Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурная организация, кооперативное функционирование и аллостерическая регуляция глутаматдегидрогеназы

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурная организация, кооперативное функционирование и аллостерическая регуляция глутаматдегидрогеназы"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В.А.ЭНГЕЛЬГАРДТА

/Ь^

На правах рукописи УДК 577. (158.4 + 150.3 + 150.5)

д/ 070 в

у?. л. и

КмРАБАШЯН ЛЕОН ВАГАРШАКОВИЧ

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ, КООПЕРАТИВНОЕ ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ И АЛЛОСТЕРИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ГЛУТАМАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

"Молекулярная биология" 03. 00. 03

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 1989

Работа выполнена в Институте экспериментальной биологии АН Армянской ССР

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор В. К. АНТОНОВ доктор химических наук, профессор Р. И. ЛИХТЕНШТЕЙН доктор химических наук, профессор Г. И. ЯКОВЛЕВ

Ведущая организация - Проблемная научно-исследовательская лаборатория молекулярной биологии и биоорганической химии им.А.Н.Белозерского Московского Государственного университета им.М.В.Ломоносова.

Защита состоится "_"_ 1990 г. в _ часов на

заседании Специализированного совета Д 002.79.01 Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта АН СССР по адресу: 117984, ГСП-1, Москва, В-334, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта АН СССР.

Автореферат .разослан "_"_ 1990 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат химических наук

А. М. КРИЦЫН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность пройдет. В настоящее время все большее признание получают представления о реализации метаболических процессов на уровне структурно организованных полиферментных систем, сформированных из ферментов, осуществляющих последовательные метаболические реакции. Вместе с тем, механизмы регуляции подобных, а также других, находящихся на более высоком уровне структурированности систем, базируются на каталитических и регу-ляторных механизмах олигомерных ферментов, занимающих наиболее низкий уровень в таких иерархически построенных структурах. Значительная часть ферментов, участвующих в метаболизме, представляет собой олигомеры, состоящие из идентичных по химической структуре субъединиц. Уникальными особенностями подобных ферментов являются кооперативность функционирования и аллостерическая регулируемость, обеспечивающие их исключительную чувствительность к незначительным изменениям концентраций метаболитов в клетке.

Широко развернувшиеся в последнее время энзимологические исследования, с использованием наряду с растворимыми иммобилизованных форм ферментов, привели к значительному углублению наших представлений о молекулярном строении и механизмах функционирования ряда олигомерных ферментов, в большинстве своем представляющих димеры или тетрамеры. Вместе с тем, в связи с недостаточностью экспериментальных данных, относящихся в частности к молекулам с высокой степенью олигомерности, выяснение общих принципов формирования, функционирования и аллостерической регуляции кооперативных систем с взаимодействующими активными и ре-гуля торными центрами остается нерешенной проблемой.

К числу ферментов, занимающих важное место в клеточном метаболизме, относится глутаматдегидрогеназа (ь-глутамат-НАБ(р)-оксидоредуктаза К.Ф. 1.4.1.3), катализирующая взаимопревращения ь-глутаминовой и 2-оксоглутаровой, а также ряда других амино- и кетокислот. Согласно современным представлениям глутаматдегидрогеназа является связующим звеном ряда метаболических превращений, в частности реакций аминокислотного, углеводного и азотистого обменов. Участие глутаматдегидрогеназы в таком широком спектре

метаболических процессов предполагает наличие у молекулы фермента различных механизмов оперативной регуляции каталитической активности, что, по-видимому, обеспечивается его гексамерным строением.

Очевидно, что значение исследований структурно-функциональных особенностей каталитически активного гексамера глутаматдеги-дрогеназы выходит за рамки выяснения принципов формирования и функционирования олигомерных систем, состоящих из идентичных субъединиц, и наряду с этим представляют интерес для понимания чрезвычайно важных вопросов контроля и регуляции метаболических процессов, в которых принимает участие этот фермент.

Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования заключалась в выяснении структурной организации и основных принципов кооперативного функционирования и аллостерической регуляции гексамера глутаматдегидрогеназы. Для достижения поставленных целей, в работе был использован комплексный подход, основанный, с одной стороны, на исследовании кооперативных и регуляторных характеристик различных растворимых производных глутаматдегидрогеназы, полученных путем специфической модификации функциональных групп фермента, и, с другой, - на изучении структурно-функциональных особенностей различных олигомерных форм фермента, полученных путем его иммобилизации на нерастворимом носителе. Задачи настоящего исследования состояли в

- получении методом химической модификации глутаматдегидрогеназы пирвдоксаль-Р* и ТМОРО^производных фермента, с нарушениями з определенных звеньях системы взаимодействий меаду активными и регуляторными центрами, и исследовании их физико-химических, каталитических и регуляторных свойств;

- разработке различных теоретических моделей кооперативной инактивации гексамера и его десенсибилизации к действию аллостери-ческого эффектора;

- исследовании связи между структурной организацией гексамера глутаматдегидрогеназы и его кооперативными и аллостерическими

^-пиридоксаль-б^фосфат

н-2,2,6,6-тетраметил-4-оксопиперидин-1-оксил.

характеристиками путем анализа экспериментальных данных в рамках разработанных моделей;

- исследовании роли межсубъединичных контактов в обеспечении конформационной устойчивости глутаматдегидрогеназы;

- иммобилизации гексамера на сефарозе посредством ковалентной сшивки одной из субъединиц, и исследовании процессов диссоциации и инактивации иммобилизованного фермента, с целью выяснения условий получения конформационно устойчивых олигомерных фрагментов гексамера и исследования их свойств;

- выяснении взаимной ориентации субъединиц в составе гексамера глутаматдегидрогеназы и роли различных типов межсубъединичных контактов в формировании активных центров;

- исследовании роли межсубъединичных взаимодействий в реализации механизмов кооперативного и аллостерического поведения гексамера.

Научная новизна и практическая ценность -работы. Комплексное изучение физико-химических, каталитических и регуляторных характеристик различных растворимых и иммобилизованных производных глутаматдегидрогеназы, моделирующих нативный фермент, позволило установить, что субъединицы, составляющие каталитически активный гексамер, занимают эквивалентные позиции и упакованы в структуру, описываемую точечной группой симметрии 3 2х, с учетом внутренней асимметрии субъединиц. При этом каждая из субъединиц взаимодействует с соседними посредством двух типов контактов -идентичных изологических и идентичных гетерологических.

В рамках постулированной структурной организации гексамер может быть представлен как в виде структуры, сформированной из трех эквивалентных димеров (Зсх^), в которых субъединицы взаимодействуют посредством изологических контактов, так и з виде структуры, сформированной из двух эквивалентных тримеров (20^), в которых субъединицы взаимодействуют посредством гетерологических контактов.

Гексамер с постулированной структурной организацией представляет собой молекулу, обладающую минимальной степенью олиго-

здесь, и далее в тексте симметрия молекулы дана в символах Германа-Могена.

мерности, в которой эквивалентно ориентированные субъединицы участвуют в формировании двух простейших олигомерных фрагментов - димеров, с субъединицами, взаимодействующими посредством изо-логических контактов, и тримеров, имеющих кольцевую структуру с идентичными гетерологическими контактами.

Оба типа межсубъединичных контактов необходимы для обеспечения конформационной устойчивости каталитически активного гек-самера глутаматдегидрогеназы. Вместе с тем, ассоциация субъединиц в гексамеры не является необходимым условием сборки активных центров. При условии обеспечения конформационной устойчивости, для формирования активны:-; центров достаточно ассоциации субъединиц в кольцевые тримерные фрагменты посредством идентичных гетерологических контактов.

Как изологические, так и гетерологические межсубъединичные контакты принимают участие в формировании гексамера в виде система с взаимодействующими активными центрами.

Изологические контакты обеспечивают реципрокальные межсубъединичные взаимодействия, обусловливающие отрицательную коопера-тивность гексамера глутаматдегидрогеназы. Гетерологические межсубъединичные контакты обеспечивают взаимодействия между активными центрами, обусловливающие кооперативное действие аллостери-ческого эффектора gtp.

Полученные в настоящей работе данные о структурной организации гексамера и о роли различных межсубъединичных контактов в его реализации в виде системы с взаимодействующими активными центрами, удовлетворяют требованиям, предъявляемым к олигомер-ным ферментам, функционирующим по кооперативному механизму "flip-flop". При этом, подобный кооперативный механизм может быть реализован как в рамках каждого из трех димерных фрагментов 0Г2, так и в рамках гексамера в целом, при его представлении в виде димера идентичных тримеров - 2 оСд.

Вместе с тем, полученные данные не исключают возможность функционирования глутаматдегидрогеназы в виде пленарного триме-ра при условии обеспечения его конформационной устойчивости, которая может быть реализована, в частности,при включении глутаматдегидрогеназы в состав структурно организованных полиферментных систем.

Результаты настоящей работы могут быть использованы при выявлении общих закономерностей кооперативного функционирования и аллостерической регуляции олигомерных ферментов, сформированных из идентичных субъединиц. Предложенные методы теоретического анализа различных моделей кооперативной инактивации и аллостерической регуляции гексамера глутаматдегидрогеназы могут найти применение при исследовании других олигомерных ферментов.

Полученные в результате проведенных исследований сведения о механизме кооперативного функционирования и аллостерической регуляции глутаматдегидрогеназы открывают возможности целенаправленного поиска путей контролируемых воздействий на метаболические процессы, в которых принимает участие глутаматдегидроге-наза. Кроме того, полученные результаты могут найти применение для усовершенствования промышленных методов энзиматического получения оптических изомеров ь-аминокислот из соответствующих кетокислот.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на:

Ш Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции активных центров ферментов", (Пущино на Оке, 1976),

Международном симпозиуме по аминокислотам, пептидам и белкам, (Ереван, 1978),

IV Всесоюзном симпозиуме "Физико-химические основы ферментативного катализа и его регуляция", (Москва, 1982),

Конференции по молекулярно-клеточной биологии, (Ереван, 1983), Шестой Закавказской конференции по адсорбции и хроматографии, (Ереван, 1984),

16-ой конференции ФЕБО, (Москва, 1984),

Симпозиуме "Макромолекулы и функционирование клетки", (Ереван, 1986),

V Всесоюзной научной конференции "Проблемы и перспективы ферментативного катализа", (Москва, 1987),

IX симпозиуме биохимических обществ ГДР и СССР "Метаболическая регуляция на клеточном и молекулярном уровне", (йена, ГДР, 1987).

Работа апробирована на совместном научном коллоквиуме лабораторий стереохимии ферментативных реакций и химии регуляторов

ферментативной активности ИМБ АН СССР от 10 октября 1989г.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (гл.1), описания методов исследований (гл.2), результатов экспериментов и их обсуждения (гл. 3-6), заключения, выводов, приложений I и II и списка цитируемой литературы.

Работа изложена на 325 страницах машинописного текста, включая 58 рисунков и 16 таблиц. Приложение I содержит 3 рисунка и 3 таблицы, приложение 11-9 таблиц. Список цитированной литературы содержит 328 наименований.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Глутаматдегидрогеназу из тканей млекопитающих выделяли, пользуясь методами ионообменной и аффинной хроматографии. Производные глутаматдегидрогеназы с определенными нарушениями в системе взаимодействии между активными и регуляторными центрами получали путем специфической модификаций лизиновых остатков фермента пиридоксаль-Р и ТТ.ЮРО в присутствии различных комбинаций специфических лигавдов - коферментов, субстратов и аллостеричес-ких эффекторов.

Иммобилизацию глутаматдегидрогеназы на сефарозе проводили в условиях, обеспечивающих вовлечение в ковалентнуга связь с носителем одной из субъединиц гексамера. Для достижения этой цели в качестве подложки использовали либо сефарозу, предварительно активированную Бгсы , либо сефарозу, предварительно модифицированную пиридоксаль-Р посредством образования фосфамидной связи между его фосфатной группой и аминогруппой аминогексильного производного сефарозы.

Ферментативную активность растворимых и иммобилизованных производных определяли спектрофотометрически, по начальной скорости изменения оптической плотности в полосе поглощения кофер-мента (340 нм).

Конформационную устойчивость белков оценивали методом изотермической денатурации мочевиной или гуанидиний хлоридом.

Параметры взаимодействия глутаматдегидрогеназы с кофермен-тами и регуляторами определяли методом равновесного диализа.

Содержание в производных фермента спиновой метки и фосфопи-

ридоксильного остатка определяли соответственно методом двойного интегрирования спектра ЭПР или спектрофотометрически.

Коэффициенты седиментации определяли методом скоростной седиментации на аналитической ультрацентрифуге "Spinco" модель Е фирмы "Beckman" (США), снабженной сканирующей приставкой. Спектры ЭПР снимали на радиоспектрометре "Varian Е-9" (США), КД -на дихрографе "Jobin Ivon Ш" (Франция), флуоресценции - на спек-трофлуориметре "Farrand Opt.Co.Xnc. " (США), поглощения - на спектрофотометрах "Specord м-40" и "Specord uv vis" (ГДР). Радиоактивность образцов оценивали, пользуясь сцинтиллятором Брея, на жидкостном сцинтилляционном счетчике SL-t-221 (Франция).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЗДШИЕ-

Модификация глутаматдегидрогеназы пиридоксаль-Р. Изучение роли структурной организации гексамера в ингиби-ровании gtp.

Представленные в настоящей главе результаты исследований позволили установить, что пиридокоаль-Р образует восстанавливаемые RaBH^ основания Шиффа с тремя различными функционально значимыми аминокислотными остатками глутаматдегидрогеназы. Модификация фермента в присутствий nadh, 2-оксоглутарата и gtp - ли-,гавдов, блокирующих активные и регуляторные центры глутаматдегидрогеназы от взаимодействия с гшридоксаль-Р, позволила получить фоофопиридоксильное производное Ер_рХу, которое не отличается от нативногб фермента по каталитической активности и регуляции gtp. Вместе с тем, полученное производное не обладает способностью к образованию высокомолекулярных ассоциатов. Эти результаты свидетельствуют о том, что ингибиторный эффект gtp не зависит от агрегатного состояния глутаматдегидрогеназы и осуществляется по крайней мере на уровне гексамера. Согласно результатам исследований по идентификации модифицируемого аминокислотного остатка, в указанных условиях пиридоксаль-Р блокирует 6 -аминогруппу остатка Lys-333.

Модификация данного производного глутаматдегидрогеназы в присутствии nadh и 2-оксоглутарата - лигандов, блокирующих только активные центры гексамера, - сопровождается дополнительным

включением I моль фосфопиридоксильного остатка на I моль субъединиц фермента. Полученное производное фермента Ер_рху сохраняет каталитическую активность, однако частично десенсибилизируется к ингибиторному эффекту gtp. Анализ данных по изучению влияния gtp на каталитическую активность нативной глутаматдегидроге-назы и производного Ер_рХу в координатах Хилла показал, что одновременно с повышением к^ от 5xI0~® М до 2x10"^ М, модификация сопровождается понижением коэффициента Хилла от 2,1 до 0,95. Иначе говоря, модификация приводит к исчезновению положительной кинетической кооперативности ингибирования глутаматдегидрогена-зы со стороны gtp. Для выяснения природы кинетической кооперативности ингибирования глутаматдегидрогеназы, методом равновесного микродиализа были определены константы диссоциации комплексов gtp с производными ер_рХу и ер_рху Анализ полученных данных в координатах Скэтчарда позволил установить, что каждая субъединица производного Ер-Рху' подобно нативному ферменту, обладает одним центром связывания gtp с Kd = 6,5xI0~5 М. В присутствии же nadh, на каждой субъединице индуцируется дополнительный центр связывания gtp и взаимодействие характеризуется двумя значениями Kd = 1СГ® М и 5x10"^ М. В случае же производного Ер_рху, не проявляющего кинетической кооперативности ингибирования gtp, nadh не влияет на количество gtp-связывающих центров и приводит к относительно небольшому смещению Kd от 6x10"^ М до 9хЮ~® М. Эти данные позволяют заключить, что при модификации производного Ер-Рху готРВДоксаль-Р в присутствии nadh и 2-оксо-глутарата, имеет место блокирование hadh-ицдуцируемого центра связывания gtp. При э'юм, несмотря на изменение характера инги-'бирования, фермент сохраняет способность к ингибированию со стороны gtp.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что связывание gtp в nadh-индуцируемом центре не является необходимым условием ингибирования фермента. В то же время, связывание молекулы эффектора в другом центре (далее в тексте именуемом "инги-бирующий" центр связывания gtp) является достаточным условием для реализации действия gtp. Сопоставление Kd комплексов gtp с производными Ер-Рху и Ер^рху. при отсутствии и в присутствии nadh, позволяет заключить, что связывание молекулы gtp в nadh-

индуцируемом центре обеспечивает лучшее сродство эффектора к "шгибирующему" центру. Полученные данные дают основание считать, что кинетическая кооперативность ингибирования глутамат-дегидрогеназы йТР обусловлена положительной кооперативностыо связывания ферментом двух молекул эффектора.

Данное производное глутаматдегидрогеназы было использовано нами в качестве модели для получения информации о роли структурной организации гексамера в реализации действия отр. С этой целью производное Ер_рху подвергали модификации пиридоксаль-Р в отсутствие КАШ и 2-оксоглутарата - протекторов модификации остатка Ьу8-126, локализованного в активном центре глутаматдегидрогеназы.

На рис. I представлены зависимости ферментативной активности производного Ер_рху при отсутствии и в присутствии (5ТР от времени инкубации фермента с пиридоксаль-Р. На том же рисунке

Рис. I. Зависимости ферментативной активности производного р

Ер_рХу от времени инкубации с гагридоксаль-Р: (I) - при отсутствии СТР; (2) - в присутствии 2хЮ~3 М втр. (3) - Зависимость степени ингибирования 3 - А+Отр/А_етр от времени инкубации Ер_рХу с пиридоксаль-Р.

о 10 20

мин

приведена аналогичная зависимость для степени ингибирования я, представляющей собой отношение ферментативных активностей в присутствии и при отсутствии йтр.. Согласно полученным результатам, инактивации данного производного фермента сопутствует десенсибилизация его остаточной активности к действию йтр.

