Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИЗУЧЕНИЕ ИНДУЦИРУЕМОЙ ИОНАМИ АММОНИЯ НАДФСПЕЦИФИЧНОЙ ГЛЮТАМАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ХЛОРЕЛЛЫ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ИЗУЧЕНИЕ ИНДУЦИРУЕМОЙ ИОНАМИ АММОНИЯ НАДФСПЕЦИФИЧНОЙ ГЛЮТАМАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ХЛОРЕЛЛЫ"



АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А. Н. БАХА

На правах рукописи

АМБАРЦУМЯН Вардуи Габриеловна

ИЗУЧЕНИЕ ИНДУЦИРУЕМОИ ИОНАМИ АММОНИЯ НАДФСПЕЦИФИЧНОЙ ГЛЮТАМАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ХЛОРЕЛЛЫ

(Специальность 03.00.04 биологическая химия)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации, представленной на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1973 г.

АКЩМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. Л.Н.ВЛХА

На правах рукописи

Амбарцумян Вардуп Габриеловна

изучение щщушруи.ш иовдя аммония нлдф-спщшчнш глшиштвдрогшш июишц

(Специальность (13.00.0^ биологическая химия) Диссертация написана аа русской языке

А В"Т ОРЕ^ЕРЛТ

диссертации, предстаплеш;о.'1 на соискание ученой стене [га кандидата Око логических наук

Косква, 1'Ш г.

Работа выполнена в лаборатории энзямологии Ордена Ленина Института биохимии им, -А.Н.Баха АН СССР

Научные руководители: члея-корресповдент АН СССР, проф. В.Л.КРЕТОВКЧ кандидат биологических наук В.Р.ШАТИЛОВ

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Г.Я.ЖИЗКЕБСКАЯ кащшдат биологических наук А.А.ГЛУТУСКИН

На официальный отзыв работа направлена на кафедру физиологии растений Московского Государственного Университета им. И.В.Ломоносова.

Автореферат разослан "У 7 " уу/СЯ-ЬрЯ 19ТО г.

Защита диссертации состоится "1974 г. на заседании Ученого совета Ордена Ленина Института биохимии им. А.К.Баха АН СССР (Москва В~71, Ленинский проспект, 33).'

С диссертаидей можно ознакомиться в библиотеке Института.

Ученый секретарь кандидат биологических наук

(11. Н. Дьячков)

■3 У Ё Л Е И И и

Глнтаматдсгцарогеназа является одним из нажне£киих ферментов на пути ассимиляции неорганического азота. Она катализирует следующую двухоторолнш^еакцш:

Продукт этой реакции, глгатамглтовая кислота, явдяатофая-нейиим иетайолитом, связывающим обмен углеводов и шило кислот. Поэтому вполне понятен йольиой интерес, проявляем«;! ию-гши исследователями к изучению фермента, катализирующего эту реакцию. 3 настоящее время в литературе известны три формы глютаматдегидрогеназн (ГДГ), 1;оторке отличаются друг от дрота по своей специфичности к кофактору. Одна форма ГДГ в качестве кофактора использует только НАД, другая толы» НАД1-», а т ре тая работает как с НАД, так и с НАДО. Если перше дна фермента распроогранеш среди микроорганизмов, то последняя форма характерна для высших организмов - животных, выспих растений.

Хлорелла, которая является объектом наших исследований, привлекает к>се$е внимание своим необичнш сочетанием фэри ГДГ. Кретовлчем и сотр . было показано, что в клетках хлореллы, выращенных па среде о КИО^ содержится ГДГ, Ее специфичная к кофактору /НАД (Ф) - ГЛГ/. После инкубации "нитратных" клеток на среде с N1^ индуцируется новый фермент, строго специфичный к 11АДФ (Шда-ГДГ). Такое сочетание форм ГДГ для микроорганизмов является уникальным. У хлореллы была изучена только ШЦЦФ)-ГДГ. (Шатилов и др., 1969). Задачей настоящей работы било ввделенне, очистка к изучение свойств индуцируемой ионами аммония 11АДФ-ГДГ хлореллы. Для сравнения параллельно изучали аналогичные свойства конститутивной НАД(Ф^-ГДГ.

МАТЕРИАЛА И МЕГОдЦ ИССЭДСИ.ШШ

■.{атеркалом для исс ледова] Лг в настоящей работе служили клетки тердофилыгого штамма СЬ. р^щю^мд, 1%Т

Культуру выращивали на среде Тайгам,которая имеет следующий состав (т/л: 1СН03-5; М^О^."? Н.,0-2,5; [ШйР04-0,5; .411,0-0,75; ДЛТЛ (этилекчиа»лшь-отетраацетат)-0^37; £ еЙО^. ■ 711;0-0,003 и I мл раствора микроэлементов. Раствор г.шсроэлементов имел следуюцкй состав (г/л): ]1;>Л0^-;-!,0в; МпЙТо-!,81; 2л504.7Н.;0-Пг;-:Г::;; N П4У03 -0,(К.;9б;' N Н4№Ю4-0,029Э).

Культивирование проводили в специальных камерах из органического стекла при освещенности 8000-10000 люксов и температуре 30-32°, Аэрация культуры достигалась 1фи помощи продувания воздуха, содержащего 0,5-0,87? 00.;;. ¡¡ыращивание про те-дилн 2-3 суток до плотности 300-350 миллионов клеток на I мл, После впрадшвания клетки собирали в суперцентрифуге С—14, проживали дистиллированной водой и переносили в свекую среду Та-мийя, но содержащую, в качестве источника азота (МН^ )а в концентрации 4,9*>Ю~3М/л (138 мг N на I л). Инкубацию в этой * среде продолжали в течение 5 часов в ростовых условиях. Затем клетки собирали центрифугированием, промывали дистиллированной водой. Получению пасту использовали для выделения ферментов. *

Бесклеточную экстракты получаля по. ранее описанной методике (Шатилов и др., 1966) с той лишь разницей, что оттаивание проводили бистро при температуре 30°.

