Взаимоотношения Paramecium bursaria (Ciliophora) с вирусами хлорелл (cem. phycodnaviridae) в трехкомпонентной симбиотической системе Paramecium bursaria - Chlorella sp. - вирус

Ященко, Варвара Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Взаимоотношения Paramecium bursaria (Ciliophora) с вирусами хлорелл (cem. phycodnaviridae) в трехкомпонентной симбиотической системе Paramecium bursaria - Chlorella sp. - вирус
ВАК РФ 03.00.08, Зоология

Автореферат диссертации по теме "Взаимоотношения Paramecium bursaria (Ciliophora) с вирусами хлорелл (cem. phycodnaviridae) в трехкомпонентной симбиотической системе Paramecium bursaria - Chlorella sp. - вирус"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ЯЩЕНКО ВАРВАРА ВЛАДИМИРОВНА

ВЗАИМООТНОШЕНИЯ PARAMECIUM BURS ARIA (CILIOPHORA) С ВИРУСАМИ ХЛОРЕЛЛ (СЕМ. PHYCODNAVIRIDAE) В ТРЕХКОМПОНЕНТНОЙ СИМБИОТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЕ PARAMECIUM BURSARIA - CHLORELLA SP. - ВИРУС

специальность: 03.00.08 - зоология 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2009

003467592

Работа выполнена в лаборатории кариологии одноклеточных биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета

Научный руководитель: доктор биологических наук

Раутиан Мария Сергеевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Карпов Сергей Алексеевич

кандидат биологических наук Андронов Евгений Евгеньевич

Ведущее учреждение Институт Цитологии РАН

Защита состоится ^¿¿оЛ_ 2009 г. в К> часов на заседании совета

Д.212.232.08 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, Биолого-почвенный факультет, аудитория .

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан ^ 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

С.И. Сухарева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Термин «симбиоз» был предложен Де Бари и обозначает форму взаимоотношений при сожительстве неродственных организмов (de Вагу, 1879). Изучение симбиотических отношений имеет большое фундаментальное значение, как в зоологии, так и в микробиологии, а также практическую значимость для медицинской микробиологии (Осипов, Подлипаев, 1981; Margulis, Chapman, 1998), Симбиотические отношения являются прекрасной моделью для изучения межклеточных взаимодействий, иммунных механизмов (Gerashenko et al., 2000). Признано, что симбиоз - это один из основных механизмов эволюции в биосфере (Bhattacharya et al., 2007). Протесты представляют широкий спектр возможностей для исследований симбиотических отношений и симбиогенеза. Они формируют симбиотические ассоциации как с про- , так и с эукариотическими симбионтами, включая археи, бактерии, грибы и микроводоросли (Epstein et al, 1998; Reisseretal., 1985).

Симбиотические отношения инфузории Paramecium bursaria (Ciliophora Oligohymenophorea) и зеленой водоросли Chlorella (Chlorellaceae, Trebouxiophyceae) -представляют собой пример классического симбиоза (Karakashian et al, 1968; Reisser, 1986). Эта система активно изучается во многих лабораториях мира. Хлореллы, выделенные из клеток парамеций, специфически инфицируются гигантскими ДНК-содержащими вирусами из рода Chlorovirus, семейства Phycodnaviridae (Van Etten, Meints, 1999). Это активные литические вирусы, они не инфицируют свободноживущие хлореллы и не атакуют хлореллы, находящиеся в симбиотических вакуолях внутри P. bursaria (Van Etten et al., 1991). Система P. bursaria - Chlorella sp. и вирус представляет особый интерес в качестве модельной вирус-содержащей симбиотической системы. Вирусы, патогенные для человека, способны успешно мультиплицироваться, персистировать и сохранять инфекционность в клетках протистов, в том числе инфузорий (Терас, 1981).

Все, что известно о вирусе хлорелл и его хозяине, не дает полного представления о поддержании вируса в природе. Вирусы хлорелл парамеций активно изучаются на протяжении более 25 лет, однако механизмы поддержания вируса и причины возникновения высоких концентраций вируса в природных водоемах неизвестны. Вероятно, поддержание вируса осуществляется за счет системы P. bursaria -Chlorella. В настоящей работе впервые было проведено развернутое исследование взаимоотношений Р. bursaria с вирусами хлорелл в трехкомпонентной симбиотической системе Р. bursaria - Chlorella - вирус. Понимание роли Р. bursaria в этой вирус-содержащей системе является ключевым для объяснения механизма поддержания вирусов хлорелл.

Пель и задачи исследования. Целью настоящей работы стало исследование роли P. bursaria в трехкомпонентной симбиотической системе Р. bursaria - Chlorella -вирус. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. выбрать адекватные методы и адаптировать их для работы с полноценной трехкомпонентной симбиотической системой Р. bursaria - Chlorella - вирус.

2. детектировать вирусную ДНК в симбиотической системе Р. bursaria -Chlorella - вирус с помощью метода пульс-электрофореза, определить, в интегрированном или свободном состоянии вирусная ДНК находится в системе.

3. определить с помощью световой и электронной микроскопии локализацию вирусных частиц в симбиотической системе Р. bursaria - Chlorella - вирус.

4. определить, существует ли специфичность отношений между парамециями (видами, внутривидовыми группами) и вирусами симбиотических хлорелл парамеций.

Научная новизна работы. В ходе исследования методами пульс-электрофореза и гибридизации по Саузерну было обнаружено, что в вируссо держащей симбиотической системе Р. bursaria - Chlorella выявляется препаративное количество неинтегрированной вирусной ДНК, которая ассоциирована с клеткой инфузории. С помощью световой и электронной микроскопии была определена локализация вирусных частиц в симбиотической системе Р. bursaria - Chlorella -вирус. Впервые исследован вопрос о том, существует ли специфичность парамеций того или иного сингена по отношению к вирусу хлорелл определенного типа, северного или южного. Результаты работы указывают на то, что ассоциация с клеткой Р. bursaria обеспечивает надежное воспроизведение вирусов. Полученные в работе данные позволили предложить схему жизненного цикла вируса в трехкомпонентной симбиотической системе Р. bursaria - Chlorella - вирус.

Практическое значение работы. Результаты работы носят фундаментальный характер. Исследование данной вирус-содержащей симбиотической системы важно с точки зрения выяснения возможной роли протестов в экологии вирусов, механизмов распространения и поддержания вирусных инфекций, а также очищения водоемов и сточных вод от вирусов. Работы в этом направлении позволяют получить ценную информацию о физиологии, генетике, патогенносга, специфичности и изменчивости биологических свойств, как протестов, так и вирусов. Протесты могут являться природными резервуарами, где сохраняются и размножаются важные вирусные патогены человека и животных. Этот факт относительно мало исследован, хотя имеет бесспорное значение для медицинской микробиологии. Данная модель инфузория -вирус может стать ценной моделью также и в молекулярно-биологических исследованиях.

Вирусы хлорелл выделяются среди других вирусов рядом уникальных особенностей (см. обзор Van Etten, 2003). Геном вируса хлорелл PBCV-1 полностью сиквенирован и состоит из мозаики про- и эукариотических генов. Эти вирусы являются хорошим биотехнологическим объектом: так, он является источником ферментов, имеющих коммерческое значение, например, эндонуклеаз рестрикции с новыми сайгами узнавания; он уже используется для исследования действия некоторых лекарственных препаратов (Mitra et al., 1994). Также вирусы хлорелл рассматривают как потенциальный вектор для трансформации растительных клеток (Kang et al., 2005).

Данная работа является первым опытом применения стереологического количественного подхода по отношению к парамеции, и вообще к протестам.

Полученные результаты используются в курсах лекций «Симбиоз» кафедры зоологии беспозвоночных Биолого-почвенного факультета СПбГУ.

Апробация работы. Результаты работы представлены на Юбилейной научной конференции «Биоразнообразие, Экология, Адаптация» (Одесса, Украина, 2003), конференции «Молодые ученые Санкт-Петербурга - 300-летию города» (Санкт-

Петербург, 2003), III Съезде ВОГиС (Москва, 2004), IV Симпозиуме по вирусам водорослей (Амстердам, Нидерланды, 2005), XII Международном конгрессе по протозоологии (Гуанчжоу, Китай, 2005), XV ежегодном семинаре по вирусам растений (Ардмур, США, 2006), IV (Сан-Бенедетто дель Тронто, Италия, 2003) и V (Санкт-Петербург, Россия, 2007) Европейских протистологических конгрессах. Материалы диссертации неоднократно обсуждались на научных семинарах кафедры зоологии беспозвоночных и лаборатории кариологии одноклеточных биолого-почвенного факультета СПбГУ, семинарах лаборатории вирусов водорослей Университета Небраски, Линкольн, США, семинарах центра синтеза экологии и эволюции (CEES) Биологического института Университета г. Осло, Норвегия.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из Введения, Обзора литературы, экспериментальной части, включающей Материалы и методы, Результаты исследования и их Обсуждение, Выводов и Списка литературы, содержащего 160 наименований. Работа изложена на 168 страницах, содержит 22 рисунка и 9 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Использованные культуры. В работе использовали 102 клона P. bursaria, содержащих хлореллы, 1 природный асимбионтный клон P. bursaria, 1 клон Р. caudatum из Коллекции клонов инфузорий Paramecium лаборатории кариологии одноклеточных БиНИИ СПбГУ. В экспериментах использовали штаммы из коллекции лаборатории микробиологии БиНИИ СПбГУ, а также предоставленные Джеймсом Ван Этгеном, Линкольн, США; 3 штамма экссимбиотических хлорелл Chlorella sp. и 6 штаммов вирусов хлорелл.

Методы лабораторной работы с инфузориями. Культивирование клонов Paramecium проводили по стандартной методике (Sonneborn, 1970). Питательной средой служил салатный отвар, инокулированный бактериями Klebsiella cloacae.

Тестирование клонов P. bursaria на наличие вирусов и определение титра вирусов проводили по стандартной методике (Van Etten et al., 1983). В качестве тестерной культуры использовали хлореллы двух штаммов: NC64A и Pbi. В пробирку к активно растущей культуре хлорелл добавляли аликвоту профильтрованной (Nucleopore, 0.4 мкм) культуральной среды из клона Р. bursaria. В отсутствие вируса хлореллы росли так же, как и в контроле, в присутствии специфического вируса в клоне хлореллы лизировались, среда становилась прозрачной.

Приготовление препаратов ДНК парамеций, хлорелл и вирусов для ПЭФ. Мягким центрифугированием клетки парамеций концентрировали в течение 5 минут при 600 g до объема 0.5 мл. Полученную суспензию клеток смешивали в соотношении 1:1 с нагретым до 56 °С 1.5 %-ным раствором агарозы (SeaKem FMC, США), приготовленным на 0.125 М ЭДТА, рН=9.5, пипетировали и заливали между донышками двух чашек Петри, фиксированных липкой лентой, получая агарозные блоки. Застывшие блоки помещали в буфер ESP (0.5 М ЭДТА, рН=9.5, 1 %

лауроилсаркозин Na, 200 мкг/мл проназы Е) и инкубировали двое суток при температуре +37 °С. Блоки хранили в буфере ESP при температуре +4 °С. Клетки хлорелл, снятые микробиологической петлей с агара, суспендировали в средс Бристоль (Sonneborn, 1970), затем концентрировали центрифугированием в течение 10 минут при 600 g до объема 0.5 мл. Далее препараты готовили так же, как препараты ДНК P. bursaria. Очищенные вирусные частицы, суспендированные в 100 мМ трис-HCl, рН=7.4, смешивали с расплавленной агарозой в соотношении 1:1, далее препараты готовили аналогично препаратам ДНК P. bursaria.

