Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Полиморфизм электрофоретических кариотипов макронуклеуса у видов-двойников комплекса Paramecium aurelia (ciliata)
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология
Автореферат диссертации по теме "Полиморфизм электрофоретических кариотипов макронуклеуса у видов-двойников комплекса Paramecium aurelia (ciliata)"
САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
На правах рукописи
НЕКРАСОВА Ирина Владимировна
ПОЛИМОРФИЗМ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИХ КАРИОТИПОВ МАКРОНУКЛЕУСА У ВИДОВ-ДВОЙНИКОВ КОМПЛЕКСА PARAMECIUM AURELIA (CILIATA)
специальность: 03.00,25 - гистология, цитология, клеточная биология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Санкт-Петербург 2008
003456603
Работа выполнена в лаборатории кариологии одноклеточных биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета
Научный руководитель: доктор биологических наук Родионов Александр Викентьевич
Официальные оппоненты: доктор биологических наук
Скарлато Сергей Орестович
доктор биологических наук, профессор Колесников Александр Александрович
Ведущее учреждение: Российский государственный педагогический университет имени А.И. Герцена
Защита состоится " " 2008 г. в часов на заседании совета Д.212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, Биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета
Автореферат разослан " "_2008 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук
Л.А. Мамон
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
, Актуальность проблемы. Проблема вида у инфузорий очень запутана. Морфологи-еские критерии зачастую не дают возможности однозначно определить видовую при-адлежность тех или иных представителей рода (Schlegel, Meisterfeld, 2003). Внутри (классических» морфологических видов у большинства инфузорий выделяют репродук-ивно изолированные группы - сингены, границы между которыми могут быть более или енее ярко выраженными. Иногда сингенам придают статус генетических видов, или ви-ов-двойников (Sonneborn, 1975; Nanney, McCoy, 1976). Комплекс видов-двойников aramecium aurelia является одним из наиболее изученных комплексов генетических ви-ов у инфузорий. По сути, появление генетических видов отражает начальные этапы ви-ообразования. Именно сравнительное изучение сингенов кажется наиболее перспектив-1ым подходом к проблеме видообразования и структуре вида у инфузорий.
Исключительная распространенность сингенов у инфузорий дает основания свя-ывать это явление с уникальной особенностью этой группы протестов - наличием ге-ероморфного ядерного аппарата. У инфузорий в одной клетке функционирует два типа ер (Райков, 1978; Осипов, 1981): микронуклеус (МИК) и макронуклеус (МАК). МИК одержит десятки мелких хромосом; это в целом транскрипционно инертное ядро, чья сновная функция -.передача генетической информации дочерним клеткам при поло-ом процессе. МАК является соматическим ядром с активной транскрипцией, опреде-яющим фенотип клетки; в этом ядре отсутствуют традиционные хромосомы, и геном остоит из тысяч амплифицированных молекул ДНК (Prescott, 1994).
В ходе полового процесса (конъюгации) МАК постепенно деградирует, а МИК ретерпевает мейоз. В результате слияния образующихся при этом гаметических ядер ормируется зиготическое ядро (синкарион), из продуктов деления которого дифферен-ируются новые МАК и МИК. При формировании МАК зиготический геном претерпевает ряд существенных перестроек (Jahn, Klobutcher, 2002): происходит фрагментация исходных хромосом, значительная часть генетического материала элиминируется, а оставшиеся последовательности амплифицируются. Общая схема данного процесса одинакова [я всех инфузорий, но детали формирования (и, соответственно, организации) генома МАК сильно различаются у разных групп Ciliata (Prescott, 1994; Katz, 2001).
Сформированный в ходе таких перестроек геном МАК состоит из набора фрагментов ДНК различной длины, представленных различным числом копий, фланкированных теломерами и способных к репликации. В нём практически отсутствуют повторы, некодирующие последовательности и транспозонные элементы, характерные для генома МИК.
Одной из предпосылок дивергенции видов является высокая изменчивость геномов и кариотипов (см. Кайданов, 1996). Однако сложность и нетривиальность организации генома МАК не позволяют использовать стандартные методы цитогенетики для ка-риотипирования этого ядра; хромосомный набор МИК, содержащий у большинства инфузорий десятки очень мелких и не имеющих отличительных черт хромосом, также неудобен для цитогенетических исследований.
Электрофоретическое разделение молекул ДНК МАК - пока единственный способ кариотипирования МАК. «Хромосомы» МАК большинства инфузорий находятся за пределами разрешения обычного электрофореза, но могут быть исследованы методом
пульс-электрофореза (ПЭФ), позволяющим разделять в геле молекулы ДНК размером от 50 т.п.н. до 10 млн.п.н. (Maule, 1996). Получаемые при этом ПЭФ-профили можно использовать как своеобразный эквивалент традиционных, классических кариотипов.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось исследование изменчивости генома макронуклеуса инфузорий на ранних этапах видообразования. В качестве объекта исследования был выбран комплекс видов-двойников P. aurelia.
Нами были поставлены следующие конкретные задачи:
1. На модели P. tetraurelia проанализировать ПЭФ-профиль и локализовать на нем несколько генов, сопоставив полученные результаты с данными секвенирования генома МАК этого вида (http://paramecium.cgm.cnrs-gif.fr/db/index). Показать, что электрофоре-тический кариотип отражает реальную молекулярную организацию генома МАК.
2. Изучить возможные изменения ПЭФ-профиля МАК в ряду клеточных поколений. Для этого получить синхронные культуры (все клетки которых находятся на одной стадии жизненного цикла) и сравнить ПЭФ-профили синхронизированного клона на разных этапах «старения» МАК.
3. Провести сравнительный анализ ПЭФ-профилей видов-двойников комплекса P. aurelia: определить уровень внутри- и межвидового полиморфизма по данному признаку, а также его связь с географическим происхождением клонов; локализовать несколько сцепленных у P. tetraurelia генов на ПЭФ-профилях разных видов комплекса P. aurelia.
4. Сопоставить полученные результаты с опубликованными молекулярными филогениями комплекса P. aurelia. Определить, сопровождается ли дивергенция видов-двойников комплекса P. aurelia возникновением и накоплением изменений в геноме МАК.
Научная новизна работы. Предлагаемая работа является первым сравнительным исследованием молекулярной организации генома МАК видов-двойников комплекса Р. aurelia. Впервые получены и детально описаны электрофоретические кариотипы всех пятнадцати видов комплекса.
На примере вида P. tetraurelia, геном МАК которого секвенирован (Aury et al., 2006), показано, что электрофоретический кариотип отражает реальное распределение «хромосом» МАК по размерам. Впервые установлено, что молекулярная организация генома МАК не изменяется в ходе жизненного цикла Paramecium и является постоянной характеристикой клона
Впервые определен уровень внутривидового полиморфизма электрофоретических кариотипов для видов комплекса P. aurelia, при этом показано, что полиморфизм по молекулярной организации генома МАК может быть связан с разным географическим происхождением сравниваемых клонов.
Впервые получены данные о том, что возникновение изменений в организации генома МАК сопряжено с дивергенцией видов или групп видов у инфузорий.
Практическая ценность. Работа носит фундаментальный характер. Полученные в работе данные вносят важный вклад в понимание проблемы видообразования у инфузорий. Синтез различных - геномных, генетических, физиологических, молекулярно-филогенетических - данных, позволяющих достоверно определять уровень филогенетической близости видов, может открыть возможности для изучения механизмов видообразования, и, видимо, является единственно адекватным на сегодняшний день подходом к проблеме вида и изучению биоразнообразия у Protozoa в целом.
Генетические виды характеризуются высоким морфологическим сходством, что затрудняет процесс определения видовой принадлежности вновь выделяемых в природе
клонов. Показано, что для восьми из пятнадцати видов-двойников комплекса P. aurelia электрофоретический кариотип является видоспецифичным. Полученные данные позво-[ют использовать метод ПЭФ для точной идентификации представителей этих видов.
Показана возможность использования метода ПЭФ для исследования групп сцеп-ения у инфузорий, что, в свою очередь, важно для понимания общих закономерностей волюции геномов.
Полученные результаты используются в курсах лекций "Частная зоология беспо-воночных. Инфузории" на кафедре зоологии беспозвоночных, "Эволюция геномов и ариотипов" на кафедре цитологии и гистологии биолого-почвенного факультета ПбГУ.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на Международной онференции по молекулярной биологии и биотехнологии инфузорий и анаэробных ротистов (Ниймеген, Голландия, 2003), III Съезде ВОГиС (Москва, 2004), IV (Сан-енедетто дель Тронто, Италия, 2003) и V (Санкт-Петербург, Россия, 2007) Европей-ком протистологическом конгрессе, XII Международном конгрессе по протозоологии Гуанчжоу, Китай, 2005), 2-ом Международном совещании по геномике Paramecium Дурдан, Франция, 2006). Материалы диссертации неоднократно обсуждались на науч-ых семинарах кафедры цитологии и гистологии и лаборатории кариологии однокле-очных биолого-почвенного факультета СПбГУ.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обора литературы, экспериментальной части, включающей материалы и методы, результа-ы исследования и их обсуждение, выводов и списка литературы, содержащего 142 на-менования. Работа изложена на 172 страницах, содержит 41 рисунок и 4 таблицы.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Использованные культуры. В работе использовали 87 клонов пятнадцати ви-ов-двойников комплекса P. aurelia {P. primaurelia, P. biaurelia, P. triaurelia, Р. etraurelia, P. pentaurelia, P. sexaurelia, P. septaurelia, P. octaurelia, P. novaurelia, P. deaurelia, P. undecaurelia, P. dodecaurelia, P. tredecaurelia, P. quadecaurelia, P. sonne-orni). Все использованные культуры поддерживаются в Коллекции клонов инфузорий aramecium лаборатории кариологии одноклеточных биолого-почвенного факультета СПбГУ. Некоторые клоны, в том числе клон P. tetraurelia d 4-2, геном МАК которого секвенирован, получены нами от иностранных коллег (Е. Przybos, Польша; Н. Schmidt, М. Simon, H.-D. Görtz, Германия; К. Aufderheide, США; J. Cohen, Франция).
Методы лабораторной работы с инфузориями. Культивирование клонов Paramecium проводили по стандартной методике (Sonneborn, 1970). Питательной средой служил салатный отвар, инокулированный бактериями Klebsiella cloacae.
Синхронизация культур инфузорий. Синхронные культуры парамеций получали по методу, предложенному Соннеборном (Sonneborn, 1970). Инфузорий, завершающих автогамию, выявляли при помощи «камеры Сковородкина» (Сковородкин, 1990) и интерференционного микроскопа с контрастом Номарского Polyvar Reichert. Такие клетки клонировали в микроаквариуме в 100 мкл среды. Вегетативное потомство каждой такой клетки ежедневно кормили из расчета 800 мкл пищевой среды на одну клетку
(то есть, культуру вели при избыточном кормлении). В таких условиях P. aurelia делятся с постоянной высокой скоростью (2-3 деления в сутки), и автогамия наступает у клеток одновременно, через 25-28 делений. Одну клетку культуры ежедневно изолировали и переводили в новый микроаквариум, что позволяло регистрировать частоту делений клеток культуры. Автогамия наступала на стадии 28-32 делений. Если все клетки клона полностью проходили автогамию за двое суток, культуру считали синхронной, и через каждые 5-10 делений из части клеток готовили препарат для ПЭФ. Для дополнительного контроля состояния стареющих культур из части клеток готовили постоянные препараты, окрашенные по Фёльгену.
Приготовление препаратов ДНК парамеций для ПЭФ. Для приготовления препаратов использовали 10-20 мл культур парамеций, число клеток в которых достигало 103- 104 на 1 мл. Мягким центрифугированием в течение 5 минут при 700 g клетки концентрировали в объеме 0.3 - 0.6 мл. Полученную суспензию клеток смешивали в соотношении 1:1 с нагретым до 56 °С 1.5 %-ным раствором агарозы (SeaKem FMC, США), приготовленным на 0.125 М ЭДТА, рН=9.5, пипетировали и заливали между донышками двух чашек Петри, фиксированных липкой лентой, получая агарозные блоки. Застывшие блоки помещали в буфер ESP (0.5 М ЭДТА, рН=9.5, 1 % лауроилсаркозин Na, 200 мкг/мл проназы Е) и инкубировали двое суток при температуре +37 °С. Далее блоки хранили в буфере ESP при температуре +4 °С.
В качестве размерного маркера для ПЭФ использовали хромосомы дрожжей Sac-charomyces cerevisiae штамма 15В-П4, размер которых был определен в нашей лаборатории ранее (Тимофеева, Раутиан, 1997). Приготовление препаратов ДНК дрожжей проводили по стандартной методике (Carle, Olson, 1985).
Проведение ПЭФ. Для проведения ПЭФ использовали прибор авторской конструкции, позволяющий создавать и чередовать два электрических поля с углом переориентации 120°. ПЭФ проводили в 1 %-ном агарозном геле (Sea Kern, FMC, США), приготовленном на 0.5х буфере TBE (45 мМ трис, 45 мМ борная кислота, 2 мМ ЭДТА, рН=8.0). Толщина геля составляла 4 мм. Электрофорез проводили в 0.5х буфере TBE при температуре +16 °С. Напряженность поля составляла 10 В/см. При этих условиях оптимального разделения ДНК МАК Р. aurelia удавалось добиться при следующем режиме ПЭФ: 30 с - 5 ч, 60 с - 7 ч, 90 с - 10 ч, 120 с - 13 ч, 150 с - 8 ч (в секундах - время действия каждого электрического поля, так называемое «время пульса»; в часах - продолжительность работы прибора при этом времени пульса). По окончании электрофореза гель выдерживали в растворе бромистого этидия и фотографировали в ультрафиолетовом свете на фотопленку "Микрат Изопан". Негативы сканировали для дальнейшего анализа изображений.
Перенос ДНК инфузорий из агарозных гелей на нейлоновые мембраны (Аш-ersham Pharmacia Biotech Nylone Membranes, Великобритания) осуществляли капиллярным способом по стандартной методике (Маниатис и др., 1984); ДНК иммобилизовали облучением ультрафиолетом. Гибридизацию по Саузерну проводили согласно протоколам производителя мембран. Зонды для гибридизации получали в полимеразной цепной реакции (ПЦР), добавляя в смесь для ПЦР дигоксигенин-11-dUTP (Roche Diagnostics, Mannheim, Германия). Выбор последовательностей для гибридизации осуществляли с использованием базы данных ParameciumDB (http://paramecium.cgm.cnrs-gif.fr/db/index). Для гибридизации использовали следующие зонды: 1) последовательность из макронуклеарного повтора PI26 (Forney, Rodkey, 1992); температура гибриди-
зации 61 °С; 2) 342-нуклеотидный фрагмент последовательности гена кальмодулина Р. tetraurelia (Genbank М34540); температура гибридизации 60 °С; 3) 850-нуклеотидный фрагмент последовательности гена Rab-GAP P. tetraurelia (Genbank CR548612); температура гибридизации 53 °С; 4) 280-нуклеотидный фрагмент последовательности гена малой ГТФ-азы rab С66 (gtp) P. tetraurelia (Genbank CR933380); температура гибридизации 54 °С; 5) 661-нуклеотидный фрагмент последовательности гена CYC2 Р. tetraurelia (Genbank CR548612); температура гибридизации 54 °С; 6) 613-нуклеотидный фрагмент последовательности безымянного гена {met) P. tetraurelia (Genbank ХМ_001438439); температура гибридизации 54 °С; 7) 356-нуклеотидный фрагмент последовательности безымянного гена {elt) Р. tetraurelia (Genbank ХМ_001438232); температура гибридизации 54 °С. Детекцию сигнала проводили, используя набор для коло-иметрического выявления дигоксигенина (Roche Diagnostics, Mannheim, Германия) и следуя рекомендациям производителя. Термические отмывки мембран после гибридизации проводили в 0.5х SSC при температуре на 1 °С выше температуры гибридизации.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Общая характеристика ПЭФ-профилей представителей P. aurelia. ПЭФ-препараты были приготовлены из интактных клеток инфузорий без предварительного выделения МАК. Однако согласно литературным данным (Райков, 1978), МИК P. aurelia содержит только 0.2 % общей клеточной ДНК. Таким образом, можно утверждать, что основную часть электрофоретического профиля образуют именно молекулы ДНК МАК.
Размер молекул ДНК МАК P. aurelia варьирует примерно от 75 т.п.н. до 1100 т.п.н. В целом, ПЭФ-профили проанализированных представителей P. aurelia достаточно похожи и всегда характеризуются специфической «блоковой» структурой,- то есть на фоне сплошного спектра молекул ДНК выделяются более или менее выраженные отдельные полосы и районы. Блоковая структура ПЭФ-профилей видов комплекса P. aurelia позволила разработать для них принцип иерархического описания (Rautian, Ро-tekhin, 2002), примененный нами для всех видов комплекса. Внутри наиболее ярко выраженных блоков (блоков первого порядка) исследуемого ПЭФ-профиля, четко выявляющихся при любых параметрах проведения эксперимента, выделяют блоки второго порядка. Они могут сливаться или, наоборот, разделяться при разных режимах проведения ПЭФ. Подобное «формализованное» описание ПЭФ-профилей облегчает сравнительный анализ и сопоставление получаемых данных. У большинства видов комплекса P. aurelia можно выявить 9 блоков первого порядка. Верхние три блока, как правило, не разделены на блоки второго порядка. Блоки 4-6 обычно включают в себя по 2-3 блока второго порядка каждый. В состав наиболее протяженного блока 7 входит наибольшее число типов молекул, поэтому выявление внутри него блоков второго порядка затруднено; тем не менее, у большинства видов удается достоверно детектировать 4-7 блоков второго порядка. Блоки 8 и 9 - одиночные низкомолекулярные полосы.
Влияние «старения» МАК на структуру ПЭФ-профилей. МАК Paramecium формируется заново при каждом половом процессе; у всех видов P. aurelia его наиболее обычным вариантом является автогамия - половой процесс, проходящий внутри одной клетки, в отсутствие партнера. В норме автогамия наступает приблизительно через каждые 25-30 вегетативных делений, при которых МАК делится неравномерно, и в дочерние клетки попадает разное количество ДНК (Berger, 1979). В результате этого мо-
жет происходить постепенное накопление изменений в организации его генома. Если культура не синхронизирована, в каждый момент времени все ее клетки различаются по числу делений, пройденных ими после последней автогамии. Соответственно, разные _ клетки клона различаются по «возрасту» своих МАК. То есть, каждый клон Р. аигеНа -клеточная линия, полученная из одной изолированной клетки - является клоном относительно генома МИК, но популяцией относительно генома МАК. Таким образом, нужно было проверить, различаются ли парамеции на разных этапах «старения» МАК по молекулярной композиции его генома.
Рис. 1. ПЭФ-профили синхронизированного клона Р. ргипаигеИа на разных этапах старения МАК (негатив). 1-15 делений после автогамии; 2-20 делений; 3-27 делений; 4 - 70 % клеток вступили в автогамию (в клетках несколько продуктов деления МИК); 5 - в ав-тогамонтах начинается формирование новых МАК; 6 - в поставтогамных клетках крупные зачатки новых МАК и мелкие фрагменты старых МАК; 7-10 делений после автогамии; Эс - хромосомы 5. сегеушае. Стрелкой показана высокомолекулярная ДНК в ПЭФ-профилях.
