Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и характеристика 2-дезоксид-Д-глюкоза резистентных мутантов Chlorella с нарушенной системой метаболитной регуляции фотосинтеза

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Получение и характеристика 2-дезоксид-Д-глюкоза резистентных мутантов Chlorella с нарушенной системой метаболитной регуляции фотосинтеза"

российская академия наук

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИИ им К. А. ТИМИРЯЗЕВА

он

На правах рукопнсп

ОН!

УДК 581.1

ШИТОВА Лариса Александровна

ПОЛУЧЕНИЕ II ХАРАКТЕРИСТИКА 2-ДЕЗОКСИ-Д-ГЛЮКОЗА РЕЗИСТЕНТНЫХ МУТАНТОВ ОНШИЕЬЬЛ С НАРУШЕННОЙ СИСТЕМОЙ (МЕТАБОЛИТНОЙ РЕГУЛЯЦИИ ФОТОСИНТЕЗА

Специальность 03.00.12 — физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1994

Работа выполнена в Институте физиологии растений име-'111Г'1\Г"ЛгТимир«зсва_Росспискоц-Лкадсмиц-Наук.------------------------ ------

Официальные оппоненты:

диктор биологических наук 13. Г. ЛЛДЫГИН, кандидат биологических паук М. В. ТУР1ШНА

Ведущее учреждение — Ботанический институт имени В. Л. Комарова РАН.

Защита состоится «»1994 г. в час. на

заседании Специализированного сбвета и о присуждению ученой степени кандидата биологических наук (К 002.45.01) при Институте физиологии [»астений им. К. А. Тимирязева РАИ но адресу: 127270, Москва, Ботаническая ул., 35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН.

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор В. Е. СЕМЕНЕНКО

Ученый секретарь Специализированного совета, канд. биол. наук

Л. И. СЕРГЕЕВА

об!дая характеристика работы

Лиауальвоаяь. Изучение генетического контроля и молекулярных

механизмов эндогенной регуляции фотосинтеза с участием различных внутриклеточных мессенжерсв (фптогормс-нов, фитохромной системы, ненов, метаболитов) является одной из актуальных проблем, которой уделяется большое внимание исследователями различных лабораторий (Мскроносов, 1381: 1382; Семененко, 1375; 1982: 1988; Seineneako et al., 1534; Пронина, 1992; Ладыгин, 1994; Chue, 1988; Sheen 1990). Интерес к этой проблеме, находящейся на стыке физиологии и генетики Фотосинтеза, обусловлен тем, что многие внутренние факторы и регуляторные системы в растении лежат в основе адаптивных свойств растения и могут ограничивать функцию фотосинтеза и продуктивность растений. Особый интерес представляет выяснение регуяятеркого действия в хлоропласте конечны:-: продуктов фотосинтетического восстановления углерода. С помощью стереахкмическкх аналогов (2-дезок-си-Л-глккоеа, з-0-метилглюкоза) показано,что гдюкеза вызывает в хлоропласте глубокое, но полностью обратимое подавление синтеза рРНК, ряда ферментов цикла Кальвина, а также ключевых белков, участвующих з организации фотохимическое систем и 5ТД ххорошгзстз (Seitenenko et al., 1Q84; Зверева, 1530; Купцова, 1983).

3 последнее время на примере ряда ключевых генов фотосинтеза (psbA и psbD генов), показано (Lefcedeva, Senenenko, 1S32), что глюкоза вызывает специфическое подавление экспрессии (образование первичного транскрипта) psbA и psbD генов в отличие от экспрессии нефотосинтетических генов (desA гена).

Глюкозный эффект негативной метаболитной регуляции экспрессии генома хлоропласта является, таким образом, эндогенным регулятор-ным механизмом, который ограничивает сверхсинтез структурных компонентов хлоропласта и продуктов фотосинтеза. 3 физиологическом смысле этот механизм выполняет важную функцию, играя роль концего-. го исполнительного механизма докерко-акцепторных отношений между фотосшпетическим аппаратом и аттрагирукщими органами растений (3eir,enenko et al., 1384).