В качестве размерного маркера для ПЭФ использовали хромосомы дрожжей Saccharomyces cerevisiae штамма 15В-П4, размер которых был определен в нашей лаборатории ранее (Тимофеева, Раутиан, 1997). Приготовление препаратов ДНК дрожжей проводили по стандартной методике (Carle, Olson, 1985).

Проведение ПЭФ. Для проведения ПЭФ использовали прибор авторской конструкции, позволяющий создавать и чередовать два электрических поля с углом переориентации 120°. ПЭФ проводили в 1 %-ном агарозном геле (Sea Kern, FMC, США), приготовленном на 0.5х буфере TBE (45 мМ трис, 45 мМ борная кислота, 2 мМ ЭДТА, рН=8.0). Толщина геля составляла 4 мм. Электрофорез проводили в 0.5х буфере TBE при температуре +16 °С. Напряженность поля составляла 10 В/см. Оптимальный режим разделения ДНК для Р. bursaria: 30 с - 7 ч, 50 с - 7 ч, 70 с - 7 ч, 120 с - 7 ч, 150 с - 8 ч (в секундах - время действия каждого электрического поля, так называемое «время пульса»; в часах - продолжительность работы прибора при этом времени пульса). По окончании электрофореза гель выдерживали в растворе бромистого этидия и фотографировали в ультрафиолетовом свете на фотопленку "Микрат Изопан". Негативы сканировали для дальнейшего анализа изображений.

Перенос ДНК из агарозных гелей на нейлоновые мембраны. (Amersham Pharmacia Biotech Nylone Membranes, Великобритания) осуществляли капиллярным способом по стандартной методике (Маниатис и др., 1984); ДНК иммобилизовали облучением ультрафиолетом.

Гибридизацию по Саузерну проводили согласно протоколам производителя мембран при температуре гибридизации 60 °С. Зонды для гибридизации получали в полимеразной цепной реакции (ПЦР), добавляя в смесь для ПЦР дигоксигенин-11-dUTP (Roche Diagnostics, Mannheim, Германия). В качестве зонда использовали консервативный участок гена ДНК-полимеразы вируса (Chen, Suttle, 1995), соответствующий консервативному фрагменту полимеразного домена. Праймерами служили олигонуклеогидные последовательности: 5'-GA(A/G)GGIGCIACIGTI(T/C) TIGA(T/C)GC-3' и 5'-GCIGC(A/G)TAIC(G/T)(T/C)TT(T/C)TTI(A/T)(A/G)TA-3'. В качестве матрицы использовали тотальную ДНК вирусов PBCV-2L (Pbi тип) и Т316-1S (NC64A тип). Детекцию сигнала проводили, используя набор для колориметрической детекции метки (Roche Diagnostics, Mannheim, Германия), и следуя рекомендации производителя. Термические отмывки в 0.5х SSC проводили при температуре на 1°С выше гибридизационной.

Выделение белков вирусов и иммунопреципитация. Вирусные частицы (клетки хлорелл или парамеций) ресуспендировали в лизирующем буфере, содержащем 20 мМ трис, pH 7.5, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ЭГТА, 1% Тритон Х-100, 2.5 мМ пирофосфат натрия, 1 мМ ß-глицерофостфат, SIGMA Protease Inhibitor Cocktail

(Sigma Aldrich, США), 6 мкл/мл. Непосредственно перед использованием в буфер добавляли PMSF до конечной концентрации 1 мМ и инкубировали в течение 5 мин. на льду, затем подвергали действию ультразвука, и микроцентрифугировали при 5 тыс. об/мин. в течение 5 мин при +4 °С, отбирали лизат-супернатант. Супернатант инкубировали с антителами кролика анти-PBCV-l (конечная концентрация 40 мкг/мл), предоставленными Дж. Ван Этгеном (Университет Небраски, Линкольн, США), мягко перемешивая в течение ночи при +4 °С. Протеин-агарозу G (Protein Agarose G, Pierce Bioltechnology, США) готовили согласно рекомендации производителя. К смеси белков и первых антител добавляли 15 мкл суспензии протеин-агарозы G и инкубировали 2 ч при +4 °С. Микроцентрифугировали при 14 тыс. об/мин. в течение 30 с при +4 °С. Осадок пять раз отмывали в 1х лизирующем буфере на льду и затем растворяли в lx SDS-PAGE буфере нанесения (10 % глицерин, 62.5 мМ трис-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 0.01 мг/мл Бромфеноловый синий), инкубировали при 100 °С в течение 3 мин и микроцентрифугировали при 14 тыс. об/мин. в течение 30 с при +4 °С. Супернатант разделяли на градиентном 4-20% SDS-PAGE геле (Gold precast Gels, Cambrex Bioscience, США).

Вестерн-блоттинг проводили с помощью электропереноса, используя установку BIO-RAD "Trans-blot" в условиях, рекомендованных производителем установки. Белки переносили на мембрану PVDF (Immobilon-P transfer membrane, Millipore, США). Мембрану инкубировали в 2%-ном РМВ буфере (lxPBS, 2% сухого молока) в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем в растворе первых антител (1:1000000), приготовленном на 2%-ном РМВ с 1% Твин 20, в течение ночи при +4°С. Мембрану 4 раза по 10 мин отмывали в 2%-ном РМВ с 0.05% Твин 20. Затем на 2 ч помещали в раствор вторых антител, приготовленный на 2%-ном РМВ, содержащем 1% Твин 20, при комнатной температуре. В качестве вторых антител были использованы козьи антитела против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена в разведении 1:50000 (Pierce, США). Белки выявляли методом усиленной хемолюминесценции (Supersignal West Pico Chemiluminescent Detection Kit, Pierce, США).

Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание клеток P. bursaria. Для получения густой суспензии клетки P. bursaria осаждали мягким микроцентрифугированием в течение 5 мин при 2 тыс. об/мин. Также клетки осаждали после каждого этапа обработки и удаляли супернатант. Суспендированные клетки фиксировали 2%-ным параформальдегидом, приготовленным на фосфатном буфере (PBS), в течение часа и промывали этим же фосфатным буфером. В качестве блокирующего агента использовали раствор 3% БСА (Sigma) на фосфатном буфере с 0.02% Твин 20; блокирование проводили в течение 40 мин. В качестве первых антител использовали поликлональные антитела кролика против вирусов хлорелл анти-PBCV-l вразведении 1:100 в растворе 0.1% БСА на фосфатном буферес 0.02% Твин 20 инкубировали в течение 1 ч. В качестве вторых антител использовали антитела козы против IgG кролика, конъюгироващше с FITC (TAGO-IMMUNOLOGICAL USA), в разведении 1:200. После каждого этапа окрашивания клетки по 5 минут отмывали в трех сменах lxPBS с 0.02% Твин 20. Контрольные препараты обрабатывали только вторыми антителами. После заключительного этапа клетки раскапывали на предметные стекла и наносили заключающую среду

Vectashield® (H-1000, Vector laboratories). Препараты анализировали с помощью универсального флуоресцентного микроскопа DMRXA (Leica Wetzlar GmbH). Съемка производилась цветной цифровой камерой Leica DC 500. Для получения и обработки видеоизображения использовалось программное обеспечение IM 50 (Leica Cambridge Ltd.) и Adobe Photoshop 6.0 (Adobe).

Визуализация вирусов при помощи красителей SYTOX. К суспензии очищенного вируса добавляли краситель SYTOX Orange или SYTOX Green (Invitrogen, США), разведенный в буфере в концентрации 50 нМ, разведенный в буфере (50 мМ трис, рН 7.8). Смесь перемешивали и инкубировали 15 мин. при комнатной температуре в темноте. Для отмывки красителя смесь разводили в два раза тем же буфером. Вирус концентрировали микроцентрифугированием при 15 тыс. об/мин в течение 10 мин. Полученный осадок растворяли в свежем буфере и переносили в чистую пробирку. Отмывки повторяли три раза. В эксперименте окрашенный вирус добавляли к клеткам безвирусного клона P. bursaria in vivo и инкубировали 15 мин, или в течение 16 ч. Изготавливали препарат для микроскопирования и изучали с помощью конфокального микроскопа. Для окрашивания P. bursaria in vivo к клеткам добавляли краситель SYTOX до концентрации 10 нМ. Через 1 ч. изготавливали препарат для микроскопирования.

Конфокальную микроскопию проводили с помощью микроскопа Olympus FluoView 500 Confocal Microscope. Для получения и обработки видеоизображения использовали программное обеспечение MetaMorph Software (Molecular Devices, США) и Adobe Photoshop 6.0 (Adobe).

Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ"). Интерфазные клетки фиксировали в 2% глютаральдегиде и 1% формальдегиде в 0.1 М какодилатном буфере, рН 7.4 (вместе с 0.15% рутениевым красным или без него), затем фиксировали 1% оксидом осмия в том же буфере. Клетки отмывали в 0.1 М какодилатном буфере, рН 7.4. После дегидратации клетки по одной заключали в Эпон. Клетки ориентировали по методике Реймонда (Reymond, Pickett-Heaps, 1982). Делали ультратонкие срезы в сагиттальной плоскости (делит клетку на левую и правую сторону) или фронтальной плоскости (делит клетку на спинную и брюшную сторону) с блоков, полученных в результате двух фиксаций, выполненных в разные дни. Срезы контрастировали уранил ацетатом и цитратом свинца, затем изучали на электронном микроскопе Philips СМ 100. В эксперименте по добавлению вирусов к клонам P. caudatum и P. bursaria в среду с культурой парамеций добавляли вирус МТ-325 (Pbi тип). Титр вируса в конечном растворе составлял 10б на 1 мл. Концентрация клеток P. bursaria в культуре составляла 1х103 - 1.5х103 клеток на 1 мл. После 16 часов инкубирования клетки фиксировали для ТЭМ.

Количественный стереологический анализ. Небольшую серию ультратонких срезов нарезали с блока, содержащего ориентированную клетку P. bursaria, и наносили на сеточки. Руководствуясь методом случайного отбора, анализировали один из срезов на каждой сеточке (Mayhew et al., 2002). На каждом срезе поверхность клетки на основании морфологических критериев разделили на зоны (см. рис. 6). Для оценки относительной длины проанализированной поверхности клетки P. bursaria в каждой зоне использовали решетку тестовых линий. Подсчитывали количество вирусных частиц, расположенных на поверхности в каждой анализируемой зоне. Для

каждой зоны оценивали плотность вирусных (VD) частиц: суммарное количество частиц делили на общее количество пересечений с тестовыми линиями. Относительный показатель распределения вирусов по поверхности в определенной зоне (RDI) рассчитывали как отношение плотности вирусных частиц в определенной зоне к плотности вирусных частиц на поверхности клетки в целом. При случайном распределении вирусов RDI = 1; если RDI > 1, то плотность вирусов больше ожидаемой; если RDI < 1, то плотность вирусов меньше ожидаемой (Mayhew, 2007).