Мы синхронизировали клон Р. ргтаигеПа и сравнили ПЭФ-профили культур, состоящих из клеток с молодыми МАК (сразу после автогамии), зрелыми МАК (в середине жизненного цикла, 10-20 делений после автогамии), старыми МАК (27 делений, непосредственно перед автогамией) и собственно клеток, проходящих автогамию. Было показано, что ПЭФ-профили клеток, прошедших 10, 15, 20, 27 делений после автогамии, не отличаются (рис. 1). Единственное отличие заключалось в том, что в ПЭФ-профилях ранних поставтогамных клеток и клеток, прошедших не больше 15 делений после автогамии, обнаруживалась высокомолекулярная полоса (рис. 1), которая по мере прохождения клетками дальнейших делений становилась все менее выраженной. На некоторых препаратах несинхронизированных клонов, использованных нами, аналогичная полоса также была заметна. Вероятно, что автогамия даже в синхронизированной культуре растянута во времени, и высокомолекулярная полоса образуется за счет тех клеток, в которых именно в этот момент формируется новый МАК и происходит про-цессинг ДНК. Постепенно доля таких клеток в синхронизированной культуре уменьшается, и полоса становится все менее и менее выраженной. Возможно также, что процес-синг ДНК еще продолжается в клетках, которые после прохождения полового процесса уже перешли к вегетативным делениям. С каждым последующим делением количество недопроцессированных молекул в клетке будет уменьшаться и постепенно станет слишком незначительным, чтобы выявляться методом ПЭФ. Кроме того, данная полоса теоретически может содержать хромосомы МИК. Так или иначе, данную высокомолекулярную полосу нельзя рассматривать как постоянную характеристику электрофоре-тических кариотипов Р. аигеНа, поэтому мы не включаем ее в число блоков, выделяемых при иерархическом описании ПЭФ-профилей МАК.
1 г з 4 _»•*, ®о
Таким образом, рисунок полос ПЭФ-профиля воспроизводим и постоянен для ртона; сравнительный анализ организации генома МАК может быть выполнен на не-ринхронизированных культурах Р. аигеИа.
Причины появления полос в ПЭФ-профилях Р. аигеИа. Мы допускаем два возможных объяснения факта наличия полос в ПЭФ-профиле парамеций: 1) полосы образованы молекулами ДНК, амплифицированными в большей степени, чем остальные; £) полосы образованы несколькими молекулами ДНК, близкими по размеру. Геном ЛАК одного из представителей комплекса Р. аигеИа, Р. ¡е^аигеНа (клон с! 4-2), секве-дарован (Аигу й а1., 2006; http://paramecium.cgm.cnrs-gif.fr/db/index). Весь геном МАК рыл представлен как набор из нескольких сотен минихромосом, на обоих концах заканчивающихся теломерами. Каждая такая минихромосома соответствует отдельному фрагменту ДНК МАК. По данным секвенирования мы построили гистограмму, отражающую распределение этих минихромосом по размерам (рис. 2). Три сопоставлении полученной гистограммы и ПЭФ-профиля клона d 4-2 Р. 1е(гаигеИа мы бнаружили, что пики гистограммы в подавляющем большинстве случаев соответствуют
блокам ПЭФ-профиля. В двух случаях (минихромосомы размером 890 т.п.н. и 220 т.п.н.) на гистограмме присутствуют ярко выраженные пики, для которых мы не обнаружили соответствующих полос ПЭФ-профиля. Возможно, в этих случаях молекулы ДНК амплифицированы в меньшей степени, чем остальные, что затрудняет их выявление методом ПЭФ.
Таким образом, в результате проведенного сопоставления наших данных и результатов секвенирования ге-
I л и/а шгп 11 и ,юма мак 77 шмиге1ш
т-'К- - 1, т | можно заключить, что все на-
И- .'.-у. г"; тивные молекулы ДНК МАК
.■5',. представлены в ядре близким
| Г * "* I числом копий, а рисунок
ПЭФ-профиля реально отражает их распределение по Рис. 2. Сопоставление результатов секвенирования ге- размерам.
нома МАК клона d 4-2 Р. ге^аигеИа и блоковой структу- Полиморфизм элек-
ры электрофоретического кариотипа этого вида. По го- Тр0форетических кариоти-ризонтальной оси гистограммы отложены размеры ми- пов представителей ком-
[ нихромосом (с точностью до 10 т.п.н., по убыванию); по Плекса Р. аигеИа. В резуль-
■ вертикальной - количество минихромосом. Внизу при- тате сравнительного анализа
веден ПЭФ-профиль клона с1 4-2 Р. ¡еЬ-аигеНа (негатив). §7 кжшов всех 15 видов-
двойников, составляющих комплекс Р. аигеПа, мы выявили 12 «типов» ПЭФ-профилей (рис. 3).
Рис. 3. Электрофоретические кариотипы представителей комплекса Р. аигеПа (негатив). 1 - Р. ргтаигеНа, 2-Р. ЫаигеНа, 3 - Р. /паигеПа, 4 - Р. ¡е^аигеНа, 5 -Р. реп-IаигеПа, 6-Р. ¡ехаигеНа, 7 -Р. $ер1аигеНа, 8 - Р. оЫаигеНа, 9 - Р. поуаигеНа, 10 - Р. йесаигеНа, 11 - Р. ип(1есаигеНа, 12-Р. с1ос1есаигеНа, 13 - Р. &ес1есаигеНа, 14-Р. циас1есаигеНа, 15 - Р. зоппеЪогт. вС- размерный маркер, & еегеушае. Красным цветом обозначены варианты ПЭФ-профилей «ПЭФ-профиль Р. ргтаигеНа», синим - «ПЭФ-профиль Р. зер1аигеПа>'>, зеленым - «ПЭФ-профиль Р. поуаигеПа».
Оказалось, что 8 из них являются видоспецифичными, то есть характерны для всех представителей только одного определенного вида. К числу видов, имеющих такой «маркерный» вариант электрофоретического кариотипа, относятся: Р. й-шигеИа, Р. (еП'аигеПа, Р. яехаигеНа, Р. ос1аигеНа, Р. ипЛесаигеНа, Р. (гес1есаигеИа, Р. диас1есаигеНа, Р. эоппеЬогт. При этом электрофоретические кариотипы Р. ге^аигеНа и Р. оМаигеНа очень похожи на первый взгляд, и отличия могут быть выявлены только при детальном сравнении (рис. 3). Для двух из этих восьми видов (Р. ¡е^аигеПа и Р. циас1есаигеНа) был показан внутривидовой полиморфизм по исследуемому признаку, но внутривидовые отличия всегда менее выражены, чем межвидовые.
Еще один вариант электрофоретического кариотипа характерен только для Р. Ы-аигеИа, причем не для всех представителей данного вида, а только для части клонов.
Остальные 3 варианта электрофоретических кариотипов «разбросаны» по клонам семи видов комплекса Р. аигеПа. Так, вариант электрофоретического кариотипа, условно названный «ПЭФ-профиль Р. ргтаигеНа» был обнаружен у всех клонов Р. рп-таигеНа и Р. реШаигеНа, некоторых клонов Р. ЫаигеНа, Р. вергаигеПа и Р. с!есаигеНа, а также у единственного американского клона Р. по\аигеПа (рис. 3).
Вариант электрофоретического кариотипа, условно названный «ПЭФ-профиль Р. ьергаигеНа», был обнаружен у некоторых клонов Р. зергаигеНа и некоторых клонов Р. с1ос1есаигеНа (рис. 3).
Вариант электрофоретического кариотипа «ПЭФ-профиль Р. поуаигеНа» был обнаружен у большинства клонов Р. по\аигеНа, некоторых клонов Р. с1есаигеНа и некоторых клонов Р. с1ос1есаигеНа. Интересно, что все эти клоны были изолированы в мате-
риковой части Евразии, в то время как клоны, изолированные из природных популяций Америки и Японии, имели другие электрофоретические кариотипы.
Среди видов комплекса Р. aurelia можно выделить виды, где внутривидовой полиморфизм не выявлен или выражен незначительно, и виды, внутри которых ПЭФ-лрофили разных клонов отличаются очень ярко. К числу последних в первую очередь следует отнести виды Р. biaurelia, Р. septaurelia, Р. novaurelia, Р. decaurelia, Р. dode-caurelia. Для двух из них был исследован внутривидовой полиморфизм по некоторым молекулярным признакам (Przybos et al, 2007; Przybos et al., 2008).
Для вида Р. decaurelia выявлено два варианта ПЭФ-профилей, каждый из которых приурочен к определенной географической территории. Так, одинаковые электрофоретические кариотипы, относящиеся к типу «ПЭФ-профиль Р. novaurelia», были обнаружены у трех российских клонов Р. decaurelia, а ПЭФ-профиль клона из Японии относился к типу «ПЭФ-профиль Р. primaurelia». Полученные данные хорошо совпадают с результатами сравнительного исследования клонов Р. decaurelia методом RAPD (Przybos et al., 2007), согласно которым два из трех исследованных нами европейских клонов образуют единый кластер внутри вида, а клон JN из Японии формирует вместе с клоном из США отдельную группу.
Распределение вариантов ПЭФ-профилей внутри Р. dodecaurelia также коррелирует с географическим происхождением исследованных клонов, i li t
вс_с у та ш
— —
ЗС«- ию&м:íumM
* Г-■»* — ^^
| tft, PafZHswGivm itíb&c-nvtav,г IJ
_f— í> ЛвяямМЕйш <3й>аеелштей« I
ít. Рагапкí*Liíf| I Í^JÍJí.-JfliV^ III
1--fíj. ('хй'юх+ат (кхЛюх Ít^ít.* III
- H«S, PAniñHKáim О&Яесаи/шИл I il
Рис. 4а. Два типа ПЭФ-профилей (I и II) у четырех европейских клонов Р. dodecaurelia (негатив). 8С - хромосомы Я. сеге\'к1ас. Тип III, характерный для клонов, выделенных в тихоокеанско-американском регионе, не представлен на фотографии.
Рис. 46. Филогенетическая схема вида P. dodecaurelia, построенная по результатам сравнительного анализа нуклеотидной последовательности 28S рДНК (из Tarez et al., 2006). Цифрами I, II и III обозначены исследованные нами клоны, имеющие соответствующие варианты ПЭФ-профилей.
Так, четыре клона, имеющие «ПЭФ-профиль Р. .а'р/аигеПа» (рис. 3), были изолированы в Японии, США, на Гавайских островах, а клоны, имеющие «ПЭФ-профиль Р. по-уаигеИа» (рис. 3), были изолированы в материковой части Евразии. Кроме того, ПЭФ-
профиль клона TR (Италия) отличался от ПЭФ-профилей всех остальных клонов (рис. 4а). Эти данные хорошо соответствуют молекулярно-филогенетическим построениям. Так, по результатам секвенирования фрагмента гена 28S рРНК (Tarez et al., 2006) и фрагмента гена митохондриальной цитохром-оксидазы (COI) (Przybos et al., 2008) клоны P. dodecaurelia разделились на две ветви, одна из которых содержит клоны из Японии, США и с Гавайских островов, а вторая - «евразийские» клоны (рис. 46). Особенно интересно, что клон TR, имеющий отличающийся от остальных «евразийских» клонов вари- [ ант ПЭФ-профиля, по данным филогении также стоит особняком по отношению ко всем остальным клонам из Евразии (Tarez et al., 2006) (рис. 46).
Локализация генов в электрофоретических кариотипах видов комплекса Р. aurelia. Проводя сравнительный анализ ПЭФ-профилей, мы в первую очередь сравниваем размерные характеристики молекул ДНК, их формирующих. Но для того, чтобы такое сравнение было адекватным, важно понимать, действительно ли полосы в одной размерной области ПЭФ-профилей разных видов P. aurelia образованы гомологичными фрагментами ДНК МАК. Для этого нужно выяснить, где в разных ПЭФ-профилях находятся гомологичные молекулы ДНК.
Различия в расположении верхних, высокомолекулярных, блоков в ПЭФ-профилях разных видов являются наиболее характерными (рис. 3). Мы попытались идентифицировать молекулы ДНК, образующие два верхних, наиболее хорошо обособ- 1 ленных блока электрофоретического кариотипа P. tetraurelia, в электрофоретических кариотипах остальных видов комплекса. Верхний блок у P. tetraurelia образован от- ! дельной молекулой ДНК (Zagulsky et al., 2004), в состав второго входят одна или две молекулы (рис. 2). Используя базу данных ParameciumDB, мы выбрали по два-три не имеющих паралогов гена с двух самых длинных минихромосом P. tetraurelia и провели гибридизацию по Саузерну последовательностей этих генов с разделенной в ПЭФ ДНК МАК разных представителей комплекса P. aurelia.
Оказалось, что все три проанализированных гена минихромосомы 1 P. tetraurelia у большинства исследованных видов комплекса P. aurelia локализуются в одном блоке ПЭФ-профиля (рис. 5).
Рис. 5. Результаты ПЭФ (А) и гибридизации по Саузерну (Б) ДНК шести видов комплекса Р. аигеИа с фрагментом генаЯаЪ-САР. 6 -Р. зехаигеПа, 14 -Р. quadecaurelia, 1
- Р. ргипаигеНа, 4 - Р. ¡е^аигеНа, 2
- Р. ЫаигеИа, 9 - Р. помаигеИа, БС
- хромосомы сеге\ч.ч1ае. Стрелками обозначены блоки, которым соответствуют сигналы, получаемые при гибридизации.
Единственным исключением оказался вид Р. яехаигеИа, у которого гены ЯаЬ-СЛР > и СУС2 располагались в одном и том же блоке ПЭФ-профиля, а ген gíp давал сигналы гибридизации на двух других блоках (данные не приведены).
Результаты, полученные при локализации генов минихромосомы 2 Р. ¡е^аигеИа в электрофоретических кариотипах других видов, оказались менее однозначными (рис. 6).
fc !3 М 1 * 2 9 ас * t3 U | i 1 9
Рис. 6. Результаты ПЭФ (А) и гибридизации по Саузерну (Б) ДНК семи видов комплекса P. aurelia с фрагментом гена elt. 6 - P. sexaurelia, 13 - P. tredecaurelia, 14 - P. quade-caurelia, 1 - P. primaureUa, 4 - P. tetraurelia, 2- P. biaurelia, 9 - P. novaurelia, SC - хромосомы S. cerevisiae. Стрелками обозначены блоки, которым соответствуют сигналы, получаемые при гибридизации. Аналогичные результаты получены при гибридизации со вторым геном минихромосомы 2, геном met (данные не приведены).
Несмотря на данные, свидетельствующие об отсутствии в геноме P. tetraurelia гомологичных последовательностей для двух выбранных нами генов (ParameciumDB), нами было получено по несколько сигналов гибридизации для каждого из них.
Для каждого из двух генов верхний из сигналов гибридизации выявлялся на блоке 2 электрофоретического кариотипа P. tetraurelia, как и следовало ожидать по результатам сопоставления размерных характеристик минихромосом и блоков ПЭФ-профилей. Однако при анализе других видов комплекса только у нескольких из них оба гена также локализовались на блоке 2 ПЭФ-профиля, у некоторых же видов оба гена были обнаружены на блоке 1. У этих же видов на блоке 1 ПЭФ-профилей были локализованы и маркерные гены блока 1 ПЭФ-профиля P. tetraurelia. По-видимому, верхний блок ПЭФ-профилей у этих видов образован двумя разными типами молекул ДНК. В случае Р. sexaurelia на блоке 3 ПЭФ-профиля был локализован как один из генов минихромосомы 1, так и оба гена минихромосомы 2.
Наиболее вероятным объяснением получения нескольких сигналов при гибридизации ДНК МАК некоторых видов комплекса с геном gtp и генами минихромосомы 2 Р. tetraurelia является наличие альтернативных сайтов фрагментации на хромосомах МИК, использующихся при формировании генома МАК. Этот феномен известен для P. aurelia (Carón, 1992). У Р. sexaurelia происходит не только изменение размеров молекул ДНК, формирующих верхние блоки ПЭФ-профилей, но и перераспределение генов на этих молекулах: гены минихромосомы 2 локализуются вместе, на одном фрагменте ДНК, а гены минихромосомы 1, сцепленные у Р. tetraurelia, разбиваются. Обнаруженные перестройки не могут быть сведены к появлению нового сайта фрагментации, так как длины минихромосомы 1 Р. tetraurelia и каждого из двух фрагментов ДНК Р. sexaurelia, на которых обнаруживаются «гены минихромосомы 1», сопоставимы. У двух видов - P. bi-
сшгеИа («уникальный» вариант ПЭФ-профиля) и Р. ипс^есаигеНа, наоборот, разбивается группа сцепления минихромосомы 2 Р. ¡еГгаигеНа.
Таким образом, при сравнении электрофоретических кариотипов разных видов следует учитывать, что близкие по размеру блоки не обязательно сформированы гомологичными фрагментами ДНК. '
Кроме того, важно отметить, что для большинства видов комплекса Р. аигеИа даже при наблюдаемом изменении размеров гомологичных молекул ДНК МАК, форми- ( рующих верхние блоки ПЭФ-профилей, сцепление исследованных генов не нарушалось.
Результаты гибридизации с генами минихромосомы 2 стали дополнительным контролем того, что внешнее сходство ПЭФ-профилей действительно отражает единый вариант молекулярной организации генома МАК (рис. 7). Оказалось, что паттерн гибридизации у представителей разных видов и клонов одного вида, имеющих одинаковые ПЭФ-профили, одинаков. Паттерн гибридизации у клонов одного вида, имеющих разные варианты ПЭФ-профилей, отличается. То есть, паттерн гибридизации оказывается специфичным именно для типа ПЭФ-профиля (рис. 7).
г г ? »(} 1© \г (з 1 ."«с г з ■? № 13 и 1
Рис. 7. Результаты ПЭФ (А) и блот-гибридизации (Б) с фрагментом гена ек. 2 -Р. Ы-аигеНа, 1 -Р. зергсшгеНа, 10 -Р. с1есаигеИа, 12 - Р. (1сн1ессшгеИа, 8 С - хромосомы 5. сегептаде. Стрелками обозначены блоки, которым соответствуют сигналы, получаемые при гибридизации.
Сопоставление полученных результатов, молекулярно-филогенетических построений и данных о возможности межвидовых скрещиваний. Полученные нами результаты в целом хорошо совпадают с наиболее полным молекулярно-филогенетическим древом комплекса Р. аигеИа (Ног! й а1., 2006) (рис. 8) и данными о возможности межвидовых скрещиваний (\Vichtennann, 1986). Так, две пары видов (Р. рптаигеИа и Р. реЫаигеНа; Р. 1е(гаигеИа и Р. оМаигеНа) могут достаточно часто образовывать конъюгирующие пары, хотя жизнеспособного потомства в результате таких скрещиваний не образуется. Эти виды оказываются попарно близки и по нашим данным, и по данным секвенирования гена кчр70 (Ноп Л а1., 2006). В одном кластере по результатам секвенирования оказываются виды Р. зер1аигеИа и Р. с1ос1есаигеиа. Эти виды близки и по нашим данным, поскольку для некоторых представителей лишь этих видов характерен «ПЭФ-профиль Р. зер1аигеИа». Все виды, у которых встречается вариант «ПЭФ-профиль Р. ргтгаигеНа», попадают в единый куст в базальной части древа. Семь
идов комплекса (Р. ЫаигеНа, Р. ¡ехаигеНа, Р. потигеНа, Р. иМесаигеНа, Р. ¡гсЛе-аигеНа, Р. диас]есаигеИа, Р. яоппеЬогп(') не способны вступать в конъюгацию с представителями других видов. Все эти виды, за исключением Р. ЫаигеНа, дивергировали от остальных по данным секвенирования Ь$р70. Эти же виды, (за исключением Р. по-уаигеНа и части клонов Р. ЫаигеНа), имеют заметно отличающиеся от остальных видов комплекса ПЭФ-профили.
t ? иЫакглта»¿we* ¿¿В
Р «îïtiWw мжк lit
Р cilaurztia дехЬ 11?