Вместе с тем молекулярные механизмы регуляторног-о действия

глюкозы в хлоропласте остаются неясными. В связи а этим представляет большой интерес исследование возможности создания селективной системы отбора и получение мутантов с нарушенной системой метаболитной регуляции экспрессии генома хлоропласта.

Такие мутанты, - с -нарушенным feed- back механизмом рёгуляции фотосинтеза, представляют интерес, как модельные объекты для выяснения молекулярной организации регуляторного действия глюкозы в хлоропласте и как объекты биотехнологии.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось получение мутантов с нарушенной системой метаболитной регуляции фотосинтеза конечными продуктами фотосинтетического восстановления углерода (глюкоза) и изучение их физиолого-биохимических свойств . Исходя иэ цели работы были поставлены следующие задачи:

1. Разработать метод и получить мутанты Chlorella устойчивые к действию стереохимического аналога глюкозы (2дезокси-Д-глюкоза) С2дДГКез- мутанты).

2. Исследовать, способность 2дДГКеэ мутантов к гетеротрофному росту на среде с глюкогой и выявить мутанты с нарушенной системой метаболитной регуляции фотосинтеза (2m£TResCRS- мутанты), а также мутанты с нарушенной системой транспорта экзогенной глюкозы в клетку (2дДГКезБТ- мутанты) -

3. Провести сравнительное изучение активности поглощения экзогенной глюкозы и ее аналогов у исходной формы Chlorella , 2дДГЯе®СКБ и 2дДГКез GT мутантов.

4. Изучить влияние аналогов глюкозы на рост, фотосинтетическое выделение кислорода, синтез пигментов, активность хлорспласт-ной карбоангидразы у 2дДГг-езСг?3 мутантов.

5. Исследовать мутанты с нарушенной системой метаболитной регуляции фотосинтеза (2дДГЯез GRS - мутанты) на их способность к гипертрофированному накоплению продуктов фотосинтеза.

8. Исследовать стабильность признаков 2дДГКезСКЗ мутантов в условиях многократных последовательны;-: пересевов в отсутствии селектирующего (2дДП) фактора.

Научная вошава работы. Разработан способ и впервые выделены мутанты Chlorella -с нарушенной системой негативной метаболитной регуляции фотосинтеза конечным продуктом фотосинтетического восстановления углерода ,глюкозой, Chlorella 2дДГке£5 CRS мутанты. Исследовано поглощение экзогенной глюкозы и ее аналогов в клетки 2дДГ резистентных мутантов Chlorella и впервые показано, что устойчи-

- о -

вооть клеток микрсводорослей к репрессирующему действию аналогов глюкозы может быть обусловлена мутациями, вызывающими нарушение системы активного транспорта экзогенной глюкозы в клетку (2дДГКези1-мутанты) и нарушением "глшсзнсго эффекта" метаболктной регуляции экспрессии генов хлоропласта (2дДГаезСНЗ-мутантсв). Показано, что в отличии от исходного штамма у 2дДГг-езСЕЗ мутантов аналог гдюкогы не вызывает полного подавления синтеза пигментов, активности хлорсплзстной карбоангидразы и фотссинтетического выделения кислорода. Впервые показано, что нарушение в системе метабс-литной регуляции фотосинтеза конечными продуктами восстановления углерода приводит к гипертрофированному накоплению зссимилятов в хлоропласте, что позволяет рассматривать эти мутанты как суперпродуценты зссимилятов. Исследована стабильность признаков 2дДГНез CF3 мутантов и показано, что все свойства изначально присущи этим мутантам, устойчивы я сохраняются без селектирующего (2дДГ) фактора в условиях многократных последовательных пересевов культур.

Пражииеспая иевпосшь работы. Подученные результаты могут быть использованы для развития исследование в области молекулярных механизмов эндогенной регуляции фотосинтеза, а также представляют интерес для биотехнологических целей: селекции форм растений, от-личншцихся высокой фотссинтетической продуктивностью.

