Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование водорослей в симбиотической системе: Paramecium bursaria - Chlorella sp. - вирус PBCV

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мигунова, Александра Владимировна

Введение.

Глава I. Обзор литературы.

1.1. Явление тройственного симбиоза в системе: Paramecium bursaria

Chlorella sp.- PBCV.

1.1.1. Взаимоотношения инфузории с ее эндосимбионтом зоохлореллой.

1.1.1.1. Клеточная биология симбиоза "растение - животное".

1.1.1.2. Периальгальные и пищеварительные вакуоли.

1.1.1.3. Инфицирование Paramecium bursaria как индукционный процесс.

1.1.1.4. Регуляция численности внутриклеточных водорослей.

1.1.1.5. Метаболические взаимоотношения между симбионтами.

U.2. Chlorella sp.

1.1.2.1. Сравнительная физиология, биохимия и таксономия Chlorella

1.1.2.2. Видоспецифическая способность штаммов Chlorella sp. формировать стабильный симбиоз.

1.1.2.3. Описание зоохлорелл из Paramecium bursaria.

1.1.2.4. Маркирование зоохлорелл.

1.1.2.4.1. Клоновая изменчивость зоохлорелл.

1.1.2.4.2. Механизмы действия ингибиторов роста на клетки зеленых водорослей и на другие эукариотические микроорганизмы.

LI.2.4.3. Получение и описание множественно-маркированных линий

Chlorella sp. и зоохлорелл.

1.1.3. Явление вирусоносительства зоохлорелл в культурах гидр и инфузорий.

1.1.3.1. Вирусы PBCV-1 типа.

1.1.3.2. Место вируса в симбиозе: Paramecium bursaria - Chlorella sp.- PBCV

1.1.3.3. Экология вирусов из США, Китая и Европы.

1.1.3.4. Физические и химические свойста вирусов PBCV-1 типа.

1.1.3.5. Редуцирующие агенты и их влияние на PBCV-1.

1.1.3.6. Рецепторы вируса.

1.1.3.7. Рецепторы зоохлорелл.

1.2. Серологические методы.

1.2.1. Серологические методы исследования симбиотических ассоциаций.

1.2.2. Основные серологические понятия.

1.2.3. Иммунизация.

1.2.3.1. Выбор лабораторных животных.

1.2.3.2. Процесс иммунизации.

1.2.4. Методы иммунного анализа.

1.2.4.1. Определение титра антигенов и антител методом агглютинации.

1.2.4.2. Иммунодиффузия в геле.

1.2.4.3. Вестерн-блоттинг.

1.3. Полимеразная цепная реакция с универсальными праймерами (УП

ПЦР).

Глава II. Материал и методы исследования.

II. 1. Объекты исследования.

II. 1.1. Клоны инфузорий Paramecium bursaria.

II. 1.2. Штаммы Chlorella sp., эндосимбионты P. bursaria.

II. 1.3. Клоны вирусов зоохлорелл.

II. 1.4. Использованные антисыворотки.

II.2. Методы культивирования.

11.2.1. Получение и поддержание коллекционных клонов инфузорий Paramecium bursaria.

11.2.2. Выделение и культивирование штаммов Chlorella sp.

11.2.3. Получение и сохранение вирусов.

II. 3. Проверка штаммов зоохлорелл на чувствительность к вирусам.

II.4. Методы определения чувствительности членов тройного симбиоза к температуре.

11.4.1. Определение влияния температуры на рост зоохлорелл.

11.4.2. Определение влияния температуры на размножения инфузорий.

II.4.3. Определение влияния температуры на репликацию вируса.

11.5. Серологические методы.

II.5.1. Иммунизация кроликов.

И.5.2. Получение сыворотки.

11.5.3. Иммунизация кур.

11.5.4. Получение сыворотки из желтков куриных яиц.

11.5.5. Определение титра сыворотки.

11.5.6. Метод двойной диффузии по Оухтерлони.

11.5.7. Иммуноблоттинг.

11.6. Генотипирование коллекционных штаммов зоохлорелл с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

11.6.1. Выделение ДНК из клеток зоохлорелл.

11.6.2. Амплификация фрагментов ДНК с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) с универсальными праймерами.

11.6.3. Электрофорез ДНК.

11.7. Статистическая обработка результатов.

Глава III. Результаты исследований и обсуждение.

III. 1. Экотипы симбиотической системы: Paramecium bursaria - Chlorella sp.

- PBCV (Phycodnaviridae),.

III. 1.1. Экологическое распространение тройного симбиоза: Paramecium bursaria - Chlorella sp.- PBCV.

III. 1.2. Влияние температуры на рост и размножение членов тройного симбиоза в системе: Paramecium bursaria - Chlorella sp.- PBCV.

III. 1.3. Возможности существования вируса PBCV- типа в природе вне клетки зоохлореллы.

111.2. Серологическая характеристика зоохлорелл.

111.3. Генотипирование коллекционных штаммов методом амплификации фрагментов ДНК с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) с универсальными праймерами.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование водорослей в симбиотической системе: Paramecium bursaria - Chlorella sp. - вирус PBCV"

Важнейшим направлением экологии является исследование взаимоотношений между организмами в сообществах. Уже в конце прошлого века наметился ряд направлений исследований в области экологической бактериологии. Выделились почвенная, пресноводная и морская микробиологии - направления, связанные с изучением взаимоотношений микроорганизмов (Громов, Павленко, 1989).