Наблюдаемое и ожидаемое число вирусных частиц в анализируемой зоне сравнивали с ожидаемым по критерию %2, количество степеней свободы определяли по количеству анализируемых зон (Sokal, Rohlf, 1981). Нулевую гипотезу отвергали при уровне значимости Р < 0,05. Для того чтобы оценить степень близости значений VD в определенной зоне для разных клеток, применяли коэффициент конкордации Кендалла. Для проверки значимости различий значений VD разных зон доя всех клеток применяли дисперсионный анализ Фридмана. Анализ провели для четырех групп зон. Расчет проводили с помощью программы STATISTICA 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Скрининг клонов P. bursaria на наличие вирусов. Мы провели исследование частоты встречаемости вирусов на большой выборке клонов P. bursaria, собранных в удаленных друг от друга географических точках. На наличие вирусов хлорелл NC64A и Pbi типов были протестированы 102 клона P. bursaria', путем постановки скрещиваний И.И. Скобло была определена сингенная принадлежность клонов (Табл. 1). Встречаемость типов вируса в разных сингенах позволяет утверждать, что специфичность вируса по отношению к парамециям определенного сингена существует: вирусы Pbi типа характерны для сингенов 1 и 2 P. bursaria, вирусы NC64A типа - для сингенов 3 и 4. Нетипичным можно считать обнаружение вируса NC64A типа в клоне парамеций сингена 1 из Таджикистана.

Табл. 1. Встречаемость вирусов у P. bursaria разных сингенов.

Сингены 1 2 3 4 5 Не определен Всего

Всего клонов 43 26 17 8 3 5 102

Безвирусные 30 13 15 2 3 0 63

С вирусом Pbi типа 12 13 0 0 0 4 29

С вирусом NC64A типа 1 0 2 6 0 1 10

Локализация ДНК вирусов в симбиотической системе Р. bursaria - Chlorella -вирус. Сравнительный анализ ПЭФ-профилей ДНК всех участников симбиоза по отдельности позволил определить, в какой части общего профиля мигрирует ДНК того или иного партнера. Характеристики ПЭФ-профилей, полученные в нашей работе, хорошо согласуются с полученными ранее данными (Rautian, Potekhin, 2002). В области высокомолекулярной фракции, более 950 т.п.н., выявляется ДНК хромосом хлорелл. Спектр относительно коротких молекул от 30-40 т.п.н. до 120-150 т.п.н. сформирован ДНК макронуклеуса Р. bursaria. На ПЭФ-профиле бессимбионтных Р. bursaria в области более 2000 т.п.н. заметна слабая полоса (рис. 1.), которая, по всей видимости, образована ДНК микронуклеуса. Мы подтвердили

Рис. 2Б Результаты разделения ПЭФ

Рис.1

Рис.1. Результаты разделения ПЭФ тотальной ДНК клонов P. bursaria и штамма хлорелл. Д. (дорожка) 1 - хлореллы, штамм ОСН1, д.. 2 - размерный маркер, хромосомы дрожжей S, cerevisiae, д. 3 - P. bursaria, клон ОК 1 не содержит хлорелл, д. 4 - P. bursaria, клон 87 МС 1 содержит вирус РЫ типа, д. 5 - Р. bursaria, клон Т 316 содержит вирус NC64A типа, д. 6 - P. bursaria, клон Mit R 1, безвирусный. Черной стрелкой отмечено положение полосы в размерной области 300 т.п.н.

Для того чтобы выяснить ассоциирована ли вирусная ДНК, выявляемая на ПЭФ-профилях P. bursaria, с клеткой парамеции или находится в среде, мы провели сравнение ПЭФ-профиля стандартного препарата P. bursaria и ПЭФ-профиля препарата отфильтрованной от инфузорий среды. Оказалось, что вирусную ДНК в среде невозможно обнаружить с помощью ПЭФ. Основное количество вирусной ДНК, которая формирует интенсивную полосу в области 300 т.п.н., ассоциировано с парамецией. Было проведено визуальное сравнение

Рис. 2А Рис.2. А.

тотальной ДНК клона Р. Ьикапа и ДНК изолятов вирусов: д. 1,4- ДНК вируса РВСУ-1 (ЫС64А тип), д. 2, 5 - Р. Ьигэапа, клон Т 245, содержит вирус ЖГ64А типа, д. 3,6 - ДНК вируса РВСУ-2Ь (РЫ тип). Б. Результаты блот-гибридизации с зондом, синтезированным с матрицы вируса Т316-18 (ЯС64А типа): д. 1, 2, 3, и с зондом, синтезированным с матрицы вируса РВСУ-2Ь (РЫтипа): д. 4, 5.6.

вирусную природу полосы размером около 300 т.п.н., выявляемой на ПЭФ-профилях тотальной ДНК некоторых клонов Р. bursaria. Эта полоса всегда присутствовала на ПЭФ-профилях только тех клонов, которые содержали вирусы по результатам микробиологических тестов. Размер данной полосы соответствовал размеру генома вируса хлорелл (Van Etten et al., 2003). При гибридизации разделенной ПЭФ ДНК с вирус-специфичным зондом сигнал получали только в области этой полосы и никогда - в других областях ПЭФ-профиля (рис. 2А, Б). Таким образом, вся детектируемая вирусная ДНК в системе представляет собой неинтегрированную геномную ДНК вирусов хлорелл. Интегрированных копий вирусной ДНК не выявляется на уровне чувствительности использованного нами метода; это говорит о том, что в жизненном цикле вируса хлорелл парамеций, вероятнее всего, отсутствует -лизогенная фаза.

1 2 3 4 5 6

т.п.н.

>2000 1120

800 590

>2000

интенсивности полос, формируемых вирусной ДНК, на ПЭФ-профилях препаратов ДНК вирусов в разной концентрации. По нашим оценкам, на одну клетку парамеции приходится порядка 100 копий вирусного генома. Этот результат стал первым подтверждением того, что с клеткой Р. bursaria может быть ассоциировано значительное количество вирусов. Таким образом, в симбиотической системе Р. bursaria - Chlorella - вирус значительное количество вирусов ассоциировано с клеткой парамеции, при этом их ДНК находится в неинтегрированном, свободном состоянии.

При проведении экспериментов по гибридизации, оказалось, что сигнал был -рче в тех случаях, когда при получении зонда в качестве матрицы использовали ДНК вируса того же типа, который присутствовал в клоне Р. bursaria (рис. 2Б). Зависимость эффективности гибридизации от типа вируса, использованного для получения зонда, вероятнее всего, связана с большей изменчивостью гена ДНК-полимеразы между вирусами, принадлежащими к разным типам, чем внутри одного типа вирусов.

Локализация вирусных частиц в симбиотической системе Р. bursaria -Chlorella - вирус. С помощью различных методов электронной и световой микроскопии мы установили, что в вирус-содержащей симбиотической системе Р. bursaria - Chlorella вирусные частицы располагаются на поверхности клетки парамеции и в буккальной полости. Это хорошо согласовалось с разрозненными наблюдениями, сделанными ранее (Kawakami, Kawakami, 1978, Д.В. Осипов, личное сообщение).

При исследовании вирус-содержащих клонов Р. bursaria методом непрямой иммунофлюоресценции с поликлональной сывороткой к PBCV-1 мы выявляли метку на поверхности клетки и в буккальной полости (рис. 3). В цитоплазме парамеции или в ассоциации с симбиотическими хлореллами метку не выявляли. Мы также выявили метку на поверхности клетки при окрашивании безвирусного клона. В контрольных экспериментах по иммунопреципитации белков вирусов и белков безвирусных Р. bursaria мы получили подтверждение тому, что использованные нами поликлональные антитела реагируют не только с белками вирусов хлорелл, но и, вероятно, с какими-то белками парамеции. Важно подчеркнуть, что, хотя поликлональная антисыворотка оказалась специфичной не только к белкам вирусов, иммунофлюоресцентный сигнал обнаруживали только на поверхности парамеции. Этот результат позволяет утверждать, что единственный компартмент, который могут занимать вирусы, - это поверхностные структуры парамеции.

Мы применили и другой подход для обнаружения вирусов в ассоциации с Р. bursaria: окрашивание вирусных частиц красителем SYTOX. После инкубации Р. bursaria с красителем SYTOX in vivo, а также при добавлении окрашенных вирусов к клеткам Р. bursaria на инктактной клетке парамеции вирусные частицы мы не выявляли. После того, как клетку раздавливали покровным стеклом, симбиотические хлореллы оказывались во внешней среде, и через 1-2 минуты после выхода хлорелл в среду на препарате наблюдали, что около флюоресцирующих хлоропластов клеток хлорелл хорошо заметна флюоресценция окрашенной ДНК вирусов (рис. 4). Такая совместная локализация показывала, что

произошло специфическое прикрепление вирусной частицы к клеточной стенке хлореллы. По какой-то причине вирусные частицы не выявлялись до того, как прикрепились к хлореллам, где именно находились частицы в симбиотической системе - с помощью этого подхода выяснить не удалось. Возможно, что полисахаридный слой на поверхности Р. Ьигзапа «экранировал» частицы вирусов, или краситель не мог проникать в ресничные карманы Р. Ьигзапа.

> ' £ • ■ЙРЧЬ,

I" ^ dpi f Jp —«Igj—jS—■

Г Ch £ „

Рис. 3. Непрямое иммуно-флюоресцентное окрашивание клеток Р. Ьигзапа клона Т-316 (содержит вирус Ь1С64А типа) антителами к вирусу РВСУ-1. Белыми стрелками отмечено расположение метки на поверхности клетки и в буккальном отделе ротового аппарата. Размерная линейка 20 мкм.

Рис 4. Локализация вирусных частиц (отмечены белыми наконечниками стрелок), окрашенных красителем SYTOX green, вблизи от клеток хлорелл (Ch). Размерная линейка 5 мкм.

Только применение ТЭМ позволило окончательно разрешить вопрос о локализации частиц вирусов хлорелл парамеций в ассоциации с P. bursaria. Вирусные частицы обнаруживали в ассоциации с разными областями соматической цилиатуры P. bursaria (рис. 5): как на переднем, так и на заднем концах клетки, на спинной и на брюшной стороне, в околоротовой воронке и буккальном отделе. В области ротового аппарата вирусы в основном были прикреплены к плазматической мембране цилиатуры пеникуль. Ни в цитоплазме парамеции, ни в пищеварительных вакуолях, ни в периальгальных вакуолях, содержащих хлореллы, вирусные частицы не обнаруживались.

Вирусные частицы локализовались на расстоянии от 2.5 нм до 77.0 нм (среднее 18.9±14.5 нм) от плазматической мембраны или были прикреплены к мембране. Капсиды, которые располагались на расстоянии 2-20 нм от плазматической мембраны, были связаны с ней посредством тонких фибрилл (рис. 5). Окрашивание рутениевым красным выявило наличие тонкого полисахаридного слоя толщиной 10-20 нм на поверхности P. bursaria, что соответствует данным о наличии слоя такой же толщины у других видов рода Paramecium, полученным ранее (Watanabe, 1981). По всей видимости, вирусы хлорелл обладают механизмом прикрепления к поверхности P. bursaria, можно предположить, что они прикрепляются к специфическому рецептору на поверхности инфузории.

