Глутаматдегидрогеназа мозга человека в норме и при шизофрении

Воробьева, Елена Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Глутаматдегидрогеназа мозга человека в норме и при шизофрении
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Глутаматдегидрогеназа мозга человека в норме и при шизофрении"

На правах рукописи

Воробьева Елена Анатольевна

ГЛУТАМАТДЕГИДРОГЕНАЗА МОЗГА ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ И ПРИ ШИЗОФРЕНИИ.

03.00.04.-Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2003

Работа выполнена в Научном Центре психического здоровья РАМН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Г.Ш. Бурбаева

Официальные оппоненты: член-корр. РАМН, доктор биологических наук, профессор В.П.Чехонин доктор биологических наук, профессор С.П. Сяткин

Ведущая организация: Институт биохимии им А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится 19 сентября 2003 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.13 в Российском Университете дружбы народов по адресу: 117198, ГСП, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского Университета дружбы народов по адресу: 117198, ГСП, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.

Автореферат разослан «_»_2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат фармацевтических наук,

доцент

Актуальность проблемы. Одной из нейрохимических гипотез патогенеза шизофрении является «глутаматергическая гипотеза» о нарушении глугаматного нейромедиаторного пути (глутамат служит возбуждающим нейромедиатором в нервной системе).

Установлено, что изменения метаболизма глутамата (Глу), приводящие к нарушениям нейромедиаторной системы в мозге при шизофрении, обусловлены нарушением процессов его захвата переносчиками и его связывания со специфическими рецепторами (Heresko-Levy et al.,1998, Ohuma et al.,1998, Axbarianet et al.,1996). В течение последних двух лет в мозге больных шизофренией обнаружены изменения уровней ферментов, участвующих в метаболизме Глу, таких как, глутаминсинтетаза (Терешкина и др., 2000), фосфатактивируемая глутаминаза и глутаматдекарбоксилаза (Gluck et al.,2002, Me Cullumsmith et al.,2002, Dracheva et al.,2002).

Глутаматдегидрогеназа (ГДГ, КФ 1.4.1.3) является одним из ключевых ферментов метаболизма глутамата.

В настоящее время еще не сложилось единого мнения как относительно функции (преимущественного направления реакции в сторону биосинтеза или деградации глутамата), так и о клеточной локализации ГДГ в нервной ткани человека и животных.

Активность ГДГ выявлена в нейронах и в глии (Subbala-Kshmi and Murty,1985, Aree et al., 1990). Иммуногистохимические исследования показали, что ГДГ преимущественно локализована ь астроцитах (Rothe et al., 1990) и в олигодендроцитах (Werner et al.,2001), напротив, молекулярно-биологические данные свидетельствуют о значительной экспрессии гена ГДГ в нейронах (судя по содержанию мРНК) (Smitt and Kurar,1999). Противоречие результатов исследования ГДГ может быть обусловлено гетерогенностью этого фермента в нервной ткани.

ГДГ мозга человека, а тем более при патологии нервной системы, в частности при шизофрении не изучена. В литературе имеются данные об изменении содержания ГДГ при нейродегенеративных расстройствах (Plaitakis et al.,1984, Hussain et al.,1989).

Безусловно, исследования, проведенные на аутопсийном материале, помогают понять механизмы развития заболевания. Однако, поиск соответствующих изменений в работе глутаматергической системы на периферии и проведение прижизненных обследований больных может быть полезным для разработки диагностических и прогностических тестов.

Из литературы известно, что тромбоциты, выделенные из кропи человека, могут служить удовлетворительной моделью, отражающей процессы, которые происходят в нервной ткани. В тромбоцитах обнаружены компоненты серотонинергиче« ой

системы (Sneddon, 1973, Белоус и др.,1999) и глутаматергической системы: рецепторы и переносчики глутамата (Berk et al.,2000, Fetrarese et al.,2000), фосфатактивируемой глутаминазы и ГДГ (Gluck et al.,2000). Таким образом в связи с глутаматергической гипотезой патогенеза шизофрении изучение ГДГ, как в мозге, так и в тромбоцитах человека, при этом заболевании представляется актуальным.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является оценка возможного участия ГДГ в нарушении метаболизма глутамата при шизофрении. В задачи исследования входило: '

1. Выделение ГДГ из ткани мозга лиц, не страдавших психическими или нервными заболеваниями.

2. Характеристика физико-химических свойств ГДГ.

3. Сравнительная оценка уровня активности ГДГ в экстрактах бенков различных областей мозга человека в контрольной гр;»ппе (лииа, не страдающие неврологическими и психическими расстройствами) и при шизофрении.

4. Получение моноспецифичных антител к ГДГ мозга человека.

5. Сравнительное изучение содержания ГДГ в мозге в контрольной группе и при шизофрении.

6. Сравтгительное изучение содержания ГДГ в тромбоцитах в контрольной группе и при шизофрении.

Научиая новизна работы. Впервые обнаружены три изоформы ГДГ: две растворимые изоформы, с молекулярными массами субъединиц 58 кДа (ГДП) и 56 кДа (ГДГ11), и мембрано-ассоциированная изоформа, с молекулярной массой субъединиц 56 кДа (ГДГ111). Ферментативная активность ГДГ в экстрактах белков мозга является суммарной активностью растворимых изоформ.

Получгны специфичные поликлональные антитела к ГДП, ГДГИ и к ГДГП1 мозга человек«. Методом вестерн - иммуноблоттинга установлено, что антисыворотка к ГДП и ГДГИ распознает оба изофермента, в то время как очищенная ассоциированная с мембранами ГДГ111 обнаруживается только специфичными к ней антителами, причем перекрестная реакция между легко растворимыми и ассоциированной с мембранами формами практически отсутствует.

Адаптирован метоп иммуноблоттинга с хемилюминесцентным усилением сигнала и подобраны системы, позволяющие определять уровни всех трех изоферментов ГДГ. Сравнительная оценка содержания иммунореак гквных ГДП , ГДГ11 и ГДГП1 при шизофрении и в контрольных случаях в лобной, передней и задней лимбической коре и коре мозжечка проведена с использованием этого метода. Содержание ГДГ при шизофрении в лобной (р<0.01), задней лимбической (р<0.01) коре и коре- мозжечка (р<0.05) повышено. Впервые выявлено достоверное

повышение (р<0.01) содержания ГДГ в тромбоцитах при шюофрении по сравнению с контрольной группой.

Теоретическая и практическая значимость работы. В работе обнаружены и охарактеризованы три изоформы ГДГ мозга человека. Получены специфичные поликлональные антитела, распознающие растворимые и мембрано-ассоциированнуто ГДГ. Выявлено изменение содержания ГДГ в отдельных областях мозга при шизофрении по сравнению с контролем. Впервые обнаружено изменение содержания ГДГ при шизофрении в элементах крови - тромбоцитах. Результаты исследования могут быть использованы при изучении метаболизма возбуждающего медиатора нервной системы — глуг.чмата и при изучении патогенеза шизофрении. Наряду с содержанием кальция, активностью NMDA рецепторов в тромбоцитах, содержание ГДГ в тех же элементах крови может отражать статус глутаматергической системы у больных шизофренией.

Основные положения, выносимые на зашн гу.

1. Ферментативная активность ГДГ в экстрактах мозга человека представлена суммарной активностью трех изоформ ГДГ, различающихся по физико-химическим свойствам.

2. Содержание растворимых и мембрано-ассоциироаанной ГДГ при шизофрении в лобной, задней лимПической коре, коре мозжечка достоверно повышено (р<0.01, р<0.01, р<0.05, соответственно) по сравнению с контрольной группой.

3. Содержание растворимых изоформ ГДГ в тромбоцитах достоверно повышено (р<0.01) при шизофрении по сравнению с контрольной группой.

4. Предложен способ определения содержания изоформ ГДГ в экстрактах мозга человека и в тромбоцитах крови человека. В основу метода положены электрофорез в ПААГ с ДС-Na, вестерн-иммуноблоттинг с хемилюминесцентным усилением сигнала, сканирование на денситометре.

Апробация диссертационного материала.

Результаты исследования были доложены на: конференции «Механизмы структурной, функциональной и нейрохимической пластичности мозга» (НИИ Мозга РАМН, Москва, 1999г.); межлабораторной конференции НЦПЗ РАМН «Прогресс в области биологической психиатрии» (2000г); XIII съезде психиатров России, Москва, 2000; конференции «Новое в изучении пластичности мозга» (НИИ Мозга РАМН, Москва, 2000г.); World Congress of Biological Psychiatry

(2001); 5-th European Meeting on Glial Cell Function in Health and Disease

(2002); Всероссийской конференции «Проблемы медицинской

энзимологии» (Москва, Россия, 2002); European Congress of Biological Psychiatry (June, 2002).

По теме диссертации опубликовано 11 научных работ: 4 статьи, 7 тезисов.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на _ страницах и состоит из 6 разделов, включающих введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и указатель литературы. Обзор литературы посвящен исследованиям роли глутаматдегидрогеназы в метаболизме глутамата в мозге человека в норме и при патологии нервной системы, изложена глутаматергическая гипотеза шизофрении. Библиографический указатель состоит из _ источников отечественной и зарубежной литературы. Диссертация иллюстрирована _ рисунками и таблицами.

Содержание работы.

1. Материалы и методы исследования.

Объектом исследования служил аутопсийный материал: мозг психически здоровых людей и больных шозофренией. Контрольная группа насчитывала 9 случаев, группа больных шизофренией - 8 пациентов, из них 4 случая с непрерывнотекущей параноидной формой , 3 случая с параноидной приступообразной прогредиентной формой и 1 случай с непрерывнотекущей резидуальной формой. Причина смерти в обеих группах - острая сердечно-сосудистая недостаточность, инфаркт миокарда или тромбоэмболия легочной артерии.

Для выделения фермента был использован мозг человека, не страдавшего психическими и неврологическими расстройствами. В сравнительных исследованиях уровней активности и содержания ГДГ использовали аутопсийныс образцы следующих областей мозга, взятых по атласу по Бродман: лобная кора - поле 10, передняя лимбическая кора -поле 24, задняя лимбическая кора - поле 23, кора мозжечка. Группы не отличались по времени, прошедшему после смерти до взятия ткани мозга. Образцы структур мозга замораживали в жидком азоте и хранили до использования при температуре -70°С.

В сравнительных исследованиях содержания ГДГ в тромбоцитах использовали клетки, выделенные из образцов крови лиц контрольной группы (психически здоровые доноры), насчитывающей 22 случая, и 23 случая больных с диагнозом параноидная шизофрения с эпизодическим течением с прогрессивным дефицитом, параноидная шизофрения с эпизодическим течением со стабильным дефицитом.

Для выделения изоформ ГДГ применяли дифференциальное центрифугирование, фракционирование сульфатом аммония, колоночную

хроматографию: гидрофобную - на фенил-сефарозе 4В, ионообменную - на сефарозе Q, ионообменную - на ДЭАЭ-сефацеле, адсорбционную - на оксиапатите и аффинную - на ГТФ-агарозе. Выделенные образцы ферментов хранили при -20°С в 50 мМ трис-HCl буфере, содержащем 1,4 мМ 2-меркаптоэтанол и 40% глицерин, pH 7,4.

Концентрацию белка определяли по методу Lowri [1951]. Гомогенность белков определяли методом электрофореза в ПААГ с ДС Na (Laenmili,1970). Для определения изоэлекгрической точки субъединиц ферментов проводили двумерный электрофорез по методу O'Farrel [1975] в градиенте pH 5-8,5.

Для приготовления экстрактов мозга 200 мг ткани гомогенизировали в четырех объемах буфера низкой ионной силы (20 мМ трис-HCI, pH 7,0). Гомогенат центрифугировали 1 час при 60 000 g.

Тромбоциты выделяли по методу, разработанному Брусовым (2000).

Активность ГДГ измеряли спсктрофотометрически в прямой реакции восстановительного аминирования а-кетоглутарата и в обратной реакции окислительного дезаминирования L-глутамата по методу Fahien and Cohen (1970). Удельную активность ГДГ выражали в мкМ окисленного NADH в расчете на 1 мг белка за одну минуту при 20°С.

Для получения антисывороток кроликов иммунизировали очищенными препаратами ГДГ1, ГДП1 и ГДГШ. Титр и специфичность полученных антисывороток определяли методом вестерн-иммуноблоттинга (Towbin, 1979). Антисыворотки использовали для сравнительной оценки содержания ГДГ1, ГДГП и ГДГШ у лиц контрольной группы и больных шизофренией по иммунореактивности методом вестерн-иммуноблоттинга с хемшпоминесцентным усилением сигнала (Amersham-Pharmacia Biotech) с засветкой рентгеновской пленки. Достоверность различий между полученными данными в контрольной группе и группе больных шизофренией определяли по непараметрическому U-тесту Вилкоксона-Манна-Уитни. Различия между измерениями считали достоверными, если значение р было меньше 0,05.

2. Основные результаты исследования.

Выделение ГДГ из мозга человека.

В настоящей работе предложен способ разделения и очистки изоферментов ГДГ, представленный на схеме 1.

Ткань мозга 300 г измельчали скальпелем и гомогенизировали в пяти объемах буфера, содержавшего 10 мМ трис- HCl, pH 7,4, 0,1 мМ ФМСФ, 0,5 мМ ЭДТА, гомогенат центрифугировали при 480g в течение 10 мин. В супернатант 1 добавляли тритон Х-100 и NaCl до конечной концентрации 1% и 0,5 М, соответственно, после чего белки осаждали

сульфатом аммония в интервале насыщения 30-60%. Затем проводили очистку ГДГ на колонке с фенил-сефарозой 4В. При элюции белков двойным градиентом (0-90% этиленгликоль и 15-0% насыщения сульфат аммония) (рис. 1) было обнаружено три пика активности ГДГ, которые мы обозначили: ГДГ1, ГДГП и ГДГШ.

Разделение «растворимых» и «мембрано-ассоциированой» белков (схема 1) проводили центрифугированием супернатанта 1 при 100000g.

В супернатанте содержатся растворимые изоформы ГДГ, в осадке -мембрано-ассоциированная ГДГ. Осадок растворяли п буфере, содержавшем 1% тритон Х-100 и 0,5 М NaCl, затем белки осаждали сульфатом аммония в интервале насыщения 30-60%, после чего проводили очистку на колонке с фенил-сефарозой 4В. При элюции белков двойным градиентом (0-90% этиленгликоль и 15-0% насыщения сульфат аммония) наблюдали один пик с активностью ГДГ, который элюировался «60% этиленгликолем (рис. 2). Дальнейшую очистку этой мембрано-ассоциированной изоформы ГДГ (ГДПП) проводили по схеме 1.

«Растворимую» ГДГ выделяли из супернатанта 2 (схема 1). При хроматографии белков растворимой фракции на колонке с фенил-сефарозой 4В было обнаружено два пика активности ГДГ (рис. 3). Первая фракция с ГДГ активностью (пик I элюировался »40% этиленгликолем) существенно перекрывалась второй фракцией с ГДГ активностью (пик II элюировался »50% этиленгликолем). Последующие стадии очистки «растворимой» фракции ГДГ (ГДП и ГДГП) проводили по схеме 1. Результаты очистки изоформ ГДГ представлены в таблицах 1 и 2.