У îpittll» '
f (•marr&i Êp-Mcti )
P JoMbHvk» ttoet ÎH
P ¿odarewtia Е^йгив 2 * P герииЫа tfati 215 P ntf>imtt(ia £ji.-)fcBti 1 ) P frwwti» ïjhfwei 5 tmurtia Ep-tfcîCl $
F ptimertfut EjManrai 9 P HV tî-l
P R«r*aur*fts «ftdr irO SM
' t -dec&trtk* Vf P tfte-juivita ttxi ¿2}
P itiaurtha lî
P «Meneia stock 159 ^ ,vr,im'*i3 Fjf-tîûik It
j» vrcc ami
./»«.«wiwmi-j
P. ь&чтыз tp Й0ti 17
- 91 ttib&a&MLvMS«
P. n&kvawtb* Hixi il I ^ P щшкк&чЬа AN Ы iw>- p fjaaà&f&rib^ «Jack КЪ
Рис. 8. Филогенетическая схема комплекса видов-двойников Р. аигеНа, построенная по результатам сравнительного анализа нуклеотидной последовательности гена шаперона Нвр 70 (из Ноп е1 а1., 2006). В соответствии с полученными нами данными на дендрограмме стрелками показаны возможные точки возникновения определенного варианта электрофоретиче-ского кариотипа. 1 - «ПЭФ- профиль Р. рптаигеНа», 2 - «Р. ЫаигеНа», 3 - «Р. аигеНа», 4 - «Р. ШгаигеНа», 6 - «Р. яехаигеНа», 7 - «Р. $ер1аигеИа», 8 - «Р. ос-/аигеНа», 11 - «Р. иМесаигеНа», 13 - «Р. &ес1есаигеНа», 14-«Р. циайесаигеНа», 15 - «Р. зоппеЪогт».
Основываясь на наиболее полной молекулярной филогении комплекса P. aurelia, включающей все 15 видов-двойников (Hori et al., 2006), можно заключить, что изменение молекулярной организации генома МАК, как правило, сопровождало обособление того или иного вида или группы видов. Так, у видов базальной группы (P. tetraurelia и P. octaurelia) электрофоретические кариотипы очень сходны. Затем появляется другой тип организации генома МАК - «ПЭФ-профиль P. primaurelia», который мы обнаруживаем в нескольких ветвях дендрограммы. Обособление ветви, включающей виды P. do-decaurelia и P. septaurelia, сопровождалось возникновением третьего варианта электро-форетического кариотипа - «ПЭФ-профиля P. septaurelia». Что касается остальных видов комплекса, то обособление практически каждого из них сопровождалось появлением уникального для этого вида электрофоретического кариотипа.
Единственным исключением оказывается «ПЭФ-профиль P. novaurelia» - такой тип молекулярной организации генома МАК встречается у трех филогенетически удаленных видов комплекса. Однако при построении молекулярной филогении по hsp70 не были использованы те клоны P. decaurelia и P. dodecaurelia, которые имеют этот вариант ПЭФ-профиля; отметим, что они отличаются от остальных клонов этих видов и по другим молекулярным данным (Tarez et al., 2006; Przybos et al., 2007). Возможно,
дополнительное секвенирование последовательности гена hsp70 этих клонов P. de-caurelia и P. dodecaurelia изменило бы расположение ветвей в дендрограмме.
Таким образом, полученные данные показывают, что изменения в организации генома МАК, выявляемые с помощью ПЭФ, тесно связаны с эволюцией комплекса видов-двойников P. aurelia.
Итак, впервые проведено детальное сравнение геномов МАК всех видов-двойников комплекса P. aurelia методом ПЭФ. Исследован внутривидовой и межвидовой полиморфизм электрофоретических кариотипов, влияние «старения» МАК на молекулярную организацию генома этого ядра, проанализированы связи географической и репродуктивной изоляции с возникновением изменений в молекулярной организации генома МАК. Полученные результаты позволили сделать следующие ВЫВОДЫ:
1. ПЭФ-профиль отражает распределение молекул ДНК в макронуклеусе по размеру, является стабильной воспроизводимой характеристикой клона и может быть использован для сравнительного анализа разных клонов P. aurelia. «Старение» макронуклеуса не приводит к изменению электрофоретического кариотипа клона.
2. Большинство молекул ДНК в макронуклеусе P. tetraurelia амплифицированы примерно в равной степени. Блоки ПЭФ-профиля могут быть как мономолекулярными, так и сформированными разными молекулами ДНК, близкими по размеру.
3. Размер высокомолекулярных фрагментов ДНК макронуклеуса у разных видов комплекса P. aurelia может несколько различаться; при этом группы сцепления, как правило, сохраняются.
4. В комплексе видов P. aurelia выявлено 12 вариантов электрофоретических кариотипов: девять являются видоспецифичными, три встречаются у представителей нескольких видов. Существует приуроченность определенных вариантов к географическим территориям.
5. Степень сходства электрофоретических кариотипов разных клонов P. aurelia хорошо согласуется с наиболее полным молекулярно-филогенетическим древом комплекса P. aurelia (Hori et al., 2006) и данными о возможности межвидовых скрещиваний (Wichtermann, 1986).
6. Дивергенция видов комплекса P. aurelia сопровождается возникновением различий в организации генома макронуклеуса.
Список работ, опубликованных по теме диссертации.
1. A. Potekhin, I. Nekrasova, М. Rautian. Electrokaryotype of the macronucleus as a basis for macronuclear genome mapping in Paramecium II Abstr. of International Conference on the Molecular Biology and Biotechnology of Ciliates and Anaerobic Protozoa, Nijmegen, the Netherlands, March 4-6,2003. P. 23.
2.1. Nekrasova, A. Potekhin, E. Przybos, M. Rautian. Comparative study of macronuclear genomes of the Paramecium aurelia species complex by PFGE // Abstr. of 4th European Congress of Protistology and 10th European Conference of Ciliate Biology, San Benedetto del Tronto, Italy, August 31 - September 5,2003. P. 131.
3. Некрасова И.В., Потехин А. А., Пржибош Е., Раутиан М.С. Виды-двойники комплекса Paramecium aurelia (Ciliophora, Protozoa): электрокариотип макронуклеуса как индиви-1уальная характеристика вида // Вестник Томского гос. Университета. 2004. Т. 3. № 10. Прил. С. 64-68.
4. Некрасова И.В., Потехин А.А., Пржибош Е., Раутиан М.С. Сравнительный анализ геномов макронуклеуса видов-двойников комплекса Paramecium aurelia (Ciliophora, Protozoa) методом пульс-электрофореза // Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития (материалы III съезда ВОГиС), Москва, 6-12 июня, 2004. Т. II. С. 264.
5. Потехин А.А., Некрасова И.В., Раутиан М.С. Эволюция генома макронуклеуса в ходе эволюции рода Paramecium (Ciliophora, Protozoa) // Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития (материалы III съезда ВОГиС), Москва, 6-12 июня, 2004. Т. II. С. 188.
6. Potekhin A., Nekrasova I., Przybos Е., Rautian М. Molecular organization of macronuclear genomes in sibling species of Paramecium aurelia complex // XII International Congress of Protozoology, Guangzhou, China, 2005. P. 74.
7. Potekhin A., Rautian M., Nekrasova I., Przybos E. Occurrence of Paramecium species in Western Siberia, Russia//Folia Biologica(Krakow). 2006. V. 54. № 1-2. P. 127-131.
8. Potekhin A., Nekrasova I., Przybos E., Rautian M. Divergence of macronuclear-genome organization in Paramecium aurelia species complex // Paramecium Genomics Meeting, Dour-dan, France, May 3-4,2006. P. 17.
9. Nekrasova I.V., Potekhin A.A., Przybos E., Rautian M.S. Macronuclear genome organization changes at the initial stages of speciation: Paramecium aurelia complex as a model // Protistology. 2007. V. 5. № 1. P. 58.
10. Potekhin A., Nekrasova I., Skoblo I., Berendonk Т., Rautian M. Sibling species concept in ciliates Paramecium revisited: zoogeographic and genomic aspects of syngen biology // Protistology. 2007. V. 5. № 1. P. 64.
11. Некрасова И.В., Потехин А.А., Пржибош E., Раутиан М.С. Сравнительное описание электрофоретических кариотипов макронуклеуса видов-двойников Paramecium pri-maurelia и Paramecium novaurelia // Цитология. 2008. Т. 50. № 10. С. 913-922.
Подписано к печати 30.10.08. Формат 60x84 'Лб. Бумага офсетная. Гарнитура Тайме. Печать цифровая. Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 4315
Отпечатано в Отделе оперативной полиграфии химического факультета СПбГУ 198504, Санкт-Петербург, Старый Петергоф, Университетский пр., 26 Тел.: (812) 428-40-43,428-69-19
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Некрасова, Ирина Владимировна
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
Виды-двойники у инфузорий и методы их исследования.
Наиболее известные виды-двойники у инфузорий
Euplotes (Hypotrichia).
Diophrys (Hypotrichia).
Uronychia spp. (Hypotrichia).
Stylonychia (Stichotrichia).
Tetrahymena (Hymenostomatia).
Paramecium (Peniculia).
Географическое распределение видов-двойников.
Методы, используемые для сравнительного изучения видов-двойников.
Изоферментный анализ.
RAPD.
ARDRA.
Гибридизация in situ.
Филогенетический анализ и секвенирование нуклеотидных последовательностей.
Гетероморфный ядерный аппарат инфузорий как критерий для сравнения и возможная причина возникновения видовдвойников.
Организация ядерного аппарата инфузорий
Два типа ядер.
Организация генома МАК.
Электрофоретический анализ генома МАК как метод сравнительного исследования видов-двойников у инфузорий.
Электрофорез.
Пульс-электрофорез.
ДЕЛИ И ЗАДАЧИ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
I. Материалы
Использованные культуры.
П. Методы
1) Методы лабораторной работы с инфузориями
Культивирование.
Синхронизация.
2) Окраска препаратов по Фёльгену.
3) Пульс-электрофорез
Приготовление препаратов для ПЭФ.
Проведение ПЭФ.
4). Гибридизация по Саузерну.
Полимеразная цепная реакция.
Гибридизация по Саузерну.
Детекция сигнала.
РЕЗУЛЬТАТЫ.
Сравнительное исследование геномов макронуклеусов представителей комплекса P. aurelia методом ПЭФ.
Влияние старения МАК на ПЭФ-профили.
ПЭФ-профили МАК представителей комплекса P. aurelia
P. primaurelia.
P. biaurelia.
P. triaurelia.
P. tetraurelia.
P. pentaurelia.
P. sexaurelia.
P. septaurelia.;.
P. octaurelia.
P. novaurelia.
P. decaurelia.
P. undecaurelia.
P. dodecaurelia.
P. tredecaurelia.
P. quadecaurelia.
P. sonneborni.
Гибридизация по Саузерну.
Ген кальмодулина.
Повтор PI26.
Гены минихромосомы 1 P. tetraurelia.
CYC2. Ill
Rab-GAP.
Гены минихромосомы 2 Р. tetraurelia.
ОБСУЖДЕНИЕ.
ПЭФ-профиль является постоянной характеристикой каяедого клона и отражает реальное распределение молекул ДНК в МАК
Получаемые электрофоретические кариотипы являются электрофоретическими кариотипами МАК.
Природа полос в ПЭФ-профилях P. aurelia.
Результаты гибридизации по Саузерну.
Влияние старения МАК на ПЭФ-профили.
Электрофоретические кариотипы МАК видов-двойников комплекса P. aurelia
Внутривидовой полиморфизм ПЭФ-профилей.
Межвидовой полиморфизм ПЭФ-профилей.
Сопоставление полученных данных с данными о других видах-двойниках у инфузорий.
Причины возникновения изменений в ПЭФ-профилях
Две возможные причины возникновения изменении в структуре ПЭФ-профилей.
Гибридизация по Саузерну.
Электрофоретический кариотип МАК как филогенетический маркер.
ВЫВОДЫ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Полиморфизм электрофоретических кариотипов макронуклеуса у видов-двойников комплекса Paramecium aurelia (ciliata)"
Несмотря на постепенный переход науки на изучение все более мелких объектов - от организмов к органам и тканям, от тканей к клеткам, от клеток на молекулярный уровень — изучение биоразнообразия, эволюционные и филогенетические исследования по-прежнему не теряют актуальности. Наоборот, по мере накопления различных молекулярных данных всевозможные филогенетические построения постоянно пересматриваются, дополняются и изменяются. И по-прежнему не теряет актуальности спор о том, что собственно можно считать «видом» - ключевым понятием в любых эволюционных и филогенетических работах, систематической основой биоразнообразия. Часто остается непонятным, являются ли две географически изолированные отличающиеся популяции двумя разными видами или разновидностями одного вида.
В середине XX века Эрнст Майр предложил свою концепцию вида, ключевым моментом которой являлось понятие репродуктивной изоляции - возможность получения плодовитого потомства у особей, обладающих общим пулом генов, и изолированность этого пула генов от других (Майр, 1974). Однако эта концепция имеет свои слабые места — применение критерия репродуктивной изоляции затруднено в случае организмов, не имеющих полового процесса или способных к самооплодотворению. Согласно концепции Майра в ее исконном варианте получалось, что среди беспозвоночных, растений и, особенно, протистов есть группы организмов, для которых невозможно выделить виды, или, наоборот, каждую особь следует считать отдельным видом. Трэйси Соннеборн, работавший на представителях комплекса Paramecium aurelia, не отвергая концепцию Майра, предложил ее модифицировать. Он предложил считать видом «группу, минимально эволюционно дивергировавшую», то есть вид возникает, когда «возникают минимальные необратимые эволюционные отличия» (Sonneborn, 1957). Соннеборн утверждал, что для выявления таких отличий у организмов, не имеющих полового процесса, необходим детальный сравнительный анализ жизненных циклов, морфологического строения, строения клетки, физиологических и экологических особенностей. Соннеборн не отвергал концепцию Майра, предложенная им формулировка некоторым образом включает в себя понятие репродуктивной изоляции — если представители двух отличающихся популяций дают при скрещивании плодовитое потомство, то в результате подобных скрещиваний отличия будут нивелироваться, то есть они не являются необратимыми, а, следовательно, популяции не могут считаться видами. То есть для видов с «нормальным» половым процессом изменение формулировки не меняет принципа выделения видов. В случае же организмов, имеющих сложные половые процессы или не имеющих их вовсе, только такая формулировка позволяет вообще выделять виды.
В настоящее время при описании видов используются как традиционные морфологические и морфометричесьсие данные, так и всевозможные молекулярные методы (изоферментный анализ, ПЦР со случайными прай-мерами, сравнение секвенированных последовательностей ДНК).
Дополнительные трудности возникают в случае так называемых видов-двойников, то есть видов, не отличимых по морфологическим характеристикам, но репродуктивно изолированных и имеющих ряд биохимических и молекулярных отличий. Широко известны примеры видов-двойников среди животных — Drosophila, Rhagoletis, Anopheles, различные Lepidoptera, Rana, Microtus (Майр, 1974); очень распространены виды-двойники среди протистов (Schlegel, Meisterfeld, 2003).
Так, в случае инфузорий понятие вида является дискуссионным. Многие виды морфологически очень похожи, что вызывает множество трудностей с определением видовой принадлежности тех или иных представителей рода. Филогенетические взаимоотношения между различными видами зачастую неясны, и само по себе существование некоторых видов вызывает вопросы. Наряду с морфологическими видами во многих группах инфузорий по признаку возможности/невозможности вступления в перекрестный половой процесс выделяют сингены (английский термин "syn-gen" — "generating together", предложен Т. Соннеборном (Sonneborn, 1957)). Сингенам иногда придают статус видов-двойников — границы между син-генами могут быть более или менее ярко выраженными в разных группах инфузорий. Например, род Stylonychia включает в себя, в том числе, два вида-двойника S. lemnae и S. mytilus (Ammermann, Schlegel, 1983), комплекс видов Tetrahymena pyriformis подразделяется более чем на двадцать таких видов (Nanney, McCoy, 1976), Paramecium aurelia подразделяется на пятнадцать генетических видов (Sonneborn, 1975). В других случаях, например, в случае морфологического вида Paramecium caudatum, различия между сингенами слабо выражены, и несмотря на их существование вид считается единым (Stoeck et al., 2000b).
Таким образом, реконструкция филогенетических взаимоотношений и идентификация видов остаются двумя из важнейших задач современной биологии инфузорий. Существующие сложности в определении видовой принадлежности различных инфузорий, противоречия в филогенетических построениях внутри различных групп инфузорий, связанные с использованием разных характеристик при их разработке,, а также собственно не теряющий актуальности вопрос о концепции вида заставляют исследователей вновь и вновь анализировать возможность применения различных методов при сравнительном изучении тех или иных групп инфузорий.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Проблема вида и видообразования тесным образом сопряжена с исследованием биоразнообразия. Тщательное и разностороннее исследование разнообразия и географического распределения различных представителей рода необходимо для получения ответа на вопрос, является ли определенная популяция самостоятельным видом или разновидностью. При этом морфологический критерий, играя существенную роль, все же не может быть основным критерием вида. Зачастую внутри определенного вида существуют морфологически различающиеся формы, в то время как представители разных видов могут быть морфологически очень похожи (виды-двойники). Примеры видов-двойников встречаются в самых разных группах организмов; наиболее известны комплексы видов-двойников у насекомых из отрядов Diptera (Drosophila, Anopheles) и Lepidoptera, и у протестов (Майр, 1974).
Репродуктивный критерий также не универсален, поскольку не может быть применен к организмам, не имеющим полового процесса или способным к самооплодотворению. При этом в последние годы в результате сравнительного анализа геномов разных эукариот выяснилось, что практически все считающиеся бесполыми протисты сохранили в своих геномах большую часть генов, контролирующих мейоз; накапливаются и другие данные, позволяющие предполагать, что у этих организмов существует половой процесс (Ramesh et al., 2005; Schurko, Logsdon, 2008). Отметим -также, что тщательное сравнительное изучение не имеющих полового процесса свободноживущих и паразитических протистов говорит о том, что видовая форма жизни характерна и для этих групп организмов (Полянский, 1976), Основная же идея репродуктивного критерия, применимая ко всем организмам, заключается в том, что любой самостоятельный вид должен представлять собой «замкнутую» генетическую систему — обмен генетической информацией происходит только внутри вида.
В то же время и такую трактовку проблемы вида нельзя считать универсальной. Так, у птиц в некоторых случаях встречаются межвидовые гибриды: хотя в природе это явление считается довольно редким, гибриды встречаются примерно между 850 видами (10% всех видов мировой фауны птиц) (Паевский, 2004). Примерами могут служить гибриды между серо-крылой и западной чайками, бурым и южным поморниками, белым гусем и гусем Росса. Обычно гибриды возникают между близкородственными видами в зонах перекрывания их ареалов. Для большинства таких гибридов характерна пониженная устойчивость и выживаемость, но в некоторых случаях плодовитость в гибридной зоне при наложении ареалов двух видов практически не отличается от плодовитости в исходных ареалах родительских видов (Паевский, 2004). Случаи образования межвидовых гибридов известны и в других группах животных. Так, неоднократно отмечалась гибридизация зеленой {Bufo viridis) и камышевой (Bufo calamita) европейских жаб; изучение канадских видов жаб также показало отсутствие репродуктивных барьеров и наличие зоны гибридизации между представителями Bufo americanus americanus и В. americanus hemiophrys (Писанец, 2002). Таким образом, если наличие репродуктивного барьера свидетельствует о принадлежности популяций к разным видам, то его отсутствие не всегда является показателем того, что изучаемые популяции относятся к одному виду.
Кроме того, следует помнить о том, что процесс дивергенции новых видов растянут во времени, и наряду с четко изолированными видами могут существовать и промежуточные формы, отражающие различные этапы видообразования. К таким промежуточным вариантам в том числе можно отнести и сингены — репродуктивно изолированные группы внутри «классических» морфологических видов инфузорий. Среди млекопитающих примером такого промежуточного положения могут служить две пары популяций землероек Sunciis murinus: непальские и шриланкийские землеройки и японские и бангладешские землеройки. В каждом случае для двух разновидностей одного вида показана частичная репродуктивная изоляция (Бородин, Рогаче ва, 2003). При этом если в случае инфузорий возникновение репродуктивного барьера не сопровождается появлением значимых: морфологических отличий, то в случае землероек различные популяции существенно отличаются по размерам тела (Бородин, Рогачева, 2003). У жаб критерий вида также не позволяет дать однозначный ответ о статусе некоторых популяций. Так, при скрещивании серых и зеленых жаб {Bufo bufo и Bufo viridis), систематический статус которых не вызывает сомнений, образовавшиеся гибриды бесплодны; при скрещивании же серых жаб, таксономический ранг которых является предметом дискуссии (центрально-восточноевропейские и кавказские жабы), гибриды F1 обладают фер-тильностью, но жизнеспособность их потомков (гибриды F2) снижена (Пи-санец, 2002).
Репродуктивная изоляция может возникать на самых разных уровнях — от этологических барьеров до возникновения несовместимых хромосомных перестроек и молекулярных различий. При этом очевидно, что существуют разные механизмы появления репродуктивного барьера. В некоторых случаях представители двух видов не вступают в половой процесс, что может быть вызвано различными причинами: различиями в поведении, в размерах тела и др. Так, у птиц зачастую препятствием для: образования-гибридов'служит отличное специфическое брачное поведение каждого вида птиц, причем даже похожие внешне виды-двойники у птиц отличаются не только генетически, но и по поведению (особенностями песни, деталями строения гнезд и т.п.) (Паевский, 2004).
Другим вариантом репродуктивного барьера является ситуация, при которой в результате прохождения полового процесса между представителями разных видов образуются нежизнеспособные или стерильные гибриды. В этом случае барьер возникает на уровне генетической несовместимости двух видов. За счет чего возникает такая репродуктивная изоляция? Каким образом из общего предкового генотипа возникают два новых, несовместимых друг с другом? Простейшим вариантом возникновения репродуктивной изоляции популяций за счет генетической несовместимости (так называемой «несовместимости Добжанского-Мёллера») может служить следующая модель (Огг, 1995). Пусть две популяции с неперекрывающимися ареалами исходно имеют генотип aabb. В одной из них возникает новая аллель А и генотипы Aabb и AAbb. Особи, имеющие такие генотипы, жизнеспособны и фертильны. В другой популяции возникает аллель В и генотипы ааВЬ и ааВВ. Поскольку популяции изолированы, аллель В не «проверяется» на совместимость с А, и возможно, что сочетание аллелей АВ дает какой-либо эффект, за счет которого возникает стерильность или нежизнеспособность. Если в дальнейшем две популяции встретятся, у образованных гибридов может возникать сочетаете аллелей АВ; тогда такие гибриды будут стерильными или нежизнеспособными. В реальных же условиях в процесс возникновения репродуктивной изоляции могут быть вовлечены не две, а множество аллелей в различных локусах (Огг, 1995).
Для трех видов дрожжей, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces castellii и Candida glabrata, был показан механизм возникновения репродуктивной изоляции и видообразования за счет потери различных генов в популяциях после дупликации предкового генома (Scannell et al., 2006). В результате в гибридах некоторые хромосомные сегменты оказываются делегированными, а некоторые дуплицированными, что приводит к их нежизнеспособности. Аналогичный механизм дивергенции видов может быть обнаружен и в случае видов-двойников инфузорий комплекса Paramecium aurelia (Aury et al., 2006). Секвенирование генома одного из представителей комплекса — P. tetraurelia, показало, что геном этого вида сформировался в эволюции в результате трех полных дупликаций предкового генома, последняя из которых произошла непосредственно перед дивергенцией видов внутри комплекса P. aurelia. При этом многие гены являются уникальными (Aury et al., 2006), то есть происходит утрата возникших паралогов из генома.
Даже в пределах одного вида между географически изолированными популяциями могут встречаться разные варианты репродуктивной изоляции. Так, репродуктивный барьер между непальскими и шриланкийскими землеройками возник за счет случайной фиксации в разных популяциях разных генов, влияющих на формирование половых клеток. Репродуктивный барьер между бангладешскими и японскими землеройками связан с изменением размеров тела особей в двух популяциях — бангладешские землеройки почти вдвое крупнее японских (Бородин, Рогачева, 2003).
Виды-двойники у инфузорий и методы их исследования
Морфологически сходные виды встречаются в самых разных группах инфузорий. Поэтому проблема идентификации представителей разных видов является исключительно актуальной. Наличие сингенов (см. Введение) внутри многих морфологических видов еще больше запутывает ситуацию, поскольку возникает вопрос о том^ с какого момента и на основании каких характеристик репродуктивно изолированную группу внутри вида — синген — следует считать самостоятельным видом. Даже для таких распространенных модельных объектов, как представители родов Euplotes, Stylonychia, Tetrahymena, Paramecium, вопрос о статусе некоторых описанных морфологических видов и обнаруженных внутри них сингенов остается открытым. Кроме того, особый интерес вызывает вопрос о причинах возникновения такого разнообразия генетических видов у Инфузорий, механизмах видообразования. Для ответа на эти вопросы в первую очередь необходимо накопление и сопоставление огромного массива сравнительных исследований, выполненных различными методами. При этом отметим, что для многих признанных видов по-прежнему не существует метода простого и быстрого определения видовой принадлежности вновь выделяемых в природе клонов.
Наиболее известные виды-двойники у инфузорий Euplotes (Hypotrichia)
Представители рода Euplotes достаточно широко используются как модельные объекты в различных исследованиях. Для всех представителей этого рода характерны яйцевидная форма клетки, длина которой варьирует от 30 до 160 мкм, один изогнутый макронуклеус (МАК) и один микронуклеус (МИК). Ресничный аппарат представителей рода Euplotes сложно организован, реснички объединены в сложные структуры — цирри и кинеты. Именно строение ресничного аппарата разных представителей Euplotes наряду с формой МАК являлось ключевой морфологической характеристикой в ранних сравнительных исследованиях и филогенетических построениях внутри рода (см. Petroni et aL, 2002). В более поздних работах к числу критериев, используемых для филогенетического анализа представителей Euplotes, добавилось сравнительное изучение и сопоставление строения кортикальных структур, эндосимбионтов, данных морфометрического анализа и экологии (Воггог, Hill, 1995; цит. по Petroni et aL, 2002).
Три вида Euplotes, Е. crassus, Е. vannus и Е. minuta, настолько морфологически похожи, что их разделение на отдельные виды вызывает сомнения у некоторых авторов (см. Petroni et al., 2003). Так, виды Е. vannus и Е. minuta отличаются только по размерам клетки и по местоположению перистома. Результаты секвенирования последовательности 18S рДНК 11 видов рода Euplotes показали, что виды Е. crassus, Е. vannus и Е. minuta формируют единую кладу и филогенетически очень близки (Petroni et al., 2002). В то же время, представители трех видов отличаются по некоторым экологическим особенностям. Так, несмотря на то, что все три вида, Е. crassus, Е. vannus и Е. minuta, являются литоральными обитателями морского бентоса, они различаются по пищевой специализации: основным компонентом пищи Е. vannus служат одноклеточные водоросли, в то время как Е. minuta преимущественно питается бактериями. Все три вида являются космополитичными и играют важную роль в морских литоральных экосистемах. Представители Е. crassus встречаются наиболее часто. Морфологическое сходство представителей трех видов в сочетании с их кос-мополитичностью заставляет исследователей искать методы, позволяющие быстро определять видовую принадлежность выделяемых из природы особей.
Помимо морфологического сходства представителей трех видов рода Euplotes, сами морфологические виды этого рода иногда разделены на сингены. Например, морфологический вид Е. vannus состоит из пяти репро-дуктивно, но не обязательно географически изолированных групп (Mache-lon, Demar, 1984). Сингены Е. vannus филогенетически более близки друг к другу, чем такие признанные виды-двойники, как представители комплексов видов Tetrahymena pyriformis или Paramecium aurelia. В этих комплексах виды-двойники отличаются по географическому распространению, температурной устойчивости, изоферментному паттерну, особенностям жизненного цикла, генетическому контролю типов спаривания и т.д. (см. ниже). Сингены же Е. vannus очень близки друг к другу как по результатам биохимических исследований, так и по морфологическим критериям, и по различным данным дивергировали совсем недавно (Machelon, Demar, 1984).
Diophrys (Hypotrichia)
На данный момент род Diophrys разделен на три морфологических вида: D. scutum, D. appendiculata и D. oligothrix (Song, Packroff, 1997 (нем.), цит. по Chen, Song, 2002). При этом представители одного из них, D. scutum, характеризуются наиболее крупными размерами (длина клетки около 120-170 мкм), и по морфологическим характеристикам и деталям строения ресничного аппарата хорошо отличаются от представителей остальных двух видов. Представители же D, appendiculata и ZX oligothrix обычно очень похожи, имеют меньшие размеры (длина около 50-100 мкм) и различаются в первую очередь на основании некоторых деталей организации ресничного аппарата, в целом также имеющего сходное строение у двух видов (Song, Packroff, 1997, цит, по Chenr Song, 2002). Такое внешнее сходство D. appendiculata и D. oligothrix затрудняет определение видовой принадлежности вновь выделяемых в природе клонов.
Uronychia spp. (Hypotrichia)
Представители рода Uronychia — широко распространенные обитатели морских и других соленых вод. Систематические построения внутри этого рода неоднократно изменялись; в настоящее время род Uronychia насчитывает четыре вида: широко распространенные U. transfuga, U. setigera, U binucleata и редкий U. multicirrus (Song, Wilbert, 1997 (нем.), цит. по Chen et al., 2003). Особенности представителей U. transfuga: удлиненная, прямоугольная форма клетки; размер 110-250 х 80-180 мкм; МАК подковообразный, без выростов, включает несколько (6-13) сегментов. Именно множественность сегментов МАК считается наиболее надежным маркером U. transfuga (Song, Wilbert, 1997, цит. по Chen et al., 2003). Виды U. setigera и U binucleata морфологически очень похожи: МАК обычно имеет два сегмента, соединенных короткой перетяжкой (в случае U. setigera иногда бывает один сегмент); один МИК. Строение ресничного аппарата у этих двух видов также сходно, хотя и отличается некоторыми деталями. Кроме того, U. setigera отличается от U. binucleata меньшим размером клетки. Выявление такого рода отличий является непростой и трудоемкой задачей, что затрудняет рутинное определение видовой принадлежности клонов.
Stylonychia (Stichotrichia)
Представители рода Stylonychia характеризуются жесткой, негнущейся структурой клетки, напоминающей по форме лапоть. Два вида этого рода, S. mytilus и S. lemnae, практически неотличимы по морфологическим критериям и считаются видами-двойниками (Ammermann, Schlegel, 1983). Представители этих двух видов имеют сходную организацию ядерного аппарата (МАК состоит из двух сегментов, микронуклеусов два или три) и физиологические особенности, и с точки зрения морфологии отличаются только размером и формой клетки, различия по которой незначительны и выявляются с трудом. Длина клетки у представителей S. mytilus обычно составляет около 300 мкм, а у представителей S. lemnae — около 230 мкм. В то же время виды полностью репродуктивно изолированы, то есть являются самостоятельными генетическими видами (Ammermann, Schlegel, 1983).
Tetrahymena (Hymenostomatia)
Все виды внутри рода Tetrahymena морфологически похожи. Для выделения отдельных видов потребовались многочисленные исследования их экологических, морфологических, биохимических и молекулярных особенностей. Изначально многие морфологически сходные свободноживу-гцие виды рода Tetrahymena были классифицированы как сингены вида Т. pyriformis. Затем, как и в случае комплекса Paramecium aurelia (см. ниже), по результатам изоферментного анализа и других сравнительных исследований внутри рода Tetrahymena были выделены самостоятельные виды (Nanney, McCoy, 1976). Однако по сравнению с комплексом видов P. aurelia, ситуация внутри бывшего комплекса Т. pyriformis оказалось более запутанной. Самая большая сложность в случае изучения представителей Т. pyriformis связана с наличием большого числа клонов, не вступающих в половой процесс (порядка 30-50% вновь выделяемых в природе клонов). Большинство из них являются амикронукпеарными, то есть не имеют МИК (Nanney, McCoy, 1976). МИК — транскрипционно инертное ядро инфузорий — необходим для образования потомства при прохождении клетками полового процесса. Поэтому даже искусственная стимуляция амикронук-леарных клеток к вступлению в половой процесс не может привести к образованию полноценного потомства. Соответственно, оказывается невозможным определить их видовую принадлежность на основе критерия репродуктивной изоляции. Поэтому для определения видовой принадлежности таких клонов необходимо использовать другие методы сравнительного анализа.
Кроме того, представители Tetrahymena не способны к автогамии — половому процессу, проходящему внутри одной клетки, направленному на «обновление» клеток. Спустя некоторое количество вегетативных делений
Tetrahymena стареют и оказываются неспособными давать жизнеспособное потомство после полового процесса, какой бы клон ни выступал в качестве партнера при скрещивании. То есть, некоторые клоны не дают при скрещивании потомства не потому, что принадлежат к разным сингенам, а потому что один из них является «старым». Таким образом, при определении сингенной принадлежности того или иного клона Tetrahymena необходимо еще и дополнительно проверять способность каждого из партнеров давать потомство при скрещивании с другими клонами (Nanney, McCoy, 1976).
Такие сложности с определением сингенной (видовой) принадлежности разных клонов, а также недостаточная изученность описанных син-генов (видов) Tetrahymena на момент присвоения им ранга видов неминуемо должны были приводить к многократным изменениям существующих филогенетических построений внутри этого рода. Именно поэтому в отличие от P. aurelia генетические виды внутри Т. pyriformis не были названы созвучно соответствующим сингенам. При использовании порядковых названий (prim, bi и т.д.) расформирование части видов в дальнейшем или, наоборот, разделение вида на несколько, привело бы к тому, что, например, пятый вид отсутствовал бы вообще, а восьмых стало бы два (Nanney, McCoy, 1976).
Paramecium (Peniculia)
Род Paramecium является монофилетичным и включает в себя несколько морфологических видов. Признанные виды этого рода сильно ди-вергировали друг от друга и хорошо отличаются на основании морфологических характеристик. При этом практически все морфологические виды рода Paramecium разделены на сингены. Границы между разными синге-нами внутри одного вида могут более (как у P. bursaria) или менее (как у P. caudatum) ярко выраженными (Wichtermann, 1986).
Существует несколько вариантов филогенетических построений внутри этого рода. Еще в 1921 году род Paramecium условно разделили на две группы видов: «bursaria» (клетки имеют форму ступни) и «aurelia» (клетки имеют форму сигары) (Woodruff, 1921, цит. по Янковский, 1969). Позже, основываясь на таких морфологических характеристиках, как форма и размер клетки, расположение цитостома, особенности строения ресничных комплексов, организация ядерного аппарата и характер конъюгации, Янковский выделил внутри рода Paramecium три подгруппы (подро-да) и предложил схему эволюции рода (Янковский, 1969). Согласно предложенной схеме порядок отхождения выделенных им подгрупп от общего предкового ствола был следующим: подрод Helianter ("putrinum") — Су-preostoma ("woodruffi") — Paramecium ("aurelia"). Результаты секвениро-вания последовательности 18S рДНК разных видов рода Paramecium (Striider-Kypke et al., 2000a, b; Hoshina et al., 2006) подтвердили его моно-филетичное происхождение. В то же время оказалось, что такие морфологические виды внутри рода как P. bursaria и P. polycaryum или P. pri-maurelia дивергировали друг от друга сильнее, чем представители двух разных подклассов инфузорий — Ophryoglenina (Ophryoglena catenuld) и Tetrahymenina (Tetrahymena corlissi) (Striider-Kypke et al., 2000b).
В целом данные секвенирования 18S рДНК соответствуют модели, предложенной Янковским, хотя и требуют некоторой ее модификации. Согласно данным молекулярно-филогенетического анализа вид P. bursaria, который Янковский относил к подроду Helianter, находится в основании группы. Вид P. putrinum близок к P. bursaria, хотя и не является для него сестринским (Striider-Kypke et al., 2000а), и образует единый кластер с Р. duboscqui (Striider-Kypke et al., 2000b). Группа «woodruffi» включает в себя виды P. woodruffi, P. nephridiatum, P. polycaryum и P. calkinsi, причем Р. woodruffi оказался сестринским видом для P. nephridiatum. У этих двух видов секвенированные последовательности отличались только по шести нуклеотидам, в то время как другие морфологические виды отличались более значительно: 107 нуклеотидов в случае видов P. multimicronucleatum и P. caudatum, 112 - в случае P. putrinum и P. bursaria, 104 — в случае Р. duboscqui и P. bursaria, 77 — в случае P. putrinum и P. duboscqui. Только у таких близких видов, как виды-двойники комплекса P. aurelia, разница составляла от 5 до 7 н. При этом группа «woodruff!», предложенная Янковским, не может считаться филогенетически единой, поскольку вид Р. polycaryum стоит несколько особняком, а вот виды P. nephridiatum, Р. woodruffi и P. calkinsi похожи как по морфологии и экологии, так и по анализируемой последовательности (Striider-Kypke et al., 2000b).
Группа «aurelia» является монофилетичной и включает в себя комплекс видов P. aurelia, а также P. jenningsi, P. multimicronucleatum и Р. саи-datum. Топология ветвей внутри группы зависит от способа анализа данных: при одном из способов анализа P. aurelia оказывается ближе к Р. саи-datum, а при другом — к P. midtimicronucleatum. Вид P. jenningsi оказался очень близок к видам-двойникам комплекса P. aurelia: если секвенирован-ные последовательности двух клонов P. calkinsi отличаются по трем нук-леотидам, то в случае Р: primaurelia и P. tetraurelia разница составляет пять нуклеотидов, а разница между каждым из них и P. jenningsi составляет всего семь и шесть нуклеотидов соответственно (Striider-Kypke et aL, 2000а). Более того, если при применении одних способов анализа данных сестринскими являются виды-двойники Р. primaurelia и P. tetraurelia, то другие способы анализа показывают, что сестринским видом для вида Р. primaurelia является P. jenningsi (Striider-Kypke et al., 2000b). Следует отметить, что морфологически представители комплекса видов P. aurelia и вида P. jenningsi тоже очень похожи, их отличают только по типу МИК (хромосомный у P. jenningsi и везикулярный у P. aurelia) и по размеру клетки: P. jenningsi (115—218 мкм) крупнее большинства видов комплекса P. aurelia (80-135 мкм) (Diller, Earl, 1958; Wichtermann, 1986). В последние годы накапливается все больше данных, ставящих под сомнение самостоятельность вида P. jenningsi — так, внутри этого вида было обнаружено несколько репродуктивно изолированных групп (Przybos, Skotarczak,
Wodecka, 2003), которые, по молекулярно-филогенетическим данным, оказывались «разбросаны» по древу комплекса P. aurelia (Maciejewska, 2007).
Таким образом, на данный момент внутри рода Paramecium выделяют четыре группы видов: Chloroparamecium (P. bursaria), Helianter (P. duboscqui, P. putrinum), Cypriostomum (P. calkinsi, P. polycaryum, P. nepkridiatum, P. woodruffi) и Aurelia (P. caudatum, P. multimicronucleatum, комплекс P. aurelia, P. jenningsi, P. schewiakoffi) (Striider-Kypke et al., 2000a; Hoshina et al., 2006).