Мы применили статистический подход для того чтобы проверить предположение, равномерно или нет распределены вирусные частицы по поверхности P. bursaria в четырех группах зон; зоны были выделены на основании морфологических критериев.

Рис. 5. Ассоциация вирусов хлорелл с поверхностью клетки Р. Ьигэапа А2 17-7. Вирусные частицы в ассоциации с кортексом: плазматической мембраной (пм), ресничками (р), парасомальным мешочком (м), трихоцистой (т): А, В, Г - продольный срез, Б - тангентальный срез. Вирусные частицы обозначены белыми стрелками. Тонкие фибриллы показаны черными стрелками. Размерная линейка 200 нм.

Клетка парамеции полярна и имеет передний и задний концы, в средней части клетки располагается вестибулюм. Преоральный и посторальный швы разделяют ¡клетку на правую и левую зоны. Ротовой аппарат располагается на брюшной стороне клетки. Всего мы проанализировали 63 среза, сделанные с 7 клеток клона (AZ 17-2. Проведенный статистический анализ показал, что существует корреляция ,по показателю плотности вирусных частиц в исследуемых зонах у разных клеток.

При сборе материала для анализа распределения вирусов по поверхности, мы |Не учитывали, на какой стадии клеточного цикла находится клетка P. bursaria. Тем ре менее, проведенный статистический анализ отдельных клеток показал, что распределение вирусов по зонам для разных клеток клона сохраняется, что и позволило нам пренебречь этим фактором. Мы перешли к анализу распределения 1вирусных частиц по зонам с использованием данных по всем клеткам. Было доказано, что вирусные частицы неравномерно распределены между зонами клетки рарамеции. Значение RDI и значение частичного % квадрата показали, что на поверхности клетки вирусные частицы преимущественно занимают среднюю, 'правую зону на брюшной стороне, а также преимущественно локализуются в |буккальной полости. На основании гипотез, подтвержденных статистически, была достроена модель распределения вирусных частиц по поверхности P. bursaria (рис. 6). Судьба поверхностных структур при делении клетки, а также механизмы 'поступления пищевых частиц в глотку у инфузорий из рода Paramecium описаны

достаточно подробно (Iftode et al, 1997; Takahashi et al., 1998; Beisson, 1994; Ishida et al., 2001). На основании анализа литературных данных мы предположили, что | концентрация вирусов в средней части клетки поддерживается за счет регулярного поступления частиц в среднюю зону. Вирусы из среды первоначально «оседают» в области вестибулюма, откуда затем при делениях парамеции распространяются к ! переднему и заднему концам клетки и в результате оказываются во всех областях | поверхности клетки.

Рис.6. Модель распределения вирусных частиц (черные точки) по поверхности Р. bursaria в выделенных зонах. Значения частичного %-квадрата и RDI указывают, что в ассоциации с соматической цилиатурой ; вирусные частицы преимущественно занимают | среднюю, правую зону на брюшной стороне (ПСЗ) и преимущественно располагаются в буквальной полости (б). А. Вид правой стороны клетки. Весгибулюм (в) расположен в средней части клетки (средняя зона). Б. Вид брюшной стороны клетки (брюшная зона). Преоральный (пе) и посторальный (по) швы делят клетку на правую (П) и левую (JI) стороны (левая и правая зоны). Отмечены передний (пк) и задний (зк) концы клетки (передняя и задняя зоны). В. Вид левой стороны клетки.

Мы исследовали вопрос о том, возможно ли установление ассоциации Р. bursaria - Chlorella - вирус в эксперименте, а также возможно ли искусственное установление ассоциации P. caudatum с вирусами хлорелл. Для этого к клеткам клона P. bursaria AZ 17-5, природного безвирусного клона, в цитоплазме которого содержатся хлореллы Pbi типа (Kvitko et al, 2007), а также к клеткам клона Р. caudatum искусственно был добавлен специфический вирус МТ325 (Pbi типа) в избыточной концентрации. Анализ микрофотографий показал, что вирусные частицы не прикрепились к поверхности P. caudatum в условиях данного эксперимента. Вероятно, если вирусы и попадали в ПВ, то они были полностью переварены клетками. В ассоциации с клеткой P. bursaria вирусы обнаруживали на поверхности, в области ротового аппарата, в пищеварительных вакуолях и в маленьких вакуолях 300 нм в диаметре.

Специфичность взаимодействия вирусов хлорелл парамеций и P. bursaria. Хорошо известно, что вирусы высокоспецифичны к хлореллам одного типа - либо NC64A, либо Pbi (Van Etten et al, 1991). С другой стороны, существуют надежные подтверждения тому, что существует предпочтение парамеции по отношению к своему «штамму» водоросли-симбионта (Summerer et al., 2007). Мультипликация вирусов на хлореллах «несоответствующего» типа невозможна (Van Etten et al, 1991). Для одного из исследованных в нашей работе клонов известно, что присутствующие в нем вирусы и хлореллы относятся к одному экотипу. Результаты сопоставления типа вируса и сингена P. bursaria, в ассоциации с которой он был обнаружен, показали, что тип вируса ограничен определенным

ингеном. Соответственно, парамеция определенного сингена содержит пределенный тип хлорелл: сингены 1 и 2 - хлореллы Pbi типа; сингены 3 и 4 -ореллы NC64A типа. Существование специфичности типов хлорелл для двух еографических групп P. bursaria было показано ранее (Hoshina et al., 2005). Было бнаружено, что разные сингены P. bursaria имеют разные ареалы аспространения (Скобло, 1989; Potekhin et al., 2007). Несовпадение ареалов азных сингенов у P. bursaria хорошо согласуется с гипотезой о зависимости аспространения двух типов вирусов и двух типов хлорелл, Pbi (северного) и С64А (южного), от широты и гипотезой о климатической зависимости стречаемости вирусов хлорелл (Kvitko et al., 1996; Мигунова и др., 1999).

Роль P. bursaria в системе Chlorella - вирус. Результаты, полученные нами, сключают всякие сомнения в том, что во многих природных клонах Р. bursaria одержатся инфекционные вирусные частицы. В этих клонах на ПЭФ-профилях ыявляется геномная ДНК вирусов, а на микрофотографиях инфузорий бнаруживаются вирусные капсиды. При разрушении клетки парамеции имбиотические хлореллы, выходящие из клеток такого клона, мгновенно [филируются вирусами. Такую систему по всем признакам можно назвать ехкомпоненгной симбиотической системой P. bursaria - Chlorella - вирус. По ашим оценкам, титр вируса в системе достаточно высок и может изменяться на орядок на протяжении культивирования.

Наряду с этой симбиотической системой в природе существует система Р. bursaria - Chlorella, в которой не обнаруживаются ни инфекционные частицы, ни ирусные капсиды, ни геномная вирусная ДНК. Разделение на вирус-содержашие и езвирусные системы было предложено ранее (Migunova et al., 1996). При золяции клонов инфузорий и дальнейшем культивировании симбиотическая истема остается либо свободной от вируса, либо вируссодержащей (Мигунова и р., 1999). В нашей работе мы полностью подтвердили такое разделение. На сновании анализа большой выборки клонов P. bursaria, полученных из удаленных еографических точек, мы показали, что характеристика «безвирусная» система ш «вируссодержащая» система относится к единичной клетке инфузории, из оторой был получен клон.

Один из известных феноменов взаимоотношения вирусов симбиотических юрелл и ассоциации P. bursaria - Chlorella состоит в том, что вирус не причиняет гкакого вреда ни симбиотическим хлореллам внутри парамеции, ни самой трамеции (Reisser et al., 1988). Таким образом, с одной стороны, литические ирусы специфически инфицируют только симбиотические хлореллы, с другой ороны, в природе хлореллы всегда изолированы от вирусов, так как находятся нутри клеток P. bursaria. Нам впервые удалось получить данные о том, как ieHHO вирусные частицы ассоциированы с симбиотической системой P. bursaria -Chlorella и, таким образом, прояснить жизненный цикл вируса в этой системе. Мы читаем, что ассоциация и поддержание вирусов на поверхности Р. bursaria -¡ляется частью жизненного цикла вируса. Мы предполагаем, что функционально ассоциация с парамецией является для вируса защитой, во-первых, от поглощения как самой парамецией, так и другими биофильтраторами, во-вторых, от действия негативных факторов, снижающих инфекционность вирусных частиц, или

разрушающих вирусы, таких как действие ультрафиолета и температуры. Очевидно, что именно Р. bursaria является системообразующей компонентой и играет важную роль в реализации специфического взаимодействия вирусов и хлорелл и поддержании баланса между популяцией вирусов и хлорелл в природе. Выяснение в будущем возможных механизмов регуляции данной системы представляется, несомненно, актуальным.

ВЫВОДЫ

1. Вирусы хлорелл не являются обязательным компонентом природных симбиотических ассоциаций Р. bursaria - Chlorella; в природе встречаются как вируссодержащие, так и безвирусные клетки парамеций

2. Существует специфичность вирусов хлорелл по отношению к Р. bursaria определенного сингена: вирусы Pbi типа (северный экотип) характерны для сингенов 1 и 2, вирусы NC64A типа (южный экотип) - для сингенов 3 и 4.

3. В вируссодержащей симбиотической системе методом пульс-электрофореза выявляется препаративное количество неинтегрированной вирусной ДНК, которая ассоциирована с клеткой Р. bursaria. На одну клетку Р. bursaria приходится порядка 100 копий вирусного генома. Интегрированные копии не выявляются.

4. Вирусные частицы находятся только на поверхности клетки Р. bursaria. Они располагаются преимущественно в ресничных карманах, и могут быть прикреплены к плазматической мембране тонкими фибриллами.

5. Вирусные частицы встречаются во всех зонах поверхности клетки парамеции, но распределены неравномерно: предпочтительно локализуются в средней, правой зоне на брюшной стороне клетки Р. bursaria, а также в буккальной полости.

6. Ассоциация с клеткой Р. bursaria обеспечивает надежное воспроизведение вирусов: в момент гибели парамеции и высвобождения в среду хлорелл вирусы всегда находятся в области гарантированно высокой локальной концентрации их хозяев - хлорелл.

7. Предложена схема жизненного цикла вируса в трехкомпонентной симбиотической системе Р. bursaria - Chlorella - вирус. 1) Вирусные частицы аккумулируются на поверхности клетки парамеции, содержащей в цитоплазме симбиотические хлореллы; 2) клетка Р. bursaria разрушается, хлореллы попадают во внешнюю среду; вирусные частицы отсоединяются от ПМ парамеции и прикрепляются к клеточной стенке хлорелл; 3) популяция вышедших во внешнюю среду хлорелл инфицируется вирусом, вирусы мультиплицируются и, в результате лизиса клеток хлорелл, оказываются во внешней среде; 4) (соответствует: пункту 1) вирусные частицы вновь аккумулируются на поверхности клетки парамеции, содержащей в цитоплазме симбиотические хлореллы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК:

1. В.В. Ященко, А.А. Потехин, А.В. Мигунова, К.В. Квитко, М.С. Раутиан. Идентификация вирусов хлорелл в клонах Paramecium bursaria методом пульс-электрофореза //Микробиология. 2008. т. 77. № 5. с. 668-674.