Разделение изоформ ГДГ растворимой фракции проводили по модифицированному методу Cho et. al.(1995). Супернатант 2 очищали на колонке с сефарозой Q. Элюцию проводили ступенчатым градиентом NaCl (20мМ, 200мМ, 400мМ NaCl соответственно). Фракции, содержащие активность ГДГ, элюировались при 200мМ NaCl. Затем проводили очистку на колонке с фенил-сефарозой 4В. Наблюдалось два пика активности ГДГ. Из-за близости гидрофобных свойств пики существенно перекрывались. Таким образом, не представляется возможным разделение растворимых изоформ на колонке с фенил-сефарозой 4В. Последующее разделение ГДП и ГДГП проводили на колонке с оксиапатигом. Элюцию проводили ступенчатым градиентом ЗОмМ, 50мМ, ЮОмМ и 200мМ К-фосфат, рН 7,2. Первый пик активности, содержащий ГДП, элюировался при ЮОмМ К-фосфата, второй пик активности, содержащий ГДГП, элюировался 200мМ К-фосфата (рис. 4).

Дальнейшую очистку каждой растворимой изоформы ГДГ проводили по схеме 1.

Схема 1. Выделение и очистка глутаматдегидрогеназы мозга

Рисунок 1. Профиль элюции белков мозга человека, экстрагированных 1% тритоном +0,5 М ЫаС1, при хроматографии на колонке с фенил-сефарозой 4В.

Рисунок 2. Профиль элюции ГДГ фракций, содержащих «мембрано-ассоциированную» ГДГ, при хроматографии на колонке с фенил-сефарозой 4В.

Рисунок 3. Профиль элюции фракций, содержащих «растворимую» ГДГ, при хроматографии на колонке с фенил-сефарозой 4В.

А280

1 5 -

1 0 -05 -

Рисунок 4. Профиль элюции фракций, содержащих «растворимые» ГДГ, при хроматографии на колонке с оксиаиатитом.

Таблица 1. Очистка ГДГ1 и ГДГП из мозга человека.

Стадии очистки Белок (мг) Активность ГДГ(ед) Удельная активность (мкМУмгб елка/мин) Степень очистки

Гомогенат Супернатант (100 000 в) 18200.0 ' 3081.0 ~ 399 600 263425 21.9 85.5 1 4

Осадок 30-60% (ЫН4)2804 236.8 23 180 97.9 4.5

Фенил-сефароза 4В 177.5 18 500 104.2 5

ДЕАЕ-сефацель 3.7 11080 3019.1 138

ГТФ-агароза 1.2 5 130 4275.0 193

Таблица 2. Очистка ГДГШ из мозга человека.

Стадии очистки Белок (мг) Активность ГДГ(ед) Удельная активность (мкМ/мгбепка/мин) Степень очистки

Гомогенат 18 200 399 600 21 9 1

осадок П 00 000 е) 1 680 73 416 43 7 2

Осадок 30-60% (ЫН^О., 710 37 133 52 3 2.5

Фенил-сефароза 4В 74 35 860 481.6 22

ДЕАЕ-сефацель 20 20 600 1030 47

ГТФ-агароза 0.9 5112 5 680 256

Определение молекулярной массы и изоэлектрической точки ГДП, ГДГН и гдпп.

Выделенные изоформы ГДГ представляли собой электрофоретически гомогенные белки при электрофорезе в ПААГ с ДС-Иа с молекулярной массой субъединиц 58 кДа (ГДП), 56 кДа (ГДГН) и 56 кДа (ГДГ1П), соответственно (рис. 5). Выявлена микрогетерогенность ГДГ субъединиц по значениям изоэлектрической точки. Субьединицы ГДП разделяются на несколько «субфракций» (по крайней мере 5) в интервале ИЭТ 7,5-6,6, 17СГП на 6 «субфракций» в интервале ИЭТ 7,3-6,6, ГДГГИ разделяется на пять «субфракиий» в интервале ИЭТ 7,5-6,6(рис. 6).

Характеристика физико-химических свойств ГДГ.

Как было указано ранее, все три изоформы ГДГ обладают различной гидрофобностыо.

При изучении устойчивости изоформ ГДГ к температурному фактору было обнаружено, что после 30 мин инкубации при 45°С ГДГ I сохраняет 40% активности, ГДП1 сохраняет 60% активности, тогда как ГДГ III-90%.

Активнссть ГДГ как прямой так и обратной реакции стимулируется АБР (150% активности наблюдалось в присутствии 0,25 - 0,5 мМ АЭР в реакционной смеси).

Кинетические параметры для ГДГ I, ГДГ II и ГДГ III приведены в таблица 3.

Таблица 3. Кинетические параметры (Km) для ГДГ I, ГДГ II и ГДГ III мозга человека.

Субстрат Кт(мМ)

ГДП ГДГН ГДГШ

NH/ 19.7011.80 17.6011.40 20.5012.40

а-кетоглутарат 1.50:1:0.080 3.40+0.50 1.2010.45

NADH 0.04±0.01 0.0910.03 0.0610.01

NAD+ 0.34 ±0.02 0.4410.06 0.3710.07

L- глутамат 4.4510.31 3.2310.18 3.1010.38

Ш94

- - г

'^ijfi §

>30

.tfc-4 ■■чшгивк».

Рисунок 5. Электрофореграммаюоформ ГДГ. (а) - маркеры молекулярных масс; (б,г) - ГДП и ГДГП, молекулярная масса субъединиц, 58 и 56 кДа; (в) - ГДГ Ш, молекулярная масса субъединиц 56 кДа; (д) - ГДП; (е) - ГДГП.

вт

f 43

L I ii i GDH1 Г гОни

4.8 Pi

- 6,7

4 8 pi

48 Pi

Рисунок 6. Двумерная электрофореграмма ГДГ [, ГДГ1Г (А) и ГДГ III (Б). Маркеры молекулярных масс, кДа, указаны на рисунке слева и справа. В качестве стандартов ИЭТ (pi) - карбомилированные глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (сверху) и карбоангидраза (внизу) (6.7-4.8).

Получение специфичных антител.

Специфичность полученных антител к изоформам ГДГ была изучена с помощью вестерн-иммуноблоттинга. Показано, что антисыворотка к растворимым ГДГ1 и ГДП1 имеет высокую степень перекреста, в то время как мембрано-ассоциированная ГДГ III обнаруживается только специфичными к ней антителами, причем перекрестная реакция между легко растворимыми и ассоциированной с мембранами формами практически отсутствует.

Сравнительное изучение ферментативной активности и содержания (по иммунореактивности) ГДГ в мозге у лиц контрольной группы и при шизофрении.

Определена ферментативная активность растворимых изоформ ГДГ в лобной коре (поле 10), передней (поле 24), задней (поле 23) лимбичсской коре и коре мозжечка в контрольной группе и при шизофрении. Ферментативная активность ГДГ (рис. 7) при шизофрении по сравнению с контрольными случаями достоверно повышена (р<0.01) в лобной коре, задней лимбической коре и коре мозжечка.

Активность ГДГ, определенная в мозговом экстракте, представляет собой сумму ферментативных активностей растворимых изоформ ГДГ, и измерение общей активности не дает информации относительно уровня активности каждой изоформы ГДГ. Так как ГДГ I и ГДГ II имеют различную молекулярную массу (58кДа и 56кДа), то после электрофоретического разделения в ПААГ методом ЕСЬ-Вестерн иммуноблоттинга при использовании специфической антисыворогки к растворимым изоформам можно оценить содержание по иммунореактивности каждой из них. Данным методом при использовании моноспецифичной антисыворотки к мембрано-ассоциированной ГДГ (ГДГ III) представляется возможным оценить ее содержание в экстрактах мозга. Таким образом нам удалось разработать способ раздельного определения содержания изоформ ГДГ.

Иммунореактивность ГДГ1 (рис. 8) и ГДГП (рис. 9) достоверно повышена в экстрактах мозга больных шизофренией в поле 10 (р<0,01), поле 23 (р<0,01) и в мозжечке (р<0,05) по сравнению с контролем; не выявляются различия в поле 24. Иммунореактивность ГДГШ достоверно повышена в экстрактах мозга больных шизофренией поле в 10 (р<0,01), поле 23 (р<0,01) и в мозжечке (р<0,01) по сравнению с контролем; не выявляются различия в поле 24 (рисунок 10).

I-

8 »

£ яо

1 ^ 9 я»

□

—й

~0"" -О-

~хтг

■ контроль П.10 а контроль П.23

• контроль п.24

♦ контроль мозжечок

шизофрения л. 10 шиза зрения п.23 шиза зрения п.24 шизофрения мозжечок

Рисунок 7. Активность ГДГ в лобной коре (поле 10), передней (поле 24), задней (поле 23) лимбической коре и коре мозжечка в контрольной группе и при шизофрении.

Двумя звездочками обозначены достоверные различия - (р<0.01).

□ •ЛгА •

Дй А

а в : о

>0000 9000 0 1 -ВГ-* А • * о •йг

■■ -4-А А "8

* а"

■ контроль п.10 в шиэоф

а контроль п.23 а шизос

• контроль п.24 о шизоф

♦ контроль мозжечок о шизо!

прения п.10 прения п.23 фения п.24 френия мозжечок

Рисунок 8. Содержание ГДГ I в лобной коре (поле 10), передней (поле 24), задней (поле 23) лимбической коре и коре мозжечка в контрольной группе и при шизофрении.

Одной звездочкой обозначены достоверные различия - (р<0.05), двумя звездочками обозначены достоверные различия - (р<0.01).

п А

а Л А Й £

и л о

& А д

—а*

...А. • 9? ♦ Л-

4 —§— <£Ь 1 °

■ контроль п. 10

* контроль п.23

• контроль п.24

♦ контроль мозжечок

юфрем шизос >рен! *1за)рен1 13офрен1

□ ШИ31 &

о цм о ши:

1ия п. 10 ия п.23 ия п.24 ия мозжечок

Рисунок 9. Содержание ГДГ П в лобной коре (поле 10), передней (поле 24), задней (поле 23) лимбической коре и коре мозжечка в контрольной группе и при шизофрении.

тгсга

-Ь-Ь,

— а _.

■ контроль Л 10

л контроль л. 23

* контроль п.24

» контроль мозжечок

□ шизофрения п.10

д шизос >рения л.23

о шизсх зрения п.24

о шизофрения мозжечок

Рисунок 10. Содержание Г,ЦТ Ш в лобной коре (поле 10), передней (поле 24), задней (поле 23) лимбической коре и коре мозжечка в контрольной группе м при шизофрении.

Двумя звездочками обозначены достоверные различия - (р<0.01).

Сравнительное изучение содержания ГДГ в тромбоцитах в контрольной группе и при шизофрении.

Нами была обнаружена иммунореактивность изоферментов ГДГ в тромбоцитах иммуноблоттингом с использованием антител, полученных к изоферментам ГДП и ГДП1 из мозга человека, а ГДГП1 - с антисывороткой к ГДГШ.

Определено содержание растворимых ГДГ по иммунореактивности в тромбоцитах в контрольной группе и при шизофрении. Кровь для исследований была взята у больных до проведения психотропно Я терапии.

Уровень иммунореактивности ГДГ в группе больных достоверно превышает уровень в контрольной группе (рис. 11),

I контроль (п*22)

□ больны» шизофренией (л=23) — медиана

Рисунок 11. Содержание ГДГ в тромбоцитах в контрольной группе и при шизофрении.

Двумя звездочками обозначены достоверные различия - (р<0.01).

Таким образом, в работе показаны увеличение содержания изоформ ГДГ при шизофрении в лобной коре (поле 10), задней лимбической коре (поле 23) и коре мозжечка по сравнению с контрольной группой, а также в тромбоцитах крови больных шизофренией. Данные результаты могут быть использованы при изучении метаболизма глутамата, играющего роль в патогенезе шизофрении. Уровень иммунореактивности ГДГ в тромбоцитах мог бы послужить полезным прижизненным маркером, отражающим статус г/гутамат ергической системы у больных шизофренией.

il Обсуждение.

В последнее время в мозге больных шизофренией обнаружены изменения активности и содержания ферментов, участвующих в метаболизме глутамата, таких как глутаминсинтетаза, активируемая фосфатом глутаминаза, а также глутаматдекарбоксилаза: так, обнаружено достоверно«! повышение ферментативных активностей и уровней мРНК активируемой фосфатом глутаминазы и глутаматдекарбоксилазы в таламусе и префронтальной коре больных шизофренией (Терешкина и др., 2000, Gluck et al.,2002, McCullumsmith et al.,2002, Dracheva et al.,2002).

Таким образом, нарушение функционирования глутаматергической системы в мозге при шизофрении может быть связано с изменением ферментов глутамат/глутаминового цикла.

Настоящая работа посвящена изучению глутаматдегидрогеназы (ГДГ, КФ 1.4.1.3.) - одного из ключевых ферментов метаболизма глутамата.

Нами было показано, что в экстрактах мозга человека присутствуют три фермента, обладающих искомой активностью. Все три изоформы ГДГ были выделены из ткани мозга человека и очищены. Две из них -растворимые формы ГДГ! и ГДШ, а третья, ГДГШ, связана с мембранами. Молекулярная масса субьединиц ГДГ1 - 58кДа, ГДГП и ГДГШ -56 кДа. ГДП, ГДГП и ГДГШ различаются между собой по гидрофобности, термостабильности и кинетическим параметрам.

Получены специфичные поликлональные антитела к растворимым ГДГ (ГДГ1 и ГДГП) и к мембрано-ассоциированной ГДГШ.

Выделенные изоформы ГДГ и полученные к ним специфичные антитела послужили основой в разработке подхода к количественной оценке изоформ ГДГ в мозге человека.

Мы адаптировали иммуноблотганг с хемилюминесцентным усилением сигнала и подобрали системы, позволяющие определять количество ло иммунореактивносги отдельных изоферментов ГДГ.

Было показано достоверное повышение содержания растворимых изоформ ГДП, ГДГП и ассоциированной с мембранами ГДГШ в экстрактах лобной коры, задней лимбической коры и коры мозжечка при шизофрении по сравнению с контролем. В передней лимбической коре различия не были выявлены.

ГДП, ГДГП и ГДГПТ были обнаружены в тромбоцитах человека методом иммуноблотганга с применением политональных антител к изоферментам ГДГ, полученных в данной работе. Содержание растворимой ГДГ в тромбоцитах человека достоверно выше в группе больных шизофренией, чем в контрольной группе. Предполагается, что

уровень иммунореактивности ГДГ можег быть использован как маркер глутаматергической системы у больных шизофренией.

Полученные результаты поддерживают наше предположение о нарушении функционирования ферментов метаболизма глутамата в мозге при шизофрении.

Наши данные расширяют представления о нейрохимических механизмах развития патологического процесса в мозге при шизофрении. По-видимому, обнаруженные изменения активности и содержания ГДГ вовлечены в нарушение работы Глу/Глн цикла и следовательно всей глутаматергической системы в мозге.

ВЫВОДЫ

1. В мозге человека впервые обнаружены три изофермента глутаматдегидрогеназы (ГДГ, КФ 1.4.1.3). Два из них (ГДП и ГДГН) содержатся в растворимой фракции экстрактов мозга, а третий (ГДГ III) является мембрано-ассоциированным изоферментом.

2. Охарактеризованы физико-химические свойства изоформ ГДГ.

• Гомоолигомеры ГДП и ГДГИ состоят из субъедимиц с молекулярными массами 58±1кДа и 56±1кДа, соответственно. ГДГ III имеет молекулярную массу субъединиц 56±1кДа.