Данная работа посвящена изучению зоохлорелл - чувствительных к вирусу симбиотических Chlorella-подобных водорослей из системы тройного симбиоза: Paramecium bursaria - Chlorella sp. - вирус PBCV (сем. Phycodnaviridae).

Впервые вирус PBCV (Paramecium bursaria Chlorella virus) был обнаружен японскими исследователями (Kawakami, Kawakami, 1978) в клонах инфузорий Paramecium bursaria. Позже (1981-2001) он исследовался в США группой ученых под руководством Ван Эттена (Van Etten et al., 1981-1999; Zhang et al., 2001), а так же в Германии группой Вернера Рейссера (Reisser et al., 1980-1991; Becker et al., 1993). В нашей стране первые вирусы PBCV-типа были найдены К. В. Квитко и Б. В. Громовым в клонах инфузорий P. bursaria выделенных из популяций Дальнего Востока и Армении (Квитко, Громов, 1984), а затем (Квитко и др., 1985) они были обнаружены и в карельских клонах. В природе эти вирусы часто обнаруживают в пробах воды из пресноводных водоемов (Van Etten et al., 1985; Reisser et al., 1986; Yamada et al., 1991, 1993; Kvitko et al., 1994, 1996; Migunova et al., 1996, Мигунова и др., 1999; Van Etten and Meints, 1999).

Большое разнообразие водорослей рода Chlorella (Андреева, 1975) позволило им широко распространиться в пределах биосферы. Их клетки встречаются в воде, почве, в виде обрастаний на деревьях, в составе пресноводных симбиотических систем. В последнем случае они вынуждены приспосабливаться к условиям, определяемым клеткой хозяина. Такая узкая специализация с одной стороны ограничивает распространение водоросли, а с другой стороны дает им возможность прочно занять свою экологическую нишу.

Симбиотические Chlorella-подобные водоросли - зоохлореллы из системы тройного симбиоза: Paramecium bursaria - Chlorella - PBCV, являются специфической группой эукариотических организмов. В организме хозяина симбиотические водоросли защищены от вирусов индивидуальными периальгальными вакуолями, но после разрушения клетки хозяина зоохлореллы становятся беззащитными. Зоохлореллы также получают от P. bursaria витамины и азотсодержащие органические вещества, что делает их ауксотрофами. Хозяин же получает от зоохлорелл такие продукты фотосинтеза как кислород и сахара (мальтозу, глюкозу) и симбиоз становится практически облигатным. Поэтому естественный отбор среди зоохлорелл должен работать в направлении образования клонов специализированных форм с очень устойчивыми сочетаниями признаков приспособления к клеткам хозяина.

Вероятно, прародительская форма изучаемого нами симбиоза содержала единый тип симбионтов, но в результате дивергенции в процессе эволюции могли формироваться разные формы зоохлорелл, отличающиеся по экологическим показателям (например, температурная зависимость),. что оказалось важным для расширения ареала обитания.

Изучение симбиотической системы: Paramecium bursaria - Chlorella sp. - PBCV важно по ряду причин. Во-первых, слабо исследованы свойства симбиотических хлорелл (генетика, физиология, серология) и принципы географического распространения изучаемой симбиотической системы. Их анализ может расширить существующие представления о биологическом разнообразии и географическом распространении водорослей рода Chlorella. Для этого необходимо было создание коллекции зоохлорелл. Во-вторых, такая коллекция могла бы быть использована для проведения работ по проверке трансдуцирующей способности вируса, а также для работы по получению искусственных симбиотических ассоциаций, по реконструкции симбиотических отношений, и в других работах, связанных с изучением тройного симбиоза. В-третьих, предметом нашего исследования является сложная иерархическая высокоспецифичная система. Для существования в природе вируса необходимо предварительное развитие симбиотических зоохлорелл, стабильно существующих в природе лишь в симбиозе с инфузорией. Это предполагает необходимость в наличии стабильных экологических условий для существования системы в целом. А это позволяет использовать симбиотическую систему, а точнее, вирус - как индикатор чистоты водоемов (Квитко и др., 1994).

Изучение системы тройного симбиоза: Paramecium bursaria - Chlorella - PBCV ведется нами с 1984 года. Данная работа является продолжением дипломной работы, в ходе которой были показаны четкие различия между зоохлореллами (чувствительными к вирусам симбионтами P. bursaria) и свободноживущими Chlorella sp. по способности к клонированию, фотосинтетической активности, чувствительности 8 к УФ-облучению, к антибиотикам и ингибиторам роста, а также была получена коллекция множественно-маркированных штаммов зоохлорелл (Чернышева, 1988).

Целью настоящей работы является изучение закономерностей географического распространения зоохлорелл - компонентов системы: Paramecium bursaria - Chlorella sp. - PBCV и уточнение их систематического положения. В задачи работы входили:

1) поиски вирусов PBCV-типа в коллекционных клонах инфузории и в природных пробах воды для определения географических границ распространения изучаемого симбиоза, а также пополнение коллекции вирусов, зоохлорелл и инфузорий Paramecium bursaria.

2) изучение зависимости роста и размножения членов тройного симбиоза от температуры;

3) антигенная характеристика коллекционных штаммов зоохлорелл серологическими методами;

4) генотипирование зоохлорелл с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР);

5) уточнение систематического положения зоохлорелл - симбионтов Paramecium bursaria.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Мигунова, Александра Владимировна

Выводы

1. Изолированные из Paramecium bursaria штаммы Chlorella sp. могут быть подразделены на три группы: вирусочувствительные штаммы зоохлорелл "северного" и "южного" экотипов, а также вирусоустойчивые Chlorella sp.