Другие публикации:

2. Ященко В.В., Потехин А.А., Мигунова А.В., Раутиан М.С. Электрокариотипы тройной симбиотической системы Paramecium bursaria - Chlorella - вирус PBCV из разных географических точек // Тезисы на конференции «Молодые ученые Санкт-Петербурга - 300-летию города. СПб. 2003. №33. с.52-53

3. Ященко В.В., Потехин А.А., Мигунова А.В., Раутиан М.С. Выявление вируса в тройной симбиотической системе Paramecium bursaria - Chlorella - PBCV вирус из разных географических точек // Юбилейная научная конференция «Биоразнообразие, Экология, Адаптация». Одесса. Украина. 2003. с.206

4. Rautian М., Yashchenko V.V., Potekhin A., Migunova A., Kvitko К., Triple symbiotic system of Paramecium bursaria - Chlorella - Chlorella viruses: study by means of pulsed field gel electrophoresis // Abstr. Of 4th European Congress of Protistology and 10th European conference on Ciliate Biology, San-Benedetto del Toronto, Italy, August 31 - September 5. 2003. p.52.

5. Ященко B.B., Мигунова A.B., Потехин A.A., Квитко К.В., Раутиан М.С. Исследование механизма протекции симбиотических зоохлорелл из Paramecium bursaria от логического действия вируса PBCV II Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития (материалы Ш съезда ВОГиС). Москва. 6-12 июня. 2004. Т. II. с. 433.

6. Yashchenko V., Potekhin A., Rautian М. Detection of PBCV DNA and viral particles in the symbiotic system Paramecium bursaria - Chlorella sp. II Abstr of IVth Algal virus workshop. Amsterdam, Netherlands. 2005. p. 34.

7. Rautian M., Yashchenko V., Potekhin A., Van Etten J. The study of Paramecium bursaria chlorella virus (PBCV). Propagation mechanism in triple symbiotic system Paramecium bursaria - Chlorella sp.- virus PBCV // XIIth International Congress of Protozoology. Guangzhou, China. 2005. p. 35.

8. V.V. Yashchenko, I.I. Skoblo, A.A. Potekhin, A.V. Migunova, M.S. Rautian. Coordinated distribution of Paramecium bursaria syngens and viruses of their endosymbiotic Chlorella II Protistology. 2007. Vol. 5. № 1. p. 89.

Подписано к печати 02.04.09. Формат 60x84 'Лб. Бумага офсетная. Гарнитура Тайме. Печать цифровая. Печ. л. 1,25. Тираж 100 экз. Заказ 4421

Отпечатано в Отделе оперативной полиграфии химического факультета СПбГУ 198504, Санкт-Петербург, Старый Петергоф, Университетский пр., 26 Тел.: (812) 428-4043, 428-6919

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ященко, Варвара Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1 Введение.

2 Цели и задачи.

3 Обзор литературы.

3.1 Феномен симбиоза P. bursaria - Chlorella.

3.2 Общая характеристика P. bursaria.

3.3 Общая характеристика симбиотических водорослей Chlorella sp.

3.4 Систематическое положение симбиотических хлорелл.

3.5 Формирование и поддержание симбиоза P. bursaria — Chlorella.

3.6 Координация жизненных циклов хозяина и симбиотических хлорелл.

3.7 Специфичность взаимоотношений P. bursaria- Chlorella.

3.8 Общая характеристика вирусов хлорелл.

3.9 Филогенетические отношения вирусов хлорелл.

3.10 Жизненные циклы вирусов.

3.11 Литический цикл вирусов хлорелл P. bursaria.

3.12 Протесты и вирусы.

3.13 Поддержание вирусов хлорелл в природных водоемах и в симбиотической системе P. bursaria - Chlorella.

4 Материалы и методы.

4.1 Материалы.

4.1.1 Клоны P. bursaria.

4.1.2 Клоны P. caudatum.

4.1.3 Штаммы хлорелл.

4.1.4 Штаммы вирусов хлорелл.

4.2 Методы.

4.2.1 Методы культивирования инфузорий.

4.2.2 Тестирование клонов P. bursaria на наличие вирусов и определение титра вирусов.

4.2.3 Пульс-Электрофорез.

4.2.4 Гибридизация по Саузерну.

4.2.5 Антитела и непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание клеток P. bursaria.

4.2.6 Визуализация вирусов при помощи красителей SYTOX.

4.2.7 Конфокальная микроскопия.

4.2.8 Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ).

4.2.9 Метод количественного стереологического анализа.

Результаты.

5.1 Скрининг клонов P. bursaria на наличие вирусов.

5.2 Обнаружение вирусов в клонах P. bursaria разных сингенов.

5.3 Идентификация вирусов хлорелл в симбиотической системе P.bursaria - Chlorella методом пульс-электрофореза.

5.3.1 Сравнительный анализ ПЭФ-профилей P.bursaria и хлорелл.

5.3.2 Исследование природы полосы размером около 300 т.п.н. на электрокариотипах клонов P. bursaria.

5.3.3 Локализация интегрированной ДНК вируса в симбиотической системе P. bursaria — Chlorella - вирус.

5.3.4 Локализация неинтегрированной ДНК в симбиотической системе P. bursaria - Chlorella - вирус.

5.3.5 Оценка количества вирусных геномов.

5.4 Исследование локализации вирусных частиц в ассоциации с клеткой P. bursaria.

5.4.1 Идентификация вирусов в трехкомпонентной симбиотической системе P. bursaria - Chlorella - вирус методом непрямой иммунофлюоресценции.

5.4.2 Конфокальная микроскопия клеток P. bursaria окрашенных красителем SYTOX in vivo.

5.4.3 Конфокальная микроскопия клеток P. bursaria in vivo инкубированных с вирусами, предварительно окрашенными красителем SYTOX.

5.5 Исследование вирусов и парамеций методом ТЭМ.

5.5.1 Локализация вирусных частиц в симбиотической системе P. bursaria - Chlorella - вирус.

5.5.2 Распределение вирусных частиц на поверхности P. bursaria.

5.5.3 Локализация вирусов в безвирусной системе P. bursaria — Chlorella.

5.5.4 Локализация вирусов в ассоциации с P. caudatum.

Обсуждение.

6.1 Исследование симбиотической системы P. bursaria - Chlorella -вирус методом ПЭФ и гибридизации по Саузерну.

6.2 Локализация вирусных частиц в симбиотической системе P. bursaria -Chlorella — вирус.

6.3 Специфичность взаимодействия вирусов хлорелл парамеций и Р. bursaria.

6.4 Ассоциация вирусных частиц с цилиатурой ротового аппарата Р. bursaria.

6.5 Распределение вирусных частиц на поверхности клетки парамеции.

6.6 Роль P. bursaria в системе P. bursaria - Chlorella - вирус.

6.7 Роль вирусов в эволюции и экологии симбиоза P. bursaria — Chlorella.

6.8 Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Взаимоотношения Paramecium bursaria (Ciliophora) с вирусами хлорелл (cem. phycodnaviridae) в трехкомпонентной симбиотической системе Paramecium bursaria - Chlorella sp. - вирус"

Термин «симбиоз» был предложен Де Бари в 1979 году. Симбиоз (от Греч, cruv - вместе, {Згсоак; - жизнь) - форма взаимоотношений при сожительстве неродственных организмов (Вагу, 1879). Сегодня под термином симбиоз понимают совместное сосуществование двух или более видов (Margulis, Fester, 1992; Douglas, 1995). Понимание симбиотических отношений имеет большое фундаментальное значение, как в зоологии, так и в микробиологии, а также практическую значимость для медицинской микробиологии (Осипов, Подлипаев, 1981; Margulis, Chapman, 1998).Симбиотические отношения можно рассматривать как модель для изучения межклеточных взаимодействий, иммунных механизмов (Gerasheiiko et al., 2000). Признано, что симбиоз - это один из основных механизмов прогрессивной эволюции в биосфере (Bhattacharya et al., 2007).Протисты представляют широкий спектр возможностей для исследований симбиотических отношений и симбиогенеза. Они формируют симбиотические ассоциации как с про- , так и с эукариотическими организмами, включая бактерии, археи, грибы и микроводоросли (Epstein et al., 1998; Осипов, Подлршаев, 1981; Reisser et al., 1985).Симбиотические отношения Paramecium bursaria (Ciliophora, Oligohymenophorea) и зеленой водоросли Chlorella (Chlorellaceae, Trebouxiophyceae) представляют собой пример классического симбиоза (Karakashian et all, 1968; Reisser, 1986). Эта симбиотическая система является одной из наиболее активно изучаемых систем. Исследования проводятся во многих лабораториях мира уже более полувека.Хлореллы, выделенные из клеток парамеций, специфически инфицируются гигантскими ДНК-содержащими вирусами из рода Chlorovirus семейства Phycodnaviridae (Van Etten, Meints, 1999). Это активные литические вирусы, они не инфицируют свободноживущие хлореллы и не атакуют хлореллы, находящиеся в симбиотических вакуолях внутри Р. bursaria (Van Ettenetal, 1991).Система P. bursaria - Chlorella sp. представляет особый интерес в качестве модельной вирус-содержащей симбиотической системы.Исследования данной многокомпонентной симбиотической системы невозможны без представления об особенностях каждого из партнеров как отдельного организма. Для многих систем раздельное культивирование участников симбиоза весьма трудоемко, а часто и невозможно. В выбранной нами системе этой проблемы не возникает. Участников симбиоза можно разделить и культивировать отдельно (Douglas, Huss, 1986; Kavako et al., 2005). С другой стороны, при изоляции клонов инфузорий и их культивировании сохраняются все три компонента симбиотической системы (Мигунова и др., 2000). Методика культивирования инфузорий Р.bursaria в лабораторных условиях давно отработана (Sonnebom, 1970).В распоряжении лаборатории кариологии одноклеточных Биологического НИИ СПбГУ (после 2008 года лаборатории кариологии одноклеточных биолого-почвенного факультета СПбГУ) имеется уникальная коллекция клонов P.biirsaria из разных районов земного шара (Европа, Европейская часть России, практически все республики бывшего СССР, Япония, Китай, США). Коллекция ежегодно пополняется. Для каждого клона Р.bursaria определена сингенная принадлежность. В сотрудничестве с лабораторией микробиологии БиНИИ СпбГУ (после 2008 года лаборатории микробиологии биолого-почвенного факультета СПбГУ), которая обладает коллекцией симбиотических хлорелл и вирусов, значительная часть (около 100) клонов P.biirsaria была протестирована на наличие вируса. Материалы этих коллекций стали базой для масштабного исследования симбиотической системы Р. bursaria - Chlorella sp. и вирусов хлорелл.2 ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ. Целью настоящей работы стало исследование роли Р. bursaria в трехкомпонентной симбиотической системе Р. bursaria - Chlorella - вирус. В связи с этим были поставлены следующие задачи: 1. выбрать адекватные методы и адаптировать их для работы с полноценной трехкомпонентной симбиотической системой Р. bursaria - Chlorella - вирус; 2. детектировать вирусную ДНК в симбиотической системе Р. bursaria -Chlorella - вирус с помощью метода пульс-электрофореза, определить, в интегрированном или свободном состоянии вирусная ДНК находится в системе.3. определить с помощью световой и электронной микроскопии локализацию вирусных частиц в симбиотической системе Р. bursaria -Chlorella - вирус.4. определить, существует ли специфичность между парамециями (видами, внутривидовыми группами) и вирусами симбиотических хлорелл парамеций.