• Обнаружена микрогетерогенность субъединиц: для ГДП - 5 субфракций в интервале ИЭТ 7,5-6,6, для ГДГИ - 6 субфракций в интервале ИЭТ 7,3-6,6, для ГДГ Ш - 5 субфракций в интервале ИЭТ 7,5-6,6.

• Изоформы ГДГ I, ГДГ П и ГДГ Щ различаются между собой по гидрофобным свойствам, термостабильности и кинетическим параметрам для а-кетоглутарата,. NH/, NADH, NAD, L-глутамата.

3. Получены специфические поликлональные антитела к растворимым изоферментам ГДГ (ГДГ I и ГДГ II) и мембрано-ассоциированной ГДГ III.

4. Содержание ГДГ I и ГДГ II и ГДГ III при шизофреиии достоверно повышено по сравнению с контрольными случаями в лобной коре, в задней лимбической коре и коре мозжечка, содержание ГДГ Ш достоверно повышено во всех перечисленных областях мозга. Ферментативная активность ГДГ в этих областях мозга человека так же достоверно повышена.

5. Содержание растворимых изоформ ГДГ (ГДГ I и ГДГ II) в тромбоцитах при шизофрении достоверно повышено по сравнению с контрольной группой.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Бокша И.С., Герешкина Е.Б., Турищева М.С., Савушкина O.K., Воробьева Е.А., Бурбаева Г.Ш. Гетерогенность глутаминсит етазы и глутаматдегидрогеназы мозга человека // Материалы конференции "Механизмы структурной, функциональной и нейрохимической пластичности мозга", НИИ Мозга РАМН, Москва, 1999г.- с. 16.

2. Г.Ш. Бурбаева, И.С. Бокша, М.С. Турищева, Е.Б. Терешкина, Е.А. Воробьёва, O.K. Савушкина. Нарушение функционирования

ключевых ферментов метаболизма глугамата в лобной коре при шизофрении // Тез. XIII съезда психиатров России,- 2000.- С.352.

3. Е.А.Воробьева, М.С. Турищева, Г.Ш. Бурбаева. Повышение активности и содержания глутаматдегидрогеназы в лобной коре при шизофрении. // Тез. Конференции «Новое в изучении пластичности мозга».- Москва.- 2000г.- С.23.

4. Г.Ш. Бурбаева, И.С. Бокша, М.С. Турищева, O.K. Савушкина, Е.Б. Терешкина, Е.А. Воробьёва. Нарушение метаболизма глутамата в мозге при психической патологии (болезни Альцгеймера и шизофрении) И Вестник РАМН.-2001.-№ 7.-С.34-37.

5. Burbaeva G. Sh., Boksha I.S., Turishcheva M.S., Tereshkina B.B., Vorobyeva E.B. Glutamine syntetasc and glutamate dehydrogenase in frontal cortex of patients with schizophrenia // The World Journal of Biological Psychiatry.-2001 .-V.2.-S. 1 .-P.286S.

6. Burbaeva G. Sh., Turishcheva M.S., Vorobyeva E.B., Savushkina O.K., Tereshkina E.B., Boksha I.S. Diversity of glutamate dehydrogenase in human brain // Progress in Neuro-Psyhopharmacology and Biological Psychiatry.-2002.-V.26.N3.-P.427-435.

7. G.Sh. Burbaeva, I.S. Boksha, M.S.Turishcheva, E.B. Tereshkina,-Savushkina O.K. Vorobyeva E.A. Glial glutamate metabolizing enzymes in frontal cortex of patients with schizophrenia // Abstracts of fifth European Meeting on Glial Cell Function in Health and Disease.-Glia.-2002.-S.1.- P.80.

8. Г.Ш. Бурбаева, И.С. Бокша, M.C. Турищева, Е.А. Воробьёва, Е.Б. Терешкина, O.K. Савушкина. Ферменты метаболизма глутамата (глутаматдегидрогеназа и глутаминсинтетаза) в ткани мозга при шизофрении // Тезизы Всероссийской конференции "Проблемы медицинской энзимологии",- Москва.- 2002.-С.40.

9. Г.Ш. Бурбаева, И.С. Бокша, М.С. Турищева, Е.Б. Терешкина, O.K. Савушкина, Е.А. Воробьёва. Ферменты метаболизма глутамата в мозге и тромбоцитах больных шизофренией // Сибирский вестник психиатрии и наркологии.-2003.-№1(27).-С.36-39.

10.Burbaeva G. Sh. , Boksha I.S., Tereshkina E.B., Vorobyeva E.B., Morozova M.A., Jarkova N.B., Turishcheva M.S., Savushkina O.K. Glutamate dehydrogenase immunoreactiviti in platelets in schizophrenia // The World Journal of Biological Psychiatry.-2001.-V.3.-S. 1 .-P.32.

11.Burbaeva G. Sh. , Boksha I.S., Turishcheva M.S., Vorobyeva E.B., Savushkina O.K., Tereshkina E.B. Glutamine synthetase and glutamate dehydrogenase in prefrontal cortex of patients with schizophrenia // Progress in Neuro-Psyhopharmacology and Biological Psychiatry.-2003.-V.27.-P.675-680.

Воробьева Елена Анатольевна

Россия

Глутаматдегидрогеназа мозга человека в норме и при шизофрении.

Из мозга человека впервые выделены и охарактеризованы по физико-химическим свойствам три изофермента глутаматдегидрогеназы (ГДГ, КФ 1 4.1.3), одного из ключевых ферментов метаболизма глутамата. Получены специфические поликлональные антитела к изоферментам ГДГ, что дало возможность разработать метод количественного определения изоформ Г,ЦГ в экстрактах мозга и тромбоцитах с использованием полученных специфичных поликлональных антител вссгерн-иммуноблоиингом с хемилюминесцентным усилением сигнала. Показано увеличение содержания всех трех изоформ ГДГ в лобной коре, задней лимбической коре и коре мозжечка, а также изменение содержания ГДГ в тромбоцита < при шиюфрении. Полученные данные указывают на участие ГДГ в нарушении мет аболизма глутамата при шизофрении.

Vorobyeva Elena A.

Russia

Glutamate dehydrogenase in brain from controls and patients with schizophrenia.

Three isoenzymes of glutamate dehydrogenase (GDH, EC 1.4.1.3), the key glutamate metabolizing enzyme, are isolated and characterizied. Specific polyclonal antibodies against these isoenzymes are raised enabling quantitive determination of the GDH isoenzymes in human brain extracts and platelets using Western immunoblotting with chemiluminescence amplification (ECL -immunoblotting). Elevation of the amount of all GDH isoenzymes in frontal cortex, posterior cingulate cortex and cerebellum as well as elevation of GDH amount in platelets from patients with schizophrenia compared with controls was found. The data suggest the involvement of GDH in the glutamate metabolism disturbance in schizophrenia.

1ЩГ

* 126 1 9 /

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Воробьева, Елена Анатольевна

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Материалы.

2. Методы.

2.1. Получение экстрактов белков мозга.

2.2. Выделение ГДГ из мозга человека.

2.3. Гидрофобная хроматография.

2.4. Ионообменная хроматография.

2.5. Аффинная хроматография.

2.6. Адсорбционная хроматография.

2.7. Хранение очищенных ферментов.

2.8. Выделение тромбоцитов.

2.9. Получение экстрактов белков тромбоцитов.

2.10. Определение концентрации белка.

2.11. Определение ферментативной активности ГДГ.

2.12. Определение кинетических параметров изоформ ГДГ.

2.13. Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДС-Ыа-ПААГ).

2.14. Двумерный электрофорез.

2.15. Вестерн-иммуноблоттинг с хемилюминесцентным усилением сигнала.

2.16. Статистическая оценка данных.

2.17. Получение антисывороток и их тестирование.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Выделение ГДГ из мозга человека.

2. Изучение физико-химических свойств изоферментов ГДГ.

2.1 Определение молекулярной массы и изоэлектрической точки ГДГ1, ГДГН и ГДГШ.

2.2. Изучение гидрофобности ГДГ.

2.3. Изучение кинетических параметров изоформ ГДГ.

2.4. Изучение температурной зависимости изоформ ГДГ.

3. Изучение иммунохимических свойств изоформ ГДГ.

3.1. Получение специфичных антител.

3.2. Определение органо- и видоспецифичности изоформ ГДГ.

4. Сравнительное изучение ферментативной активности и содержания (по иммунореактивности) ГДГ в мозге лиц контрольной группы и при шизофрении.

4.1. Изучение ферментативной активности ГДГ.

4.2. Изучение содержания (по иммунореактивности) изоформ ГДГ.

5. Сравнительное изучение содержания (по иммунореактивности) ГДГ в тромбоцитах лиц контрольной группы и при шизофрении.

5.1. Выявление изоформ ГДГ в тромбоцитах крови человека.

5.2. Сравнительное изучение содержания ГДГ в тромбоцитах в контрольной группе и при шизофрении.

V. ОБСУЖДЕНИЕ.

VI. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Глутаматдегидрогеназа мозга человека в норме и при шизофрении"

Актуальность проблемы.

Одной из нейрохимических гипотез патогенеза шизофрении является «глутаматергическая гипотеза» о нарушении глутаматного нейромедиаторного пути (глутамат служит возбуждающим нейромедиатором в нервной системе).

Установлено, что нарушения нейромедиаторной системы глутамата (Глу) в мозге при шизофрении, обусловлены нарушением процессов его захвата переносчиками и его связывания со специфическими рецепторами (54, 87, 9). В течение последних двух лет в мозге больных шизофренией обнаружены изменения уровней ферментов, участвующих в метаболизме Глу, таких как, глутаминсинтетаза (4, 7, 24, 27), фосфатактивируемая глутаминаза и глутаматдекарбоксилаза (46, 74, 40). {

Глутаматдегидрогеназа (ГДГ, КФ 1.4.1.3) является одним из ключевых ферментов метаболизма глутамата.

Биохимические данные свидетельствуют о том, что активность ГДГ выявлена в нейронах и в глии (12, 118). Иммуногистохимические исследования показали, что ГДГ преимущественно локализована в астроцитах (101) и в олигодендроцитах (132), напротив, молекулярно-биологические данные свидетельствуют о значительной экспрессии гена ГДГ в нейронах (судя по содержанию мРНК) (104). Противоречие результатов, полученных при исследовании ГДГ может быть обусловлено гетерогенностью этого фермента в нервной ткани.

ГДГ мозга человека как в норме, так и при патологии нервной системы, практически не изучена. В литературе имеются отдельные данные об изменении содержания ГДГ при нейродегенеративных расстройствах (94, 59).

В связи с этими данными, а также данными о нарушении глутаматного медиаторного пути при шизофрении, изучение свойств, содержания, локализации, распределения ГДГ в мозге, (одного из ключевых ферментов глутаматного метаболизма) в норме и при шизофрении, представляется актуальным.

Безусловно, исследования, проведенные на аутопсийном материале, помогают понять механизмы развития заболевания. Однако, поиск соответствующих изменений в работе глутаматергической системы на периферии является важным, поскольку из литературы известно, что тромбоциты, выделенные из крови человека, могут служить удовлетворительной моделью, отражающей процессы, которые происходят в нервной ткани. В тромбоцитах обнаружены компоненты серотонинергической нейромедиаторной системы (111, 1) и глутаматергической системы: рецепторы и переносчики глутамата (21, 45), ферменты метаболизма глутамата (ФАГ и ГДГ) ( 47).

Таким образом в связи с глутаматергической гипотезой патогенеза шизофрении изучение ГДГ, как в мозге, так и в тромбоцитах человека, при этом заболевании представляется актуальным.

Цель и задачи исследования.

Целью данной работы является оценка возможного участия ГДГ в нарушении метаболизма глутамата при шизофрении. В задачи исследования входило:

1. Выделение ГДГ из ткани мозга лиц, не страдавших психическими или нервными заболеваниями.

2. Характеристика физико-химических свойств ГДГ.

3. Сравнительная оценка уровня активности ГДГ в экстрактах белков различных областей мозга человека в контрольной группе (лица, не страдающие неврологическими и психическими расстройствами) и при шизофрении.

4. Получение моноспецифичных антител к ГДГ мозга человека.

5. Сравнительное изучение содержания ГДГ в мозге в контрольной группе и при шизофрении.

6. Сравнительное изучение содержания ГДГ в тромбоцитах в контрольной группе и при шизофрении.

Научная новизна работы.

Впервые обнаружены три изоформы ГДГ: две растворимые изоформы, с молекулярными массами субъединиц 58 к Да (ГДГ1) и 56 кДа (ГДГИ), и мембрано-ассоциированная изоформа, с молекулярной массой субъединиц 56 кДа (ГДГШ). Ферментативная активность ГДГ в экстрактах белков мозга является суммарной активностью растворимых изоформ.

Получены специфичные поликлональные антитела к ГДГ1, ГДГП и к ГДГШ мозга человека. Методом вестерн - иммуноблоттинга установлено, что антисыворотка к ГДГ1 и ГДГН распознает оба изофермента, в то время как очищенная ассоциированная с мембранами ГДГШ обнаруживается только специфичными к ней антителами, причем перекрестная реакция между легко растворимыми и ассоциированной с мембранами формами практически отсутствует.

Адаптирован метод иммуноблоттинга с хемилюминесцентным усилением сигнала и подобраны системы, позволяющие определять уровни всех трех изоферментов ГДГ. Сравнительная оценка содержания иммунореактивных ГДГ1 , ГДГН и ГДГШ при шизофрении и в контрольных случаях в лобной, передней и задней лимбической коре и коре мозжечка проведена с использованием этого метода. Содержание ГДГ при шизофрении в лобной (р<0.01), задней лимбической (р<0.01) коре и коре мозжечка (р<0.05, р<0.01) повышено. Впервые выявлено достоверное повышение (р<0.01) содержания ГДГ в тромбоцитах при шизофрении по сравнению с контрольной группой.

Теоретическая и практическая значимость работы. В работе обнаружены и охарактеризованы три изоформы ГДГ мозга человека. Получены специфичные поликлональные антитела, распознающие растворимые и мембранно-ассоциированную ГДГ. Впервые выявлено изменение содержания ГДГ в отдельных областях мозга при шизофрении по сравнению с контролем. А также впервые обнаружено изменение содержания ГДГ при шизофрении в элементах крови - тромбоцитах. Результаты исследования одного из ключевых ферментов глутаматного пути могут быть важными для понимания метаболизма глутамата при патологии нервной системы. Наряду с содержанием кальция, активностью NMDA рецепторов, содержание ГДГ в тромбоцитах может являться полезным прижизненным маркером, отражающим статус глутаматергической системы у больных шизофренией.

Основные положения, выносимые на защиту.

2. Содержание растворимых и мембранно-ассоциированной ГДГ при шизофрении в лобной, задней лимбической коре, коре мозжечка достоверно повышено (р<0.01, р<0.01, р<0.05 и р<0.01, соответственно) по сравнению с контрольной группой.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Взаимосвязь нейронов и глиальных клеток через метаболизм глутамата в мозге здоровых и больных нервно-психическими заболеваниями людей.

Представления о роли глии в обеспечении нейрональной активности существенно расширились в последние годы: на основе экспериментальных данных разработана модель нейронально-глиального взаимодействия, служащего основой функционирования мозга. Согласно этой модели, нейромедиатор глутаминовая кислота (глутамат, Глу) является «сопрягающим» фактором между нейронами и глиальными клетками (55, 57).

