Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ КОНСТИТУТИВНОЙ И ИНДУЦИРУЕМОЙ ГЛУТАМАТДЕГИДРОГЕНАЗ ХЛОРЕЛЛЫ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ КОНСТИТУТИВНОЙ И ИНДУЦИРУЕМОЙ ГЛУТАМАТДЕГИДРОГЕНАЗ ХЛОРЕЛЛЫ"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А. Н. БАХА

На правах рукописи

КАСПАРОВА Мария Арестакесовна

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ КОНСТИТУТИВНОЙ И ИНДУЦИРУЕМОП ГЛУТАМАТДЕГИДРОГЕНАЗ ХЛОРЕЛЛЫ

(Биологическая химия — 03.00.04)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

■ Москва, 1977

Работа выполнена в лаборатории энзимологии Ордена Ленина Института биохимии имени А. Н. Баха АН СССР, i

Научные руководители:

член-карреспондент АН СССР, профессор В. Л. Кретович, кандидат биологических наук В, Р. Шатилов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Н, Б. Ливанова, доктор биологических наук О. Л. Поляновский.

Ведущее л¡>едприятие: Ордена Трудового Красного Знамени Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева АН СССР.

Защита диссертации состоится * & * ^^G.éCGf&P* — 1977 г. на заседании специализированного совета Ордена Ленина Института биохимии им. А. Н. Бака АН СССР (Москва, Ленинский проспект, 33).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института. Автореферат .разослан « > 1977 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

(Н. Н. Д..-:. •Л

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

- В живых организмах поражает согласованность в проте-: кании огромного количества взаимозависимых процессов. Согласованность и упорядоченность достигается как за счет;' компартментации, так и в результате регуляторных механиз--мов, действующих в клетке на различных уровнях." Наиболее!' быстрым является механизм регуляции, активности фермен-., тов. Обычно регуляции подвергаются ключевые . ферменты; т. е. такие, которые катализируют узловые реакции мета б о _ лическнх путей. В случае ферментов, кинетика которых подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен, регуляция активности, скорости и направленности катализируемой, ими реакции происходит по закону действующих масс. У'аллостери-ческнх ферментов, таких как глутаматдегидрогеназа; (ГДГ)У наряду с законом действующих масс, главную роль; играет аллостерический механизм регуляции.

Огромен интерес к изучению ключевых ферментов. Для многих таких ферментов при их изучении in vitro накоплено много экспериментальных данных, но вопрос о функциониро-, вании их в клетке в большинстве случаев остается неясным. Например, ГДГ из печени быка, полученная в, кристаллическом состоянии еще в 1951 г., изучается в нескольких крупных • лабораториях мира, но вопрос о ее функционировании в митохондриях печени остается далеко не ясным,, также как и вопрос о значении многих интересных явлений, обнаруженных in vitro.

Особый интерес представляют те случаи, когда в клетке, присутствуют несколько молекулярных форм одного и того же фермента (изоферментов), катализирующих одну и туже реакцию. Одним из таких случаев является .присутствие в клетке хлореллы трех глутаматдегидрогеназ. Один фермент-конститутивный, другой синтезируется de novo под влиянием NH4+, а третий синтезируется также de novo под влиянием NH4+ н глюкозы. Первый фермент работает как с НАД, так и с НАДФ, а два последних — специфичны только к НАДФ.

Актуальность проблемы. Вопрос о различии этих форм

ТТ" . * ' • • .Гг.гяк* j 1

ГДГ, о свойствах, структуре и функционировании их в клетке представляет большой интерес. Глутаматдегидрогеназа хлореллы является основным ферментом, катализирующим превращение неорганического азота КНз в органический (глу-тамат).

Свойства ГДГ хлореллы изучаются с 1965 г. в лаборатории энзимолопш института биохимии им. А. Н. Баха. При этом конститутивная НАД (Ф) ГДГ и индуцируемая под влиянием NH«+ НАДФ-ГДГ были разделены и частично очищены (Шатилов, 1972 6), были изучены некоторые их физико-химические свойства: определена молекулярная масса (300000), рН-оптимум аминирования и дезаминирования, чувствительность к п-ХМБ, а также подробно изучено поведение обоих ферментов в реакции аминирования.. '

Цель и задачи исследования. Нашей целью было дальнейшее изучение свойств обеих ГДГ, их сравнительная характеристика и особенности функционирования в клетке.

. В связи с этим в задачи работы входило:

1. Получение гомогенных препаратов НАД(Ф)-ГДГ и НАДФ-ГДГ (или препаратов близких к гомогенному состоянию).

2. Определение их субъединичной природы и молекулярного веса субъединиц.

3. Дальнейшее'изучение свойств обоих ферментов и особенностей функционирования ГДГ ín vivo.

4. Выявление механизма преимущественного накопления аланина при ассимиляции аммония.

Научная новизна. В представленной работе получены экс перимеитальные данные, которые позволили сделать важные теоретические выводы о природе индуцируемых ферментов и о путях ассимиляции хлореллой неорганического азота. Полученные результаты являются приоритетными в изучении ферментов глутаматдегидрогеназ.:

Практическая ценность. Одноклеточная зеленая водоросль хлорелла — широко используется в народном хозяйстве как добавка к кормовым рационам; кроме того, она рассматривается как перспективный регенератор в замкнутых системах (космических кораблях).

Таким образом, изучение-глутаматдегидрогеназ хлореллы — вопрос не только теоретический; но и . практический, позволяющий всесторонне познать возможности этого организма.

Апробация работы. Работа была доложена на совместном коллоквиуме лаборатории энзимологии Института биохимии им. А, Н, Баха АН СССР и кафедры биохимии и зер-новедения МТИППа. В конкурсе на лучшую научную работу

Института биохимии им. Л. Н. Баха АН СССР в 1974 г. работе присуждена третья премия.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Объём работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, включающих литературный обзор, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также выводов'и списка литературы (159 наименований).