Наличие сингенов или генетических видов характерно для всех изученных видов рода Paramecium. Для морфологического вида P. bursaria было описано шесть сингенов (Bomford, 1966). Позже эта коллекция была утеряна, и в настоящее время единственной в мире коллекцией клонов пяти сингенов этого вида обладает лаборатория кариологии одноклеточных биолого-почвенного факультета СПбГУ. Внутри каждого сингена P. bursaria выделяют несколько типов спаривания (от 4 до 8), причем скрещивание возможно только между представителями разных типов спаривания внутри сингена. Сингены P. bursaria полностью репродуктивно изолированы друг от друга. Единственное исключение составляют представители одного из типов спаривания сингена 4, которые могут вступать в конъюгацию с представителями четырех из восьми известных типов спаривания сингена 2 (Bomford, 1966; И.И. Скобло, личн. сообщ.). Еще в 1939 году Дженнингс, описав систему множественных типов спаривания (Jennings, 1939), по сути предположил, что морфологический вид P. bursaria представляет собой комплекс генетических видов. Однако до сих пор P. bursaria по сравнению с такими признанными комплексами видов-двойников, как, например, P. aurelia, изучен относительно слабо.
Внутри морфологического вида P. caudatum также существуют репродуктивно изолированные группы — сингены (Gilman, 1941). В то же время изоферментный анализ (Khadem, Gibson, 1985) и другие молекулярные методы (Tsukii, 1996; Stoeck et al., 2000b) не позволяют их различить см. ниже). Более того, Тзуки и Хиваташи (Tsukii, Hiwatashi, 1985) сумели получить фертильные гибриды между представителями разных сингенов, что говорит о том, что сингены Р. caudatum генетически очень близки. Тем не менее, в мейозе у таких «межсингенных» гибридов, как правило, наблюдалось нерасхождение некоторых хромосом — то есть, сингены все же относительно изолированы друг от друга, хотя и не настолько, чтобы нарушения мейоза приводили к возникновению полноценных репродуктивных барьеров.
Морфологический вид P. multimicronucleatum также разделен на сингены, которые согласно данным изоферментного анализа (Allen et al., 1983, цит. по Hori et al., 2006) можно считать самостоятельными генетическими видами. По данным молекулярно-филогенетического анализа границы между сингенами этого вида выражены не менее четко, чем границы между признанными видами комплекса P. aurelia (Barth et al., 2006).
Представители комплекса видов P. aurelia (наряду с P. caudatum) наиболее часто используются в качестве экспериментальных моделей. Сингены внутри этого вида разграничены не только репродуктивным барьером, но и отличаются друг от друга по биохимическим и молекулярным признакам настолько сильно, что каждому сингену был присвоен ранг вида и дано латинское название в соответствии с правилами бинарной номенклатуры: P. primaurelia, P. biaurelia и т.д.; морфологический вид P. aurelia стали считать комплексом видов-двойников (Sonneborn, 1975). В 6070-е годы с целью нахождения оптимального способа определения видовой (тогда еще сингенной) принадлежности представителей P. aurelia проводили сравнительные электрофоретические анализы подвижности разных белков (Tait, 1970). Оказалось, что хотя данных по каждому из изученных белков в отдельности не было достаточно для точного определения синге-на, совокупность данных по четырем изученным белкам позволяла отличить практически все сингены друг от друга. Опираясь на результаты Тайта, Соннеборн предложил присвоить сингенам P. aurelia статус самостоятельных видов (Sonneborn, 1975).
Разными авторами предпринимались попытки провести сравнительное исследование видов-двойников комплекса P. aurelia с помощью тех или иных методов. Так, тщательный морфометрический анализ нескольких клонов показал, что по совокупности биометрических характеристик возможно отличить друг от друга такие виды, как P. primaurelia, P. biaurelia, P. tetraurelia и P. sexaurelia (Gates et al., 1974), в то время как P. primaurelia и P. pentaurelia оказались неотличимы (Gates, Berger, 1976). При этом наиболее значительно отличался от остальных вид P. tetraurelia, что подтверждается и морфометрическими данными, полученным Фокиным и Чивиле-вым: эти авторы даже вывели P. tetraurelia за пределы всей группы видов «aurelia» (Fokin, Chivilev, 2000). Правда, необходимо отметить, что ими был исследован только один клон этого вида.
У всех представителей комплекса P. aurelia существует два типа спаривания: О и Е (Sonneborn, 1975). Конъюгация возможна только между представителями разных типов спаривания. При этом наследование типа спаривания обусловлено сложными эпигенетическими взаимодействиями старого и нового МАК (см. Ргеег, 2000), и характер наследования отличается у разных видов комплекса (Wichtermann, 1986). По этому признаку всех представителей Р. aurelia можно разделить на три группы. В группе А, к которой относятся P. primaurelia, P. triaurelia, P. pentaurelia, Р. по-vaurelia, P. undecaurelia, P. quadecaurelia, тип спаривания наследуется «ка-рионидно» — то есть каждая карионида (в случае P. aurelia это потомок первого деления эксконьюгантной клетки) приобретает один или другой тип спаривания по случайному принципу. Старый «родительский» МАК не влияет на этот процесс. Сходный механизм наследования типов спаривания характерен и для представителей Tetrahymena (Ргеег, 2000). В группе С, к которой относится только вид P. tredecaurelia, тип спаривания наследуется по менделевским законам. В группе В, к которой относятся Р. tetraurelia, P. sexaurelia, P. septaurelia, P. octaurelia, P. decaurelia и P. dode-caurelia, типы спаривания наследуются «цитоплазматически» — тип спаривания обеих дочерних карионид после прохождения полового процесса повторяет родительский (Ргеег, 2000). Можно сказать, что МАК, развившийся в цитоплазме О-типа спаривания, экспрессирует О-тип, а МАК в Е-цитоплазме — Е-тип. Потенциально оба МАК способны экспрессировать оба типа спаривания. Эксперименты показали, что в этом случае именно старый МАК влияет на экспрессию того или иного типа спаривания после прохождения полового процесса (см. Ргеег, 2000).
Представители противоположных типов спаривания некоторых видов комплекса могут вступать в межвидовые скрещивания, но жизнеспособного потомства в таких случаях никогда не образуется (Sonneborn, 1950; Wichtermann, 1986). Ряд видов (P. biaurelia, P. sexaurelia, Р. по-vaurelia, P. undecaurelia, P. tredecaurelia, P. quadecaurelia и P. sonneborni) никогда не образуют конъюгантных пар с представителями других видов.
Географическое распределение видов-двойников
При разговоре о генетических видах и ранних стадиях видообразования всегда встает вопрос о роли одного из существенных факторов формирования новых видов — географической изоляции, то есть географическом распределении представителей разных генетических видов. В случае комплекса видов-двойников P. aurelia этот вопрос наиболее хорошо исследован. Разные виды комплекса P. aurelia отличаются по степени географической распространенности (Przybos, Fokin, 2000; Przybos, Barth, Berendonk, 2008). Так, виды P. primaurelia, P. biaurelia, P. tetraurelia, P. pentaurelia, P. sexaurelia, P. octaurelia можно однозначно отнести к числу космополитных видов. Также довольно широко распространены представители P. triaurelia (они встречаются и в Европе, и в Америке). Вид P. novaurelia долгое время считали исключительно европейским, но позже И.И. Скобло был изолирован американский клон (клон АБ 8-22, Бостон, США) этого вида (Przybos,
Tarcz, Skoblo, 2007). Вид P. septaurelia, наоборот, считали обитателем Североамериканского континента, но относительно недавно представители вида были обнаружены нами на территории Астраханского заповедника (Przybos et al., 2004) и в Германии (Przybos et al., 2005). Представителей вида P. dodecaurelia также долгое время не встречали на территории Европы, но за последние семь лет было сделано несколько находок этого вида в Европе и Азии (Испания, Италия, Германия, Польша, Северо-Запад России, Центральная Сибирь, Казахстан). Так что этот вид также можно считать космополитным (Przybos, Tarcz et al., 2008). To же самое относится и к представителям вида P. decaurelia, который ранее считали видом, встречающимся только в Северной Америке, но позже клоны этого вида были изолированы в Японии (Przybos, Fujishima, Nakaoka, 2003), в Европе и Западной Сибири (Przybos, Greczek-Stachura et al., 2007). В то же время существуют виды, которые удавалось изолировать лишь единожды (P. unde-caurelia, P. sonneborni). Таким образом, внутри комплекса Р. aurelia существуют либо исключительно редкие виды, представленные в мировых коллекциях одним-двумя клонами (P. undecaurelia, P. quadecaurelia, P. sonnebomi), либо, наоборот, виды, встречающиеся практически повсеместно. При этом можно выделить определенные закономерности распространения тех или иных видов по климатическим зонам. Так, P. biaurelia является широко распространенным обитателем водоемов северных широт, обладает большей относительно других видов комплекса устойчивостью к понитго 1Лtjatj oi;тплг!\77лртт1 рпдттг.т л^итаптга тэ тп nnas<rrr irmr ijuttlt Р рля/лш'^/тл О iiwiinuii s/j i pui^ituwiii uuxnuimy^ и iиpvitiA ivuiv tiii^Di x , jwptuiw ^t-tu^ x v sexaurelia и P. pentaurelia являются более теплолюбивыми (Potekhin et al., 2008). Две единственные находки представителей P. quadecaurelia были сделаны на разных континентах (Африка и Австралия), но практически на одной географической широте и в сходной климатической зоне (Przybos, Hon, Fokin, 2003).
Удивительно четкое географическое распределение характерно для сингенов P. bursaria. Опубликованные (Bomford, 1966; Hoshina et al., 2006) данные хорошо согласуются с результатами, накопленными сотрудниками нашей лаборатории за 40 лет регулярных сборов проб и выделения новых клонов этого вида из водоемов практически всего Северного полушария (И.И. Скобло, личн. сообщ.). Так, сингены 1 и 2 P. bursaria (в нашей лаборатории придерживаются собственной нумерации сингенов, не соответствующей предложенной Бомфордом) являются обычными для Европы, и их ареал простирается до Сибири и Китая; однако эти сингены не обнаружены в сборах в США, в Японии и на Дальнем Востоке. Синген 3, напротив, встречается именно на Дальнем Востоке, в Северном и Восточном Китае и в Северной Америке; есть сведения также о его находках в Австралии и Южной Америке (Hoshina et al., 2006; Т. Берендонк, личн. сообщ.). Синген 4 до сих пор отмечали только в США. По всей видимости, сингены 3 и 4 практически отсутствуют в Европе (где в течение 40 лет проводили подавляющую часть сборов). Наконец, синген 5 является крайне редким, о его распространении невозможно делать выводы. Такой уникальный для протестов паттерн географического распределения может быть связан со специфичностью симбиоза разных сингенов P. bursaria с разными зоохлорел-лами — одноклеточными зелеными водорослями. Эта версия подтверждается недавно опубликованной молекулярной филогенией симбиотических зоохлорелл и их хозяев (Summerer et al., 2008).
В заключение отметим, что представления о встречаемости того или иного вида на определенной территории зачастую отражают лишь степень исследованности данной территории, и новые находки часто опровергают предшествующие сведения о встречаемости тех или иных видов в конкретном регионе.
Методы, используемые для сравнительного изучения видов-двойников
Невозможность определения видовой принадлежности некоторых инфузорий на основе морфологических отличий заставляла исследователей искать другие возможные критерии, позволявшие различать представителей тех или иных генетических видов. Так, например, сравнивали содержание гуанина-цитозина в последовательностях ДНК у разных представителей комплекса видов Т. pyriformis (этот показатель варьирует от 24 до 33% у разных клонов Т. pyriformis'). Оказалось, что некоторые виды Т. pyriformis различаются по данному показателю довольно значительно, в то время как внутри генетического вида (тогда еще сингена) вариабельность обычно не превышает 2% (синген 1 — 24-26%, синген 10 — 31%, синген 6 — 25%). Но если повышенная вариабельность по данному признаку (различие в содержании G-C больше 2%) позволяет однозначно заключить, что клоны принадлежат к разным сингенам (как, например, в случае сингенов 1 и 10), то одинаковое содержание G-C отнюдь не означает, что клоны относятся к одному сингену (как, например, в случае сингенов 1 и 6) (Allen, Gibson, 1973, цит. по Nanney, McCoy, 1976). Сравнительный анализ содержания фосфолипидов в клетках представителей восьми видов комплекса Т. pyriformis также не выявил характерных видоспецифичных особенностей (Burdette et al., 2006).
Иммобшшзацнонный тест, основанный на агглютинации ресничек с помощью антител, также применяли в сравнительных исследованиях видов-двойников. Дело в том, что поверхность ресничек парамеций и тетра-химен покрыта так называемыми поверхностными антигенами (ПАТ), которые у парамеций формируют надмембранную оболочку толщиной 17-25 нм (Schmidt, 1988). Функция их до сих пор не выяснена окончательно; считается, что они участвуют в трансмембранных сигнальных каскадах, приводящих к выходу кальция в цитоплазму клеток и ряду разнообразных последующих событий, в том числе к смене экспрессируемого ПАТ (Simon, Schmidt, 2007). У P. tetraurelia существует 11 разных поверхностных антигенов с молекулярной массой от 250 кДа до 380 кДа (Forney et al., 1996). Каждый поверхностный антиген состоит из одной аминокислотной цепи и кодируется отдельным геном (Caron, Meyer, 1989). Гены, кодирующие разные ПАТ — это семейство паралогичных генов, то есть генов, являющихся продуктами дупликации одного предкового гена и независимо диверги-рующих в пределах генома (Caron, Meyer, 1989). В каждый момент времени клетка экспрессирует только один ПАГ. При этом при постоянных условиях среды все потомство данной клетки будет экспрессировать данный антиген, образуя так называемый серотип (Godiska, 1987).
Данные белки являются очень удобным объектом исследования, так как наличие или отсутствие этого признака очень легко детектировать: добавляя в среду сыворотку, содержащую антитела к данному ПАГ, можно определить наличие его на поверхности клеток по агрегации клеток и слипанию их в комок (в случае отсутствия антигена агрегации не будет) (Schmidt, 1988). В случае Paramecium, однако, одноименные ПАГ у разных видов обладают столь высокой гомологией, что кросс-реакции между гомологичными серотипами разных видов комплекса Р. aurelia оказываются сильнее, чем между разными серотипами внутри вида (Schmidt, 1988). Так, например, ген ПАГ А клона 172 Р. tetraurelia на 97% гомологичен гену ПАГ А клона 51 P. tetraurelia, в то время как гомология генов ПАГ А и ПАГ G у одного клона P. tetraurelia составляет только 80% (Forney et al., 1996), а гомология центральной части генов ПАГ А и ПАГ В — всего 59 % (Simon, Schmidt, 2007). Для представителей Tetrahymena, для которых, в отличие от Paramecium, не известны случаи кросс-реакции между синге-нами, успешная агглютинация всегда означает принадлежность клонов к одному сингену (Loefer, Scherbaum, 1963, цит. по Nanney, McCoy, 1976). То есть теоретически возможно определение видовой принадлежности клона таким методом. Однако количество различных ПАГ у разных представителей Tetrahymena очень велико; различаются и условия, при которых экспрессируется тот или иной ПАГ. Поэтому для каждого вида необходим большой набор иммобилизирующих агентов, специфичных к разным ПАГ, и тщательный подбор условий, что делает данный метод не пригодным для рутинного определения видовой принадлежности клонов (Nanney, McCoy, 1976).
Кроме того, оказалось, что некоторые виды-двойники различаются по устойчивости к определенным воздействиям. Так, например, представители Т. thermophyla (бывший синген 1 Т. pyriformis) устойчивы к нагреванию до 38-41 °С (что и легло в основу видового названия) (Holz et al., 1959, цит. по Nanney, McCoy, 1976). Было показано, что представители четырех видов комплекса P. aurelia (проанализировали по несколько клонов P. primaurelia, P. biaurelia, P. tetraurelia и один клон P. decaurelia) отличаются по устойчивости к таким воздействиям, как повышение солености среды, понижение рН, повышение температуры (Nyberg, 1988). Представители вида P. primaurelia отличались наибольшей устойчивостью к повышению температуры и наличию в среде хлорида кальция; единственный использованный в работе клон P. decaurelia оказался наименее устойчивым к повышению температуры, наличию кальция и натрия. В то же время при сравнении устойчивости представителей двух видов комплекса P. aurelia (P. primaurelia и P. triaurelia:) к наличию в среде тяжелых металлов были обнаружены выраженные внутривидовые отличия, что делает данный признак не пригодным для сравнения разных видов комплекса P. aurelia (Nyberg, 1988).
Разные виды Paramecium различаются и по некоторым характеристикам жизненного цикла, в частности, по продолжительности периода незрелости (Nyberg, 1988). По данному признаку инфузорий делят на две группы: аутбридеры и инбридеры. Для классических аутбридеров характерен длинный период клональной незрелости (период, когда клетки не способны вступать в конъюгацию), длинный период зрелости (клетки способны конъюгировать) и множественная система типов спаривания. Инбриде-ры, наоборот, имеют короткий или вообще отсутствующий период незрелости, короткий период зрелости, два типа спаривания; для инбридеров характерна автогамия (Nyberg, 1988). Короткие периоды незрелости приводят к тому, что клетки преимущественно вступают в конъюгацию с клетками из относительно близко расположенных популяций. Длинные згсе периоды незрелости дают клеткам больше возможностей для скрещиваний с представителями относительно удаленных популяций, и, соответственно, популяции менее изолированы. Аутбридеры, таким образом, предположительно лучше приспособлены к изменениям условий среды, в то время как изолированность популяций инбридеров приводит к их специализации к жизни в конкретных условиях. Соответственно, разные сингены (генетические виды) могут занимать разные экологические ниши. Среди разных морфологических видов рода Paramecium типичными аутбридерами считают представителей вида P. bursaria, а виды комплекса P. aurelia относят к инбридерам (Nyberg, 1988). В то же время степень «инбридности» для разных видов комплекса отличается. Наиболее ярко выраженными инбри-дерами считают представителей видов P. sexaurelia и P. dodecaurelia — период незрелости у них короток, при этом для этих видов характерен высокий внутривидовой полиморфизм по ряду признаков и затруднено скрещивание между клетками из географически разобщенных популяций (Stoeck et al., 1998; Przybos, Rautian et aL, 2007; Przybos, Tarcz et aL, 2008). Также к числу выраженных инбридеров относят представителей P. tetraurelia и Р. octaurelia (Nyberg, 1988); P. primaureliaT P. biaurelia, P, triaurelia, P„ no-vaurelia, P. decaurelia относят к умеренным инбридерам (Nyberg, 1988; Przybos, Tarcz, Skoblo, 2007; Przybos, Greczek-Stachura et al., 2007), яР.реп-taurelia — к слабым инбиридерам (Stoeck et al., 2000a). Однако продолжительность периода незрелости не может служить удобным и надежным маркером видовой принадлежности.
Изоферментпый анализ
Метод изоферментного анализа — злетсгрофоретического разделения различных белков — широко используется: при сравнительном изучении различных групп видов-двойников у инфузорий.
Так, по результатам электрофоретического разделения зстераз и кислых фосфатаз клоны шести видов рода Euplotes были разделены на две группы, причем результаты изоферментного анализа совпадали с морфологическими особенностями исследованных видов (Machelon, Demar, 1984). Морфологически очень похожие виды Е. vannus и Е. minuta оказались в одной группе, а морфологически сильно отличающиеся от них виды — в другой. Кроме того, оказалось, что метод изоферментного анализа позволяет различить и представителей видов Е. vannus и Е. minuta. При анализе изоферментного паттерна для кислых фосфатаз удалось выявить по специфичному бэнду для каждого из этих морфологических видов, обозначенному Р1 и Р2 соответственно (Machelon, Demar, 1984). На зимо-граммах представителей еще одного из проанализированных видов, Е. charon, также могут быть как один из двух, так и сразу оба описанных бэн-да, но остальные бэнды изоферментного паттерна представителей Е. charon располагаются в геле выше этих двух бэндов, в то время как подавляющая часть бэндов в случае Е. vannus и Е. minuta располагается в геле ниже Р1 и Р2 (Machelon, Demar, 1984).