В обзоре отмечены основные моменты, важные для обеспечения работы глутаматергической нейромедиаторной системы. Рассмотрено рециклирование Глу и ключевые ферменты метаболизма Глу (подробно освещены данные о глутаматдегидрогеназе). В обзоре охарактеризованы изменения, происходящие с ферментами метаболизма Глу и затрагивающие нейронально-глиальные взаимодействия при нервных и психических патологиях (в частности, шизофрении).

Метаболическая связь нейронов и астроцитов. Гипотеза о разделении нейромедиаторного и метаболического пулов глутамата.

Идея о компартментализации метаболизма и метаболическом сопряжении нейронов и глии развивается уже более 100 лет. Согласно современным представлениям, глутамат (Глу) служит возбуждающим нейромедиатором в нервной системе (во всех важнейших афферентных волокнах, ведущих к коре мозга, и в собственно возбуждающих волокнах) (69); кроме этого, превращения Глу важны в энергетическом метаболизме мозга (123). Ключевые моменты этих превращений нашли отражение в гипотезе о разделении нейромедиаторного и метаболического пулов Глу

42, 55, 57, 75). Для того, чтобы присутствие Глу, не служащего нейромедиатором, не могло сильно влиять на отношение сигнал/фон при передаче сигнала посредством Глу, необходима система разделения пулов Глу (посредством компартментации отдельных биохимических превращений). Рассмотрим основные "пункты сопряжения", или звенья, составляющие эту систему.

1. Отделение мозга от системной циркуляции крови гематоэнцефалическим барьером, позволяющим мозгу автономно синтезировать и утилизировать Глу.

2. Окружение глутаматергических синапсов глиальными клетками, способными значительно эффективнее, чем нейроны, поглощать Глу своими переносчиками, так, что большинство молекул Глу, высвобожденного нейронами, поглощаются и превращаются в Глн глиальными клетками.

3. Существование цикла Глу/глутамин (Глн) между нейронами и глией. Ограничение экспрессии глутаминсинтетазы (ГС) - ключевого фермента, превращающего Глу в Глн, глиальными клетками (Глн не обладает нейромедиаторной активностью, и после высвобождения в межклеточное пространство Глн преодолевает его, возвращаясь в нейроны как субстрат для образования Глу).

4. Ограничение экспрессии ключевых ферментов формирования углеродного скелета Глу de novo, из глюкозы, (пируваткарбоксилазы и цитозольной малатдегидрогеназы) глиальными клетками и возврат углеродного скелета "избыточного" Глу в метаболический путь окисления глюкозы.

Вследствие этих особенностей нервной ткани нейроны для поддержания работы своего цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) постоянно нуждаются в новых углеродных скелетах-основах, поставляемых из глиальных клеток; при истощении этих запасов нейроны перестают образовывать нейромедиатор - Глу, а их окислительный метаболизм нарушается. Принимая во внимание тесную связь между нейронами и глией, функционирование мозга можно рассматривать как серии взаимодействий между нейронами и глиальными клетками (57).

Методы и методологические подходы: особенности, связанные с изучением метаболизма мозга человека.

In vitro

При изучении in vitro отдельных звеньев «системы сопряжения» нейронов и глии и, в целом, метаболизма мозга человека используют специфические методологии, в связи с недоступностью клинического материала и тем, что экспериментальные данные, полученные на животных, не всегда можно экстраполировать на организм человека из-за существенных биохимических различий мозга человека и животных.

В исследованиях ферментов, катализирующих превращения метаболитов, используют аутопсийный и биопсийный материал.

Ферментативную активность и активность рецепторов и переносчиков определяют в специально обработанных образцах нервной ткани, субклеточных фракциях и экстрактах из них.

При определении количества белка (определенного фермента) используют косвенные методы: оценивают иммунореактивность белка с применением специфических антител иммунохимическими (иммуногисто- и цитохимическими) методами, с применением световой, иммунофлуоресцентной и электронной микроскопии.

Специфические антитела получают к синтетическим фрагментам полипептидных цепей ферментов человека или применяют обладающие перекрестной специфичностью антитела, полученные к ферментам животных. Лишь в случае глутаминсинтетазы и глутаматдегидрогеназы мозга человека получены антитела к белкам, выделенным из ткани мозга человека, пригодные для специфического количественного анализа (135,

24, 26). Для этих ферментов разработаны способы выделения из ткани мозга человека, и поэтому они изучены - в сравнении с другими ферментами мозга человека - наиболее подробно.

Для оценки уровней экспрессии генов, кодирующих ферменты, определяют количество соответствующей мРНК соответствующими молекулярно-биологическими методами.

Совершенствование приборов и методов позволило повысить их чувствительность, что, очевидно, важно при использовании аутопсийного и биопсийного материала (благодаря этому снизился объем исследуемого образца ткани).

In vivo

В экспериментах на животных в качестве приемлемого подхода к выяснению механизмов функционирования нейромедиаторных и ферментных систем в нервной ткани служит ингибиторный анализ. При этом рецепторную, транспортную или ферментативную активность подавляют селективным ингибитором.

Создание мутантов - животных моделей "knock-out" с инактивированными генами, ответственными за синтез изучаемых белков (ферментов) - второй подход в исследованиях метаболизма нервной ткани животных (102, 84, 15).

Известны данные о развитии у добровольцев симптомов, подобных таковым при шизофрении, вследствие приема фенциклидина (или кетамина) - антагонистов глутаматных (NMDA-типа) рецепторов (эти данные подробнее будут описаны ниже). Представляют ценность данные о фенотипических проявлениях мутаций генов человека, которые напрямую затрагивают гены ферментов, метаболизирующих Глу, например, ген глутаматдегидрогеназы (115, 80, 103).

В последние годы прогресс в области ЯМР спектроскопии и позитронной эмиссионной томогафии (ПЭТ) позволил использовать эти методы в изучении отдельных метаболических путей, в частности, метаболизма нейромедиаторов, в организме человека in vivo (в настоящее время ЯМР in vivo позволяет оценить концентрации таких низкомолекулярных соединений, как аминокислоты, например, Глу и Глн) (125, 60, 109).

Одни новые методы уже применяются в медицинской практике, а другие еще только проходят апробацию на животных in vivo (например, газовая хроматография 15N в сочетании с масс-спектрометрией, микродиализ, вольтометрия, спектрофотометрия микропроб).

С применением перечисленных выше методов исследований к настоящему времени подтверждено существование всех основных звеньев системы сопряжения нейронов и глии в мозге человека.

Основные звенья системы сопряжения нейронов и глии.

Первое звено системы разделения пулов Глу -гематоэнцефалический барьер. Доказана его непроницаемость для Глу (52).

Внеклеточный Глу, включая его нейромедиаторный пул, активно поглощается астроцитами, и подтверждением существования второго звена системы связи нейронов с глией служит множество фактов (56, 35, 105, 106, 130, 102, 20, 63).

Путь к пониманию того, что именно глиальные клетки (астроциты) отвечают за поглощение и метаболизм основной доли Глу в мозге, и именно глиальные клетки удаляют Глу, высвобожденный в синаптическую щель, поддерживая низкую внеклеточную концентрацию Глу (92, 130) начинался с исследований культур клеток. Еще в конце 70-х годов стало известно, что внеклеточный Глу поглощается более активно в культуре астроцитов, чем нейронов (56).

Позднее были накоплены многочисленные экспериментальные данные, подтверждающие тесную связь глутаматергических нейрональных и глиальных клеток. Например, это данные о структурной организации глутаматергических синапсов. Астроциты, в которых локализованы переносчики Глу и ГС (ключевой фермент метаболизма Глу), локализованы рядом с глутаматергическими нейронами. Это означает, что астроциты занимают позиции в синаптическом аппарате, позволяющие им эффективно выполнять функцию поглощения и метаболизма Глу, высвобождаемого нейронами (38, 71, 131). Также показано, что глиальные переносчики Глу (GLT и GLAST) сконцентрированы в отростках астроцитов, окружающих пресинаптические окончания нейронов (35).

С другой стороны, (на основе данных о структурной организации отдельной глиальной клетки) обнаружено, что глиальные переносчики Глу (GLAST) и ГС локализованы рядом друг с другом - в отростках глиальных клеток, окутывающих глутаматергические синапсы. Это указывает на тесную связь поглощения Глу с его превращением в Глн внутри глиальных клеток (39).

Подтверждением системы "сопряжения" глутаматергических нейронов и глиальных клеток посредством Глу служат факты, свидетельствующие об их тесной функциональной связи (эти факты получены физиологическими и гистохимическими методами, объектами исследований служили культуры клеток, тканей и животные). Обнаружено, что происходит активация глиальных переносчиков, обращенных в пространство, окружающее синапс, при выбросе медиатора в синаптическую щель. Более того, в ходе этого процесса удалось непосредственно продемонстрировать активное удаление Глу из синаптической щели астроцитами (78, 77). Кроме этого оказалось, что транспортный поток Na+ , связанный с поглощением Глу астроцитами, отражает высвобождение нейромедиаторного Глу нейронами (20). Значение in vivo активного поглощения Глу астроцитами выясняли экспериментально с применением животных, полученных генетической инженерией (модели "knock-out") - на интактном мозге мышей, дефицитных по астроцитарному переносчику Глу (102). Дополнительные доказательства того, что основная доля высвобожденного нейронами Глу поглощается астроцитами, получены в гистохимических исследованиях (51, 63).

Цикл Глу/Глн - основное звено «сопряжения» нейронов и глии. Хотя этот цикл был впервые описан более 30 лет назад (22), за последнее время получены прямые доказательства его существования in vivo методом ЯМР in vivo (109). Синтез Глн из Глу в глиальных клетках - важная часть этого цикла. Его катализирует ГС. ГС локализована в глии (ранее она считалась маркером астроцитов, но позднее была обнаружена также в олигодендроцитах (13, 14)).

Функциональная роль Глу/Глн цикла и ГС оценена благодаря опытам по ингибированию ГС животных селективным ингибитором MSOX (32). MSOX в токсических дозах вызывает у млекопитающих нарушение ориентации, изменения поведения, судороги, вплоть до гибели животного, а инъекция или аппликация в определенную область центральной нервной системы ведет к утрате функции этой области. Например, нанесение раствора MSOX на участок сетчатки вызывает временную слепоту, ведет к утрате способности глутаматергических нейронов реагировать на свет (17), а инактивация ГС в полосатом теле нарушает процесс запоминания (83). Как слепота, так и нарушение запоминания проходят при аппликации экзогенного Глн. Это указывает на то, что функциональные нарушения, вызванные MSOX, могут быть обусловлены ингибированием ГС.

До недавнего времени не возникало сомнений относительно важной роли ГС в процессах запоминания. Однако, недавно получены данные о том, что хроническое введение (в течение 10 недель) мышам MSOX в дозах, не вызывающих судорог и гликогенеза (20 мг/кг), не влияет ни на их обучение, ни на память (23).

В модельных экспериментах показано, что ГС может выполнять защитную функцию. Избыточное высвобождение Глу считается основной причиной нейродегенерации при повреждении ЦНС. В нормальных условиях избыточное накопление Глу, высвобождаемого в синапсы, предотвращается глиальными клетками. Но, как предположил Gorovits R. et al., 1997 (49), при повреждении нейронов глиальные клетки не могут полностью нейтрализовать нейротоксичность высоких концентраций Глу из-за недостаточно высокого уровня активности ГС. В экспериментах на поврежденной сетчатке авторы показали, что индукция (гормонами) экспрессии гена ГС в глиальных клетках может защитить нейроны от дегенерации. Напротив, ингибирование ГС MSOX приводило к усилению гибели нейронов. Препарат очищенной ГС, нанесенный на культуру ткани сетчатки, тоже защищал нейроны от гибели, а эффект зависел от дозы ГС. Эти результаты свидетельствуют о том, что ГС может служить эффективным нейропротектором и что усиление экспрессии ГС в глиальных клетках скорее всего служит эндогенным механизмом, защищающим нейроны от токсического действия избытка Глу во внеклеточной жидкости (например, при травме или ишемии).

Возможно, эти результаты помогут в дальнейшем найти новые подходы к лечению нейродегенеративных процессов.

Схематическое представление метаболизма глутамата.

Компартментация метаболизма Глу - основная особенность превращений Глу в нервной ткани. Можно выделить три "уровня" разделения пулов Глу: в целом организме (за счет гематоэнцефалического барьера), в нервной ткани - между нейронами и глиальными клетками, и внутри этих клеток (в цитоплазме и митохондриях).

Поскольку Глу не преодолевает гематоэнцефалический барьер (52), весь Глу в ЦНС образуется из глюкозы в пределах самой ЦНС, для чего необходим синтез de novo компонентов цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) (50). В работах Hertz с соавторами (55, 57) развивается схема, согласно которой пути превращений глюкозы через ЦТК до Глу в нейронах и астроцитах, а также нейрональный путь синтеза Глу («шаттл» между цитоплазмой и митохондриями в нейронах) связаны между собой так, как представлено на рисунках 1 и 2 соответственно. Внутриклеточный путь метаболической деградации глюкозы через ЦТК до Глу регулирует пул нейромедиатора-Глу, обеспечивающего глутаматергическую передачу сигнала. (Рис. 1).

Кроме этого существует «шаттл» между митохондриями и цитозолем, участвующий в синтезе Глу в нейронах (Рис. 2). Давно известно, что выделенные из мозга клетки в культуре могут окислять Глу и Глн, а относительно недавно было показано, что эти аминокислоты окисляются в нормальном мозге in vivo (140). Окислительное разложение Глу существенно для удаления его «избытка» из ЦНС (поскольку он там синтезируется и не преодолевает гематоэнцефалический барьер - см. первое и четвертое «звенья» системы нейронально-глиальных взаимодействий). В то же время этот процесс позволяет сохранить (хотя и не всю) энергию, запасенную в процессе превращения глюкозы до Глу (55), а избыток Глн тоже может метаболизироваться после его превращения в Глу (114).

Синтез глутамата в нейронах (цитозольно-митохондриальный «шаттл»).

Глн, синтезированный ГС в астроцитах и поступивший через межклеточное пространство в нейроны, превращается в Глу под действием активируемой фосфатом глутаминазы (ФАГ) Однако, синтез нейромедиаторного Глу из Глн в глутаматергических нейронах является более сложным процессом, нежели непосредственное расщепление Глн. Этот процесс описан в работах Hertz с соавторами (55, 57). Отдельные звенья этого процесса представлены на рисунке 2.

Синтезированный астроцитами Глн переносится через цитоплазматическую и наружную митохондриальную мембраны нейрона. Затем он гидролизуется ФАГ до Глу (ФАГ локализована между наружной и внутренней мембранами митохондрий). Дальнейшие превращения Глу происходят в матриксе митохондрии, поэтому Глу переносится транспортером (1) в обмен на аспартат через внутреннюю митохондриальную мембрану, а затем трансаминируется до а-кетоглутаровой кислоты (а-КГ) внутри митохондрии под действием митохондриальной аспартатаминотрансферазы (ААТМ). Образованный а-КГ переносится переносчиком дикарбоновых кислот (2) через обе митохондриальные мембраны в цитозоль в обмен на малат. Цитозольный а-КГ затем трансаминируется цитозольной ААТЦ в Глу, накапливающийся в синаптических везикулах, из которых он потом высвобождается посредством Са2+-зависимого механизма.

Аспартат, вступающий в реакцию трансаминирования, превращается в щавелево-уксусную кислоту, которая в присутствии NADH восстанавливается в малат, переносимый вновь в митохондрии переносчиком 2.