Результаты исследований по идентификации модифицируемого

аминокислотного остатка позволили выяснить, что ocia обсуждаемых процесса обусловлены специфической модификацией остатков Lys-126 субъединиц производного Ер_рху. Изучение зависимости остаточной активности производного фермента от среднего содержания включаемого в белок фосфопиридоксилъного остатка позволило установить, что блокирование ¿-аминогруппы остатка Lys-126 произвольной субъединицы сопровождается ее полной инактивацией, не отражаясь на каталитической активности соседних субъединиц. Полученные данные о некооперативном характере инактмвации производного фермента, совместно с результатами анализа кинетических зависимостей модификации, инактивации и десенсибилизации к действию gtp , позволили выдвинуть предположение о том, что, наряду с инактивацией модифицируемой субъединицы, происходит десенсибилизация к действию gtp одной из каталитически активных субъединиц фермента. Очевидно, что подобный эффект может иметь место лишь при эквивалентной взаимной ориентации субъединиц, составляющих гекса-мер. Простейшей структурой, удовлетворяющей этому условию, является замкнутый планарный гексамер с идентичными гетерологически-ми субъединичными контактами. Однако подобная структура не может быть согласована с результатами электронномикроскопических исследований морфологической структуры гексамера глутаматдегидрогеназы печени быка ( Eisenberg, Keisler , 1970; Josephs, 1975, 1971), согласно которым молекула глутаматдегидрогеназы аппроксимируется эллипсоидом вращения с соотношением осей 1:1,5, и описывается точечной группой симметрии 3 2 в форме треугольной призмы или антипризмы (рис. 2 А и Б соответственно). На том же рисунке приведены схематические изображения разверток этих моделей гексамеров, с учетом эквивалентной взаимной ориентации субъединиц. Следует отметить, что при любой иной упаковке субъединиц в рамках точечной группы симметрии 3 2, условие эквивалентности взаимной ориентации субъединиц не может быть выполнено.

Очевидно, что при способах упаковки субъединиц, приведенных на рис. 2, гексамер можно представить: I - как систему, состоящую из двух идентичных тримеров (2 сх^), каждый из которых представляет собой замкнутую кольцевую структуру с идентичными гетерологическими межсубъединичными контактами. Очевидно, что при таком представлении модификация произ-

Рис. 2. Структурные модели гексамера глутаматдегидрогеназы и схематические изображения разверток этих моделей (подробности в тексте).

вольной субъединицы гексамера приведет к десенсибилизации к действию отр соседней субъединицы либо по направлению pq, либо чр; 2 - как систему из трех идентичных димеров (ЗоС2), в которых субъединицы взаимодействуют посредством идентичных изологичес-ких контактов (аа или ЪЪ). При подобном представлении, вследствие идентичной взаимной ориентации субъединиц в димере, модификация любой из них может вызвать десенсибилизацию соседней посредством изологического межсубъединичного контакта.

Опираясь на эти представления, нами был произведен расчет степени ингибирования гексамера сК У ) в зависимости от среднего числа модифицированных субъединиц. При расчете учитывали, что при модификации в среднем у субъединиц, реализуется статистический набор гексамеров, в которых модифицировано п субъединиц (О^п^б). Принимая во внимание это обстоятельство, степень регуляции гексамера определяли по соотношению:

6

B(V) £ V»>'Bn Q<1>) - ---SSS--(I)

zl vn(v).an n»o

где vn(V)- функция распределения гексамеров с п модифицированными субъединицами, ап и вп- активности гексамера, в которых модифицировано а субъединиц, при отсутствии и в присутствии ал-лостерического эффектора соответственно. Поскольку инактивация производного Ер_рху представляет собой некоопоративный процесс, значение ап определяли по следующему соотношению:

6-п

Ав---Ас (2)

п

где aq - активность нативного гексамера.

Согласно предложенным схемам десенсибилизации, при модификации п субъединиц реализуется статистический набор i типов гексамеров, различающихся по каталитической активности в присутствии gtp - в*. Учитывая, что каждый из типов модифицированных гексамеров может реализоваться с вероятностью р*, величина Вп будет определяться соотношением:

в - /Lp^B1 (3)

и 11

где представляет собой аддитивную сумму активностей нативных и десенсибилизированных к действию GTP субъединщ гексамера .i-го типа с соответствующими статистическими весами:

л г 1

В;---A - qn.Kj + (I-qa)-K2 (<0

n L

Чп - статистический вес нативных субъединиц, и £2 - степени регуляции нативной и десенсибилизированных субъединиц соответственно.

Поскольку модификация остатков Lys-126 субъединиц производного Ер_рХу представляет собой взаимонезависимый и равноверсят-

ностный процесс, при расчете значений Я^Ю по соотношению (I), в качестве функции распределения Уп(у) использовали функцию распределения Бернулли.

Учитывая, что при модификации в среднем 5 и более субъединиц производного Ер_рху гексамер практически полностью десенсибилизируется к действию йтр, значение к? принимали равным I.

Рис. 3. Теоретические зависимости степени ингибировагшя гекса-мера глутаматдегидрогеназы СТР V)) от среднего числа (У) модифицированных остатков Ьув-126 при к1=0,1 и для способов десенсибилизации а, б, в и г. (•) - экспериментальные значения 0.С V) 1 полученные при концентрации отр, составляющей ¡¿хЮ-^ М. [») и [Т) - схематические изображения модифицированной и десенсибилизированной к ОТР субъединиц соответственно.

На рис. 3 представлены теоретические зависимости ), рассчитанные при условии, что к^. = 0,1 для случаев десенсибилизации гексамера глутаматдегидрогеназы как посредством гетероло-гических (а), так и посредством изологическях (б) межсубъединичных контактов. Как видно, расчетные зависимости С}(>>) в обоих случаях совпадают друг с другом, и удовлетворительно согласуются с экспериментальными значениями ч(^), полученными при концентра-

ту)

I 2 3 4 5 -у 6

- 16 -

о

ции gtp , составляющей 2x10 M. На том же рисунке приведены зависимости, рассчитанные для описанной в литературе модели с .неэквивалентной ориентацией субъединиц. Согласно данным по изучению четвертичной структуры глутаматдегидрогеназы методом "перекрестных сшивок" диметиладипимидатом, гексамер фермента может быть представлен как "димер тримеров" ( Rashed et al,1977). При этом, по мнению авторов, реализуется структура тримера с двумя изоло-гическими контактами и, вероятно, одним гетерологическим контактом. Для этого случая, вследствие неидентичности всех трех контактов в тримере, десенсибилизирующее воздействие может передаваться или через гетерологический контакт (в), или через один из изологических контактов (г).

Как видно из приведенных на рисунке данных, экспериментальные результаты существенно отличаются от зависимостей, рассчитанных для этих случаев.

Таким образом, сравнение экспериментальных данных с рассчитанными зависимостями свидетельствует об эквивалентной ориентации субъединиц в гексамере, и подтверждает представление о том, что модификация остатка Lys-126 любой из субъединиц гексамера сопровождается десенсибилизацией к действию GTP одной из соседних каталитически активных субъединиц фермента.

С целью получения информации о причине десенсибилизации глутаматдегидрогеназы к действию аллостерического эффектора, методом равновесного диализа было исследовано влияние модификации производного Ер_рХу на характеристики его взаимодействия с gtp. Согласно полученным результатам модификация остатка Lys-126 приводит к блокированию "ингибирующего" участка связывания gtp, или, по крайней мере, ухудшению сродства эффектора к этому участку. При этом необходимо отметить, что этот участок может быть локализован как на субъединице, в состав которого входит модифицированный остаток Lys-126, так и на соседней, десенсибилизированной субъединице. Эти результаты свидетельствуют о том, что действие gtp не может быть реализовано на уровне изолированной субъединицы, и в его реализацию должен быть вовлечен, по крайней мере, димерный фрагмент гексамера.

Модификация глутаматдегидрогеназы ТМОРО. Изучение роли межсубъединичных взаимодействий в кооперативном функционировании и аллостерической регуляции.

В предыдущем разделе было установлено, что в производных

аллостерического ингибирования и активными центрами гексамера.

в результате блокирования ¿-аминогруппы остатка Ьув_126, в отличие от нативного фермента, происходит по некооперативному механизму. Вследствие этого представления о механизмах аллостерической регуляции глутаматдегидрогеназы йтр, полученные на основании результатов предыдущей главы вряд ли могут быть экстраполированы на гексамер нативной глутаматдегидрогеназы.

В настоящей главе приведены результаты исследований каталитических и регуляторных свойств глутаматдегидрогеназы, при селективной модификации нативного фермента ТМОРО, способным с помощью 4-оксогруппы к образованию восстанавливаемого навн^ основания Шиффа с ¡5 -аминогруппами остатков лизинов.

Проведенные исследования показали, что инкубация глутаматдегидрогеназы с ТМОРО в области рН 8,0 - 9,0 сопровождается обратимой инактивацией фермента. Обработка инкубационной смеси ИаВН^ приводит к образованию производного фермента, обладающего около 30% активности нативного фермента. Изучение инактивации глутаматдегидрогеназы при ее инкубации с ТМОРО в присутствии различных комбинаций специфических лигандов позволило установить, что ТМОРО взаимодействует с группой белка, расположенной в области активного центра и конкурирует с субстратом за участок связывания.

Согласно результатам исследований по идентификации модифицируемого аминокислотного остатка ТМОРО селективно блокирует 6 -аминогруппу остатка Ьув-126.