Более того, изоферментный анализ позволяет даже отличать представителей некоторых сингенов Е. vannus (Machelon, Demar, 1984). При изоферментном анализе кислых фосфатаз для 40 клонов разных видов комплекса Е. vannus авторам удалось выявить девять типов изоферментного паттерна (I, Г, II, III, IV, V, VI, VII, VIII), причем каждому клону всегда соответствовал только один тип паттерна (Machelon, Demar, 1984). Во всех девяти вариантах выявляется общий специфичный для всех представителей Е. vannus бэнд Р1. Несмотря на то, что некоторые типы изоферментного паттерна могут встречаться у представителей разных сингенов комплекса Е. vannus (так, тип паттерна 1 и Г характерен как для сингена 1, так и для сингена 2), в большинстве случаев определенный тип изоферментного паттерна приурочен к определенному виду комплекса Е. vannus (так, типы паттерна VII и VIII были обнаружены только у представителей сингена 5). Большое количество вариантов паттернов и отсутствие однозначной корреляции между типом паттерна и видовой принадлежностью исследуемого клона не позволяет считать изоферментный анализ удачным методом для определения сингенной принадлежности вновь выделенных в природе представителей комплекса Е. у annus. В то же время изоферментный паттерн некоторым образом отражает степень «родства» видов комплекса Е. vannus: так, пары сингенов 1 и 2 или 3 и 4, имеющие общие для двух сингенов типы изоферментного паттерна, филогенетически более близки к друг другу, чем к остальным сингенам Е. vannus (Machelon, Demar, 1984).
Паттерны электрофоретического разделения нескольких ферментов и структурных белков S. lemnae и S. mytilus (Steinbriick, Schlegel, 1983) в целом оказались достаточно похожи как по числу бэндов, так и по их положению. В то же время при анализе некоторых ферментов (например, изоцитрат-дегидрогеназы) удавалось выявить четкие видоспецифичные отличия по положению бэндов. При этом внутривидовые отличия были незначительны. Таким образом, метод изоферментного анализа позволяет однозначно различить представителей видов-двойников S. lemnae и S. mytilus (Steinbriick, Schlegel, 1983). В дальнейшем на основе этих результатов был разработан более простой и быстрый способ определения видов сти-лонихий. Последовательность гена изоцитрат-дегидрогеназы была секве-нирована для S. lemnae и S. mytilus; за счет обнаруженных межвидовых различий были подобраны видоспецифичные праймеры для определения видовой принадлежности стилонихий с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Haentzsch et al., 2006).
Изоферментный анализ оказался довольно успешным методом при сравнительном анализе различных представителей Т. pyriformis. При исследовании четырех типов ферментов — кислой фосфатазы и трех эстераз — была выявлена межсингенная вариабельность (Allen, Weremiuk, 1971, цит. по Nanney, McCoy, 1976). Наиболее эффективным оказалось использование для анализа эстераз 1 и 2. По наличию/отсутствию этих двух ферментов 12 сингенов Т. pyriformis (на момент исследования сингенам не был присвоен ранг видов) удалось разделить на четыре группы: сингены 5, 6, 8,
10, 11 (отсутствуют обе эстеразы); синген 3 (есть эстераза 1, но нет эстера-зы 2); сингены 2, 12 (нет эстеразы 1, но есть эстераза 2); сингены 1, 4, 7, 9 (есть обе эстеразы). При этом в некоторых случаях сингены внутри группы отличались по электрофоретической подвижности белков. Однако высокий уровень внутривидовой вариабельности не позволил разработать однозначный алгоритм диагностики видовой принадлежности разных тетрахи-мен на основании этих данных. Позднее был проведен анализ еще нескольких ферментов (Nanney, McCoy, 1976), который позволил отличить представителей большей части исследованных видов друг от друга. При этом все равно оставались виды, отличить которые по изоферментному паттерну было невозможно.
Исследования методом изоферментного анализа неоднократно проводились и для видов-двойников комплекса P. aurelia (Tait, 1970; Adams, Allen, 1975). При электрофоретическом разделении пяти разных дегидро-геназ клонов разных видов (сингенов) комплекса P. aurelia по совокупности полученных данных удалось отличить все сингены комплекса (на тот момент насчитывалось 14 сингенов) друг от друга (Tait, 1970). В ходе работы были также выявлены и некоторые внутривидовые отличия, но они встречались с очень низкой частотой (один случай на 50-100 клонов) и не соответствовали межвидовым. Единственным исключением оказались виды P. primaurelia и P. pentaurelia, различий между которыми не было обнаружено. Аналогичные результаты (различаются все виды, кроме P. primaurelia и P. pentaurelia) получили при сравнительном электрофоретическом анализе девяти ферментов (фумараз, эстераз и дегидрогеназ) всех видов комплекса P. aurelia Адаме и Аллен (Adams, Allen, 1975). Следует отметить, что виды P. primaurelia и P. pentaurelia очень близки и по результатам других экспериментов. Именно эти два вида оказались неотличимыми по данным морфометрического исследования (Gates, Berger, 1976). В 1976 году были проведены исследования по пересаживанию митохондрий с помощью микроинъекции между тремя видами комплекса: P. primaurelia,
P. pentaurelia, P. septaurelia (Beale, Knowles, 1976). Оказалось, что митохондрии представителей видов P. primaurelia и P. pentaurelia могут быть успешно пересажены в цитоплазму представителей всех трех исследованных видов, хотя процент успешных переносов митохондрий между представителями одного вида выше, чем при межвидовых пересаживаниях. Если же в качестве донора митохондрии выступает представитель P. septaurelia, то митохондрии не приживаются у представителей двух других видов. В то же время, если в случае рода Euplotes удавалось проследить определенные корреляции между данными изоферментного анализа и морфологическими и филогенетическими особенностями видов (Machelon, Demar, 1984), то в случае комплекса P. aurelia построенные на основании данных изоферментного анализа дендрограммы (Adams, Allen, 1975) никак не коррелировали с другими данными сравнительного исследования видов комплекса. Так, виды P. tetraurelia и P. octaurelia, для которых показана возможность образования межвидовых конъюгантных пар (Haggard, 1974), оказались далеки друг от друга по данным изоферментного анализа.
В результате сравнительного анализа электрофоретической подвижности гемоглобина у восьми видов комплекса P. aurelia (Usuki, Irie, 1983а) был выявлен как межвидовой, так и внутривидовой полиморфизм по анализируемому признаку, но уровень внутривидового полиморфизма был существенно ниже. Всего у видов комплекса P. aurelia было обнаружено 12 форм гемоглобина, различающихся по электрофоретической подвижности. Согласно полученным результатам, каждый из исследованных восьми видов имеет индивидуальный набор таких форм гемоглобина, в том числе по данному признаку различаются и неразличимые по данным сравнительного исследования других белков виды P. primaurelia и P. pentaurelia. Никаких корреляций с данными других сравнительных исследований видов комплекса P. aurelia так же, как и в работе Адамса и Аллен, выявлено не было (Usuki, Irie, 1983а). Интересно, что при проведении аналогичного исследования для десяти клонов двух сингенов P. caudatum, двух клонов Р. multimicronucleatum и одного клона P. jenningsi (Usuki, Irie, 1983b) для каждого из этих видов была выявлена лишь одна основная форма гемоглобина (при более детальном исследовании в минорных количествах удалось выявить еще несколько форм). У P. caudatum и P. jenningsi она соответствовала гемоглобину 10 P. aurelia, а у P. multimicronucleatum — гемоглобину 11. Никакого полиморфизма для разных сингенов P. caudatum выявлено не было, что еще раз подтверждает, что сингены этого морфологического вида филогенетически очень близки. Важно также отметить, что морфологический вид P. jenningsi, который по всем данным является сестринским видом комплекса P. aurelia, в этом случае не отличался по исследуемому признаку от P. caudatum и значительно отличался от представителей комплекса Р. aurelia (Usuki, Irie, 1983b).
RAPD
Метод RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) - ПЦР со случайными праймерами - также исключительно широко и успешно применяется в сравнительных исследованиях как видов-двойников и сингенов, так и популяций внутри одного вида. В качестве праймеров для RAPD используют случайные часто встречающиеся в любых геномах последовательности ДНК. Для реакции обычно используют один олигонуклеотид размером от 10 до 25 н. В результате перебора многих последовательностей зачастую удается выявить один или несколько праймеров, позволяющих получить специфичный паттерн продуктов ПЦР для каждой из исследуемых групп организмов. Поскольку в результате RAPD амплифициру-ются случайные, неизвестные последовательности ДНК, данный метод сам по себе не может служить основой для филогенетических построений, но является хорошим методом для идентификации представителей морфологически сходных видов (Landry, Lapointe, 1996).
Так, например, удалось подобрать олигонуклеотидные праймеры (три из 45 протестированных), позволяющие однозначно отличить методом RAPD представителей морфологически сходных видов Euplotes vannus и Е. minuta (Chen et al., 2000). В нашей лаборатории были подобраны праймеры, позволяющие различить виды-двойники Stylonychia mytilus и S. lemnae (А.А. Потехин, А.Р. Коцинян, неопубл.). Несмотря на наличие внутривидовых отличий метод RAPD позволяет отличить друг от друга и три распространенных вида Uronychia - U. transfuga, U. setigera, U. binu-cleata (показано для четырех различных праймеров), поскольку сходство RAPD-паттернов разных клонов внутри вида гораздо выше (82-89% для U. setigera; 92% для U. binucleata), чем у представителей разных видов (35% между U. setigera и U. transfuga, 39% между U. binucleata и U. transfuga, 34% между U. setigera и U. binucleata) (Chen et al., 2003).
Использование метода RAPD для исследования внутривидового полиморфизма морфологического вида Е. octocarinatus, который по результатам скрещиваний разделен на несколько сингенов, привело к выявлению неких «групп клонов». Однако из-за отсутствия у автора возможности определить сингенную принадлежность исследованных клонов значение полученных данных неочевидно (Mollenbeck, 1999).
В то же время из-за очень высокой внутривидовой вариабельности использование метода RAPD иногда оказывается неэффективным. Так, неудачной оказалась попытка идентификации морфологически сходных видов рода Diophrys — отличия внутри вида и между представителями разных видов были сопоставимы (Chen, Song, 2002).
Метод RAPD неоднократно применяли для сравнительного исследования популяций и сингенов внутри нескольких морфологических видов рода Paramecium. Так, RAPD был использован для сравнительного анализа сингенов P. caudatum (Stoeck et al., 2000b). Говоря об этой работе, следует отметить, что при употреблении терминов «сингены» и «виды-двойники» в литературе возникает некоторая путаница. Сингены - репродуктивно изолированные группы внутри вида. Виды-двойники - близкородственные виды, неотличимые по морфологическим характеристикам, но репродуктивно изолированные и имеющие ряд молекулярных и биохимических отличий. Наличие сингенов характерно для многих видов инфузорий. Лишь в некоторых случаях, когда удается обнаружить существенные молекулярные и физиологические различия между сингенами, им присваивают статус видов-двойников. Некоторые авторы, к числу которых относятся и Шток с соавторами, употребляют эти два термина как синонимы. Авторы пишут, что ставили перед собой цель проверить, существуют ли сингены внутри вида P. caudatum. На самом деле более правильно было бы сформулировать их задачу как проверку того, можно ли считать сингены Р. caudatum видами-двойниками, поскольку наличие собственно сингенов, то есть репродуктивно изолированных групп, внутри вида P. caudatum не вызывает сомнений (Gilman, 1941; Осипов, 1963; Tsukii, Hiwatashi, 1985 и др.). Во избежание путаницы в данной диссертации при описании работ разных авторов мы будем использовать термины «сингены» и «виды-двойники» именно в тех значениях, которые были приведены выше. Метод RAPD (было проанализировано пять различных праймеров) не выявил никаких отличий между представителями семи сингенов P. caudatum, что подтверждает данные о том, что сингены P. caudatum филогенетически очень близки и не являются истинными видами-двойниками (Stoeck et al., 2000). Аналогичные данные были получены и Тзуки на большой выборке клонов (Tsukii, 1996).
Метод RAPD был успешно применен для сравнительного анализа представителей девяти распространенных в Европе видов комплекса P. aurelia: P. primaurelia, P. biaurelia, P. triaurelia, P. tetraurelia, P. pentaurelia, P. sexaurelia, P. octaurelia, P. novaurelia и P. tredecaurelia (Stoeck, Schmidt, 1998). Перебрав несколько десятков праймеров, авторам удалось подобрать единственный (последовательность 5л -GCAGAGAAGG-3л), с помощью которого оказалось возможным однозначно различить все анализируемые виды, в том числе и виды P. primaurelia и P. pentaurelia, которые неотличимы с помощью большинства других методов. Каждый вид имел свой уникальный паттерн RAPD, и клоны одного вида имели идентичные паттерны вне зависимости от их географического происхождения. Только в случае P. octaurelia были обнаружены внутривидовые отличия: на RAPD-паттерне клона из Уганды был один дополнительный бэнд по сравнению с клоном из Панамы. При этом все представители P. aurelia принципиально отличались по RAPD-паттерну от представителей P. caudatum. На основании полученных результатов авторы предложили использовать метод RAPD для относительно легкой и быстрой идентификации вновь выделенных в природе представителей комплекса P. aurelia. Используя предложенный метод, авторы определили видовую принадлежность десяти ранее неопределенных ими клонов P. aurelia. По результатам RAPD четыре клона были отнесены к виду P. novaurelia, а шесть — к P. biaurelia. Позже результаты были подтверждены реакциями скрещивания (Stoeck, Schmidt, 1998). Таким образом, при правильном подборе праймера метод RAPD позволяет различать виды-двойники комплекса P. aurelia. В то же время следует еще раз отметить, что хотя метод RAPD позволяет однозначно идентифицировать виды комплекса P. aurelia, он не дает представления о филогенетических взаимоотношениях исследуемых видов. Так, на приведенных авторами фотографиях RAPD-паттерны таких близкородственных видов как P. primaurelia и P. pentaurelia отличаются столь же значимо, как и RAPD-паттерны значительно более далеких друг от друга P. pentaurelia и P. sexaurelia. Таким образом, не удается обнаружить прямой связи между филогенетической близостью видов и степенью сходства их RAPD-паттернов.
Успешное использование метода RAPD для определения видовой принадлежности разных представителей комплекса P. aurelia побудило исследователей применить этот метод и для анализа внутривидового разнообразия для отдельных видов комплекса. Для некоторых видов комплекса было показано существование субгрупп, или рас — относительно генетически изолированных групп внутри генетического вида (Stoeck et al., 1998).
Совместное использование метода RAPD и внутри- и межклональных скрещиваний с последующим анализом выживаемости потомков в F1 (после конъюгации) и F2 (после последующей автогамии) для исследования видов P. triaurelia и P. sexaurelia позволило получить интересные результаты. RAPD-паттерны тринадцати клонов P. triaurelia оказались похожими, но детальное сравнение показало наличие дополнительных, специфичных для конкретных популяций, бэндов. По наличию/отсутствию таких бэндов внутри вида P. triaurelia выделили три подгруппы, или «генотипа», как их называют авторы. При этом не удалось обнаружить никакой корреляции между географическим происхождением клона и его RAPD-паттерном. Так, первый вариант RAPD-паттерна был обнаружен у одного из клонов, изолированных в Румынии, у одного из чешских, одного из польских, двух украинских клонов, а также у типового для вида клона 324, изолированного в США. Второй вариант был обнаружен у другого клона из Румынии и второго чешского клона. Третий вариант обнаружили у двух клонов из Польши и трех испанских клонов. Таким образом, клоны из близкорасположенных популяций имели разные RAPD-паттерны, а RAPD-паттерны клонов из сильно удаленных географических районов в некоторых случаях оказывались идентичными. Во всех межклональных скрещиваниях внутри вида P. triaurelia процент выживаемости потомков F1 и F2 был очень высок (не менее 92%, чаще 94% и более) и не зависел от географического происхождения клонов, участвующих в конъюгации.
Совсем другую картину наблюдали при анализе шести клонов Р. sexaurelia. Как и в случае P. triaurelia, несмотря на то, что RAPD-паттерны всех проанализированных клонов были похожи друг на друга и на паттерн типового для вида клона 159 из Пуэрто-Рико, на основании единичных дополнительных бэндов RAPD-паттерна удалось выделить четыре генотипа внутри вида. Однако в случае P. sexaurelia разные генотипы были «привязаны» к разным географическим районам. Так, первый вариант RAPD-паттерна обнаружили у двух клонов из Испании, второй — у двух клонов из
Германии, третий у греческого клона, четвертый - у типового клона 159 из Пуэрто-Рико. При скрещивании клонов из Испании друг с другом наблюдали такой же высокий процент выживаемости потомков в обоих поколениях, как и при внутриклональных конъюгациях (98% и более). При скрещивании испанских клонов с типовым клоном 159 в поколении F1 выживало 95% потомков и более, а в поколении F2 — 40% в случае одного из испанских клонов и 11% в случае другого. В то же время испанские клоны, как и клон 159, не вступали в конъюгацию с клонами из Германии в лабораторных условиях. На основании полученных данных авторы пришли к выводу о существовании генетически изолированных популяций внутри вида P. sexaurelia. Сопоставление данных, полученных при исследовании методом RAPD, и результатов межклональных скрещиваний для разных популяций P. sexaurelia позволило построить дендрограмму (Przybos, Rau-tian et al., 2007), определяющую степень расхождения разных клонов этого вида. Важно, однако, помнить, что метод RAPD, основанный на случайной амплификации неизвестных последовательностей, не может являться определяющим методом при филогенетических построениях (Landry, Lapointe, 1996).
Наличие генетической изоляции популяций внутри вида P. sexaurelia и отсутствие генетической изоляции популяций P. triaurelia авторы связывают с двумя разными типами «жизненных стратегий» этих видов (Stoeck et al., 1998). Как было сказано выше, среди инфузорий выделяют инбриде-ров, имеющих короткий период незрелости и размножающихся преимущественно на ограниченных территориях, и аутбридеров, имеющих длинный период незрелости, позволяющий вступать в половой процесс представителям относительно удаленных популяций. В результате можно ожидать, что у видов-инбридеров будет быстрее происходить накопление различий в локальных популяциях, в том числе приводящее и к возникновению внутривидовых репродуктивных барьеров. Согласно данным, полученным Штоком с соавторами, представителей P. sexaurelia можно отнести к выраженным инбридерам, в то время как представители P. triaurelia больше тяготеют к аутбридности (Stoeck et al., 1998).
Представители P. jenningsi (Diller, Earl, 1958), сестринского вида для комплекса P. aurelia (Striider-Kypke et al., 2000b), морфологически очень похожи на последних, что затрудняет определение видовой принадлежности клонов. Оказалось, что метод RAPD позволяет отличить представителей комплекса P. aurelia и P. jenningsi (Skotarczak et al., 2004). В то же время по результатам сравнительного анализа девяти клонов P. jenningsi методом RAPD (использовали четыре различных праймера) сами представители P. jenningsi распались на две группы: в одну группу попали шесть клонов из Японии, которые оказались отделены от остальных как по результатам скрещивания, так и по RAPD-паттерну; в другую - клоны из Индии, Саудовской Аравии и Китая (Skotarczak et al., 2004). Аналогичные результаты были получены и при исследовании девяти клонов P. jenningsi методом CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence): паттерн рестрикции последовательности гена hsp70 одной из использованных эндонук-леаз, Tru II, позволял отличить группу клонов из Японии от остальных (Maciejewska, 2006). Обнаруженная генетическая изоляция части популяций внутри P. jenningsi говорит о возможном наличии сингенов внутри этого вида. В то же время для окончательного ответа на вопрос о структуре данного вида необходимо более детальное исследование.