В качестве альтернативного пути а-КГ (возможно, это а-КГ, перенесенный из астроцитов, Рис.1) может накапливаться непосредственно в цитозоле и трансаминироваться в Глу с использованием другой аминокислоты (аланина или др. аминокислоты с разветвленной цепью), но при этом не происходит переноса через митохондриальную мембрану.

Другие пути биосинтеза глутамата

Глу может синтезироваться в реакциях переаминирования из а-КГ путем переноса аминогруппы с аланина (Рис.1) или с лейцина, изолейцина, валина с участием трансаминаз (137). Как было упомянуто выше, в настоящее время нет единого мнения относительно того, переносится ли а-КГ из астроцитов в нейроны и там подвергается трансаминированию или превращается через Глу в Глн в астроцитах под действием ГС, а Глн впоследствии высвобождается и накапливается в нейронах как предшественник Глу (Рис.1). Различные точки зрения на этот вопрос подробно рассмотрены в обзоре Hertz et al., 1999 (55).

В биосинтезе Глу в мозге, возможно, принимает участие глутаматдегидрогеназа (ГДГ) (равновесие реакции ГДГ in vitro, судя по термодинамическим параметрам, сдвинуто в сторону синтеза Глу, но направление протекания реакции в отдельных типах клеток мозга in vivo, вероятно, зависит от локальных концентраций субстратов и кислотности ткани. Так, изменение рН (ацидоз ткани мозга) играет роль в регуляции преимущественного направления протекания метаболических реакций метаболизма Глу/Глн (85).

Рисунок 1. Схематическое представление основных путей превращения глутамата в нейронах и астроцитах.

Сокращения: ФЕП - фосфоенолпировиноградная кислота; ПК -пируваткарбоксилаза; ЩУК - щавелевоуксусная кислота; а-кетоглутаровая кислота; ТА - трансаминаза; ГС - глутаминсинтетаза; ГДГ - глутаматдегидрогеназа; ФАГ - активируемая фосфатом глутаминаза.

Рисунок 2. Схематическое представление цитозольных и митохондриальных реакций, участвующих в биосинтезе нейромедиаторного глутамата в нейроне. а-КГ - а-кетоглуторат, ЩУК - щавелевоуксусная кислота,

ФАГ —активируемая фосфатом глутаминаза,

ААТц - цитопл азматическая аспартатаминотрансфераза,

ААТМ - митохондриальная аспартатаминотрансфераза,

1 — переносчик глутамата,

2 — переносчик дикарбоновых кислот.

Утилизация глутамата в нервной ткани

Поскольку Глу, образующийся в ЦНС, не может легко покинуть ее пределы, должны существовать механизмы утилизации избытка Глу. Это обеспечивается следующими процессами. Из Глу образуется Глн под действием ГС в астроцитах, а Глн возвращается в нейроны в цикле Глн/Глу (ГС - основной фермент цикла Глу/Глн, - см. выше). Функционируют и другие группы реакций (137): окисление Глу и вовлечение в энергетический метаболизм с образованием а-КГ (под действием ГДГ); включение Глу в ЦТК с участием аспартатаминотрансферазы; вовлечение (посредством малатдегидрогеназы) в астроцитарный ЦТК с образованием малата; образование пирувата или щавелево-уксусной кислоты, в дальнейшем превращающейся в фосфоенолпируват (ФЕП) (пируват либо окисляется через ацетил-КоА в астроцитах либо высвобождается, главным образом, после превращения в лактат, во внеклеточное пространство, откуда поглощается и метаболизируется нейронами); ФЕП может использоваться для синтеза гликогена (в астроцитах) и глюкозы, которая опять окисляется (и в астроцитах, и в нейронах) (Рис. 1).

Давно известно, что выделенные из мозга клетки (в частности, глиальные) в культуре могут окислять Глу и Глн, а относительно недавно было показано, что эти аминокислоты окисляются в нормальном мозге in vivo (140). Окислительное разложение Глу существенно для удаления его «избытка» из ЦНС (поскольку он там синтезируется и не преодолевает гематоэнцефалический барьер). В то же время этот процесс позволяет сохранить (хотя и не всю) энергию, запасенную в процессе превращения глюкозы до Глу (55), а избыток Глн тоже может метаболизироваться после его превращения в Глу (114).

На пути окисления Глн для энергетических нужд нейрональной клетки первый этап - превращение его в Глу. Эту реакцию могут осуществлять ферменты, обладающие глутаминазной активностью. Помимо ФАГ известны глутаминтрансаминаза, образующая а-КГ из Глн (34), и малат-активируемая глутаминазная активность (также называемая независимой от фосфата глутаминазой), которую может проявлять у-глутамилтрансфераза (124), хотя роль последней в превращении Глн в мозге спорна (69). Роль глутаминазной активности в глии не ясна (функция глутаминазы в астроцитах обсуждается в работе Laake et al., 1999 (69)).

Согласно представлениям McKenna et al., (2000) о роли ГДГ и ААТ во внутриклеточной компартментации метаболизма Глу, превращения "эндогенного" и "экзогенного" Глу пространственно разделены. Свидетельства различия метаболических путей "экзо-" и "эндогенного" Глу приводятся многими исследователями (105, 133, 76). "Экзогенный" Глу, поглощаемый клетками из синаптической щели, переносится в митохондрии Глу/аспартатным антипортером и используется для производства энергии. Этот Глу на первом этапе превращается ГДГ (активируемой АДФ в условиях низкого энергоснабжения). Превращение "эндогенного" Глу, образованного из Глн (под действием ФАГ в нейронах, или, возможно, других глутаминаз - см. выше), начинается под действием ААТ (68, 76).

Влияние дефицита энергии на метаболизм глутамата в мозге: ишемия.

В большинстве случаев дефицит энергии в ЦНС (падение запасов кислорода и глюкозы) наступает вследствие блокирования артерии, что приводит к локальной ишемии. В очаге ишемического поражения ток крови сокращается (иногда составляя лишь 20% от нормы), при этом количество кислорода, переносимого кровью, меньше, чем необходимо для полного окисления глюкозы. В отличие от нейронов и олигодендроцитов, астроциты могут переживать ишемию за счет энергии гликолиза (61). Следовательно, астроциты, переживая ишемию мозга, могут в течение относительно длительного времени выполнять некоторые функции, например, поглощать Глу (в этом случае за счет гликолиза) (120). В соответствии с этим, первопричина немедленного увеличения концентрации внеклеточного Глу при ишемии мозга и связанного с этим нейротоксического действия Глу (89, 31) заложена не в дефиците поглощения Глу, а, скорее в усилении его образования из Глн поврежденными глутаматергическими нейронами и последующем высвобождении этого Глу (81). Было выяснено, что только Глу, высвобожденный в течение первых минут ишемии, представляет собой нейромедиаторный Глу, тогда как остальной происходит из других цитозольных пулов при обращении процесса поглощения и утилизации Глу, а также при нарушении целостности мембран под действием фосфолипаз или при открывании анионных каналов, индуцированном набуханием клеток.

Возрастание содержания Глу в астроцитах при ишемии in vivo или при сочетанном воздействии гипоксии и нехватки субстратов обнаружено рядом исследователей. Это возрастание обусловлено относительно хорошей защитой в условиях ишемии процесса поглощения Глу астроцитами (в этом случае поддерживаемого энергией гликолиза), тогда как последующее окисление Глу нарушено из-за отсутствия кислорода; особенно сильно повышается концентрация Глу внутри митохондрий (126). Как было показано in vivo (127) и на переживающих срезах мозга (8), последующая реперфузия или восстановление снабжения ткани кислородом и энергией может привести к нормализации концентрации Глу в астроцитах, что свидетельствует о правильности представлений об окислительном метаболизме Глу по путям, изображенным на рисунках 1 и 2. С этими наблюдениями согласуются экспериментальные данные о значительном усилении окисления Глу в мозге крысы после гипоксии (91).

При ишемии нервной ткани отмечались изменения уровня ГС (65). Обнаружено перераспределение ГС в мозге крысы под действием длительного портокавального анастомоза (уровень ГС оценивали методом иммуногистохимии) (в одних областях иммунореактивность ГС * снижалась, а в других - повышалась) (117).

Нарушения метаболизма глутамата при патологиях нервной системы.

При патологии нервной системы могут повреждаться не только компоненты глутаматергической системы (переносчики и рецепторы Глу), но и межклеточный и внутриклеточный метаболические пути Глу (см. рис. 1 и 2). В пользу этого свидетельствуют экспериментальные исследования ишемии или ограничения энергетических источников (имитация инсульта), а также биохимические и генетические исследования больных синдромом гипераммонемии-гиперинсулинемии (у которых наблюдается печеночная энцефалопатия) (80, 103).

Нарушение метаболизма Глу имеет место при нейродегенеративных расстройствах. Так, Hussain и др. (1989) (59) исследовали болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, мультисистемную атрофию, ассоциированную со слепотой, офтальмоплегией и миоклонусом. Авторами было обнаружено значительное снижение содержания одной из изоформ ГДГ мозжечка при мультисистемной атрофии, ассоциированной со слепотой, офтальмоплегией и миоклонусом (59).

Описан дефицит ГДГ в лейкоцитах и фибробластах у пациентов с мультисистемной дегенерацией при атрофии оливомостомозжечкового типа, мозжечковой дисфункции с периферической нейропатией и у пациентов преимущественно с экстрапирамидальными проявлениями (94). В лейкоцитах человека и культивированных фибробластах кожи было обнаружено существование растворимой и мембрано-ассоциированной изоформ ГДГ. Ферментативная активность ГДГ была измерена у пациентов с различными типами нейродегенеративных расстройств, затрагивающих преимущественно мозжечок и базальные ганглии. У пациентов с медленно прогрессирующей мультисистемной атрофией был обнаружен частичный дефицит ГДГ, однако эта недостаточность ограничивалась только мембрано-ассоциированной изоформой фермента, что свидетельствует о том, что две изоформы (растворимая и мембрано-ассоциированная) ГДГ находятся под различным генетическим контролем (95).

Нарушение регуляции метаболизма глутамата (уменьшение катаболизма глутамата) встречается у пациентов с множественной системной атрофией (95). Так, у пациентов с дефицитом ГДГ были измерены в плазме крови субстраты реакции: глутамат, а-кетоглутарат и аммоний, катализируемой ГДГ. Результаты показали значительное увеличение концентрации глутамата (на 137-150%) и снижение концентрации а-кетоглутарата (на 21-22%), что свидетельствует о частичном метаболическом блоке при окислительном дезаминировании глутамата. Авторы полагают, что накопление глутамата в нервной ткани может быть причиной нейрональной дегенерации.

Гетерогенность (множественность генов и их продуктов -различных форм ферментов) характерна не только для ГДГ, но и для других ферментов метаболизма Глу в нервной ткани, например, для глутаматдекарбоксилазы, ГС и глутаминазы (113, 10, 24, 67, 88). По-видимому, молекулярная гетерогМюсть ключевых ферментов метаболизма - фундаментальное свойство нервной ткани, позволяющее реализовывать основные механизмы нейропластичности (113).

Нарушение метаболизма глутамата наблюдалось также при рассеянном склерозе (132), боковом амиотрофическом склерозе (132, 47), болезни Дауна, паркинсонизме. Значение повреждений глутаматергической системы при эпилепсии подробно рассматривается в работе Дамбиновой с соавт. (2001) (5). Предполагается также, что взаимодействия нейронов с астроцитами нарушены при болезни Альцгеймера (БА) и при шизофрении (3). Остановимся подробнее на шизофрении, при которой происходят сильные расстройства психики, нарушения когнитивных функций и памяти.

Шизофрения. Взаимосвязь нейромедиаторных систем.

В последние годы заметно расширились представления о роли нейромедиаторов и метаболических связей в нервной системе, что особенно важно для понимания патогенеза шизофрении (28). Получены прямые доказательства постулата дисфункции дофаминовой нейромедиаторной системы при шизофрении, в пользу которого долгие годы свидетельствовали лишь косвенные данные. Более того, обнаружены взаимодействия между дофаминовой и другими нейромедиаторными системами. Как и другие моноаминергические нейроны, дофаминергические нейроны находятся, вероятно, либо под прямым контролем глутаматергических нейронов либо контролируются посредством ГАМК-ергических промежуточных нейронов, действующих в качестве ускоряющих или тормозящих посредников. Глу может оказывать ингибирующее действие на высвобождение дофамина: получено подтверждение гипотезы о том, что в ингибирующем действии Глу (ионотропных глутаматных рецепторов) на дофаминергические нервные окончания принимает участие зависимый от импульса механизм высвобождения дофамина (112).

Разработаны фармакологические модели шизофрении, базирующиеся на гипоглутаматергии (48). Наконец, гипотеза о системной стабилизации, одна из центральных задач которой -достижение баланса нейромедиаторных систем, как главной терапевтической стратегии в психиатрии и неврологии, в настоящее время достигла уровня концепции, подлежащей проверке на практике.

Глутаматергическая гипотеза шизофрении

Фенциклидиновая модель шизофрении возникла на основании наблюдений за добровольцами, у которых прием фенциклидина или кетамина (неконкурентных антагонистов глутаматных рецепторов NMDA-типа) вызывает психозы, по симптомам неотличимые от острой формы шизофрении, включая слуховые галлюцинации, спутанность сознания и негативные симптомы, а прием фенциклидина больными шизофренией сильно обостряет у них симптомы заболевания. Таким образом, психотомиметические свойства некоторых антагонистов возбуждающих аминокислот (фенциклидина, кетамина, МК-801) послужили основой так называемой «фармакологической глутаматергической» гипотезы шизофрении (64, 119, 84).

Предположения о том, что шизофрения может развиваться вследствие дисфункции глутаматергической системы в мозге, возникли более 20 лет назад (62). Накопленные за последнее время данные позволили сформулировать современную нейрохимическую гипотезу, согласно которой нарушение глутаматного нейромедиаторного пути играет важную роль в патогенезе шизофрении (19, 18, 66, 121, 48). Гипотеза основана на серии фактов, полученных в следующих работах: Deakin et al., (1989); Simpson et al., (1991); Olney and Farber, (1995); Akbarian et al., (1996); Humphries et al., (1996); Heresco-Levy and Javitt,

1998); Ohnuma et al., (1998); Theberge et al., (2002) (37, 110, 90, 9, 58, 54, 87, 125). Эти факты следующие:

• ингибиторы рецепторов Глу NMDA типа вызывают у людей симптомы, характерные для шизофрении, а у животных - утрату способности избирать правильные поведенческие программы;

• в мозге больных шизофренией изменена экспрессия генов компонентов глутаматергической системы - рецепторов и глиальных переносчиков Глу, изменяются параметры связывания агонистов и антагонистов рецепторами Глу;

• концентрация Глу в мозге и спинномозговой жидкости больных снижена, а концентрация Глн в передней лимбической коре больных в период первого психотического приступа повышена;

• в мозге больных шизофренией обнаружены количественные изменения активности и иммунореактивности ферментов, участвующих в метаболизме Глу, таких как ГС (4, 7, 24). Изменения затрагивают также ФАГ и глутаматдекарбоксилазу (фермент, декарбоксилирующий Глу с образованием ГАМК). Так, обнаружено достоверное повышение ферментативных активностей и уровней мРНК ФАГ и глутаматдекарбоксилазы в таламусе и префронтальной коре больных шизофренией (46, 74, 40).