Апробация рабд-я. Результаты работы докладывались на международной 15 конференции ФЕВО (Москва, 1384), на г, 3 Всесоюзных конференциях молодых ученых по физиологии растений (Москва, 1985; Петрозаводск, 1988). на Всесоюзной конференции молодых ученых "Современные проблемы биохимии и физико-химической биологии" (Москва, 19В6), на 3 съезде Всероссийского обсеотва физиологов растений (Санкт-Петербург, 19S3), на 5-ой Международной конференции по прикладной альгологии (Тржебон, 1993).

Пубтиащт. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, из 4 глав экспериментальной чаруй, заключения, списка литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста и содержит 21 рисунок и 7 таблиц.

- 6 -

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследования использовали зеленую одноклеточную водоросль Chlorellavvulgaris Beiger, var. vulgaris IPPAS C-l (штамм-Косикова, известен как Chlorella sp.. К) из. коллекции культур одноклеточных водорослей Института физиологии растений РАН - IPPAS (Владимирова, Маркелова, 1983; Семененко, 1991).

Данный штагам относится к термофильным, высокопродуктивным и фотоустойчивым штаммам с хорошо изученными фигиолого-биохимическими характеристика}/«!. Существенным является то, что основные результаты по негативной метаболитной регуляции фотосинтеза были выполнены на этом же штамме.

Выращивание водорослей осуществляли в стеклянных сосудах объемом 250 мл и толщиной слоя суспензии 20 мм (Дилов, Семененко и др., 1969) и в специальных стеклянных микроячейках с толщиной слоя суспензии 12 мм (Семененко, Афанасьева, 1972) и объемом 19 мл . В качестве питательной- среды выращивания водорослей использовали среду Та,алия (Владимирова, Семененко, 1952). Для посевов на чашки Петри использовали агариэованную среду Таымия Культуру выращивали до плотности 70- 100 млн. мл-1, после чего вносили аналог глюкозы 2-дезокси-Д-глюкозу (фирмы Merck, Германия) в конечной концентрации 0,25 %. Стерилизацию 2дДГ осуществляли фильтрацией через мембранный фильтр. Отмывание от аналогов проводили двукратным центрифугированием в стерильных условиях и последующим ресуспендировани-ем клеток в свежую питательную среду Таммия. Эффект действия аналога глюкозы оценивали по изменен}® скорости роста культур, содержания хлорофилла и интенсивности фотосинтетического выделения кислорода .

Скорость рсспш культур определяли по изменению численности клеток в популяции микроводорослей посредством прямого счета числа клеток под микроскопом " Ergaval " в камере Горяева, так же нефе-лометркчески по оптической плотности суспензии на предварительно проградуированном фотоэлектроколориштре ФЭКМ-1954 с зеленым фотофильтром (Владимирова, Семененко. 1962).

Продутшность культуры определяли по накоплению сухой биомассы и по оптической плотности суспензии на градуированном " Specol " при 750 нм.

Морфологические изменения клеток контролировали с помощью микроскопа " Ergaval ".

Pssksp плеток u их распределение по р-агиерш в популяции микро-водоросли определяли о помощью счетчика Coulter Counter ZM ("Coultronics France", Франция).

Содержание углеводов определяли в свежесобранной биомассе методом "фенол-серная кислота " (Dubois et al., 1355) 2 модифккаши.

Активнее^ карбсангидрааы определяли в гомогенате и во фракции растворимого белка, полученного после центрифугирования гомо-геката при 3,5,14 к 18 тыс g в течение соответственного 5,10,20 и 60 мин и расчитывали на объем суспензии и единиц;/ белка. Активность карбэанпщрзы измеряли электрометрическим методом по изменению начального значения pH в процессе реакции гидратации двуокиси углерода. Активность фермента расчитывал:: в стнсс. ед. по формуле Е-10 (То''Т-i ), где Го- время изменения pH энзиматической реакции на мл суспензии или мг белка (Sickly, Gha2anfar et.al., 1364}.

Интенсивное.™, фотосинтеза определяли по выделению кислорода. Выделение кислорода измеряли непрерывно в течение роста культур с кош^ю датчика парциального давления растворенного кислорода по открытой схеме на специально разработанной установке (Семененко, Сяняпккй и др., 1972). Светозые кривые фотосинтеза снимали амперо-метрическим методом по выделению кислорода в широком диапазоне освещенности клеток. Плотность суспензии в измерительной ячейке составлял э 18 - 20 IG5 млн/мл.

Активность поглощения экзогенной илюкогы с ее аналогов клэт-ками Chlorella измеряли по описанной ранее методике (Холодова к др., 1982) о использованием 14С меченных глюкозы и ее аналогов : 3-0-иетилглюковы к 2-девзкси-Д-глюкозы. Опыты проводили на оуспен-зии клеток микроьодорослей, которые предварительно перед экспозицией с мечеными сахара,ги выдердивэли з темноте в течение 20-24 час. на 0,2 мМ растворе Сайг.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ПОЛУЧЕНИЕ И ОТБОР МУТАНТОВ УСТОЙЧИВЫХ К 2-ДЕЗОКСН-Д-ГЛЮКОЗЕ

В результате разработанного нами метода (рис.1) были получены 2д,2Гк-Чэзмутанты Chlorella (рис.2). Выделены две группы : GT- мутанты (glucose translocation mutants) не способные к гетеротрофному росту на глюкозе в темноте и CRS- мутанты (chlorcplast regulatory systems mu- tants), у которых сохранилось свойство рос-

\

^1-й этап »'селекции

Кез

2дДГ - мутанты, спонтанные и УФ

Изучение физиолого-биохими-ческих свойств СКЕ> - мутантов

Рис.1 Схема, селекции 2дДГ-

.Изучэние физиологе-биохимических свойств ВТ - ¡лутантов

регпстенткыА мухагто» о нарушенной сис-

темой кйгатиЕнзй ).:ё?=£олитко:': регуляции экспресии г&немд хлормздазть (СЯЗ-кутанты) г. о нарушенной системой транспорта

гявкегы ъ кгегку (ВТ- »¡утангы).

та на глюкозе в темноте, что присуще исходной (дикой) фор\ Chlorella IFPAS С-1 (табл. 1).

Исследование процессов поглощения 14С меченых глюкозы к е неметаболиеируемых аналогов показало, что у GT-мутантов (табл. 2 табл. 3) практически совершенно не происходит поглощение и -накоп ления " в клетках с-ахаров, в отличие- от клеток исходной культуры GRS- мутантов.

Таким образом, показано, что у 2дДГКезЗТ- мутантов нарушен система транспорта глюкозы в клетку. Данные мутанты представляю интерес для изучения вопросов связанных о транспортом глюкозы образованием ее переносчиков в клетке. У 2дЦГКеэСК5 мутантов сох ранилась интактной система активного транспорта экзогенной глюкоз; в клетку и их 2дДГ резистентность обусловлена не нарушениям: транспорта глюкозы, а иными причинами.

Изучение ростовых характеристик и продуктивности CRS а GT-мутантов показало, что они не отличаются по скорости роста и накоплению биомассы от исходной формы Chlorella (рис.3, рис.4). Отличительной особенностью полученных мутантов является то, что размер клеток, как ST-, так и GRS- мутантов существенно меньше пс сравнению с исходной культурой Chlorella, что еидно из кривы> распределения клеток по размерам в популяции культур (рис.5).

ИЗУЧЕНИЕ ФИЗНОЛОГО-ШОтЖЕСКИХ СВОЙСТВ 2дЗГйезСЗК МУТАНТОВ

Иаучете вмшяш 2дДГ на функциональную аяпувность хлоропласта CRS мутантов. Для выяснения причин устойчивости к аналогу глюкозы данной группы мутантов, а именно, обусловлена ли эта устойчивость нарушением механизма негативной регуляции фотосинтеза, исследовали действие 2дЦГ на ростовые характеристики, на фотосинтетическое выделение кислорода и синтез хлорофилла, а также на синтез белков хлоропласткого кодирования.

Исследования показали, что фотосинтетическое выделение кислорода у исходной формы Chlorella полностью подавляется через 60-75 мин после внесения 2дДГ в суспензию (рис.6). У CSS- мутанта выделения кислорода хотя и подавляется в начальный период о такой же скоростью как и у исходной формы, однако через 30 мин выделения 02 стабилизируется на уровне 30% от исходной интенсивности.

Кинетика подавления синтеза хлорофилла описывается двухфазной кривой с выходом на стационарное значение (рис. 7) в отличие от

Таблица 2

Скорость поглощения 14С - меченых 2дДГ и глюкозы клетками исходной культуры и ЕдДГКез - мутантами Chloreila

Штамм Число клеток Поглощение гексоз,

X Юбкл/мл мкмоль/мин/109 клеток

D-глюкоза 2дДГ

Исходный 125 89,2 318,4

2дДГКезмутанты:

CES-03 120 217,4 290,4

ST-1 122 7,5 9,6

Таблица 3

Скорость поглощения 14С меченых 3-0-метилглюкозы к глюковы клетками исходной культуры и 2дДГКез-мутантами Chlorella.

Штамм Число клеток Поглощение гексоз,

мкмоль/мин/10'эклеток

10бкл/мл ------------------------------

D- глюкоза З-О-метклглюкоза

Исходный 200 62,4 302,4

2дДГКезмутанты:

CRS-03 200 213,0 405,0

GT-2 200 3,3 6,3

ВРЕМЯ, Ч

PHC.S ДИНАМИКА РОСТА ИСХОДНОГО ШТАММА И 2дДГКЕЗМУТАНТ0В CHLORELLA: 1- ИСХОДНЫЙ ШТАММ, 2- GRS 03, 3- CRS 4, 4- ВТ 2, 5- ВТ 1.

РИС.4 ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОДУКТИВНОСТИ

ИСХОДНОГО ШТАММА (1), 2ДДГКЕЗ 'РИС.5 РАСПРЕДЕЛЕНИЕ КЛЕТОК ПО МУТАНТОВ: 2- CRS 03, 3- CRS 4, РАЗМЕРАМ: 2 - ИСХОДНЫЙ'

4- GT 2, 5- GT 1. ШТАМЛ, i-CRS 03, 3-ВТ 1

Chlorella IPPAS C-l где сразу же после внесения аналога глюкозы наблюдается подавление синтеза хлорофилла, содержание которого к 48-ми ч достигает нулевого значения.

Полученные результаты могут указывать на то, что 2дДГ резистентность фотосинтеза GRS мутантов связана с нарушениями репрессирующего действия глюкозы в хлоропласте. Частичное подавление синтеза хлорофилла и выделения кислорода и последующая их стабилизация на определенном уровне может быть обусловлено множественностью копий .ДНК в геноме хлоропласта, не все из которых затрагиваются мутациями.

Важным был вопрос- сохраняется ли у регуляторных мутантов синтез основных ферментов фотосинтеза при действии 2дДГ, В качестве маркерного фермента использовалась мембранносЕязанная карбоангид-раза (мсКА), синтез которой осуществляется на 70S рибосомах (Пронина, 1982). Измерение активности фермента у регуляторных CRS -мутантов показало, что в отличии от исходной формы Chlorella, 2дДГ не подавляет у них сгатез мсКА (рис.8), уровень которой практически не изменяется по сравнению с исходным значением (36% от контроля) , что является еще одним доказательством того, что у этих мутантов нарушена система метаболитной регуляции экспрессии гекомз хлоропласта.

CKS-муианш супврпродуцвзтгм ашшшвшоз. Исходя из гипотезы о молекулярной организации механизмов регуляторного действия глюкозы в хлоропласте (Семененко, 1988), можно было ожидать, что CRS- мутанты, у которых произошли нарушения в системе метаболитной регуляции экспрессии генома хлоропласта, т.е. в системе ограничивающей функцию хлоропласта, должны отличаться свойствами суперпродуцентов и накапливать сверхвысокие количества аосимилятов (углеводов) в хлоропласте.

Для создания условий направленного синтеза углеводов блокировали деление клеток путем исключения азота из питательной среды. Как видно из таблицы 4 содержание углеводов у мутанта к 64 ч. з 1,9 раз выше исходной культуры Chlorella.

Другим фактором, вызывающим направленный синтез углеводов является экстремальная (43°С) температура (Семененко и др., 1969). В проведенных экспериментах исходную культуру и мутант выращивали на полной среде Тамия при 36°, а затем переводили в условия экстремальной температуры. Содержание углеводов определяли через 20 ч. Как видно из таблицы 5 накопление углеводов у мутанта в 1,5 раза

м 1 а м XI й ККНЕ

го а

[Л пп

IV

а

да к

ш г* <3

1 о

м

С} го га

м Г" Г" > Ьм гч Йз

_ Э ш & 2

■11 ПГ1

1 -и > 9 1

гл £ г

а

гп о 14 -

м I ш

>

^

о ё

С) "О О

м >?.<

м 1

;и Е-

[Ч

м э

5,

> и

ж

ч о

CJ •ч

го ш §

СИНТЕЗ ХЛОРОФИЛЛА, ОТН. ЕД

ВЫДЕЛЕНИЕ КИСЛОРОДА, ОТН. ЕД.

Л*

I

- 15 -

превышает их содержание в исходной культуре.

Данные этих экспериментов однозначно свидетельствуют о том, что мутации у 2дДГКезСRS- мутантов, в результате которых произошли нарушения в системе метаболитной регуляции экспрессии генома хлоропласта, привели к повышению, по сравнению с исходной культурой, предела накопления ассимилятов (углеЕодоЕ), уровень которых достигал 60 - 70% от сухой биомассы.

Таким образом, 2дДГКе£!СЕ5 мутанты, характеризуются следующими маркерными признаками: 1) способностью к росту на средах с аналогом глюкозы 2) способностью к активному транспорту в клетку экзогенной глюкозы и ее аналогов; 3) способностью к гетеротрофному росту на глюкозе в темноте 4) устойчивостью фотосинтетического выделения кислороде, синтеза пигментов и хлороплнстных белков к репрессирующему действию аналогов глюкозы; 5) способностью накапливать сверхвысокие количества ассимилятов в хлоропласте.

Изучение атбильносгт признаков CSS мутантов.Исследована стабильность признаков 2дДГКез0ЕБ мутантов. Показано, что после 4-х летнего поддержания этих культур в коллекции в условиях последовательных пересевов о последующим хранением их в течение четырех лет при температуре жидкого азота (в условиях крисконсервации) все свойства , изначально присущие этим мутантам , устойчивы и стабильно сохраняются дате в отсутствии селектирующего (2дДР) фактора.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате разработанного метода получены мутанты Chlorella, несущие дефект в системе негативной метаболитной регуляции экспрессии генома хлоропласта. Исследованно поглощение экзогенной глюкозы и ее аналогов в клетки мутантов и показано, что устойчивость клеток микроводорослей к репрессирующему действию аналогов глюкозы может быть обусловлено: нарушением системы активного транспорта экзогенной глюкозы в клетку - 2дЦГйе!30Т мутанты, нарушением системы метаболитной регуляции экспрессии генома хлоропласта (2дДГКезСК5 мутанты).

Показано, что е отличие от исходного штамма у полученных 2дДГЯезСЕЗ мутантов, 2дДГ не вызывает полного подавления роста культур, фотосинтетического выделения кислорода, Биосинтеза хлорофилла и синтеза мембранносвязанной хлоропласт-ной карбознгидразы.

Таблица 4

Сравнительная характеристика накопления углеводов у Chlorella IFPAS С-1 и Chlorella 2дДГЯезСКЗ 03 на среде без азота

Культура Содержания углеводов мг/мл Прирост углеводов

0 час. 24 час. 58 час. мг/ыл %

Chlorella

IPPAS С-1 0,146 0,390 0,390 0,242 1С0

Chlorella

2ддГКе5СКЗ 03 0,130 0,314 0,500 0,471 195

Таблица в

Сравнительнал характеристика накопления углезодог у Chlorella IPPAS С-1 и Cnlorelia 2д£ГКезСЯЗ 03 при экстремальной температуре

Chlorella IFPAS C-l Chlorella 2дДГЙ53СР5 03

Параметры 0 чао. 20 чао. прирост и час. 20 час. Прирост

Кол-во

угл.мг/106кл 0,135 0,604 0,405 0,134 0,727 0,603

Сод-е

угл.% от

сух. массы 31,4 57,5 26,1 26,8 55,4 33,5

Наблюдающееся частичное подавление может быть связано с множеством копий ДНК в геноме хлоропласта, не все из которых затрагиваются мутациями.

Устойчивость 2дДГ - резистентных CF:S мутантов к репрессирующему действию аналога глюкозы, может быть обусловлена различными причинами: 1. мутзциями генов, ответственных за синтез ферментов углеводного метаболизма и нарушением процесса образования эффекторов в в хлоропласте - молекул глюкозы, т.е. нарушением процессов появления регуляторного сигнала; 2. мутациями генов, контролирующих синтез регуляторных макромолекул и мессенжеров, с которыми взаимодействует глюкоза, как эффектор, т.е. нарушением механизмов детекции сигнала. Вероятнее всего, имеет место второе, поскольку в первом случае система детекции оказалась бы не нарушенной и аналоги глюкозы вызывали бы репрессию генома хлоропласта у этих мутантов, как и у исходной формы Chlorella, что, как видно из полученных результатов, не наблюдается. В чем состоит природа нарушения регуляторного действия глюкозы остается неясным. Это могут быть деффекты регуляторных последовательностей гена репрессора, или структурной части этого гена, или мутации регуляторной макромолекулы, с аллоотерическим центром которой связывается молекула глюкозы.

Модельные эксперименты с разобщением клеточных функций деления клеток и фотосинтеза, которое достигалось исключением азота из питательной среды и повышением температуры, показали, что в клетках CRS мутантов накапливается почти в два раза больше углеводов по сравнению с исходной культурой.

Полученные мутанты представляют интерес для дальнейшего углубленного исследования молекулярной организации системы регуляторного действия глюкозы в хлоропласте, а также в связи с проблемами биотехнологии фотоавтотрсфных биосинтезов.

выводы

1. Разработан метод и получены мутанты Chlorella о нарушенной системой негативной метаболиткой регуляции фотосинтеза конечным продукте« фотоскнтетического восстановления углерода (глюкозой) -Chlorella 2дДГКезСК5 мутанты.

2. Изучено поглощения 14С-меченых глюкозы, 2-дезокси-Д-глюкозы и 3-0-метилглюкозы клетками 2дДГ резистентных мутантов и пока-

еако, что устойчивость к икгибкрушэму действию аналога глюкогы обусловлена у одной группы мутантов нарушением системы поглощения экзогенной глюкозы ь клетку гЕдДГ'^05 GT мутанты), у другой группы нарушением системы негативной метаболитной регуляции фотосинтеза (2дДГНезСКЗ- мутанты).•_

3. Исследованы ростовые характеристики, фотосинтетическое выделение кислорода, синтез пигментов, активность хлороплаотной кар-боангццразк у 2дДГК|гзСЕ5 мутантоЕ и показано, что аналог глюкозы не вызывает у них в отличие от исходной формы полного подавления функциональной активности фотосинтеткческого аппарата .

4. Показано, что нарушение в системе метаболитной регуляции Фотосинтеза приводит к гипертрофированному накоплению азсимидлтов в клетка:-; 2дДГгсезСН5 мутантов.

5. Исследована стабильность признаков 2дДГКезСК5 мутантов и показано, что свойства, изначально присущие данной группе мутантов устойчивы и сохраняются как в обычных условиях хранения, при регулярных пересева:-: без селектирующего фактора, так и ь условиях кри-оконсергацли.

'8. Полученные мутанты Chlorella с нарушенной системой метаболитной регуляции являются инструментом для исследования молекулярных механизмов регулятсрного действия глюкозы в хлоропласте, к могут представлять интерес для биотехнологических целей.

Сгшсон работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Семененко В.Е., Шитова Л.А. г-дезокси-Д-глжкова резистентный мутант Chlorella с нарушенной системой метаболитной регуляции экспрессии генома хлоропласта // 16 конф. ФЕЕО. 19S4. С.253.

■ 2. Шитова Л.А. Получение и характеристика 2-дДГ резистентных мутантов Chlorella // Тез. докл. 2 Есессюз. конф. молодых учены:-: по физиологии растений, М. 1985. С. 76.

3. Семененко Е.Е., Шитова Л.А., Рудова Т.С. Характеристика фотссиктетического аппарата и биосинтеза 2дЛГ-резистентного мутанта хлореллы с нарушенной системой метаболитной регуляции экспрессии генома хлоропласта /'/ Тез. докл. Есессюз. конф. молод, учены?: "Современные проблемы биохимии и физико-химической биологии", М. 1986.

4. Шитова Л. А. Глюкозный эффект репрессии синтеза карбоангид-разы и РБФ-карбоксилазы у Chlorella и ее регуляторпых мутантов // Тез. 3 Всесоюз. копф. молодых ученых по физиологии раст., Петрозаводск. 1988. С. 36.

5. Семененко В. Е., Шитова Л. А. Способ получения регуляторпых мутантов фотосиптезирующих микроводорослей и штамм водоросли СЫогеНа-продуцент углеводов: А. С. № 1054337 // 199:1. Д» 21.

6. Kasatkina Т. Т.. Sliylova L. A., Rudova Т. S. The influence exctreme factors on (he photosyntesis Chlorella cells // 4 International Phycological Congress, Duke, 1991.

7. Семененко В. E„ Шитова Л. А., Рудова Т. С., Пронина II. А. Ре-гуляторные 2-дезокси-Д-глюкоза резистентные мутанты Chlorella с нарушенной системой негативно!"! метаболитной регуляции экспрессии генома хлоропласта конечными продуктами фотосинтеза // Физиология растений, 1992. Т. 39. Вып. (>. С. ,1135.

8. Шитова Л. А., Маслова И. II., Владимирова М. Г., Купцова Е. С., Семененко П. Е. Стабильность признака 2дДГце5С1?5 03 мутанта после длительной криоконсервации // Тез. докл. 3 съезда Всерос. общ. фи-зиол. раст. С.-Петербург. 1993. С. 97.

9. Ivuptsova Е. S., Maslova I. P., Vladimirova М G., Shytova L. А., Semenenko V. Е. Stability of the characteristic features of 2dDG regulatory Chlorella mutant CRS-03 after cryoconservation // Progress in Biotechnology of Photoautotrophic Microorganisms" 6th International conference on Applied Algology. Czechia, 1993.

10. Shytova L. A., Semenenko V. E. Regulatory 2-deoxy-D-glucose resistant mutants of Chlorella deficient in the system of negative metabolite regulation and their properties // "Progress in Biotechnology of Photoautotrophic iMicroorganisms" 6th International conference on Applied Algology, Czechia, 1993.

11. Шитова Л. А., Мещеряков В. E., Семененко В. Е. Регуляторные мутанты Chlorella с нарушенной системой транспорта экзогенной глюкозы в клетку // Физиология растении, 1994. Т. 41. Д° 2. С. 223.

-Объем 1,25 п. л.

Поди, к печ. 27.09.94.

Зак. 315. Тир. 100

Типография МПГУ им. В. И. Лешша