ARDRA
Метод ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis - pe-стрикционный анализ амплифицированных рибосомных ДНК) основан на амплификации в ПЦР гена 16S или 18S рРНК и последующей рестрикции полученного продукта мелкощепящей рестриктазой.
Выбор ферментов для рестрикции зависит от анализируемой последовательности. Поскольку в данном случае амплифицируется относительно консервативная последовательность рДНК, этот метод позволяет не только оценить разнообразие внутри изучаемой группы, но и делать выводы о филогенетической близости сравниваемых видов. Метод ARDRA успешно используется для сравнительных исследований видов-двойников. Например, этот метод оказался наиболее удачным для идентификации видовой принадлежности восьми клонов трех видов рода Diophrys: D. арреп-diculata, D. oligothrix и D. scutum (Chen, Song, 2002). Во всех случаях длина амплифицированного фрагмента рибосомной ДНК была одинакова - 3000 п.н. В результате дальнейшего тестирования двенадцати ферментов было показано, что по паттерну рестрикции, получаемому с помощью одного из них {Hinf I), можно однозначно отличить все три вида Diophrys. При использовании другого фермента {Msp I) можно было легко отличить два морфологически похожих вида, D. appendiculata и D. oligothrix, но паттерны рестрикции D. scutum и D. appendiculata были одинаковы. При использовании Msp I также обнаружили и внутривидовые отличия для вида D. oligothrix (Chen, Song, 2002).
Использование метода ARDRA оказалось эффективным и при сравнительном анализе двух морфологически похожих видов рода Uronychia, U. setigera и U. binucleata. При рестрикции полученной амплифицирован-ной рибосомной ДНК (3000 п.н.) с использованием двух из десяти исследованных ферментов, Msp I и Alu I, удавалось отличить два из трех проанализированных видов (Chen et al., 2003). Паттерн рестрикции Msp I для трех клонов U. setigera и единственного исследованного клона U. transfuga был идентичным, а три клона U. binucleata отличались; использование Alu I также позволяет отличить представителей U. transfuga и U. setigera от U. binucleata, поскольку для представителей последнего характерно наличие видоспецифичного продукта рестрикции размером около 400 п.н.
В 1996 году данный метод был применен и для идентификации видов Tetrahymena (Jerome, Lynn, 1996). Для исследования была выбрана последовательность, содержащая как консервативные районы (фрагмент 18S рДНК и 5,8S рДНК), так и более вариабельные участки (ITS1, ITS2; Internal Transcribed Spacers - внутренние транскрибируемые спейсеры в гене рРНК). Оказалось, что при использовании восьми различных ферментов некоторые виды (Т. malaccensis, Т. pyriformis, Т. mimbres, Т. asiatica, Т. ет-pidokyrea, Т. corlissi) могут быть однозначно идентифицированы данным методом, в то время как другие виды неотличимы. К числу последних относятся четыре пары видов (Т. tropicalis - Т. furgasoni, Т. hegewischi -T.americanis, Т. thermophila - Т. elliotti и Т. borealis - Т.canadensis) и еще восемь видов, имеющих идентичные паттерны рестрикции по всем проанализированным эндонуклеазам (Т. pigmentosa, T.nipissingi, Т. sonneborni, Т. nanneyi, Т. cosmopolitanis, Т. aastralis, Т. capricornis и Т. hyperangularis). Для двух видов был проведен сравнительный анализ разных клонов, но внутривидового полиморфизма выявлено не было.
Несмотря на успешное использование метода ARDRA для идентификации различных видов, он имеет и определенные ограничения. Поскольку в данном случае анализируется достаточно консервативная последовательность рДНК, при исследовании филогенетически очень близких групп организмов данный метод оказывается неэффективным. Так, было показано, что даже в относительно вариабельных участках рДНК, ITS1 и ITS2 последовательности некоторых видов комплекса P. aurelia оказываются идентичными (Coleman, 2005). Тем более неудивительно, что метод ARDRA не выявил отличий между филогенетически еще более близкими сингенами P. caudatum (Stoeck et al., 2000b).
Последняя из обнаруженных нами в литературе попытка тщательного анализа представителей комплекса P. aurelia с помощью сразу нескольких молекулярных методов - RAPD, ARDRA и ПЦР-RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism, полиморфизм длин фрагментов рестрикции) - показала, что виды группируются совершенно по-разному в зависимости от используемого метода (Przybos, Prajer et al., 2007). Эти результаты еще раз подтверждают, что ни один из этих методов сам по себе не может служить основой для филогенетических построений.
Гибридизация in situ
Метод гибридизации in situ - гибридизации специальным образом фиксированных целых клеток с меченым видоспецифичным олигонуклео-тидным зондом (обычно используется флуоресцентное мечение), широко применяют как при изучении бактерий (Amann et al., 1995), так и в протис-тологических экспериментах (Petroni et al., 2003; Schmidt et al., 2006, и др.). Этот метод оказался эффективным для идентификации трех морфологических сходных видов Euplotes — Е. crassus, Е. vannus и Е. minuta (Petroni, 2003). Проанализировав последовательность рДНК малой субъединицы рибосомы и выбрав вариабельные участки, авторы подобрали видоспецифичные зонды, позволившие им идентифицировать представителей всех трех исследуемых видов. При этом для исключения ошибки авторы предлагают использовать для каждого вида не менее двух специфичных зондов.
Этот же метод был применен в 2006 году для идентификации представителей двух видов-двойников S. lemnae и S. mytilus (Schmidt et al., 2006). Несмотря на то, что использованная последовательность рДНК малой субъединицы рибосомы у этих двух видов отличалась только одним нуклеотидом, авторам удалось получить зонд, позволявший однозначно определить видовую принадлежность всех проанализированных клонов этих двух видов.
Филогенетический анализ и секвенирование нуклеотидных последовательностей
Секвенирование и последующий анализ различных последовательностей ДНК позволяет судить о филогенетических взаимоотношениях как разных видов, так и сингенов внутри одного вида. В настоящее время для многих широко используемых модельных объектов построено по несколько филогений на основании анализа различных последовательностей. Зачастую различные молекулярные филогении существенно противоречат друг другу. Эта проблема все чаще встает перед исследователями самых разных организмов. При выборе между различными филогенетическими построениями в первую очередь необходимо учитывать, что молекулярная филогения не должна быть оторвана от других сравнительных исследований. «Хорошая» молекулярная филогения должна подтверждаться множеством других сравнительных данных. На данный момент для построения молекулярных филогений используют несколько основных нуклеотидных последовательностей: ДНК малой субъединицы рибосомы (16S и 18S рДНК); ITS 1 и ITS 2; гены гистонов; гены шаперонов Hsp70; последовательность митохондриального гена цитохром-оксидазы и др.
Попытки определить филогенетические взаимоотношения представителей Tetrahymena предпринимались неоднократно (см. Nanney, 1984). Наиболее ранние классификации были основаны на морфологических и экологических особенностях разных видов. Корлисс (Corliss, 1972, цит. по Striider-Kypke et al., 2001) выделил внутри рода Tetrahymena три комплекса видов: Т. pyriformis, включающий мелкие свободноживущие, питающиеся бактериями виды; Т. rostrata, включающий более крупные паразитические или питающиеся падалью виды, способные формировать цисты; наконец, Т. patula. Внутри этих комплексов виды отличались по способности/неспособности к перекрестной конъюгации и по изоферментному паттерну. Причем комплекс Т. pyriformis, включающий 22 свободноживущих вида, согласно этой концепции оказывался в основании рода.
По мере развития молекулярной биологии для филогенетических построений внутри рода стали использовать анализ различных последовательностей ДНК (рис. 1). Результаты секвенирования 190-н. фрагмента последовательности 23 S рРНК для 29 видов Tetrahymena (Nanney et al., 1998) в целом совпали с полученными ранее данными секвенирования 5.8S рДНК (Preparata et al., 1989, цит. по Nanney et al., 1998). Исследованные виды разделились на пять групп: группу Т. americanis (С), в которую вошли виды Т. asiatica, Т. americanis, Т. australis, Т. hegewischi, Т. hyper-angularis, Т. nanneyi, Т. nipissingi, Т. pigmentosa, Т. capricornis, Т. sonneborni, Т. patula\ группу Т. pyriformis (В), к которой были отнесены Т. leuco-phrys, Т. vorax, Т. pyriformis и Т. silvana; группы Т. tropicalis (виды Т. fur-gasoni и Т. tropicalis) и Т. borealis {Т. mimbres.T. borealis и Т. canadensis), вместе формирующие кластер А2; группу Т. thermophila (Al), в которую вошли виды Т. elliotti.T. malaccensis и Т. thermophila (Nanney et al., 1998). При этом последовательности 5.8S рДНК и 23S рРНК оказалась слишком консервативными для определения положения видов внутри выделенных кластеров - секвенированные фрагменты оказались идентичными для многих видов Tetrahymena.
В 1986 году была секвенирована последовательность гена РНК малой субъединицы рибосом 13 видов Tetrahymena, и исследовано положение сайтов для эндонуклеаз внутри анализируемого гена (Sogin et al., 1986). Следует отметить, что и в этом случае некоторые виды имели идентичные последовательности. На основании полученных данных исследованные виды были разделены на две ветви - «australis» и «borealis». В первую группу попали виды Т. capricornis, Т. pigmentosa, Т. hyperangidaris, Т. nanneyi, Т. patula, Т. hegewischi, Т. australis (Sogin et al., 1986). Внутри второй можно выделить два самостоятельных кластера видов: к одному относятся виды Т. malaccensis и Т. thermophila; а к другому — Т. tropicalis, Т. pyriformis, Т. borealis и Т. canadensis. Причем последние два вида во втором кластере очень близки, а каждый из двух оставшихся формирует отдельную веточку филогенетического дерева. Позже эта работа была продолжена и расширена. В 2001 году помимо уже имеющихся последовательностей были дополнительно секвенированы последовательности 18S рДНК еще для нескольких видов рода Tetrahymena (Striider-Kypke et al., 2001). Полученные результаты подтвердили наличие двух основных ветвей, «australis» и «borealis», внутри рода Tetrahymena. Причем оказалось, что если эволюционные расстояния внутри каждой из этих двух групп очень малы, то между представителями разных групп они более выражены. При этом положение видов внутри кластеров «australis» и «borealis» зависит от способов обработки данных. При сопоставлении полученных в результате анализа 18S рДНК данных с данными секвенирования 5.8 и 23S рРНК наблюдается хорошее соответствие. Группа «australis» соответствует рибогруппе С (группа Т. americanis). Вторая группа, «borealis», более гете-рогенна и включает в себя рибогруппы A (Al: Т. thermophila), А2 (Т. tropi-calis/borealis) и В (Г. pyriformis) (Striider-Kypke et al., 2001). Существенным результатом данной работы по анализу 18S рДЬЖ является вывод о том, что классификация представителей Tetrahymena по принципу «свободно-живущие — гистофаги» не отражает реальную эволюцию рода, так как гис-тофагия, по-видимому, несколько раз возникала параллельно в разных ветках питающихся бактериями Tetrahymena. В целом, последовательность рРНК является слишком консервативной для определения тонких филогенетических взаимоотношений между столь близкородственными видами, как представители рода Tetrahymena (Sogin et al., 1986; Nanney et al., 1998; Striider-Kypke et al., 2001).
Межгенный участок между генами гистонов Н311 и Н411, вместе с 5'-концами обоих генов - последовательность, содержащая как высоко консервативные, так и высоко вариабельные участки генома. Данная последовательность была секвенирована для 29 видов Tetrahymena и вида Glaucoma chattoni в качестве аутгруппы (Sadler, Brunk, 1992). Длина последовательности гистонов Н311/Н411 варьировала от 521 п.н. у Glaucoma chattoni до 563 п.н. у Т. paravorax. Разница по числу отличающихся нук-леотидов в последовательности варьировала от одного (между Т. sonne-borni и Т. hyperangularis) до 242 (между G. chattoni и Т. paravorax). Филогенетические деревья, построенные на основании полной последовательности и одного только межгенного спейсера, совпадали. Хотя разные способы обработки данных дают несколько отличающиеся результаты, во всех случаях исследованные виды разделились на пять кластеров. Первый кластер содержит 11 видов, которые настолько близки друг к другу, что их взаиморасположение внутри кластера не вполне очевидно, и соответствует группе Т. americanis (С), выделенной на основании данных секвенирования 23S рРНК (Nanney et al., 1998); второй включает в себя группу Т. pyriformis (В) и вид Т. setosa; третий соответствует группе Т. thermophila (Al); четвертый включает группу Т. borealis и вид Т. rostrata; пятый — вид Т. limacis и группу Т. tropicalis. Взаимоположение же кластеров несколько отличается в зависимости от способа анализа результатов (Sadler, Brunk, 1992). Таким образом, полученные данные прекрасно совпадают с результатами секвенирования 18S рДНК для 13 видов Tetrahymena (Sogin et al., 1986) (рис. 1) и в целом не противоречат данным секвенирования гена 23 S рРНК (Nanney et al., 1998), на основании которых 29 видов комплекса Tetrahymena были разделены на пять кластеров. Единственное расхождение разных филогенетических деревьев касается того, что по одним данным виды Т. borealis и Т. rostrata оказываются близкородственными Т. tropicalis, а по другим Т. borealis и Т. rostrata группируются вместе с Т. pyriformis.
По сравнению с ядерной ДНК ДНК митохондрий характеризуется более высокой скоростью фиксации изменений. Поскольку митохондри-альные гены менее консервативны, их анализ теоретически может позволить разделять виды, которые оказываются идентичными при сравнительном анализе рДНК. Поэтому митохондриальные последовательности часто используют для изучения филогеографии на низких таксономических уровнях. В 2006 году был проведен сравнительный анализ 980 н. последовательности из митохондриального гена цитохромоксидазы 1 (COl) для восьми видов комплекса Т. pyriformis (Lynn, Striider-Kypke, 2006). При сравнении данной последовательности для 14 клонов Т. thermophila (по два клона каждого из семи типов спаривания) отличий практически не было обнаружено. При сравнении этим методом четырех пар видов Tetrahymena, имеющих идентичные последовательности 18S рДНК (Т. pyriformis и Т. setosa; Т. canadensis и Т. rostrata; Т. pigmentosa и Т. hyperangularis; Т. tropicalis и Т. mobilis), отличия по нуклеотидному составу между видами варьировали от 1% до 12.4%. Во всех случаях виды, имеющие идентичные
Рис 1. Молекулярные филогении рода Tetrahymena, построенные на основании анализа нуклеотидных последовательностей межгенного промежутка и генов гистонов НЗ11 и Н411 (A) (Sadler, Bmnk, 1992) и 18S рДНК (Б -Striider-Kypke et al., 2001), (В - Sogin et al., 1986). Разными цветами выделены кластеры, включающие те виды, которые были использованы во всех трех работах. последовательности рДНК, отличались по нуклеотидному составу исследуемой последовательности гена COl. При этом у пар видов, идентичных по последовательности рДНК, нуклеотидные замены в гене COl были синонимичными. Было также обнаружено по крайней мере 9 позиций, по которым существовали межвидовые отличия в аминокислотном составе ци-тохромоксидазы 1. То есть, при низкой вариабельности по крайней мере внутри одного вида, Т. thermophila, сравнительный анализ последовательности митохондриального гена цитохромоксидазы 1 позволяет отличить виды, неотличимые по последовательностям рДНК (Lynn, Striider-Kypke, 2006).
Таким образом, при секвенировании различных последовательностей ДНК во всех случаях род Tetrahymena разбивается на группы видов одинаково. В то же время филогенетические взаимоотношения между видами внутри каждой из групп менее понятны.
Ситуация внутри рода Paramecium несколько иная. Морфологические виды этого рода сильно дивергировали друг от друга (см. выше) и хорошо отличаются на основании морфологических критериев. В то же время практически все они разделены на сингены или виды-двойники, которые зачастую группируются по-разному при анализе разных нуклеотидных последовательностей.
P. bursaria, P. multimicronucleatum, P. caudatum
В 2006 году была предпринята попытка проследить филогенетические взаимоотношения между несколькими клонами P. bursaria на основе сравнения последовательностей 18S рДНК и ITS (Hoshina et al., 2006). Исследуемые клоны P. bursaria относились к двум разным сингенам, кроме того, для нескольких клонов не была определена сингенная принадлежность. По результатам секвенирования 18S рДНК 13 исследованных клонов P. bursaria были объединены в четыре группы. При попарном сравнении различия между группами составляли от 2 до 23 замен; кроме того, было обнаружено несколько инсерций/делеций. В качестве дополнительного контроля исследуемые последовательности были проанализированы также для двух клонов P. multimicronucleatum, двух представителей комплекса P. aurelia (P. primaurelia и P. tetraurelia) и трех клонов P. caudatum, относившихся к двум разным сингенам. Последовательности 18S рДНК двух клонов P. multimicronucleatum отличались на 5 нуклеотидов, так же как и последовательности P. primaurelia и P. tetraurelia; между последовательностями трех исследованных клонов P. caudatum различий не было обнаружено. Таким образом, отличия между двумя клонами P. multimicronucleatum были не менее выражены, чем отличия между двумя разными видами комплекса P. aurelia, а различия между разными группами P. bursaria были в некоторых случаях даже более значительными.
По результатам сравнения последовательностей ITS2 клоны P. bursaria были объединены в шесть групп; разница между группами составляла 2-3 нуклеотида. При этом последовательности ITS2 разных клонов внутри P. multimicronucleatum и P. aurelia отличались на 6 нуклеотидов. Для P. caudatum различий и в этом случае обнаружено не было. Следует отметить, что в зависимости от типа анализируемой последовательности (18S рДНК или ITS) объединение клонов в группы происходило по-разному. Тем не менее в обоих случаях в отдельную группу попали клоны из Азии и Океании, в то время как остальные группы были сформированы из клонов европейского происхождения. При анализе структуры ITS представителей P. bursaria не было обнаружено СВС (Compensatory Base Change; компенсаторные замены нуклеотидов в рДНК; позволяют сохранить вторичную структуру РНК, шпильку, с соблюдением правила ком-плементарности оснований после того, как в результате мутации изменяется один из формирующих участок комплементарности нуклеотидов). В случае P. multimicronucleatum СВС были обнаружены. Существует гипотеза, что обнаружение СВС при сравнении структуры ITS двух клонов является однозначным признаком того, что клоны относятся к разным видам (Coleman, 2005, см. ниже). В то же время, обратное не всегда справедливо - клоны, для которых СВС не обнаружены, также могут принадлежать к разным видам. Таким образом, в случае P. bursaria секвенирование разных последовательностей ДНК приводит к различным результатам, и реальные филогенетические взаимоотношения сингенов этого морфологического вида остаются невыясненными. При этом обнаружение СВС при сравнении последовательностей ITS двух клонов P. multimicronucleatum указывает на возможное существование видов-двойников внутри этого морфологического вида.
Анализ нуклеотидной последовательности гена митохондриальной цитохромоксидазы I (COl) у нескольких десятков клонов пяти сингенов Р. bursaria показал, что клоны каждого сингена формируют отдельный четкий кластер. При этом филогенетическое расстояние между кластерами достаточно велико, чтобы предполагать длительную дивергенцию сингенов этого морфологического вида (Т. Берендонк, А.А. Потехин, неопубл.).
Для исследования вариабельности внутри морфологических видов Р. caudatum и P. multimicronucleatum использовали также последовательность размером 500 н., содержащую внутренние транскрибируемые спейсеры ITS1 и ITS2 вместе с расположенным между ними геном 5.8S рибосомной РНК, и более вариабельную последовательность гена COl (Barth et al., 2006). Было исследовано девять клонов P. caudatum и восемь клонов Р. multimicronucleatum, но сингенная принадлежность анализируемых клонов была неизвестна. По результатам анализа фрагмента рибосомной ДНК все представители рода P. caudatum оказались идентичны, в то время как представители рода P. multimicronucleatum разделились на две группы.