Данные о нарушении ферментов метаболизма Глу существенно расширяют глутаматергическую гипотезу шизофрении

Обнаруженные нарушения функционирования глутаматергической системы при шизофрении в течение последнего десятилетия служили основанием для выработки новых подходов в лекарственной терапии этой патологии. Предполагается, что гипофункция NMDA рецепторов развивается при шизофрении, приводя к нарушению когнитивных функций и памяти, причем наиболее сильная «гипофункция» проявляется в виде симптомов, составляющих основу психозов и психических расстройств (82). Успешными оказались попытки лечения негативных симптомов и когнитивных расстройств при шизофрении модуляторами активности NMDA рецептора (так называемыми агонистами), действующими через его глицин-связывающий участок, а также веществами, влияющими на транспорт глицина (ингибиторами обратного захвата глицина) (54). Оказалось, что «гипофункцию» NMDA рецепторов можно компенсировать препаратами, влияющими на транспорт Глу (ламотриджином или рилузолом) и предотвращающими реализацию механизмов нейротоксичности, развивающейся из-за «гипофункции» NMDA рецепторов (44). Более того, механизм действия некоторых типичных и нетипичных нейролептиков тоже может отчасти объясняться их способностью модулировать активность NMDA рецепторов через его глицин-связывающий участок. Поиск лекарств, механизм действия которых реализуется через компоненты глутаматергической системы, продолжается.

В заключение этой части обзора, отметим, что к основным ферментам глу/глн цикла можно отнести: глутаминсинтетазу, глутаматдегидрогеназу, активируемую фосфатом глутаминазу, глутаматдекарбоксилазу, аспартатаминотрансферазу.

Поскольку наша работа посвящена изучению глутаматдегидрогеназы, то в следующей части обзора рассматривается более подробно данные литературы об этом ферменте.

Глутаматдегидрогеназа

Глутаматдегидрогеназа (ГДГ, КФ 1.4.1.3) катализирует обратимое окислительное дезаминирование глутамата в а-кетоглутарат, с использованием НАД и/или НАДФ как кофакторы. Известно, что у низших организмов существует две различные по структуре формы фермента, проявляющие специфичность или к НАД или к НАДФ.

Напротив, все известные ГДГ млекопитающих обладают способностью использовать оба кофактора (108).

Реакция, катализируемая глутаматдегидрогеназой:

L- глутамат + НАД(Ф)+ •<-» а-кетоглутарат + NH4+ + НАД(Ф) Н

Таким образом, этот фермент катализирует взаимопревращение субстратов - Глу и а-КГ.

Относительно участия ГДГ в превращениях нейромедиаторного Глу и о клеточной локализации ГДГ в нервной ткани человека и животных сведения довольно противоречивы.

В настоящее время еще не сложилось определенного мнения относительно преимущественного направления in vivo реакции ГДГ в сторону биосинтеза или деградации Глу. Так, при синтезе Глу ГДГ присоединяет NH3 к а-КГ. При деградации все происходит в обратном направлении: ГДГ удаляет аминогруппу, высвобождая NH3, и образует а-КГ из Глу.

Ранние биохимические данные свидетельствовали о том, что активность ГДГ есть и в нейронах, и в глии (118, 12). Иммуноцитохимические исследования показали, что ГДГ преимущественно локализована в астроцитах (11, 101), и в олигодендроцитах (132). Молекулярно-биологические данные свидетельствовали о значительной экспрессии гена ГДГ в нейронах (судя по содержанию мРНК) (104). Некоторые исследователи считали, что ГДГ преимущественно участвует в окислительном дезаминировании Глу до а-КГ в астроцитах (136, 94). McKenna et al. (2000) полагает, что основанием для такого суждения послужил факт обнаружения ГДГ преимущественно в астроцитарных, а не в нейрональных митохондриях (иммуноцитохимическими методами). Однако, те же авторы, которые находили ГДГ в глии, отмечали присутствие ГДГ и в нейронах (101).

Кажущееся противоречие результатов исследований ГДГ может быть обусловлено гетерогенностью этого фермента в нервной ткани. Действительно, описано существование нескольких изоформ ГДГ в нервной ткани млекопитающих.

Так, в мозге крысы обнаружены растворимая и мембранно-ассоциированная изоформы ГДГ (33). Авторы определяли активность ГДГ в супернатанте и осадке (центрифугирование при lOOOOOg), полученных из гомогенатов головного мозга крысы после удаления низкоскоростного осадка (центрифугирование при 480g). Ими было показано, что приблизительно 60% активности ГДГ было ассоциированно с мембранами, а 40% - была растворимой. Мембрано-ассоциированная ГДГ не экстрагировалась общеупотребляемыми детергентами, солями высокой концентрации и при обработке ультразвуком. Однако, мембрано-ассоциированная ГДГ экстрагировалась в значительной степени катионным детергентом цетилтриметил бромидом аммония в гипотоническом буферном растворе.

Следует отметить, что обе изоформы ГДГ значительно различались по термостабильности. При нагревании до 45°С в течение 30 мин. растворимая ГДГ теряла до 98% активности, в то время как мембрано-ассоциированная - до 80%.

При изучении кинетических параметров было показано, что обе изоформы ГДГ имеют сходные значения Км для субстратов а-кетоглутарата, аммония и глутамата, но различаются в значениях Км для НАДН и НАДФН. Так, значения Км растворимой ГДГ для НАДН и НАДФН (79,7 и 108,1, соответственно) меньше значений Км мембрано-ассоциированной ГДГ (99,1 и 154,7, соответственно). Это свидетельствует о том, что большее сродство к этим двум субстратам имеет растворимая изоформа ГДГ, чем мембрано-ассоциированная.

Ферментативная активность ассоциированной с мембранами и растворимой ГДГ стимулировалась АДФ и L-лейцином и ингибировалась диэтилбестролом и ГТФ. Хотя аллостерическая стимуляция посредством АДФ и L-лейцином и ингибирование диэтилбестролом было сопоставимо, две изоформы ГДГ существенно отличались по своей чувствительности к ингибированию посредством ГТФ в присутствии 1 мМ АДФ. Коэффициент Хилла, константа связывания и индекс кооперативного эффекта для ингибирования посредством ГТФ также значительно различались, указывая на то, что две изоформы ГДГ различны по своим аллостерическим сайтам (33).

Корейские авторы Cho et al., (1995) выделили из мозга быка две растворимые изоформы ГДГ, состоящие из шести идентичных субъединиц с одинаковыми молекулярными массами равными 57 кДа (30).

Обе изоформы ГДГ были легко растворимыми и никаких детергентов не требовалось для начальных стадий экстракции.

Значительные различия по термостабильности были обнаружены у этих двух растворимых форм ГДГ: одна из изоформ сохраняла 70% активности после 10 минут инкубации при 42°С, тогда как другая - 30%.

Оптимум рН для ферментативной активности обеих изоформ в направлении реакции восстановительного амминирования а-кетоглутарата было около 8,0. Однако, оптимум рН в направлении окисления глутамата было более высоким - 9,5-10,0.

При исследовании авторами кинетических параметров ими было обнаружены наибольшие различия в значениях Км этих изоформ ГДГ для а-кетоглутарата и глутамата.

Чтобы убедиться, что две растворимые изоформы ГДГ мозга быка структурно различные полипептиды, авторами были определены N-терминальные аминокислотные последовательности. Эти исследования показали высокое сходство между изоформами, исключая первые пять аминокислот.

Дальнейшие исследования различий в структурах изоферментов были проведены ограниченным протеолизом с трипсином. Выявились различия в остаточных активностях и в аминокислотных последовательностях между изоферментами ГДГ, обработанными трипсином. Эти данные подтверждают, что растворимые изоформы ГДГ мозга быка являются различными полипептидами.

В литературе отсутствуют данные о наличие нескольких растворимых изоформ ГДГ в мозге человека. Выделенная из мозжечка человека ГДГ (59) показала одну белковую зону с молекулярной массой 60 кДа на электрофорезе в ПААГ с ДС-Na, однако при двумерном электрофорезе в ПААГ было обнаружено четыре белковые зоны, различающиеся по молекулярной массе и изоэлектрической точке. Хотя авторы предполагают, на основании своих результатов, что это четыре изоформы ГДГ, по-видимому, выявление нескольких зон на двумерном электрофорезе связано с молекулярной гетерогенностью фермента.

Shaschidharan et al. (1997) обнаружили две изоформы ГДГ путем экспрессии GLUD1 кДНК и GLUD2 кДНК в клетках Sf9. Одна из которых, кодируемая геном GLUD1, выявляется почти во всех тканях, другая, кодируемая геном GLUD2, специфична для нервной ткани (нервноспецифичная) (107).

Эти изоформы ГДГ различались по термостабильности: неспецифичная ГДГ более термостабильна, чем нервноспецифичная (107).

Platiakis и Zaganas (2001) при дальнейшем изучении этих изоформ обнаружели значительное различие значений Км для глутамата. Так, для нервно-специфичной ГДГ значение Км составляло 2.43 мМ, тогда как для неспецифичной ГДГ это значение было значительно выше и составляло 7.64 мМ (96).

Наблюдались различия в регуляции ферментативной активности ионами магния: неспецифичная ГДГ ингибировалась в присутствие 1-2мМ Mg , тогда, как на нервно-специфичную ГДГ ионы магния не оказывали влияния (107).

Была обнаружена значительная разница в АДФ стимуляции этих изоформ. Так, при стимуляции 0,02-0,25 мМ АДФ неспецифичная ГДГ показала повышение ферментативной активности на 150%, а нервно-специфичная - на 1300% (107).

АДФ обычно считается активатором ферментативной активности ГДГ, но существуют сведения о том, что в некоторых условиях он может ингибировать ГДГ активность (16). Так Cho et al.(1995) наблюдали различные эффекты воздействия АДФ на активность двух растворимых изоформ ГДГ мозга быка. В реакции восстановительного аминирования а-кетоглутарата эффект активации АДФ зависел от рН среды, кофакторов (НАДН или НАДФН) и концентрации АДФ. При рН 8,0, с применением НАДФН как кофактора наблюдалось ингибирование активности ГДГ при концентрации АДФ 0,05-0,1мМ. В реакции окислительного дезаминирования глутамата ингибиторный эффект АДФ наблюдался при рН 6,0 и рН 9,5 как с НАДН, так и с НАДФН (при концентрации АДФ 0,025-0,1) (30). Bailey et al. (1982) предположили, что эти эффекты объясняются исходя из модели с АДФ связыванием как с регуляторным сайтом, так и с коэнзимом в активном центре фермента (16).

Изоформы ГДГ могут быть продуктами разных генов или же транслироваться с разных мРНК, образовавшихся в результате альтернативного сплайсинга, либо они могут возникать в результате посттрансляционных модификаций.

Действительно, в геноме человека обнаружена множественность генов ГДГ (79), по меньшей мере два из которых функционально активны (108). мРНК, кодируемая геном GLUD1, расположенным на десятой хромосоме, встречается в различных тканях и считается, что с нее синтезируется форма ГДГ, ответственная за обеспечение внутренних нужд клеток (79). мРНК, кодируемая геном GLUD2, расположенным на Х-хромосоме, специфически синтезируется в нервной ткани и яичках

108), и предполагается, что белковый продукт GLUD2 принимает участие в синтезе нейромедиаторного Глу (96).

Zaganas and Plaitakis (2002) показали, что человеческая ГДГ, кодируемая генами GLUD1 и GLUD2, состоит из шести идентичных субъединиц, каждая из которых составляет 505 аминокислот. Хотя две изоформы ГДГ, кодируемые генами GLUD1 и GLUD2 высокогомологичны по аминокислотному составу (97% гомологии), они различаются по 15 аминокислотам. Эти аминокислоты определяют аллостерическую регуляцию изоформ ГДГ. Так, были отобраны три таких остатка: глицин в положении 456, аргинин - 498, аспарагин - 498, расположенных в С-терминальной области фермента, кодируемого GLUD1, которая является частью регуляторного домена. У нервно-специфичного фермента, кодируемого GLUD2 геном, в этих положениях находятся: аланин, гистидин и серин, соответственно. Путем сайт-направленного мутагенеза были созданы три мутанта, каждый из которых содержал одну из трех аминокислотных замен. Мутантные кДНК экспрессировали в Sf21 клетках. Полученные мутантные изоферменты очищали и исследовали их кинетические и регуляторные характеристики. Результаты данной работы показали, что замена глицина на аланин заметно ослабляла ингибирование фермента посредством ГТФ, но не изменяла активацию фермента АДФ. Таким образом было показано, что глицин в положении 456, расположенный в С-терминальной области ГДГ человека, ответственен за ингибирование фермента посредством ГТФ (138, 97).

В другой работе Zaganas and Plaitakis, 2002 показали, что аргинин в положении 443, расположенный в регуляторном домене неспецифичной (кодируемой GLUD1 геном) ГДГ человека ответственен за активацию фермента, посредством АДФ и L-лейцином (139, 97).

Кроме специфической ферментативной активности ГДГ может выполнять и другие функции: ГДГ, связанная с мембранными структурами, обладает способностью связывать микротрубочки и является посредником, обеспечивающим связь лизосом с микротрубочками (100, 99).

Также, Preiss et al., (1993) показали, что ГДГ обладает РНК-связывающей активностью и, возможно, участвует в регуляции транскрипции (98).

В панкреатических Р-клетках, ГДГ включается в механизм секреции инсулина (96).

Cavallaro et al., (1997) обнаружено, что один из генов ГДГ имеет отношение к группе генов, контролирующих память в гиппокампе (29).

Приведенные данные литературы свидетельствуют о важной роли глутаматдегидрогеназы в метаболизме нейромедиатора глутамата.

III. Материалы и методы.

1. Материалы.

Биологическим материалом настоящих исследований служил: аутопсийный мозг, почка, печень, сердце лиц, не страдавших психическими заболеваниями, а также мозг больных шизофренией; тромбоциты крови нормальных доноров и больных шизофренией; мозг животных (бык, свинья, крыса).

Для выделения фермента был взят мозг человека, не страдавшего психическими и неврологическими расстройствами. Большие полушария, мозжечок и ствол мозга освобождали от оболочек и промывали физиологическим раствором. Затем выделяли поля коры и структуры мозга и замораживали в жидком азоте кусочками 1см2 , оставшуюся ткань мозга замораживали целиком и хранили до использования при температуре -70° С. Период от момента смерти до использования ткани мозга составил 6-8 часов.

В сравнительных исследованиях уровней активности и содержания ГДГ в мозге использовали аутопсийные образцы различных структур мозга, выделенных по картам Бродмана (6): лобная кора - поле 10, передняя лимбическая кора - поле 24, задняя лимбическая кора - поле 23, кора мозжечка. Контрольная группа насчитывала 9 (8 мужчин и 1 женщина) случаев, группа больных шизофренией - 8 (4 мужчин и 4 женщина) пациентов, из них 4 случая с непрерывнотекущей параноидной формой , 3 случая с параноидной приступообразной прогредиентной формой и 1 случай с непрерывнотекущей резидуальной формой. Причина смерти в обеих группах - острая сердечно-сосудистая недостаточность, инфаркт миокарда или тромбоэмболия легочной артерии. Образцы для исследования были взяты из коллекции мозга, хранящиеся в лаборатории нейрохимии НЦПЗ РАМН. Отбор образцов мозга для исследования проводился с точки зрения наибольшей однородности групп по длительности хранения мозга, времени, прошедшему с момента смерти до взятия материала, все образцы были взяты из левого полушария мозга.