Изучение кинетической зависимости инактивации глутаматдегидрогеназы при ее модификации ТМОРО показало, что процесс завершается через 15 мин, и при этом уровень активности фермента понижается на 70$ от исходного. Поскольку модификация глутаматдегидрогеназы происходит через стадию образования основания Шиф-

нарушены системы взаимодействий между центрами

В частности, было показано, что инактивация производного

фа (между ¿-аминогруппой остатка Ьув-126 и 4-оксогруппой ТТЛОРО) можно предположить, что конечный уровень инактивации фермента может быть обусловлен равновесием между образованием основания Шиффа и его распадом. С целью выяснения этого вопроса, образец предварительно модифицированной ТМОРО глутаматдегидрогеназы, обладающий 30$ остаточной активностью, подвергали повторной модификации в аналогичных экспериментальных условиях. Согласно полученным данным кинетика инактивации этого образца полностью совпадает с аналогичной зависимостью для нативного фермента. Эти данные показывают, что достигаемый уровень инактивации фермента обусловлен равновесием между образованием и распадом основания Шиффа. Полученный после двух циклов модификации образец фермента обладал 10$ активности нативной глутаматдегидрогеназы. При этом, как показал анализ количества остатка ТМОРО-, включаемого в белок, при первом цикле модифицируется в среднем 2,6 - О субъединиц, в расчете на гексамер фермента (около 43% субъединиц гексамера). При втором же цикле - модификации подвергается дополнительно 0,8 - 1,1 субъединиц (около 25 - 30% от количества субъединиц, не модифшщюванных при первом цикле). Сопоставление этих данных со значениями остаточных активностей произвол ных глутаматдегидрогеназы, полученных после обоих циклов модифи кации, очевидно свидетельствует о кооперативном характере инактивации глутаматдегидрогеназы. Иначе говоря, блокирование ТМОРО 6 -аминогруппы каталитически важного остатка Ьуз-126 произвольной субъединицы глутаматдегидрогеназы, наряду с ее инактивацией приводит к частичной или полной потере активности, по крайней 'мере, одной из соседних немодифицированных субъединиц гексамера

Анализ кинетики инактивации в полулогарифмических координз тах показал, что этот процесс описывается кинетической зависимостью псевдопервого лорвдка. Принимая во внимание эти данные, а также кооперативный характер инактивации, следует заключить, что при модификации произвольной субьединицы, инактивации подвергается олигомерный фрагмент гексамера, представляющий собой, по крайней мере, димер.

Основываясь на этих представлениях, нами был произведен расчет зависимости активности гексамера от среднего числа модифицированных субъединиц, в рамках моделей структурной организа-

ции глутаматдегидрогеназы, описываемых точечной группой симметрии 3 2, с эквивалентной ориентацией субъединиц (рис. 2).

Принимая во внимание специфический характер кооперативных взаимодействий, можно предположить, что при модификации произвольной субъединицы гексамера кооперативная инактивация осуществляется либо в пределах димера с"Р0 участии изологических контактов, либо в пределах тримера оСд при участии гетерологи-ческих контактов.

Допуская, что вероятность модификации субъединиц, входящих в состав инактивированных фрагментов гексамера (ос, и оС3), равна вероятности модификации субъединиц активных фрагментов, следует заключить, что при модификации п субъединиц может быть реализован набор из 1 типов гексамеров, различающихся по каталитической активности -А^. Считая, что вероятность реализации каждого из этих типов гексамеров составляет активность гексаме-ра (Ап), в котором модифицировано и субъединиц, может быть представлена в следующем виде:

Ап - (5)

Учитывая, что при модификации в среднем у субъединиц реализуется статистический набор гексамеров, в которых модифицировано п субъединиц (0<а^6), математическое ожидание активности гексамера, в котором модифицировано в среднем V субъединиц, определяли по соотношению: 6

¿(V) - ¿I V(б)

л.« о

где - распределение гексамеров Сл модифицированными субъ-

единицами, при модификации в гексамере в среднем V субъединиц. Принимая во внимание условие равновероятностности модификации субъединиц гексамеров, будет представлять собой биномиаль-

ное распределение.

На рис. 4 приведены рассчитанные зависимости математического ожидания активности гексамера а(У) от среднего числа модифицированных субъединиц, при условном представлении гексамера в виде структур Зо^ и 2о£д (зависимости 1а и 2а соответственно). Там же приведены экспериментальные значения активности глутамат-

АО>)

Рис. 4. Зависимости активности гексанера (А(у)) от среднего числа (») модифицированных субъединиц.

I и 2 - Расчетные зависимости, при которых инактивируемш

I

г г

» 5

V

б

фрагментом является димер(о6,) и тример(«"3) соответственно, а) ш = I; б) т = 0; в) вь=0,25 о - Экспериментальные значения активности гексамера глу-таматдегидрогеназы в зависимости от среднего числа модифицированных ТМОРО субъединиц.

дегидрогеназы, в зависимости от среднего числа модифицированных ТМОРО субъединиц. Однако приведенные данные не дают оснований для выбора между представлениями о реализации кооперативной га-активации в пределах димеров аГ2 или с^.

В связи с этим необходимо отметить, что приведенные расчетные зависимости получены при произвольном допущении о равно-вероятностности модификации субъединиц гексамера. Однако выше было отмечено, что при первом цикле модифицируется около 435? субъединиц гексамера. При втором же цикле, в аналогичных условиях, дополнительной модификации подвергается не более 30% не-модифицированных при первом цикле субъединиц. Эти данные, скорее всего, свидетельствуют о том, что немодифицированные субъединицы, входящие в состав инактивированных фрагментов сх^ или модифицируются менее эффективно по сравнению с субъединицами, входящими в состав соответствующих активных фрагментов. Иначе говоря, модификация гексамера глутаматдегидрогеназы "ШОРО представляет собой кооперативный процесс. Это обстоятельство может быть учтено при расчете значений активностей Ап ,считая, что вероятности модификации субъединиц в составе активных и инактивированных фрагментов гексамера различаются в о раз, т.е. р' = тр, 0 <т < I, где р и р' - вероятности модификации субъединиц активного и инактивированного фрагментов соответственно. Оче-

видно, что при m = I моделируется рассмотренный выше случай, при котором модификация субъединиц гексамера представляет собой равновероятностный процесс. При значении же и = 0, моделируется случай, при котором происходит полная потеря способности к модификация субъединицами, входящими в состав инактивированных фрагментов. В таком случае, при реализации кооперативных взаимодействий в рамках димеров о^ и-®1 тримеров с^, зависимости А(у) будут представлять собой прямые, пересекающие ось абсцисс при V = 3 или у= 2 соответственно. Очевидно, что при неполной потере способности субъединиц инактивированного фрагмента к модификации (0<m <1), зависимости а(^) будут располагаться между зависимостями при m = I и при m = 0. Сравнение экспериментальных значений А{у) с расчетными зависимостями для модели показывает, что при любых значениях 0<т<1 эти данные не могут быть согласованы. В то же время, аналогичное сравнение для модели Зс*2 показывает, что при определенном значении 0<т<1 расчетная зависимость может быть согласована с экспериментальными значениями а(у). Как видно, удовлетворительная согласованность эксперимента с расчетом достигается.при m = 0,25 (рис. 4). Следует отметить, что данный расчет является приближенным, поскольку математическое ожидание а(у) определяли, аппроксимируя функцию распределения V (У) биномиальным распределением. Подобная аппроксимация при m < I, строго говоря, не является корректной, вследствие нарушения условия равновероятностности модификации субъединиц гексамера. Тем не менее, проведенный анализ показывает, что данные по кооперативной инактивации глутаматдегидрогеназы, наблюдаемые при модификации остатка Lys-126 ТМОРО, могут быть интерпретированы в рамках структурной организации гексамера с эквивалентной ориентацией субъединиц. При этом кооператив-ность реализуется в рамках дилеров oCg, в которых субъединицы взаимодействуют реципронально посредством изологичесних контактов.

На рис. 5 представлены зависимости степени ингибирования gtp (q{>0) глутаматдегидрогеназы от среднего числа (у) модифицированных ТМОРО остатков Lys-126. Видно, что экспериментальные значения Q(y) не согласуются с линейной зависимостью, наблюдаемой при модификации остатков Lys-126 производного Е^р^ (рис.3),

«ч»

а

й

в

г

• I

2

3

4

Рис. 5. Теоретические зависимости степени ингибирования гекса-мера глутаматдегидрогеназы стр (от среднего числа (У) модифицированных остатков Ьув-126 цри к^ОД и для способов десенсибилизации а, б, в и г. (О) - экспериментальные значения ), полученные при концентрации (ир, составляющей 2х1(Г5 М. , ^ и[|) - схематические изображения модифицированной, инак-тивированной по кооперативному механизму и десенсибилизированной к сир субъединиц соответственно.

С целью получения информации о молекулярном механизме де-сесибилизации глутаматдегидрогеназы к действию бтр нами был проведен расчет зависимостей ) для различных моделей десенсибилизации гексамера.

Расчет зависимостей проводили для моделей, в которых наряду с кооперативной инактивацией димерного фрагмента происходит десенсибилизация к действию с5тр: а - одной из субъединиц, входящих в состав тримерного фрагмента оС3, к которому принадлежит модифицированная субъединица, б - двух субъединиц, входящих в состав тримерного фрагмента схГ3,

которому принадлежит модифицированная субъединица, в - двух субъединиц, каждая из которых контактирует с одной из субъединиц инактивированного димера <х>> по одному из направлений ря или др,

г - четырех каталитически активных субъединиц гексамера.

Значения рассчитывали по соотношению I, значения вп и в* рассчитывали, пользуясь соотношениями, аналогичными соотношениям 3 и 4, приведенными в предыдущем разделе. Расчеты проводили при допущении о равновероятностном и взаимонезависимом характере модификации субъединиц.

Как это видно из данных, представленных на рис. 5, лишь теоретические зависимости для моделей десенсибилизации бив удовлетворительно предсказывают экспериментальные значения 0С>>), полученные при модификации нативного фермента ТМОРО. Эти данные показывают, что как кооперативная инактивация, так и десенсибилизация глутаматдегидрогеназы к действию аллостерического эффектора в результате блокирования ¿-аминогруппы остатка Ьув-126, могут быть интерпретированы в рамках структурной организации гексамера с эквивалентной ориентацией субъединиц. При этом десенсибилизация к действию стр осуществляется посредством гетероло-гических межсубъединичных контактов. Результаты расчетов сами по себе не дают оснований для выбора между моделями десенсибилк-заци бив. Однако способ десенсибилизации б осуществляется в рамках тримера, в состав которого входит модифицируемая субъединица, и в силу этого следовало ожидать, что подобный способ десенсибилизации мог бы иметь место и при модификации остатка Ъуз-126 производного Ер_рху Вследствие этого представляется более вероятным способ десенсибилизации в.

Денатурация и инактивация растворимой глутаматдегидрогеназы и ее производных под влиянием мочевины и гуанидиний хлорида.

Постулированная на основании данных по химической модификации структурная организация гексамера глутаматдегидрогеназы допускает принципиальную возможность его диссоциации на конформа-ционно устойчивые димерные или тримерные фрагменты - оС-^ или ос3. Очевидно, что диссоциация гексамера на подобные олигомеры сама по себе может служить веским свидетельством в пользу предложенной структурной организации гексчмера. Вместе с тем, исследование особенностей диссоциации гексамера позволит получить дополнительную информацию о функциональной роли межсубъединич-

них контактов.

В настоящей главе суммированы результаты исследований инактивации, диссоциации и денатурации глутаматдегидрогеназы индуцированных мочевиной или гуанидиний хлоридом.

Пользуясь методами кругового дихроизма и аналитического ультрацентрифугирования, удалось показать, что индуцируемая денатурирующими агентами (мочевиной или гуанвдиний хлоридом) инактивация глутаматдегидрогеназы обусловлена диссоциацией гекса-мера до денатурированных полипептидных цепей. Причем, согласно кинетическим исследованиям гексамер диссоциирует до денатурированных субъединиц в одну стадию, минуя стадии образования кон-формационно устойчивых олигомерных фрагментов. Подобные результаты были получены в широком интервале рН, в котором глутамат-дегидрогеназа сохраняет каталитическую активность (от 5,5 до 9,2). Аналогичные данные были получены также при изучении диссоциации гексамера глутаматдегидрогеназы в присутствии различных специфических лигандов и их комбинаций (коферментов и субстратов). Полученные результаты позволяют' заключить, что для обеспечения конформационной устойчивости глобулярной .структуры субъединиц, формирующих каталитически активный гексамер фермента, необходимо участие как изологических, так и гетерологических межсубъединичных контактов.

Выше было отмечено, что специфические лиганды не способствуют диссоциации гексамера до конформационно устойчивых олигомерных фрагментов. Однако, в ряде случаев коферменты, субстраты и аллостерические эффекторы оказывают влияние на индуцируемые денатурирующими агентами инактивацию и денатурацию фермента. В частности, в присутствии иабн и 2-оксоглутарата концентрация мочевины, при которой происходит полуинактивация фермента, снижается от 3,2 до 1,5 М. Концентрация же мочевины, соответствующая полуденатурации (Сд 5), практически не изменяется, и составляет 3,0 - 3,2 М.

Полученные результаты с очевидностью свидетельствуют о той, что при образовании комплекса фермента с наш и 2-оксоглутара-том, мочевина индуцирует необратимую инактивацию фермента, без изменения вторичной структуры его субъединиц. Одной из наиболее вероятных причин инактивации может быть необратимая локальная

конформациокная изомеризация глутаматдегидрогеназы, затрагивающая каталитический аппарат фермента.

Взаимодействие фермента с аллостерическими эффекторами сопровождается изменением его конформационной устойчивости, в частности, активатор абр способствует повышению устойчивости фермента к денатурации мочевиной (Ср ^ смещается от 3,2 М до 4,2 М мочевины), а ингибитор этр - к понижению (Сд д смещается до 2,4'М мочевины).

Изучение влияния абр и других фосфорных эфиров аденозина на активность и конформационную устойчивость глутаматдегидрогеназы позволило установить, что активация фермента является следствием ее конформационной изомеризации, обусловленной взаимодействием с гетероциклическим основанием эффектора. Роль же рибозо-фоофатного участка, по всей видимости, заключается в обеспечении эффективности связывания абр глутаматдегидрогеназой.

Выше было отмечено, что йтр в противоположность айр , приводит к. понижению конформационной устойчивости гексамера, обусловленной межсубъединичными взаимодействиями. Согласно полученным результатам, дестабилизирующий эффект этр не зависит от присутствия коферме'нта, в частности наш . Это обстоятельство позволяет предположить, что изменение состояния межсубъединичного контакта обусловлено связыванием ОТ? в "ингибирующем" центре. С целью выяснения этого вопроса было изучено влияние этр на конформационную устойчивость фосфоплридоксильных производных глутамат-дегидрогеназы - Е^р^ и Ер_рху. Поскльку, независимо от иавн, параметр полуденатурации обоих фосфопиридоксильных производных глутаматдегидрогеназы смещается на одну и ту же величину (от 2,93,0 до 2,4 - 2,5 М мочевины), следует заключить, что понижение конформационной устойчивости гексамера обусловлено связыванием ОТР в "ингибирующем" центре, и не зависит от связывания эффектора в "набн -индудяруе!ДОм"центре.

Одновременное воздействие аллостерического эффектора на каталитическую активность и конформационное состояние глутаматдегидрогеназы, скорее всего, осуществляется путем его конформационной изомеризации. Данное предположение подтверждается также и тем, что сходное с втр воздействие на активность и конформационную устойчивость глутаматдегидрогеназы оказывает отличающийся по

химической природе от вТР двухвалентный ион меди.

Учитывая то обстоятельство, что тексаиеу стабилизирован межсубъединичными взаимодействиями, можно предположить, что эффектор, связываясь в ингибирующем центре одной из субъединщ, влияет на состояние активного центра соседней субъединицы посредством межсубъединичного контакта. С другой стороны, как это было показано выше, инактивация произвольной субъединицы гекса-мера посредством химической модификации каталитически важного остатка Ьуа-126 приводит к десенсибилизации к действию йтр соседней субъединицы. Эти данные очевидно свидетельствуют о связи между состояниями активных центров двух соседних субъединиц, которая реализуется при участии межсубъединичного контакта и при посредничестве молекул эффектора.

Иммобилизация глутаматдегидрогеназы на нерастворимом носителе. Структурная организация гексамера и роль различных типов межсубъединичных контактов в функционировании фермента.

Один из наиболее информативных подходов, применяемых в последнее время для выяснения структурно-функциональных особенностей олигомерных ферментов, заключается в использовании в качестве моделей растворимых ферментов их иммобилизованных производных. Иммобилизация, как правило, сопровождается повышением конформа-ционной устойчивости олигомера в целом, а также его низкомолекулярных фрагментов - вплоть до субъединиц, которые при диссоциации в растворе проявляют крайне низкую термодинамическую устойчивость и денатурируют до развернутых полипептидных цепей. Опираясь на эти представления, можно полагать, что диссоциация игл-мобилизованных на нерастворимом носителе глутаматдегидрогенас может позволить получить конформационно устойчивые олигомерные фрагменты гексамера.

Очевидно, что для корректной интерпретации данных по диссоциации олигомеров, необходима их мобилизация посредством вовлечения в ковалентную связь с носителем лишь одной из субъединиц. Только в этом случае возможно осуществить диссоциацию тех субъединиц олигомера, которые удерживаются на носителе посредством нековалентных связей.

Один из способов, позволяющих осуществлять подобную иммо-

билизацию олигомерных ферментов, заключается в использовании в качестве агентов, связывающих белок с носителем, соединений, специфически взаимодействующих с ферментом. При иммобилизации глутаматдегидрогеназы, в качестве такого соединения нами был использован пиридоксаль-Р, который пришивали к аминогексильному производному сефарозы 4В посредством фосфамидной связи. Иммобилизацию фермента проводили, благодаря образованию восстанавливаемого навн^ основания Шиффа мевду альдегидной группой остатка пиридоксаль-Р на сефарозе и одной из реакционноспособных аминогрупп белка. Для ограничения числа субъедиииц, ковалентно связывающихся с носителем, иммобилизацию проводили в присутствии различных комбинаций специфических лигандов - субстратов, кофермен-тов и эффекторов. Иммобилизация глутаматдегидрогеназы в присутствии насыщающих концентраций НАШ, 2-оксоглутарата и йТР позволила получить производное Фермента, вовлеченное в ковалентную связь с носителем, посредством одной субъединицы, и практически не отличающееся от нативного по каталитическим и регуляторным свойствам.

Изучение процессов диссоциации и инактивации данного производного фермента под влиянием гуанидиний хлорида и мочевины показало, что иммобилизация глутаматдегидрогеназы на пиридоксаль-Р-сефарозе не способствует получению конформационно устойчивых олигомерных фрагментов гексамера. Это обстоятельство, скорее всего, обусловлено большим числом степеней свободы иммобилизованного белка, что связано с химической структурой подложки (пиридоксаль-Р, связанный фосфамидной связью с аминогруппой гексамети-лендиамина).

С целью ограничения степеней свободы иммобилизованного белка и обеспечения более эффективного взаимодействия с матрицей носителя, нами была предпринята попытка иммобилизации глутаматдегидрогеназы на Вгсн-активированной сефарозе. При подобной иммобилизации ограничение количества субъединиц, ковалентно связывающихся с носителем, достигается путем понижения степени активации сефарозы Вгся.

Проведенные исследования позволили установить, что при активации сефарозы малым количеством Вгси (до 5 мг на I мл геля), глутаматдегидрогеназа иммобилизуется на носителе посредством

ковалентной фиксации лишь одной из субъединиц. С целью повышения точности определения содержания белка, связанного с носителем, для иммобилизации использовали радиоактивную форму производного глутаматдегидрогеназы Ер_рху.

Как показали проведенные исследования, производное Ер_р, иммобилизованное на носителе посредством ковалентного связывания одной из субъединиц, по каталитическим и регуляторным свойствам имитирует нативный фермент, и может служить удобной моделью для выяснения структурно-функциональных особенностей гекса-

мера глутаматдегидрогеназы.

100г

Рис. 6. Зависимости активности иммобилизованного производного глутаматдегидрогеназы (а) и содержания иммобилизованного белка (б), в расчете на 1мл осевшего геля сефарозы, от концентрации мочевины. Инкубацию проводили при 25°С в течение 30 мин при рН: (I) - 5,6; (2) - 7,0; (3) - 7,8; (4) - 8,9.

1 2 3 4 5 6 [Мочевина], М

Исследование индуцируемых мочевиной процессов инактивации и диссоциации иммобилизованных на Бгск-активированной сефарозе глутаматдегидрогеназ (рис. 6) показало, что в области нейтральных рН гексамер диссоциирует на субъединицы в одну стадию. Однако при слабощелочном рН среды, составляющем 8,9, диссоциация ге-ксамера до субъединиц происходит через стадию образования кон-формационно устойчивого иммобилизованного димера. Иная картина наблюдается при инкубации иммобилизованного фермента в средах, содержащих мочевину, при слабокислом рН 5,6. В этих условиях диссоциация до субъединиц происходит через стадию образования иммобилизованного тримера.

Сопоставление данных, представленных на рис. 6 а и б, свидетельствуют о том, что образующиеся в данных экспериментальных условиях иммобилизованные фрагменты гексамера не обладают каталитической активностью. Анализ кинетических зависимостей инактивации и диссоциации иммобилизованного гексамера позволил установить, что в области нейтральных и слабощелочных рН индуцируемая мочевиной инактивация фермента является следствием диссоциации гексамера до субъединиц или димеров соответственно. Вместе с тем, как это следует из кинетических зависимостей инактивации и диссоциации при рН 5,6 (рис. 7 а), после диссоциации гексамера до иммобилизованного тримера, последний проявляет каталитическую активность, которая исчезает лишь при дальнейшей инкубации фермента в среде, содержащей мочевину. Из кинетических зависимостей, представленных на рис. 7 б в полулогарифмических координатах, следует, что -процесс диссоциации характеризуется линейной зависимостью и подчиняется кинетике псевдопервого порядка. Вместе с тем, кинетическая зависимость инактивации, в тех же координатах, аппроксимируется, по крайней мере, двумя линейными участками. Сопоставление кинетических зависимостей инактивации и диссоциации позволяэт заключить, что первая (быстрая) стадия инактивации обусловлена как диссоциацией гексамера до иммобилизованного тримера, так и конформационной изомеризацией последнего до каталитически неактивного состояния. Вторая же (медленная) стадия инактивации обусловлена лишь конформационной изомеризацией образовавшегося иммобилизованного тримера. Экстраполяция второй (медленной)" стадии инактивации фермента до-пересечения с осью ординат показала, что каталитическая активность тримера в начальный момент диссоциации составляет не менее 60% от активности гексамера.

Таким образом, в зависимости от рН, иммобилизованный на ВгСИ-активированной сефарозе гексамер глутаматдегидрогеназы способен диссоциировать либо до иммобилизованных субъединиц, либо до конформационно устойчивых иммобилизованных димеров или триме-ров. Аналогичные результаты были получены при изучении индуцируемой мочевиной диссоциации и инактивации иммобилизованной глутаматдегидрогеназы в присутствии коферментов и субстратов.

Рис. 7. а) Кинетика инактивации (I и 2) и диссоциации (3 и 4) иммобилизованного производного глутаматдегидрогеназы -Ер_рХу, при его инкубации в средах, содержащих 3,0 М (I и 3) и 2,5 М (2 и 4) мочевину при рН 5,6.

б) Те же зависимости в полулогарифмических координатах.

10 20 30 40 60 мин

Из данных, приведенных на рис. 8 следует, что в присутствии ильн гексамер, в зависимости от концентрации мочевины, способен диссоциировать до конформационно устойчивого иммобилизованного димера. В то же время,, при одновременном присутствии в инкубационной среде насыщающих концентраций наш и 2-оксоглутарата гексамер способен диссоциировать до конформационно устойчивого иммобилизованного тримера.

Как показал анализ кинетики инактивации и диссоциации иммобилизованного гексамера в присутствии иа1ш, инактивация фермента обусловлена его диссоциацией до не прояляющего каталитической активности иммобилизованного димера.

Рис. 8. Зависимости активности (а) иммобилизованного гексамера глута-матдегвдрогеназы и содержания белка (б) в расчете на I мл осевшего геля от концентрации мочевины после инкубации в средах, содержащих различные концентрации лигандов: I) без лигандов; 2) 5хЮ~2 М 2-ок-соглутарата; 3) 5х1(Г5 М наш; 4) 2Х10"4 М иаш; 5) IО"3 М маш ; 6) 2ХЮ-4 м иабн и 5хЮ~4 м 2-ок-соглутарата; 7) 2хЮ~4 М наш и бхГО-4 М 2-оксоглутарата; 8) 2ХЮ"4 М набн и 5x10 м 2-оксоглутарата.

Инкубацию проводили в 0,1 М калий-фосфатном буфере, рН 7,2 при 25°С в течение 30 мин.

Вместе с тем, как это видно из кинетических зависимостей, представленных на рис. 9 а, при относительно высокой концентрации мочевины в инкубационной среде (3 М) иммобилизованная глу-таматдегидрогеназа через 30 мин практически полностью теряет каталитическую активность, хотя и диссоциирует до тримера. в то же время, при 2 М концентрации мочевины гексамер диссоциирует до иммобилизованных тримеров, обладающих не менее 60$ активности гексамера. Анализ кинетических зависимостей инактивации и диссоциации глутаматдегидрогеназы в этих условиях (рис. 9 б) показал, что оба процесса подчиняются кинетике псевдопервого порядка и характеризуются близкими значениями констант скоростей. Эти данные позволили заключить, что наблюдаемое понижение ферментативной активности обусловлено диссоциацией гексамера до тримера. Вместе с тем, при концентрации мочевины в инкубационной среде, составляющей 3 М, процесс инактивации фермента, в отличие от диссоциации, аппроксимируется двумя линейными участками. Первая, быстрая стадия этого процесса, очевидно, обусловлена диссоциацией гексамера до тримера. На второй же, более мед-

[Мочевина], М

100

Ряс. 9. а) Кинетика инактивации (I и 2) и диссоциации (3 и 4) иммобилизованного производного глутаматдегидрогеназы - Ер_рху.

в присутствии гхГС^М наин И 5х10-3М 2-ок-соглутарата под влиянием 2 М (I и 3) и 3 М (2 и 4) мочевины. рН 7,2; 25°С. б) Те же зависимости в полулогарифмических координатах.

ленной стадии, инактивация фермента происходит без изменения степени олигомерности тримера. Вследствие этого можно полагать, что в присутствии 3 М мочевины гексамер диссоциирует до тримера, проявляющего каталитическую активность. Однако в дальнейшем, под влиянием присутствующей в среде мочевины, происходит его изомеризация до каталитически неактивного конформера. Экстраполяция линейного участка второй, медленной стадии инактивации фермента, в присутствии 3 М мочевины, до пересечения с осью ординат показывает, что каталитическая активность иммобилизованного тримера в начальный момент диссоциации составляет около 60% от активности гексамера.

На рис. 10 суммированы представления о диссоциации иммобилизованного гексамера глутаматдегидрогеназы в различных экспо-

Рис. 10. Возможные пути диссоциации иммобилизованного гексамера глутаматдегидрогеназы под влиянием мочевины, в присутствии специфических лигандов при нейтральных рН и в отсутствие лигандов при вариации рН. В квадратных скобках приведены интервалы концентраций мочевины,' в которых происходит соответствующий переход. Штриховкой отмечены субъединицы, не обладающие каталитической активностью.

риментальных условиях. При нейтральных рН и в отсутствие лигандов гетералог/ческие (рд) и изологические (аа) межсубъединичные контакты обладают близкой устойчивостью к диссоциации мочевиной. Вследствие этого, гексамер в этих условиях диссоциирует до мономеров в одну стадию. "Однако в присутствии мш йлй при повышении рН инкубационной среды до слабощелочных значений, происходит понижение устойчивости гетерологических контактов рч по отношению к устойчивости изологических контактов аа. Вследствие этого, в данных условиях иммобилизованный гексамер диссоциирует до мономеров через стадию образования иммобилизованного димера, в котором субъединицы взаимодействуют посредством изологических контактов. В присутствии ИАМ и 2-оксоглутарата иммобилизованный гексамер глутаматдегидрогеназы диссоциирует до мономера через стадию образования каталитически активного тримера. Последующая же диссоциация до мономера, в свою очередь, происходит через стадию изомеризации этого тримера до каталитически неактивного

конформера. Сходная картина наблюдается при слабокислых pH инкубационной среды, в отсутствие специфических лигавдов. Принимая во внимание эквивалентность ориентации субьединиц в гекса-мере, следует заключить, что в данных условиях происходит относительное понижение устойчивости изологических межсубъединичных контактов аа.

Согласно приведенным данным 2-оксоглутарат кардинально меняет конформационное состояние гексамера глутаматдегидрогеназы, индуцированное восстановленной формой кофермента - nadh. В этой связи следует отметить, что замена 2-оксоглутарата на его бикар-боксильный аналог - глутарат, не приводит к какому-либо изменению процессов инактивации и диссоциации иммобилизованного гексамера глутаматдегидрогеназы в присутствии nadh. Этот факт, очевидно, указывает на участие 2-оксогруппы субстрата во взаимодействии с ферментом и в реализации конформационного перехода гексамера глутаматдегидрогеназы. Интересно отметить, что замена 2-оксоглутарата на глутамат также не приводит к изменению характера конформационного перехода гексамера, индуцируемого nadh. Иммобилизованный гексамер в присутствии nadh и глутамата, так же как и при отсутствии последнего, диссоциирует до не обладающего каталитической активностью димера. Однако при этом возрастает эффективность индуцируемой мочевиной диссоциации гексамера. Так, при концентрации мочевины, равной 4 М, константа скорости диссоциации первого порядка, составляющая 0,11 мин""*, смещается до 0,24 мин"''' в присутствии глутамата. Эти данные показывают, что аминогруппа глутамата, взаимодействуя с ферментом, приводит к относительному понижению устойчивости гетерологических меж-субъединичных контактов.

Проведенные нами исследования влияния монокарбоксильных субстратов (пирувата, аланина, норвалина и др.) показали, что последние не оказывают заметного воздействия на процессы диссоциации и инактивации гексамера глутаматдегидрогеназы в присутствии nadh .

Таким образом, лишь одновременное участие во взаимодействии с белком обеих карбоксильных групп и 2-оксогруппы субстрата приводит к индуцированию уникального конформационного состояния иммобилизованного гексамера, способного диссоциировать до

каталитически активного шлмобилизованного тримера.

В этой связи следует отметить, что при обработке растворимой глутаматдегидрогеназы edc* в присутствии nadh и 2-оксоглута-рата, образуется внутримолекулярная "сшивка", приводящая к фиксации конформации, которую фермент приобретает при образовании комплекса с этими лигацдами. При замене 2-оксоглутарата на глу-тамат, либо моно- и бикарбоксильные аналоги субстратов, образования подобной внутримолекулярной "сшивки" не происходит.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Согласно результатам настоящего исследования, ассоциация идентичных по химической структуре субъединиц глутаматдегидрогеназы в гексамеры, обладающие молекулярной симметрией 3 2с эквивалентной упаковкой субъединиц, наряду с обеспечением их конфор-мационной устойчивости, приводит к образованию единой системы с взаимодействующими активными и регуляторными центрами. При этом взаимодействия, реализуемые посредством изологических межсубъе-диничных контактов, обусловливают отрицательную кооперативность глутаматдегидрогеназы. В то же время, взаимодействия, реализуемые посредством гетерологических контактов, обусловливают регуляцию фермента аллостеричесними эффекторами. Очевидно, что полученные результаты отражают лишь часть функциональных связей между субъединицами гексамера. Вместе с тем, они показывают, что сборка олигомеров посредством, различных типов меж субъединичных контактов дает возможность реализации различных способов регуляции каталитической активности фермента. Очевидно, что это обстоятельство может иметь принципиальное значение для ферментов, осуществляющих контроль и управление метаболическими превращениями, в особенности для ферментов, осуществляющих подобные функции в узловых точках различных метаболических процессов.

Развитые в настоящей работе представления о структурно-функциональных особенностях гексамера позволяют предположить, что глутаматдегидрогеназа функционирует по механизму "flip-flop", согласно которому в каждый данный промежуток времени в каталитическом акте принимает участие лишь половина активных центров и

х - 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид.

при этом имеет место их поочередное функционирование. Не анализируя физико-химическую природу "полуцентровой реакционной способности" глутаматдегидрогеназы и связанного с ней механизма "flip-flop", следует отметить, что в рамках структуры с эквивалентной ориентацией субъединиц эти эффекты могут быть обусловлены лишь индуцированной при связывании лигавдов асимметрией конформационного, ионного или какого-либо иного физико-химического состояния субъединиц, взаимодействующих посредством изоло-гтеского контакта.

Способность глутаматдегидрогеназы к взаимодействию с мито-хондриальной мембраной и с различными ферментами матрикса, а также представления о ее метаболической функции, позволяют предполагать о включении этого фермента в состав метаболонов - динамических полиферментных систем, адсорбированных на клеточных мембранах и осуществляющих катализ последовательных стадий определенного метаболического пути (Srere, 1987).

Очевидно, что в составе подобных .систем, наряду с гексамер-ной формой, глутаматдегидрогеназа может функционировать также в виде тримера, поскольку межмолекулярные взаимодействия могут участвовать в обеспечении ее конформационной устойчивости. При этом, в зависимости от степени олигомерности фермента, из-за различий молекулярной симметрии и контактных участков, посредством которых реализуются межмолекулярные взаимодействия, глутаматдегидрогеназа может участвовать в формировании различных по составу, структуре и функции метаболонов. Включение в состав метаболонов гексамерной или тримерной форм фермента, в силу различий их кооперативных свойств, может иметь принципиальное значение для регуляции системы в целом, и в частности, для согласования функционирования ферментов, осуществляющих катализ последовательных метаболических превращений в данном микро-компартменте. В этой связи следует отметить, что, хотя в настоящее время нет прямых доказательств включения глутаматдегидрогеназы в состав метаболонов, по ряду физико-химических и функциональных характеристик этот фермент удовлетворяет требованиям, предъявляемым к ферментам, играющим ключевую роль в формировании и регуляции метаболонов (Курганов и др., 1987).

ВЫВОДЫ

1. Исследованы основные принципы формирования, структурной организации, кооперативного и аллостерического функционирования каталитически активных олигомеров глутаматдегидрогеназы. Показано, что ассоциация идентичных по химической структуре субъединиц фермента в гексамеры приводит к образованию единой системы

с взаимодействующими активными и регуляторными центрами, в которой эквивалентно ориентированные субъединицы одновременно входят в состав двух простейших олигомерных структурных элементов -димеров с субьединицами, взаимодействующими посредством изологических контактов, и планарных тримеров с субъединицами, взаимодействующими посредством идентичных гетерологических контактов. Гексамер же в целом представляет собой минимальную по степени олигомерности структуру, в которой одновременно могут быть реализованы указанные различные типы взаимодействий, и как следствие, -различные способы управления каталитической активностью фермента.

2. На основании комплексного анализа результатов исследований физико-химических, каталитических и регуляторных свойств различных растворимых и иммобилизованных производных глутаматдегидрогеназы установлено, что субъединицы, составляющие каталитически активный гексамер глутаматдегидрогеназы, занимают эквивалентные позиции и упакованы в структуру, описываемую точечной группой симметрии 3 2с учетом внутренней асимметрии субъединиц.

В рамках предложенной структурной организации гексамер может быть представлен как в вид-з системы, состоящей из трех идентичных димеров (ЗоГ2), в которых эквивалентные субъединицы взаимодействуют реципрокально посредством изологических, контактов, так и в виде системы, состоящей из двух идентичных планарных гримеров (2о£д), в которых эквивалентные субъединицы взаимодействуют последовательно посредством идентичных гетерологических ¿юнтактов.

3. Все типы межсубъединичных контактов являются необходимыми для обеспечения конформационной устойчивости каталитически активного гексамера глутаматдегидрогеназы.

4. Как изологические, так и гетерологические межсубъединич-;ше контакты принимают участие в формировании гексамера, в каче-

стве системы о взаимодействующими активными и аллостерическими регуляторными центрами.

Изологические межсубъединичные контакты обеспечивают реци-прокальные взаимодействия между активными центрами, обусловливающие отрицательные кооперативные свойства фермента.

Гетерологические межсубъединичные контакты обеспечивают взаимодействия между активными и регуляторными центрами, обусловливающие кооперативный характер действия аллостерического эффектора «ср.

5. Разработаны различные теоретические модели кооперативной инактивации гексамера и его десенсибилизации к действию аллостерического эффектора. На основании анализа экспериментальных результатов, в рамках разработанных моделей установлено, что блокирование £ -аминогруппы остатка Ьуь-126 произвольной субъединицы фермента сопровождается, с одной стороны," кооперативной инактивацией димерного фрагмента гексамера о£,, субъединицы которого взаимодействуют посредством изологических контактов, и, с другой, - десенсибилизацией к действию етр двух каталитически активных субъединиц гексамера, каждая из которых взаимодействует с одной из инактивированных субъединиц фрагмента посредством гетерологического контакта.

6. Ассоциация субъединиц глутаматдегидрогеназы в гексаме-ры не является необходимым условием сборки активных центров фермента. Для их формирования достаточно ассоциации субъединиц в планарные тримерные структуры, в которых они взаимодействуют посредством идентичных гетерологических контактов.

Показано, что иммобилизованный на сефарозе конформационно 'устойчивый тример глутаматдегидрогеназы проявляет не менее 60$ каталитической активности гексамера.

7. Аллостерическая регуляция глутаматдегидрогеназы йТР реализуется на уровне планарных тримерных фрагментов О^ и не зависит как от их ассоциации в гексамеры, так и от агрегатного состояния самих гексамеров.

8. Необходимым и достаточным условием реализации ингибитор-ного эффекта &ГР является его взаимодействие с так называемым "ингибирующим" участком связывания эффектора, локализованным на каждой из субъединиц гексамера, и не зависящим от взаимодействия

фермента с другими специфическими лигаццами.

Роль связывания gtp в другом, так называемом 'nadh-зависимом" участке, который индуцируется на каждой субъединице фермента при его взаимодействии с коферментом, заключается в обеспечении лучшего сродства эффектора к "ингибирующему" участку, и в обеспечении положительной кооперативное™ связывания кофермента в пределах тримерного фрагмента Ы3.

9. В организме, при условии обеспечения конформационной устойчивости, глутаматдегидрогеназа, наряду с гексамерной формой, может быть представлена также в виде тримера.

10. Представления о молекулярной симметрии глутаматдегидрогеназы и о роли изологических межсубъединичных контактов в реализации кооперативных свойств фермента, указывают на возможность его функционирования по механизму "flip-flop". Причем, этот кооперативный механизм может быть реализован как автономно в рамках димерных фрагментов о^, так и в рамках гексамера в целом, при его представлении в виде димера тримеров - 2 схГд.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Карабашян Л.В., Мовсесян С.Г. О связи между структурой активного центра и конформационной устойчивостью глутаматдегидрогеназы. Тезисы Ш Всесоюзного симпозиума "Структура и функция активных центров ферментов", стр.32-33, Москва, I97G.

2. Карабашян Л.В., Экизян Н.Г., Мовсесян С.Г. Применение пири-доксаля и пиридоксальфосфата для изучения активного центра глутаматдегидрогеназы. Биолог.ж.Армении, XXXI, №2, II3-I20.

3. Карабашян Л.В., Экизян Н.Г., Мовсесян С.Г. Влияние мочевины на конформацию и каталитическую активность глутаматдегидрогеназы. Биолог.ж.Армении, XXXI, №6, 572-579, 1978.

4. Карабашян Л.В., Экизян Н.Г., Сафарян В.М., Мовсесян С.Г. Конформационная стабильность глутаматдегидрогеназы и ее комплексов со специфическими лигандами. Мол.биология, 14, №4, 773-778, 1980.

5. Карабашян Л.В., Агаджанян С.А., Сафарян В.М., Мовсесян С.Г. Очистка глутаматдегидрогеназы из мозга быка и ее некоторые физико-химические свойства. Биохимия, 45, №2, 258-264, 1980.

6. Каэарян P.A., Погосян A.A., Мартиросян К.А., Карабашян Л.В. Конформационная стабильность глутаматдегидрогеназы из мозга и печени. Биолог.ж.Армении, ХХХУ, №4, 271-276, 1982.

7. Агаджанян С.А., Погосян A.A., Карабашян Л.В. Модификация глу-таматдегидрогеназы печени быка 2,2,6,6-тетраметил-4-оксопипери-дин—I—оксилом. Влияние на активность и каталитические свойства. Мол.биология, 16, №2, 345-351, 1982.

8. Агаджанян С.А., Карабашян Л.В. Влияние двухвалентного иона меди на каталитические свойства глутаматдегидрогеназы печени быка. Биохимия, 47, №6, 1022-1026, 1982.

9. Агаджанян С.А., Карабашян Л.В., Арутюнян A.A. Идентификация аминокислотного остатка глутаматдегидрогеназы, модифицируемого спиновой меткой - 2,2,6,6-тетраметил-4-оксотшеридин-1-оксилом. Материалы науч.конф. "Вопросы молекулярно-клеточной биологии", стр.43, Ереван, 1983.

10. Аветисян С.Г., Каэарян P.A., Карабашян Л.В. Молекулярная гетерогенность глутаматдегидрогеназы печени кролика. Материалы науч.конф. "Вопросы молекулярно-клеточной биологии", стр.44, Ереван, 1983.

11. Казарян P.A., Карабашян Л.В., Аветисян С.Г. Аффинная хроматография глутаматдегидрогеназы на сефарозе 4В, модифицированной аденозиндифосфатом. Тезисы У1 Закавказской конф. по адсорбции

и хроматографии, стр.88, Ереван, 1984.

12. .Агаджанян С.А., Карабашян Л.В., Арутюнян A.A. Изучение распределения активности между протомерами каталитически активного гексамера глутаматдегидрогеназы. Тезисы ХУ1 конф.ФЕБО, стр.139, Москва, 1984.

13. Агаджанян С.А., Арутюнян A.A., Карабашн Л.В. Идентификация аминокислотного остатка глутаматдегидрогеназы, модифицируемого 2,2,6,6-тетраметил-4-оксопиперидин-1-оксилом. Изучение характера инактивации каталитически активного олигомера фермента при модификации. Виоорган.химия, 10, №9, II7I-II76, 1984.

14. Казарян P.A., Аветисян С.Г., Погосян A.A., Карабашян Л.В. Очистка глутаматдегидрогеназы печени кролика и изучение основных физико-химических свойств. Биохимия, 50, №8, 1255-1259, 1985.

15. Карабашян Л.В., Агаджанян С.А., Арутюнян A.A., Погосян A.A. Роль структурной организации гексамера глутаматдегидрогеназы в

его функционировании и аллостерической регуляции. Тезисн респ. конф. "Макромолекулы и функционирование клетки", стр.23, Ереван, 1986.

16. Казарян Р.А., Аветисян С.Г., Агаджанян С.А., Карабашян Л.В. Специфическая иммобилизация глутаматдегидрогеназы на сефарозе 4В. Изучение диссоциации гексамера под влиянием гуанидиний хлорида. Тезисы респ.конф. "Макромолекулы и функционирование клетки", стр.21, Ереван, 1986.

17. Агаджанян С.А., Погосян А.А., Карабашян Л.В. Модификация глутаматдегидрогеназы пиридоксаль-5-фосфатом. Влиявде на полимеризацию и ингибирование NADH. Мол.биология, 20, №3, ''37-744, 1986.

18. Агаджанян С.А,, Карабашян Л.В., Модификация глутаматдегидрогеназы пиридоксаль-5^-фосфатом. Изучение структурной организации гексамера и его возможной роли в реализации действия GTP. Мол. биология, 20, №4, 1070-1079, 1986.

19. Агаджанян С.А., Карабашян Л.В. Модификация глутаматдегидрогеназы лиридоксаль-5^осфатом. Изучение кооперативного характера ингибирования gtp. Мол.биология, 20, №4,■1062-1069, 1986.

20. Аветисян С.Г.., Агаджанян С.А., Казарян Р.А., Карабашян Л.В. Иммобилизация глутаматдегидрогеназы на сефарозе 4В, модифицированной пиридоксаль-5^-фосфатом. Изучение диссоциации гексамера под действием гуанидингидрохлорвда. Биоорган.химия, 12, №3, 332339, 1986.

21. Karabashian L.V., Aghadjanian S.A. The role of the structural organization of glutamate dehydrogenase hexamer in the action of allosteric inhibitor GTP. Abstr.of 9-th Joint Symposium of the Biochemical Societies of the GDR and USSR (Metabolic Regulation at the Cellular and Molecular Level), p.69, 1987.

22. Карабашян Л.В., Агаджанян С.А., Казарян P.А.. Структурная организация и аллостерическая регуляция гексамера глутаматдегидрогеназы. Сб.науч.тр. "Химия физиологически активных веществ",, стр.19-20, Нальчик, 1988.

23. Карабашян Л.В., Агаджанян С.А., Даноян К.В., Казарян Р.А. Структурная организация гексамера глутаматдегидрогеназы.

I. Иммобилизация на сефарозе, с целью получения модели для изучения структурно-функциональных особенностей фермента. Биоорган.

химия, 14, MI, I495-I50I, 1988.

24. Карабашян Л.В., Агадаанян С.А., Даноян К.В., Казарян P.A. Структурная организация гексамера глутаматдегидрогеназы.

2. Изучение инактивации и диссоциации иммобилизованного гекса мера под влиянием мочевины. Биоорган.химия, 14, №11, 1502-150 1988.

25. Карабашян JI.B., Агадаанян С.А., Кооперативная инактивация глутаматдегидрогеназы 2,2,6,6-тетраметил-4-оксопиперидин-1-ок силом. Интерпретация результатов в рамках модели гексамера с эквивалентной ориентацией субъединиц. Мол.биология, 22, №6, 1539-1544, 1988.

26. Даноян К.В., Агадаанян С.А., Аветисян С.Г., Карабашян Л.Е Модификация глутаматдегидрогеназы печени быка 1-этил-3-(3-дт тиламинопропил)карбодиимидом. Доклады АН АрмССР, 87, №2, 85-S 1988.

27. Карабашян Л.В., Агадаанян С.А., Даноян К.В., Казарян P.A. Структурная организация гексамера глутаматдегидрогеназы.

3. Влияние кофермента и субстрата на индуцируемые мочевиной диссоциацию и инактивацию гексамера. Биоорган, химия, 15, М 32-39, 1989.