Заключение Диссертация по теме "Зоология", Ященко, Варвара Владимировна

6.8 Выводы

Впервые, с применением широкого спектра методик, было проведено исследование трехкомпонетной симбиотической системы P. bursaria -Chlorella - вирус. Полученные данные позволили сделать следующие выводы:

1. Вирусы хлорелл не являются обязательным компонентом природных симбиотических ассоциаций P. bursaria - Chlorella; в природе встречаются как вируссодержащие так и безвирусные клетки парамеций

2. Существует специфичность вируса по отношению к P. bursaria определенного сингена: вирусы Pbi типа (северный экотип)

139 характерны для сингенов 1 и 2, вирусы NC64A типа (южный экотип) - для сингенов 3 и 4.

3. В вируссодержащей симбиотической системе методом пульсэлектрофореза выявляется препаративное количество неинтегрированной вирусной ДНК, которая ассоциирована с клеткой P. bursaria. На одну клетку P. bursaria приходится порядка 100 копий вирусного генома. Интегрированные копии не выявляются.

4. Вирусные частицы находятся только на поверхности клетки Р. bursaria. Они располагаются преимущественно в ресничных карманах и могут быть прикреплены к плазматической мембране тонкими фибриллами.

5. Вирусные частицы встречаются во всех зонах поверхности клетки парамеции, но распределены неравномерно: предпочтительно локализуются в средней, правой зоне на брюшной стороне клетки P. bursaria, а также в буккальной полости.

6. Ассоциация с клеткой P. bursaria обеспечивает надежное воспроизведение вирусов: в момент гибели парамеции и высвобождения в среду хлорелл вирусы всегда находяться в области гарантированно высокой локальной концентрации их хозяев - хлорелл.

7. Предложена схема жизненного цикла вируса в трехкомпонентной симбиотической системе P. bursaria — Chlorella - вирус:

1) вирусные частицы аккумулируются на поверхности клетки парамеции, содержащей в цитоплазме симбиотические хлореллы;

2) клетка P. bursaria разрушается, хлореллы попадают во внешнюю среду; вирусные частицы диссоциируют от ПМ парамеции и прикрепляются к клеточной стенке хлорелл;

3) популяция вышедших во внешнюю среду хлорелл инфицируется вирусом, вирусы мультиплицируются и, в результате лизиса клеток хлорелл, оказываются во внешней среде;

4) (соответствует пункту 1) вирусные частицы аккумулируются на поверхности клетки парамеции, содержащей в цитоплазме симбиотические хлореллы.

БЛАГОДАРНОСТЬ Автор глубоко признателен научному руководителю Раутиан Марии Сергеевне за терпение, поддержку и критические замечания, Потехину Алексею Анатольевичу и Некрасовой Ирине Владимировне за ценные критические замечания и всестороннюю поддержку, Инне Исааковне Скобло за внимание и ценные советы. Автор благодарит за помощь в выполнении данной работы и предоставление материала Ольгу Владимировну Гаврилову, Константина Васильевича Квитко и Александру Владимировну Мигунову, Светлану Анатольевну Галкину, Татьяну Вадимовну Куликову. Автор благодарен коллективам лаборатории кариологии одноклеточных БиНИИ СПбГУ и центра «ХРОМАС» СПбГУ.

Автор благодарит за сотрудничество и критические замечания: Джеймса Ван Эттена, Дэвида Данигана и Ирину Агаркову, Department of Plant Pathology, University of Nebraska, Линкольн, США; Кьетиля Якобсена, Center for Ecological and Evolutionary Synthesis (CEES), Department of Biology, Осло, Норвегия, Норберта Pooca и Тове Маргарет Бакар, Department of Molecular Biosciences, Осло, Норвегия.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ященко, Варвара Владимировна, Санкт-Петербург

1. Инге-Вечтомов С.Г., Андрианова В.М. Каталог Петергофской генетической коллекции дрожжей Saccharomyces cerevisiae. J1.: Изд-во Ленинградского Университета. 1988. 53 с.

2. Квитко К.В., Громов Б.В. Новые находки титруемого инфекционного вируса хлореллы // Докл. АН СССР. 1984. Т. 279, № 4. С. 998-999.

3. Макино Т., Охаси М., Докэ X., Макино К. Контроль качества с помощью персональных компьютеров// Москва. Машиностроение. 1986.224 с.

4. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование.// Москва. Мир. 1984. 479 с.

5. Межевая Е.В., Бериташвили Д.Р., Степанова В.П., Яровой Б.Ф., Захаров И.А. Изучение интеграции плазмиды pYF91 в дрожжевые хромосомы методом пульс-фореза // Биополимеры и клетка. 1990. Т.6, № 3. С. 90-93.

6. Мигунова А.В., Квитко К.В., Прокошева М.Ю., Литвинов Д.Б. Влияние температуры на размножение Paramecium bursaria,

7. Chlorella, PBCV-1 вирусов в системе тройного симбиоза// Вестник СПбГУ. 2000. Сер.З. Биол. вып. 1, № 3. С. 65-75.

8. Мигунова А.В., Квитко К.В., Скобло И.И., Прокошева М.Ю. Экология симбиотической системы: Paramecium bursaria — Chlorella -virus // Вестник СПбГУ. 1999. Сер.З. Биол. вып. 3, № 17. С. 131-144.

9. Ю.Мигунова А.В. Исследование водорослей в симбиотической систмеме Paramecium bursaria — Chlorella sp. вирус PBCV (сем. Phycodnaviridae) //Канд. Дисс. СПбГУ.Санкт-Петербург. 2000. 123 с.

10. П.Осипов Д.В. Подлипаев С.А. Теоретические и практические аспекты изучения взаимоотношений простейших с микроорганизмами. // В кн.: Протозоология. Вып. 6. Л.: Наука. 1981. С. 5-30.

11. Осипов Д.В., Скобло И.И., Борхсениус О.Н., Раутиан М.С., Подлипаев С.А. Holospora acuminata — новый вид симбиотической бактерии микронуклеуса инфузории Paramecium bursariaH Цитология. 1980. Т. 22, № 8. С. 922-929.

12. З.Осипов Д.В., Борхсениус О.Н., Скобло И.И., Лебедева Н.А.// Цитология. 1994. Т. 36, № 7. С. 718-725.

13. Пичугин A.M., Галкина С.А., Потехин А.А., Пунина Е.О., Раутиан М.С., Родионов А.В. Определение минимального размера микрохромосом курицы Gallus gallus domesticus методом пульс-электрофореза // Генетика. 2001. Т. 37, № 5. С. 657-660.

14. Потехин А.А., Раутиан М.С., Бригге Т. Геном инфузории Paramecium caudatum: анализ методом пульс-электрофореза// Генетика. 1999. Т. 35, № 12. С. 1413-1420.

15. Скобло И.И. Распространение сингенов инфузории Paramecium bursaria на территории Советского союза // Тезисы докладов П-го всесоюзного симпозиума протозоологов. Экология морских и пресноводных простейших. 1989. С. 63.

16. Скобло И.И., Лебедева Н.А. Инфекция ядерного аппарата инфузории Paramecium bursaria симбиотическими бактериями Holospora curviuscula П Цитология. 1986. Т. 28. № 3. С.367-372

17. Тимофеева А.С., Раутиан М.С. Определение размера генома внутриядерной симбиотической бактерии Holospora undulata методом пульс-электрофореза // 1997. Т. 39, № 7. С. 634-639.

18. Agarkova I.V., Dunigan D.D., Van Etten J.L. Virion-associated restriction endonucleases of Chloroviruses // Journal of Virology. 2006. Vol. 80, № 16. P. 8114-8123.

19. Allen R. D. Food vacuole membrane growth with microtubule associated membrane transport in Paramecium II J. Cell Biol. 1974. Vol. 63. P. 904922.

20. Allen RD., Schroeder CC., Fok AK. Endosomal system of Paramecium: coated pits to early endosomes // J. of Cell Science. 1992. Vol. 101. P.449-461.

21. Вагу G.H. Die Erscheinung der Symbiose // Strassburg. 1879

22. Beisson J. Cytoskeleton and molecular basis of patterning in Ciliates // In Haussmann K, Hulsmann N (eds) Progress in Protozoology. Gustav Fischer Verlag. Stuttgart. 1994. c. 15-24.

23. Beisson J., Clerot J.-C., Fleury-Aubusson A., Nicole Garreau De Loubresse, Ruitz F., Klotz C. Basal body-associated nucleation center for the centrin-based cortical cytoskeletal network in Paramecium // Protist. 2001.Vol. 152. P. 339-354.

24. Benchimol M., Monteiro S.P., Chang T.-H., Alderete J. F. Virus in Trichomonas an ultrastructural study. // Parasitology International. 2002. Vol. 51. P. 293-298

25. Bhattacharya D., Archibald J.M., Weber Andreas P.M., Reyes-Pietro A. How do endosymbionts become organelles? Under standing early events in plastid evolution// Bio Essays. 2007. Vol. 29. P. 1239-1246.

26. Bomford R. The Syngen of Paramecium bursaria: New mating types and intersyngenic mating reactions // J. Protozool.1966. Vol. 13, № 3. P. 497501.

27. Brussaard C.P.D. Viral Control of Phytoplankton Population a Review // J. Eucariot. Microbiol. 2004. Vol.51, №.2. P. 125-138.

28. Bubeck J.A., Pfitzner A.J.P. Isolation and characterization of a new type of chlorovirus that infects an endosymbiotic Chlorella strain of the heliozoon Acanthocystis turfacea II Journal of General Virology. 2005. Vol. 86. P.2871—2877.

29. Carle G.F., Olson M.V. An electrophoretic caryotype for yeast // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. Vol.82, № 11. P.3756-3760.

30. Chen F., Suttle C.A. Amplification of DNA Polymerase gene fragments from viruses infecting microalgae // Applied and Enviromental Microbiology. 1995. Vol.61, №.4. P. 1274-1278.

31. Chen F., Suttel C.A. Evolutionary relationships among large double-stranded DNA viruses that infect macroalgae and other organisms as inferred from DNA polymerase genes// Virology. 1996. Vol. 219. P. 170178.

32. Clarke K.J. Virus particle production in lysogenic bacteria exposed to protozoan grazing // FEMS Microbiology Letters. 1998. Vol. 166. P. 177180.

33. Clerot J.C, Iftode F., Budin K., Jeanmaire Wolf R., Coffe G., Fleury-Aubusson A. Fine oral filaments in Paramecium: a biochemical and immunological analysis // J. Eukaryot Microbiol. 2001. Vol. 48, № 2. P.234-245.

34. Corliss J.O. Concept, definition, prevalence, and host-interactions of xenosomes (cytoplasmic and nuclear endosymbionts) // J. Protozol. 1985. Vol. 32. P. 373-376.

35. Delaroque N., Maier I., Knippers R., Muller DG. Persistent virus integration into the genome of its algal host, Ectocarpus siliculosus (Phaeophyceae) // J Gen Virol. 1999. Vol.80. P.1367-1370.

36. Dimitrov D.S. Virus entry: molecular mechanisms and biomedical applications//Microbiolog. 2004. Vol. 2. P. 109-122.

37. Douglas A.E. The ecology of symbiotic microorganisms // Adv. Ecol. Res. 1995. Vol. 26. P. 69-103.

38. Douglas A.E., Huss V.A.R. On the characteristics and taxonomic position of symbiotic Chlorella.il Arch. Microbiol. 1986. Vol.45. P. 80-84.

39. Douglas A., Smith D.C. The green Hydra symbiosis. VIII. Mechanisms in symbioht regulation//Proc. R. Soc. Lond. B.1984. Vol. 221. P.291-319.

40. Dunigan D., Fangman Т., Zhou Y., Kronshnabel В., Agarkova I., Van Etten J.L. // Abstr. at the "IVth Algal virus workshop" Amsterdam, Netherlands, 2005. P.8

41. Dunigan D.D., Fitzgerald L.A., Van Etten J.L. Phycodnaviruses: A peek at genetic diversity // Virus Research. 2006. Vol. 117. P. 119-132

42. Ehret C.F., Powers E.L. The Organization of gullet organelles in Parameciam bursaria// J. Protozool. 1957.Vol.4. P. 55-59.

43. Gerashenko B.I., Nishihara N., Ohara Т., Tosuji H., Kosaka T. and Hosoya H. Flow cytometry as a strategy to stady the endosymbiosis of algae in Paramecium bursaria// Cytometry. 2000. Vol. 41. P.209-215.

44. G6rtz H.D. Infections of Paramecium bursaria with bacteria and yeasts // J. Cell Sci. 1982. Vol. 58. P. 445-453.

45. Goetsch W. Die Symbiose der Susswasser-Hydroiden und ihre kiinstlische Beeinflussung // Zeitschr. Morph. Okol. Tirte.1924. Vol. 1. P. 660-731.

46. Grabherr R., Strasser P., Van Etten J.L., 1992. The DNA polymerase gene from chlorella viruses PBCV-1 and NY-2A contains an intron with nuclear splicing sequences.// Virology. 1992.Vol. 188. P. 721-731.

47. Graham L.E., Graham J.M. Ultrastracture of endosymbiotic Chlorella in a Vorticella //J. Protozool. 1978. Vol. 25, № 2. P. 207-210.

48. Gu F., Chen L., Ni В., Zhang X. A comparative study on the electron microscopic enzymo-cytochemistry of Paramecium bursaria from light and dark cultures // Euorop. J. Protistol. 2002. Vol. 38. P.267-278.

49. Hoshina R., Kamako S.I., Imamura N. Phylogenetic position of endosymbiotic green algae in Paramecium bursaria Ehrenberg from Japan// Plant, biol. (Stuttg). 2004. Vol.6, №.4. P.447-453.

50. Hoshina R., Kato Y., Kamako S-i., Imamura N. Genetic evidence of "American" and "European" type symbiotic algae of Paramecium bursaria Ehrenberg // Plant Biol. 2005. Vol. 7. P. 526—532.

51. Hoshina R., Imamura N. Multiple Origins of the Symbioses in Paramecium bursaria II Protist. 2008.Vol. 159. P.53—63.

52. Huss V.A.R., Holweg C., Seidel В., Reich V., Rahat M, Kessler E. There is an ecological basis for host/symbiont specificity in Chlorell a/Hydra symbioses // Endocyt. Cell. Res. 1993/94. Vol.10. P. 35—46.

53. Huss V.A.R., Ciniglia C., Cennano P., et al. Phylogenetic position of Chlorella-WkQ isolates from low pH anvironments (pH < 3.0) // BMC Evolutionary biology. 2002. Vol. 13. P.2.

54. Iftode F., Fleury-Aubusson A. Structural inheritance in Paramecium: ultrastructural evidence for basal body and associated rootlets polaritytransmission through binary fission // Biology of the Cell. 2003. Vol. 95. P. 39-51.

55. Jennings H.S. Genetics of Paramecium bursaria. I. Mating types and groups, their interrelations and distribution; mating behavior and self sterility // Genetics. 1939. Vol 24, № 2. P. 202-233.

56. Hightower R.C., Metge D.W., Santi D.V. Plasmid migration- using orthogonal-field-alteration gel electrophoresis // Nucl. Acids. Res. 1987. Vol.15, №20. P. 8387-8398.

57. Kadono Т., Kawano Т., Hosoya H., Kosaka T. Flow cytometric studies of the host-regulated cell cycle in algae symbiotic with green Paramecium // Protoplasma. 2004. Vol. 223. P. 133-141.

58. Kang M., Dunigan D.D., Van Etten J.L. 2005. Chloroviruses: a genus of Phycodnaviridae that infect certain chlorella-like green algae // Mol. Plant Path. 2005. Vol. 6. P. 213-224.

59. Karakashian S.J. Grow of Paramecium bursaria by the presence of algal symbionts//Physiol. Zool. 1963. Vol. 36. P. 52-68.

60. Karakashian S.J., Karakashian M.W., Rudninska M.A. Electron microscopic observations on the symbiosis of Paramecium bursaria and its intracellular algae // J. Protozool. 1968. Vol. 15, № 1. P. 113-128.

61. Karakashian S.J., Rudzinska M.A. Inhibition of lysosomal fusion with symbiont-containing vacuoles in Paramecium bursaria// Exptl. Cell. Res. 1981. Vol. 131. P. 387-393.

62. Kawakami H., Kawakami N. Behavior of a virus in a symbiotic system Paramecium bursaria — zoochlorella // J. Protozool. 1978. Vol. 25. P. 217-225.

63. Kodama Y. and Fujishima M. Symbiotic Chlorella sp. of the ciliate Paramecium bursaria do not prevent acidification and lysosomal fusion of host digestive vacuoles during infection// Protoplasma. 2005. Vol. 225. P. 191-203.

64. Kodama Y., Fujishima M. Cycloheximide induces synchronous swelling of perialgal vacuoles enclosing symbiotic Chlorella vulgaris and digestion of the algae in the Ciliate Paramecium bursaria // Protist. 2008. Vol. 159. P. 483-494.

65. Kodama Y., Nakahara M., Fujishima M. Symbiotic alga Chlorella vulgaris of the ciliate Paramecium bursaria shows temporary resistance to host lysosomal enzymes during the early infection process // Protoplasma. 2007. Vol. 230. P. 61-67.

66. Kosaka T. Life cycle of Paramecium bursaria syngen 1 in nature// J.Protozool. 1991. Vol.38, №.2. P. 140-148.

67. Kosaka T. Life cycle of Paramecium bursaria syngen 1 in a natural pond// Zool. Sci. 1994. Vol. 11. P. 517-526.

68. Kvitko К., Zelennikova О., Migunova A. Ecological and climatic rules for PBCV-virus circulation // Abstracts of X-th International Congress of Virology. Jerusalem. Israel. 1996. P. 250.

69. Kvitko K.V., Migunova A.V., Karelov D.B., Prokosheva., M.Ju. Molecular taxonomy of virus-sensitive Clorella sp. symbionts of Paramecium bursaria 11 Protistology. 2001. Vol. 2, № 2. P. 96-104.

70. Larsen J. В., Larsen A., Bratbak G., Sandaa R.-A. Phylogenetic analysis of members of the Phycodnaviridae virus family, using amplified fragments of the Major Capsid Protein gene// Applied and Environmental Microbiology. 2008. P. 3048-3057.

71. Lee J. J., Zucker W. Alga flagelate symbiosis in formanifer Archaias //J. Protozool. 1969. Vol. 16. P. 71-80

72. Lee J.J., Soldo A.T., Reisser W., Lee M.J., Jeon K.W. & Gotzt HAD/ The extent of algal and bacterial endosymbiose in Protozoa // J. Protozoor.1985.Vol. 32. P 391-403.

73. Lehmann M.J., Sherer N.M, Marks C.B, Pypaert M., Mothes W. Actin-and myosin-driven movement of viruses along filopodia precedes their entry into cells // J. of Cell Bioljgy. 2005. Vol. 170, № 2. P. 317-325.

74. Linz В., Linz A., Migunova A.V., Kvitko K.V. Correlation between virus-sensitivity and isoenzyme spectrum in symbiotic Chlorella-like algae // Protistology. 1999. Vol.1, № 2. P. 76-81.

75. Lucocq J.M., Habermann A., Watt S., Backer J., Mayhew TM., Griffiths G. A rapid method for assessing the distribution of gold labelling on thin sections // J. Histochem Cytochem. 2004. Vol. 52. P. 991-1000.

76. Marie D., Brussaard C., Thyrhaug R., Bratbak G., Vaulot D. Enumeration of marine viruses in culture and natural samples by flow cytometry // Appl. Environ. Microbiol. 1999. Vol. 65. P. 45-52.

77. Margulis L., Chapman M.J. Endosymbioses: cyclical and permanent in evolution //Trends Microbiol. 1998. Vol. 6. P. 342-345.

78. Margulis L., Fester R. Symbiosis as a Source of Evolutionary Innovation: Speciation and Morphogenesis // MIT Press, Cambridge, Massachusetts. 1992. 454 pp.

79. Maule J. Electrophoretic karyotype analysis // Methods in Molecular Biology. 1994. Vol. 29. P. 221-252.

80. Mayhew T. Quantative Immunoelectron Microscopy // In Kuo J (ed) Methods in Molecular Biology, Electron Microscopy: Methods and Protocols. Humana press, Totowa . 2007. Vol. 369. P. 309-328.

81. McCluskey K., Graves M., Dallice M., Meints R.H. Replication of Chlorella virus PBCV-1 and host karyotype determination studied with pulsed-field gel electrophoresis // J. Phycol. 1992. Vol. 28. P. 846-850.

82. Meier R., Reissner W., Wiessner W. et al. Freeze-fracture evidence of differences between membranes of perialgal and digestive vacuoles in Paramecium bursaria HZ. Naturforsch. 1984. Vol. 35. P.l 107-1110.

83. Meier R., Wiessner W. Infection of algae-free Paramecium bursaria with symbiotic Chlorella sp. isolated from green paramecia. II. Effect of incubation period// J.Cell.Sci. 1988. Vol.24. P.69-74.

84. Meier R., Wiessner W. Infection of algae-free Paramecium bursaria with symbiotic Chlorella sp. isolated from green paramecia. II. A timed study. // J.Cell.Sci. 1989. Vol.93. P.571-579.

85. Meints R.H., Van Etten J.L., Kuczmarski D., Lee K.,and Ang B. Viral infection of the symbiotic Chlorella-like alga present in Hydra viridis// Virology. 1981. Vol.113. H. 698-703.