Мозг животных был получен на московском мясокомбинате в течение одного часа после забитая животных.

В сравнительных исследованиях содержания ГДГ в тромбоцитах использовали клетки, выделенные из образцов крови лиц контрольной группы (психически здоровые доноры), насчитывающей 22 случая, и 23 случая больных с диагнозом параноидная шизофрения с эпизодическим течением с прогрессивным дефицитом и параноидная шизофрения с эпизодическим течением со стабильным дефицитом

В работе использовались реактивы и материалы производства следующих фирм: додецил-сульфат натрия, акриламид и NN -метилен-бис-акриламид, нонидет Р-40, мочевина, бычий сывороточный альбумин (Serva); трис основной, персульфат аммония (Bio-Rad); глицин, 2-меркаптоэтанол, фенилметилсульфонилфторид, кумасси бриллиантовый синий R-250, а-кетоглутарат, L-глутамат, АДФ, хлорида аммония, NADH, NAD ,NADP , этилендиаминтетрауксусная кислота, тритон Х-100, дитиотреитол, глицерин, фенил-сефароза 4В, ДЭАЭ-сефацел, ГТФ-агароза, сефароза Q, козьи антитела к кроличьим IgG, меченные пероксидазой хрена (Sigma); фармалиты, люминесцирующие реагенты ECL™ (люминол, перекись водорода, химические усилители люминесценции в щелочной среде), нитроцеллюлоза Hybond ECL™ , рентгеновская пленка Hyperfilm ECL™ , белковые стандарты молекулярных масс и изоэлектрических точек (Amersham-Pharmacia), твин-20 (Loba Chemie), цитрат Na, лимонная кислота, глюкоза (Россия), кроличьи антитела к ГДГ печени быка (Biogenesis).

Для получения антисывороток иммунизировали 2-х месячных кроликов породы «шиншилла» весом 1,5-2 кг.

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННА 41 БИБЛИОТЕК

2. Методы.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Воробьева, Елена Анатольевна

У1.Выводы

1. В мозге человека впервые обнаружены три изофермента глутаматдегидрогеназы (ГДГ, КФ 1.4.1.3). Два из них (ГДГ1 и ГДГП) содержатся в растворимой фракции экстрактов мозга, а третий (ГДГ III) является мембрано-ассоциированным изоферментом.

2. Охарактеризованы физико-химические свойства изоформ ГДГ.

• Гомоолигомеры ГДГ1 и ГДГП состоят из субъединиц с молекулярными массами 58±1кДа и 56±1кДа, соответственно. ГДГ III имеет молекулярную массу субъединиц 56+1 кДа.

• Обнаружена микрогетерогенность субъединиц: для ГДГ1 - 5 субфракций в интервале ИЭТ 7,5-6,6, для ГДГП - 6 субфракций в интервале ИЭТ 7,3-6,6, для ГДГ III - 5 субфракций в интервале ИЭТ 7,5-6,6.

• Изоформы ГДГ I, ГДГ II и ГДГ III различаются между собой по гидрофобным свойствам, термостабильности и кинетическим параметрам для а-кетоглутарата, NH4+, NADH, NAD+, L-глутамата.

4. Содержание ГДГ I и ГДГ II и ГДГ III при шизофрении достоверно повышено по сравнению с контрольными случаями в лобной коре, в задней лимбической коре и коре мозжечка, содержание ГДГ III достоверно повышено во всех перечисленных областях мозга. Ферментативная активность ГДГ в этих областях мозга человека так же достоверно повышена.

Содержание растворимых изоформ ГДГ (ГДГ I и ГДГ II) тромбоцитах при шизофрении достоверно повышено по сравнению контрольной группой.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Воробьева, Елена Анатольевна, Москва

1. Белоус А.Р., Раммамурти С., Блэкли Р.Д. и др. Состояние белка -переносчика серотонина в тромбоцитах больных соматотрофными заболеваниями // Журн. невропатол. и психиатр.-1999.-№11 .-С.32-35.

2. Брусов О.С., Пантелеева Г.П., Бондарь В.В. и др. Клинико-биологическое исследование серотонинтранспортного комплекса тромбоцитов у терапевтически резистентных больных эндогенной депрессией при комплексном лечении // Вестник РАМН.-1996.-№4.-С.29-32.

3. Бурбаева Г.Ш., Бокша И.С., Турищева М.С. и др. Нарушение метаболизма глутамата в мозге при психической патологии (болезни Альцгеймера и шизофрении) // Вестник РАМН.-2001.-№ 7.-С.34-37.

4. Бурбаева Г.Ш., Бокша И.С., Турищева М.С. и др. Ферменты метаболизма глутамата в мозге и тромбоцитах больных шизофренией // Сибирский вестник психиатрии и наркологии.-2003.-№1(27).-С.36-39.

5. Дамбинова С.А., Одинак М.М., Скулябин Д.И. и др. Лабораторные методы при эпилепсии и нарушениях мозгового кровообращения // Ж. Невропатол. и психиат. Им. С.С.Корсакова.-2001.-Т.101.-№1.-С.58-64.

6. Синельников Р.Д. Атлас анатомии человека // М.: Медицина,-1968.-С.94-95.

7. Терешкина Е.Б., Бокша И.С., Савушкина O.K., Бурбаева Г.Ш. Глутаминсинтетаза и белок, подобный глутаминсинтетазе, в лобной коре при шизофрении // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсаковаю-2000.-№7.-С.51-53.

8. Aas J.E., Berg-Johnsen J., Hegstad E. et al. Redistribution of glutamate and glutamine in slices of human neocortex exposed to combined hypoxiaand glucose deprivation in vitro // J. Cerebral Blood Flow and Metabolism.-1993.-V. 13 .-P.503-515.

9. Akbarian S., Sucher N.J., Bradley D. et al. Selective alterations in gene expression for NMDA receptor subunits in prefrontal cortex of schizophrenics // J.Neuroscience.-1996.-V.16.-P. 19-30.

10. Aledo J.C., Gomez-Fabre P.M., Olalla L., Marquez J. Identification of two human glutaminase loci and tissue-specific expression of the two related genes // Mamm Genome.-2000.-V.l 1.-N.12.-P.1107-1110.

11. Arce, C., Canadas, S., Oset-Gasque, M.J. et al. Glutamate Dehydrogenase: Some Properties of the Rat Brain Enzyme from Different Cellular Compartments // Сотр. Biochem. Physiol.-1990.- V.97.-N.2.-P.265-267.

12. Baas D., Dalencon D., Fressinaud C. et al. Oligodendrocyte-type 2 astrocyte (0-2A) progenitor cells express glutamine synthetase: developmental and cell type-specific regulation // Mol. Psychiatry.-1998.-V.3.-N.4.-P.356-361.

13. Baas D., Fressinaud C., Vitkovic L., Sarlieve L.L. Glutamine synthetase expression and activity are regulated by 3,5,3'-triiodo-L-thyronine and hydrocortisone in rat oligodendrocyte cultures // Int. J.Dev.Neurosci.-1998.-V.16.-N.5.-P.333-340.

14. Bacich D. J., Ramadan E., O'Keefe D. S., et al. Deletion of the glutamate carboxypeptidase II gene in mice reveals a second enzyme activity that hydrolyzes N -acetylaspartylglutamate // J. Neurochem.-2002.-V.83.-N.1.-P.20 29.

15. Bailey J., Bell E.T., Bell E.J. Regulation of Glutamate dehydrogenase: the effects of pH and ADP // J. Biol. Chem.-1982.-V.257.-P.5579-5583.

16. Barnett N.L., Pow D.V., Robinson S.R. Inhibition of Muller cell glutamine synthetase rapidly impairs the retinal response to light // Glia.-2000.-V.30.-N. 1 .-P.64-73.

17. Bartha R., Drost D.J., Menon R.S., Williamson P.C. Comparison of the quantification precision of human short echo time 'H spectroscopy at 1.5 and 4.0 Tesla // Magn. Reson. Med.-2000.-V.44.-P.185-192.

18. Bergles D.E., Jahr C.E. Glial contribution to glutamate uptake at Schaffer collateral-commisural synapses in the hippocampus // J. Neuroscience.-1998.-V. 18.-P.7709-7716.

19. Berk M., Plein H., Belsham B. The specificity of platelet glutamate receptor supersensitivity in psychotic disorders // Life Sci.-2000.-V.66.-N.25 .-P.2427-2432.

20. Berl S., Nicklas W.J., Clarke D.D. Compartmentation of citric acid cycle metabolism in brain: labelling of glutamate, glutamine, aspartate and gaba by several radioactive tracer metabolites // J. Neurochem.-1970.-V.17.-N.7.-P.1009-1015.

21. Blin M., Crusio W.E., Hevor Т., Cloix J.-F. Chronic inhibition of glutamine synthetase is not associated with impairment of learning and memory in mice // Brain Res. Bull.-2002.-V.57.-N.l.-P.l 1-15.

22. Boksha I. S., Tereshkina E. В., Burbaeva G. Sh. Glutamine synthetase and glutamine synthetase-like protein from human brain: Purification and comparative characterization // J. Neurochemistry.-2000.-V.75.-P.2574-2582.

23. Buchsbaum M.S., Haier R.J., Potkin S.G. et al. Frontostriatal disorder of cerebral metabolism in never-medicated schizophrenics // Arch. Gen. Psychiatry.-1992.-V.49.-P.935-942.

24. Burbaeva G. Sh., Turishcheva M.S., Vorobyeva E.B. et al. Diversity of glutamate dehydrogenase in human brain // Progress in Neuro-Psyhopharmacology and Biological Psychiatry.-2002.-V.26.-N.3.-P.427-435.

25. Burbaeva G. Sh. , Boksha I.S., Turishcheva M.S. et al. Glutamine synthetase and glutamate dehydrogenase in prefrontal cortex of patients with schizophrenia // Progress in Neuro-Psyhopharmacology and Biological Psychiatry.-2003.-V.27.-P.675-680.

26. Carlsson A., Waters N., Waters S., Carlsson M.L. Network interactions in schizophrenia therapeutic implications // Brain Res. Rev.-2000.-V.31 .-N.2-3.-P.342-349.

27. Cavallaro S., Meiri N., Yi C.-L. et al. Late Memory-related Genes in the Hippocampus Revealed by RNA Fingerprinting // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. Cell Biol.-1997.-V.94.-P.9669-9673.

28. Cho S.-W., Lee J., Choi S.Y. Two Soluble Forms of Glutamate Dehydrogenase Isoproteins from Bovine Brain // Eur. J. Biochem.-1995.-V.233.-P.340-346.

29. Choi D.W. Glutamate neurotoxicity and diseases of the nervous system. // V Neuron.-1988.-V. 1 .-P.623-634.

30. Cohen D.M. Inhibition of glutamine synthetase induces critical energy threshold for neuronal survival // Ann. N.Y. Acad.Sci.-1997.-V.826.-P.456-460.

31. Colon A.D., Plaitakis A., Perakis A. et al. Purification and Characterization of a Soluble and a Particulate Glutamate Dehydrogenase from Rat Brain // J. Neurochem.-1986.-V.46.-P. 1811-1819.

32. Cooper A.J., Abraham D.G., Gelbard A.S. et al. High activities of glutamine transaminase К (dichlorovinylcysteine P-lyase) and omega-amidase in the choroid plexus of rat brain // J. Neurochem.-1993.-V.61 .-P. 1731-1741.

33. Danbolt N.C., Storm-Mathisen J., Kanner B.I. An Na++K+. coupled L-glutamate transporter purified from brain is located in glial cell processes // Neuroscience.-1992.-V.51 .-P.295-310.

34. Davis J.M. Dose equivalence of the anti-psychotic drugs // J. Psychiat. Res.-1974.-V.l 1.-P.65-69.

35. Deakin J.F., Slater P., Simpson A.C. et al. Frontal cortical and left temporal glutamatergic dysfunction in schizophrenia // J.Neurochem.-1989.-V.52.-P. 1781-1786.

36. Derouiche A., Frotcher M. Astroglial processes around identified glutamatergic synapses contain glutamine synthetase: Evidence for transmitter degradation // Brain Research.-1991.-V.552.-P.346-350.

37. Derouiche A., Rauen T. Coincidence of L-Glu/L-Asp transporter (GLAST) and glutamine synthetase (GS) immunoreactions in retinal glia: evidence for coupling of GLAST and GS in transmitter clearance // J.Neurosci.Res.-1995.-V.42.-P. 131 -143.

38. Dracheva S., Elhakem S.L., Davis K.L., Haroutunian V. GAD65 and GAD67 protein expression in dorsolateral prefrontal cortex of elderly schizophrenia patients // Biol. Psychiatry.- 2002.-V.51.-P. 166.

39. Eastwood S.L., Harrison P.J. Synaptic pathology in the anterior cingulated cortex in schizophrenia and mood disorders, A review and Western blot study of synaptophysin, GAP-43 and the complexins // Brain Research.-2001.-V.55 .-P.569-578.

40. Erecinska M., Silver I.A. Metabolism and role of glutamate in mammalian brain // Prog. Neurobiol.-1990.-V.35.-P.245-296.

41. Fahien L.A., Cohen P.P. L-Glutamate dehydrogenase from frog and tadpole liver // Enzymology.-1970.-V.117.-P.839.

42. Farber N.B., Jiang X.P., Heinkel C., Nemmers B. Antiepileptic drugs and agents that inhibit voltage-gated sodium channels prevent NMDA antagonist neurotoxicity // Mol. Psychiatry.-2002.-V.7.-N.7.-P.726-733.

43. Ferrarese C., Begni В., Canevari C. et al. Glutamate uptake is decreased in platelets from Alzheimer's disease patients // Ann. Neurol.-2000.-V.47.-N.5.-P.641-643.

44. Gluck M.R., Thomas R.G., Davis K.L., Haroutunian V. Implications for altered glutamate and GABA metabolism in the dorsolateral prefrontal cortex of aged schizophrenic patients // Am. J. Psychiatry.-2002.-V. 159.-N.7.-P.1165-1173.

45. Goff D.C., Coyle J.T. The emerging role of glutamate in the pathophysiology and treatment of schizophrenia // Am. J. Psychiatry.-200 l.-V. 158.-P. 1367-1377.

46. Gorovits R., Avidan N., Avisar N. et al. Glutamine synthetase protects against neuronal degeneration in injured retinal tissue // PNAS USA.-1997.-V.94.-N.13.-P.7024-7029.

47. Gruetter R., Novotny E.J., Boulware S.D. et al. Localized 13C NMR spectroscopy in the human brain of amino acid labelling from D-l-13C.glucose // J. Neurochemistry.-1994.-V.63.-P. 1377-1385.

48. Hawkins R.A., DeJoseph M.R., Hawkins P.A. Regional brain glutamate transport in rats at normal and raised concentrations of circulating glutamate // Cell and Tissue Research.-1995.-V.281.-P.207-214.

49. Haznedar M., Buchsbaum M.S., Luu C. et al. Decreased anterior cingulated gyrus metabolic rate in schizophrenia // Am. J. Psychiatry.-1997.-V.154.-P.682.

50. Heresco-Levy U., Javitt D.C. The role of NMDA-receptor-mediated neurotransmission in the patophysiology and therapeutics of psychiatric syndromes // Eur. Neuropsychopharmacology.-1998.-V.8.-P. 141-152.