Содержание аммиака в бесклеточном экстракте определяли по методу Любимова и лр. (Любимов и др., 1968). ■

При разделении и очистке- НАД (О) - и 11АДФ-ГЛГ бшш ис- " пользованы следующие приемы: ^^акционирование (МН^д ¡ЗО^, обессоливание при помощи гель-фильтрации через сейадсксС-'-Ь

я иоинообмекную хроматографию па ДЭЛо-целлгалозе.

/истинность ферментов определяли епектровютоиетричео-кп ira регистрирующих спектрофотог.ктрах SB-700, или EPS-ЗГ Хитачи-356. Sa единицу актигшости прш шмали коли честно фермента, необходимое для окисления или восстановления Гг.итголя НАЛ,(О). Уделыме активности рассчитншлись как число единиц за I ши, на I мг белка.

№лок определяли по методу Лоуря (iiOWtij ctatlOSI) после предварительного диализа экстрактов и элюатов против Q,005!.i фосфатного буфера. При элшролалии шход белка регистрировали по поглощений при "00 шл,

Лля проверки разделения HAJKiO - и ШУУ^ГДГ и выявления ГДГ з экстрактах использовали метод диск-электрофореза на по-лиакриладалпом геле (Î>aviM ,1951 ). Электрофорез проводили в стеклянных Tpyd;:œc, заполненных системой из двух гелей: крушюпористого Ci.Qpî-ro) и мелкопористого (7, SJi-ro). й качестве катализатора при полимеризации геля использовали ¡"».ПОЙ

раствор рибофлавина. В кажцую трубку наслаивали по 50-150f исследуемого бедка. Электрофорез проводили при силе тока около '3 ма на каддуга трубку. Полоса, содержащие фермент, проявляли по методу Терпена и др. (Ткитал tt at. ,1065).

Для определения молекулярной t.tacct.r ферментол использовали гель-фильтрацию через колонки с сефадексом G -:.:00, употребляя в качестве метчиков чистые препараты белков с известной молекулярной массой. Свободна! объем колонки бил установлен по голубому декстрану.

РЕЗУЛЬТАТУ ИССЛЕДОВАНИЯ

Поскольку задачей настоящей работы являлось выделение, очистка и изучение свойств ивдунируемой NНАД<5-ГДГ, было необходимо выяснить оптимальные уело шя ее шшукдаи.

lopoao известно, что на синтез ГДГ и других спер.юнтов существенное гмияпие оказывает свет и условия углеродного питания (SLucftíi. ct а£. ,1965; Кретошч и др., 1971; Кароог ti tí-,1970). JlooToi.iy i:.u исследовали роль этих факторов.

■I. :1лия1вге света па игогукнию НА1В-ГДГ

Для изучения влияния света на 1$укцию 1Щ1>-ГДГ, культуру хлорелли внр.чпщвали на среде Тамийя,как .описано л материалах и методах. Хлореллу, упрощенную в таких условиях, прл-нималм за исходную культуру. Опнгн проведали с клетками ис-ходай культура, а также с кдегк.-тми, дефицитными до углероду (после зшержигаипя исходной культурн в течение 15 часов в темноте,при непреривдо;.1 продувании смесь» воздуха и 1,53 СОО. ^ качестве контрольного па_рианта служили клетки, инкубировавшиеся на срсде о 1ÍNCU в тех же условиях: в тшеих клетках оса г да при сутствовала только ко пститутивяоя НАД(^)-ГЖ, -и raí н одном случае не проявлялась индукция ,11АД0-ГДГ.

Из данных спектрофотометрического определения активностей (.табл. 1) видно, что в дефицитных по углероду клетках хлореллы, активность ГДГ по отношению н НАДИ под влиянием Шц* заметно увеличивается на свету.

Jaблица 11

Ишумшя НАДО>-ГДГ в клетках, предварительно мддержаннцх в темноте в течение 15 часов

J'S условия ин- белок активность ел/мл экст. количество

вари- кубами +) ыг/ыл даолей Nlk, поглощенного ■ из I л среды за 5 часов

анта с гадж с 1ИДН

I на свету 8,1 0,89 2,12 1320

II в темноте 6,7 0,55 1,87; 960

III кмец на свету 11,4 0,65 1,94 _

Г> КНОо в темноте 6,6 0,53 1,92 -

+)В процессе инлуйаши продувание про водилой!, смесь» воздуха и 3,SS СО.,.

- * -

Интересно отметить, что m всех случаях, независимо от исходного состояния кулътурп, "тщукшм НЛД'Г>-ГДГ на сшту diura внпе всегда па одну к ту не величину - &TÍ.

Активирующее влияние света на шщуташи ПЛДО-Г/ЦГ в клетках хлорелл]j не связано с фотосинтезом, поскольку активность фермеит.1 одинакова в клетках, шйсубировавшхся как в услоии-ях фотосинтеза, так и при его .шгябироваши (табл.^). Иигиби-рование (Фотосинтеза достигалось добавлением Л-(3,4 -дихлорфе-нил)- 1,1-яиметил1лочешн» СДХ11.0 d концентрации 2, 5.Ю~"мшш полным исклвче нием С0? из продувающей смеси путем последовательного пропускания воздуха через раствор ftOH и за (0Н)2*

Таблица 2

ИЩУЩИ НШ-ГДГЙ КЛЕТКАХ ИСХОДНОЙ КУЛЬТУРЫ В УСЛ031ЯХ ИНШБИРОВАННОГО СОТОСИНТБЗА

JS» варианта условия . иякубацни на свету II активность ел/мл SKCTO. С Н№ с НАДН колич.молей N 113, погл. из I л.среды за 5 часов

I (NII4)2S04 13,8 1,09 4,33 7350

П {N 12,1 0,93 4,02 4700

Ш С N Н4)^4 12.0 0,92 4,00 пао

1У КН03 11,3 .0,67. 4,25 —

Таким образом очевидно, что индукция НЛДМГДГ под плия-

■ кием аммония-активируется светом. Однако, механизм влияния света пока остается иеясиш, также как и в большинстве других известных случаев, (ZiftX-tb^ fáto).

^iffttne глгокозн на интукшя) КЛДФ-ЩГ

Для выяснения зависимости индукции !ш№-г,ЦГ от условий углеродного питания клеток»сравнивали степень индукции в условия* ачтотроф1:ого%етеротрофного питания (в темноте, б присутствии I.sfí глккозп), а также в присутствии 13 глюкозу cae ту без со,,. результат представлены «а рис, i й

Рис, I, Яимограг.мн ГДГ, пгюявлепннв с ЛАд*?* из клеток, янкубировавяихся з условиях: 1 - (Н па свету

В - (NII4);j£04+ 1,5^глвкояы в-темноте Ш - (NHjj^SO^ в темноте

а - конститутивная !ЩКФ)-ГДГ 4 б — игащшруеиая в присутствии Н НДЛФ-1Ж в — индуцируемая в присутствии N П/ л глюкозн "i НЩ-ЗХГ.

!гошо, что глюкоза на свету подавляет синтез НЛД;1)-Г;!Г, лс-роятн^за счет катаболитноЛ репрессии

+

Рис.^. Йпмограшн ГЛГ, проявленные с НАДО из

клеток,инкубировавшихся на спету в течение

5 часов в условию:;

I - (Нн4)2£04 п - кио3

а - (Мп4)2504 сОз + 1^ глюкозы 1У- СМН4)2^04 без С02

1 - контроль, проявление в отсутствии 1| -глютамата

2 - «онтроль, проявление в отсутствии НАДФТ а - Конститутивная НАД(Ф)-ГДГ

6 - индуцируемая в присутствии^* НАПМЯГ

в - ивдуцируемая в присутствии (Н4 и глюкозы 11ДДО-

В гетеротрофных условиях репрессирушее влияние глввдзы кезаметко> так как отсутствие света, как ухе указывалось вшю, само йКтшражается в подавлении синтеза. Помимо репрессирувде-го влияния,глюкоза вызывает индукцию ноной ГЛГ, также специфичной к НАДО и обладающей наименьшей элегсгрофоретической подвижность» и активностью.

Степень индукции и репрессии нового .изофермента зависит от концентрации глюкозы: с увеличением концентрации эффект усиливается (шс,.^.

Рис.ría.Влияние глюкозы на синтез ГДГ хлореллы ^ в зависимости от ее концентрации в среде.

Клетки бшги выращены на среде с и инкубировались затем на свету на среде с ( N K^gOo^ в присутствии различных концентраций глюкозы (0; 0,1; 0,5;

с а - конститутивная-1Ш1(Ф)-ГДГ

ó - индуцируемая под влиянием М Н^ 11АДФ-ГДГ в - ивдушгруемая под влиянием глюкозы 11ЛДО-ГДГ-2.

Актидион в концентрации bY/wi полностью блокировал индуцирующее влияние глюкозы..Интересно, что фруктоза и сахароза не обладали индуцирующим влиянием.

Синтез НАДФ-ГИ7-2 зависит от форми источника азота и происходит специфически в среде с Ыно не о Н 03. Следует отметить, что в клетках,голодавших ш азоту,синтез этого изофермента происходит как в присутствии, так и в от- .

сутствии глюкози. Однако»в варианте без глюкозы НАДФ-ГДГ обнаруживается в очень незначительном "количестве. Вероятно, что синтез этого изоферлента контролируется каким-то метаболитом, уровень которого зависит, с одной стороны, от -продуктов ассимиляцииЛН^, а с другой - от наличия в клетках определенных углеродных соединений, возможно, продуктов гликолиза. Достаточный уровень таких соединений может возникнуть или ь голодавших по азоту клетках, или цри ассимиляции экзогенной глюкозы.

На основании полученных данных можно сделать следующие выгоды:

1. Свет усиливает синтез ивдуцируемой NНАДФ-ГДГ, независимо от исходного состояния культуры.

2. Глюкоза, наоборот, подавляет индукцию этого фермента и, кроме того, индуцирует синтез нового изофермента -НАДФ-ГДГ-2. Сахароза и фруктоза не проявляют "глюкозного" эффекта.

V

3. Синтез этого пзофермента зависит от концентрации глюкозы и, по-видимому, контролируется как продуктами углеводного обмена, так я продуктами ассимиляции Мн£.

3. разделение и очистка НАДФ - и НАД(Ф)-ГДГ

Установив оптимальные условия индукции ГЖ, мы перешли к ввделедаю ишцгсшруемойНн^ и конститутивной ГДГ. Для разделения 'этих ферментов была разработана следующая схема:

исходшл экстракт

эдтт

аГОАТ - элюи-рованшй 0,08М фосф.буф. 'рН 7,4 I

- надосадочиая жидкость после ПООООу. Высаливание (N11^)^50^, 35-65Й от полного шсщенияи обессоливание на сефадексе й -2Ъ.

Хроматография на ДЭАЭ-целлюлоэе, элш-рование фосфатным буфером рН 7,4 возрастающей концентрации, затем раствором ЙаС1 в 0,Ш фосфатном буфере возрастающей концентрации

ЗЛЮАТ - актированный 0,2ММаС1 в фосфатном буфере рН 7,4.

препарат НАДФ-ГДГ препарат НАД(Ф)-ГДГ

После хроматографии на колонке с ДЭАЭтЦеллюлозой степень очистки НАДФ-ГДГ составляет 10-15 раз при выходе Вьюалишние: (МН^дЙО^ до 9С$ с последующим обеесоливанием ва колонке с сефадексом О-25 приводит к увеличению удельной активности НАДФ-ГДГ в 3-4,5 раза, и следовательно, степень очистки увеличивается до 40-60 раз.

Результаты .разделения НАД(Ф)- я НАДФ-ГДГ представлены на рисунке 4.

- ТП _

ступенчатого злюировакия.

1,2,3 и 5 - элюированне соответственно 0,03; 0,05; ■ 0,О9 и 0,11.1 фосфатиш буфером рН 7,4 и

4,5,6 соответственно, 0,1; 0,2 и 0,ЗМЫаС1 в 0,Ш фосфатном буфере рН 7,4.

I - поглощение при 230 нм.

Глк годно из рис.4, а НЛД(®)-ГЖ легко разделяют-

ся на ДОЛЭ-целлюлозе. Препараты шиупнруемо!! и конститутивной ГЛГ хранились при -15° в веде оуспензии в ЭйЗ растворе (НН^)о^Од• По мере надобности норшш этих препаратов обессоливали на колонке с сефэдексом (* -25 и использовали для изучения кинетических свойств НЛД{Ф) и НАДщ-ГДГ в реакции аминирования и дезаминирования. Изучение юшетических свойств проводили при температуре 25° в 0,05М трис-Ш1 буфере при : оптимальных значениях рН, т.е. в реакции а-.шшроиакия-при рН а,2 для индуцируемой НАДО-ГДТ^ при 7,8 И 8,7-для ЩД(Ф)-ГДГ с [ВДФН И НАШ! соответственно. .Оптимальное значе|гпе рН : в реакции дезамикирования для обоих ферментов было одинаково ; и равнялось 8,7.

4. Определение молекулярной массн

Молекулярную массу ИГ определяли методой пельфильтраши через се<г>адекс Сг-2>Э0. результата определения молекулярной

Эу 3«: Зч зв зь -и

оФьем елюцж* Рис.5, график, иллюстрирувдий определение молв-. кулярной массы ГДР хлореллы.

[Летчики: I - НАД(Ф)-ГДГ из печени быка; * 2 - каталаза; -"3 - лактатдегвдрогеввза; ■ 4 - сывороточный альбумин; ¿в - индуцируемая 11АДФ-ГДГ; б - конститутивная НАД (й)-ПЕГ хлореллы.

Как можно видеть из рисунка 5« индуцируемая я аонсти-тутивяая ГДГ "имеют практически одинаковую молекулярную массу, ревную 320000.

- -

5. ¡йше-та'чдсккй СРО'^Т^П Г;,1' л ^.¡ЧИПТЮ^РИУЧ

а) %влслг.:ость -,кт"в;юст]Г Г/,Г от коI¡цекттif.auа

Рисунок в. Зависимость активности индуцируемой (Л) и конститутивной (Б) ГДГ от концентрами кофакторов. В - графики двойных обратных : величин»

Состав реакционной смеси для (А): 5- 1СГ%¿-иетоглютарат, 45 мкг белка, 8-Ю~2:.НА'н4)2нро, и КАДФ^Н в 0.05Ы трнс-1101 буфере рН 8,1. Для (Б): 8.10-^-кетоглютарат, 16,жгЩ?ри определении С НЛДН или 33,4 мдг белка при определении с 11АД0.И, кофактор и З.М-%1 )2НР04 в 0.05Н трис-11С1 буфере рК 8,7 или 8,1.

даруемой ГДГ для НАДФК^ 30 раз меньше, чем величина у конститутивной ГДГ для этого кофактора. Кроме того, ингабирование в случае индуцируемого фермента начинается 1ри более низких концентрациях НАД<Н& выражено значительно слабее.

6) Зависимость активности ГДГ от концентрация «¿-кетоглютарата Характер изменения активности ЮТ от концентрации =£-ке-'г тоглютарата представлен на рис.7.

Рис. 7. Зависимость активности индуцируемой (А) и кояститу-ТйвшЯ (Б) ГДГ от концентрации оС-кетоглютарета. В - графики двойных обратных величин. Г- трафик Хллла.

Состав реакционной смеси для (Л):«С~кетоглютарат, 3.10"% 11АДФП, 45 мкг белка и 8Л0~%(Ын4)^ НР04 э 0,0® тртс-НС1 буфере рН 8,1. Для (Б): #С-кетоглютарат, 10"% НАД11 и 23,1 мкг йелка (ттли 2,5.10"%НЛДФ1Г и 46,2 мкг (5елка) и 8-10" "М. (Н]14);,]ГР04 б 0,05М-Трис-Ш1 буфере рН 8,7 (или С,Г).

1Сак можно надеть из рисунка,активность НЛД(щ)-ГДГ с обоими кофакторами меняется по гиперболической кривей, в то время как характер изменения активности ГВДКГДГ носит более сложный характер. 3 случае, явдуцируемой НАЛ^Щ* при связывании оС-кетоглютарата наблюдается положительная кооперативноеть, на что указывают графики Лайвуивера-Берка (рис.7) и график Хлдла (рис.7г). кьэффиаиент кооперативное!и имеет, по крайней ыере,з значения: 1,й и 3,2. Индуцируемый фермент проявляет значительно большее сродство к <А, -кетоглютарату, по сравнению с конститутивным фехмеитом и очень быстро насыщается этим субстратом. Концентрация, пря которой происходит полное насыщение, находится в пределах 0,&-1,ЭЛ<г\{в отличее от I<Г% для конститутивной 1ДР. Кроме того, для индуцируемой ЕЕ Г при

- 17 -

концентрации оС -кетсглютарата вше 3-4.10 Л наблюдается ннгибирование, которое при 7 • Ю~ М составляет ЗОЙ.

в) Зависимость активности ГДГ от конлентращи

Зависимость нггивлости индуцируемой ГДГ от зсовделтрашш (Н н4)2 цро4 тлеет еще более слояни» характер. Это наглядно :шд5ю из рисунка 3.

Рис.8. Зависимость активности индуцируемой (А) и конститутивной (Б) ГДГ от концентрация (Мн^зНР^* В - графики двойяих обратных величии.

ш

3 Состав реакционной адеси ^

0 для (А): (*!Г4)2НР04, 4.Хо" ь И вС-кетоглютарат, 63,3 мкг т белка, З.КГ4!! ИАД<Шв 0,05 8 М трис -1ГС1 буфере рН 8,1. « Для,(Б): (М Н4Ы1Р04, 8-

й • I СГ'^М тоглютарат, КГ4 £ 1Л НАДН, 2,5.10"*% 11АДФН, Е 16,2 мкт белка при опре-Я делеиии о 11АДН или 32,4 ша й белка при определении с

1 НАДФН в 0,03.1 трис-НС1 буфере рН 8,7 или 8.1.

График двойнях обратных величин к график Хилла предполагают наличие участка с отрицательной и положительной кооператвг-

Рис.9, График Хилла для зависимости индуцируемой (I) и конститутивной ГДГ от концентрации (К|Н4)2НР04-

При низких концентрациях {^Кд^НРО^ коэффициент хоопера-тигкости равен 0,48, а при высоких - 1,4. В отличие от индуцируемой, активность конститутивной 1ДГ с обоими кофакторами меняется по подобным 3 -образным кривым. Коэффициент кооперативное ти не выражается определенной величиной, а пдашо меняется по хода кривой (9).

Таким образом, полученные данные показывают, что НЛДЬ-и НАД(Ф) ^»ГДГ в реакции восстановительного акинироваякя

-кетоглютарата по своим свойствам резко отличаются •Единственное сходство их состоит в том, что они имеют практически одинаковую молекулярную массу. Следует отметить, что кинетические свойства индуцируемся НАДФ-ГДГ при катализе реакции восстановительного аминкрования <=<?-кетоглютарата являются необычным:!, по сравнению сс свойствами ГДГ из других источников. Например, по отношению ж * -кетогяютарату кооперативное ть проявляла только КАД-ГДГ из ростков и корней гороха, притом при использовании в качестве мн^С1 /с (Ш^^С^

кинетика была нормальной/, а для ШД(Ф)-ГДГ из печени животных кооперативность наблюдалась только в щелочной среде при рН 9,0. С СЬярреИе еЬ а1., 1972 ).

По отношению к нн£ ГДГ иа других источников не проявляла кооперативности. Единственный исключением является ШДО-ГДГ иа дрожжей, для которой наблюдали отрицательную »©оперативность. (. Роигсайв , 1968). Однако явление, наблкдаемое нами для индуцируемой НАДФ-ГДГ хлореллы, не является уникальным вообще. По мнению Кошленда ( еЪ а!. , 1969» 1 вЪ а!»,1969.),

такое явление можно обнаружить при определенных условиях, вероятно, для всех олигомерных ферментов, обладающих двумя или более центрами связывания лигачда и проявляющих конфорыацион-ные изменения, индуцируемые связыванием молекулы яиганда.

6, Кинетические свойства НДД&- и НАД1Ф)-ГДГ в

реакции дезаминирования Ь -глютамата а) Зависимость активности от концентрации субстратов

В реакции дезаминкрования конститутивная НАД (Ф)-ГДГ подчиняется уравнению Мюсаэлиса-Мзнтен. для НАД* = 1,43*10й4. а для ь-глютамата = 5«10~%. Следует отметить, "то НАД(IV-ГДГ практически не осуществляла дезаминирование с Так, если

ота скотче скоростей аминкрования с НАДН и НАДШ равно 3, то

скорость дезааинировакия с НАД'*' в 25-30 раз меньше скорости деьаыинироеания о КАДФ+. ^

Для индуцируемой НАДФ-ГДГ» ничего нельзя сказать о характере зависимости начальной скорости дезаминирования от концентрации НАД£+ и Ь -глютамата, поскольку скорость возрастала во времени, т.е. 5ериент активировался. Зависимость стационарной скорости, т.е. скорости после полной активации НАДФ-ГДГ, от концентрации субстратов имеет гиперболичебкий характер, для НАДО = 1,2-Ю~5Ы, для -ь-глютамата - 1,1*10~гМ.

С) Активация НАДФ-ГДГ под влиянием ь-глютамата и КАДФН

Как ухе было отмечено в ¡лье, для индуцируемой НАДФ-ГДГ в реакции дезаминирования ваблсдалось явлений, которое не обнаруживалось в реакции аминирования. ото - возрастание начальной скорости реакции во времени. Для конститутивной НАД(Ф)-ГДГ такое явление не наблвдалось. На рис. 10 представлена кривые зависимости скорости реакции дезаминирования от времени, записанные на спектрофотометре ЗР-700.

центрашги субстратов насыщающие.

I - ход реакции в присутствии ЯАДЬН 2,3 и 4 - начало реакции осуществлялось добавлением в последнею очередь НАДГ+, ^ -глк-тамата и фермента, соответственно. 5 - тфк, ЧТО 4; ВО при 1Ш 8.2 , ~ время ускорения, мин.

Как видео из рпс.ГО,^емя ускорения ( 2" ) не является постоянной величиной я зависит от порядка добавления субстратов ■ и значения рЩрвс.Ю). При добавлении в последнюю очередь Ь -глшашта и фермента. а тажхе при уменьшения рн уве-

жчивается, Во всех указаккнх на рксунка случаях .лаксишльная скорость, т.е. скорость на стационарно« участке, остается постоянной. В присутствия ШДОН ускорение или отсутствует пол-кость», или происходят в течение нескольких секунд. Активируй шее' влияние НШН на деззминирование без снижения максимальной скорости свидетельствует о том, что дм его связывания на молекуле фермента поится аадйстеричесхие центры. Об аклостерической природе действия НАД® свидетельствует также ^акт, что НАДК1 совершенно одинаково защищает как амини-ров&ние, так и деваминирование от сильного цнгибированмя н-хлорнераурибензоатом. (си. стр. 24 ).

2* значительно уменьшается также 1фа црединкубации фермента.с Ь -глюташтом -N0. (табл.3)

Таблица3

Влияние предиввубашш НАДФ-ГЛГ с и -глютаматом-Са на время ускорения реакции деввмшщрования ■

время арединкуба- | ции, мин. | -г- время ускорения } С* »мин. ; макеймальная скорость ЛА/мин.

0 0,73 0,155

I 0,60 0,160

3 0,30 0,155

5 0,10 0,150

Таким образом^из полученных данных можно сказать, что под влиянием Ъ -глютяыата и НАДФН происходит активация КАДФ-ГДГ, причем в присутстыга глютамата процесс идет относительно медленно, а под влиянием НАДФК - очень быстро. Активация НАДФ-ГЯГ, вероятно,осуществляется за счет конформационного переходе от неактивной или малоактивной формы в активную.

Следует отметать, что в присутствии НАДО* как продукта реакции при актировании также ваблцдается возрастание начальное скорости реакции. Кроме того, происходит ингибировеяже. С уве-. личением концентрации ШД*|+ время ускорения и степень ингиби-рования возрастают. Действие НАДО+ зависит от его порядка добавления в реакционную смесь. Если НАДО* добавляется после НАЛФН, время ускорения уменьшается. С другой стороны, степень ингибирования не зависит от порядка добавления НАДО*. Вероятно, НАДО* может также связываться аа адлостерических пентрах, аа которых связывается НАДОН как активатор, и способствовать поддержанию неактивной формы фермента. Таким образом, НАДФН и НААФ1" является адлостериЧе сышл эффекторами противоположного действия.

7. Действие п-хдормеркурибекзоата на НАДО- я НАД(Ф)-ГДГ ■

Для выяснения вопроса о величия £Н-групп на молекуле НАДО- и НАД(Ф)-ПЕГ uei изучил» поведение обоих ферментов по отношении к п-хлормеркурибензоату (д-ХМБ) s реакции амнни-рованмя и дезаминирования, а также защитное действие субстратов.

Таблица 4

Влияние п-ХМБ на скорость реакции аиширования и дезаминирования,катализируемых индуиируеиой^Ш№-1ЖГ

концентрация п-2МЕ,М*10° двгибивование. %

' - аминир. pH 8.2 дезамия. рЦ

О 0 0

1.8 - 6,5

3,5 - 53,3

5,3 - 73,3

7,1 28,5 86.7

8,8 54,7 92,6

10,6 t 64,3 98.7

12,4 71,4 : 100

Как видно из таблЛ, п-ХМЕ сильно ингибируе^ НАДФ-ГДГ, причем дезаминированиевнгибируется значительно сильнее, чем *'аминироьание. Однако, если определять действие п-ХМБ на аш-ниротание при том же рН, что и на деааминирование, то степень ингибирования обеих реакция оказываетсяодишковоЯ (табл.5). Значительно меньшее ингибирование а минирования при рН 8,2 объясняется или меньшей реакционное.способностью ¿"Н-групл ^ при этом рН(8,2), или их меньшей доступностью,■ что наиболее вероятно. Из всех субстратов и кофакторов заштное действие оказывает только 11АДФ, причем как-окисленная, так в восстановительная формы (табл.5). ... ,.

Таблица 5

1г1нгибяроБание -тандуцнруемой НАДи-1Ж п-ХМБ при рН 8,7 и защитное действие субстратов

Субстрат, присут. при прединкуба-гош

- 0 0 0

- 2 42,0 40,0

- 3 72,0 64,0

- 4 85,0 76,0

■ * 5 91,0 86,0

-глютамат 4 77.0 66,0

еС -кетоглютарат 4 73,0 - '

(НН4)2НРО4 4 70,0 -

НАДФН 4 6,0 10,0

НАД£+ 4 - 8,0

НАДИ 4 80,0 76,0

концентра-' ингибирование, %

аминмров. дезаминиров.

х) концентрации субстратов бнли насацапцини.

Степень защиты амшнфования и деэаминирования НАД£Н одинакова и составляет практически 100^. Этот факт указывает на то, что п-ХМБ реагирует на том же центре, где связывается НАДФН как аллостерический активатор. Следовательно,5Н-группы играют важную роль в активирующем хонформашюнном переходе. Если бй действие п-ШБ осуществлялось на каталитическом цент- ■ ре, то защитный аффект НАДШ был бы,по-видимому,односторонним.

В отличие от индуцируемой НАДФ-ГДГ. конститутивная НАД(Ф)--ЩГ иягибируется п-ХМВ значительно слабее. Даже при высоких концентрациях п-ШВ а минирование как с НАДН, так и с 11АДФ1Г икгибируется лит. незначительно. Однако, дезаминирование с НАД*- подавляется сильнее, по сравнению с аиинированием, причем при одном и том же рН. Кофактор и I» -глютаматЧУа не оказывала защитного действия ни в том, ни в другом случае (табл.53 Одностороннее действие п-ХМБ на конститутивную ГДГ остается непонятным, равно как неясны и другие случаи однонаправленного действия различных метаболитов на ферменты, например, на ИАД-1ДГ ¡¡Ыш 1968). Однонаправленное

действие п-ХМБ можно объяснить, если предположить, что участки аминирования и дезаданировання разграничены на молекуле фермента, и что только в дезаминигроъании существенную роль играют 5 Н-грушш.

Таблица £в

Ингибирование п-ШЕ конститутивной ЕАД(Ф)-1ЯГ и защитное действие субстратов

¿уЬЬтра^, и*® еоиоование. %- -

присут. при ЙЙ5- амиШро вание дез< шинирование , ЩЦ1+ ■

предикку-баютг рй "ОН 8.7 бН.8.7

— 0,06 0 0 12,5

- 0,147 0 0 30,0

- 0,3 0 0 37,5

- 0,6 0 0 50.0

0,9 - - 69,0

— 1.47 - — 86,0

- 2,38 23 22 100

1» -глмаиат НАГ 1,47 1,47 65,0 84,0

8. Влияние продуктов реакции на аминирование и дезаминированве НАДО- я НАДОМ-ЦГ

Какова физиологическая роль индуцируемой и конститутивной ЩГ в клетках хлореллы? Для шяснения этого вопроса ш исследовали влияние продуктов реакции на скорость реакции аминиро-ваиияи дезаминирования обоих ферментов, поскольку известно, что направленность двухсторонней ферментативной реакции могет определяться соотношение* концентрации субстратов и продуктов реакции. Из табл.5 видно, что еС -кетоглютарат иМн£

§ Таблица е

Влияние продуктов реакции на активность индуцируемой НШ -ЕЕГ

продукт концентрация, М иншбировавие, %

аминирование дезаминиров.

НАДФК Ю-4 2, Б «Ю-4 5.1а-4 - +15 +8 14

(№4)2НР04 Ю-3 Ю-® 5-Ю**2 50 85 _эз,а _.

оС -кетоглвтарат Ю"3 2,5*10 5'Ю-3 15,5 31,0 52,3

^ -глр^анат ю-1 ___£5______ -Г

1ОДН 5-Ю"4 15 —

значительно ингибвруют дезаминирование индуцируемой ИШ^-ГДГ, б то же гремя Ь -глютамат практически не оказывает влаяижя даже в концентрации Ю-1 М. У конститутивной Г£Г N Н^.Л-ке-тоглютарат и НДД(Ф)Н в значительной степени ингиОируют реакцию деэамширования 1 тае>л.7). L -глютамат незначительно ингибиру-ет аминпрование,причем с НДДН это действие проявляется сильнее чем с НАД'Й!. 1IAJT сильно подавляет скорость а минировании как с HAJffl, так и с НАДФН, причем с HAJMH степень ингибированпя гораздо выше. НАДФ+ практически не оказывал влияния на скорость аминирования с обоими кофакторами.

Полученные данные могут свидетельствовать о том, что индуцируемая НАДО-ГДГ., главным образомлфункционирует как синтетический фермент, что полностью согласуется с тем фактом, что она индуцируется в ответ на субстрат (NH^) и исчезает при удалении индуктора.

Взаимоотношения между ШЦЫ>+ Ш НАД'Ш при их связывании носят сложный характер, поскольку для НАД'Ш, как активатора фермента, определенно есть аллостерические центры связывания, и на них,вероятно,может также связываться .

В отношении конститутивной НДД9-ЖГ трудно сказать что либо определенное о ее функциональных особенностях на основе данных по влиянию продуктов реакции. Основываясь ira определенных косвенных данных мы предполагаем, что in- vivo этот , фермент осг'цествляет как синтез, так и распад глотаминовой, кислоты. Для гацт^зг! иг-лодъауется НАЛ®, а для дезаминирова-ния-НАД*". Активность с НАДН, возможно,не имеет физиологического значения. Цри таком функционировании конститутивной ÎKT следовало бы быть локализованной на мембране митохондрий. Однако,проверить это невозможно, т.к. не удается разрушить клетки хлореллы и сохранить неразрушенными органеллы.

Таблица 7

2аюагаэ продуктов реакции на активность конститутивной НАД(Ф)-ГДГ

продукт концентра- ивтибировонв е, . К

ция, M амшированае дезааднирован.

сЖШ" с КАДФН с НАД+

НАДЙ1 2.5-КГ4 - — 0

5,0.1<Г4 - — ■ 30,0

7,5-Ю"4 _ _ 70,0

КГ3 - - 100

НАЛН 1(Г* - _ 40,0

Й-Ю"4 - - 5S.4

5-иг4 - - 86,0

оС -кетоглюгарат 2-10"^ - — 47,5

5'Ю"3 - - 50,0

ХО"2 - - 58,4

(tfí^JgHPC^ IÖ-3 _ — 28,0

2'Ю"2 — 40,0

5'КГ2 - — 44,5 .

ю-1 - - 72.0

Ь -глютамат 5.I0-2 26,5 2,7

IQ"1 30,0 - -

2.IV* 17,5 32,5 _

НАД4" 5*10"^ 32,5 57,0 -

44,0 75,7 -

2. КГ3 59,0 - . -

2-ГО-4 5,9

Ю-3 14,8 — 10

2-I0"3 23,5 - 10

~ 29 ' Тепловая инактивация и ШД(&)-1Ж

Для дальнейшего срашекия ПК* ни изучили тепловую инактивацию ШДО- и ШЛ(Ф)-£ЦР и защитное действие субстратов.

Таблица 8

Тепловая инактивация икдуцируемоЯ НДДМЗЕГ и защитное действие субстратов

субстрат, оставшаяся активность, %

првсут. при жийЯроеание , дезаминпровоние

ЦРСГРвВ* ист. 40° 50° 60° 70° 75° 80° исх. 40° 60° 70°75°80о

без субст. 100 94 97 47 0 0 0 100 100 53 0 0 0

Ь-глщ-атт 100 03 92 72 94 94 0 100 100 310 320 300 0

«С-нетоглют. 100 78 89 75 0 0 — — — — — _ _

ВШИ 100 81 32 0 0 0

нш+ - — - — - - ' ■ — 100 - 48 - - С

Для этой целя фер**ент прогревали б кювете при определенноЗ теш« ратуре в теяетае 5,минут в присутствии и отсутствии сусстратов, затек быстро охлаждали я добавил» буфер. недостагаие субстраты я измеряли скорость. В отсутствия субстратов индуцируедая Н4Д6-ПСГ инактивируется ¡фактически полностью при прогревании при температуре ш 60° Чтабл.З), N,«С-кетоглютарат и особенно 1> -гдгташт эффективно защищают фермент от тешгоюй инактивации. В присутствии -глютатта врогревание даже при 75° не приводило к инактивации, и иаоборо^присутствие глюгаиата приводило всегда к незначительном? (10-20^) увеличению скорости дезаминироваяия. Вероятно, это связано с акт ивяр ушам действием Ц -глюташта ш НАДФ-ГЕГ.

Из этого (ложно таидё сделать.что. активирующее действие ^ -гл юта мата происходит лря^'еГо связывании, вероятно, на активном центре. Комплекс фермект-глютамат оказывается термостабильным, в отличие от свободного фермента. В противоположность -глютамату, -кетоглютарату и К ИДДФН способствовал инактивации. В его присутствии фермент быстро терял активность даже при 45-50°, причем аминирупцая активность страдала больше, чем дезашпируюцая (табл.8). Действие НАДШ было специфичным, поскольку НАД11 не оказывал аналогичного эффекта. ■ , •

Конститутивная НАД1*>)-ГДГ, но сравнению с индуцируемой ЛАДФ-ГДГ,проявляла высокую термостабильность. Инактивация КАДЫ-Гет начинается после 75°. Ни один из субстратов не защищал полностью конститутивный фермент.- ЙАД(Ф)Н>как и в' случае индуцируемой ГДГ,способствовали-инактивации конститутивного фермента, однако гораздо в меньшей степени. Следует отметить, что инактищрупцее действие НАД(Ф)Н на дегидрогена-'з* и,в частности не ИГ,—явление-известное. Механизм инактивации детально, изучался на примере фоофоглицеральдегиддегид-рогеназы ( а^. , 1964 2- В случае НАДФ-Ш1

хлореллы инактивирующее действие НАНФН., по-видимому, связано с . тем, что под его влиянием как аллостерического активатора, фермент переходит в активное состояние; которое оказывается, очень термолабильным. Что касается конститутивной ЙАД(^)-ГДГ> то этот вопрос остается неясным.

выводи

1» Установлено« что у хлореллы шщукция НАДО-ГДГ под влиянием аммония стимулируется светом. Независимо от исходного состояния клеток, свет усиливает синтез фермента на 60$.

2. В присутствии глюкозы происходит репрессия синтеза НАДФ-ЩГ.

3. На среда с N но яе с N Од, под влиянием глюкозы индуцируется НАДФ-ГДГ, обладающая наименьшей активностью и электрофоре тическоИ подвижностью. Синтез этого фермента контролируется, по-видимому, каким-то метаболитом, уровень которого зависит от соотношения продуктов гликолиза и ассимиляции

N 4$.

4» Разработана схема разделения и очистки индуцируемой под влиянием ионов аммония НАДФ-ТЩГ и конститутивной НАД(Ф)--ГДГ,

б.Сшпользованием очищенных в 100-150 .раз препаратов проведено сравнительное изучение кинетических и'физикозсимических свойств этих ферментов. Практически по всем свойствам индуцируемая и конститутивная ГИГ различаются между собой.

6. Кинетическое поведение I5tT хлореллы отличается от поведения 1ДГ яз других источников.

7. Анализ кинетических данных позволил установить: а) индуцируемый фермент существует в двух формах^ активной а неактивной (или малоактивной); переход неактивной^ формыъ активную осуществляется бистро под влиянием ШДФН и медленно -под влиянием Li -глютадата;

б) действие НАДФН,как активатора,имеет аллостерическую природу;

в) переход в активное состояние осуществляется за счет конфоршционных изменений, существенную роль в которых играет Sh^m.

8, £анныэ о влиянии продуктов реакции доказали, что индуцируемая ью- у^уо ' функционирует как синтетический фермент. Конститутивная ПЕГ, тто-видамому, выполняет как синтетическую, ток и биодеградатнвную Функцию.

Список райот^ опубликованных по материалам диссертации

1. 0.Р.Шатилов, Р.В.Ванкова, В.Г.Амбарцумян, В.Л.Кретович. 1972. Индукция нового изофермента глютаматдегидрогеназы в клетках хлореллы под влияниеи глюкозы. ДАН СССР, 207, И 2, 476.

2. В.Р.Шатилов, В.Г.Амбарцумян, В.Л.Кретович. 1972. Индуцируемая в присутствии ионов аммония НАДО-специфгсческая глюта-иатдегкдрогенаэа хлореллы. ДАН СССР. 207. Й 5, 1220.

3. Р.В.Ванкова, В.Р.Шатилов, В.Г.Амбарцумян, В.Л.Кретович, 1972. Влияние света на индукцию, аммонием НАДФ-гдтаматдегид-рогеназы хлореллы. ДАН СССР, 210* ,'*» Т, 2?Я.

1. В.Р.Шатилов, В.Г.Амбарцумян, В.Л.Кретовпч. 1974 г. Свойства индуцируемой ионами аммония НАД*?-специфичной глютаматдегидрогеназы хлореллы. Биохимия (в печати).

5. В.Р.Шатилов, В.Г.Амбарцумян, М.А.Каспарова, В.Л.Крето-вич. 1974. Активация глютаматом и ИАД*?*Н специфичной к НАД«

глютаматдегидрогеназы хлореллы. ДАН Св печати).

6. В.Р.Шатилов, В.Г.Амбарцумян, М.А.Каспарова, Б.Л.Крстршч Влияние пара-хлормеркурибензоата на глютаматдегидрогеназы хлореллы. ДАН, (в печати).

7. В.Р.Шатилов, М.А.Каспарова, В.Г.Амбарцумян, В.Л.Крето-вич. Сравнительное изучение глютаматдегидрогеназ хлореллы. Биохимия. (в печати).

Результаты исследований были доложены:

-I. На 6-й конференции <ЖБ0 (Амстердам, август 1972).

2. На Всесоюзной конференции по регуляции биохимических процессов у микроорганизмов (Пущино, декабрь 1972 г.)

3. На 3-ем Всесоюзном совещании по управляемому биосинтезу та биофизике популяций (Красноярск, ишь 1973).

Ф.ПЛ.-Д&Г тиражей? Типография ХЭЗУ Миннефтелромя. Зак.¿Aï>i