86. Meints R. H., Lee K., Burbank D.E. et al. Infection of a Chlorella-like alga with the virus, PBCV-1: ultrastructural studies// Virology. 1984. Vol.138. P.341-346.

87. Migunova A., Scoblo I., Kraeva E., Litvinov D., Voitsekhovski E., Kvitko K. Zoochlorella viruses carrier status of Paramecium bursaria // Abstracts of X-th International Congress of Virology. Jerusalem. Israel. 1996. P. 251.

88. Mushegian A.R., Koonin E.V. A minimal gene set for cellular life derived by comparison of complete bacterial genomes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. Vol.93. P.10268-10273.

89. Naiton Y., Sugino K. Ciliary movement and its control in Paramecium // J Prorozool. 1984. Vol. 31. P. 31-40.

90. Nishihara N., Takahashi Т., Kosaka Т., Hosoya H. (1996) Characterization of endosymbiotic algae in Paramecium bursaria// Jpn. J .Protozool Vol. 29. P.35.

91. Pardy R.L., Spargo В., Crowe J.H. Release of trehalose by symbiotic Algae // Symbiosis. 1988. Vol.7. P.149-158.

92. D.T. Petrik, A Iseli, B. A. Montelone, James L. Van Etten, R. J. Clem Improving baculovirus resistance to UV inactivation: increased virulence resulting from expression of a DNA repair enzyme // J. Invert Pathology. 2004.

93. Radke К., Dohner К., Sodeik B.Viral interactions with the cytoskeleton: a hitchhiker's guide to the cell // Cellular Microbiology. 2006. Vol. 8, № 3. P. 387-400.

94. Rahat M., Reich V., A revalution of alleged requirements for the establishment of Algal/Hydra symbioses and Host/Symbiont specificity: preadaptation and VACUOLAR ecology// Endocyt.C. Res. 1987. Vol. 4. P.13-23.

95. Rahat M., Reich V. Algal endosymbiosis in brown hydra: host-symbiont specifity//J. Cell. Sci. 1986. Vol.86. P. 273-286.

96. Raoult D., Audic S., Robert K., Abergel C., Renosto P., Ogata H., Bernard La Scola, Suzan M., Claverie J.-M. The 1.2-Megabase Genome Seguence of Mimivirus // Science. 2004.Vol. 306. P. 1344-1350.

97. Rautian MS., Potekhin AA. Electrokaryotypes of macronuclei of several Paramecium species // J. Eukaryot Microbiol. 2002. Vol. 49, № 4. P. 296304.

98. Reisser W. Endosymbiotic association of freshwater protozoa and algae // Progress in Protistol. 1986. Vol. 1. P. 195-214.

99. Reisser W. Naturally occurring and artificially established associations of ciliates and algae // Endocytobiology. 1987. P. 316-329.

100. Reisser W., Meier R., Kurmeier B. The regulation of endosymbiotic algal population size in ciliate-algal association. An ecological model// Endocytobiology. 1983. Vol. II. P.533-543.

101. Reisser W., Meier R., Gortz H.D., Jeon K.W. Establishment, maintenance, and integration mechanisms of endosymbionts in Protozoa // J. Protozool. 1985. Vol. 32, № 3. P. 383-390.

102. Reisser W., Niess D. Photobehavior of ciliate-algae association: an indicator for symbiosis formation // Endocytobiology. Walter de Gruyter & Co., Berlin-New York. 1983. Vol. II. P.345-552.

103. Reymond O.L., Pickett-Heaps J.D. A routine flat embedding method for electron microscopy of microorganisms allowing selection and precisely orientated sectioning of single cells by light microscopy // J. of Microscopy. 1982. Vol. 130. P. 79-84.

104. Schuster A.M., Burbank D.E., Meister В., Skrdla M.P., Hattman S., Swindon D., Van Etten J.L. Characterization of viruses infection a eukaiyotic ChlorellaAike green alga // Virology. 1986. Vol. 150. P. 170177.

105. Schuster A.M., Waddle JA., Korth K., Meints RH. The chloroplast genome of an exsymbiotic Chlorella-Wkz green alga // Pant Molecular Biology. Vol. 14, № 5. P. 859 862.

106. Siegel RW. Hereditary endosymbiosis in Paramecium bursaria // Exp Cell Res. 1960. Vol. 19. P. 239-252.

107. Skrdla M.P., Burbank D.E., Xia Y., Meints R.H., Van Etten J.L. Structural proteins and lipids in a virus, PBCV-1, which replicates in a chlorella-like alga//Virology. 1984.Vol. 135. P. 308-315.

108. Smith A.E., Helenius A. How viruses enter animal cells // Science. 2004. Vol. 304. P. 237-242.

109. Sokal R.R., Rohlf F.J., Biometry. Yhe Principles and Practice of , Statistics in Biological Research // San Francisko: W. H. Freeman. 1981.859 p.p.

110. Sonneborn T.M. Methods in Paramecium research // Methods Cell Physiol. 1970. Vol. 4. P. 241-339.

111. Stabell Т., Andersen Т., Klaveness D. Ecological significance of endosymbionts in a mixotrophic ciliate an experimental test of a simple model of growth coordination betweenhost and symbiont // J. Plankton Res. 2002. Vol. 24. P. 889-99.

112. Summerer M., Sonntag В., Sommaruga R. An experimental test of the symbiosis specificity between the ciliate Paramecium bursaria and strains of the unicellular green alga Chlorella // Enviromental Microbiology. 2007. Vol. 9, № 8. P. 2117-2122.

113. Summerer M., Sonntag В., Sommaruga R. Ciliate symbiont specificity of freshwater endosymbiotic Chlorella (Trebouxiophyceae, Chlorophyta) // J. Phycol. 2008. Vol. 44. P. 77-84.

114. Takahashi T.,Okubo M.A., Hosoya H. Differentiation of cortical structures and their reorganization during cell division in Paramecium trichium II J. of Eukaryotic Vicrobiology. 1998. Vol. 45, № 4. P. 369-380.

115. Tanaka M., Miwa I. Significance of photosyntheticproducts of symbiotic Chlorella to establish the endosymbiosis and to express the mating reactivity rhythm in Paramecium bursaria I I Zool. Sci. 1996. Vol. 13. P. 685-692.

116. Tonooka Y., Watanabe T.Genetics of the relationship between the ciliate Paramecium bursaria and its symbiotic algae// Invertebrate Biology. 2007. Vol. 126, № 4. P. 287-294.

117. Trench R.K. The cell biology of plant-animal symbiosis// Ann. Rev. Plant Physiol. 1979.Vol. 30. P. 485-531.

118. Van Etten J.L. Unusual life style of Giant chlorella viruses//Annu. Rev. genet. 2003. Vol. 37. P. 153-95.

119. Van Etten J.L., Burbank D.E., Kuczmarski D., Meints RH. Virus infection of culturable Chlorella-like algae and development of a plaque assay// Science. Vol. 219. 1983. P. 994-996.

120. Van Etten, J. L., D. E. Burbank, A. M. Schuster, R. H. Meints. 1985. Lytic viruses infecting a Chlorella-like alga // Virology. Vol. 40. P. 135143

121. Van Etten J.L., Graves M.V., Muller D.G. et al. Phycodnaviridae large DNA algal viruses //Arch. Virology. 2002. Vol.147. P.1479-516.

122. Van Etten J.L., Lane L.C. and Meints R.H. 1991. Viruses and virus-like particles of eukaryotic algae// Microbiological Reviews. 1991. Vol. 55. P. 586-620.

123. Van Etten J.L. and Meints R.M. Giant viruses infecting algae// Annu. Review Microbiology. 1999. Vol.53. P. 447-494.

124. Van Etten J.L., R.H. Meints, D.E. Burbank, D. Kuczmarski, D.A. Cuppels and L.C. Lane. 1981. Isolation and characterization of a virus from the intracellular green alga symbiotic with Hydra viridis И Virology. 1981. Vol. 113. P. 704-711.

125. Van Etten J.L., Meints R.H., Kuczmarski D. et al. Virus of symbiotic Chlorella-like algae isolated from Paramecium bursaria and Hydra viridis 11 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. Vol.79. P.3867-3871.

126. Vanchini R. G., Benchimol M. Appearance of virus-like particles in Tritrichomonas foetus after drug treatment // Tissure and Cell. 2005. Vol. 37. P. 317-323.

127. Villareal L.P., DeFilippis V.R. A hypothesis for DNA viruses as the origin of eucariotic replication proteins // J. Virol. 2000. Vol. 74. P.7079-7084.

128. Vorobyev К, Andronov E, Rautian M, Skoblo I, Migunova A, Kvitko K. Detection of an atypical Paramecium bursaria Chlorella symbiont // In press

129. Watanabe T. Electron microscopy of cell surfaces of Paramecium caudatum stained with ruthenium red // Tissue and cell. 1981. Vol. 13. № l.P. 1-7.

130. Weinbauer M.G. Ecology of prokaryotic viruses// FEMS Microbiology Reviews. 2004. Vol. 28. P. 127-181.

131. Weis D.S. Digestion of added homologous algae by Chlorella-bearing Paramecium bursaria //J. Protozool. 1976. Vol. 23, No.4. P.527-529.

132. Weis D.S. Infection in Paramecium bursaria as an inductive process// Endocytobiology. 1983. Vol. II. P. 523-532.

133. Weis D.S., Ayala A. Effect of exposure period and concentration on the frequency of infection of aposymbiotic ciliates by symbiotic algae from Paramecium bursaria H J. Protozool. 1979. Vol. 26, №2, P. 245-248.

134. Wichtermann R. The Biology of Paramecium II New York. London: Plenum Press. 1986. P. 599.

135. Wommack K.E., Colwell R.R. Virioplankon: Viruses in aquatic ecosystems // Microbiology and Molecular Biology reviews. 2000. Vol.64, №.1.P. 69-114.

136. Yamada Т., Higashiyama Т., Fucuda T. Screening of natural waters for viruses which infect Chlorella cells // Appl. Environment. Microbiol. 1991. Vol. 57, №12. P. 3433-3437.

137. Yamamoto Y, Fujimoto Y, Arai R et al. Retrotransposone-mediatad restoration of Chlorella telomeres: accumulation of Zepp retrotranspozones at termini of newly formed minichromosomes// Nucleic Asid research. 2003. Vol. 31,№ 15. P.4646-4653.

138. Yan X., Olson N.H., Van, Bergoin M, Rossman M.G., Baker T.S. Stracture and assembly of large, lipid-containing, dsDNA viruses // Nat. Struct. Biol. 2000. Vol.7. P. 101-103.

139. Zhang Y., Adams В., Sun L. Intron conservation in the DNA polymerase gene encoded by Chlorella viruses // Virology. 2001. Vol. 285. P. 313-321.

140. Zhang Y., Burbank D.E., Van Etten J.L. Chlorella viruses isolated in China//Appl. Environment. Microbiol. 1988. Vol. 54. P. 2170-2173.

Информация о работе

Ященко, Варвара Владимировна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2009
ВАК 03.00.08

Диссертация

Взаимоотношения Paramecium bursaria (Ciliophora) с вирусами хлорелл (cem. phycodnaviridae) в трехкомпонентной симбиотической системе Paramecium bursaria - Chlorella sp. - вирус - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы