Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метаболитная регуляция первичных процессов фотосинтеза

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Метаболитная регуляция первичных процессов фотосинтеза"

РГб 0я 2 7 ЯНЧ <

На правах рукописи УДК 581.174.4

ЧЕМЕРИС Юрий Константинович

МЕТАБОЛИТНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ПЕРВИЧНЫХ ПРОЦЕССОВ ФОТОСИНТЕЗА

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 1997

Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор, чяен-коррсслондсягг РАН Рубин А. Б.

Официальные оппоненты;

доктор биологических наук Ладыгин В. Г.

доктор биологических наук Цоглин Л. Н.

доктор физико-математических наук, профессор Борисов А. Ю.

Ведущая организация; Институт биохимии им. А Н.Баха РАН

Защита состоится февраля 1997 г. в 15 час 30 мин на заседании Диссертационного Совета Д.053.05.53 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119&99 Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет (ЛИК).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан " (> " января 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор биологических наук профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Важной проблемой экологической биофизики является изучение механизмов адаптации живых организмов к изменяющимся факторам внешней среды. Широкие адаптационные возможности растений обусловлены не только высокой пластичностью темнового метаболизма, но и способностью регулировать такой жзненно важный для растительных организмов процесс, как фотосинтез. К настоящему времени достигнуты существенные успехи в исследовании молекулярных механизмов первичных реакций фотосинтеза и структурной организации тилакоидных мембран в хлоропластах, обеспечивающих высокую эффективность первичных реакций фотосинтеза. Долгое время существовала точка зрения, согласно которой регуляция этих процессов со стороны целого растения не является необходимой в оптимальных условиях. Однако, тот фага1, что в первичных процессах фотосинтеза, особенно при повышенной интенсивности света, образуются сильные восстановители и окислители, избыток которых может вызвать деструктивные процессы в клеточных мембранах и органеллах, указывает на необходимость согласования в клетке скоростей образования и расходования этих продуктов. В свою очередь это предполагает наличие специальных механизмов регуляции первичных процессов фотосинтеза в нормальных физиологических условиях.

Как правило, при изучении механизмов регуляции первичных реакций фотосинтеза основное внимание уделялось исследованию тех факторов внешней среды, которые прямо влияют на фогосингетический аппарат. В частности, при изменении интенсивности или спектрального состава света регуляция осуществляется путем структурной перестройки тияакондных мембран, а также изменения состава и соотношения светособирающих и электрон-транспортных комплексов, т.е. за счет

биосинтеза структурных белков. Вместе с тем, целый ряд экспериментальных данных (Сшсненхо, 1978; УепесШот, 1989; Кренделева, 1994) показывает, что структурно-функциональная организация фотосинтетических мембран находится под контролем продуктов клеточного метаболизма. Необходимость метабогппного контроля первичных процессов фотосинтеза обусловлена тем, что потребности клетки в продуктах фотосинтеза в значительной степени зависят от ее физиологического состояния, изменяющегося как в процессе роста и развития растений, так и под действием внешних факторов. Молекулярные механизмы такого рода эндогенной метаболитной регуляции активности фогосинтетических мембран и электрон-транспортных комплексов изучены недостаточно.

Изучение внутриклеточных механизмов, лежащих в основе метабсшитной регуляции активности фогосинтетических мембран, имеет существенное значение для понимания фотосинтеза как важнейшего физиологического процесса, а также расширяет возможности целенаправленного воздействия на фотосинтетические реакции при создании промышленных бштехнологических систем.

Цель и задачи исследования. Основная цель настоящей работы заключалась в изучении природы внутриклеточных регуляторных механизмов, обеспечивающих адаптационную перестройку структурной и функциональной организации тилакоидных мембран хлоропластов при изменениях скорости и направленности темпового метаболизма одноклеточных водорослей. Потребности темнового метаболизма клетки в продуктах световых реакций фотосинтеза изменяются не только под воздействием внешних факторов, но и при постоянных условиях роста в процессе развития клетки. В связи с этим в конкретные экспериментальные задачи входило:

- исследовать эндогенную регуляцию формирования фого-синтетического аппарата одноклеточной зеленой водоросли хлореллы в течение цикла деления клеток;

- для выявления взаимосвязи между темновым метаболизмом клетки и активностью первичных процессов фотосинтеза изучить изменении состояния фогтосинтетическото аппарата при внешних воздействиях, влияющих на скорость и направленность темпового метаболизма растительной клетки (обеспеченность минеральным питанием, гетеротрофные условия роста, тепловой шок);

- выявить и изучить процессы, лежащие в основе механизмов метаболитного контроля фогосюттстической активности клетки.

Научная новизна. В результате изучения формирования фотосинтетического аппарата в синхронной культуре хлореллы, установлено, что регуляция активности мембран хлорошгастов, направленная на оптимизацию энергообеспечения процессов роста и воспроизведения клетки в се онтогенезе, основана на однократном, поочередном синтезе и включении отдельных энертопреобразующих комплексов в тшгакоидную мембрану на различных стадиях клеточного цикла.

Впервые экспериментально доказано наличие эндогенной регуляции активности первичных реакций фотосинтеза в клепках хлореллы, а также выявлен один из механизмов метаболитного контроля структурно-функциональной организации фотосинтетического аппарата, связанный с активацией хлороплаетного дыхания.

Впервые доказано, что обратимая инактивация реакционных центров фотосистемы II, предшествующая разборке фотосинтетического аппарата при лимитировании скорости роста водоросли минеральным питанием, носит адаптационный характер. Аналогичная инактивация, приводящая к накоплению РЦ ФС II, неспособных к фотохимическому тушению энергии возбуждения антснны, обнаружена и при гетеротрофном росте водоросли. Этот факт, а также результаты исследования влияния ингибиторов фотосинтеза и гликолиза на активность ФС П, позволили установить,

что инактивация фотосистемы II инициируется накоплением в хлоропласте продуктов углеводной природы. Она является проявлением действия механизма метаболишой регуляции, направленной на согласование скорости образования продуктов световых реакций фотосинтеза с энергетическими потребностями клеточного метаболизма.

Впервые в целых клетках водоросли показано, что ускорение синтеза углеводных метаболитов при дефиците азота сопровождается увеличением вклада циклического транспорта электронов в энергизацию мембран тилакоидов.

Обнаружено, что при действии теплового шока в отсутствие освещения инактивация ФС II обусловлена двумя процессами. Первый связан с изменением темнового метаболизма клетки и инициируется появлением в хлоропласте промежуточных продуктов углеводного метаболизма при температурнозашеимом ускорении распада запасных углеводов. В результате этого процесса РЦ ФС II теряют способность к фотохимическому тушению энергии возбуждения, также как это наблюдается при дефиците минерального питания или гетеротрофном росте. Второй процесс отражает необратимую деструкцию ФС П при повышенных температурах, приводящую к усилению безизлучательной диссипации энергии возбуждения в реакционных центрах.

Впервые обнаружено, что центральную роль в механизме метаболишой регуляции активности ФС П играет активация хлоропластного дыхания, т.е. усиление потока электронов от НАД(Ф)Н на кислород через пластохинон при накоплении в хлоропласте продуктов углеводного метаболизма. Взаимодействие восстановленного плаегтохинона с первичным хинонным акцептором (Оа) приводит к инактивации ФС П, связанной с потерей способности РЦ ФС П к фотохимическому тушению энергии возбуждения антенны.

Научная и практическая значимость работы. Установлешше в работе закономерности регуляции активности и состава тилакоидных мембран в зависимости от изменения физиологического состояния клеток водоросли раскрывают картину взаимодействия первичных процессов фотосинтеза с процессами метаболизма в целой клетке. Эти закономерности позволяют провести углубленный анализ природы молекулярных механизмов метаб слитной регуляции первичных процессе® фотосинтеза. Полученные экспериментальные результаты и обобщения вносят существенный вклад в исследование механизмов адаптации и устойчивости фотосинтезирукяцих организмов к условиям среды обитания.

Выявленные закономерности в реакции фотосинтетического аппарата на внешние воздействия использованы для разработки методов диагностики состояния фоггоситетического аппарата растений и природного фитопланктона, а также дан выявления его повреждений под действием неблагоприятных факторов среды и при антропогенных воздействиях. Полученные результаты могут быть использованы при разработке методов оптимизации и управления биосинтезом микроводорослей при использовании их в качестве продуцентов ряда ценных метаболитов в промышленных масштабах.

Ряд научных положений, обоснованных в работе, используется в курсах лекций и практикумах по биофизике для студентов и аспирантов кафедры биофизики Биологического факультета МГУ.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на Ш Всесоюзной конференции по фотоэнергетике растений, Алма-Ата, 1974; Всесоюзном биофизическом съезде, Москва, 1982; Международной конференции по биоконверсии солнечной энергии, Пущино, 1983; Всесоюзном совещании по лимнологии горных водоемов, Севан, 1984; Всесоюзной конференции по изменчивости пигментного аппарата и направленности первичных процессов фотосинтеза в зависимости от

факторов среды, Чернигов, 1985; V Всесоюзном биохимическом съезде, Киев, 1986; Всесоюзной конференции по первичным процессам фотосинтеза и механизмам их регуляции, Ужгород, 1988; I Всесоюзном съезде физиологов растений, Минск, 1990; Конференции стран СНГ по структурно функциональной организации фотосинтетических мембран и их моделей, Пущино, 1993; XI Международном биофизическом конгрессе, Будапешт, 1993; Ежегодном симпозиуме ОФР "Физико-химические основы физиологии растений", Пенза, 1996; Международной конференции "Биоэнергетика фотосинтеза", Пущино, 1996.

Основные результаты доложены и обсуждены на специализированном научном семинаре в Московском государственном университете.

Объект и мргояы исследования. Одноклеточные водоросли обладают уникальной способностью изменять направленность метаболизма при различных воздействиях. Данная особенность, наряду с легко реализуемой, по сравнению с высшими растениями, возможностью культивирования микроводорослей в полностью контролируемых условиях, делает их удобной модельной системой для изучения проблем адаптации и эндогенной регуляции фотосингетического аппарата. Основные закономерности внутриклеточной регуляции фотосинтетических процессов у одноклеточных водорослей, могут быть спроецированы, с учетом надклегсчных уровней регуляции, и на изменение активности первичных реакций фотосинтеза в хлорошгастах высших растений. Это определило выбор в качестве основного объекта исследования одноклеточной зеленой водоросли СЫотеЛа ругепсабова.

Для изучения роста водорослей в строго контролируемых условиях выращивания был разработан и сконструирован оригинальный культиватор, снабженный рядом проточных датчиков и програмируемым управляющим устройством. Данная система

позволяла вести непрерывный контроль за условиями культивирования и автоматически, каждые 30 мин, регистрировать изменения состояния фотосинтетического аппарата целых клеток хлореллы непосредственно в условиях культивирования путем измерения миллисекундной и долгоживущей замедлешгой флуоресценции хлорофилла (ЗФ). Эндогенную регуляцию состояния фотосинтетического аппарата исследовали в синхронной культуре хлореллы, которую получали методом чередования световых и темновых периодов культивирования. В полученной таким образом синхронной культуре разброс клеток по возрастам, измеряемый по продолжительности периода увеличения числа клеток, составлял 2,5 часа и соответствовал продолжительности периода возрастания числа многоядерных клеток в середине цикла развития водоросли.

При исследовании влияния дефицита минерального питания культуру хлореллы, находящуюся в экспоненциальной фазе роста, отмывали центрифугированием от минеральной среды Тамия и помещали на ту же среду, не содержащую азота или фосфора.

Гетеротрофные условия роста создавали путем переноса выращенной на свету культуры в темноту и внесения в минеральную среду 0,5% глюкозы.

Хлоропласт! юе дыхание измеряли по амплитуде медленного амперметрического сигнала после освещения короткой вспышкой света насыщающей интенсивности адаптированных к темноте клеток водоросли, находящихся на поверхности открытого платинового электрода. Увеличение концентрации кислорода вблизи электрода в этом случае связано не с фотосшггетическим выделением кислорода, а с обратимым подавлением хлоропластного дыхания за счет фоюиндуцированного оттока электронов из дыхательной в фотосинтетическую электрон-транспоргшую цепь через общий для двух цепей пул пластохинона (Peltier, 1987).

Кроме того, для характеристики состава и функциональной активности фотосинтетического аппарата использовали широкий набор спектральных и спектрально-динамических методов: абсорбционная, флуоресцентная, производная и дифференциальная спектроскопия, поляризационная флуоресценция, пикосекундная импульсная флуоресцентная спектроскопия. Были использованы методы измерения переменной флуоресценции, методы ЭПР и полярографический метод определения кислородного обмена при импульсным и постоянном освещении клеток.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Эндогашая регуляция функционального состояния фото синтетического аппарата в клетках хлореллы

Для выявления процессов эндогенной регуляции функционального состояния хлоропластов необходимо, чтобы изменения состава и активности фогосинтетического аппарата (ФА) происходили в условиях, полностью исключающих влияние внешних факторов среды на фотосинтез и общий метаболизм клетки. Наиболее полно этим требованиям отвечает процесс формирования ФА в течение индивидуального цикла развития клетки водоросли, В этом случае, при постоянных и оптимальных условиях для развития водоросли, все изменения состояния ФА обусловлены изменением физиологического состояния водоросли в результате прохождения последовательных стадий клеточного цикла.

Клепочный цикл водоросли завершается делением материнской клетки на 4 автоспоры, каждая из которых идентична исходной. В ходе развития клетки хлореллы от авгоспоры до материнской клетки, содержание фогосинтетических мембран также возрастает в 4 раза. Оставалось, однако, неясным, в какой степени изменяется структурно-функциональная организация ФА в цикле развития водоросли.

Ниже приведены результаты исследования первичных реакций фотосинтеза в синхронной культуре хлореллы, показывающие, что состав и активность ФА значительно изменяются в течение клеточного цикла.

При периодическом освещении синхронной культуры хлореллы фотосингетическач активность клеток (скорость фото-индуцированного выделения кислорода) возрастала в четыре раза в течение первых 2,5 часов светового периода, после чего оставалась постоянной до начала следующего светового периода (Рис. 1). На постоянном свету, то есть в условиях, исключающих влияние синхронизирующего воздействия на состояние ФА, деление клеток у предварительно синхронизированной культуры сопровождалось ступенчатым возрастанием фагоситетической активности сразу после выхода автоспор. Очевидно, изменение фотосшттетической активности, происходящее одновременно с выходом автоспор, регулируется светом и связано с однократным включением в состав ФА (или активацией) компонента, лимитирующего скорость фотосинтеза.

Автоматическая регистрация ЗФ непосредственно в условиях культивирования позволила установить, что миллисекундаая ЗФ, также как и скорость фотосинтеза, скачкообразно возрастала в 4 раза в процессе накопления в клетке ФА, но не в начале цикла развития клетки, а только через 4 часа после выхода автоспор (Рис. 1). Интенсивность долгоживущих компонент ЗФ увеличивалась непрерывно в течение всего цикла деления, но скорость увеличения ЗФ возрастала в 4 раза за 2 часа до выхода автоспор.

Выход ЗФ зависит как от скорости электронного транспорта в хлоропластах, так и знергизации тилакоидных мембран (МаИшг, 1977). Поскольку интенсивность ЗФ изменяется в цикле деления клетки независимо от скорости нециклического транспорта электронов, было изучено изменение в этих условиях энергизации

мембран хлоропласте®, которую определяли путем регистрации фотоиндуцированных изменений поглощения при 520 нм. Амплитуда быстрой фазы нарастания фотоивдуцированных изменений поглощения при 520 нм, которая обусловлена сдвигом полос поглощения каротиноидов при светоиндуцированном образовании электрического поля на тилахоидных мембранах хлоропласте© (Witt, 1972), изменялась совершенно аналогично интенсивности миллксекундной ЗФ, скачкообразно возрастая через 4 часа после выхода авгоспор.

В процессе накопления ФА в цикле деления клетки происходит также закономерное перераспределение энергии возбуждения между хлорофилл-белковыми комплексами. В спектрах низкотемпературной флуоресценции целых клеток отношение интенежш гостей полос флуоресценции F72o/Fi85, характеризующее распределение энергии возбуждения между фотосистемами I и П, возрастало с первого по шестой час цикла, а затем возвращалось к исходному значению. В спектрах возбуждения полосы F720 отношение интенсивностей флуоресценции при возбуждении в полосах поглощения Хл а и Хл b возрастало в начале и уменьшалось во второй половине цикла деления.

Наблюдаемые различия в кинетике изменения параметров, характеризующих фотосинтетическую активность и энергизацию тилакоидных мембран в течение цикла деления клетки, свидетельствует о том, что количественный рост фотосинтетического аппарата во время развития клетки сопровождается изменением его состояния. Последнее может быть связано с изменением состава и соотношения составляющих его компонентов. С целью выяснения связи между изменениями функциональной активности и состава тилакоидных мембран хлорогогастов, в дальнейшем была изучена кинетика накопления в клетке компонентов фотосинтетического аппарата.

и

с X

9 с

5! 10 о

н

6

о с и

Ю 5

38 час

врем, после начала светового периода

Рис, 1. Изменение скорости фотосинтеза (0:Т ). интенсивности миллисекундной замедленной флуоресценции (ЗФ) и числа клеток (Ы) в синхротшой культуре хлореллы.

граня после начала светового периода,час

Рис. 2. Изменения содержания (А) и скорости накопления (Б) хлорофилла в синхронной культуре хлореллы. I - Хл а; 2 - (Хл а - Хл Ь); 3 - Хл Ь; 4 - Хл а/Хл Ь.

Исследование изменений состава ФА в синхронной культуре хлореллы показало, что его основные энергопре образующие комплексы, также как и компонент, лимитирующий скорость "фотосинтеза, синтезируются в течение короткого времени на определенных стадиях клеточного цикла.

Хлорофилл Ь, который входит в состав только светособирающих хлорофилл-белковых комплексов, может служить маркером для контроля за изменением содержания светособирающих комплексов (ССК) в целой клетке. На основании того, что в ССК П отношение Хл й/Хл Ь составляет около 1,1, а комплексы фотосистем содержат тслько Хл а, можно оценить кинетику накопления в клетке хлорофилл-белковых комплексов фотосистем по разнице между содержанием общего количества Хл а и Хл Ь. Содержание Хл Ь увеличивалось в клетках в 4 раза только с 5 по 8 час после выхода автоспор, в остальное время цикла развития хлореллы Хл Ь не синтезировался. В сшшчие от Хл Ь, Хл а накапливался в клетке в течение большей части светового периода, но скорость его синтеза была максимальна в первой половине. В результате, величина отношения Хл а/Кл Ь за первые 5 часов возрастала от 3 до 6,5, а затем снижалась до исходного значения (Рис. 2). Кинетика накопления Хл Ь указывает: на то, что в течение цикла развития водоросли новые хлорофилл-белковые комплексы формируются однократно на определенной стадии онтогенеза клетки. Содержание ССК в синхронной культуре увеличивалось в течение периода времени, не отличающегося по длительности от интервала времени, характеризующего разброс клеток по возрастам (2,5-3 часа). Это означает, что в отдельной клетке содержание ССК возрастает скачкообразно за еще более короткое время, не более 1 часа. Хл а, входящий в фотосистемы I и П (Хл а - Хл Ь), синтезировался преимущественно со 2 по 5 час светового периода, до образования светособирающей антенны. По изменению скорости синтеза

пигментов (Рис. 2 Б) отчетливо видно, что светособирающие комплексы формируются только после того, как завершится образование комплексов фотосистем. Тот факт, что в течение цикла деления клетки образование пигмент-содержащих комплексов фотосистем и ССК разделены во времени, подтверждается измерением разностных и низкотемпературных спектров поглощения. Коротковолновые формы Хл а, характерные для ССК, появлялись одновременно с Хл 6, а накопление длинноволновых форм Хл а, входящих преимущественно в состав пигментов фотосистем, происходило раньше. Соответственно, отношение длинноволновых форм Хл а к коротковолновым имело максимум на 4-5 часу светового периода, т.е. в то же время, когда было максимальным отношение Хл я/Хл Ъ.

Содержание в клетке функционально активных РЦ фотосистем I и П, которое определяли по характеристикам замедленной флуоресценции, сигналу I ЭПР и по дифференциальным спектрам поглощения "окисленный минус восстановленный", ступенчато возрастало в 4 раза в начале цикла деления, в то же время, что и Хл а в хлорофилл-белковых комплексах фотосистем. Такое совпадение позволяет считать, что со 2 по 6 час цикла развития клетки, синтезируется не только Хл а, образующий внутреннюю светособирающую антенну, но и элеклрон-транспсршые компоненты фотосистем, и в тюгакоидную мембрану в это время встраивается полностью сформированный активный мулыиферментный комплекс. Таким образом, отношение ССК и фотосистем изменяется в течение цикла развития клетки, а стехеометрия комплексов ФС I и ФС П сохраняется постоянной.

Количество способного к фотоокислению цитшрома /, которое определяли по амплитуде фотоиндуцированных изменений абсорбции (ДА 550-56») > скачкообразно увеличивалось в клетке в 4 раза в течение 3-5 часа светового периода, а в остальное время цикла не изменялось.

Количество цитохрома /, доступного химическому окислению, изменялось аналогично количеству фотоокисляемого, т.е. увеличивалось в 4 раза только на 3-5 часу светового периода. Последнее позволяет заключить, что весь внсшь синтезированный цкгохром / сразу включается в электрон-транспортные реакции в составе щпохромного 6// комплекса. Синтез и включение в фотосинтетнческую мембрану цитохромного ЪЦ комплекса совпадает по времени с увеличением электрохромных изменений поглощения. Возможно, что увеличение содержания в мембране цитохромных комплексов приводит к усилению трансмембранного электрического поля за счет электрогенной активности циклического транспорта электронов.

Приведенные ниже результаты позволяют, в частности, сделать предположение о местонахождении компонента электрон-транспортной цепи (ЭТЦ), лимитирующего фотосинтетическую активность в течение цикла развития водоросли. На всех стадиях клеточного цикла степень фотоиндуцированной окисленности цитсжрома/, также как и степень окисленности Р700, не возрастала в Присутствии диурона, ингибирующего перенос электрона между первичным (Од) и вторичным (Ов) хинонными акцепторами ФС П. Данный факт указывает на то, что скорость фотосинтеза в течение цикла развития клеток хлореллы лимитируется не темновыми реакциями фотосинтеза, а скоростью переноса электрона на участке ЭТЦ от воды до цитохрома / Кислород-ныделяющая система не лимитирует фотосинтез, поскольку при ее частичной инактивации во время длительной (6 часов) темнешй инкубации водоросли скорость выделения кислорода целыми клетками не снижалась. Четырехкратное увеличение содержания в клетке фотохимически активных РЦ ФС II или цитохрома / в течение цикла развития клепки не влияло на скорость фотосинтеза. Эти данные позволяют предположить, «по скорость фотосинтеза лимитируется наиболее

медленной реакцией на этом участке ЭТЦ, а именно переносом электрона и протона через тгогакондную мембрану дважды восстановленным и протонированным пластохиноном. Для синхронной культуры Scenedesmus показано (Schapendonk and VredenbBrg, 1977), что двухкратное возрастание фогосинтетической активности сопровождается двухкратным увеличением концентрации ингибитора окисления ПХ (ДБТХ), необходимым для ингибирования фотосинтеза. По-видимому, и в цикле развития хлореллы лимитирование фотосинтеза связано с изменением размера пула пластохинона, участвующего в окислительно-восстановительных реакциях.

Результаты исследования формирования ФА синхронной культуры хлореллы свидетельствуют, что четырехкратное увеличение содержания ФА в течение клеточного цикла водоросли сопровождается закономерными изменениями его состава и активности. Тот факт, что эти изменения происходят при постоянных и оптимальных условиях, указывает на существование эндогенной регуляции процесса формирования ФА и его активности. Такая регуляция осуществляется в основном за счет изменения соотношения основных знергопреобразующих комплексов в фотосинтетических мембранах хлоропластов. Синтез и одновременное включение функционально-активных комплексов в состав тилакоидных мембран происходит однократно в течение короткого времени на различных стадиях клеточного цикла (Рис. 3). Эндогенная регуляция фогосинтетической активности направлена, по-видимому, на согласование активности первичных реакций фотосинтеза с изменяющимся в течение цикла развития физиологическим состоянием клетки, что позволяет оптимизировать обеспеченность процессов развития и деления клетки продуктами световых реакций фотосинтеза.

Увеличение скоросш фото-

СШПСЭИ (ЛЗ£МДтфуКЦД1Ш Х.0МЛ0НС1П >

Цнтснром "Г

Реакционные центры ФС I иФСН

Выход аигослор

9 час

Сиегособлршащш!

таорофилл-вслкошй

комплекс

Дспстю ядер'*

Рис. 3. Схема формирования фопосит:етич.еского аппарата в течение цикла развития хлореллы.

Время, сутки

Рис. 4. Измените содержания хлорофилла в клетках хлореллы во время азотного голодания. 1-Хла;2-Хл6;3-Хл а/Хл Ъ.

II. Регуляция первичных реакций фотосинтеза при изменении физиологического состояния водоросли в результате торможения скорости роста

Результаты, изложенные в предыдущем разделе, свидетельствую! о том, что даже при оптимальных условиях культивирования активность и состав ФА контролируется эндогенными механизмами регуляции. Действие таких механизмов носит адаптационный характер и обеспечивает согласование скорости образования продуктов световых реакций фотосинтеза с потребностями темпового метаболизма водоросли, изменяющимися в течение ее цикла развития. В реальных условиях существования, которые чаще всего далеки от оптимальных, скорость и направленность общего метаболизма растительных организмов определяются не только эндогенными механизмами, но и факторами внешней среды, что также предполагает необходимость регуляции фотосинтетической активности.

В дальнейшей работе была поставлена задача выявления и изучения адаптационных изменений ФА при воздействиях, не оказывающих прямого влияния на фотосинтез, но изменяяющих физиологическое состояние клетки. В качестве одного из таких воздействий изучено влияние обеспеченности минеральным питанием на первичные процессы фотосинтеза хлореллы.

Результаты проведенных исследований позволили установить, что деструкции ФА при дефиците минерального питания предшествуют адаптационные изменения его состояния, при которых в первую очередь происходит обратимая инактивация РЦ ФС П. Процесс инактивации инициируется накоплением в клетке продуктов углеводного метаболизма.

При помещении водоросли на среду, не содержащую азота, деление клеток прекращалось через 12 часов, что сопровождалось изменением состава и активности фотосшггетического аппарата.

Отношение Хл а/Ь в первые 48 часов азотного голодания уменьшалась от 3-3,5, значения, типичного для нормальных клеток, до 1,3-2,0, после чего изменялась мало (Рис. 4). Такая зависимость обусловлена тем, что на ранних стадиях голодания, после первичного накопления обеих форм хлорофилла, разрушался только Хл а. Затем содержание Хл а и Хл Ъ уменьшалось практически с одинаковой скоростью. Данный факт свидетельствует о том, что разборка фотосинтетического аппарата на ранних стадиях голодания носит избирательный характер: в первую очередь снижается содержание Хл а, который связан с хлорофилл-белковыми комплексами I и П фотосистем, а светособирающий комплекс, который содержит Хл Ь, оказывается более стабильным. Белее длительное (больше 2-х суток) голодание приводило к уменьшению общего содержания фотосиететических мембран. При добавлении нитрата к клеткам, голодающим в течение 48 часов, хлорофилл не синтезировался в первые 4 часа - время, характерное для активации нитрат-восстанавливающей системы после азотного голодания. Затем начинался синтез Хл а, а синтез Хл Ь возобновлялся только после того, как восстанавливалось исходное значение отношения Хл а/Ь.

Белее высокая стабильность светособираклцего комплекса подтверждается также следующим наблюдением: когда в низкотемпературных спектрах поглощения исчезала длинноволновая полоса поглощения Хл а, связанного с хлорофилл-белковыми комплексами фотосистем, полосы поглощения при 650 нм и 669 нм, принадлежащие Хл Ъ и Хл а светособирающего комплекса уменьшались незначительно.

Изменение состава ФА в первые 48 часов азотного голодания не приводило к уменьшению жизнеспособности клеток, а исходное отношение хлорофилл-белковых комплексов быстро восстанавливалось после внесения азота в культуру водоросли. После 48 час голодания содержание ФА уменьшалось при сохранении

постоянной стехиометрии ССК и хлорофилл-белковых комплексов фотосистем, что сопровождалось резким снижением выживаемости клеток. При этом значительно возрастало время, необходимое для восстановления исходного состава ФА после добавления в среду азота. По-видимому, обнаруженные на первом этапе азотного голодания направленные изменения состава ФА связаны с адаптацией водоросли к неблагоприятным условиям роста. Исследование влияния дефицита фосфора показало, что и в этом случае торможение роста клеток сопровождалось изменением состава ФА, которое происходило более медленно, но в конечном итоге приводило к тому же результату. Данный факт позволяет заключить, что наблюдаемые изменения неспецифичны для отсутствия конкретного элемента питания, азота или фосфора, а отражают адаптационную реакцию ФА в ответ на торможение роста.

Адаптационная реакция включает изменения не только состава ФА, но и активности первичных реакций фотосинтеза. Количество функционально активных РЦ ФС I и ФС П заметно снижалось во время первых 12-14 часов азотного голодания (Рис. 5), когда общее количество хлорофилла еще продолжало увеличиваться (Рис. 4). В результате уже к 20 часу азотного голодания накапливались хлорофилл-белковые комплексы с фотохимически неактивными реакционными центрами фотосистем. Изучение характеристик световых кривых замедленной флуоресценции клеток, обработанных диуроном, показало, что в первую очередь инактивировались РЦ ФС Е, эффективно восстанавливающие Од. Накопление неактивных реакционных центров ФС II, сопровождающееся возрастанием относительного количества светособирающих комплексов, приводило к увеличению потерь поглощенной энергии света в ФС П. Об этом свидетельствует уменьшение отношения интенсивности полос флуоресценции Р^о/Рвза в начальный период голодания.

I I Г"

О 10 20 30 40 50 Бремя, час

Рис. 5. Изменение содержания функционально-активных реакционных центров ФС I и ФС П, интенсивности мшишсекундной ЗФ после исключения азота из среды культивирования. На вставке показаны кинетики изменения поглощения при 520 нм, измеренные в точках 1 и 2, обозначенных на графике.

0.8-

Е

Ь

\ 0.6 Ь.

0.4-

0.2-

-СОг

___в-__о

+всии

Контроль

v

10

20 30

40 50 Время, час

ВО

О

Рис. 6. Изменение величины отношения во время азотного

голодания, хлореллы в зависимости от содержания СО^ и присутствия диурона (5-Ю"7 М).

Скорость выделения кислорода, измеренная при насыщающей интенсивности действующего света, несколько возрастала в первые часы голодания, а затем значительно уменьшалась, что может свидетельствовать об ингибировании темновых реакций фотосинтеза. Однако, тот факт, что более выраженное подавление скорости выделения кислорода на линейном участке световой кривой совпадало по времени с уменьшением фотохимической активности хлоропласгов, выделенных из голодающих клеток, свидетельствует об инактивации также и первичных реакций фотосинтеза.

О снижении квантовой эффективности световых реакций фотосинтеза свидетельствует также уменьшение переменной флуоресценции хлорофилла, которое было обусловлено увеличением начального уровня флуоресценции - Р0. Увеличение выхода Р0 в 3-4 раза происходило на фоне незначительного увеличения выхода максимальной флуоресценции - Бщ. В результате относительный выход переменной флуоресценции - Ру/Рщ, характеризующий эффективность использования квантов света в ФС П, уменьшался за 20 часов голодания от 0,7 до 0,2.

Во время азотного голодания, на фоне накопления фотохимически неактивных РЦ ФС П и подавления нециклического транспорта атегарона постепенно возрастал выход ЗФ, и через 20 часов стационарная интенсивность милли секундной ЗФ увеличивалась в 5-7 раз (Рис. 5). Такое усиление замедленной флуоресценции может быть связано с увеличением знергизации тилакоидных мембран. Действительно, амплитуда фото-индуцированных электрохромньк изменений поглощения при 520 нм увеличивалась в первые часы азотного голодания и не снижалась до исходного уровня даже через 40 часов голодания. Энергизация хлоропласгов осуществляется преимущественно за счет нециклического транспорта электронов у нормальных клеток. Однако, у клеток, испытывавших в течение суток недостаток азота,

энергизация была связана с активностью ФС I, то есть обеспечивалась главным образом циклическим транспортом электронов (Рис. 5, вставка). Результаты исследования влияния изменений активности нигратредуктазы на выход ЗФ (инактивация -при замещении молибдена на вольфрам в ее активном центре; в присутствии циклогексимида или аммония; активация - в темноте при добавлении глюкозы) позволили заключить, что переход фотосинтетического аппарата хлореллы в состояние с высоким выходом ЗФ на свету связан с инактивацией нитрат-восстанавливающей системы. Активация нитрат-восстанавливающей системы путем добавления нитрата или нитрита к лишенным азота и имеющим высокий выход замедленной флуоресценции клеткам, вызывала быстрое (за 30 мин) снижение интенсивности замедленной флуоресценции и амплитуды алектрохромных изменений поглощения при 520 нм. При этом энергизация тилакоидных мембран хлоропластов, связанная с циклическим транспортом электронов, подавлялась практически полностью. Эти результаты позволяют сделать вывод, что в целых клетках водоросли при инактивации нитратвосстанавливающей системы, вызываемой отсутствием субстрата, изменяются не только степень, но и способ энергизации тилакоидных мембран. В этих условиях энергизация осуществляется за счет активации циклического транспорта электронов в ФС I.

Таким образом, изменения физиологического состояния водоросли, вызванные остановкой или замедлением скорости роста, приводят к глубоким изменениям состава и активности ФА, которые происходят в два последовательных этапа. В начальный период изменение состава и активности ФА обусловлено, по-видимому, процессами внутриклеточной регуляции скорости образования продуктов световых реакций фотосинтеза. На втором этапе уменьшение фотосинтетической активности клетки связано уже с

разрушением ФА. Регуляция, очевидно, направлена на снижение скорости образования продуктов световых реакций фотосинтеза в условиях, когда потребности темнового метаболизма в этих продуктах снижены из-за торможения роста клетки. Наиболее ранней реакцией ФА, в ответ на изменение физиологического состояния клетки при торможении се роста, является обратимая инактивация ФС И в результате потери РЦ ФС Н способности к фотохимическому тушению энергии возбуждения антенны, что сопровождается увеличением выхода начального уровня флуоресценции Р„.

Инактивация ФС П при дефиците минерального питания зависит от освещения: с уменьшением освещенности степень инактивации значительно снижалась. Инактивация ФС П при дефиците минерального питания может быть связана с накоплением фотошпибированных реакционных центров в результате замедления ресинтеза повреждаемого светом Ов-связывакяцего белка В1 в ФС П. Однако, снижение освещенности замедляет также образование продуктов световых реакций фотосинтеза. А именно на это звено может быть направлено ретуляторное воздействие, приводящее к снижению активности ФА. Действительно, оказалось, что инактивация ФС И в значительной степени предотвращалась, т.е. величина отношения сохранялась на высоком уровне (0,4-0,5),

если фотосинтез клеток, растущих в условиях дефицита минерального питания, подавлялся путем добавления в среду разобщителя фотофосфорилирования метиламина или ингибитора нециклического транспорта электронов диурона (Рис. 6). Поскольку ингибирование фотосинтеза может только замедлять скорость синтеза белка, и, в то же время, ингибирование фотосинтеза предотвращает инактивацию ФС II, то наблюдаемую при дефиците минерального питания инактивацию ФС П нельзя связывать с нарушением ресинтеза белка

Известно, что в условиях азотного голодания происходит избыточное накопление продуктов ассимиляции С02 (углеводов) (Жукова и др., 1969). Очевидно, что это осуществляется за счет продуктов световых реакций фотосинтеза (АТФ, НДЦФН), которые не могут быть использованы для роста. Предотвращение накопления в клетке углеводов путем помещения голодающей культуры в атмосферу, лишенную СО}, в значительной мере предотвращало инактивацию ФС П даже в условиях высокой освещенности. Наоборот, при увеличении содержания С02 в воздушной смеси до 2,5%, величина отношения Бу/Рщ снижалась до 0,06, то есть инактивация усиливалась (Рис. 6). Данные факты указывают, что инактивация ФС П в клетках хлореллы при дефиците минерального питания связана не с прямым повреждающим действием света, а инициируется накоплением избытка запасных углеводов в результате изменения направленности томнового метаболизма водоросли. Иными словами, в клетках водоросли существует механизм метаболитной регуляции эффективности первичных процессов фотосинтеза.

Если вывод о роли продуктов углеводного метаболизма и света в инактивации ФС П верен, то, очевидно, следует ожидать инактивации ФС П и при экзогенном создании избытка углеводов у клеток, путем гетеротрофного культивирования в отсутствие освещения.

С целью уточнения механизма метаболитной регуляции и природы продуктов, инициирующих процесс инактивации ФС Н, в дальнейшем были исследованы изменения состояния ФА при гетеротрофном росте водоросли на глюкозе.

III. Ивактившшя ФС II при гетеротрофном росте хлореллы

Клетки хлореллы, помещенные на полную минеральную среду, содержащую 0,5% глюкозы, росли без освещения несколько медленнее, чем автотрофная культура. Однако, в первые 48 часов

гетеротрофного роста обнаруживался весь комплекс изменений ФА, характерный для метаболишой инактивации у автогрофной культуры, выращенной в условиях дефицита минерального питания.

Одновременно с ростом клеток, увеличивалась интенсивность флуоресценции хлорофилла, но скорость возрастания Бо заметно превышала скорость увеличения Рт. В результате, отношение Ру/Рт снижалось за двое суток с 0,75 до 0,3-0,35, что свидетельствует об инактивации ФС П при гетеротрофном росте.

Так же как при дефиците минерального питания, инактивация ФС II у гетеротрофно растущих клеток была обусловлена накоплением РЦ ФС II, неспособных к фотохимическому тушению энергии возбуждения антенны, о чем свидетельствует опережающий рост начального уровня флуоресценции. Наиболее отчетливо это проявлялось при добавлении к клеткам глюкозы в анаэробных условиях, когда число клеток и интенсивность Бщ не увеличивались, и отношение Р„/Рт снижалось только за счет увеличения выхода Р0 (Рис. 7).

Исследование изменения выхода флуоресценции хлорофилла клеток хлореллы, находящихся на среде Тамия с различным содержанием глюкозы, показало, что, чем выше концентрация глюкозы, тем быстрее уменьшалась величина отношения Ру/Рт. Однако, при длительном культивировании на глюкозе (белее трех суток) отношение ¥у/¥т достигало примерно одинакового значения (0,3-0,35) при всех изученных концентрациях глюкозы в среде (0,011%). Инактивация ФС П у гетеротрофной культуры не связана с прямым влиянием продуктов углеводного метаболизма ее активность. Об этом свидетельствует тот факт, что, после исчерпания запаса глюкозы в среде, отношение не увеличивалось до исходного

значения.

Интенсивность ЗФ, измеренная в присутствии диурона, уменьшалась у гетеротрофно выращенных клеток на 50% уже через

24 часа, что указывает на уменьшение числа фотохимически активных реакционных центров ФС П. Уменьшение содержания фотохимически активных РЦ ФС II сопровождалось увеличением относительного размера светособирающей антенны. На это указывает уменьшение величины отношения Хл а/Хл Ъ, что как и при азотном голодании сопровождалось возрастанием отношения максимумов 17685Д7720 в спектре низкотемпературной флуоресценции хлорофилла. В процессе гетеротрофного роста максимум в спектре возбуждения полосы Р72о сдвигался в коротковолновую сторону от 680 к 675 нм.

Полученные результаты подтверждают существование в клетках хлореллы процессов метаб сшитной регуляции первичных реакций фотосинтеза и прямо указывают на роль продуктов углеводного метаболизма в инициировании таких процессов. Ингибигорный анализ гликолиза позволил уточнить природу этих продуктов. Активность ФС П полностью восстанавливалась при освещении культуры слабым светом и частично восстанавливалась в отсутствие освещения при внесении экзогенной АТФ, что, очевидно, связано с ингибированием гликолиза на стадии фосфорилирования фруктоз о-6-фосфата. Эти данные позволили предположить, что процесс инактивации ФС П инициируется фруктозо-1,6-бифосфатом или триозсфосфатами, метаболитами, общими для гликолиза и цикла Кальвина.

Отсутствие повреждений белковой структуры ФС П при обратимой метабсоштной инактивации РЦ подтверждается тем, что инактивация ФС П у гетеротрофно выращенных клеток обратима. Циклогексимид и хлорамфеникол, ингибиторы синтеза белка, соответственно, на цитоплазматических и хлоропластных рибосомах, не препятствовали световой реактивации ФС П, т.е. для реактивации ФС П не требуется синтез новых погашешидов.

Вместе с тем, необходимым условием для самого процесса инактивации у гетеротрофно растущих водорослей является синтез

Врен1,час

Рис. 7. Влияние гетеротрофных условий роста на изменение: А - интенсивности начального (Б0) и максимального (Ищ) уровня флуоресценции; Б - величины отношения Ру/Рш (Р„=Рт-Р0). 1 - аэробные; 2 - анаэробные условия. Пунктирной линией показано разбавление культуры водоросли свежей средой, содержащей 0,5% глюкозы.

Рис. 8. Влияние температуры на кинетику обмена кислорода при импульсном освещении адаптированных к темноте клеток хлореллы. Амплитуда медленного сигнала после одной и двух вспышек света пропорциональна величине хлоропластного дыхания.

определенных белков, синтезируемых в цитоплазме. Об этом свидетельствует тот факт, что в присутствии циклогсксимида, ингибирукицего цитоплазматический синтез белка, гетеротрофный рост на глюкозе не сопровождался увеличением выхода Fc, в то время, как хлорамфеникол, ингибитор синтеза белка на хлоропластных рибосомах, не препятствовал индуцированному глюкозой увеличению выхода начального уровня флуоресценции.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что в клетках водоросли действует механизм метаболитной регуляции фотосинтетической активности хлоропласте® за счет обратимой инактивации реакционных центров ФС П. Необходимым условием для запуска такого процесса инактивации является не только накопление в клетке продуктов углеводного метаболизма, общих для гликолиза и цикла Кальвина., но также синтез определенных белковых молекул на цитешлазматичееккх рибосомах.

Известно, что характерным ответом общего метаболизма как животных, так и растительных организмов, на тепловой шок является ингибирование синтеза ряда белков и, в то же время, усиление синтеза небольшого числа белков ("белки теплового шока") (Key, 1985). В связи с этим, представлялось интересным сравнить метабешпную инактивацию ФС П с влиянием теплового шока на первичные процессы фотосинтеза.

Исследование показало, что в отсутствие освещения температурно-зависимое ускорение распада запасных углеводов инициировало обратимую инактивацию ФС П, во многом аналогичную таковой при гетеротрофном росте водоросли шш при азотном голодании автотрофной культуры.

IV. Обратимая инактивация ФС II при тепловом шоке Известно, что тепловой шок (43-44°С) вызывает светозависимую инактивацию ФС П у растущей на свету хлореллы, что связывают с метабсяитной репрессией синтеза белка (Семененко, 1978). Такая

инактивация сопровождается тушением Рт, что характерно для фотоингибироБания, которое может происходить и при нормальной освещенности, если в клетке подавлен синтез белка. Для того, чтобы исключить эффект фотоингибирования, мы исследовали влияние теплового шока на активность ФС П в отсутствие освещения.

Длительная (до 48 часов) темповая инкубация клеток хлореллы при оптимальной температуре (36-38°С) не влияла на активность ФС II, величина отношения Ру/Рт сохранялась на постоянном уровне (0,7-0,8). При этом кислород-выделякяцие центры частично инактивировались, на что указывает значительное возрастание вклада медленной фазы в кинетике нарастания переменной флуоресценции и увеличенияе концентрации в клетке свободных ионов марганца. Это, однако, не лимитировало скорость фотосинтеза, о чем говорит тот факт, что скорость фогоиндуцированного выделения кислорода целыми клетками не уменьшалась во время длительной (48 часов) темповой инкубации водоросли.

Повышешге температуры темповой инкубации до 41°С вызывало уменьшение величины отношения Ру/Рт за двое суток от 0,7-0,8 до 0,3-0,4, главным образом за счет увеличения в 2-3 раза выхода Р0. Уменьшение отношения Ру/Рт, свидетельствующее о снижении квантового выхода разделения зарядов в ФС П, сопровождалось подавлением фотоиндуцировшшого выделения кислорода целыми клетками не только на линейном участке световой кривой, но и при насыщающей интенсивности действующего света. Это указывает на ингибирование как темповых, так и световых реакций фотосинтеза.

Подавление переменной флуоресценции усиливалось во время темповой инкубации клеток при более высокой температуре (43°С), так как помимо увеличения выхода Р0 происходило также значительное тушение Рт, что характерно для действия теплового шока на свету. Подавление Рт, обусловленное безизлучательным тушением энергии возбуждения в РЦ ФС П, может указывать на

температурно-зависимую деструкцию хлорофилл-белкового комплекса ФС П. Действительно, если у водоросли, выдержанной 48 часов в темноте при 41°С, активность ФС П может быть полностью восстановлена путем освещения клеток и частично реактивирована даже в отсутствие освещения при снижении температуры огг 41°С до 36°С, то после теплового шока при 43°С, последующее освещение уже не приводило к восстановлению активности ФС П.

Можно заключить, что обратимая инактивация ФС П при тепловом шоке (40-41°С), так же как и при метаболитной инактивации, связана с регуляцией первичных реакций фотосинтеза, а не с разрушением ФА

Для увеличения выхода Р0 во время теплового шока требуется цитоплазматический синтез белка, так как в присутствии циклогексимида такого увеличения не происходило. При тепловом шоке в отсутствие освещения, так же как при гетеротрофном росте, не разрушаются белки РЦ, поскольку ингибирование синтеза белка циклогексимидом или хлорамфениколом не препятствовало световой реактивации ФС П. Совпадали световые зависимости и продолжительность освещения, необходимая для полного восстановления активности ФС П после теплового шока или гетеротрофного роста. Степень световой реактивации достигала максимального значения при величине фотоиндуцированного нециклического потока электронов 0,65 е'/сек. И, самое главное, изменение активности первичных реакций фотосинтеза при температуре теплового шока, равной 41°С, зависело от скорости темнового метаболизма углеводов в клетке. Торможение потребления углеводов в анаэробных условиях усиливало, а их окисление, в присутствии разобщителя окислительного фосфорилирования динитрофенола, снижало инактивацию ФС П при повышенной температуре.

Приведенные экспериментальные результаты позволяют считать, что изменение метаболизма водоросли в результате воздействия теплового шока в отсутствие освещения инициирует обратимую инактивацию ФС П, аналогичную ее инактивации при дефиците минерального питания у автотрофной культуры, или при гетеротрофном росте водоросли. Если в двух последних случаях инактивация инициируется накоплением в клетке продуктов углеводного метаболизма, то при повышенной температуре в отсутствие освещения появление в клетке избытка этих продуктов маловероятно. Очевидно, что в этом случае сосггостствующие метаболиты не взаимодействуют непосредственно с ФС П, а повышение их концентрации является лишь сигналом для запуска механизма инактивации ФС П. Имеющиеся в литературе данные о значительном ускорении распада запасного крахмала в клетках хлореллы при 40°С, позволяют предположить, что повышение концентрации сигнальных метаболитов связано с температурно-зависимой активацией процессов темнового распада запасных метаболитов.

V. Роль хлоропластного дыхания в метаболипгой регуляции фотоспитетической активности

Изложешше в предыдущих разделах результаты экспериментального исследования влияния темнового метаболизма водоросли на активность ФС П позволяют предположить существование единого механизма метаболитной регуляции первичных реакций фотосинтеза при различных по своей природе воздействиях на клетку. Действие такого механизма инициируется при тех воздействиях, которые приводят к увеличению содержания продуктов углеводного метаболизма (дефицит минерального питания, гетеротрофный рост), или к ускорению распада запасных углеводов (тепловой шок).

Дальнейшие исследования были посвящены выяснению природы метабалитной регуляции фотосинтетической активности хлоропластов.

В предыдущих экспериментах был использован штамм хлореллы, у которого при дефиците азота усиливается синтез крахмала, который накапливается в хлоропласте. Существует, однако, штамм хлореллы, у которого азотное голодание приводит к накоплению в цитоплазме липидов. Если потеря способности РЦ ФС П к фотохимическому тушению энергии возбуждения инициируется появлением сигнальных метаболитов в хлоропласте, то такая инактивация должна быть существенно снижена у липид-накалливающего штамма, у которого эти продукты экспортируются в цитоплазму.

Действительно, отсутствие азота в среде культивирования не вызывало у лшшднакапливающего штамма хлореллы инактивацию ФС II, и величина отношения Fv/Fm не уменьшалась по крайней мере в течение 24 часов. При гетеротрофном росте или тепловом шоке подавление относительного выхода переменной флуоресценции было достоверно ниже у липиднакашшваклцего штамма, что в обоих случаях связано с меньшим ростом начального уровня флуоресценции Fo.

Данные результаты позволяют заключить, что появление сигнальных метаболитов именно в хлоропласте инициирует процесс инактивации ФС П. Ответственным за это может быть процесс хлоропластного дыхания, электрон-транспортная цепь которого взаимодействует с фотосинтетической на уровне пула пластохинона.

Известно, что при азотном голодании хламидомонады хлоропласшое дыхание возрастает в 7-10 раз. Такое усиление связывают с появлением в хлоропласте избытка крахмала, глшсолитическос расщепление которого приводит к образованию субстрата для хлоропластного дыхания - НДЦН, и с индукцией синтеза НАДН-ПХ-оксидоредуктазы (Godde, 1980; Peltier, 1991).

Мы обнаружили, что хлоропластнос дыхание в клетках хлореллы значительно усиливалось (в 7-11 раз) не только при азотном голодании, но и при гетеротрофном росте водоросли, а также при повышении температуры темновсм инкубации клеток (Рис. 8). Следует отмстить, что если в диапазоне температур от 18°С до 35°С хлоропласшое дыхание усиливалось примерно в 2 раза на каждые 10° ловышешш температуры, то при температуре выше 35-38°С дыхание усиливалось значительно более резко, в 10 раз на 10°. Индуцируемое повышением температуры усиление дыхания было обратимым. Уже через 20 мин после сшскешет температуры с 42°С до 35°С хлоропласшое дыхание уменьшалось в 5 раз. Обращает на себя внимание тот факт, что область температур, при которых хлорошгастное дыхание наиболее быстро возрастало, соответствовала той области температур, которые инициировали обратимую инактивацию ФС П. В этом температурном диапазоне полностью совпадали температурные зависимости хлоропластного дыхания и скорости инактивации ФС II при тепловом шоке (Рис. 9). Эти данные подтверждают связь инактивации ФС II при тепловом шоке с температурнозависимым ускорением распада запасных углеводов и указывают на прямую связь между усилением хлоропластного дыхания и процессом метаболитной инактивации ФС П. Кроме того, воздействия, предотвращающие ускорение образования субстрата для хлоропластного дыхания - НДДН (исключение С02 из воздушной смеси при азотном голодании, торможение гликолиза неметаболизируемым аналогом глюкозы 2-дез окси-О-глюкся ой при гетеротрофном росте и тепловом шоке), предотвращали не только усиление хлоропластного дыхания, но и характерное для метаболитной инактивации ФС II увеличение выхода начального уровня флуоресценции - Р0. При гетеротрофном росте и тепловом шоке аналогичный эффект ашжения степени инактивации ФС П достигался при ингибировахши цшоплазматического сгагтеза белка

циклогексимидом, что можно связать с ингибированнем синтеза ферментов гликолишческого пути и (или) компонентов хлоропласгной дыхательной цепи.

Можно прийти к выводу, что ни торможение роста клеток при дефиците минерального питания, ни гетеротрофные условия роста, ни тепловой шок, сами по себе не вызывают инактивацию ФС II, если эти воздействия не сопровождаются усилением потока электронов в хлоропласгной дыхательной ЭТЦ от НДДН на пластохинон. Иными словами, для инактивации ФС П необходимо восстановление пластохинона.

Действительно, при гетеротрофном росте или тепловом шоке подавление относительного выхода переменной флуоресценции за счет увеличения выхода Р0 значительно усиливалось при торможении кислородзависимого окисления пластохинона в анаэробных условиях, или при ингибировании хлрропластных оксид аз салицил-гидроксаматом. Связь метаболигной инактивации ФС II с восстановлением пластохинона в дыхательной электрон-транспортной цепи подтверждается следующими результатами. При ингибировании окисления пластохинона салицилгидроксаматом уже небольшое (в 2-3 раза) усиление потока электронов в хлоропласгной дыхательной цепи в присутствие экзогенного НАДН приводило к быстрой инактивации ФС П в отсутствие освещения и при оптимальной температуре - 37°С. В то же время добавление к культуре водоросли в отдельности салицюшидроксамата или НАДН не вызывало инактивацию второй фотосистемы. Принципиальную роль в инактивации ФС П играет взаимодействие восстановленного пластохинона с первичным хинонным акцептором Од. Об этом говорит тот факт, что диурон, который, как известно, не влияет на хлоропласт ое дыхание, но ингибирует перенос электрона между Ра и ГСХ, предотвращает инактивацию ФС П не только во время азотного голодания на свету, но и в отсутствие освещения при

Рис. 9. Температурная зависимость величины хлоропласшого дыхания (светлые символы) и зависимость скорости возрастания начального уровня флуоресценции, Р0 (темные символы) от температуры темновой инкубации культуры хлореллы.

и и ч

Время, »с

Рис.-10. Кинетика затухания флуоресценции хлорофилла в пикосекундном диапазоне у автотрофных клеток хлореллы (А) и через 43 часов гетеротрофного роста на среде Тамия, содержащей 0,5% глюкозы (Б). Сплошная линия - профиль возбуждающего импульса.

гетеротрофном росте и тепловом шоке. Согласно этому предположению, увеличение выхода F0 при инактивации ФС II связано с переходом QÄ в восстановленное состояние. В этом случае уровень F0 должен был увеличиваться одновременно с восстановлением пула пластохинона в ЭТЦ хлоропластного дыхания. В то же время в инактивированных клетках с увеличенным выходом начального уровня флуоресценции при торможении потока электронов от НАДН на ПХ выход F0 должен уменьшаться за счет окисления ПХ кислородом. Оказалось однако, что в присутствии глюкозы или при тепловом шоке поток атектронов в дыхательной цепи быстро увеличивался и достигал максимальной величины уже через 20 мин. В противоположность этому, уровень F0 достигал максимального значения только через 24 часа. При исследовании хлоропластного дыхания мы обнаружили также, что при исчерпании глюкозы в среде культивирования, при ингибировании метаболизма глюкозы ее неметабслизируемым аналогом 2ДЕ)Г, или при снижении температуры темновой инкубации клеток с 41°С до 36°С происходило значительное торможение потока электронов, восстанавливающих ПХ. Это должно было приводить к уменьшению F0. Однако у клеток водоросли с увеличенным выходом F0, такая остановка потока электронов от НДЦН на ПХ даже в аэробных условиях не приводила в течение 12 часов к ожидаемой релаксации выхода F0 к исходному значению. Это означает, что при метабслишой инактивации возникает стабильное состояние реакционных центров ФС П с увеличенным выходом F0. Ранее для объяснения ранних стадий развития процесса фотоингибирования был предложен механизм, согласно которому стабильное состояние РЦ с увеличенным выходом начального уровня флуоресценции (Fe) возникает при блокировании окисления фсофтина (Ph) в результате ухода дважды восстановленного и цротонированного Од. с места посадки в РЦ (Anderson, 1993). По аналогии с механизмом, предложенным для

фотокнгибирова1ши ФС П, можно предположить, что и при метаболитом контроле активности ФС II инактивация связана с потерей РЦ ФС П акцептора Од не только при азотном голодании на свету, но и в отсутствие освещения во время гетеротрофного роста или теплового шока. Такое предположение подтверждается данными работы (МеИв А., 1990), где показано, что величина отношения РЬ/Ра возрастает в 1,5 раза у гетеротрофно выращенной культуры СЫатускмпопаэ, но возвращается к исходному значению при освещении таких клеток. Во время фотоингибирования накопление инакягаированных комплексов ФС П в результате ухода ОдН2 то РЦ происходит за очень короткое время, поскольку Од быстро переходит в восстановленное состояние при интенсивном освещении. Как показывают результаты наших экспериментов с диуроном, при активации хлоропластного дыхания образование дважды протонированной формы Од должно происходить в результате обмена электронами между восстановленным дыхательной ЭТЦ ПХ и <3д. В результате такого обмена вероятность накопления Оа в восстановлешгой форме намного ниже, чем в фотосинтетической ЭТЦ при интенсивном освещении. Соответственно, значительно замедляется накопление дважды протоннровзнной формы Од, что и объясняет крайне низкую скорость накопления инактикированных РЦ ФС II, у которых блокировано окисление феофитина Р1г в результате ухода ОдН^ с места посадки в РЦ.

Связь метаболитной инактивации ФС Н с накоплением РЦ, у которых ингибирован перенос электрона от РК на <3д, подтверждается результатами исследования кинетики затухания флуоресценции. У клеток с инактинированной ФС П в кинетике затухания флуоресценции на уровне Р0, кроме типичного компонента, имеющего время жизни около 400 пс, появляется медленный компонент затухания (2,5 не), характерный у нормальных клеток для закрытого состояния РЦ, при котором невозможен перенос

электронов от РЬ на первичный хинон. По мере развития метабсшпной инактивации вклад этого компонента возрастал до 60% и кинетика затухания флуоресценции уже не изменялась при попытке восстановить Од. дополнительным освещением клеток в присутствии диурона (Рис. 10).

Результаты проведенных исследований позволяют прийти к выводу, что инактивация части РЦ ФС П при метаболитном контроле фотосинтетической активности водоросли связана с активацией процессов хлоропластного дыхания. Взаимодействие восстановленного в дыхательной электронтранспоршой цепи ПХ с первичным хинонным акцептором ФС П приводит к накоплению неспособных к фотохимическому тушению энергии возбуждения РЦ в результате блокирования окисления фотовосстановленного феофитина, что и вызывает увеличение начального уровня флуоресценции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных в настоящей работе исследований изменения состава и функциональной активности ФА в зависимости от физиологического состояния водоросли, получены новые экспериментальные результаты, указывающие на наличие в клетке процессов регуляции первичных реакций фотосинтеза, направленной на согласование скорости образования продуктов световых реакций фотосинтеза со скоростью их потребления в процессах темнового метаболизма. Такая регуляция в первую очередь обеспечивает защиту клетки от деструктивных процессов, которые могут инициироваться накоплением сильных окислители! и восстановителей, образующихся в световых реакциях фотосинтеза. Вместе с тем, регуляция состава и активности ФА позволяет оптимизировать энергообеспеченность определенного уровня метаболизма, зависящего от изменения

физиологического состояния клетки в ее онтогенезе или при воздействии факторов внешней среды.

Указания на существование механизмов эндогенной регул яшм состава ФА были получены при исследовании формирования ФА в синхронной культуре хлореллы. При постоянных и оптимальных условиях культивировщшя, исключающих возможность влияния внешних факторов на физиологическое состояние клетки, четырехкратное увеличение содержания ФА в течение цикла развития клетки происходит за счет строго скоординированного, поочередного синтеза и включения в состав тилакоидных мембран основных энергопреобразующих комплексов. В результате такого построения, состав ФА обнаруживает значительные изменения в онтогенезе водоросли.

Исследование состояния ФА при изменении обеспеченности водоросли минеральным питанием позволило установить, что обратимая инактивация ФС. П при дефиците минерального питания отражает наиболее раннюю адаптационную реакцию клетки в ответ на торможение роста. Несмотря на снижение квантовой эффективности работы ФС II и замедление нециклического транспорта электронов, адаптация ФА к дефициту минерального питания приводит к усилению энергшации тилакоидных мембран за счет активации циклического транспорта электронов в ФС I. Последнее, очевидно, обеспечивает изменение соотношения скоростей образования НАДФН и АТФ в соответствии с изменениями потребностей темпового метаболизма водоросли. Значительное уменьшение при азотном голодании стеле™ инактивации ФС П в результате замедления накопления запасных углеводов при ингибировании фотосинтеза диуроном или исключением из газовой смеси СО2, позволило заключить, что, помимо светозависимой регуляции ФС П в клетках водоросли, существует механизм метаболшной регуляции активности ФС II.

Действие такого механизма инициируется накоплением в хлоропласте избытка запасных углеводов при изменении направленности темнового метаболизма клетки.

Исследование аналогичной инактивации ФС П, обнаруженной при гетеротрофном росте водоросли, подтвердило существование механизма метабслишого контроля первичных реакций фотосинтеза на уровне регуляции активности ФС П, а также позволило установить, что эта инактивация инициируется накоплением в хлоропласте фруктозо-1,6-бифосфата или триоз офосфатов, метаболитов, общих для гликолиза и цикла Кальвина.

Данные о природе процессов, лежащих в основе механизма метабсшпной регуляции активности ФС И, получены при исследовании влияния теплового шока, где была показана четкая корреляция между величиной хлоропластного дыхания и скоростью инактивации ФС П. В дальнейшем, участие хлоропластного дыхания в регуляции активности ФС II было подтверждено также тем фактом, что при азотном голодании и гетеротрофном росте степень инактивации возрастала с увеличением потока электронов в дыхательной ЭТЦ хлоропластов.

Таким образом, одинаковый характер обратимой инактивации ФС П при различных по своей природе воздействиях обусловлен тем, что развитие процесса инактивации связано с усилением в 10-11 раз хлоропластного дакания. При внешних воздействиях, оказывающих влияние на темновой метаболизм водоросли, усиление хлоропластного дыхания связано с накоплением в хлоропласте избытка запасных углеводов или температурно-зависимым ускорением их распада, что увеличивает содержание субстрата для хлоропластного дыхания - НДЦН в результате гликсяитического расщепления глюкозы.

Для развития самого процесса м слаб слитного контроля активности ФС II необходим синтез определенных белковых молекул

в цитоплазме, поскольку усиление дыхания связано не только с накоплением углеводных метаболитов, но и с индукцией синтеза компонентов дыхательной ЭТЦ в хлоропластах. Об этом свидетельствует меньшая степень усиления хлороштастного дыхания и, соответственно, отсутствие характерного для метаболитной инактивации ФС П увеличения начального уровня флуоресценции при ингибировании цитоплазматнческого синтеза белка циклогексимидом.

Б основе процесса метаболитной регуляции активности ФС П лежит переход общего для дыхательной и фотосшгтетической ЭТЦ пула пластохинона в восстановленное состояние в результате усиления потока электронов в дыхательной цепи. Как показали эксперименты с ингибитором нециклического транспорта электронов диуроном, центральным звеном в механизме инактивации ФС II является редокс-взаимодействие пластохинона, восстаноаленного дыхательной ЭТЦ, с первичным хинонным акцептором ФС П - <3д. В результате такого взаимодействия происходит инактивация ФС II, которая, однако, не связана с увеличением стационарной восстановленностк С?л> поскольку при окислении пластохинонов в аэробных условиях и в отсутствие освещения не происходило даже частичной релаксации увеличенного выхода флуоресценции к исходному значению. Эти результаты позволили предположить, что, хотя стационарно Од находится в окисленном состоянии, имеется некоторая вероятность перехода его в восстановленное, а затем и дважды восстановленное протонированное состояние, в котором ОаН2 уходит с места посадки в РЦ. По-видимому, в результате таких маловероятных, но необратимых, процессов происходит медленное накопление инактивированных РЦ ФС И.

Схему метаболитной регуляции активности ФС П при адаптации водоросли к замедлению скорости роста при воздействии факторов внешней среды, отличных от света, можно представить следующим

образом (Бис. 11). При торможении скорости роста клеток водоросли значительно замедляется использование продуктов фотосинтеза в процессах роста, что может привести к перевосстановлению переносчиков электронов в фотосинтетической ЭТЦ, которые при взаимодействии с кислородом способны инициировать окислительную деструкцию компонентов клетки. На начальном этапе лимитированного роста усиление синтеза запасных углеводов за счет продуктов фотосинтеза, не используемых для роста, позволяет предотвратить такое перевосстановление и возможную деструкцию клетки. При накоплении некой критической массы запасных углеводов в хлоропласте активируются процессы хлоропластного дыхания. В конечном итоге, такое усиление хлоропластного дыхания приводит к инактивации ФС И, что позволяет привести дальнейшую наработку продуктов фотосинтеза в соответствие с потребностями клеточного метаболизма в условиях лимитированного роста.

Результаты, полученные нами при исследовании изменения состояния фотосинтетического аппарата в синхронной культуре хлореллы, указывают на пластохинон, как возможное место эндогенной регуляции скорости алектрошранспортных реакций в цикле развития водоросли. С другой стороны, результаты исследования метаболитной инактивации ФС П при различных стрессовых воздействиях на клетку (дефицит минерального питания, гетеротрофные условия роста, тепловой шок) прямо свидетельствуют, что регулятором этого процесса является уровень восстановленности пластохинона в электронтранспорггной цепи хлоропластного дыхания.

Эти результаты наряду с хорошо известными данными о роли пластохинона в светоз авксимой регуляции фотосинтетической активности за счет перераспределения энергии возбуждения между двумя фотосистемами свидетельствуют о центральной роли пластохинона в регуляции первичных процессов фотосинтеза при

экзогенная глюк со а

крахмал, ■тепловой шок

глюкоза

ЦИКЛ ОГСК С11ХШД _

2-д«акаг-0-глюкоза

надф+

снег

окевдазз><--сзтщнлпщроксамат

- анаэробиоз

О:

Рис. 11. Схема взаимодействия хлоропласшого дыхания и фотосинтеза. Пунктирными стрелками оплачены ингибирующие воздействия.

различных по своей природе воздействиях на клетку. По-видимому, именно расположение пула пласгохинона (основного связующего звена между фотосистемами и, в то же время, между атектронтранспоргными цепями фотосинтеза и хлоропластного дыхания) определяет его уникальную роль не только как непосредственного регулятора скорости алектронтранспортных реакций, но и индикатора степени согласованности скоростей образования и потребления продуктов фотосинтеза.

ВЫВОДЫ

1. Показано существование эндогенной регуляции построения фотосингетического аппарата у одноклеточной зеленой водоросли хлореллы, которая основана на строго скоординированном поочередном включении вновь синтезированных основных знергопреобразующих комплексов в тилакоидную мембрану в течение цикла деления клетки. Такая регуляция приводит к изменению стехиометрии компонентов мембран хлоропластов и направлена на оптимизацию энерго^об еспеченности процессов роста и деления клеток водоросли.

2. Адаптация водоросли к условиям минерального питания происходит за счет снижения квантового выхода фотосинтеза в результате обратимой потери реакционными центрами ФС ГГ способности к фотохимическому тушению энергии возбуждения свеггособирающей антенны. Накопление в хлоропласте продуктов углеводного метаболизма служит сигналом к инактивации ФС П. Подобная инактивация, а также обнаруженное усиление энергизации тилакоидных мембран за счет активности ФС I, могут обеспечивать регуляцию отношения НАДФН/АТФ при изменении направленности темнового метаболизма в условиях дефицита минерального питания.

3. Снижение активности первичных реакций фотосинтеза при гетеротрофном росте хлореллы также обусловлено процессами мстаболитного контроля фотосинтетической активности. Процесс инактивации ФС И инициируется накоплением в хлоропласте метаболитов, общих для гликолиза и цикла Кальвина, и зависит от цитоплазматического синтеза белка.

4. Доказано, что в отсутствие освещения при супраоптималышх температурах (40-41°С) обратимая инактивация РЦ ФС П, сопровождающаяся увеличением выхода начального уровня флуоресценции - Р0, связана с усилением хлоропластного дыхания в результате температурно зависимого ускорения распада запасных углеводов.

5. Основную роль в метаболишой регуляции активности ФС П у хлореллы при различных стрессовых воздействиях (азотное голодание, гетеротрофный рост, тепловой шок) играет увеличение восстановленности пластохинона, обусловленное усилением потока электронов от НАД(Ф)Н на кислород (хлоропластное дыхание) через общий для дыхательной и фотосинтетической электротранспортных цепей пул пластохинона. Активация хлоропластного дыхания в этих условиях обусловлена накоплением в хлоропласте углеводных метаболитов.

6. Предложен механизм метаболитного контроля активности ФС П, центральным звеном которого является редокс-взаимодействие восстановленного пластохинона с первичным хинонным акцептором ФС П - Од., что в конечном итоге приводит к накоплению неактивных РЦ ФС II, у которых блокирован перенос электрона между феофитином и Од- Действие такого механизма предотвращает перевосстановление переносчиков электронов в ФС I и тем самым возможное развитие деструктивных процессов, а также позволяет оптимизировать энергообеспеченность метаболизма клетки при торможении скорости ее роста внешними факторами.

Список основных публикаций по теме диссертации

1. Копопеяко A.A., Vcnediktov P.S., Chemeris Yu.K., Adamova N.P., Rubin A.B. On the relation between electron transport-linked processes and delayed luminescence in photosynthesizing ршр!е bacteria. Photosynthetica, V. 8, N. 3, 176-183, 1974.

2. Чемерис Ю.К., Уголкова Н.Г., Пахорукава Л.В., Венедиктов П.С., Шендерова JI.B. Установка для исследования замедленной флуоресценции хлорофилла в культуре синхронно делящихся клеток водорослей. Науч. докл. высшей школы, Биологические науки, N 3, 138-142, 1977.

3. Чемерис Ю.К., Хигров ЮА, Ушакова Н.Г., Венедиктов П.С. Исследование замедленной флуоресценции хлорофилла в культуре синхронно делящихся клеток хлореллы. Физиология растений, Т. 24, Вып. 5, 976-980, 1977.

4. Чемерис Ю.К., Гришина НА, Венедикте® П.С. Различный характер синтеза хлорофиллов "а" и "в" в течение цикла развития хлореллы. Физиология растений, Т. 26, Вып. 2, 378-382,1979.

5. Чемерис Ю.К., Гришина НА-, Калачев ВА., Венедиктов П.С. Исследование фотоиндуцированных изменений абсорбции при 520 нм и окисления цитохроиа Т в течение цикла развития хлореллы. Науч. докл. высшей школы, Биологические науки, N 5, 39-44, 1979,

6. Чемерис Ю.К., Венедиктов П.С. Изменение степени поляризации флуоресценции хлорофилла в течение цикла развития синхронной культуры хлореллы. Биофизика, Т. 25, 736-738, 1980.

7. Чемерис Ю.К., Гришина НА, Венедиктов П.С. Накопление функционально активных реакционных центров фотосистем и энергизация мембран хлоропласте® в онтогенезе клеток хлореллы. Физиология растений, Т. 28, Вып. 2, 253-262,1981.

8. Venediktov P.S., Chemeris Yu.K., Grishina NA Photosynthetic apparatus formation during the cell cycle oí Chlorella. Plant.Physiol., V. 67, 930-935, 1981.

9. Левенко БА, Чеиерис Ю.К., Венедиктов П.С. Различия в накоплении длинноволновых и коротковолновых форм хлорофилла в течение цикла деления клеток хлореллы и при азотном голодании. В сб.: I Всесоюзный биофизический съезд. Москва, Т. 1, с. 336, 1982.

10. Чемерис Ю.К., Шендерова Л.В., Венедиктов П.С. Изменение параметров фотосинтетического аппарата Chlorella vulgaris Beijer в процессе развития и обращения голодания по азоту. Физиология растений, Т. 30, Вып. 2, 355-359,

1983.

11. Шендерова Л.В., Чемерис Ю.К., Венедиктов П.С. Разрушение хлорофиллов у Chlorella vulgaris Beijer в условиях азотного голодания и последующего восстановления на среде с нитратом. Физиология растений, Т.

30, Вып. 4, 668-672, 1983.

12. Чемерис Ю.К., Попова А.В., Шендерова Л.В., Венедиктов П.С. Изменение фотосинтетического аппарата хлореллы при азотном голодании. Науч. докл. высшей школы, Биологические науки. Рукопись деп. в ВИНИТИ 21.12.83, N6942-83, 1983.

13. Чемерлс Ю.К., Попова А.В., Шендерова Л.В., Венедиктов П.С. Изменение фотосинтетического аппарата хлореллы в процессе азотного голодания. В сб.: Биоконверсия солнечной энергии. Пущинскна-Охе. 57-63,

1984.

14. Levenko ВА, Chemeris Yu.K., Venediktov P.S. Changes in content of chlorophyll a spectra] forms in synchronous culture and during nitrogen starvation of Chlorella. Biochim. Physiol. Pflanzen, V. 180, N 1, 157-162, 1985.

15. Chemeris Yu.K., Popova A.V.,Venediktov P.S. Enchancement of chloroplast energization in Chlorella by treatments inactivating the nitrate-reducing system. Planta, Vrl63, Nl" 201-206, 1985.

16. Арутюнян AA, Чемерис Ю.К., Шендерова Л.В., Венедиктов П.С. Изменения содержания хторофиллов и интенсивность замедленной флуоресценции при фосфорном голодании хлореллы. Биофизика, Т. 31, N 2, 350-351, 1986.

17. Васильев С.С., Арупоняя А_А, Чемерис Ю.К., Пащенко В.З., Венедиктов П.С., Рубин А.Б. Кинетика затухания ликосекундной флуоресценции хлорофилла при недостатке минерального питания хлореллы. Биофизика, Т.

31, Вып. 1, 27-30, 1986.

18. Чемерис Ю.К., Попова А.В., Арутюнян А-А. и Венедиктов П.С. Влияние недостатка минерального питания на фотосинтетический аппарат хлореллы. Физиология растений, Т. 36, Вып.1, 57-66, 1989.

19. Venediktov P.S., Chemeris Yu.K., О Joun Hcclc. Regulation of the Quantum "ïield of PS2 Reactions by Products of CO2 Fixation in Chlorella. Photosynthetica, V. 23, N. 3,281-287, 1989.

20. Горбунов М.Ю., Чемерис Ю.К., Мамедов H Д., Венедиктов П.С. Влияние ингибиторов и репрессоров синтеза белка на флуоресценцию хлорофилла в клетках хлореллы. Физиология растений, Т. 36, Выл, 3, 451-459,1989.

21. Венедиктов П.С., Чемерис Ю.К., Арупоиян АА., Пащенко ВЗ., Лядский В.В., Рубин A.B. Регуляция квантового выхода фотосинтеза в клетках хюреллы при лимитировании роста различными факторами среды. В сб.: Факторы среды и организация первичного процесса фотосинтеза. Киев. Научная мысль. 69-71,1989.

22. Чемерис Ю.К., Шендгрова Л.В., Лядский В.В. и Венедикте® П.С. Связь инактивации ФС II с накоплением продуктов фотосинтетического метаболизма углерода при азотном гололдании клеток хлореллы. Физиология растений, Т. 37, Вып. 2, 241-248,1990.

23. Венедиктов П.С., Чемерис Ю.К., О Джои Хек, Регуляция метаболитами активности ФС II в клетках хлореллы. Тезисы докл. I Всесоюзного съезда физиол. раст. Минск, с. 56, 1990.

24. Чемерис Ю.К., О Джон Хек, Васильев С.С. и Венедиктов П.С. Инактивация фотосистемы II у хлореллы в процессе гетеротрофного роста. Физиология растений, Т. 38. Вып.З, 443-451, 1991.

25. Чемерис Ю.К., О Джон Хек, Венедиктов П,С. Инактивация фотосистемы II у хлореллы в условиях гетеротрофного роста, инициируемая продуктами метаболизма глюкозы. Физиология растений. Т. 39, Вып.З, 421-427, 1992.

26. Venediktov P.S., Chemeris Yu.K., Dang Diem Hong. Metabolite inactivation of phùtosystem 1. llth International Congress on Biophysics. Abstracts, Budapest, p. 188, 1993.

27. Чемерис Ю.К., Данг Зьем Хода, Шендерова Л.В., Венедиктов П.С. Мстаболитная инактивация фотосистемы II у хлореллы. Сравнение храхмал-и липиднакапливающего штаммов. Физиология растений, Т. 43, Вып. 2, 235241,1996.

28. Чемерис Ю.К., Данг Зьем Хснг, Шендерсша Л.В., Венедиктов П.С. Обратимая инактивация фотосистемы II у хлореллы при длительной инкубации в темноте при супрзопгималыюй температуре. Физиология растений, Т. 43. Вып. 2, 242-246,1996.

29. Чемерис Ю.К., Шендеровз Л.В., Венедиктов П.С. Хлоропластнос дыхание в клетках хлореллы: влияние дефицита азота, экзогенной глюкозы, повышенной температуры. Физиология растений, Т.43, Вып.4, 541-547,1996.

30. Чемерис Ю.К., Венедиктов П.С., Рубин А.Б. Роль хлоропластного дыхания в инакгивашш ФС II у хлореллы. Физиология растений, Т.43, Вып.6, 833-841, 1996.

31. Chemeris Yu.K., Venediktov P.S. The role respiration of chloioplasts in PS II inaetivation in Chlorella. Ann.symp. RSSP "Physical-chemical basis of plant physiology"- Abstracts, p. 21, Penza, 1996.

32. Чемерис Ю.К., Венедиктов П.С. Взаимодействие фагосингетической и дыхательной электрон-транспортных цепей в хлоропласте хлореллы. Тез. дохл, международной конференции "Биоэнергетика фотосинтеза", Пущине, с.19,1996.

33. Venediktov P.S., Chemeris Yn.K., Dang Diem Hong and Rubin A.B. The role of caibon fixation products in the inaetivation of photosystem II in nitrogen-starred Chlorella pyrenoidosa. Physiol.Plant., 1996, in press.