2. Экспериментально подтверждена гипотеза о климатической зависимости географического распространения двух экотипов ("южного" и "северного") симбиотической системы Paramecium bursaria - Chlorella sp. - PBCV, выдвинутая нами в результате скрининга природных проб воды и коллекционных клонов инфузорий Paramecium bursaria на наличие вирусов PBCV-типа.

3. Доказана зависимость скорости размножения инфузорий и зоохлорелл - членов тройного симбиоза от температуры. Определен температурный предел выживаемости (32° С), при котором члены симбиотической системы "северного" экотипа гибнут, тогда как члены симбиотической системы "южного" экотипа продолжают размножаться.

4. Получены кроличьи и куриные антисыворотки к штаммам зоохлорелл "южного" (Ас-21) и "северного" (ОСН) экотипа и к штамму свободноживущих Chlorella sp. (CALU-157). С их помощью показано существование штаммоспецифических поверхностных антигенов для вирусочувствительных зоохлорелл двух экотипов.

5. На основе отработанного нами эффективного метода ПЦР-идентификации экотипов зоохлорелл показано, что консервативный праймер L-15 может быть использован для строгой ПЦР-идентификации экотипов, а вариабельный АА 2 - для определения серотипов внутри групп.

6. Антигенное сходство внутри групп "северных" и "южных" зоохлорелл, а также различие между этими группами подтверждено методом геномной дактилоскопии. Показано, что если зоохлореллы - симбионты P. bursaria и могут относиться к единому виду Chlorella paramecii, то внутри этого вида должны быть выделены как минимум два экотипа зоохлорелл.

Заключение

В результате исследования коллекции инфузорий, а также природных проб воды установлены географические границы распространения 2-х экотипов ("южного" и "северного") симбиотической системы Paramecium bursaria - Chlorella sp. - PBCV. Была выдвинута гипотеза о климатической зависимости географического распространения 2-х экотипов исследуемой симбиотической системы.

Экспериментально доказана зависимость скорости размножения членов симбиоза (в большей степени инфузорий и водорослей) от температуры, что подтверждает гипотезу о климатическом влиянии и является основанием для разделения экотипов на "северный" и "южный". Определен температурный предел (32°С) существования членов симбиотической системы "северного" экотипа, при котором они гибнут, тогда как члены симбиотической системы "южного" экотипа продолжают размножаться.

С помощью полученых кроличьих и куриных антисывороток к штаммам зоохлорелл "южного" (Ас-21) и "северного" (ОСН) экотипа и к штамму свободноживущих Chlorella sp. (CALU-157) показано существование штаммоспецифических поверхностных антигенов для вирусочувствительных зоохлорелл 2-х экотипов.

Исследование фенотипических характеристик Chlorella sp. в сочетании с методом ПЦР-дактилоскопии позволило определить, что все изолируемые из Paramecium bursaria штаммы Chlorella sp. могут быть подразделены на 3 группы: вирусочувствительные штаммы зоохлорелл "северного" и "южного" экотипов, а также вирусоустойчивые Chlorella sp.

Эффективный метод ПЦР-идентификации экотипов зоохлорелл был применен и отработан на основе использования двух праймеров. Праймер L-15 проявлял свойства консервативного, а праймер АА 2 - вариабельного. Консервативный праймер может быть рекомендован для строгой ПЦР-идентификации экотипов зоохлорелл, а вариабельный - для определения серотипов внутри групп.

Обнаружено сходство между дендрограммами родства, построенными по данным серологического анализа методом иммуноблоттинга и по данным метода ПЦР-генотипирования.

Зоохлореллы-симбионты Paramecium bursaria могут относиться к одному виду Chlorella paramecii, однако внутри этого вида должны быть выделены как минимум два экотипа зоохлорелл.

94

Полученная в ходе работы коллекция множественно-маркированных штаммов зоохлорелл использовалась в работах по реконструкции симбиотических отношений (Ордян, 1985, 1989), по изучению тройственного симбиоза (Линц, 1990, 1992; Прокошева, 1999) и в работе по получению искусственных симбиотических ассоциаций (Карпов, 1999). В работах Ордян (1985, 1989), Гончаровой (1987), Линца (1990, 1992), Прокошевой (1999) были использованы полученные в данной работе антисыворотки. Антисыворотки применялись также в практикуме "серологические методы в микробиологии" проводившемся нами для магистрантов кафедры микробиологии в 1999 и 2000 годах.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мигунова, Александра Владимировна, Санкт-Петербург

1. Андреева В.М. Род Chlorella II Ленинград. Наука. 1975. 83 с.

2. Андреева В.М. Почвенные и аэрофильные зеленые водоросли (Chlorophyta: Tetrasporales, Chlorococcales, Chlorosarcinales) // Санкт-Петербург. Наука. 1998. 352 с.

3. Бархатов Ю.В., Хромечек Е.Б., Губанов В.Г. Оценка влияния бактериальной составляющей на жизнеспособность симбиотического комплекса Paramecium bursaria (инфузория-зоохлорелла) // Экология. 2001. N 4. С. 286-290.