51. Hertz L. and Fillenz M. Does "the mystery of the extra glucose" during CNS activation reflect glutamate synthesis? // Neurochemistry Intenational.-1999.-V.34.-P.71 -75.

52. Hertz L., Bock E., Schousboe A. GFA content, glutamate uptake and activity of glutamate metabolizing enzymes in differentiating mouse astrocytes in primary cultures // Developmental Neuroscience.-1978.-V.1.-P.226-238.

53. Hertz L., Yu A.C.H., Kala G., Schousboe A. Neuronal-astrocytic and cytosolic-mitochondrial metabolite trafficking during brain activation, hyperammonemia and energy deprivation // Neurochemistry International.-2000.-V.37.-N.2-3.-P.83-102.

54. Humphries C., Mortimer A., Hirsh S., de Belleroche J. NMDA receptor mRNA correlation with antemortem cognitive impairment in schizophrenia // Neuroreport.-1996.-V.7.-N. 12.-P.2051-2055.

55. Hutchinson P.J., O'Connell M.T., Kirkpatrick P J., Pickard J.D. How can we measure substrate, metabolite and neurotransmitter concentrations in the human brain? // Physiol. Meas.-2002.-V.23.-P.75-109.

56. Jelinski S.E., Yager J.Y., Juurlink B.H. Preferential injury of oligodendroblasts by a short hypoxic-ishemic insult // Brain Research.-1999.-V.815.-P. 150-153.

57. Kim J.S., Kornhuber H.H., Schmid-Burgk W., Holzmuller B. Low cerebrospinal fluid glutamate in schizophrenic patients and a new hypothesis on schizophrenia // Neurosci. Lett.-1980.-V.20.-P.379-382.

58. Kojima S., Nakamura Т., Nidaira T. et al. Optical detection of synaptically induced glutamate transport in hippocampal slices // J.Neuroscience.-1999.-V.19.-P.2580-2588.

59. Kornhuber H. Chemistry, physiology and neuropsychology of schizophrenia: toward earlier diagnosis of schizophrenia // Archiv Psychiat. Nervkrankheiten.-1983.-V.233.-P. 15-22.

60. Kvamme E., Torgner I.A., Roberg B. Kinetics and localization of brain phosphate activated glutaminase // J. Neurosci. Res.-2001.-V.66.-N.5.-P.951-958.

61. Kvamme E., Svenneby G., Trogner, A.A. et al. Postnatal development of glutamate developing enzymes in hippocampus from mice // Int. Dev. Neurosci.-1995.-V.3.-P.359-364.

62. Laake J. H., Takumi Y., Eidet J. et al. Postembedding immunogold labelling reveals subcellular localization and pathway-specific enrichment of phosphate activated glutaminase in rat cerebellum // Neuroscience.-1999.-V.88.-P. 1137-1151.

63. Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head pf bacteriophage T4 // Nature.-1970.-V.227.-P.680-685.

64. Lehre P., Danbolt N.C. The number of glutamate transporter subtype molecules at glutamatergic synapses: chemical and stereological quantification in young adult brain // J.Neuroscience.-1998.-V.18.-P.8751-8757.

65. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem.-1951.-V.193.-P.265-275.

66. Mangano R.M., Schwarcz R. The human platelet as a model for the glutamatergic neuron: platelet uptake of L-glutamate // J. Neurochem.-1981.-V.36.-N.3.-P. 1067-1076.

67. McCullumsmith R.E., Haroutunian V., Davis K.L., Meador-Woodruff J.H. Expression of glutaminase transcripts in the thalamus of subjects with schizophrenia // Biol. Psychiatry.-2002.-V.51.-P.25.

68. McKenna М.С., Tildon J.T., Stevenson J.H. and Hopkins I.B. Energy metabolism in cortical terminals from weanling and mature rat brain: evidence for multiple compartments of TCA cycle activity // Dev. Neurosci.-1995 .-V. 16.-P.291 -300.

69. Memmerick S., Benz A., Zorumski C.F. Presynaptic influence on the time course of fast excitatory synaptic currents in cultured hippocampal cells // J.Neuroscience.- 1995.-V. 15.-P.3178-3192.

70. Memmerick S., Zorumski C.F. Glial contributions to excitatory neurotransmissionin cultured hippocampal cells // Nature.-1994.-V.368.-P.59-62.

71. Michaelidis T.M., Tzimagiorgis G., Moschonas N., Papamatheakis J. The human glutamate dehydrogenase gene family, gene organization and structural characterization // Genomics.-1993.-V. 16.-P. 150-160.

72. Miki Y., Taki Т., Ohura T. et al. Novel missense mutations in the glutamate dehydrogenase gene in the congenital hyperinsulinism-hyperammonemia syndrome // J. Pediat.-2000.-V.136.-P.69-72.

73. Newcomb R., Sun X., Taylor L. et al. Increased production of extracellular glutamate by the mitochondrial glutaminase following neuronal death // J.Biol.Chem.-1997.-V.272.-P.l 1276-11282.

74. Newcomer J.W., Krystal J.H. NMDA receptor regulation of memory and behavior in humans // Hippocampus.-2001.-V.l 1.-N.5.-P.529-542.

75. Ng K.T., O'Dowd B.S., Rickard N.S. et al. Complex roles of glutamate in the Gibbs-Ng model of one-trial aversive learning in the new-born chick // Neurosci. Biobehav. Rev.-1997.-V.21.-P.45-54.

76. Nilsson M., Waters S., Waters N. et al. A behavioural pattern analysis of hypoglutamatergic mice- effects of four different antipsychotic agents // J.Neural Transm.-2001 .-V. 108.-P. 1181 -1196.

77. Pascual J.M., Carceller F., Roda J.M., Cerdan S. Glutamate, glutamine and GABA as substrates for neuronal and glial compartments after focal cerebral ishemia in rats // Stroke.-1998.-V.29.-P.1048-1057.

78. Pfrieger F.W., Barres B.A. New views on synaps-glia interactions // Current Opinion in Neurobiology.-1996.-V.6.-P.615-621.

79. Plaitakis A., Berl S., Yahr M.D. Abnormal glutamate metabolism in an adult-onset degenerative neurological disorder // Science.-1982.-V.216.-P.193-196.

80. Plaitakis A., Berl S., Yahr M.D. Neurological Disorders Associated with Deficiency of GDH // Ann. Neurol.-1984.-V.15.-P.144-153.

81. Plaitakis A., Flessas P., Natsiou A.B. and Shashidharan P. Glutamate dehydrogenase deficiency in cerebellar degenerations: clinical, biochemical and molecular genetic aspects // Can. J.Neurol.Sci.-1993.-V.20.-S.3.-P.109-115.

82. Plaitakis A., Zaganas I. Regulation of human glutamate dehydrogenases: implications for glutamate, ammoniate and energy metabolism in brain // J. Neurosci. Res.-2001.-V.66.-N.5.-P.899-908.

83. Preiss Т., Hall A.G., Lightowlers R.N. Identification of bovine glutamate dehydrogenase as an RNA-binding protein // J. Biol. Chem.-1993.-V.268.-P.24523-24526.

84. Rajas F., Gire V., Rousset B. Involvement of a Membrane-bound Form of Glutamate Dehydrogenase in the Association of Lysosomes to Microtubules // J. Biol. Chem.-1996.-V.271.-P.29882-29890.

85. Rajas F., Rouset B. A membrane-bound form of glutamate dehydrogenase possesses an ATP-dependent high-affinity microtubule-binding activity//J. Biochem.-1993.-V.295.-P.447-455.

86. Rothe F., Wolf G., Schunzel G. Immunohistochemical -у/ demonstration of glutamate dehydrogenase in the postnatally developingrat hippocampal formation and cerebellar cortex, comparison to activity staining // Neuroscience.-1990.-V.39.-P.419-429.

87. Rothstein J.D., Dykes-Holmberg M., Pardo C.A. et al. Knock-out of glutamate transporters reveals a major role for astroglial transport in excitotoxicity and clearance of glutamate // Neuron.-1996.-V. 16.-P.675-686.

88. Schmitt A., Kugler P. Cellular and regional expression of glutamate dehydrogenase in the rat nervous system, non-radioactive in situ hybridization and comparative immunocytochemistry // Neuroscience.1999.-V.92.-P.293-308.

89. Schousboe A., Westergaard N., Sonnewald U. et al. Glutamate and glutamine metabolism and compartmentation in astrocytes // Developmental Neuroscience.- 1993.-V.15.-P.359-366.

90. Schousboe A., Westergaard N., Waagepetersen H.S. et al. Trafficking between glia and neurons of TCA cycle intermediates and related metabolites // Glia.-1997.-V.21.-P.99-105.

91. Shashidharan P., Clarke D.D., Ahmed N. et al. Nerve tissue-specific human GDH that is thermolabile and highly regulated by ADP // J. Neurochem.-1997.-V.68.-P. 1804-1811.

92. Shashidharan P., Michaelidis M., Robakis N.K. et al. Novel human GDH expressed in neural and testicular tissues and encoded by an X-linked intronless gene // J. Biol. Chem.-1994.-V.269.-P.l6971-16976.

93. Shen J., Rothman D.L. Magnetic resonance spectroscopic V* approaches to studying neuronal: glial interactions // Biol. Psych.-2002.1. V.52.-P.694-700.

94. Simpson M.D., Slater P., Royston M.C., Deakin J.F. Alterations in phencyclidine and sigma binding sites in schizophrenic brains: effects of disease processes and neuroleptic medication // Schizophrenia Res.-1991.-V.6.-N.41-48.

95. Sneddon J.M. Blood platelets as a model for monoamine-containing neurons // Prog. Neurobiol.-1973.-V. 1 .-N.2.-P. 151-198.

96. Snyder G.I., Allen P.B., Feinberg A.A. et al. Regulation of phosphorylation of the GluRl AMP A receptor in the neostriatum by dopamine and stimulants in vivo // J.Neurosci.-2000.-V.20.-P.4480-4488.

97. Soghomonian J.-J., Martin D.L. Two isoforms of glutamate decarboxylase: Why? // Trends in Pharmacological Sci.-1998.-V.19.-N.12.-P.500-505.

98. Sonnewald U., Westergaard N., Jones P., et al. Metabolism of U-13C5. glutamine in cultured astrocytes studied by NMR spectroscopy: first evidence of astrocytic pyruvate recycling // J. Neurochem.-1996.-V.67.-N.6.-P.2566-2572.

99. Stanley C. A., Lieu Y. K., Hsu B. Y. L. et al. Hyperinsulinism and hyperammonemia in infants with regulatory mutations of the glutamate dehydrogenase gene //New Eng. J. Med.-1998.-V.338.-P.1352-1357.

100. Steinhauser C. and GalloV. Newson glutamate receptors in glial cells // Trends Neurosci.-1996.-V.19.-P.339-345.

101. Suarez I., Bodega G., Arilla E., Fernandez B. Region-selective glutamine synthetase expression in the rat central nervous system following portocaval anastomosis // Neuropathol. Appl. Neurobiol.-1997.-V.3.-P.254-261.

102. Subbalakshmi G.Y., Murthy C.R. Isolation of astrocytes, neurons, and synaptosomes of rat brain cortex, distribution of enzymes of glutamate metabolism // Neurochem. Res.-1985.-V.10.-P.239-250.

103. Svensson Т.Н. Dysfunctional brain dopamine systems induced by psychotomimetic NMDA-receptor antagonists and the effects of antipsychotic drugs // Brain Res. Reviews.-2000.-V.31.-N.2-3.-P.320-329.

104. Swanson R.A., Graham S.H. Fluorcitrate and fluoroacetate effects on astrocyte metabolism in vitro 11 Brain Research.-1994.-V.664.-P.94-100.

105. Tamminga C.A. and Frost D.O. Changing concepts in the neurochemistry of schizophrenia // Am. J. Psychiat.-2001.-V.158.-N.9.-P.1365-1366.

106. Tamminga C.A., Vogel H., Gao X.M. et al. The limbic cortex in schizophrenia: focus on the arterior cingulated // Brain Research.-2000.-V.31.-P.364-370.

107. Tapiero H., Mathe G., Couvreur P., Tew K.D. II. Glutamine and glutamate // Biomed Pharmacother.-2002.-V.56.-N.9.-P.446-457.

108. Tate S.S. and Meister A. Identity of maleate-stimulated glutaminase with y-glutamyl transpeptidase in rat kidney // J. Biol. Chem.-1975.-V.250.-P.4619-4627.

109. Theberge J., Bartha R., Drost D.J. et al. Glutamate and glutamine measured with 4.0 T proton MRS in never-treated patients with schizophrenia and healthy volunteers // Am. J. Psychiatry.-2002.-V.159.-P.l 944-1946.

110. Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets procedure and some applications // PNAS USA.-1979.-V.76.-N.9.-P.4350-5354.

111. Tsai G., Coyle J.T., Kleinman J.E. et al. Abnormal excitatory neurotransmitter metabolism in schizophrenic brain // Arch. Gen. Psychiatry.-1996.-V.52.-P.829-836.

112. Tsakopoulos M., Magistretti P.J. Metaboilc coupling between glia and neurons // J.Neurosci.-1996.-V.16.-P.877-885.

113. Ventura R., Harris K.M. Three-dimensional relationships between hippocampal synapses and astrocytes // J.Neuroscience.-1999.-V.19.-P.6897-6990.

114. Werner P., Pitt D., Raine C.S. Multiple sclerosis: altered glutamate homeostasis in lesions correlates with oligodendrocyte and axonal damage // Ann. Neurol.-2001.-V.50.-N.2.-P.169-180.

115. Westergaard N., Drejer J., Schousboe A., Sonnewald U. Evaluation of the importance of transamination versus deamination in astrocytic metabolism of U-13C.glutamate // Glia.- 1996.-V.17.-N.2.-P. 160-168.

116. Westergaard N., Sonnewald U. and Schousboe A. Release of a-ketoglutarate, malate and succinate from cultured astrocytes: possible role in amino acid neurotransmitter homeostasis // Neurosci. Lett.-1994.-V.176.-P.105-109.

117. V 135. Yamamoto H., Konno H., Yamamoto T. et al. Glutamine synthetaseof human brain: Purification and characterization // J.Neurochemistry.-1987.-V.49.-N.2.-P.603-609.

118. Yu A.C.H., Schousboe A., Hertz L. Metabolic fate of 14C-labeled Glu in astrocytes in primary cultures // J. Neurochem.-1982.-V.39.-P.954-960.

119. Yudkoff M. Brain metabolism of branched-chain amino acid // Glia.-1991.-V.21 .-P.92-98.

120. Zielke H.R., Collins R.M., Baab P.J. et al. Compartmentation of 14C.glutamate and [14C]glutamine oxidative metabolism in the rat hippocampus as determined by microdialysis // Journal of Neurochemistry.-1998.-V.71 .-P. 1315-1320.

Информация о работе

Воробьева, Елена Анатольевна
кандидата биологических наук
Москва, 2003
ВАК 03.00.04

Диссертация

Глутаматдегидрогеназа мозга человека в норме и при шизофрении - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Глутаматдегидрогеназа мозга человека в норме и при шизофрении ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Глутаматдегидрогеназа мозга человека в норме и при шизофрении"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Воробьева, Елена Анатольевна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Глутаматдегидрогеназа мозга человека в норме и при шизофрении"

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Воробьева, Елена Анатольевна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Воробьева, Елена Анатольевна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Глутаматдегидрогеназа мозга человека в норме и при шизофрении
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия