,
3) испытать способность возникающего в \|/ЦП (продукте трансляции уСр) сигнала доставки белков в митохондрии (СДБМ) импортировать полипептиды в митохондрии,
4) осуществить поиск продуктов транскрипции и трансляции потенциально функционального участка уСр,
5) изучить экспрессию мтЦП крысы в органах, различающихся статусом меди, чтобы получить первоначальные сведения о возможной биологической роли ЦП, локализованного в митохондриях у млекопитающих
Научная новизна полученных результатов. Все представленные в работе результаты являются новыми Так, впервые в геноме человека и шимпанзе в псевдогенах ЦП, расположенных на синтенных хромосомах, аннотирована последовательность, соответствующая СДБМ Показано, что последовательность уСр содержит все элементы, характерные для эукариотического гена класса II Также
продемонстрировано, что промоторная и структурная области уСр, предположительно кодирующего ЦП-подобный белок митохондриальной локализации, характеризуются высокой внутрипопуляционной консервативностью К тому же предсказанный СДБМ обеспечивает импорт слитого с ним зеленого флуоресцирующего белка в митохондрии Помимо этого в культивируемых клетках человека с помощью ОТ-ПЦР анализа и методом иммуноблотинга выявлены транскрипционные и трансляционные продукты участка уСр В экспериментах in vivo на лабораторных животных показано, что экспрессия мтЦП носит тканеспецифический характер, изменяется в течение онтогенеза, снижается в условиях дефицита меди в составе ЦП крови и при нарушении обмена меди, вызванном экспериментальным фибриллогенезом
Научно-практическое значение полученных результатов. Выявление экспрессирующегося участка уСр расширяет представления об организации генома человека Обнаружение новой внутриклеточной изоформы ЦП способствует пониманию роли митохондрий в распределении меди в клетке Установление связи между экспрессией мтЦП и метаболизмом меди помогает понять, как соотносится статус меди в организме с ролью митохондрий в развитии заболеваний, обусловленных нарушениями обмена меди
Основные положения, выносимые на защиту:
1 уСр человека кодирует белок, содержащий на N-конце последовательность, которая соответствует СДБМ Вычисленный полипептид на 93 % идентичен фрагменту зрелого ЦП на участке Asp703-Glu979
2 Внутри популяции участок генома, занимаемый уСр, характеризуется очень низкой частотой полиморфизмов
3 СДБМ уЦП функционален — он переносит в митохондрии слитый с ним зеленый флуоресцирующий белок
4 Культивируемые клетки человека (HuTu 80 и Нер G2) содержат продукты транскрипции уСр и полипептиды, по антигенности, размеру и внутриклеточной локализации соответствующие предполагаемому мтЦП
5 У крысы мтЦП экспрессируется преимущественно в мозге и печени, а также в клетках инволирующей молочной железы У крыс с низким содержанием оксидазного ЦП в крови (Ag-крысы, получавшие с пищей хлорид серебра) мтЦП не формируется
У крыс с фибриллогенезом, экспериментально вызванным введением в желудочек
мозга пептида ß-амилоида, формирование мтЦП нарушается в мозгу, но не в печени
Апробация результатов работы. По теме диссертации опубликовано шесть
статей в рецензируемых журналах, приведенных в списке ВАК Результаты работы
представлены в форме устных докладов и стендовых сообщений на Международной
конференции BIFI «Биология после генома физический взгляд» в Сарагосе (Испания,
февраль 2004г), Международных конгрессах по генетике человека— в Праге
(Чехия, май 2005 г) и Ницце (Франция, июнь 2007 г), 8-й, 9-й, 10-й и 11-й
Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология— наука XXI века»
(2004—2007 гг), 17-й Европейской конференции молодых ученых по биологии и
медицине в Берлине (Германия, октябрь 2006 г)
Личный вклад соискателя. Создание алгоритма теоретического поиска,
выбор экспериментальных подходов, получение основной части результатов, их
обсуждение и написание статей выполнены соискателем Секвенирование и
конфокальная микроскопия осуществлены к б н Бабичем В С в биохимической
лаборатории Национального института медицинских исследований (Лондон,
Великобритания) Трансфекция клеток Hep G2 проводилась совместно с в н с
Отдела биохимии НИИЭМ РАМН к б н Диже Э Б Образцы ДНК человека
предоставлены к б н Гюлихандановой НЕ и к м н Мищенко Е Б Они были
получены ими в период выполнения кандидатских диссертаций в НИИЭМ РАМН
Структура диссертации. Диссертация содержит разделы «Введение», «Обзор
литературы», «Материалы и методы», «Результаты и их обсуждение», «Заключение»,
«Выводы» и «Список цитируемой литературы», включающий 198 иностранных и 24
отечественных источника Диссертация изложена на 139 страницах Результаты
представлены в 9 таблицах и иллюстрированы 34 рисунками
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использованы 117 образцов ДНК человека, беспородные белые крысы, крысы линии Вистар (питомник «Рапполово», Ленинградская область) и их потомство, полученное в виварии НИИЭМ РАМН, культивируемые клетки человека линий Hep G2, HuTu 80 и НЕК-293, кроличьи антитела к зеленому флуоресцирующему белку, а также к ЦП крови человека и крысы, полученные к электрофоретически чистым препаратам этих белков, вторые антитела сыворотки крови козла против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена, фирмы "Amersham" (Великобритания), штамм £ coli DH5-a, плазмидный вектор pEGFP-N3, рестрикционные эндонуклеазы EcoRl, ВатН], Sali и Mnll, ДНК-лигаза фага Т4 фирмы «Сибэнзим» (Новосибирск), реактивы для электрофореза в агарозном и полиакриламидном гелях фирмы "Sigma" (США)
Экспериментальные методы.
ДНК из лейкоцитов периферической крови человека, ядерную и цитозольную ДНК из клеток молочной железы крысы экстрагировали смесью фенол — хлороформ из соответствующих переваров протеиназы К Полученные препараты анализировали с помощью электрофореза в 0,8—2 % агарозном геле Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрическим методом Выделение плазмидной ДНК проводили методом щелочного лизиса с последующей очисткой равновесным ультрацентрифугированием в градиенте плотности CsCl (Sambrook et al, 1989) Конструирование, клонирование и анализ рекомбинантной ДНК проводили согласно стандартным процедурам (Sambrook etal, 1989)
Тотальную РНК изолировали с использованием реактива "TRIzol Reagent" в полном соответствии с инструкцией производителя Полученные препараты РНК (А260/180 = 1,9) по данным электрофореза в 1 % агарозном геле не содержали примесей ДНК и продуктов деградации РНК Концентрацию РНК выравнивали по содержанию 28S рРНК
Гепь-электрофорез ПЦР-продуктов и их рестрикционных фрагментов проводили в 1 % агарозе типа V или в 8 % ПААГ, гели окрашивали соответственно бромистым этидием или AgNCb (Sambrook et al, 1989) В качестве маркеров использовали ДНК-маркеры молекулярных весов 100—1000 п н и 250—10000 п н фирмы «Сибэнзим» (Новосибирск)
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили, как описано ранее (Платонова и др, 2004) Синтез кДНК в реакции обратной транскрипции (ОТ) проводили на тотальной РНК со случайными праймерами или олиго(с!Т)-затравкой, как описано ранее (Васин и др, 2004) ПЦР на полученной кДНК проводили со специфическими праймерами для амплификации предположительно транскрибируемого участка \|iCp использовали прямой 5'-22CTTCACCTCTCTAATGTGACCTTTC'"í-3' и обратный 5'-
10"AGTTTCCTTCTGGGATTGAATACTT1059-3' праймеры, Tolwa 57 °С, длина продукта 1062 п н, для выявления последовательности уСр, потенциально кодирующей СДБМ, использовали прямой 5'-GCAGTCGAC308ATGAGAATGAGGGTTTACTCCTG"°-3' и обратный 5'-GATGGATCC553TGCGATATAGTATGTCCTCTCTCC"°-3' праймеры, Т„т*,„а 62 "С, длина продукта 264 п н, для амплификации 5'-участка мРНК мтЦП крысы использовали прямой 5'-9047TTCCTTCAACTATGTTCAAATGTGCTCCTT<")76-3' и обратный
5,_10205(764)TCATTGTCTTTATCGACTTTCTCTGGTTCA10I76(735)_3, праймерЫ) 6Q с>с>
длина продукта 414 п н Последовательности праймеров для выявления ЦП, ГФИ-ЦП (ЦП, связанного с плазматической мембраной через гликозилфосфатидилинозитоловый якорь) и ß-актина использовали, как описано ранее (Васин и др, 2005), последовательности 17-ти пар праймеров для исследования 5'-нетранскрибируемой области гена ЦП человека описаны в кандидатской диссертации Гюлихандановой Н Е (НИИЭМ РАМН, 2004) Праймеры и условия для ПЦР подбирали с помощью программы "Gene Runner 3 0"
Фрагменты ДНК, предназначенные для секвенирования, очищали с помощью гель-электрофореза в 0,7 % легкоплавкой агарозе, затем элюировали и секвенировали автоматически на 96-капнллярном ссквенаторе "MegaBACE 1000" фирмы "Amersham" (Великобритания)
Выделение субклеточных фракций из гомогената клеток, приготовленного в буфере, содержащем 0,25 М сахарозу, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 100 мМ KCl, 8 тМ MgCl2, 0,04 % ß-меркаптоэтанол и смесь ингибиторов протеаз фирмы "Sigma" (США), проводили методом дифференциального центрифугирования
Молекулярно-весовой анализ белков осуществляли в 8 % ПААГ в присутствии 0,1 % SDS по методу Laemmli (Laemmli, 1970) с использованием белковых маркеров фирмы "Bio-Rad" (США) После окончания электрофореза белки, находящиеся в геле, переносили на нитроцеллюлозные мембраны полусухим методом Для выявления иммунореактивных полипептидов использовали детекционную систему "ECL western blotting detection reagent" фирмы "Amersham" (Великобритания) Визуализацию иммунореактивных зон проводили с помощью хемилюминесцентного проявителя на рентгеновской пленке "Hyperfilm ECL" фирмы "Amersham" (Великобритания)
Культивирование клеток Клетки HuTu 80 и Hep G2 высевали на культуральные чашки 35 мм с плотностью 1 104 на см2 и культивировали в среде DMEM, содержащей 10 % эмбриональной сыворотки телят (фирма "Gibco", США), в атмосфере 5 % СОг при 37 °С
Компетентные клетки получали кальций-фосфатным методом Трансфецированные клетки отбирали по р-галактозидазному сигналу
Теоретические методы. При выполнении работы использовали открытые базы данных нуклеотидных и аминокислотных последовательностей GenBank и RefSeq на сервере NCBI и открытую базу данных пространственных структур биомолекул PDB В теоретической части работы использовали программы BLAST, "ORF Finder", "MitoProt II", раздел «Расчеты» сайта «Классическая и молекулярная биология», "BioEdit 7 0", "PC/Gene 6 5", "Matlnspector 7 7", "RNAstructure 4 5", "SSpro8" пакета программ "Scratch Protein Predictor", "MEGA 4" Геометрическая оптимизация молекулярных структур была выполнена с использованием метода молекулярной механики в силовом поле OPLS и полуэмпирического квантово-химического расчета методом ZIND01, реализованными в программе "HyperChem 7 01" Все вычисления были сделаны без учета растворителя Визуализация рассчитанных структур была проведена с использованием программ "HyperChem 7 01" и "RasMol 2 7" В экспериментальной части работы использовали программы "Gene Runner 3 0", "Chromas 1 45", "NebCutter 2", "Scion Image 4", "Redasoft Visual Cloning 3 2"
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Поиск, выявление и характеристика ЦП-подобного белка митохондриалыюй локализации в геноме человека На первом этапе работы поиск последовательности, предположительно кодирующей мтЦП человека, был осуществлен с помощью трех подходов Во-первых, в интронах гена ЦП был проведён поиск альтернативного промотора, инициация которого могла бы привести к образованию мтЦП Во-вторых, в аминокислотной последовательности ЦП искали внутримолекулярный СДБМ В-третьих, в базе данных RefSeq был проведен поиск и анализ ЦП-гомологичных последовательностей, способных кодировать СДБМ
В результате проведенного поиска альтернативный промотор найден не был Последовательность, обладающая свойствами СДБМ, с низкой вероятностью (0,28) была идентифицирована только в области ЦП, соответствующей экзону 9 Компьютерный поиск гомологичных церулоплазмину последовательностей по программе BLAST выявил в геноме человека последовательность процессированного псевдогена ЦП (ц/Ср) (Koschmsky et al, 1987, HGNC 2322, GenBank NGJ01106) Транслирование этой последовательности во всех рамках считывания с помощью программы "ORF Finder" показало, что только в одной из них присутствует фрагмент длиной 984 н (с 308-го по 1291-й нуклеотид), не содержащий стоп-кодонов, которому соответствует аминокислотная последовательность длиной 328 а о Она попадает в одну рамку считывания с последовательностью ЦП начиная с кодона 703 по
нумерации аминокислотных остатков в пре-ЦП На 1Ч-конце вычисленного белка программа "МЛоРпЛ II" предсказывает СДБМ длиной 65 а о с вероятностью 0,95
Нуклеотидная последовательность \\iCp соответствует кДНК ЦП начиная с экзона 9 по экзон 19 включительно (рис 1) Сравнение транслируемой части \\iCp и соответствующего участка кДНК ЦП показывает, что в \|/Ср полностью делегирован участок, соответствующий экзону 11 Также делетированы 17 и в участке, соответствующем середине экзона 17, из-за этого происходит смещение рамки считывания, вследствие чего в \|/Ср-мРНК возникает преждевременный по сравнению с ЦП-мРНК стоп-кодон Таким образом, «экзоны» 18 и 19 оказываются в З'-и Г11 *|/Ср-мРНК, однако они сохраняют высокую идентичность с геном ЦП (97 %) Старт-кодон \)/Ср-мР11К находится в «экзоне» 10 В участке \jiCp, соответствующем экзону 12 гена ЦП, присутствует вставка из четырех нуклеотидов, из-за которой при трансляции рамка считывания смещается на один нуклеотид влево по сравнению с геном ЦП и с этого момента начинает с ним совпадать Участок \|¡Ср до этой вставки хотя и высокогомологичен гену ЦП, но транслируется в другой рамке считывания, что приводит к образованию новых 47 аминокислотных остатков на М-конце 1 (продукта трансляции \|/Ср), которых нет в ЦП, главным образом формирующих СДБМ в аминокислотной последовательности \|/ЦП
1 23456 7 8 9 1011121314 15161718 19
открытая рамка считывания Рис I Сравнение нуклеотидных последовательностей ЦП и ч»ЦП Показана экзон-интронная структура гена ЦП человека Вертикальные прямоугольники — экзоны Красным цветом выделены гомологичные области Зеленым цветом выделен участок, идентичный менее чем на 50% В овальной рамке показана вставка из четырех нуклеотидов в \|/С/)-мРНК
Сопоставление последовательностей экзонов ЦП и соответствующих им гомологичных участков \цСр показало, что «экзоны» транслируемой части \\iCp (экзоны 10—17) характеризуются высокой (около 97 %) идентичностью с ЦП Первые 52 н 5'-области уС/>мРНК содержат почти треть всех нуклеотидных замен (29 из 96)
в сравнении с ЦП-мРНК Поиск промотора в уСр был осуществлен с помощью программы ' PC/Gene 6 5" путем выявления элементов, близких к консенсусным последовательностям ТАТА-бокса, сигнала кэпирования и СААТ-бокса ТАТА-бокс и инициаторный элемент на расстоянии, близком к консенсусному, были найдены только в одной области последовательности уСр перед предполагаемым старт-кодоном в теоретически предсказанной \|/С/>мРНК Потенциальная промоторная последовательность расположена в районе, соответствующем участку со 195 по 219 п н Первый транскрибируемый нуклеотид по последовательности \\iCp ОGenBank NG 001106) имеет координату +219 Если промотор идентифицирован правильно, то 5'-UTR предполагаемой \|/Ср-мРНК составляет 89 н В этой области программа "Matlnspector 7 7" предсказывает кластер последовательностей, способных связывать общий активирующий инициацию транскрипции эукариотический фактор ОСТ1 Результаты проведенного анализа позволяют считать, что 5'-область v/Cp содержит необходимые для эффективной транскрипции элементы
З'-область v|/Ср практически полностью совпадает с аналогичным участком ЦП-мРНК, включающим последовательности с 17-го по 19-й экзоны и З'-UTR (10 замен на 394 н) Такая же гомология сохраняется и на расстоянии около 1200 п н после участка, соответствующего стоп-кодону в ЦП-мРНК Известно, что З'-UTR ЦП-мРНК человека содержит альтернативный сайт полиаденилирования, который расположен в 5'-направлении от используемого при процессинге транскриптов гена ЦП, и эта консенсусная последовательность расположена до сайта связывания с фактором, индуцируемым гамма-интерфероном (IFN-y)— регулятором трансляции ЦП-мРНК Таким образом, теоретически в клетках могут образовываться молекулярные формы ЦП-мРНК, не подвергающиеся подавлению трансляции в присутствии IFN-y (Sampath et al, 2003) Однако в \|iCp единичные замены приводят к исчезновению этих сайтов полиаденилирования Сайт полиаденилирования в З'-UTR *|/С/?-мРНК найден примерно через 5000 н после стоп-кодона Поэтому теоретически \|/Ср может подвергаться строгому контролю экспрессии на уровне трансляции
Некоторые митохондриальные белки, кодируемые ядерным геномом, транслируются на полирибосомах, ассоциированных с наружной мембраной митохондрий мРНК, кодирующие такие белки, содержат в З'-UTR последовательность, имеющую вторичную структуру в форме трех-четырех
последовательно расположенных структур типа «стебель — петля» (Margeot et а!., 2005). Анализ вторичной структуры З'-UTR в уСр-мРНК с помощью программы "RNAstructure 4.5" не выявил образования структур, найденных в дрожжах. Таким образом, вероятность ассоциации vj/Cp-мРНК с митохондриями в процессе трансляции мала.
Сопоставление аминокислотных последовательностей уЦП и ЦП показало, что у ЦП содержит 21 замену в совпадающей с ЦП части и 47 дополнительных аминокислотных остатков на N-конце. В СДБМ отчётливо выделяются два участка: N-концевой, который возникает в результате четырёхнуклеотидной вставки, абсолютно не совпадающий с ЦП, и С-концевой, состоящий из 18 а. о., совпадающий с ЦП. Интересно, что С-концевой фланкирующий участок совпадает с последовательностью ЦП, соответствующей предсказываемому слабому СДБМ. Моделирование предполагаемого СДБМ в ^ЦП с помощью программы "SSpro8" с последующей визуализацией в программе "RasMol 2.7" показало, что этот участок обладает предрасположенностью к формированию амфипатической а-спирали.
уЦП утрачивает все медьсвязывающие центры молекулы ЦП, но сохраняет пять разрозненных аминокислотных остатков, входящих в состав медьсвязывающих сайтов молекулы ЦП и участвующих в координировании атомов меди. Поиск потенциальных медьсвязывающих мотивов в последовательности предполагаемого продукта \|/Ср, характерных для таких белков, как медьтранспортные АТФазы и шапероны, не дал результата. Однако в последовательности ч/ЦП присутствует мотив His-X-His, характерный для медьзависимых оксидаз (Jalkcmen&Salmi, 2001).
двух имидазольных колец His93 и His 183, расстояние между геометрическими центрами которых составляет 3,5 А. Координаты остатков гистидина даны по нумерации в последовательности зрелого \|/ЦП.
показан пространственный сайт из
методом молекулярной механики в силовом поле OPLS. На врезке
заменённых а. о. была проведена в программе "HyperChem 7.0.1"
(PDB ID 2J5W, Вето el al.. 2007), путём замены несовпадающих а. о. Геометрическая оптимизация
Рис. 2. Пространственная модель предполагаемого зрелого продукта экспрессии ч/Ср.
Модель построена на основе соответствующей части молекулы ЦП человека, полученной методом рентгеноструктурного анализа
Кроме этого, в предполагаемом продукте \\iCp из-за замены пролина в положении 884 по последовательности зрелого ЦП на гистидин образуется пространственный сайт из двух имидазольных колец His93 и Hisl83, расстояние между геометрическими центрами которых составляет 3,5 À (рис 2) Примерно на таком же расстоянии по данным расчета располагаются имидазольные кольца в дипептиде гистидил-гистидин и в бис-гистидиновом комплексе, координирующем двухвалентный ион меди Си2+ Геометрическая оптимизация комплексов была проведена в программе "HyperChem7 0 1" с помощью полуэмпирического квантово-химического расчета методом ZIND01, имеющим параметризацию для ¿/-элементов
Последовательность ц/Ср человека была выровнена с помощью программы BLAST со всеми известными нуклеотидными последовательностями геномов позвоночных, которые содержит база данных RefSeq В геноме шимпанзе (Pan troglodytes) на 8-й хромосоме был обнаружен v|iCp, почти идентичный таковому у человека Промоторные области цСр шимпанзе и человека практически совпадают за исключением одной мононуклеотидной замены, при этом в v|/Ср шимпанзе полностью сохраняется консенсусная промоторная последовательность и цис-элементы, выявленные в 5-UTR уСр человека Теоретически предсказанная аминокислотная последовательность уЦП шимпанзе обладает высокой идентичностью с \|/ЦП человека (97 %) Она на 2 а о короче с N-конца, но сохраняет N-концевой СДБМ длиной 63 а о , который программа "MitoProt II" предсказывает с вероятностью 0,96
На основании проведенного анализа можно заключить, что у человека и шимпанзе на участке генома, занимаемом уСр, возникла последовательность, содержащая все элементы, характерные для эукариотического гена класса II Его белковым продуктом может быть митохондриальный белок, высокогомологичный С-концевому участку ЦП У человека предполагаемый \|/ЦП состоит из 328-ми аминокислотных остатков, 65 из которых составляют N-концевой СДБМ В центре молекулы уЦП присутствует специфический для оксидаз медьсвязывающий мотив His-X-His На поверхности белковой глобулы возникает пространственный сайт, образованный имидазольными кольцами остатков гистидина, предположительно координирующий один атом меди Расчетная молекулярная масса зрелого уЦП составляет примерно 30 кДа
Анализ экспрессируемости \¡/Cp. В связи с увеличением объёма информации об экспрессируемости по крайней мере части процессированных генов разработаны критерии, rio которым псевдоген может быть аннотирован как функционирующий ген (.Balakirev&Ayala, 2003). К этим критериям относят: 1) превышение частоты синонимических замен над несинонимическими в транслируемых участках псевдогена у разных видов, 2) низкую частоту полиморфизмов последовательности псевдогепа внутри популяции, 3) проявление активности возникающих функциональных доменов, 4) присутствие в клетках продуктов физиологической активности псевдогена. Идентифицированный in silico потенциально активный участок \\iCp человека был тестирован по всем указанным критериям.
Анализ соотношения несинонимических (dN) и синонимических (dS) замен между нуклеотидными последовательностями мРНК уЦП и ЦП человека и шимпанзе, кодирующих совпадающие транслируемые области, по программе "MEGA 4" показал, что соотношение dN/dS ни в одной из пар сравнения не превышает 0,7, что характерно для последовательностей, подвергающихся давлению отбора.
Для оценки полиморфности структуры \\)Ср внутри популяции с помощью
уникальных 25-нуклеотидных праймеров, охватывающих потенциально
транскрибируемую область \sjCp, методом ПЦР на 117-ти образцах ДНК были
получены ампликоны, каждый из которых имел расчётную длину (рис. 3, Б, 1). Это
означает, что ни одна из исследованных областей 234-х хромосом, взятых в
эксперимент, не содержит вставок или делеций, которые бы превышали 20—30 п. н.
Во всех случаях плотность зон ампликонов была одинаковой, что указывает на
отсутствие мутаций в сайтах посадки праймеров в любой из хромосом. Также не было
выявлено ни одного случая гетерозиготного носительства, когда наряду с расчётным
ампликоном присутствовал бы продукт большего или меньшего размера.
Рис. 3. Электрофоретнческий анализ рестрицированных ампликонов /Ср человека. А. Схематичное изображение электрофореза после рестрикционного анализа, полученное с помощью программы "NebCutter 2". Б. Результат электрофореза рестрикционных фрагментов \|/Ср в 8 % ПААГ, окрашенных азотнокислым серебром. 1 — полноразмерный ампликон цСр длиной 1062 п. н., 2 — продукт рестрикции ампликона рестриктазои псом (/ js и í¿t п. h.j, ó — продукт рестрикции ампликона рестриктазой BamHI (903 и 159 п. н.), 4 — продукт рестрикции ампликона рестриктазой МпЧ (415, 241, 193 и 140 п. н.), 5 — ДНК-маркер молекулярных весов 100—1000 п. и.
mall! Uaatlil Ш1
BtoxtH Ш1
. i ■ L^l
Wüdí
i ?. ^ 4 S
Для более детального анализа структуры участка \|>Ср был применен метод выявления полиморфизмов длин рестрикционных фрагментов По результатам теоретического поиска с помощью программы "ЫвЬСиНег 2" для рестрикционного анализа были выбраны эндонуклеазы рестрикции ВатШ, ЕсоШ и Мп11 Ни в одном из исследованных ампликонов изменений длин рестрикционных фрагментов выявлено не было, как и не было выявлено ни одного случая нарушения действия рестриктаз (рис 3)
Результаты проведенных экспериментов показывают, что общая исследованная область \уСр в 234-х хромосомах длиной 20124 п н (по 86 п н в каждой из хромосом два праймера по 25 н и 36 п н сайтов рестрикции ВатН1 (6 п н ), ЕсоШ (6 п н ) и сайтов узнавания Мп11 (6 по 4 п н ), распределенных по всей длине уСр) не содержит ни одного однонуклеотидного полиморфизма, средняя частота которых по хромосомным генам составляет примерно 1 на 500 п н , хотя в соответствии с этим правилом в данной выборке ожидается около 40 (=20124/500) замен Поэтому можно заключить, что проанализированная область цСр характеризуется высоким уровнем консервативности внутри популяции
Параллельно была оценена внутрипопуляционная изменчивость 5'-области гена ЦП человека длиной около 3500 п н выше точки начала транскрипции у сорока рожениц, ДНК которых была использована и для анализа структуры цСр В исследование были взяты ДНК только тех женщин, у которых не была нарушена регуляция гена ЦП в клетках печени и молочной железы, о чем судили по изменению уровня ЦП в крови сразу после родов и в молоке в первый и пятый дни лактации (РЫопоуа е/ а/, 2007) Анализ был проведен с использованием 17-ти пар праймеров, которые позволяют получить перекрывающиеся фрагменты ДНК исследуемого участка гена ЦП
Только у двадцати одного из сорока исследованных образцов ДНК длины всех ампликонов совпали с расчетными У остальных девятнадцати были выявлены отличия, которые состояли в появлении высокомолекулярного продукта в отсутствие или наряду с продуктом ожидаемой длины, а также в нарушении посадки праймеров (отсутствие продукта) По результатам проведенного анализа можно сделать вывод, что в 5'-области активного гена ЦП присутствуют многочисленные изменения нуклеотидной последовательности, которые затрагивают 38 из 80-ти исследованных
хромосом. Эти данные согласуются с современными представлениями о внутривидовой вариабельности регуляторных участков структурных генов эукариот.
Проверка биологической способности СДБМ, кодируемого На
следующем этапе работы СДБМ \уСр был клонирован в экспрессионной плазмиде рЕСЕР-ЫЗ (СепВапк: 1157609. 4729 п. н.) как пептид, слитый с зелёным флуоресцирующим белком (ОРР). Для осуществления поставленной задачи были подобраны специфические праймеры на участок уСр. содержащий последовательность, кодирующую потенциальный СДБМ. для его последующего клонирования в p£GFP-^rЗ. Ожидаемый ампликон, полученный на ДНК человека, был очищен электрофорезом в агарозном геле, затем элюирован и встроен в вектор рЕСЕР-ЫЗ (рис. 4). Полученная рекомбинантная плазмидная ДНК была очищена в градиенте хлорида цезия, присутствие вставки проверено рестрикционным анализом, а соответствие структуры подтверждено прямым секвенированием.
промотор: г — resistant, устойчивый: MTS — Mitochondrial Targeting Signal, сигнал доставки белков в митохондрии. Рисунок построен с помощью программы "Redasofl Visual Cloning 3,2".
Рекомбинантная конструкция была использована для трансфекции клеток линии Hep G2. Из выросших зелёных клеток методом дифференциального центрифугирования были изолированы митохондрии и цитозоль. Белки этих фракций анализировали методом хемилюминесцентного иммуноблотипга с антителами к GFP. Данные, представленные на рисунке 5, показывают, что в цитоплазме клеток f lep G2. трансфецированных плазмидой pEGFP-N3 со вставкой предполагаемого СДБМ ц/ЦП (pEGFP-N3-pCp_MTS), антитела выявляют продукт с молекулярной массой, соответствующей слитому белку (37 кДа), а в митохондриях — нативному GFP.
CMV promoter
Рис. 4. Схема встраивании вставка (pCp_MTS) фрагмента v|iCp, содержащего
нуклеотидную последовательность, потенциально кодирующую СДБМ,
в вектор pEGFP-N3. EGFP — Enhanced Green Fluorescent Protein, «улучшенный» (мутантный) зеленый флуоресцирующий белок; CDS — CoDing Sequence, кодирующая последовательность; CMV promoter — CytoMegaloVirus promoter, цитомегаловирусный
Рис. 5. Иммуноблотинг субклеточных фракций, выделенных из клеток Hep G2, с антителами к GFP. Клетки были трансфсцированы рекомбинантной конструкцией pEGFP-M3-pCp_MTS. 1 — GFP, 2 — цитозоль, 3 — митохондрии.
г
3
Полученная рекомбинантная плазмида была использована для определения
локализации слитого белка в трансфецированных клетках методом флуоресцентной
конфокальной микроскопии. Клетки линии НЕК-293 были котрансфецированы
плазмидой pEGFP-N3-pCpjVlTS и маркерной плазмидой DsRed-mitotracker,
содержащей красный флуоресцирующий белок, сшитый с действующим СДБМ одной
из субъединиц цитохром-с-оксидазы. Данные конфокальной микроскопии (рис. 6)
показали, что GFP локализован как в митохондриях, так и присутствует в цитоплазме.
Наряду с данными иммуноблотинга (рис. 5) это может означать, что некоторое
количество непроцессированного рекомбинантного белка остаётся в цитозоле.
Рис. 6. Клетки линии НЕК-293, трансфсцированные плазмидой pEGFP-N3-pCp_MTS и маркерной плазмидой DsRed-mitotracker.
А. pEGFP-N3-pCp_MTS. Б. DsRed-mitotracker. В. Совмещенное изображение. Фотографии сделаны на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе "Leica SP2". GFP и DsRed были возбуждены последовательно во избежание наложения между каналами.
Выявление продуктов экспрессии \\iCp в культивируемых клетках человека. Существование продукта транскрипции м/Ср было проверено методом ОТ-ПЦР. Препараты тотальной РНК, выделенные из культивируемых клеточных линий человека 1 luTu 80 и Нер G2, были подвергнуты ОТ-ПЦР анализу с помощью специфических праймеров. В качестве праймера в обратной транскрипции использовали олиго-dT. Данные, приведённые на рисунке 7, А, показывают, что транскрипты, соответствующие секреторному и ГФИ-ЦП, как и следовало ожидать, образуются только в Нер G2. В клетках линии HuTu 80 ампликоны, соответствующие секреторному или ГФИ-ЦП, не обнаружены. ПЦР-продукты, соответствующие \\iCp, выявлены в обоих типах клеток.
А Б В
тв«.. ч 1» UKM
А
1261 п.
т
щ
1062 п. я.
ß-aferiiH * t-tf iitHil регион ЦП
Ш п. н.
1261 пн.
псеадогенцп рис 7 Экспрессия изоформ ЦП в клеточных линиях человека НиТи 80 и Нер 02. А ОТ-
ПЦР анализ тотальной РНК клеточных культур. 1 — клетки линии НиТи 80; 2 — клетки линии Нер в2; М — ДНК-маркер молекулярных весов 250—10000 п. н., стрелками указаны размеры ампликонов. Б. Схема расположения подобранных праймеров на последовательностях исследуемых мРНК. Показаны ожидаемые ПЦР-продукты.
ГФИ-якорь
гомолигичньш ЦП регион
псевдогсн ЦП |
Для выявления белковых продуктов \\iCp использовали клетки линии HuTu 80. Выбор обусловлен тем, что в них не обнаружены другие транскрипты гена ЦП, чьи белковые продукты вследствие протеолитической деградации, характерной для ЦП, могут образовывать полипептиды с молекулярной массой, близкой к расчётной для Ч/ЦП. Данные иммуноблотинга, представленные на рисунке 8, показывают, что иммунореактивные полипептиды ЦП с молекулярной массой примерно 30 кДа присутствуют в составе митохондриальных белков и белков внутриклеточных мембран.
Рис. 8. Иммуноблотинг субклеточных фракций, выделенных из клеток HuTu 80, с антителами к 2 ЦП человека. 1 —внутриклеточные мембраны, Щ j 2 — плазматическая мембрана, 3 — митохондрии.
lit t it 106 80 «17 35 28 20 к Да
Таким образом, нами получены прямые доказательства присутствия ЦП-подобного полипептида в митохондриях человека in vitro. Мы показали, что мтЦП идентифицируется более чем у одного вида млекопитающих. Косвенно это указывает на существование у выявленной изоформы ЦП биологической функции. Естественным является предположение, что она связана с метаболизмом меди. Так как у крыс мтЦП формируется in vivo и у лабораторных животных можно вызвать изменение статуса меди искусственно, первые исследования, посвященные выяснению роли мтЦП, были проведены на лабораторных крысах.
Экспрессия мтЦП крысы при различных состояниях метаболизма меди. Для изучения профиля экспрессии мтЦП были взяты сердце, мозг, печень, селезёнка, семенники, лёгкие и почки взрослой крысы. Результаты ОТ-ПЦР анализа с помощью селективных праймеров показали, что зрелые транскрипты мтЦП-мРНК присутствуют в клетках мозга, печени и почек взрослых крыс (рис. 9). При эмбриональном типе метаболизма меди (в мозге и печени 15- и 19-дневных эмбрионов, 3- и 10-дневных крысят, в эмбриональных внезародышевых органах 15-го и 19-го дней развития — плаценте и желточном мешке) мтЦП-мРНК не формируется.
Рис. 9. Экспрессия мтЦП-мРНК МТЦ11 в различных органах взрослых крыс.
»■» р-актин 1 — сердце, 2 — мозг, 3 — печень, _ . _ 4 — селезёнка, 5 — семенники,
О О f 5 — лёгкие, 7 — почки.
Для изучения экспрессии мтЦП-мРНК в клетках молочной железы крыс в течение инволюции была взята молочная железа 10-го дня лактации, молочная железа 10-го дня лактации через 12, 36 и 48 часов после прекращения кормления и молочная железа 20-го дня лактации через 48 часов после прекращения кормления. Оказалось, что в клетках молочной железы мтЦП-мРНК обнаруживается только после начала инволюции (через 12 часов после прекращения кормления, рис. 10, 2), а её количество возрастает с увеличением времени отнятия крысят от груди и коррелирует с нарастанием относительного содержания фрагментированной ДНК, выделенной из ядер и цитоплазмы.
Рис. 10. Экспрессия мтЦП-мРНК в мтЦП молочной железе крыс в течение
инволюции. 1 — молочная железа 10-го дня Р-актин лактации, 2 — молочная железа 10-го дня
лактации через 12 часов после прекращения 1 1 Л 4 э кормления, 3 — через 36 часов, 4 — через
48 часов, 5 — молочная железа 20-го дня лактации через 48 часов после прекращения кормления.
В качестве животных моделей с искусственным дефицитом меди были использованы крысы, получавшие с пищей хлорид серебра (РпЬу1 е/ а!., 1980), что приводит к снижению концентрации меди в сыворотке крови, и крысы с экспериментальным фибриллогенезом, вызванным введением нейротоксического пептида предшественника (3-амилоидного белка в латеральный мозговой желудочек, что характеризуется снижением метаболизма меди в мозгу (Федотова и др., 2006). Для ОТ-ПЦР анализа была использована печень и отделы мозга, которые отличаются по концентрации меди и уровню экспрессии генов медьтранспортных белков (Платонова и др., 2005). Данные рисунка 11 показывают, что экспрессия мтЦП-мРНК в печени и отделах мозга Ag-кpыc прекращается. В мозгу крыс с искусственным фибриллогенезом мРНК, кодирующая мтЦП, тоже не образуется, однако её экспрессия в печени сохраняется.
контроль
•г.~ тт шт
опыт
■ - : ЩШШШ ■V ■
I мтЦП (3-актин
5 мтЦП
Рис. 11. Экспрессия мтЦП-мРНК в печени и отделах мозга крыс, получавших с пищей хлорид серебра (опыт 1), и крыс с экспериментальным фибриллогенезом (опыт 2). 1 — кора, 2 — мозжечок, 3 — гипофиз, 4 —
4ШМЬ Ямм* л*»«* р-актин сосудистое сплетение, 5 — гиппокамп,
мтЦП ЙМ> (3-актин 8
6 — гипоталамус, 7 — миндалевидное тело, 8 — печень.
19
ВЫВОДЫ
1 Процессированный псевдоген ЦП человека кодирует ЦП-подобный полипептид с Ы-концевым сигналом доставки белков в митохондрии Транслируемый участок псевдогена ЦП фланкируется последовательностями, содержащими регуляторные элементы, характерные для эукариотического гена класса II
2 Область псевдогена ЦП человека, предположительно кодирующая ЦП-подобный белок митохондриальной локализации (мтЦП), высококонсервативна внутри популяции
3 Сигнал доставки белков в митохондрии, локализованный на Ы-конце предполагаемого продукта трансляции псевдогена ЦП человека, доставляет слитый с ним зеленый флуоресцирующий белок в митохондрии Он относится к отщепляемым сигналам
4 Транскрипционные и трансляционные продукты экспрессии псевдогена ЦП присутствуют в культивируемых клетках человека
5 Экспрессия мтЦП крысы зависит от статуса меди в клетке
о при эмбриональном типе метаболизма меди мтЦП не формируется, о мтЦП экспрессируется преимущественно в печени и мозге взрослых крыс, о относительное содержание мРНК, кодирующей мтЦП, повышается в клетках
инволирующей молочной железы, о уровень экспрессии мтЦП снижается при дефиците меди
ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1 Клотчепко С А , Цымбаленко Н В, Соловьев К В, Скворцов А Н, Затуловский Е А, Бабич П С, ПчатоноваНА, ¡Павловский М М, ПучковаЛВ, Броджини М Влияние ионов серебра на метаболизм меди и экспрессию генов медьтранспортных белков в печени крыс // Доклады Академии Наук, 418 (4) 549—552, 2008
2 Федотова Ю О, Бабич П С, Платонова Н А , Клотчепко С А , Цымбаленко Н В, Пучкова Л В, Сапронов Н С Экспрессия медьтранспортных генов в мозге крыс при экспериментальной деменции альцгеймеровского типа // Доклады Академии Наук, 409 (4) 555—558, 2006
3 Васин А В, Клотчепко С А , Платонова Н А, Цымбаленко Н В Бабич В С Пучкова Л В Идентификация мРНК, предположительно кодирующей митохондриальную изоформу церулоплазмина крысы // Молекулярная биология, 39 (6) 933—944, 2005
4 Васин А В, Платонова Н А, Повалихин Р Г, Клотчепко С А , Самсонов С А , Цымбаленко Н В, Пучкова Л В Митохондриальный церулоплазмин млекопитающих // Молекулярная биология, 39 (1) 48—60, 2005
5 PlatonovaN A, Vasin А V, Klotchenko S А , Tsymbalenko N V, Puchkova L V The revelation of expressing region m the processed ceruloplasmin gene in human genome by biocomputational and biochemical methods // Biophysical Chemistry, 115 (2-3) 247-250, 2005
6 Васин А В, Платонова Н А , Клотченко С А , Цьшбаленко Н В, Пучкова Л В Экспрессия псевдогена церулоплазмина в культивируемых клетках человека // Доклады Академии Наук, 397 (6) 254—257, 2004
7 Клотченко С А, Ильичева Е Ю Анализ структуры и экспрессии псевдогена церулоплазмина человека Сборник материалов 11-й Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века», Пущино, 29 10—02 11 2007, с 89
8 Klotchenko S, Tsymbalenko N, PlatonovaN, PuchkovaL Theoretical and functional analysis of expressing region of ceruloplasmm pseudogene European Human Genetics Conference, Nice, France, June 16-19, 2007, book of abstracts, p 308
9 Klotchenko S Human ceruloplasmm pseudogene fragment expression 17th European Students Conference, Berlin, Germany, October 8-12, 2006, book of abstracts, p 5
10 Бабич П С, ФедотоваЮ О, Клотченко С А , ПлатоноваН А Изменение метаболизма меди при экспериментальной деменции альцгеймеровского типа Сборник материалов 10-й Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология— наука XXI века», Пущино, 17—21 05 2006, с 65—66
11 Клотченко С А , Платонова Н А Применение биокомпьютерных методов для поиска и анализа регуляторных последовательностей в некодирующих участках хромосомного гена церулоплазмина Сборник материалов 8-й Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века», Пущино, 17—21 05 2004, с 15
12 PlatonovaN A, VasinA V, Klotchenko S А , Tsymbalenko N V, PuchkovaL V Revelation of expressing region in the processed ceruloplasmm gene in human genome by biocomputational and biochemical methods BIFI Internationa! Conference "Biology after the Genome a Physical View", Zaragoza, Spam, February 11-13, 2004, book of abstracts, p 133
Работа поддержана грантами РФФИ № 03-04-48748 и № 06-04-49786, грантами правительства Санкт-Петербурга для студентов, аспирантов, молодых ученых и специалистов в области естественных наук (2003—2007 гг)
Sergey Klotchenko
Summary of the thesis "In search of the human mitochondrial isoform of ceruloplasmm" (carried out at the Department of Molecular Genetics, Research Institute for Experimental Medicine, and at the Chair of Biophysics, the Faculty of Physics and Mechanics, Saint-Petersburg State Polytechmcal University, defended at Saint-Petersburg State University)
Introduction Copper participates in formation of active centers of vitally important enzymes involved in such fundamental cellular processes as an oxidative phosphorylation, membrane transport of iron, connective tissue matrix formation, and post-translational processing of neuropeptide precursors At the same time copper ions are able to take part in the reactions producing ROS which destroy all types of biomolecules Therefore, safe transfer of copper ions is carried out by a special system some genes of which have been recently cloned Copper metabolism disruptions caused by ecological and inherited factors lead to the development of severe neurodegenerative diseases such as a Wilson's disease, Menkes disease, aceruloplasminemia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, cardiovascular diseases, osteoporosis, cancer and prion diseases characterized by mitochondrial dysfunction
Previously we have shown that rat mitochondria contain ceruloplasmm-hke protein formed m the process of transcription from the alternative promoter located in the 3'-region of the intron 2
of ceruloplasmm (Cp) gene Cp that is the main blood copper earner of vertebrates at the same time is a ferroxidase and a copper donor for the nonhepatic cells The rat mitochondrial Cp isoform (mtCp) might participate in local metabolism of iron and redistribution of copper between cytosol and mitochondria The aim of this work was to search for human Cp isoform that can be localized in mitochondria and to characterize it
Materials and methods DNA and RNA extraction, spectrometry analysis, electrophoresis of nucleic acids and proteins in agarose and polyacrylamide gels, cloning techniques in plasmid vectors, analysis of recombinant DNA, primers design, PCR, RT-PCR, sequencing, confocal microscopy, isolation individual subcellular fractions by ultracentnfugation, immunoblot analysis, computer programs for the data analysis from GenBank, RefSeq, PDB
Results Using analysis of Cp-like sequences we have shown that the human processed Cp pseudogene (yQ>, HGNC 2322, GenBank NGJtOl 106} localized in the chromosome 8 encodes Cp-like polypeptide of 328 aa (30 kDa) that is highly identical to the C-terminal region of Cp This polypeptide contains N-termmal mitochondrial targeting signal (MTS) from 65 aa formed as a result of 4 bp insertion in the region corresponding to the exon 12 of the Cp gene Translated region of v|iCp is flanked by the sequences containing regulatory elements that are typical for class II of the eukaryotic genes Central part of V|/Cp has a copper binding motif His-X-His that is specific for oxidases yCp protein surface contains a site formed by two histidine residues putatively able to coordinate one atom of Cu(II) The transcribed region of human v/Cp is highly conserved within restriction fragment length polymorphism analysis MTS localized in v|/Cp is able to transfer the GFP-fused protein into mitochondria with further cleavage Products of the yCp transcription and translation have been found m Hep G2 and HuTu 80 cell lines The fact that the mtCp is present in more than one mammalian species suggests that it plays a biological role To check this hypothesis the in vivo level of the rat mtCp-mRNA was determined m animals with different coppeT status It has been shown that 1) mtCp is predominantly expressed in liver and brain of the adult animals, while during embryonic copper metabolic type mtCp-mRNA is not formed, 2) steady state level of mtCp-mRNA is increased in mammary gland cells during involution, 3) mtCp expression is suppressed in liver as well as bram departments of rats fed with silver chloride (treatment with AgCl leads to the decrease of copper concentration in blood serum), 4) brain mtCp expression is disrupted in rat with fibnllogenesis which was induced by injection of neurotoxic p-amyloid peptide precursor m ventricular zone
Conclusion Human mtCp encoded by processed pseudogene is a member of ceruloplasmm proteins family and might participate in mammalian copper metabolism Therefore, a disruption of i|/Cp expression could lead to a copper homeostasis disbalance which is followed by the development of severe diseases
Подписано в печать 07 05 2008 Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная Печать офсетная Уел печ л 1,0 Тираж 100 экз Заказ № 825
Отпечатано в ООО «Издательство "ЛЕМА"»
199004, Россия, Санкт-Петербург, В О , Средний пр , д 24, тел /факс 323-67-74 e-mail izd_lema@mail ru
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Клотченко, Сергей Анатольевич
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, использованных в тексте.
ВВЕДЕНИЕ.
ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Биологическая роль ионов меди.
1.2. Механизмы, обеспечивающие гомеостаз меди.
1.3. Биология церулоплазмина.
1.4. Морфология, функция и биогенез митохондрий.
1.5. Метаболизм меди в митохондриях.
ЧАСТЬ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Материалы, использованные в работе.
2.2. Модели животных, использованные в работе.
2.3. Методы, использованные в работе.
2.4. Компьютерные программы, использованные в работе.
ЧАСТЬ 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Теоретический поиск потенциального митохондриального церулоплазмина в геномах позвоночных.
3.1.1. Общая характеристика процессированного псевдогена церулоплазмина человека.
3.1.2. Анализ нуклеотидной последовательности процессированного псевдогена церулоплазмина человека.
3.1.3. Поиск промоторной последовательности в процессированном псевдогене церулоплазмина человека.
3.1.4. Анализ З'-нетранслируемой области мРНК процессированного псевдогена церулоплазмина человека.
3.1.5. Характеристика сигнала доставки белков в митохондрии, предсказанного в процессированном псевдогене церулоплазмина человека.
3.1.6. Характеристика медьсвязывающих мотивов в аминокислотной последовательности, программируемой процессированным псевдогеном церулоплазмина человека.
3.1.7. Сравнительный анализ последовательностей процессированных псевдогенов церулоплазмина человека и шимпанзе.
3.2. Анализ экспрессируемости псевдогена церулоплазмина.
3.2.1. Оценка внутрипопуляционной изменчивости процессированного псевдогена и гена церулоплазмина человека.
3.2.2. Проверка биологической способности сигнала доставки белков в митохондрии, кодируемого процессированным псевдогеном церулоплазмина человека.
3.2.3. Выявление транскриптов процессированного псевдогена церулоплазмина в культивируемых клетках человека методом полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции.
3.2.4. Выявление белковых продуктов процессированного псевдогена церулоплазмина в культивируемых клетках человека методом хемилюминесцентного иммуноблотинга.
3.3. Экспрессия митохондриального церулоплазмина крысы при различных состояниях метаболизма меди.
3.3.1. Идентификация мРНК митохондриального церулоплазмина в различных органах взрослых крыс.
3.3.2. Присутствие мРНК митохондриального церулоплазмина во фракциях тотальной РНК, выделенной из различных органов крыс в течение развития.
3.3.3. Изменение относительной концентрации мРНК митохондриального церулоплазмина в клетках молочной железы крыс в течение инволюции
3.3.4. Влияние низкой концентрации меди в крови на относительный уровень мРНК митохондриального церулоплазмина в печени и мозге крыс.
3.3.5. Влияние снижения уровня метаболизма меди при индуцированном фибриллогенезе на экспрессию мРНК митохондриального церулоплазмина в печени и мозге крыс.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Поиск изоформы церулоплазмина человека, способной локализоваться в митохондриях"
Актуальность исследования. Нарушения обмена меди как экологического, так и наследственного характера приводят к развитию тяжёлых заболеваний. К ним, помимо болезней, связанных с врождёнными ошибками метаболизма меди, относятся ацерулоплазминемия, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, сердечно-сосудистые заболевания, остеопороз, рак, прионные болезни (Fox et al., 2000; Llanos and Mercer, 2002; Brown, 2003; Bush et al, 2003; Gaggelli et al., 2006; Torsdottir et al., 2006). При всех этих заболеваниях наблюдают дисфункцию митохондрий, природа которой остаётся неизвестной. В последнее время было обнаружено, что избыток или недостаток {Pang and Chau, 1999; Gybina and Prohaska, 2003) ионов меди в клетке вызывает апоптоз, опосредованный митохондриальными белками семейства Bcl-2 {Wei et al., 2001). Показано, что медь-индуцированный апоптоз связан с внутриклеточным перераспределением меди {Pang and Chau, 1999), то есть с её транспортом, который осуществляют пока не идентифицированные переносчики. Выявление этих белков и установление их биологической роли должно способствовать пониманию механизма медь-индуцированного апоптоза, который, с одной стороны, вызывает гибель нейронов и способствует развитию нейродегенеративных заболеваний, а с другой — осуществляет санитарную функцию в отношении клеток с нарушенной системой сигнальной трансдукции, у которых, вероятно, повышена чувствительность к изменению статуса меди. На последнее указывают факты, демонстрирующие, что медь-органические комплексы в наномолярных концентрациях специфично индуцируют митохондрий-опосредованный апоптоз в культурах клеток, полученных из опухолей, но не в их нормальных гомологах. К тому же и клетки самих опухолей проявляют избирательную чувствительность к этим препаратам {Viola-Rhenals et al., 2006).
Ранее в Отделе молекулярной генетики было показано {Васин и др., 2005а), что в митохондриях крысы присутствует церулоплазмин-подобный белок, который образуется в результате транскрипции с промотора, расположенного в 3'-области интрона 2 гена церулоплазмина, медьсодержащего белка плазмы крови, обладающего свойствами ферроксидазы и также являющегося донором меди для клеток негепатоцитарных рядов. По своим структурным свойствам митохондриальная изоформа церулоплазмина крысы могла бы участвовать в локальном метаболизме железа и/или распределении меди между цитозолем и митохондриями {Huang et al., 2006). В хромосомном гене ЦП человека информация для формирования митохондриального церулоплазмина путём альтернативной транскрипции нами не обнаружена {Васин и др., 20056). По современной концепции структурно-функциональной организации геномов высших эукариот белок, выполняющий важную функцию, сохраняется у разных видов, при этом допускается, что он может образовываться различными путями {Gerstein et al., 2007). Поэтому до изучения биологической роли митохондриального церулоплазмина мы считали необходимым убедиться, что он есть более чем у одного вида млекопитающих.
Представленная работа посвящена поиску и характеристике митохондриального церулоплазмина человека. Она запланирована и выполнена с учётом актуальности изучения механизмов, обеспечивающих гомеостаз меди у млекопитающих, и потенциальной роли митохондриального церулоплазмина в локальном метаболизме меди и железа, нарушение которого является причиной многих тяжёлых заболеваний центральной нервной системы.
Цель работы состояла в поиске и характеристике изоформы церулоплазмина человека, способной локализоваться в митохондриях. Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
1) создать алгоритм для компьютерного поиска последовательностей, потенциально кодирующих церулоплазмин митохондриальной локализации, и осуществить поиск и анализ таких последовательностей в геноме человека;
2) провести внутрипопуляционный анализ изменчивости участка псевдогена церулоплазмина человека, кодирующего вычисленный митохондриальный церулоплазмин;
3) испытать способность возникающего в псевдогене церулоплазмина сигнала доставки белков в митохондрии импортировать полипептиды в митохондрии;
4) осуществить поиск продуктов транскрипции и трансляции потенциально функционального участка псевдогена церулоплазмина;
5) изучить экспрессию митохондриального церулоплазмина крысы в органах, различающихся статусом меди, чтобы получить первоначальные сведения о возможной биологической роли церулоплазмина, локализованного в митохондриях у млекопитающих.
Научная новизна полученных результатов. Все представленные в работе результаты являются новыми. Так, впервые в геноме человека и шимпанзе в псевдогенах церулоплазмина, расположенных на синтенных хромосомах, методами компьютерного анализа выявлена последовательность, соответствующая сигналу доставки белков в митохондрии. Показано, что последовательность псевдогена церулоплазмина содержит все элементы, характерные для эукариотического гена класса II. Также продемонстрировано, что промоторная и структурная области псевдогена церулоплазмина, предположительно кодирующего церулоплазмин-подобный белок митохондриальной локализации, характеризуются высокой внутрипопуляционной консервативностью. К тому же предсказанный сигнал доставки белков в митохондрии обеспечивает импорт слитого с ним зелёного флуоресцирующего белка в митохондрии. Помимо этого, в культивируемых клетках человека с помощью полимеразной цепной реакции, сопряжённой с обратной транскрипцией, и методом иммуноблотинга выявлены транскрипционные и трансляционные продукты участка псевдогена церулоплазмина. В экспериментах in vivo на лабораторных животных показано, что экспрессия митохондриального церулоплазмина носит тканеспецифический характер, изменяется в течение онтогенеза при смене типов метаболизма меди, снижается в условиях дефицита меди в составе церулоплазмина крови и при нарушении обмена меди, вызванном экспериментальным фибриллогенезом.
Научно-практическое значение полученных результатов. Выявление экспрессирующегося участка псевдогена церулоплазмина расширяет представления об организации генома человека. Обнаружение новой внутриклеточной изоформы церулоплазмина способствует пониманию роли митохондрий в распределении меди в клетке. Установление связи между экспрессией митохондриальной формы церулоплазмина и метаболизмом меди помогает понять, как соотносится статус меди в организме с ролью митохондрий в развитии заболеваний, обусловленных нарушениями обмена меди.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Псевдоген ЦП человека кодирует полипептид, содержащий на N-конце последовательность, которая соответствует сигналу доставки белков в митохондрии. Вычисленный полипептид на 93 % идентичен фрагменту зрелого церулоплазмина на участке Asp703-Glu979.
2. Внутри популяции участок генома, занимаемый псевдогеном церулоплазмина, характеризуется очень низкой частотой полиморфизмов.
3. СДБМ псевдогена ЦП функционален— он переносит в митохондрии слитый с ним зелёный флуоресцирующий белок.
4. Культивируемые клетки человека (Hep G2 и HuTu 80) содержат продукты транскрипции процессированного псевдогена ЦП и полипептиды, по антигенности, размеру и внутриклеточной локализации соответствующие предполагаемому митохондриальному ЦП.
5. У крысы мтЦП экспрессируется преимущественно в мозге и печени, а также в клетках инволирующей молочной железы. У крыс с низким содержанием оксидазного ЦП в крови (Ag-крысы, получавшие с пищей хлорид серебра) мтЦП не формируется. У крыс с, фибриллогенезом, экспериментально вызванным введением в желудочек мозга фрагмента предшественника Р-амилоидного белка, формирование мтЦП нарушается в мозгу, но не в печени.
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Клотченко, Сергей Анатольевич
выводы
1. Процессированный псевдоген церулоплазмина человека кодирует церулоплазмин-подобный полипептид с N-концевым сигналом доставки белков в митохондрии. Транслируемый участок псевдогена церулоплазмина фланкируется последовательностями, содержащими регуляторные элементы, характерные для эукариотического гена класса II.
2. Область псевдогена церулоплазмина человека, предположительно кодирующая церулоплазмин-подобный белок митохондриальной локализации, высококонсервативна внутри популяции.
3. Сигнал доставки белков в митохондрии, локализованный на N-конце предполагаемого продукта трансляции псевдогена церулоплазмина человека, доставляет слитый с ним зелёный флуоресцирующий белок в митохондрии. Он относится к отщепляемым сигналам.
4. Транскрипционные и трансляционные продукты экспрессии псевдогена церулоплазмина присутствуют в культивируемых клетках человека.
5. Экспрессия митохондриального церулоплазмина крысы зависит от статуса меди в клетке: о при эмбриональном типе метаболизма меди митохондриальный церулоплазмин не формируется; о митохондриальный церулоплазмин экспрессируется преимущественно в печени и мозге взрослых крыс; о относительное содержание мРНК, кодирующей митохондриальный церулоплазмин, повышается в клетках инволирующей молочной железы; о уровень экспрессии митохондриального церулоплазмина снижается при дефиците меди.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Представленные в работе данные демонстрируют, что расположенный на хромосоме 8 \|fCp, псевдоген ЦП человека, соответствует всем критериям, предъявляемым к экспрессирующимся участкам генома. Первоначально псевдогены определялись как участки генома, близкие в структурном отношении соответствующим функционально активным генам, но не являющиеся их аллельными формами и не кодирующие функциональных генных продуктов. Известны два подкласса псевдогенов, которые отличаются по механизму возникновения. К первому относятся непроцессированные псевдогены. Они, как правило, бывают тесно сцеплены с соответствующими функциональными генами и фланкированы участками, гомологичными последовательностям, которые фланкируют функциональный ген. Обычно такие псевдогены содержат интроны и, по-видимому, образовались в результате тандемных дупликаций генов с последующей потерей функции в результате постепенного накопления повреждающих мутаций. Процессированные псевдогены, как правило, не сцеплены с соответствующим функционально активным геном и могут локализоваться на разных хромосомах. По своей структуре они больше похожи на ДНК-копии мРНК, чем на гены. Так, процессированные псевдогены обычно не содержат интронов, а последовательности, фланкирующие процессированный ген с 5'- и 3'-концов, как правило, отличаются от последовательностей, фланкирующих активные гены. К тому же на 3'-конце они содержат поли(А)-хвост. Считается, что процессированные псевдогены образовались в результате обратной транскрипции зрелой мРНК и последующей интеграции образующихся ДНК-последовательностей в новые участки генома (Vanin, 1985). Возникающие псевдогены из-за аккумуляции мутаций быстро теряют сходство с «родительскими» генами и превращаются в «мусорную» ДНК (Lawrence et al, 2001).
В последнее время выявлен ряд структурных, функциональных и эволюционных особенностей псевдогенов, которые противоречат этой точке зрения. Оказалось, что процессированные псевдогены не всегда являются молчащими. Если интеграция копии кДНК произошла в подходящей ориентации рядом с активным промотором, псевдоген превращается в активно транскрибируемый процессированный ген. Возможен и другой сценарий: в результате мутаций в 5'-области псевдогена возникает активный промотор. В обоих случаях псевдоген становится новым геном. Такие псевдогены предложено называть ретрогенами. Для ретрогенов характерны:
1. Низкий уровень внутрипопуляционной изменчивости и межвидовой дивергенции, более высокая скорость замещений по синонимическим заменам, в сравнении с несинонимическими, и стабилизация важных функциональных областей {Jeffs and Ashburner, 1991; Mighell et al., 2000).
2. Транскрипционная и трансляционная активности.
3. Продукты ретрогенов являются функциональными изоформами продуктов «родительского» гена.
Процессированные псевдогены обнаружены у всех филогенетических групп, их количество увеличивается по мере эволюционного усложнения организмов. Почти каждый структурный ген млекопитающих имеет паралогичный процессированный ген. Некоторые гены имеют их несколько. У многих эукариотов обнаружены функционально активные ретрогены, а у человека такие примеры многочисленны (Balakirev and Ayala, 2003).
Часто псевдогены теряют определённые специфические функции, но сохраняют другие или приобретают новые, которые не могут быть выявлены за счёт простого сопоставления нуклеотидных последовательностей. Таким образом, псевдогены действуют в качестве резерва последовательностей, которые вместе с паралогичными генами генерируют генетическое разнообразие (Балакирев и Айала, 2004).
Теоретический анализ показал, что нуклеотидная последовательность \|fCp человека соответствует кДНК ЦП начиная с экзона 9 по экзон 19 включительно и характеризуется высокой (около 97 %) идентичностью с ЦП. В участке \\/Ср, соответствующем экзону 12 гена ЦП, присутствует вставка из 4-х нуклеотидов, приводящая к сдвигу рамки считывания и образованию на N-конце предполагаемого продукта экспрессии \|fCp новой аминокислотной последовательности, не совпадающей с ЦП, которая соответствует СДБМ с вероятностью 0,95. На 5'-конце \\iCp содержит консенсусные элементы ТАТА-бокса и инициатора. Кодирующая часть \|/С/?-мРНК программирует синтез полипептида длиной 328 а. о. Эта мРНК транслируется свободными полирибосомами. Доставку белка в митохондрии обеспечивает 65-членный полипептид N-концевой локализации, который на С-конце содержит сигнал отщепления. СДБМ, кодируемый \|/Ср, строго соответствует амфипатической а-спирали. Молекулярная масса зрелого полипептида составляет примерно 30 кДа. \|/Ср также найден у шимпанзе и предположительно кодирует полипептид, который больше сходен с \|/ЦП человека, чем с ЦП шимпанзе на сохранившемся участке. мтЦП человека и крысы найден по продуктам транскрипции и трансляции. У шимпанзе он идентифицирован только биокомпьютерными методами. Ранее в культивируемых клетках линии CV-1 (Jensen et al., 1964), первично полученных из почки африканской зелёной мартышки (Cercopithecus aethiops), был обнаружен новосинтезирующийся несекреторный ЦП-подобный белок с молекулярной массой около 28 кДа. Этот белок локализовался как в цитозоле, так и во фракции, содержащей митохондрии (Пучкова и др., 1995). По молекулярной массе он полностью соответствует мтЦП шимпанзе. Секвенирование генома зелёной мартышки пока не завершено. В известной его части (база данных "RefSeq") последовательности \|/Ср нами не выявлено. Однако экспериментальные данные косвенно указывают на существование ЦП митохондриальной локализации и в протеоме низших узконосых обезьян. Обращает на себя внимание тот факт, что в клетках линии CV-1 новосинтезированный несекреторный ЦП распределяется и в цитозоле, и в митохондриях. Именно такое распределение зелёного флуоресцирующего белка, слитого с предполагаемым СДБМ, который кодирует \j/Ср человека, обнаруживается в наших опытах (рис. 3.18 и 3.19, с. 93—94). Способность митохондриальных белков, имеющих отщепляемый СДБМ, локализоваться и в цитозоле, и в митохондриях уже описана. Например, шаперонин Hsp60 имеет двойную локализацию, что связано с выполнением им специфических функций в обоих компартментах (Soltys and Gupta, 1996).
У других позвоночных применение разработанных алгоритмов для поиска мтЦП не дало однозначных результатов, но показало, что и у них в глобуле ЦП может формироваться внутримолекулярный участок, по свойствам соответствующий СДБМ. У проанализированных видов можно также постулировать и альтернативные промоторы в интронах гена ЦП, которые обеспечили бы образование несекреторных форм ЦП. Однако эти данные неоднозначны и требуют экспериментальной проверки.
С помощью специфических 25-нуклеотидных праймеров, охватывающих потенциально транскрибируемую область \\fCp, на 117-ти образцах ДНК человека были получены ампликоны, каждый из которых по результатам электрофоретического анализа имел расчётную длину. В этом эксперименте не было выявлено ни нарушения посадки праймеров, ни гетерозиготного носительства. Рестрикционный анализ с помощью эндонуклеаз рестрикции BamHI, EcoRI и Mnll не выявил ни изменений длин рестрикционных фрагментов во всех исследуемых ампликонах, ни случаев нарушения действия рестриктаз. Таким образом, даже с учётом того что однонуклеотидные замены могут присутствовать в областях посадки праймеров, следует признать, что участок v/Cp характеризуется очень низкой внутрипопуляционной изменчивостью. Эти данные вместе с данными о низкой межвидовой дивергенции \jfCp у приматов однозначно указывают, что на участки генома, соответствующие \jfCp, действует естественный отбор.
Методом ОТ-ПЦР в культивируемых клетках человека линий Hep G2 и HuTu 80 был обнаружен продукт транскрипции \jtCp. Поиск полипептидов
ЦП методом иммуноблотинга был проведён в клетках HuTu 80, в которых ни мРНК ЦП, ни мРНК ГФИ-ЦП методом ОТ-ПЦР обнаружены не были, следовательно, их белковые продукты не могли мешать выявлению других молекулярных форм ЦП. Иммунореактивные полипептиды ЦП с молекулярной массой примерно 30 кДа, которые могут быть продуктом трансляции мРНК \|/ЦП, были обнаружены в составе митохондриальных белков и белков внутриклеточных мембран.
В целом, представленные в работе данные однозначно свидетельствуют, что уСр человека является ретрогеном и действительно экспрессируется, во всяком случае, в культивируемых раковых клетках. Задача установить экспрессируется ли он in situ в тканях человека не ставилась в работе.
Предсказываемый \|/ЦП человека содержит 2 атома меди, и по крайней мере один из них находится в состоянии окисления Cu(II). Он координируется двумя остатками гистидина (His93 и His 183 по нумерации в последовательности зрелого уЦП), один из которых появляется в \|/ЦП в результате однонуклеотидной замены в пролиновом кодоне ЦП. Возможно, этот атом меди может быть передан донору. Это предположение не является необоснованным. Так, более 30 лет назад в серии работ было продемонстрировано, что изолированные митохондрии млекопитающих, растений и дрожжей поглощают ион меди в состоянии окисления Cu(II) (.Zaba and Harris, 1976; Ivancheva, 1978; Manon and Guerin, 1995). В настоящее время эти работы не привлекают внимание, так как в последнее десятилетие господствует концепция, описывающая транспорт меди в клетке как последовательную передачу меди Cu(I) от шаперона к шаперону. Все медьтранспортные шапероны имеют белковую природу (см. раздел «Обзор литературы»). Однако выявление небелкового митохондриального халькофора и установление того факта, что митохондрии не теряют ионы меди и способности собирать функционально зрелую ЦО при делеции гена любого известного медьтранспортного шаперона, показывают, что медь в митохондрии поставляется пока не идентифицированным переносчиком, которым, в частности, и может быть \|/ЦП.
Второй атом меди \|/ЦП предположительно входит в состав активного центра, характерного для оксидаз и образуемого мотивом His-X-His. Именно этот мотив является общим для всех идентифицированных и предполагаемых мтЦП. \|/ЦП как оксидаза мог бы участвовать в целом ряде метаболических процессов, протекающих в митохондриях. Например, катализировать упаковку ионов железа в митохондриальный ферритин (Levi et al., 2001), осуществлять их мобилизацию для биосинтеза Fe/S-центров (bill and Kispal, 2000) и участвовать в адсорбции NO (Torres and Wilson, 1999), которая модулирует активность ЦО (Cooper, 2002). Возможно, что биологическая роль мтЦП обусловлена как его оксидазной активностью, так и способностью связывать и переносить ионы меди в митохондрии.
Если мтЦП участвует в распределении меди между цитозолем и митохондриями, то возможно, что у млекопитающих он является звеном в митохондрий-опосредованном медь-индуцируемом апоптозе (Skulachev et al., 1998; Pang and Chau, 1999; Viola-Rhenals et al., 2007). На такую возможность указывает прямая связь между уровнем экспрессии мтЦП и этапом апоптоза в клетках инволирующей молочной железы (Baxter et al., 2007). К тому же в промоторной области \|fCp присутствует кластер цис-элементов, связывающих транскрипционный фактор ОСТ1, который относится к группе ТФ, содержащих POU-домен. Этот фактор экспрессируется практически у всех организмов во всех тканях и стимулирует экспрессию многих генов «домашнего хозяйства», а также участвует в регуляции дифференцировки в период эмбрионального развития. В то же время он обеспечивает высокую тканеспецифическую регуляцию экспрессии генов IgG в В-клетках (Garcia-Cosio et al., 2004). Разнообразная биологическая активность ОСТ1 проявляется в результате его связывания с различными активаторными белками. Именно на этих характеристических свойствах ОСТ1 основано его участие в апоптозе, в частности, митохондрий-опосредованном, при котором происходит индукция экспрессии гена ОСТ1 (Zhao et al., 2000).
В представленной работе выявлена связь между уровнем экспрессии мтЦП и метаболизмом меди в клетках. Показано, что мтЦП экспрессируется только при взрослом типе метаболизма меди. Формирования мтЦП-мРНК не происходит ни в эмбриональных органах, ни во внезародышевых органах эмбриона, ни в печени, ни в мозгу новорождённых крыс. Для эмбрионального типа метаболизма меди характерны низкий уровень экспрессии гена ЦП, низкая концентрация ЦП и меди в крови и накопление меди в печени в очень высоких концентрациях. Однако в каких отделах клетки и с какими лигандами связана медь в печени в этот период развития, до сих пор остаётся неизвестным. У взрослых крыс с дефицитом меди в сыворотке крови, вызванным добавлением в пищу ионов серебра, экспрессия мтЦП подавляется. В то же время у крыс с индуцированным фибриллогенезом, при котором нарушается метаболизм меди только в мозге, экспрессия мтЦП избирательно подавляется в мозгу. В целом эта группа фактов позволяет предположить, что мтЦП может участвовать в транспорте меди в клетке.
В заключение можно думать, что мтЦП входит в набор ЦП-подобных белков, в котором у него есть собственная биологическая функция, утрата которой вследствие нарушения экспрессии v/Cp может быть причиной новой формы врождённых ошибок метаболизма меди.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Клотченко, Сергей Анатольевич, Санкт-Петербург
1. Abe Г., Shodai Т., Muto Т., Mihara К., Torii Н., Nishikawa S., Endo Т., Kohda D. Structural basis of presequence recognition by the mitochondrial protein import receptor Tom20 // Cell, 100 (5): 551-560, 2000.
2. Aden D. P., Fogel A., Plotkin S., Damjanov I., Knowles В. B. Controlled synthesis of HBsAg in a differentiated human liver carcinoma-derived cell line//Nature, 282 (5739): 615-616, 1979.
3. Aral M, Imai H, Sumi D, Imanaka T, Takano T, Chiba N, Nakagawa Y. Import into mitochondria of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase requires a leader sequence // Biochem. Biophys. Res. Commun., 227 (2): 433—439, 1996.
4. Arosio P., Adelman T. G., Drysdale J. W. On ferritin heterogeneity. Further evidence for heteropolymers // J. Biol. Chem., 253 (12): 4451^1458, 1978.
5. Balakirev E. S., Ayala F. J. Pseudogenes: are they "junk" or functional DNA? // Annu. Rev. Genet., 37: 123-151, 2003.
6. Barnes G., Frieden E. Ceruloplasmin receptors of erythrocytes // Biochem. Biophys. Res. Commun., 125 (1): 157-162, 1984.
7. Bauer M. F,, Sirrenberg C., Neupert W., Brunner M. Role of Tim23 as voltage sensor and presequence receptor in protein import into mitochondria //Cell, 87 (1): 33^41, 1996.
8. Baxter F. O., Neoh K., Tevendale M. C. The beginning of the end: death signaling in early involution // J. Mammary Gland Biol. Neoplasia, 12 (1): 3-13, 2007.
9. Beers J., Glerum D. M., Tzagoloff A. Purification, characterization, and localization of yeast Coxl7p, a mitochondrial copper shuttle // J. Biol. Chem., 272 (52): 33191-33196, 1997.
10. Bender P. K., Larson T. J. PC/GENE: searches for functional sites in nucleic acids and proteins // Methods Mol. Biol., 24: 299-306, 1994.
11. Benson D. A., Karsch-Mizrachi I., Lipman D. J., Ostell J., Wheeler D. L. GenBank // Nucleic Acids Res., 36 (Database issue): D25-30, 2008.
12. Bento I., Peixoto C., Zaitsev V. N., Lindley P. F. Ceruloplasmin revisited: structural and functional roles of various metal cation-binding sites // Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr., 63 (Pt 2): 240-248, 2007.
13. Bielli P., Calabrese L. Structure to function relationships in ceruloplasmin: a "moonlighting" protein // Cell Mol. Life Sci., 59 (9): 1413-1427, 2002.
14. Bolliger L., Junne Т., Schatz G., Lithgow T. Acidic receptor domains on both sides of the outer membrane mediate translocation of precursor proteins into yeast mitochondria//EMBO J., 14 (24): 6318-6326, 1995.
15. Bou-Abdallah F., Santambrogio P., Levi S., Arosio P., Chasteen N. D. Unique iron binding and oxidation properties of human mitochondrial ferritin: a comparative analysis with human H-chain ferritin // J. Mol. Biol., 347 (3): 543-554, 2005.
16. Brown D. R. Prion protein expression modulates neuronal copper content // J. Neurochem., 87 (2): 377-385, 2003.
17. Bush A. I., Masters C. L., Tanzi R. E. Copper, beta-amyloid, and Alzheimer's disease: tapping a sensitive connection // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100 (20): 11193-11194, 2003.
18. Campanella A., Isaya G., O'Neill H. A., Santambrogio P., Cozzi A., Arosio P., Levi S. The expression of human mitochondrial ferritin rescuesrespiratory function in frataxin-deficient yeast // Hum. Mol. Genet., 13 (19): 2279-2288, 2004.
19. Cartharius K., Freeh K., Grote K., Klocke В., Haltmeier M., Klingenhoff A.,t
20. Frisch M., Bayerlein M., Werner T. Matlnspector and beyond: promoter analysis based on transcription factor binding sites // Bioinformatics, 21 (13): 2933-2942, 2005.
21. Ceciliani F., Giordano A., Spagnolo V. The systemic reaction during inflammation: the acute-phase proteins // Protein Pept. Lett., 9 (3): 211-223, 2002.
22. С en D., Br ay ton D., Shahandeh В., Meyskens F. L. Jr., Farmer P. J. Disulfiram facilitates intracellular Cu uptake and induces apoptosis in human melanoma cells // J. Med. Chem., 47 (27): 6914-6920, 2004.
23. Chaturvedi U. C., Shrivastava R. Interaction of viral proteins with metal ions: role in maintaining the structure and functions of viruses // FEMS Immunol. Med. Microbiol., 43 (2): 105-114, 2005.
24. Cheng J., Randall A. Z., Sweredoski M. J., Baldi P. SCRATCH: a protein structure and structural feature prediction server // Nucleic Acids Res., 33 (Web Server issue): W72-76, 2005.
25. Chinenov Y. V. Cytochrome с oxidase assembly factors with a thioredoxin fold are conserved among prokaryotes and eukaryotes // J. Mol. Med., 78 (5): 239-242, 2000.
26. Claros M. G., Vincens P. Computational method to predict mitochondrially imported proteins and their targeting sequences // Eur. J. Biochem., 241 (3): 779-786, 1996.
27. СоЫпе P. A., Ojeda L. D., Rigby К. M, Winge D. R. Yeast contain a non-proteinaceous pool of copper in the mitochondrial matrix // J. Biol. Chem., 279 (14): 14447-14455, 2004.
28. Cobine P. A., Pierrel F., Winge D. R. Copper trafficking to the mitochondrion and assembly of copper metalloenzymes // Biochim. Biophys. Acta, 1763 (7): 759-772, 2006.
29. Cooper С. E. Nitric oxide and cytochrome oxidase: substrate, inhibitor or effector? // Trends Biochem. Sci., 27 (1): 33-39, 2002.
30. Cormack B. P., Valdivia R. H., Falkow S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP) // Gene, 173 (1): 33-38, 1996.
31. Daimon M., Yamatani K, Igarashi M., Fukase N., Kawanami Т., Kato Т., Tominaga M., Sasaki H. Fine structure of the human ceruloplasmin gene // Biochem. Biophys. Res. Commun., 208 (3): 1028-1035, 1995.
32. De Domenico I., Ward D. M, di Patti M. C., Jeong S. Y, David S., Musci G., Kaplan J. Ferroxidase activity is required for the stability of cell surface ferroportin in cells expressing GPI-ceruloplasmin // EMBO J., 26 (12): 2823-2831,2007.
33. Dekker P. J., Ryan M. Т., Brix J., Miiller H., Honlinger A., Pfanner N. Preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane: moleculardissection and assembly of the general import pore complex // Mol. Cell. Biol., 18 (11): 6515-6524, 1998.
34. Donley S. A., Ilagan B. J., Rim K, binder M. C. Copper transport to mammary gland and milk during lactation in rats // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 283 (4): E667-E675, 2002.
35. Drysdale J. W., Munro H. N. Regulation of synthesis and turnover of ferritin in rat liver// J. Biol. Chem., 241 (15): 3630-3637, 1966.
36. Drysdale J., Arosio P., Invernizzi R., Cazzola M., Volz A., Corsi В., Biasiotto G., Levi S. Mitochondrial ferritin: a new player in iron metabolism // Blood Cells Mol. Dis., 29 (3): 376-383, 2002.
37. Eisses J. F., Kaplan J. H. Molecular characterization of hCTRl, the human copper uptake protein // J. Biol. Chem., 277 (32): 29162-29171, 2002.
38. Fifkova E., Marsala J. Stereotaxic atlases for the cat, rabbit and rat // In: Electrophysiological Methods in Biological Research. Bures J., Petran M., Zachar J. (eds), New York: Academic Press, 653-731, 1967.
39. Fleming R. E., Gitlin J. D. Primary structure of rat ceruloplasmin and analysis of tissue-specific gene expression during development // J. Biol. Chem., 265 (13): 7701-7707, 1990.
40. Forner F., Foster L. J., Campanaro S., Valle G., Mann M. Quantitative proteomic comparison of rat mitochondria from muscle, heart, and liver // Mol. Cell. Proteomics, 5 (4): 608-619, 2006.
41. Fortna R. R., Watson H. A, Nyquist S. E. Glycosyl phosphatidylinositol-anchored ceruloplasmin is expressed by rat Sertoli cells and is concentrated in detergent-insoluble membrane fractions // Biol. Reprod., 61 (4): 10421049, 1999.
42. Fox P. L., Mazumder В., Ehrenwald E., Mukhopadhyay С. K. Ceruloplasmin and cardiovascular disease // Free Radic. Biol. Med., 28 (12): 1735-1744, 2000.
43. Fransson L. A. Glypicans // Int. J. Biochem. Cell Biol., 35 (2): 125-129, 2003.
44. Frey T. G., Mannella C. A. The internal structure of mitochondria // Trends Biochem. Sci., 25 (7): 319-324, 2000.
45. Froimowitz M. HyperChem: a software package for computational chemistry and molecular modeling // Biotechniques, 14 (6): 1010-1013, 1993.
46. Gaggelli E., Kozlowski H., Valensin D., Valensin G. Copper homeostasis and neurodegenerative disorders (Alzheimer's, prion, and Parkinson's diseases and amyotrophic lateral sclerosis) // Chem. Rev., 106 (6): 19952044, 2006.
47. Gaitskhoki V. S., L 'vov V. M., Puchkova L. V., Schwartzman A. L., Neifakh S. A. Highly purified ceruloplasmin messenger RNA from rat liver. Physico-chemical and functional characteristics // Mol. Cell. Biochem., 35 (3): 171182, 1981.
48. Garcia-Cosio M., Santon A., Martin P., Camarasa N., Montalban C., Garcia J. F., Bellas C. Analysis of transcription factor OCT.l, OCT.2 and BOB.l expression using tissue arrays in classical Hodgkin's lymphoma // Mod. Pathol., 17 (12): 1531-1538, 2004.
49. Gerstein M. В., Bruce C., Rozowsky J. S., Zheng D., Du J., Korbel J. O., Emanuelsson O., Zhang Z. D., Weissman S., Snyder M. What is a gene, post-ENCODE? History and updated definition // Genome Res., 17(6): 669-681, 2007.
50. Gitlin J. D. Aceruloplasminemia // Pediatr. Res., 44 (3): 271-276, 1998.
51. Gorman С. M, Moffat L. F., Howard В. H. Recombinant genomes whichiexpress chloramphenicol acetyltransferase in mammalian cells // Mol. Cell. Biol., 2 (9): 1044-1051, 1982.
52. Graham F. L., Smiley J., Russell W. C., Nairn R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5 // J. Gen. Virol., 36 (1): 59-74, 1977.
53. Gybina A. A., Prohaska J. R. Increased rat brain cytochrome с correlates with degree of perinatal copper deficiency rather than apoptosis // J. Nutr., 133 (11): 3361-3368, 2003.
54. Hall T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT // Nucleic Acids Symp. Ser., 41: 95-98, 1999.
55. Harris E. D. Cellular copper transport and metabolism // Annu. Rev. Nutr., 20: 291-310,2000.
56. Harris E. D. Copper transport: an overview // Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 196(2): 130-140, 1991.
57. Harris Z. L., Takahashi Y., Miyajima H., Serizawa M., MacGillivray R. Т., Gitlin J. D. Aceruloplasminemia: molecular characterization of this disorder of iron metabolism // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92 (7): 2539-2543, 1995.
58. Harrison P. M., Arosio P. The ferritins: molecular properties, iron storage function and cellular regulation // Biochim. Biophys. Acta, 1275 (3): 161— 203, 1996.
59. Hartl F. U., PfannerN., Nicholson D. W., Neupert W. Mitochondrial protein import // Biochim. Biophys. Acta, 988 (1): 1-45, 1989.
60. Herbomel P., Bourachot В., Yaniv M. Two distinct enhancers with different cell specificities coexist in the regulatory region of polyoma // Cell, 39 (3 Pt 2): 653-662, 1984.
61. Holmberg C. G., Laurell С. B. Investigations in serum copper II. Isolation of the copper containing protein, and a description of some of its properties // Acta Chem. Scand., 2: 550-556, 1948.
62. Horng Y. C., Leary S. C., Cobine P. A., Young F. В., George G. N., Shoubridge E. A., Winge D. R. Human Scol and Sco2 function as copper-binding proteins //J. Biol. Chem., 280 (40): 34113-34122, 2005.
63. Horst M, Oppliger W., Rospert S., Schdnfeld H. J., Schatz G., Azem A. Sequential action of two hsp70 complexes during protein import into mitochondria // EMBO J., 16 (8): 1842-1849, 1997.
64. Horwich A. L., Kalousek F., Mellman I., Rosenberg L. E. A leader peptide is sufficient to direct mitochondrial import of a chimeric protein // EMBO J., 4 (5): 1129-1135, 1985.
65. HuangX. P., O'Brien P. J., Tempieton D. M. Mitochondrial involvement in genetically determined transition metal toxicity I. Iron toxicity // Chem. Biol. Interact., 163 (1-2): 68-76, 2006.
66. Huffman D. L., O'Halloran Т. V. Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins // Annu. Rev. Biochem., 70: 677701,2001.
67. Hurley L. S., Keen C. L., Lonnerdal B. Copper in fetal and neonatal development // Ciba Found. Symp., 79: 221-45, 1980.
68. Ivancheva E. Cu2+-effects on mitochondrial resistance to sodium deoxycholate//Acta Physiol. Pharmacol. Bulg., 4 (3): 71-78, 1978.
69. Jalkanen S., Salmi M. Cell surface monoamine oxidases: enzymes in search of a function//EMBO J., 20 (15): 3893-3901, 2001.
70. Jeffery C. J. Moonlighting proteins // Trends Biochem. Sci., 24 (1): 8-11, 1999.
71. Jeffs P., Ashburner M. Processed pseudogenes in Drosophila // Proc. Biol. Sci., 244 (1310): 151-159, 1991.
72. Jensen F. C, Girardi A. J., Gilden R. V., Koprowski H. Infection of human and simian tissue cultures with rous sarcoma virus // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 52: 53-59, 1964.
73. Jeong S. Y, David S. Glycosylphosphatidylinositol-anchored ceruloplasmin is required for iron efflux from cells in the central nervous system // J. Biol. Chem., 278 (29): 27144-27148, 2003.
74. Karlin K. D. Metalloenzymes, structural motifs, and inorganic models // Science, 261 (5122): 701-708, 1993.
75. Khalimonchuk O., Rodel G. Biogenesis of cytochrome с oxidase // Mitochondrion, 5 (6): 363-388, 2005.
76. Kim H. J., Graham D. W., DiSpirito A. A., Alterman M. A., Galeva N., Larive С. K, Asunskis D., Sherwood P. M. Methanobactin, a copper-acquisition compound from methane-oxidizing bacteria // Science, 305 (5690): 1612-1615,2004.
77. Klomp A. E., Tops В. В., Van Denberg I. E., Berger R., Klomp L. W. Biochemical characterization and subcellular localization of human copper transporter 1 (hCTRl) // Biochem. J., 364 (Pt 2): 497-505, 2002.
78. Koschinsky M. L., Chow В. К, Schwartz J., Hamerton J. L., MacGillivray R. T. Isolation and characterization of a processed gene for human ceruloplasmin//Biochemistry, 26 (24): 7760-7767, 1987.
79. Koschinsky M. L., Funk W. D., van Oost B. A., MacGillivray R. T. Complete cDNA sequence of human preceruloplasmin // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83 (14): 5086-5090, 1986.
80. Kunapuli S. P., Singh H., Singh P., Kumar A. Ceruloplasmin gene expression in human cancer cells // Life Sci., 40 (23): 2225-2228, 1987.
81. Kuo Y M., Zhou В., Cosco D., Gitschier J. The copper transporter CTR1 provides an essential function in mammalian embryonic development // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 98 (12): 6836-6841, 2001.
82. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature, 227 (5259): 680-685, 1970.
83. Lawrence J. G., Hendrix R. W., Casjens S. Where are the pseudogenes in bacterial genomes? //Trends Microbiol., 9 (11): 535-540, 2001.
84. LeeJ., Репа M. M., Nose Y., Thiele D. J. Biochemical characterization of the human copper transporter Ctrl // J. Biol. Chem., 277 (6): 4380^1387, 2002.
85. Lee J., Prohaska J. R., Dagenais S. L., Glover T. W., Thiele D. J. Isolation of a murine copper transporter gene, tissue specific expression and functional complementation of a yeast copper transport mutant // Gene, 254 (1-2): 8796, 2000.
86. Levi S., Arosio P. Mitochondrial ferritin // Int. J. Biochem. Cell Biol., 36 (10): 1887-1889, 2004.
87. Levi S., Corsi В., Bosisio M., Invernizzi R., Volz A., Sanford D., Arosio P., Drysdale J. A human mitochondrial ferritin encoded by an intronless gene // J. Biol. Chem., 276 (27): 24437-24440, 2001.
88. Lill R., Kispal G. Maturation of cellular Fe-S proteins: an essential function of mitochondria // Trends Biochem. Sci., 25 (8): 352-356, 2000.
89. Linder M. C. Copper and genomic stability in mammals // Mutat. Res., 475 (1-2): 141-152, 2001.
90. Llanos R. M., Mercer J. F. The molecular basis of copper homeostasis copper-related disorders // DNA Cell Biol., 21 (4): 259-270, 2002.
91. Lockhart P. J., Mercer J. F. Cloning and expression analysis of the sheep ceruloplasmin cDNA // Gene, 236 (2): 251-257, 1999.
92. Luciano P., Geli V. The mitochondrial processing peptidase: function and specificity//Experientia, 52 (12): 1077-1082, 1996.
93. Madsen E., Gitlin J.D. Copper and Iron Disorders of the Brain // Annu. Rev. Neurosci., 30: 317-337, 2007.
94. Maltais D., Desroches D., Aouffen M., Mateescu M. A., Wang R., Paquin J. The blue copper ceruloplasmin induces aggregation of newly differentiated neurons: a potential modulator of nervous system organization // Neuroscience, 121 (1): 73-82, 2003.
95. Manon S., Guerin M. Investigation of the effects of Zn2+ and Cu2+ on the K+ transport in yeast mitochondria. Evidences for the involvement of a Zn(2+)-binding protein in the K+/H+ exchange // Biochem. Mol. Biol. Int., 35 (3): 585-593, 1995.
96. Margeot A., Garcia M„ Wang W., TetaudE., diRagoJ. P., Jacq C. Why are many mRNAs translated to the vicinity of mitochondria: a role in protein complex assembly? // Gene, 354: 64-71, 2005.
97. Martin J., Mahlke K., Pfanner N. Role of an energized inner membrane in mitochondrial protein import: Delta psi drives the movement of presequences //J. Biol. Chem., 266 (27): 18051-18057, 1991.
98. McArdle H.J., Danzeisen R., Fosset C., Gambling L. The role of the placenta in iron transfer from mother to fetus and the relationship between iron status and fetal outcome //BioMetals, 16 (1): 161-167, 2003.
99. McGinnis S., Madden T. L. BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools // Nucleic Acids Res., 32 (Web Server issue): W20-25, 2004.
100. Mighell A. J., Smith N. R., Robinson P. A., Markham A. F. Vertebrate pseudogenes // FEBS Lett., 468 (2-3): 109-114, 2000.
101. Missirlis F., Holmberg S., Georgieva Т., Dunkov В. C., Rouault T. A., Law J. H. Characterization of mitochondrial ferritin in Drosophila // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103 (15): 5893-5898, 2006.
102. Mittal В., Doroudchi M. M., Jeong S. Y, Patel B. N., David S. Expression of a membrane-bound form of the ferroxidase ceruloplasmin by leptomeningeal cells // Glia, 41 (4): 337-346, 2003.
103. Mukhopadhyay С. K., Attien Z. K., Fox P. L. Role of ceruloplasmin in cellular iron uptake // Science, 279 (5351): 714-717, 1998.
104. Munro H. N., Aziz N., Leibold E. A., Murray M., Rogers J., Vass J. K., White K. The ferritin genes: structure, expression, and regulation // Ann. N. Y. Acad. Sci, 526: 113-123, 1988.
105. Musci G., Di Marco S., Bonaccorsi di Patti M. C, Calabrese L. Interaction of nitric oxide with ceruloplasmin lacking an EPR-detectable type 2 copper //Biochemistry, 30 (41): 9866-9872, 1991.
106. Musci G., Fraterrigo T. Z. L., Calabrese L., McMillin D. R. On the lability and functional significance of the type 1 copper pool in ceruloplasmin // J. Biol. Inorg. Chem, 4 (4): 441^146, 1999.
107. Neifakh S. A., Monakhov N. K., Shaposhnikov A. M., Zubzhitski Y N. Localization of ceruloplasmin biosynthesis in human and monkey liver cells and its copper regulation // Experientia, 25 (4): 337-344, 1969.
108. Neupert W. Protein import into mitochondria // Annu. Rev. Biochem, 66: 863-917, 1997.
109. Neupert W., Herrmann J. M. Translocation of proteins into mitochondria // Annu. Rev. Biochem, 76: 723-749, 2007.
110. Nie G., Chen G., Sheftel A. D., Pantopoulos K, Ponka P. In vivo tumor growth is inhibited by cytosolic iron deprivation caused by the expression of mitochondrial ferritin // Blood, 108 (7): 2428-2434, 2006.
111. Nose Y., Kim В. E., Thiele D. J. Ctrl drives intestinal copper absorption and is essential for growth, iron metabolism, and neonatal cardiac function // Cell Metab., 4 (3): 235-244, 2006.
112. Ohlmeier S., Kastaniotis A. J., Hiltunen J. K, Bergmann U. The yeast mitochondrial proteome, a study of fermentative and respiratory growth // J. Biol. Chem, 279 (6): 3956-3979, 2004.
113. Olivares M., UauyR. Copper as an essential nutrient // Am. J. Clin. Nutr, 63 (5): 791S-796S, 1996.
114. Omoto E., Tavassoli M. Purification and partial characterization of ceruloplasmin receptors from rat liver endothelium // Arch. Biochem. Biophys, 282 (1): 34-38, 1990.
115. Opazo C., Barria M. /, Ruiz F. H., Inestrosa N. C. Copper reduction by copper binding proteins and its relation to neurodegenerative diseases // Biometals, 16 (1): 91-98, 2003.
116. Orrenius S., Gogvadze V., Zhivotovsky B. Mitochondrial oxidative stress: implications for cell death // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol, 47: 143-183, 2007.
117. Orrenius S., Zhivotovsky В., Nicotera P. Regulation of cell death: the calcium-apoptosis link//Nat. Rev. Mol. Cell. Biol, 4 (7): 552-565, 2003.
118. Osaki S., Johnson D. A., Frieden E. The mobilization of iron from the perfused mammalian liver by a serum copper enzyme, ferroxidase I. // J. Biol. Chem, 246 (9): 3018-3023, 1971.
119. Owen C. A., Smith H. Detection of ceruloplasmin after zone electrophoresis // Clin. Chim. Acta, 6: 441-^44, 1961.
120. Pang J. H., Chau L. Y. Copper-induced apoptosis and immediate early gene expression in macrophages // Atherosclerosis, 146 (1): 45-52, 1999.
121. Patel В. N., David S. A novel glycosylphosphatidylinositol-anchored form of ceruloplasmin is expressed by mammalian astrocytes // J. Biol. Chem, 272 (32): 20185-20190, 1997.
122. Patel B. N., Dunn R. J., David S. Alternative RNA splicing generates a glycosylphosphatidylinositol-anchored form of ceruloplasmin in mammalian brain // J. Biol. Chem, 275 (6): 4305-4310, 2000.
123. Petris M. J., Smith K., Lee J., Thiele D. J. Copper-stimulated endocytosis and degradation of the human copper transporter, hCtrl // J. Biol. Chem, 278 (11): 9639-9646, 2003.
124. Pfanner N., Geissler A. Versatility of the mitochondrial protein import machinery//Nat. Rev. Mol. Cell Biol, 2 (5): 339-349, 2001.
125. Pillai G. R. Redasoft visual cloning a review // J. Immunol. Methods, 276 (2): 243-244, 2003.
126. Platonova N., Guolikhandanova N., Tsymbalenko N., Zhiguleva E., Zhivulko Т., Vasin A., Evsukova /, Puchkova L. Milk ceruloplasmin is a valuable source of nutrient copper ions for mammalian newborns // J. Trace Elem. Med. Biol, 21 (3): 184-193, 2007.
127. Pollastri G., Przybylski D., Rost В., Baldi P. Improving the prediction of protein secondary structure in three and eight classes using recurrent neural networks and profiles // Proteins, 47 (2): 228-235, 2002.
128. Ponka P. Tissue-specific regulation of iron metabolism and heme synthesis: distinct control mechanisms in eiythroid cells // Blood, 89 (1): 1-25, 1997.
129. Prince F. P. Lamellar and tubular associations of the mitochondrial cristae: unique forms of the cristae present in steroid-producing cells // Mitochondrion, 1 (4): 381-389, 2002.
130. Pruitt К. D., Tatusova Т., Maglott D. R. NCBI reference sequences (RefSeq): a curated non-redundant sequence database of genomes, transcripts and proteins //Nucleic Acids Res, 35 (Database issue): D61-65, 2007.
131. Raju K. S., Alessandri G., Ziche M., Gullino P. M. Ceruloplasmin, copper ions, and angiogenesis // J. Natl. Cancer Inst, 69 (5): 1183-1188, 1982.
132. Ravin H. A. An improved colorimetric enzymatic assay of ceruloplasmin // J. Lab. Clin. Med, 58: 161-168, 1961.
133. Reilly C. A., Aust S. D. Iron loading into ferritin by an intracellular ferroxidase // Arch. Biochem. Biophys, 359 (1): 69-76, 1998.
134. Roberts R. J., Vincze Т., Posfai J., Macelis D. REBASE enzymes and genes for DNA restriction and modification // Nucleic Acids Res, 35 (Database issue): D269-270, 2007.
135. Robin M. A., Prabu S. K., Raza H., Anandatheerthavarada H. K., Avadhani N. G. Phosphorylation enhances mitochondrial targeting of GSTA4-4 through increased affinity for binding to cytoplasmic Hsp70 // J. Biol. Chem, 278 (21): 18960-18970, 2003.
136. Ryan M. Т., Hoogenraad N. J. Mitochondrial-nuclear communications I I Annu. Rev. Biochem, 76: 701-722, 2007.
137. Ryan T. P., Grover T. A., Aust S. D. Rat ceruloplasmin: resistance to proteolysis and kinetic comparison with human ceruloplasmin // Arch. Biochem. Biophys, 293 (1): 1-8, 1992.
138. Saenko E. L., Yaropolov A. I. Studies on receptor interaction of ceruloplasmin with human red blood cells // Biochem Int., 20 (2): 215-225, 1990.
139. Salzer J. L., Lovejoy L., binder M. C, Rosen C. Ran-2, a glial lineage marker, is a GPI-anchored form of ceruloplasmin // J. Neurosci. Res, 54 (2): 147-157, 1998.
140. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual // New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second Edition, Vol. 1-3, 1989.
141. Sampath P., Mazumder В., Seshadri V., Fox P. L. Transcript-selective translational silencing by gamma interferon is directed by a novel structural element in the ceruloplasmin mRNA 3' untranslated region // Mol. Cell Biol, 23 (5): 1509-1519, 2003.
142. Santambrogio P., Biasiotto G., Sanvito F., Olivieri S., Arosio P., Levi S. Mitochondrial ferritin expression in adult mouse tissues // J. Histochem. Cytochem, 55 (11): 1129-1137, 2007.
143. Sapronov N. S., Stepanov I. I. A novel method for memory dynamics evaluation can become the best test for early pre-diagnostics of Alzheimer's disease // Eur. Neuropsychopharmacol, 15 (2): S207-S208, 2005.
144. Sato M., Gitlin J. D. Mechanisms of copper incorporation during the biosynthesis of human ceruloplasmin // J. Biol. Chem, 266 (8): 5128-5134, 1991.
145. Sayle R. A., Milner-White E. J. RASMOL: biomolecular graphics for all // Trends Biochem. Sci, 20 (9): 374, 1995.
146. Schapira A. H. Mitochondrial disease // Lancet, 368 (9529): 70-82, 2006.
147. Scheffler I. E. Mitochondria // John Wiley & Sons, New York, 384 p, 1999.
148. Shim H., Harris Z. L. Genetic defects in copper metabolism // J. Nutr, 133 (5 Suppl 1): 1527S-1531S, 2003.
149. Skulachev V. P. Cytochrome с in the apoptotic and antioxidant cascades // FEBS Lett, 423 (3): 275-280, 1998.
150. Soltys B. J., Gupta R. S. Immunoelectron microscopic localization of the 60-kDa heat shock chaperonin protein (Hsp60) in mammalian cells // Exp. Cell Res, 222 (1): 16-27, 1996.
151. Steiner M. S., Zhang X., Wang Y, Lu Y. Growth inhibition of prostate cancer by an adenovirus expressing a novel tumor suppressor gene, pHyde // Cancer Res, 60 (16): 4419^1425, 2000.
152. Strobel G., Zollner A., Angermayr M., Bandlow W. Competition of spontaneous protein folding and mitochondrial import causes dual subcellular location of major adenylate kinase // Mol. Biol. Cell, 13 (5): 1439-1448, 2002.
153. Struewing I. Т., Toborek A., Mao C.D. Mitochondrial and nuclear forms of Wntl3 are generated via alternative promoters, alternative RNA splicing, and alternative translation start sites // J. Biol. Chem, 281 (11): 7282-7293, 2006.
154. Sylvestre J., Margeot A., Jacq C., Dujardin G., Corral-Debrinski M. The role of the 3' untranslated region in mRNA sorting to the vicinity of mitochondria is conserved from yeast to human cells // Mol. Biol. Cell, 14 (9): 3848-3856, 2003.
155. Takahashi N., Ortel T. L., Putnam F. W. Single-chain structure of human ceruloplasmin: the complete amino acid sequence of the whole molecule // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81 (2): 390-394, 1984.
156. Tamura K., Dudley J., Nei M., Kumar S. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0 // Mol. Biol. Evol, 24 (8): 1596-1599, 2007.
157. Tavassoli M., Kishimoto Т., Kataoka M. Liver endothelium mediates the hepatocyte's uptake of ceruloplasmin // J. Cell Biol, 102 (4): 1298-1303, 1986.
158. Torres J., Wilson M. T. The reactions of copper proteins with nitric oxide // Biochim. Biophys. Acta, 1411 (2-3): 310-322, 1999.
159. Torsdottir G., Sveinbjdrnsdottir S., Kristinsson J., Snaedal J., Johannesson T. Ceruloplasmin and superoxide dismutase (SOD1) in Parkinson's disease: a follow-up study // J. Neurol. Sci, 241 (1-2): 53-58, 2006.
160. Vanin E. F. Processed pseudogenes: characteristics and evolution // Annu. Rev. Genet, 19: 253-272, 1985.
161. Vassiliev V, Harris Z. L., Zatta P. Ceruloplasmin in neurodegenerative diseases //Brain Res. Brain Res. Rev, 49 (3): 633-640, 2005.
162. Verbina I. A., Puchkova L. V, Gaitskhoki V S., Neifakh S. A. Isolation and partial characterization of molecular forms of ceruloplasmin from human bile // FEBS Lett, 298 (2-3): 105-108, 1992.
163. Verner K. Co-translational protein import into mitochondria: an alternative view//Trends Biochem. Sci, 18 (10): 366-371, 1993.
164. Vincze Т., Posfai J., Roberts R. J. NEBcutter: A program to cleave DNA with restriction enzymes //Nucleic Acids Res, 31 (13): 3688-3691, 2003.
165. Viola-Rhenals M, Rieber M. S., Rieber M. Role of peroxidases, thiols and Bak/Bax in tumor cell susceptibility to CuDEDTC.2 // Biochem. Pharmacol, 74 (6): 841-850, 2007.
166. Viola-Rhenals M., Rieber M. S., Rieber M. Suppression of survival in human SKBR3 breast carcinoma in response to metal-chelator complexes is preferential for copper-dithiocarbamate // Biochem. Pharmacol, 71 (6): 722-734, 2006.
167. Voisine C., Craig E. A., Zufall N., von Ahsen O., Pfanner N., Voos W. The protein import motor of mitochondria: unfolding and trapping of preproteins are distinct and separable functions of matrix Hsp70 // Cell, 97 (5): 565-574, 1999.
168. Walravens P.A. Nutritional importance of copper and zinc in neonates and infants // Clin. Chem, 26 (2): 185-189, 1980.
169. Wang H., Koschinsky M, Hamerton J. L. Localization of the processed gene for human ceruloplasmin to chromosome region 8q21.13—q23.1 by in situ hybridization // Cytogenet. Cell Genet, 47 (4): 230-231, 1988.
170. Wei Y, Cao X., Ou Y, Lu J., Xing C., Zheng R. SeO(2) induces apoptosis with down-regulation of Bcl-2 and up-regulation of P53 expression in both immortal human hepatic cell line and hepatoma cell line // Mutat. Res, 490 (2): 113-121,2001.
171. Williams B. A., Hirt R. P., Lucocq J. M, Embley Т. M. A mitochondrial remnant in the microsporidian Trachipleistophora hominis II Nature, 418 (6900): 865-869, 2002.
172. Yang F. M, Freidrichs W. E., Cupples R. L., Bonifacio M. J., Sanford J. A., Horton W. A., Bowman В. H. Human ceruloplasmin. Tissue-specific expression of transcripts produced by alternative splicing // J. Biol. Chem, 265 (18): 10780-10785, 1990.
173. Zaba B. N., Harris E. J. Uptake and effects of copper in rat liver mitochondria // Biochem. J, 160 (3): 707-714, 1976.
174. Zaitsev V. N., Zaitseva I., Papiz M., Lindley P. F. An X-ray crystallographic study of the binding sites of the azide inhibitor and organic substrates to ceruloplasmin, a multi-copper oxidase in the plasma // J. Biol. Inorg. Chem, 4(5): 579-587, 1999.
175. Zancani M., Peresson C, Biroccio A., Federici G., Urbani A., Murgia I., Soave C., Micali F., Vianello A., Macri F. Evidence for the presence of ferritin in plant mitochondria // Eur. J. Biochem, 271 (18): 3657-3664, 2004.
176. Zhao Н., Jin S., Fan F., Fan W., Tong Т., Zhan Q. Activation of the transcription factor Oct-1 in response to DNA damage // Cancer Res, 60 (22): 6276-6280, 2000.
177. Балакирев E. С., Айала Ф. Дж. Псевдогены: консервация структуры, экспрессия и функции // Журнал общей биологии, 65 (4): 306—321, 2004.
178. Васин А. В., Клотченко С. А., Платонова Н. А., Цымбаленко Н. В., Бабич В. С., Пучкова JI. В. Идентификация мРНК, предположительно кодирующей митохондриальную изоформу церулоплазмина крысы // Молекулярная биология, 39 (6): 933—944, 2005 а.
179. Васин А. В., Платонова Н. А., Клотченко С. А., Цымбаленко Н. В., Пучкова Л. В. Экспрессия псевдогена церулоплазмина в культивируемых клетках человека // ДАН, 397 (6): 254—257, 2004.
180. Васин А. В., Платонова Н. А., Повалихин Р. Г., Клотченко С. А., Самсонов С. А., Цымбаленко Н. В., Пучкова Л. В. Митохондриальный церулоплазмин млекопитающих // Молекулярная биология, 39 (1): 48— 60, 20056.
181. Гайцхоки В. С., Воронина О. В., Денежкина В. В., Плисс М. Г., Пучкова Л. В., Шварцман А. Л., Нейфах С. А. Экспрессия гена церулоплазмина в различных органах крысы // Биохимия, 55 (5): 927—937, 1990.
182. Горман К. Высокоэффективный перенос генов в клетки млекопитающих // в книге: «Клонирование ДНК. Методы» под ред. Д. Гловера, Москва: «Мир», с. 409—463, 1988.
183. Гюлиханданова Н. Е. Изучение регуляции экспрессии гена церулоплазмина в клетках молочной железы. Диссертация насоискание учёной степени кандидата биологических наук // ГУ НИИЭМ РАМН, Санкт-Петербург, 136 с, 2004.
184. Гюлгосанданова Н. Е., Цымбаленко Н. В., Платонова Н. А., Бабич В. С., Пучкова Л. В. Изучение регуляции активности гена церулоплазмина у млекопитающих // БЭБиМ, 137 (5): 553—559, 2004.
185. Зайцева Л. Г., Овчинникова Т. В., Гринкевич В. А. Импорт белков в митохондрии //Биоорганическая химия, 26 (9): 643—661, 2000.
186. Калинин В. Л\ Транскрипция и регуляции экспрессии генов // Санкт-Петербург: СПбГТУ, 248 с, 2001.
187. Нейфах С. А., Васильев В. Б., Шавловский М. М. Строение, каталитические свойства и эволюция церулоплазмина и других голубых белков // Успехи биол. химии, 23: 102—124, 1988.
188. Платонова Н. А., Барабанова С. В., Повалихин Р. Г., Цымбаленко Н. В., Даниловский М. АВоронина О. В., Дорохова И. И., Пучкова Л. В. In vivo экспрессия медь-транспортных белков в отделах мозга крыс // Известия РАН. Сер. биол, 2: 108—120, 2005.
189. Платонова Н. А., Жигулева Э. А., Цымбаленко Н. В., Мищенко Б. С, Васин А. В., Живулъко Т. В., Пучкова Л. В. Возрастные особенности биосинтеза и распределения церулоплазмина в организме крыс // Онтогенез, 35 (3): 171—182, 2004.
190. Пучкова Л. В., Алейникова Т. Д., Цымбаленко Н. В., Захарова Е. Т., Конописцева Л. А., Чеботарь Н. А., Гайцхоки В. С. Биосинтез и секреция церулоплазмина клетками молочной железы в период лактации // Биохимия, 59 (2): 341—348, 1994а.
191. Пучкова Л,. ВВербина И. А., Гайцхоки В. С, Нейфах С. А. Взаимодействие молекулярных форм церулоплазмина со специфическим рецептором мембран эритроцитов здоровых людей и больных гепатолентикулярной дегенерацией // Биохимия, 56 (12): 2261—2269, 1991.
192. Пучкова Л. В., Вербина И. А., Денежкина В. В., Шавловский М. М., Гайцхоки В. С., Нейфах С. А. Некоторые свойства рецептора церулоплазмина, выделенного из мембран эритроцитов человека // Биохимия, 55 (12): 2182—2189, 1990.
193. Пучкова Л. В., Платонова Н. А. Механизм, обеспечивающий гомеостаз меди у эукариотов, и его связь с транспортом железа // Успехи современной биологии, 123 (1): 41—58, 2003.
194. Пучкова, Л. В., Сасина Л. К., Алейникова 71 Д., Гайцхоки В. С. Взаимодействие церулоплазмина с рецептором плазматической мембраны CV-1 и его регуляция по типу обратной связи // Бюл. эксперим. биол. и мед, 4: 417—420, 1995.
195. Пучкова Л. В., Сасина Л. К., Алейникова Т. Д., Гайцхоки В. С. Внутриклеточный церулоплазминоподобный белок млекопитающих // Бюл. эксперим. биол. и мед, 117 (1): 83—85, 19946.
196. Самсонов С. А., Платонова Н. А., Скворцов А. Н., Цымбаленко Н. В., Васин А. В., Пучкова Л. В. Активность гена CTR1 и статус меди в различных органах крысы // Молекулярная биология, 40 (2): 239—251, 2006.
-
Клотченко, Сергей Анатольевич
-
кандидата биологических наук
-
Санкт-Петербург, 2008
-
ВАК 03.00.04
- Идентификация молекулярной формы церулоплазмина, локализованной в митохондриях крысы
- Роль надпочечников в регуляции метаболизма меди в печени
- Идентификация и исследование функций НАДН-зависимой редуктазы внешних отделов митохондрий, ответственной за активацию ксенобиотиков
- Медь в гепатоцитах каракульских овец в норме и при нарушениях ее обмена
- Глутаматдегидрогеназа мозга человека в норме и при шизофрении