4. Булат С.А., Кабоев O.K., Мироненко Н.В., Ибатуллин Ф.М., Лучкина Л.А., Суслов А.В. Полимеразная цепная реакция с универсальными праймерами для изучения геномов // Генетика. 1992. Т. 28. N 5. С. 19-27.

5. Воронина Т.А. Изменчивость вирусов и чувствительных к ним зоохлорелл из Paramecium bursaria: Дипл. раб. // каф. микробиологии. ЛГУ. Ленинград. 1985.42 с.

6. Гнутова Р.В. Иммунологические исследования в фитовирусологии // Москва. Наука. 1985. 183 с.

7. Гончарова З.Г. Выделение и характеристика вирусов PBCY-1 из проб культуральной жидкости Paramecium bursaria: Курс. раб. // каф. микробиологии. ЛГУ. Ленинград. 1987. 32 с.

8. Горвиц М., Шарфф М. Получение антисывороток к вирусным антигенам // Методы вирусологии и молекулярной биологии. Москва. Мир. 1972. С. 200207.

9. Громов Б.В., Павленко Г.В. Экология бактерий // Ленинград. 1989. 248 с.

10. Громов Б.В., Титова Н.Н. Коллекция культур водорослей лаборатории микробиологии Биологического института Ленинградского университета // Культивирование коллекционных штаммов водорослей. Ленинград. 1983. С. 3-27.

11. Ефремова Л.П. Сравнительное хемотаксономическое изучение одноклеточных сине-зеленых водорослей: Канд. Дисс. // каф. микробиологии. ЛГУ. Ленинград. 1978. 150 с.

12. Захаров И.А., Квитко К.В. Генетика микроорганизмов // Ленинград. ЛГУ. 1967. 243 с.

13. Йомтов М. Иммунохимические методы в микробиологии // Экспериментальная микробиология. София. 1965. С. 86-116.

14. Карпов А.С. Получение и некоторые свойства искусственной эндоцитобиотической ассоциации амеб и хлорелл: Канд. Дисс. // институт цитологии РАН. Санкт-Петербург. 1999. 180 с.

15. Квитко К.В., Борщевская Т.Н., Чунаев А.С., Тугаринов В.В. Петергофская генетическая коллекция штаммов зеленых водорослей Chlorella, Scenedesmus, Chlamydomonas II Культивирование коллекционных штаммов водорослей. Ленинград. 1983. С. 8-57.

16. Квитко К.В., Громов Б.В. Новые находки титруемого инфекционного вируса хлореллы // Докл. АН СССР. 1984. Т. 279. N 4. С. 998-999.

17. Квитко К.В., Войцеховский Е.В., Мигунова А.В., Зеленникова О.А., Линц Б. Популяционная изменчивость агамных зоохлорелл и их вирусов // Сб. Тез. конф. "Прикладная генетика микроорганизмов". Генетика. Т. 30. Приложение. Саратов. 1994. С. 68.

18. Квитко К.В., Краева Е.С., Чернышева А.В. Генетическая маркировка зоохлорелл хозяев вирусов PBCV // Вестник ЛГУ. Сер. биол. 1988. N 3. вып. 1. С. 120-124.

19. Квитко К.В., Симаров Б.В. Множественно-маркированные линии хлореллы как инструмент для изучения генетики этой водоросли // Вестник ЛГУ. Сер. биол. 1966. N 15. вып. З.С. 110-116.

20. Квитко К.В., Скобло И.И., Краева Е.С., Сковородина Е.В., Воронина Т.А. Изменчивость вирусов и чувствительных к ним зоохлорелл из Paramecium bursaria II Сб. Тез. VII съезда ВМО. Алма-Ата. 1985. Т. 6. С. 32.

21. Квитко К.В., Хропова В.И. Использование ауксотрофных мутантов для выявления мутагенной активности алкильных производных мочевины // Исследования по генетике. Ленинград. 1979. Вып. 8. С. 82-88.

22. Квитко К.В., Хропова В.И., Чунаев А.С., Тугаринов В.В. Эукариотическиеводоросли // Методы создания и поддержания коллекции водорослей. Москва. 1982. С. 193-230.

23. Кетти Д. Антитела 1. Методы // Москва. Мир. 1991. 287 с.

24. Князева Н.В. Изменчивость скорости адсорбции вирусов на клетках зоохлорелл из Paramecium bursaria: Дипл. раб. // каф. микробиологии. ЛГУ. Ленинград. 1985. 42 с.

25. Краева Е.С. Изучение тройственности симбиоза Paramecium bursaria -Chlorella вирус: : Дипл. раб. // каф. микробиологии. ЛГУ. Ленинград. 1986. 47 с.

26. Ланчини Д., Парнети Ф. Антибиотики // Москва. Мир. 1985. 269 с.

27. Линц Б. Оценка температуроустойчивости инфузорий с симбиотическими водорослями: Курс. раб. // каф. микробиологии. ЛГУ. 1990. 75 с.

28. Линц Б. Использование белковых маркеров для характеристики вирусочувствительных и устойчивых к вирусам штаммов Chlorella : Дипл. раб. // каф. Микробиологии. СПбГУ. Санкт-Петербург. 1992. 87 с.

29. Мигунова А.В., Квитко К.В., Князева Н.В. Изменчивость серологических характеристик маркированных штаммов зоохлорелл симбионтов Paramecium bursaria, чувствительных к вирусу // Альгология. 1992. Т. 2. N 3. С.43-48.

30. Мигунова А.В., Квитко К.В., Скобло И.И., Прокошева М.Ю. Экология симбиотической системы: Paramecium bursaria Chlorella - virus // Вестник СПбГУ. сер.З биол. 1999. вып. 3. N 17. С. 131-144.

31. Мигунова А.В., Квитко К.В., Прокошева М.Ю., Литвинов Д.Б. Влияние температуры на размножение Paramecium bursaria, Chlorella, PBCV-1 вирусов в системе тройного симбиоза // Вестник СПбГУ. 2000. сер. 3. вып. 1. N3. С. 65-75.

32. Ордян Н.Э. Метод выделения вирусочувствительных ревертантов хлорелл по их способности инфицировать Paramecium bursaria: Курс. раб. // каф. микробиологии. ЛГУ. Ленинград. 1985. 18 с.

33. Ордян Н.Э. Изменчивость признака "Способность колонизировать клетки животных в потомстве маркированных линий зоохлорелл." : Дипл. раб. // каф. микробиологии. ЛГУ. Ленинград. 1989. 80 с.

34. Петров Р.В. Иммунология // Москва. Медицина. 1987. 367 с.

35. Прокошева М.Ю. Характеристика членов тройного симбиоза: Paramecium bursaria Chlorella - вирус: Магистрская диссертация // каф. микробиологии. СПбГУ. Санкт-Петербург. 1999. 78 с.

36. Раилкин А.И. Количественный анализ фагоцитоза Paramecium caudatum Ehrbg. и Spirostomum ambiguum Ehrbg. // Acta Protozoologica. Warszava. 1981. V. 20. N. 3. P. 255-280.

37. Сковородина E.B. Уточнение видовой принадлежности зоохлорелл -симбионтов Paramecium bursaria на основе морфологических признаков: Курс. раб. //каф. Микробиологии. ЛГУ. Ленинград. 1985. 18 с.

38. Сэджер Р. Цитоплазматические гены и органеллы // Москва. Мир. 1975. 423 с.

39. Тугаринов В. В. Получение стрептомицинустойчивых и стрептомицинзависимых штаммов у Chlorella vulgaris II Вестник ЛГУ. Сер. биол. 1965. N 9. вып. 2. С. 136-142.

40. Франклин Т., Сноу Дж. Биохимия антимикробного действия // Москва. Мир. 1984. 238 с.

41. Чернышева А.В. Мутационная изменчивость зоохлорелл хозяев вируса PBCV: Дипл. раб. // каф. микробиологии. ЛГУ. Ленинград. 1988. 75 с.

42. Ayala A., Weis D.S. The effect of puromycin and cycloheximide on the infection of algae-free Paramecium bursaria by symbiotic Chlorellae II J. Protozool. 1987. V. 34. N4. P. 377-381.

43. Becker В., Lesemann D.E., Reisser W. Ultrastructural studies on a chlorella virus from Germany // Arch. Virol. 1993. V. 130. P. 145-155.

44. Berninger U.G., Finlay B.J. and Canter H.M. The spatial distribution and ecology of Zoochlorellae-bearing ciliates in a productive pond // J. Protozool. 1986. P. 557563.

45. Bulat S.A., Lubeck M., Mironenko N.V., Jensen D.F., and Lubeck P.S. UP-PCR analisis and ITS1 ribotyping of strains of Trichoderma and Gliocladium /I Mycol. Res. 1998. V.102. P. 933-943.

46. Cantor M.H., Rahat M. Regulation of respiration and photosyntesis in hydra viridis and in its separate cosymbionts: effect of nutrients // Physiol. Zool. 1988. V. 55. N 3. P. 281-288.

47. Clayton B.C. Metabolic interchange in algae-invertebrate simbiosis // Intern. Rev. Cytology. 1983. V. 14. P. 117-210.

48. Douglas A.E., Huss V.A.R. On the characteristics and taxonomic position of symbiotic Chlorella II Arch. Microbiol. 1986. V. 145. P. 80-84.

49. Ebert B. Chlorellavirus proteine // Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades. Goettingen. 1999. 91 p.

50. Eves E.M., Chiang K.S. Genetics of Chlamydomonas reinhardii diploids. Isolation and characterisation and meiotic segregation pattern of a gomozygous diploid // Genetics. 1982. V. 100. P. 35-60.

51. Gassman M., Thommer P., Weiser Т., Hubscher U. Efficient production of chicken egg yolk antibodies against a conserved mammalian protein // Faseb J. 1990. V. 4. P. 2528-2532.

52. Girton L.E., Osterman J.S., Van Etten J.L. DNA segments of the algae virus, PBCV-1, capable of autonomous replication in Saccharomyces cerevisia II Genetics. 1984. V. 107. P. 38.

53. Hoson T. Structure and function of plant cell walls: Immunological Approaches // International Review of Cytology. 1991. V. 130. P. 233-263.

54. Huss V.A.R., Frank C., Hartmann E.C., Hirmer M., Kloboucek A., Seidel B.M., Wenzeler P., Kessler E. Biochemical taxonomy and molecular phylogeny of the genus Chlorella sensu lato (Chlorophyta) // J. Phycol. 1999. V. 35. P. 587-598.

55. Huss V.A.R., Hehenberger A., Kessler E. Deoxyribonucleic acid reassociation in the taxonomy of the genus Chlorella II Arch. Microbiol. 1987. V. 149. P. 1-3.

56. Huss V.A.R., Huss G., Kessler E. Deoxyribonucleic acid reassociation and interspecies relationships of the genus Chlorella (Chlorophyceae) II PL Syst. Evol. 1989a. V. 168. P. 71-82.

57. Huss V.A.R., Scharpf Т.К., Kessler E. Deoxyribonucleic acid reassociation in the taxonomy of the genus Chlorella II Arch. Microbiol. 19896. V. 152. P. 512-514.

58. Huss V.A.R., Wein K.H., Kessler E. Deoxyribonucleic acid reassociation in the taxonomy of the genus Chlorella //Arch. Microbiol. 1988. V.150. P.509-511.

59. Karakashian M.W. Symbiosis in P.bursaria Sumpos of Soc. Exp. 1 // Biol. 1975.1. V.29. P.145-173.

60. Karakashian M.W., Karakashian S.J. Intracellular digestion and symbiosis of Paramecium bursaria II Exp. Cell. Res. 1973. V. 81. P. 111-119.

61. Kawakami H., Kawakami N. Behavior of a virus in a symbiotic system Paramecium bursaria zoochlorella // J. Protozool. 1978. V. 25. P. 217-225.

62. Kessler E. A general review on the contribution of chemotaxonomy to the systematics of green algae // Systematic Association Special volume. "Systematics of the Green algae". 1984. N. 27. P. 391-407.

63. Kessler E. Comparative physiology, biochemistry, and the taxonomy of Chlorella (Chlorophyceae) II Plant Syst. Evol. 1976. V. 125. P. 129-138.

64. Kessler E., Huss V.A.R. Biocemical taxonomy of symbiotic Chlorella strains from Paramecium and Acanthocystis II Bot. Acta. 1990. V.103. P. 140-142.

65. Kessler E., Huss V.A.R., Rahat M. Species-specific ability of Chlorella strains (Chlorophyceae) to form stable symbiosis with Hydra viridis И Plant Systematics and Evolution. 1988. V. 160. P. 241-246.

66. Kessler E., Kauer G., Rahat M. Excretion of sugars by Chlorella species capable and incapable of symbiosis with Hydra viridis // Bot. Acta. 1991. V. 104. P. 58-63.

67. Kessler E. Scenedesmus : Problems of a highly variable genus of Green algae // Bot. Acta. 1991. V. 104. P. 169-171.

68. Kummel H., Kessler E. Physiological and biochemical contribution to the taxonomy of the genus Chlorella. XIII. Serological Studies // Arch. Microbiol. 1980. V. 126. P. 15-19.

69. Kutish G.F., Li Y., Lu Z., Furuta M., Rock D.L. Analysis of 76 kb of the chlorella virus PBCV-1 330-kb genom: map positions 182 to 258 II Virology. 1996. V. 223. P. 303-317.

70. Kvitko K.V., Zelennikova O., Migunova A.V., Voitsekhovsky E.V., Litvinov D., and Safonova E. Ecological and climatic rules for PBVC-virus circulation // Abstracts of X-th International Congress of Virology. 11-16 august. Jerusalem.1.rael. 1996. P. 250.

71. Kvitko K.V., Migunova A.V., Karelov D.V., Prokosheva M.Ju. Molecular taxonomy of virus-sensitive Chlorella sp. symbionts of Paramecium bursaria II Protistology. 2001. V. 2. N. 2. P. 96-104 .

72. Landis W.G. The spatial and temporal distribution of Paramecium bursaria in the litoral zone// J. Protozool. 1982. V. 29. N 2. P. 159-161.

73. Li Y., Lu Z., Burbank D.E., Kutish G.F., Rock D.L., Van Etten J.L. Analysis of 43 kb of the chlorella virus PBCV-1 330-kb genom: map positions 45 to 88 // Virology. 1995a. V. 212. P. 134-150.

74. Li Y., Lu Z., Zhang Y., Kutish G.F., Rock D.L., Van Etten J.L. Analysis of 45 kb of DNA located at the left end of the chlorella virus PBCV-1 genom // Virology. 1995b. V. 206. P. 339-352.

75. Li Y., Lu Z., Sun L., Ropp S., Kutish G.F., Rock D.L., Van Etten J.L. Analysis of 74 kb of DNA located at the right end of the 330-kb chlorella virus PBCV-1 genom // Virology. 1997. V. 237. P. 360-377.

76. Linz В., Linz A., Migunova A.V., Kvitko K.V. Correlation between virus-sensitivity and isoenzyme spectrum in symbiotic Chlorella-like alga // Protistology. 1999. V.l. N 2. P. 76-81.

77. Loefer J.B. Isolation and growth characteristics of the zoochlorella of Paramecium bursaria/l Am. Nat. 1936. V. 70. P. 184-188.

78. Lu Z., Li Y., Que Q., Kutish G.F., Rock D.L., Van Etten J.L. Analysis of 94 kb of the chlorella virus PBCV-1 330-kb genom: map positions 88 to 182 // Virology. 1996. V. 216. P. 102-123.

79. Mandalam R.K., Palsson B.O. Chlorella vulgaris (Chlorellaceae) does not secrete autoinhibitor at high cell densities // American J. of Botany. 1995. V. 82. N 8. P. 955-963.

80. Meier R., Reisser W., Wiessner W. Freeze-fracture evidence of differences between membranes of perialgal and digestive vacuoles in Paramecium bursaria И Z. Naturforch. 1980. V. 35. P. 1107-1110.

81. Meints R.H., Burbank D.E., Van Etten., Lamport D.T. Properties of the Chlorella receptor for the virus PBCV-1 //Virology. 1988. V. 164. P. 15-21.

82. Meints R.H., Lee K., Burbank D.E., Van Etten J.L. Infection of a Chlorella-likt alga with the virus, PBCV-1. Ultrastructural studies // Virology. 1984. V. 138. P.341.346.

83. Meints R.H., Lee К., Van Etten J.L. Assambly site of the virus PBVC-1 in a Chlorella-Yike green algae. Ultrastructural studies // Virology. 1986. V. 154. P. 240-245.

84. Meints R.H., Van Etten., Kuczmarski D. Viral infection of the symbiotic Chlorella-like alga present in Hydra viridis II Virology. 1981. V. 113. P. 698-703.

85. Migunova A., Scoblo I., Kraeva E., Litvinov D., Voitsekhovsky E., and Kvitko K. Zoochlorella viruses carrier status of Paramecium bursaria II Abstracts of X-th International Congress of Virology. Jerusalem. Israel. 11-16 august. 1996. P. 251.

86. Muscatine L., Cook C.B., Pardy R.L., Pool R.R. Uptake, recognition and maintenance of symbiotic Chlorella by Hydra viridis II Symp. Soc. Exp. Biol. 1975. V. 29. P. 175-203.

87. Muscatin L., Pool R.R. Regulation of numbers of intracellular alga // Proc. R. Soc. B. 1979. V. 204. P. 131-139.

88. Niess D., Reisser W., Wiessner W. Photobehavior of Paramecium bursaria infected with different symbiotic and aposymbiotic species of Chlorella II Planta. 1982. V. 156. P. 475-480.

89. Pardy R.L., Spargo В., Crowe J.H. Release of trehalose by symbiotic algae // Symbiosis. 1989. V.7. P.149-158.

90. Poison A., Von Wechmar M.B. Isolation of viral IgY antibodies from yolks of immunized hens // Immunological communications. 1980. V.9. N 5. P. 475-493.

91. Pool R.R. The role of algal antigenic determinants in the recognition of potential algae symbionts by cells of Chlorohydra II J. Cell Sci. 1979. V. 35. P. 367-379.

92. Que Q.,Li Y., Wang I.N., Lane L.C., Chaney W.G., Van Etten J.L. Protein glycosylation and myristylation in chlorella virus PBCV-1 and its antigenic variants // Viroloy. 1994. V. 203. P. 320-327.

93. Reisser W., Becker В., Klein T. Studies on ultrastructure and host range of a Chlorella attacking virus // Protoplasma. 1986. V. 135. P. 162-165.

94. Reisser W., Burbank D.E., Meints S.M., Meints R.H., Becker В., Van Etten J.L. A comparison of viruses infecting two different Chlorella-like Green algae // Virology. 1988. V. 67. P. 143-149.

95. Reisser W., Burbank D.E., Meints R.H., Becker В., Van Etten J.L. Viruses distinguish symbiotic Chlorella spp. of Paramecium bursaria // Endocytobiosisand Cell Res. 1991. V. 7. P. 245-251.

96. Reisser W. Die stoffwechselphysiologischen Berichugen zwischen Paramecium bursaria Ehrbg.und Chlorella sp. in der P.bursaria -symbiose // Arch. Microbiol. 1976. V. 107. P. 357-360.

97. Reisser W., Kapaun E. Entry of a chlorella-virus into its host cell // J. Phycol. 1991. V. 27. P. 609-613.

98. Reisser W., Klein Т., Becker B. Studies of Phycoviruses On the ecology of viruses attacking Chlorella exsymbiotic from an European strain of Paramecium bursaria //Arch. Hydrobiol. 1988. V. 111. N. 4. P. 575-583.

99. Reisser W. The metabolic interaction between Paramecium bursaria Ehrbg. and Chlorella sp. in the P.bursaria symbiosis // Arch.of Microbiol. 1980. V. 125. P. 291-293.

100. Reisser W., Vietze S and Widowski M. Taxonomic studies on endocytobiotic Chlorophyceaen algae isolated from different American and European strains of Paramecium bursaria. Symbiosis // 1988. V. 6. P. 253-270.

101. Rose M.E., Orlans E., Buttress N. Immunoglobulin classes in the hen's egg: their segregation in yolk and white // Eur. J. Immunol. 1974. V.4. P.521-523.

102. Sambrook G., Fritsch E., Maniatis T. In vitro amplification of DNA by the polymerase Chain Reaction // Molecular cloning a laboratory manual. 1989. V. 2. P. 141-147.

103. Schlosser H.G. Summlung von Algenkulturen // Ber. Deutsch. Algenkulturen. 1982. P.181-216.

104. Shihira I., Krauss W. 1965. Chlorella Phisiology and Taxonomy of Forty-one Isolates.Univ.of Maryland, p. 16.

105. Skrdla M.P., Burbank D.E., Van Etten J.L. Structural proteinsand lipids in a virus, PBCV-1, which replicates in a Chlorella-like alga // Virology. 1984. V. 135. P. 308-315.

106. Takeda H. Cell wall composition and taxonomy of symbiotic Chlorella from Paramecium bursaria and Acanthocystis // Phytochemistry. 1995. V.40. N 2. P. 457-459.

107. Takeda H. Classification of Chlorella strains by sell wall sugar composition // Phytochemistry. 1988. V. 16. N. 4. P. 367-371.

108. Takeda H. Sugar composition of the cell wall and the taxonomy of Chlorella

109. Chlorophyceae) II J. Phycol. 1991. V. 27. P. 224-232.

110. Tessman I. Short communication. Genetic recombination of the DNA plant virus PBCV-1 in a Chlorella-like alga// Virology. 1985. V.145. P. 319-322.

111. Trench R.K. The cell biology of plant-animal symbiosis // Ann. Rev. Plant Physiol. 1979. V. 30. P. 485-531.

112. Van Etten J.L., Burbank D.E., Meints R.H. DNA syntesis in a Chlorella-like alga following infection with the virus PBCV-1 // Virology. 1984. V. 134. P. 443-449.

113. Van Etten J.L., Burbank D.E., Meints R.H. Viral infection of culturable Chlorella-like algae and development of a plaque assay // Science. 1983a. V. 219. P. 994996.

114. Van Etten J.L., Burbank D.E., Xia Y., Meints R.H. Grouth cycle of a virus PBCV-1, that infects Chlorella-like algae // Virology. 1983b. V. 126. P. 117-125.

115. Van Etten J.L., Girton L., Burbank D.E. DNA methylation of viruses infection a eucariotic Chlorella-Y\ke green alga // Nucl. Acid. Res. 1985a. V. 13. N 10. P. 3471-3477.

116. Van Etten J.L., Lane L.C., Meints R.H. Viruses and viruslike particles of eucaryotic algae // Microbiological Rev. 1991. V.55. P. 586-620.

117. Van Etten J.L. Minireview: Giant chlorella viruses // Mol.Cells. 1995. V. 5. P. 99106.

118. Van Etten J.L., Meints R.H. Giant viruses infecting algae // Annu. Rev. Microbiol. 1999. V. 53. P. 447-494.

119. Van Etten J.L., Meints R.H., Burbank D.E., Kuszmarski O., Cypples D.A., Lame L.C. Isolation and Characterization of a virus from the intracellular green alga symbiotic with Hydra viridis II Virology. 1981. V. 113. P. 704-711.

120. Van Etten J.L., Meints R.H., Burbank D.E. Virus of symbiotic Chlorella-like alga isolated from Paramecium bursaria and Hydra viridis II Prot. Natl. Acad. Sci USA. 1982. V. 79. P. 3867-3871.

121. Van Etten J.L., Van Etten C.H., Jonson J.K., Burbank D.E. A survey for viruses from fresh water that infect a Eucaryotic Chlorella-like Green alga // Appl. Environmental Microbiology. 1985b. V. 49. N 5. P. 1326-1328.

122. Van Regenmortel M.H.V. Serology and immunochemistry of plant viruses // N.Y. Acad press. 1982. 302 p.

123. Weis D.S., Ayala A. Effect of exposure period and concentration on the frequencyof infection of aposymbiotic ciliates by symbiotic algae from Paramecium bursaria II J. Protozool. 1979. V. 26. N 2. P. 245-248.

124. Weis D.S. Correlation of infectivity and concanavalin-A agglutinability of algae exsymbiotic from Paramecium bursaria II J.Protozoology. 1978. V. 25. N 3. P. 366-370.

125. Weis D.S. Correlation of sugar release and concanavalin-A agglutinability with infectivity of symbiotic algae from Paramecium bursaria for aposymbiotic P. bursaria II J. Protozoology. 1979. V. 26. N 1. P. 117-119.

126. Weis D.S. Digestion of added homologous algae by Chlorella-bea.ring Paramecium bursaria // J. Protozool. 1976. V. 23. N 4. P. 527-529.

127. Weis D.S. Further tests for the hypothesis that algal maltose excrecion and cell suface ligands are signals in the infection of Paramecium bursaria by Chlorella II Abstracts of Algae symposium. Gottingen. September 1980a. P. 547-555.

128. Weis D.S. Hypothesis: free maltose and algal cell surface sugars are signals in the infection of Paramecium bursaria by algae // Endocytobiology. Endosymbiosis and cell biology. 1980b. V. 1. P. 105-112.

129. Weis D.S. Infection in Paramecium bursaria as an inductive process // Endocytobiology. 1983. V. 11. P. 523-532.

130. Yamada Т., Higashiyama Т., Fukuda T. Screening of Natural Waters forviruses which infect Chlorella cells // Applied and Environmental Microbiology. Dec. 1991. P. 3433-3437.

131. Yamada Т., Shimomae A., Furukawa S., Takechara J. Widespread Distribution of Chlorella viruses in Japan // Biosci. Biotech. Biochem. 1993. V. 57. N 5. P. 733739.

132. Yonker C.R., Caldwell K.D., Giddings J.C., Van Etten J.L. Physisal characterization of PBCV virus by sedimentation field flow fracyionation // J. Virol. Methods. 1985. V. 11. P. 145-160.

133. Yan X., Olson N.H., Van Etten J.L., Bergoin M., Rossman M.G., Backer T.S. Structure and assembly of large lipid-containing dsDNA viruses // Nat. Struct. Biol. 2000. V. 7. P. 101-103.

134. Zhang Y., Burbank D.E., Van Etten J.L. Chlorella viruses isolated in China // Appl. Environ. Microbiol. 1988. V. 54. P. 2170-2173.

135. Zhang Y., Adams В., Sun L., Burbank D.E., Van Etten J.L. Intron conservation in