Работа изложена на 98 страницах текста, иллюстрирована 32 рисунками и 21 таблицей.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалом для исследований служили клетки термофильного штамма одноклеточной зеленой водоросли Chlorella pyrenoidosa Prmgsheim 82Т, выращенные в фотоавтотроф• ных условиях на среде Тамийя. Накопление биомассы осуществляли путем культивирования в камерах из органического стекла объемом 2 л, при освещенности 8—10 тыс. люксов и температуре 30—32е. Аэрация осуществлялась путем продувания через * культуру воздуха, содержащего 1% СО». Культивирование в камерах продолжалось 2—3 суток до плотности 350 млн. клеток в 1 мл. Клетки собирали центрифугированием на центрифуге С-44 и переносили на среду Тамийя, содержащую в качестве источника азота (NH4hHPOi в концентрации 4,92 мМ (138 мг N/мл) для индукции НАДФ-ГДГ, После 6-ти часовой инкубации клетки собирали центрифугированием и промывали водой, а полученную пас. ту с,влажностью до 80% использовали для выделения ферментов согласно разработанной схеме {рис. 1). В результате очистки препарат конститутивной ГДГ был получен близким к гомогенному (98%) (рис. 2). Для НАДФ-ГДГ избавиться от примесей не удалось. ' '

Очищенные препараты хранили без добавок при +4° и использовали для исследований.

Активность ГДГ определяли спектрофотометр!!чески по скорости изменения поглощения при.340 нм в результате окисления или восстановления НАД или НАДФ. За единицу активности принимали количество фермента, необходимое для окисления или восстановления одного мкмоля НАД(Ф). Удельные активности рассчитывались как число единиц за 1 мин; на 1 мг белка.

Белок определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951). При элюнровании выход белка регистрировали по поглощению при 280 им, условно считая, что в пределах от 0 до 2,0 эта величина равна количеству белка в мг/мл (Кочетов, 1971).

Биомасса

разрушение в 0,07 М фосфатном буфере с 0-меркаптоэтанолом (5 мМ), центрифугирование при 18000 х е. 25 мин.

Надосадочная .жидкость

замораживание (10 часов), оттаивание при 30°, ультрацентрифугирование при 110000 х 1 час.

Надосадочная жидкость

осаждение нуклеиновых кислот стрептомицинсульфатом (1%), центрифугирование при 18000 х д, 10 мин.

■ Iі

Надосадочная жидкость

фракционирование сульфатом аммония 35—55% от полного насыщения

Осадок

растворение в 0,03 М фосфатном буфере с р-меркаптоэтанолом, обес-соливание на колонке с сефадексом г С-25

Элюат

хроматография на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой от 0,01 М фосфатного буфера до 0,1 М, и от 0,1 М КаС1 і до 0,3 М в том же буфере

Элюат от 0,05 до 0,1 М ф. б.

і

элюат

элюат

элюат

"^Элюат от 0,1 М до 0,3 М №01 в 0,1.М ф. б.

высаливание до 55%

обессоливанне на 0-25

хроматография на колонке с с ефа дек-сом 0-200

сорбция на геле фосфата кальция до 90%

десорбция

осадок

| 0,2 М ф; 6.

препарат индуцируемой ГДГ (НАДФ-ГДГ)

I

элюат

1

элюат

элюат

осадок

),ЗМ ф. б. |

препарат конститутивной ГДГ (НАД(Ф)-ГДГ)

Рнс. 1,- Схема разделения и очистки ГДГ хлореллы.

іі" 1"

Я

4

: Л

11 "ї .ї

І>

і'/ і :

-

Рис. 2, Препарат конститутивной ГДГ после очистки.

1 —знмограмма

2 — электрофор егр ам ма

Аминотрансфёразную активность определяли хроматографы чески м методом (Успенская, Кретович, 1962). Активность рассчитывали как количество мкмолей аланина, образовавшегося за 1 час под влиянием 1 мг белка или 1 мл экстракта.

Активность пируваткиназы определяли спектрофотомет-рически с помощью лактатдегидрогеназы, восстанавливаю-

шей образующийся лируват до Молочной кислоты в присутствии НАДН, который при этом переходит в окисленную форму, что и регистрируется спектрофото метрически по изменению поглощения света при 340 нм.

Диск-электрофорез в полнакрнламидном геле проводили по методу Дэвнса (ДаУ15, 1964).

Полосы, содержащие фермент, проявляли по методу Тер-мена (ТЬигшап.е1 а!.. 1965),

Молекулярный вес субъединиц белковых молекул определяли с помощью электрофореза в полнакрнламидном геле по методу Вебера и Осборна (ШеЬег,, ОзЬогп, 1969) в присутствии додеци л сульфата натрия (ЗБЗ).

Определение молекулярного веса субъединиц НАД(Ф)-ГДГ

Получив препарат конститутивной ГДГ в гомогенном состоянии, мы имели возможность изучать субъединичную природу ГДГ и молекулярный вес субъединиц с помощью электрофореза в поли акрил а мидном геле в присутствии БОБ, который оказался равным 49000±1000 (рис. З). Исходя из величины молекулярного веса 300.000, определенного ранее с помощью гельфильтрации через сефадекс й-200 (Шатилов и др., 1974),, можно считать, что конститутивная ГДГ является гексамером (6Х49000±1000).

Рнс. З.- График.нл.пюанрнрующий определение молекулярного веса субъединицы НАД(Ф)-ГДГ. Метчики: ]—сывороточный альбумин (69000), 2 — ГДГ животных (56000), 3—яичный альбумин (44000),

4 — лактэтдегндрогеназа (36000), -

5 — химотрнпснноген А (25000),

А — НАД (Ф) -ГДГ (49000—48000).

Влияние диссоциирующих агентов на ГДГ хлореллы

Из литературных источников известно, что ГДГ микроорганизмов и высших растений не подвержены обратимой ассоциации-диссоциации. Обычно они сравнительно устойчивы к диссоциирующим агентам, и если распадаются на отдельные субъединицы, то с необратимой потерей активности. Исключение составляет ГДГ из ВгеУ1Ьас1егшш Паушп, которая под влиянием КС] переходит из малоактивной высокомолекулярной формы в активную мономолекулярную.

Как показали результаты электрофореза, НАД(Ф)-ГДГ диссоциирует под влиянием на субъединицы с полной

и быстрой потерей активности. Для выяснения возможной обратимой диссоциации с восстановлением активности мы изучали влияние мочевины и гуанидинхлорида на активность обеих ГДГ, Оба фермента быстро и необратимо инактивн-руются под воздействием гуанидинхлорида (рис. 4),

Инкубация НАД(Ф)-ГДГ в 8М мочевине с р-меркаптоэта-нолом (0,1 М) в течение даже 20 часов при комнатной температуре приводила к инактивации всего на 25—30% (табл. 1). Исходя из такой устойчивости, можно пред поло-

ги

ЦМ

45 1 гест iatmamfvK. i

Рис. 4, Инактивация НАДФ- и ИАД{Ф)-ГДГ в процессе прединку-бацин с гу а н иди н хлоридом в 0,03 М фосфатном буфере -рН 7,4 при комнатной температуре. -А-А — НАД (Ф) - ГДГ 69 у/мл: — НАДФ-ГДГ 44 v/мл.

( , Таблица 1 Влияние 8 М мочевины и OJ М меркаптозтакола на НАД(Ф)-ГДГ

Условия инкубации фермента при ком-

Относительная активность, %

Аминирование рН 8,1

Деэаминирование рН 8,7

катиой температуре Исх. 3 час. j 30 час. Иск. 3 час. •30 час.

Контроль 100 100 95 100 400 .83

8М мочевина ЛОО 100 67 100 Ü00 , ■ г 58

fl-меркаптоэтанол лоо J00 ,42 100 83 ■■ 39

8 М мочевина +

меркаптоэта нол 100 100 38 1 100 400 •39

жить, что в поддержании четвертичной структуры НАД(Ф)-ГДГ существенную роль играют не дисульфидные и водородные связи, а гидрофобные и другие взаимодействия.

Кап видно из рисунка 5, НАДФ-ГДГ легко инактивнрует-ся под влиянием мочевины.

Добавление мочевины В: реакционную смесь вызывало ингибирование обеих ГДГ, которое было для НАД (Ф)-ГДГ. конкурентным по отношению к Ь-глутамату (рис. 6) и некон-

Рис. 5. Инактивация НАДФ-ГДГ в процессе лрединкубации в присутствии мочевины водам ф. б., рН 7,4. Концентрация фермента 0,39 мг/мл.

о. * 3 « в (О

, урттнат. '

Рис. 6. График двойных обратных величин для ингибировакия мочевиной - (] и 2 М) НАД (Ф)*-ГДГ в реакции дезамннировання (рН 3,7) по

отношению к г луга мату,-Концентрация: НАД+—М,

фермента — 9 у/мл.

О го

'/^•чевдям«мдалг |)|а')и"'

Рис. 7. График двойных обратных величин для ингибиро&ания мочевиной ([ и 2М) НАД(Ф)-ГДГ в реакции эминиравання (рН 8,3) по отношению к а-к-етоглутарату. Концентрация: НАДН — (10-< М, (ГШОаНРОч — !КИ М, фермента — 2,3 -у/мл.

курентным гго отношению к-а-кетоглутарату (рис. 7). Очевидно, мочевина и глутамат конкурируют за участок связывания ЫНг-группы.

Так как между глутаматом и кетоглутаратом существуют конкурентные взаимоотношения {рис. 8), то независимое связывание кетоглутарата и мочевины является несколько неожиданным, и может указывать на то, что глутамат и а-кето-глутарат связываются неодинаково на молекуле фермента.

1л

V

да *

а ю

10» нМ

Рис, 8. Влияние глутамата (50— 100 мМ) на зависимость скорости амннировання (рН 8,7) от коицен-' трации а-кетоглутарата для НАД(Ф)-ГДГ. Концентрация: НЛДН — ОЛ мМ, <ті4),нро, — в мм.

0 У^.-к0тгштвр<ип}-В'*мЮ

Термостабильность и1 защитный1 эффект субстратов при: тепловой инактивации-

Как показали опыты с диссоциирующими' агентами, НАДФ-ГДГ оказалась более лабильной по сравнению с НАД(Ф)-ГДГ, имеющей жесткую структуру. Тот же вывод был сделан ранее на основании опытов по тепловой инактивации (Шатилов и др., 1972). Индуцируемая ГДГ лабильна к нагреванию и инактнвируется при температуре выше 60°, а конститутивная ГДГ выдерживает нагревание до 80°. В связи с этим было интересно выяснить оказывают ли субстраты защитный эффект при нагревании.

Как видно из данных таблицы 2, а-кетоглутарат и, особенно, глутамат. эффективно защищают индуцируемую ГДГ от инактивации при прогревании до 75а.

Что касается конститутивной ГДГ, то ни один субстрат полностью не защищал от тепловой инактивации, а НАД(Ф)Н также способствовал инактивации (табл. 3).

Присутствие НАДФН усиливало тепловую инактивацию. Это явление известно также для других ГДГ (іпайакі, 1959; ОпэоИа, 1964). '

Причины инактивирующего действия. НАД(Ф)Н на ГДГ хлореллы остаются неясными..

Кинетические проявления ГДГ в реакции дезаминирования

Исследование свойств обеих ГДГ в реакции дезамиииро-кания показало, что характер, изменения активности НАДФ-ГДГ от концентрации глутамата не отличается от такового у НАД (Ф)-ГДГ, Обе зависимости носят, гиперболический -

, - - , • в-

ё«

Рис. 9, Зависимость активности НАДФ- (А> и НАД(Ф)-ГДГ (Б) от концентрации глутамата в пределах, от 0. до 2-10-3 М (I) и • от 0 до 1СНМ (II). В —графики двойных обратных величин.

« * < » „» " и * *

Рис. ю. Зависимости активностей НАДФ- (I) и НАД(Ф)-ГДГ (II)-от концентрация окисленных кофакторов: А — графики двойных.обратных величин.

I — 100 мМ тлупамата, 74 мкг белка в 0,96 М трнс—НС! буфере,

рН 8.7. НАДФ+. ,

II —50 мМ глутамата, 40 мкг белка, в 0,05 М, трис—НС! буфере,

" рН 8,7, НАД+.

Таблица 2

Тепловая инактивация индуцируемой НАДФ-ГДГ и защитное действие субстратов

Оставшаяся активность. %

*) Субсэра г, присутствующий ігри нагревании ■ Амикировакий после пропреагния препаратов Дез а минирование после прогревания ■ препаратов

25" 40е ' | 50° 1 604 70° 1 75* 80" 25" 40" 50" 60" 70" 75е 80"

Контроль 97 94 97 47 о' О 0 113 100 _ 53 0 0 0

Ь-глутанат 94 93 92 ' 72 94 94 0 93 100 — МО 120 100 0

и-кето-

глутдраг 100 78 89 75 ■ 0 0 0

ИАДФН 90 81 12 0 0 0 0 — — ' — — — _ -

КАДФ+ — — . — — — — — 100 — — 48 —. — 0>

{ЫН,)2НРО, — 89 89 — 89

*) Концентрация субстратов при прогревании фар мента: Ь-глу та мат— 1600 м М, а-кетоглутарат —¡25 мМ, НАДФН — 5 мМ, (Ш^ИРО* — 1000 мМ, НАДФ+ мМ. -

Таблица З

Тепловая инактивация конститутивной ИАД(Ф)-ГДГ и защитное действие субстратов

Оставшаяся активность после прогревания, %

страт, присутствующий при про-греваняи Деза минирован не с НАД+ рН 8,7 аминированяе

с НАДН рН 8,6 с НАДФН рН7,8

" 25е. ' £(Р - 90® . 25е 50е 80* 90° 25* 50е 80° 90°

Контроль 100 20 2 100 — 30 4 100 — 25 2

І.-глутамат 100 60' 75 — 60 40 83 — 77 * 40

«-кето-

глутарат — 90 _ 86 40 90 — 90 —

(Ш<)іНР04 — — — 90 — 76' 63 ' 85' — 88 60

Ыа1НРО< — — — 85 — 80 50 70 —. 80 —

НАДН — — — ' 60 0 0 — — ■ — _

НАДФН — ■ — — ■■ —' — ■ — ' — 80 73 0 ' 0

*) Концентрация субстратов при пропреванни фермента: 1.-глутамат — (ГШіЇіНРОі — ІІ200 мМ; НАДФН — ЗмМ, НАДН — ІД мМ и ЫагНР04 —

750 мМ, а-кетоглуітарат —150 мМ, 1200 мМ. . '

характер (рис, 9), но насыщенне НАД(Ф)-ГДГ происходит при более низких концентрациях глутамата, чем у НАДФ*

ГДГ, при этом значение К„5Ж , естественно, оказывается ниже.

Следует отметить, что поскольку в реакции дезаммкиро-вання для НАДФ-ГДГ наблюдается ускорение в начальный период (рис. И), то при построении кривой на рисунке 9 была использована скорость на линейном участке, не являющаяся принципиально начальной скоростью. Насыщение ко-, фактором для НАДФ-ГДГ происходит при более низких его

концентрациях, а К*,аж на порядок ниже, по сравнению с НАД(Ф)-ГДГ. (рис. 10).

Следует отметить, что НАД(Ф)-ГДГ, практически не осуществляя in vitro дезаминнрование с НАДФ+, в то же время прекрасно амннирует с НАДФН; Соотношение скоростей ами-нирования с НАДН и с НАДФН,'измеренных при насыщающих концентрациях субстратов и оптимальных значениях pH, равно 3:1.,Скорость деза минирования с НАД4" в 25—30 раз выше скорости дезаминирования с НАДФ+.

Соотношение скоростей аминирования и дезаминирования для НАДФ- и НАД{Ф)-ГДГ практически одинаково и равно , 4—5:1, .

Активация НАДФН и глутаматом НАДФ-ГДГ

Нами, обнаружено, что вреакцни дезаминирования при насыщающих концентрациях"-, субстратов для НАДФ-ГДГ^ наблюдается нелинейное возрастание начальной скорости реакции во времени, т. е. наблюдается ускорение т, которое не является постоянной величиной, а зависит от порядка' добавления субстратов (рис. 11). Кетоглутарат и (NHi)iHPCV не изменяют величину туск;', НАДФН полностью снимает ускорение, не снижая при этом скорость реакции. Это указывает на аллостерическое действие НАДФН как активатора. В пользу того,.что активирование НАДФН является аллосте-рическнм, свидетельствует также и то, что НАДФН совершенно одинаково защищает аминирование н дезамннирова* ние от инактивирующего действия парахлормеркурибензоата (см. стр. 1?) (п-ХМБ).-Туск. уменьшается также при предин-кубации фермента с глутаматом (табл.,4). Активация под влиянием глутамата происходит медленнее, чем под влиянием НАДФН.

На основании вышеизложенных данных можно сделать вывод о том, что НАДФ-ГДГ может находиться в двух состояниях:. неактивном (или.малоактивном) и активном. Пе-

Рис. 11. Зависимость скорости дезамнннрования от; времени ; для . НАДФ-ГДГ. Концентрации субстратов насыщающие. 1 — ход реакции ¡в присутствии НАДФН; 2, 3, 4 — начало реакции осуществлялось добавлением в последнюю очередь НАДФ+, Ь-глугамата и фермента соответствен во; 5 — то же, что и 4, но при рН 8,2.

Таблица 4'

Влияние предипкубации НАДФ-ГДГ с глутаматом на время ускорения реакции дезам инироваыия. '

Время п рединку баші и, ми».

Время уморения т, мнн.

Л А/ми и.

О

'«•.і 3

5 і

0,73 0.60 0,30 0,10

0.155 0,160 0.155 0.160

рехол из неактивного состояния в активное осуществляется пол алл остер и чески м влиянием НАДФН.

На стр.- отмечалось' стимулирующее влияние НАДФН при тепловой ннактивацин НАДФ-ГДГ. Исходя из активирующего действия НАДФН на молекулу фермента, можно полагать, что в активном состоянии индуцируемая ГДГ более чувствительна к тепловой денатурации.

Интересно также отметить влияние НАДФ+ на., амнниро-наине. Добавление его в концентрации меньшей* равной или большей, чем оптимальная концентрация НАДФН вызывает появление ускорения и ингибирование скорости реакции ами-ннрования, С увеличением концентрации НАДФ+ время ускорения м степень илгнбированйя возрастают; кроме того, появляется- и увеличивается лаг:период, т. е. начальный период, когда скорость реакции равна 0 (табл. 5); Эти факты

Л

Рис. 12, Зависимость скорости стационарной фазы реакции дезамиии-ратания от концентрации фермента при рН 8,7,:

О _ го «О ' ьо

^ ' * *

наводят на мысль о том, что НАДФ+ и НАДФН являются аллостерическими эффекторами противоположного действия. НАДФ+, видимо, соединяется с ферментом на тех же аллосте-рнческих центрах, что и НАДФН и таким;образом способствует поддержанию неактивной конформации. Наблюдаемое явление активации под .влиянием субстратов можно объяснить либо за счет изменения агрегации фермента, либо за счет конформационного перехода неактивной формы в активную. Последнее более вероятно для НАДФ-ГДГ, поскольку наблюдается пропорциональная- зависимость между скоростью реакции и концентрацией фермента (рис. 12), а активация проявляется -при всех указанных концентрациях белка.

Переход фермента из неактивной формы в активную под влиянием лигандов — явление довольно- распространенное (Курганов, 1975) и мы рассматриваем его как механизм регуляции активности ферментов.

Влияние п-ХМБ на активность глутаматдегидрогеи.тГ хлореллы;

Выявление функциональных групп очень важно для характеристики ферментов, катализирующих одну н ту же реакцию, и для сравнительного изучения их свойств. Для выяснения роли сульфгидрильных групп в функционировании НАДФ- и МАД(Ф)-ГДГ мы использовали парахлормеркури-бепзоат. Используемые в этих опытах препараты ГДГ не содержали р-меркаптоэтанола. Выяснилось, что активность НАДФ-ГДГ чрезвычайно чувствительна к действию п-ХМБ, г.ричем доза минирование (рН 8,7) ннгнбируется сильнее, чем ^минирование (рН $,2) (табл. 6). Если аминнрование измерять при рН 8,7, то степень ингибировання оказывается одинаковой. Вероятно, что ЭН-группы при рН 8,2 менее доступны действию ннгибитора.

Таблица 5

Влияние НАДФ*■ на скорость реакции, (¡минирования НАДФ-ГДГ

Концентрация НАДФ+, М I*) им

л а г-период, сек. т. сек. Д А/ШШ. ингнб., % лаг-пер иод, сек. г, сек. Д А/иин. ИНГИЙ., %

0 0 0 0,190 0 . 0 0 0/190 0

0 0,170 ' - 10 ' 3 33 0,150 21

10-" 0 —. 0,120 ' 37 5 40 0,125 31

2,5-10^ 0 ' 5-3 0,090 52 10 70 .0,080 58

5-10"« 3-6 10 0,053 72 ■ 20 80 0,040 79

- *) Реакционная смесь составлялась в следующей последовательности:

I) «-кетоглутарат+буфер рН ЗЛ+фермент+г.МО"« мМ НАДФН+НАДФН-

+7-ННМ (ЫН4),НРО,; ,

И) а-кетоглутарат+буфер+фермент+НАДФН-НАДФН+(Ш()гНР 04.

Таблица 6

Ингибирование индуцируемой НАДФ-ГДГ п-ХМБ при рН 8,7 и защитное действие субстратов

) Субстрат, прнсутст вующий при прадин-кубации

Концентрация п-ХМБ, МіІО1

Ингибирование, %

Амин про- Дез а минирование. ■вание

О 2

3

4

5 4 4 4 4 4 4

I О

42,0 72,0 85,0 91,0 77,0 73,0 70,0 6.0

О 40,0 64,0 76,0 86,0

1,-глутамат а-кетоглутарат

(ЫН«ЬНРО<

НАДФН

НАДФ+

НАДН

80,0

10,0 8,0 76,0

*) Концентрации субстратов были такими,- какие использовались для определения активности, т, е, насыщающими. _

Из всех субстратов защитное действие оказывают только НАДФН и НАДФ+ в обоих направлениях реакции (табл. 6). На основании этого можно сделать вывод о том, что п-ХМБ присоединяется к ферменту на аллостерических центрах, где присоединяется НАДФН как активатор, а не на активных-центрах, иначе защитное действие НАДФН было бы различным в направлении аминирования и дезаминирования.

Следовательно, НАДФ-ГДГ является содержащим. БН-группы ферментом, которые расположены в аллостериче-ском центре и играют важную роль в активирующем¡конфор* мационном переходе.

По сравнению с индуцируемой ГДГ, конститутивная нн-гибируется только при сравнительно высоких концентрациях п-ХМБ, причем однонаправленно: подавляется скорость дезаминирования, а скорость аминирования либо не меняется, лнбо ннгнбируется незначительно (табл, 7). Ни глутамат, ни НАД+ не защищают НАД(Ф)-ГДГ от действия п-ХМБ,

Напротив, если при измерении скорости аминирования в присутствии п-ХМБ добавить НАД*\ то ингибирующее действие п-ХМБ значительно возрастает (табл. 8), т. е. между ними наблюдается синергизм при действии на аминирование. Ни глутамат, ни НАДФ1- подобного эффекта ле оказывают.

2 Заказ 426 . 17-

. - ! _ Та бл ища 7

Ингибирование п-ХМБ конститутивной НАД(Ф)-ГДГ и защитное действие субстратов

Субстрат, присутствующий при предин-кубации ' Ингибирование, %

Концентр. п-ХМБ, АЫО», Аминированне Дезамини-

с НАДФН (рН 7.8) с НАДН (рН в,7) рованне с НАД (рН 8,7)

0,06 0 0 12,5

0,147 0 0 30,0

0,300 о 0 37,5

0,6 о 0 56,0

0,6 69.0

1,47 86.0

2,38 23 22 100

1--глутамат НАД+ . 1,47 1,47 85.0 84,0

Т.аблица 8

Зависимость действия п-ХМБ от НАД*- на аминирующую активность конститутивной ГДГ

Ингибитор и его концентрация, ыМ Общее ингибирование, % Ингибирование, вызываемое п-ХМБ

с НАДН 1 с НАДФН с НАДН с НАДФН

НАД+ 0,2 _ 36

п-ХМБ**) 1,38 — 13 16

НАД+ + п-ХМБ' — 67- — 49

ПАД+ 1 ■■ 45 — — , _

п-ХМБ + НАД+ . . 66 — 37 —

ИАД+- 1 43 — — — ■

п-ХМБ**) • 0,81 0

п-ХМБ + НАД+ 65 — . 39 — .

глутамат, 100 - 45 22 ' _ — ■

п-ХМБ, 1,38 > — ' — 13 15

п-ХМБ + глутамат 37 22 : 0 0

НАДФ+ 1 9 15 •— —

и-ХМБ + НАДФ+ : . 19 15 10 0

• **) При этих концентрациях п-ХМБ деза минирование ингибироаалось

на 50—60%.

В литературе-известны случаи однонаправленного действия метаболитов на ферменты, катализирующие двухстороннюю реакцию, в частности на НАД-ГДП некоторых представителей РЬусотусеїез (І.е\ГоКп, 1968), но объяснения им не дано. На наш взгляд, это легко можно было бы объяснить, предположив разобщенность, аминирующего и деза минирующего участков на молекуле фермента, как это изображено на рис. 13,

Амнннрование и дез а минирован не осуществляются на различных участках: молекулы. с соблюдением принципа микроскопической .обратимости. Амшшрующий участок имеет большее сродство1 к субстратам 51&|=Р2Р2 и.меньшее к продук-

Рис, 13. Схематическое изображение возможной модели ГДГ, 5[5і« РаР3 -= «-кетоглутарат+ N Н(++Н АДФН+Н+. РіРі-5а5і—Ь-глуташіт+НАД(Ф)+.

Рис, Л4. Схематическое изображение совместного дсЛствия п-ХМБ И ІІАД+ на ГДГ, I.— центр «минирования, И — центр дезами нированн я.

там 5гЗг=Р(Р|, поэтому на. нем равновесие сдвинуто в сто' рону синтеза глутамата, а на деза минирующем участке — в сторону его распада. В этом случае любой, метаболит,

2*

19-

соединяющийся конкурентно в том или другом участке, может по-разному влиять на аминирование и дезамннирование, так же как и аллостернческие эффекторы, соединяясь на аллостерическом центре А, могут вызвать конформацпонные изменения, по-разному влияющие на скорость амннирования и дезаминировання. Принимая эту модель, можно легко объяснить и совместное действие и-ХМБ и НАД+ на аминирование, которое схематично изображено на рис. 14. По-видимому, п-ХМБ связывается вблизи деза минирующего участка, нарушая его топологию, и в результате мы наблюдаем ингибнро-вание; аминирующий участок при этом не затрагивается, (рис. 14,Б). При добавлении:НАД+, очевидно, происходит образование комплекса Е-п-ХМБ-НАД+. При этом происходит изменение конформации молекулы фермента, затрагивающее аминирующий .участок. В результате наблюдается на обнаруживаемое ранее ингибирование амннирования (рис. 14, В).

В пользу модели с разобщенным» центрами амннирования и дезаминироваиия свидетельствует также описанный на стр. 8 факт, что мочевина связывается независимо от а-кето-глутарата на молекуле фермента, в то время как с глутама-том она конкурирует за участок связывания.

Роль одновалентных катионов в действии ГДГ

Исследование свойств обоих: ферментов показало, что структура НАДФ-ГДГ является подвижной, лабильной, а структура НАД (Ф)-ГДГ —жесткой, стабильной. Поэтому было интересно сравнить действие одновалентных катионов на оба фермента, так как известно, что активирующее влияние одновалентных катионов на ферменты является следствием изменения окружения водной оболочки белковой молекулы, которое влечет за собой изменение ее конформации и, следовательно, каталитических свойств (Ramasastry, Meryman, 1973).

Результаты опытов показали, что Li+, К+, Nat и Cs+ активируют НАДФ-ГДГ в обоих направлениях; для НАД(Ф)-ГДГ активирование не наблюдалось (табл. 9).

Действие К+ и Na+ было специфическим, а не результатом влияния ионной силы.

Ввиду того, что дефицит кп а не Na+ приводит к серьезным метаболическим сдвигам в клетке хлореллы (Mac Carty, Peterson, 1974; Гительзон н др., 1966) и в нормальных условиях концентрация К+ в клетке достигает 0,1 М (Shich, Barber, 1971), т. е. концентрации, при которой in vitro наблюдается сильное активирование, для дальнейших исследований мы использовали. КС1 в качестве активатора НАДФ-ГДГ.

Из анализа графиков (рис. 15) зависимости активности НАДФ-ГДГ от концентрации а-кетоглутарата и (ГЧШЬНРСЦ следует, что при. низких концентрациях кетоглутарата активирующее действие К+ не проявляется, а становится заметным лишь при концентрациях, близких к- насыщающим (>10-3М),

Таблица О

Влияние различных солей на активность глутаматдегидрогеиаз хлореллы

Соль Концентрация Относительная активность в <реакцни аминцрюания, %

i рН 8jl ивдуци^емая рН 8.7 конститутивная гдг

Без. соли ■ 0 (100 100

40 120

LiCl ' 100 . . 130

* 400 175

20 ' изо ■ 100

NaCl SO , 144 IJO

100 176 по

no )50 110

NaNOs 50 - 200

100 190 70

25- 1150

NatHP04 50 ■180 . 110

M0 145 80'

25 '165 Í10

KC1 50 Í80 110

100 200

lio 155 115

KNOj 50 150 —

100 100 ■ 70.

20 " 140

CsCt 50 ' 163

JOO 205 .

200 240 ■

Однако в присутствии К+ расширяется область значений а-кетоглутарата, при которых п остается близким к единице, что подтверждается при расчете переменного коэффициента <] по Курганову (Силонова и др., 1969) и построении зависимости величины д от концентрации а-кетоглутарата (рис. 16).

0 -2 Ч 6 ,8,.(Я

Рис. 15, А. Зависимость активности НАДФ-ГДГ от концентрации а-хетоглутарата в отсутствие (1) и в присутствии (И) 0.1 М КС1 в 0,05 М три с-НС I буфере рН 8,1. В — графики Хилла.

15 5«.«

Рис, 16. Зависимость переменного коэффициента ч (по Курганову) от во > в присутствии (II) я в отсутствие (I) 0,1 М КС!;' Эа — концентрация а*::е-тоглутарата. Расчет ч произведи:« но данным рисунка 15, А.

(л>

Сі 05 06

(в)

Рис. 17. Графики Хилла (а) и двойных обратных величин (б) для зависимости активности индуцируемой ГДГ от концентрации (ЫНО^НРО, в отсутствие (I) и їв присутствии (П) 0,1 М КС1.

В случае (ІМНОіНРСЬ активирующее действие К+ оказалось выше при его низких концентрациях (рис. 176). Возможно Г*Щ4+, будучи субстратом, в то же время является активатором НАДФ-ГДГ. по аналогии с К+ и Ыа+. Характер зависимости активности от концентрации в присутствии к+ не изменяется, о чем свидетельствует график Хилла (рис. 17а). . ■ . ; . ■ „.^ .

Из этих данйыХ следуем что К+, расширяет область эффективных концентраций

Таким образом, можно сделать вывод, что К+ способствует созданию каталитически выгодных условий для НАДФ-ГДГ, которая, являясь лабильным ферментом, легко изменяет свою конформацию под влиянием внешних факторов.

.Некоторые особенности функционирования ГДГ хлореллы

1. Направленность действия ГДГ. Для ферментов, катализирующих двухсторонние реакции, вопрос о направленности их функционирования в клетке является очень важным. Направленность и скорость реакции определяются соотношением субстратов и продуктов. Для.НАДФ-ГДГ было показано значительное ингибирование ТШ4+ и а-кетоглутаратом реакции дезаминирования, тогда как глутамат даже в кон-

Т а б л и ц а 10

~: ' Влияние продуктов реакции на активность НАДФ-ГДГ

~ Продукт Кон-цен-тра-цня, мМ Ингибцро- ' : ванне,-% . Продукт - Конце н-тра-ция, мМ Ингибвро-«акие, %

ами- ниро- ванне дезами, ниро-вание а минирование деза минирование

1.0 15,5 N32HP0« 10 + 16,7

2,5 51,0 100 +48,0

1 • 5,0 52,3 L-глутамат ■ 100 0

10,0 77,0 200 0

НАДФН 0Л +115 НАДН- 0i 0

- 0,25 .'+ 8 0,5 26

0.5 30 11,0 100

1 82

(NHíhHPCy 1 50

11) 85

50 93,2

центрации Ю^1 М практически не оказывал влияния на ами-нирование (табл. 10). Это свидетельствует^ тощ что in vivo НАДФ-ГДГ функционирует как с и н тетп^пУши ф ер мент, призванный обезвредить клетку от токсического ВЛИЯНИЯ ЫНч+.

На основании данных по изучению влияния продуктов реакции, на активность НАД (Ф) -ГДГ нельзя определенно сказать о направленности ее функционирования в клетке. Можно, однако, предположить, учитывая все данные, двоякое

/

функционирование НАД(Ф)-ГДГ 111 а именно, синтез, глутаминовой кислоты при участии НАДФН и ее распад при участии НАД*.

2. Роль пируваткиназы и аланин-аминотрансферазы в функционировании индуцируемой ГДГ

Как уже отмечалось, индуцируемая под влиянием ионов аммония ГДГ хлореллы осуществляет исключительно синтез глутамата. Однако хорошо известно (Reisner et al., I960;. То* мова.и др., 1964; Backer, Thompson, 1961), что уже в первые минуты ассимиляции голодавшими по азоту клетками

происходит быстрое и преимущественное накопление алани■ на. При ассимиляции 'NÓ3~ в наибольшем количестве образуется глутамат. Как следует из литературного обзора, механизм преимущественного синтеза аланина оставался неясным.

Бейкер и Томпсон {Backer, Thompson, 1961) считают, что образование .аланина осуществляется путем переаминирова-ния пнрувата с глутаминовой кислотой; им не удалось обнаружить активность аланиндегидрогеназы.

Хотя активность этого фермента и была обнаружена в клетках Chlorella pyrenoidosa Pringsheim 82Т, но она, по-видимому, не велика, т. к,-опыты с NISH4+ показали, что включение N" происходило в первые минуты главным обра-^ зом в глутамип и глутаминовую кислоту, а не в аланин (Шатилов и др., 1968).

Таким образом, аланин действительно образуется за счет переаминирования. В таком случае, активность аланин-аминотрансферазы должна усиливаться при ассимиляции NH(+. Это возможно за счет усиления синтеза фермента, его активации или же вследствие возрастания концентрации субстрата, лимитирующего скорость реакции. Таким субстратом является пируват,1 так как содержание его в клетках хлореллы во много раз меньше, чем содержание глутаминовой кислоты (Томова и др., 1964; Backer, .Thompson, 1961; Шатилов и др., 1967). Кроме того, содержание пирувата действительно резко возрастает под влиянием NH4+ (Kanasava et al., 1970; 1972), тогда как содержание глутамата остается довольно стабиль^ ным (Reisner et al., 1960; Backer, Thompson,- 1961). Возможно, возрастание концентрации пирувата происходит за счет активации пируваткиназы под влиянием ГШД однако экспериментально это не было доказано. Учитывая эти данные, представлялось необходимым выяснить влияние NH«+ in vivo и in vitro на активность аланинаминотрансферазы и пируваткиназы.

Результаты эксперимента показали, что, активность ала-

шнаминотрансферазы практически не изменяется под влиянием МН4+ (табл. 11).

Таблица 11

Влияние на аланин-аминотрансферазу

Время инкубации на qpftie с NHv*

Активность

моль/мг белка/час

моль/мг белка/час

Белок, мг/мл

Контроль >15 мин, б час.

5.3

5.4

5.5

48,8 49,2 <50;!

9,2 9,1 93.

На активность фермента in vitro NH4+ также практически не оказывал влияния. Следовательно, усиление^скорости синтеза аланнна не объясняется индукцией или активацией аланин-аминотрансферазы. Принимая это во внимание, вполне определенно можно сказать, что возрастание скорости'переамн-нирования пирувата с глутаматом является результатом быстрого и резкого повышения концентрации пирувата, лимитировавшего до этого скорость реакции. Концентрация пирувата увеличивается за счет активации пируваткнназы под влиянием NH4+* (рис. 18). На синтез фермента NH4+ не оказывал влияния, что было установлено на синхронной культуре используемого нами штамма хлореллы (Tomova et al., 1971). Такое же активирующее действие оказывает К+,

» 60 во -м

¡Ш KHJI по И J

Рис. 18, Влияние in vitro К'", Na+ и NH4+ на активность пируваткнназы нз клеток хлореллы. I — КО, II — NHjCI, III — NaCI.

s

-*

V

si

I

- -v

г-tt u InuwMm-.n'timefiQm-mii

Рис. .19. Зависимость активности аланин-амннотрансфера-зы от концентрации глутама-■ Та (II) и гшрузата (I),

2Г>

в то время KaK.Na+ не активировал пируваткиназу. Поскольку содержание пирувата в клетках хлореллы очень низкое, по сравнению с концентрацией глутамата, то колебания в концентрации пирувата будут сильно отражаться на скорости его переаминирования. - Это следует из зависимости активности аланин-амннотрансферазы от концентрации субстратов (рис. 19).

Система, обеспечивающая преимущественный синтез ала-ннна при ассимиляции NH4+, по-видимому, является одним из узлов механизма, обеспечивающего его быстрое связывание. Другим узлом является индуцируемая под влиянием NH4+ НАДФ-ГДГ (Шатилов и др., 1972). Согласованную работу этих- узлов можно представить в виде следующей схемы (рис. 20).

Пирув5т ^Глутамат** Nv

Аланин-зминотраисДераза НАДФ-глуйматдегндрогеназа

Алании_ ^p^x^NH^

Рис. 20, Схема, иллюстрирующая согласованное функционирование аланни-аминотраисферазы и НАДФ-глутаматдегндрогеназы в клетках ' хлореллы (»ри ассимиляции NH(+.

Согласно схеме, аланин-амннотрансфераза регенерирует'а-ке-тоглутарат\ нео(^^шый для функционирования НАДФ-ГДГ как синтетп"еско1о фермента {Шатилов и др., 1972).

Усиленное образование пирувата обеспечивается за счет активации пируваткиназы, а обеспеченность НАДФН — за счет фотосинтеза. Как указывалось в литературном, обзоре, NH<+ разобщает фотофосфорилирование, что приводит к возрастанию г восстановительного потенциала в виде НАДФН (Losada et а!„ 1973). Кроме того МН4+ усиливает пентозофос-фатный цикл (Okuda, Ida, 1962) и другие процессы (Syrett, 1962).

выводы

1. Разработана схема получения конститутивной ГДГ хлореллы в гомогенном состоянии.

2. Установлена субъеднничная природа конститутивной ГДГ и определена молекулярная масса субъединнцы.

Выяснено действие диссоциирующих агентов.

•3, Установлена аллостерическая природа индуцируемой ГДГ. Аллостери чески ми эффекторами ее являются НАДФН и НАДФ+. '

"4. Для индуцируемой ГДГ показано существование ее и двух формах: активной н неактивной (или малоактивной).

Конформационкый переход неактивной формы в активную происходит в результате аллостерического действия НАД(Ф)Н. Существенную роль в этом переходе играют ЭН-группы. ■

. 5. Кинетические данные позволяют сделать з^дючежн. о том, что фермент функционирует как сннтетн^^кі ж, Эта направленность определяется соотношением субстратов и продуктов реакции и влиянием последних на скорость реакции.

6. Выявлен механизм преимущественного накоплении аланнна при ассимиляции клетками хлореллы,

7. Показано однонаправленное действие п-ХМБ на конститутивную ГДГ.

8. Предложена модель ГДГ, объясняющая однонаправленное действие лигандов.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. В. Р. Шатилов, В. Г, Амбарцумян, М. Л. Каспарова, В. Л. Кретович, 1974.' Активация глутаматом и НАДФН специфичной к НАДФ глутаматдегидрогеназы хлореллы. ДАН СССР, 215, № 6, 1497—1500.

2. В, Р. Шатилов, В, Г. Амбарцумян, М. А. Каспарова, В. Л. Кретович, 1974. Влияние пара-хлормеркурибензоа-

, та на глутаматдегидрогеназы хлореллы. ДАН СССР, 216, № 1, 223—225.

3. В. Р. Шатилов, М. А. Каспарова, В. Г. Амбарцумян, В. Л. Кретович, 1975. Сравнительное изучение глутамат-

• дегидрогеназ хлореллы. Биохимия, 40, вып. 6, 1237—1245. 4., В. Р. Шатилов, М. А. Каспарова, В. Л. Кретович, 1974. Преимущественное накопление аланнна и активность пи-руваткиназы в клетках хлореллы при ассимиляции аммония. ДАН СССР, 219, Яэ 4, 1014—1016.

5. В. Р. Шатилов, М. А. Каспарова, В. Л. Кретович, 1976. Действие одновалентных катионов на глутаматдегидрогеназы хлореллы. Биохимия, 41, 1636—1640.

6. М. А. Каспарова, В. Р. Шатнлов и В. Л. Кретович, 1977. Влияние диссоциирующих агентов на глутаматдегидрогеназы хлореллы. Биохимия, 42, вып. 4, 754—756,

; ; _ -'. С 03171: Подписано в печать 14/1Х-1977.г. . . ; Формат бОхЭО'Ли Объем 4,75 п, л,, За к. 426.' Тираж 200.

• Типография Дагфилиала АН СССР, ■. .: " "'Махачкала, 5-й жил городок, корпус 10. ■