По результатам сравнения последовательности гена COl клоны Р. caudatum разделили на две группы с дивергенцией не более 1.2% внутри каждой группы. Клоны P. multimicronucleatum сформировали такие же две группы, как и в случае анализа фрагмента рибосомной ДНК, но если одна из групп (включавшая 3 клона) была однородна, то внутри второй (из 5 клонов) отличия достигали 6 %. Если говорить о последовательности аминокислот, то у всех представителей морфологического вида P. caudatum она оказалась идентична, за исключением замены одной аминокислоты у одного из клонов. Внутри каждой из двух групп внутри вида P. multimicro-nucleatum состав аминокислот в выбранном фрагменте также был идентичен, но между собой группы отличались по шести аминокислотным остаткам.
Таким образом, внутривидовая вариабельность внутри вида P. caudatum оказалась очень низка. В то же время данные секвенирования как 18S рДНК (Hoshina et al., 2006), так и ITS и COl (Barth et al., 2006) говорят о высокой дивергенции клонов внутри P. multimicronucleatum.
P. aurelia
В 1998 году для представителей семи видов комплекса P. aurelia {Р. biaurelia, P. triaurelia, P. tetraurelia, P. sexaurelia, P. octaurelia, P. trede-caurelia, P. sonneborni) и одного клона сестринского для этого комплекса видов морфологического вида P. jenningsi был секвенирован короткий (190 н.) фрагмент последовательности 23S рРНК (Nanney et al., 1998). При этом для каждого вида комплекса P. aurelia было исследовано только по одному клону. Такая небольшая выборка видов и клонов внутри вида, а также относительная изменчивость и малая длина (190 п.н.) выбранного для секвенирования участка не позволили получить однозначных результатов. Так, согласно полученным данным раньше всех от общего ствола дивергировал вид P. sonneborni, а только потом — морфологический вид P. caudatum. Далее отделился еще один морфологический вид, P. jenningsi, и P. triaurelia, а потом разошлись остальные виды комплекса. Интересно, тем не менее, что по результатам секвенирования 18S рДНК (Striider-Kypke et al., 2000b) P. jenningsi также оказался очень близок к видам-двойникам комплекса Р. aurelia и при двух из четырех использованных способов анализа данных оказывался филогенетически даже ближе к P. primaurelia, чем другой вид комплекса P. aurelia — P. tetraurelia (см. выше). По данным же секвениро-вания гена гистона Н4 клоны P. jenningsi сформировали два кластера (Ма-ciejewska, 2007). В один из этих кластеров входили клоны из Японии, второй был образован клонами из Индии, Китая и Саудовской Аравии. Эти данные полностью соответствовали результатам анализа клонов этого вида методом RAPD (Skotarczak et al., 2004). При этом разные клоны P. jenningsi были «перемешаны» на филогенетическом древе с клонами разных видов-двойников комплекса P. aurelia (Maciejewska, 2007).
Коулман провела сравнительный анализ последовательности ITS1-5.8S рДНК-1Т82 тринадцати из пятнадцати видов комплекса P. aurelia. Различия между видами оказались так незначительны, что филогенетические построения оказались невозможны. Так, например, анализируемая последовательность ITS2 оказалась одинаковой у представителей Р. triaurelia, P. pentaurelia и одного из двух исследованных клонов P. primaurelia, а у второго проанализированного клона P. primaurelia отличалась. Тем не менее, по результатам проведенного исследования были выделены несколько групп внутри комплекса P. aurelia. В одну группу были объединены виды P. triaurelia, P. pentaurelia и P. primaurelia, имеющие одинаковую первичную последовательность, а также вид P. septaurelia, поскольку ITS2 этих четырех видов имели сходную вторичную структуру. Виды P. tetraurelia и P. novaurelia имели идентичные ITS2 и образовали вторую группу. Третью группу составили виды P. octaurelia и P. dode-caurelia. Также по результатам сравнительного анализа вторичной структуры ITS2 в одну группу были объединены виды P. biaurelia, P. sexaurelia и P. tredecaurelia, причем автор считает, что эти три вида сильнее отличаются от остальных, чем представители первых трех групп друг от друга (Coleman, 2005). Тем не менее, тот факт, что по крайней мере в случае одного вида, P. primaurelia, было показано, что внутривидовой полиморфизм превышает межвидовой, говорит о том, что данную последовательность нельзя рассматривать как удачную для филогенетических построений внутри комплекса P. aurelia.
Ранее в результате исследований других эукариот Коулман обнаружила некий консенсус из 111-116 п.н. в последовательности ITS2 (Coleman, 2000, 2003, цит. по Coleman, 2005) и выявила определенную закономерность:
1) Если при спаривании двух организмов образуется полноценное потомство, их ITS2 должны быть идентичны в зоне данного консенсуса, в то время как обратное верно не всегда.
2) Если у двух организмов в районе консенсуса есть хоть одна СВС (см. выше), они не могут скрещиваться, или даже образовывать пары.
Эта концепция прекрасно соотносится с данными секвенирования ITS2 Р. aurelia. В соответствии с (1), только внутривидовые скрещивания (идентичные последовательности консенсуса) дают жизнеспособные линии, в то время как разные виды с одинаковыми последовательностями ITS2 при скрещивании не дают плодовитого потомства. Для одного из таких видов (P. quadecaurelia) вообще не показана способность образовывать конъю-гантные пары с представителями других видов (Wichtermann, 1986). В соответствии с (2), СВС для всех видов комплекса P. aurelia отсутствуют. На основании выявленных закономерностей Коулман был предложен термин «Z-клада» — группа организмов, внутри которой возможно образование пар, хотя потомство может и не выживать (Coleman, 2000, 2003, цит. по Coleman, 2005). С этой точки зрения в комплексе P. aurelia можно выделить 7 таких групп: каждый из видов P. biaurelia, P. sexaurelia, P. unde-caurelia, P. tredecaurelia, P. quadecaurelia, P. sonneborni образует самостоятельную группу, а остальные виды комплекса вместе формируют седьмую «Z-кладу». Интересно, что пять видов-двойников рода Drosophila (Young, Coleman, 2004, цит. по Coleman, 2005) входят в одну «Z-кладу» и не отличаются даже по полу-СВС (замена нуклеотида без сохранения комплемен-тарности в конкретной паре, не приводящая к изменению вторичной структуры РНК). В случае же комплекса видов-двойников P. aurelia полу-СВС были обнаружены. Результаты изоферментного анализа (Allen, Adams, 1983, цит. по Coleman, 2005) также показали, что дивергенция видов внутри комплекса P. aurelia выше, чем в случае видов-двойников Dro-sophila.
В 2006 году впервые было опубликовано филогенетическое дерево, включающее в себя все виды комплекса P. aurelia (Hon et al., 2006). Последовательность гена цитозольного шаперона hsp70c (416 п.н.) была сек-венирована для представителей всех пятнадцати видов-двойников комплекса P. aurelia, нескольких клонов P. jenningsi, а также семи сингенов Р. caudatum. Оказалось, что виды P. primaurelia и P. decaurelia имеют идентичные фрагменты hsplOc, далее несмотря на то, что для обоих видов анализировали по два клона. Они, вместе с видом P. pentaurelia, сформировали единый кластер. При сравнительном анализе последовательностей в основном были обнаружены синонимичные замены в третьем положении ко-дона, так что аминокислотный состав соответствующего белка у большинства видов идентичен. Однако в случае видов P. triaurelia, P. septaurelia и P. dodecaurelia находили и несинонимичные замены, что говорит о том, что эти виды дивергировали от остальных. Одну несинонимичную замену обнаружили также в случае видов P. novaurelia, P. tredecaurelia и P. quade-caurelia.
Результаты построенной по этим данным филогении хорошо согласуются с данными по межвидовым скрещиваниям внутри комплекса Р. aurelia. Так, единый кластер в основании дерева сформировали очень близкие, способные образовывать межвидовые конъюгантные пары, виды Р. tetraurelia и P. octaurelia (Haggard, 1974). Два вида, P. primaurelia и Р. pentaurelia, также способные к образованию конъюгантных пар (Sonneborn, Dippell, 1946) и неотличимые по данным изоферментного анализа (Tait, 1970; Adams, Allen, 1975), также формируют единый кластер вместе с видом P. decaurelia. Виды P. triaurelia и P. septaurelia, представители которых также способны образовывать межвидовые конъюгантные пары друг с другом (Sonneborn, Dippell, 1946), оказались достаточно близки и образуют общий кластер вместе с видом P. dodecaurelia. Виды Р. Ы-aurelia, P. sexaurelia, P. novaurelia, P. undecaurelia, P. tredecaurelia, Р. quadecaurelia и P. sonneborni неспособны к межвидовым конъюгациям. По результатам анализа последовательности hsp70c все эти виды, за исключением P. biaurelia, дивергировали от остальных видов. Каждый из них образует самостоятельную веточку филогенетического дерева.
Интересно, что все проанализированные клоны P. jenningsi, формируя отдельную ветвь внутри комплекса P. aurelia, оказались наиболее близкородственны виду P. sonneborni.
Совершенно иную картину получили при секвенировании гена гис-тона Н4 для одиннадцати видов комплекса P. aurelia (Przybos, Prajer et al., 2007). Полученное филогенетическое дерево никак не совпадало ни с данными секвенирования гена шаперона hsplO (Hori et al., 2006), ни с какими-либо другими результатами сравнительных исследований видов комплекса P. aurelia. Важно отметить, что в данном исследовании авторы использовали только по одному клону каждого вида, в то время как в работе по сек-венированию гена hsp70 исследовали по два-три клона для каждого вида. Этот факт в совокупности с тем, что филогенетическое дерево, построенное на основании данных сравнительного анализа последовательности гена шаперона Hsp70, хорошо коррелирует с результатами межвидовых скрещиваний, заставляет думать, что именно результаты секвенирования hsp70 скорее отражают реальные филогенетические отношения представителей комплекса P. aurelia.
Буквально только что (в августе 2008 г.) была отправлена в журнал статья Катаньи с соавторами (Catania et al., in press), в которой была составлена комплексная молекулярная филогения всех видов P. aurelia по данным анализа нуклеотидных последовательностей 10 ядерных и 4 мито-хондриальных генов. Основным выводом из этой работы стало то, что видообразование в комплексе P. aurelia, по-видимому, происходило не поэтапно, а взрывообразно, так как расстояния между ветвями очень коротки и не всегда однозначны. Это подтверждается и «звездообразной» дендро-граммой комплекса P. aurelia, полученной по итогам анализа последовательности гена COl (Barth et al., 2008). Вероятно, поэтому все существующие молекулярные филогении комплекса P. aurelia в той или иной степени противоречат друг другу, в отличие от ситуации, наблюдаемой для комплекса видов Т. pyriformis (см. выше). Кроме того, оказалось, что некоторые клоны, по результатам скрещиваний принадлежащие к одним видам, на основе гомологии проанализированных последовательностей ДНК должны были бы быть отнесены к другим видам (Catania et al., in press; см. Обсуждение).
Гетероморфный ядерный аппарат инфузорий как критерий для сравнения и возможная причина возникновения видов-двойников
Все описанные выше методы в той или иной степени позволяют различать генетические виды и судить о степени их родства, но не дают представления о том, в чем заключается причина возникновения морфологически похожих, но репродуктивно изолированных видов. Исключительная распространенность видов-двойников у инфузорий (так, для рода Paramecium практически для всех морфологических видов показано существование сингенов) дает основания связывать это явление с уникальной особенностью этой группы протистов — наличием гетероморфного ядерного аппарата.
Организация ядерного аппарата инфузорий Два типа ядер
Общей особенностью всех инфузорий является наличие в одной клетке двух типов ядер: микронуклеуса и макронуклеуса (Осипов, 1981). МИК содержит, как правило, много мелких хромосом; это в целом транскрипционно инертное ядро, чья основная функция — передача генетической информации дочерним клеткам при половом процессе. МАК является соматическим ядром с интенсивной транскрипцией, определяющим фенотип клетки.
При вегетативном делении клетки МИК делится митотически, ядерная оболочка не разрушается. То есть деление МИК можно охарактеризовать как закрытый ортомитоз (Райков, 1978). У кариореликтид (Karyorelic-tea, Ciliata), которых считают самыми примитивными инфузориями, МАК не делится, а возникает заново из МИК при каждом делении клетки (Райков, 1978). У остальных инфузорий возникновение МАК приурочено к половому процессу, а при вегетативном делении МАК делится амитозом, то есть молекулы ДНК «случайным» образом — не поровну — расходятся к дочерним клеткам. Интересно, что при этом у дочерних клеток не происходит потери жизненно важных генов (Ргеег, 1997). Хотя для Tetrahymena (Hymenostomatia, Ciliata) показано, что при продолжительных делениях клеток в отсутствие полового процесса в МАК могут теряться аллели генов, в результате чего он становится функционально гаплоидным, все гены остаются представленными в геноме. Механизм этого явления до сих пор до конца не понятен (Doerder, 1996; Karrer, 1999).
Во время полового процесса — конъюгации — ядерный аппарат инфузорий формируется заново, причем детали этого отличаются у разных групп инфузорий (Katz, 2001). МАК партнёров постепенно деградируют, причём в случае рода Paramecium ступени процесса деградации строго сопряжены во времени с конъюгационными событиями, так как старый МАК продолжает работу при формировании и созревании нового ядерного аппарата (Prescott, 1994). МИК претерпевают мейоз; три продукта этого мей-оза деградируют, а один делится митотически, в результате чего формируется два пронуклеуса. Один из пронуклеусов каждого партнёра мигрирует в цитоплазму другого партнёра, затем стационарный (свой) и мигрирующий (чужой) пронуклеусы сливаются, формируя синкарион. Синкарион несколько раз делится митозом, некоторые продукты деления дегенерируют, один становится новым МИК, а два или четыре (у разных видов парамеций) дифференцируются в МАК. Первые деления эксконъюгантной клетки проходят без деления МАК: вновь сформированные МАК просто распределяются по дочерним клеткам. В результате каждый эксконъюгант дает несколько (2 или 4) линий, у которых МАК дифференцировались самостоятельно — так называемых карионидных клонов (Wichterman, 1986). Таким образом, МАК разных карионид формируются независимо из продуктов деления синкариона и теоретически могут отличаться друг от друга, в то время как МАК всех потомков одной кариониды формируются в результате деления уже сформированного МАК, то есть теоретически изначально являются полностью идентичными.
Другим вариантом полового процесса, встречающимся у некоторых видов рода Paramecium, является автогамия (Wichtermann, 1986). При автогамии все процессы разборки старого и формирования нового ядерного аппарата происходят внутри одной клетки, без участия партнёра. Для некоторых представителей рода Paramecium было показано, что в тех случаях, когда конъюгация невозможна, прохождение автогамии является для этих иифузорий жизненно важным. Известно, что в отсутствие полового процесса клетки P. tetraurelia — одного из представителей комплекса видов P. aurelia — погибают после 200 клеточных делений (Gilley, Blackburn, 1994). Одна из гипотез связывала эту гибель клеток с укорочеиием теломе-ров молекул ДНК МАК. С целью проверки этой гипотезы был проведен следующий эксперимент (Gilley, Blackburn, 1994). Тотальную ДНК инфузорий, прошедших разное количество делений, разделяли с помощью электрофореза и анализировали методом блот-гибридизации. В качестве зонда для гибридизации использовали фрагмент гена ПАГ А, внутри которого располагается сайт рестриктазы Eco RI. Данный ген локализуется на конце одного из фрагментов ДНК МАК. Таким образом, при рестрикции тотальной ДНК исследуемых парамеций рестриктазой Eco RI и последующей гибридизации зонд гибридизовался как с концевым участком гена, связанным с теломерами, так и с его проксимальным участком. Оказалось, что теломерный район не укорачивался (сигнал локализовался в одной области для клеток разных возрастов). Однако по мере прохождения клетками новых и новых делений после последней автогамии наряду с исходным сигналом гибридизации центрального участка постепенно возникал дополнительный, прогрессивно увеличивающийся «шлейф» сигналов в меньшей размерной области. Аналогичный результат авторы получили и при гибридизации тотальной ДНК клеток, прошедших разное количество делений, собственно с теломерным повтором.
На основании этих данных был сделан вывод, что в отсутствие автогамии происходит постепенная деградация макронуклеарных молекул ДНК вследствие накапливающихся нарушений репарации. Но поскольку каждая молекула ДНК представлена в МАК большим количеством копий (см. ниже), деградация молекул становится летальной для инфузорий не сразу, а только при уменьшении числа молекул до некой критической точки (Gilley, Blackburn, 1994).
Организация генома МАК
В зачатке МАК хромосомы претерпевают масштабные преобразования, детали которых отличаются у разных групп ресничных (Katz, 2001), по общая схема одинакова для всех исследованных инфузорий (рис. 2); происходит диминуция значительной части хроматина. По последним данным, маркирование хроматина, который затем элиминируется из развивающегося МАК, происходит при участии коротких некодирующих РНК — таг: называемых сканирующих РНК — и сопровождается особым паттерном метилирования гистонов (Nowacki et al., 2008).
Сначала происходит вырезание из хромосом коротких внутренних последовательностей, которые впоследствии деградируют. Эти последовательности называют ВЭП — Внутренние Элиминирующиеся Последовательности (в англоязычной литературе - IES — Internal Eliminated Sequences). У разных инфузорий эти последовательности могут отличаться по структуре и механизму вырезания. У инфузорий рода Paramecium ВЭП всегда короткие (от 26 до 882 п.н.), однокопийные и фланкированы прямым повтором 5'-ТА-3\ При вырезании одна копия ТА сохраняется в геноме МАК, и одна копия оказывается в вырезанной последовательности ВЭП. Вырезание происходит очень точно, так как некоторые ВЭП располагаются внутри кодирующих последовательностей, что делает ошибку недопустимой (Meyer et al., 1997).
Vpotiomu iHiflinec«i« B-ipi hnMIlM kill IfittrHMl LI ■ tait И al p 1 опии U *
Hoc.feit»*tt.i*Uu*lrfl I It>11) lMMH|iuiia ipauatmi* 4
•*rt — H
И|>-|<Ьг IdHnlltr tr.«uUci»k< lr.1l lltfiMflltt-.tbUM ' j* IIIILMflinllin
ФрЛ1 4trtlU,|HK IJKMOIO MA
Рис. 2. Общая схема перестройки хромосом МИК в ходе созревания генома МАК.
У Euplotes ВЭП также фланкированы 5'-ТА-3' повтором, и один из повторов сохраняется в геноме МАК. Но, за счет сложного механизма вырезания, в элиминирующейся последовательности ВЭП формируется уникальная структура из двух копий повтора ТА, разделенных гетеродуплек-сом из Юн. (Jahn, Klobutcher, 2002). И у парамеций, и у эуплотеса при вырезании ВЭП образуется кольцо (Jahn, Klobutcher, 2002). В то же время у тетрахимен, которые филогенетически более близки к парамециям, ВЭП вырезаются в линейной форме, повтором 5'-ТА-3' не фланкированы, никогда не располагаются внутри кодирующих последовательностей и, соответственно, вырезание происходит с меньшей точностью (Jahn, Klobutcher, 2002). Приблизительное количество разных ВЭП на гаплоидный геном парамеций превышает 50000 (Duharcourt et al., 1998). Статистический анализ последовательностей концов ВЭП позволил обнаружить вырожденную консенсусную последовательность вырезания ВЭП — было показано неслучайное расположение по меньшей мере шести нуклеотидов, расположенных непосредственно «ковнутри» от повтора ТА; мутация же в этом ди-нуклеотиде (с любой стороны ВЭП) приводит к нарушению разрезания ДНК по обоим концам ВЭП (Gratias et al., 2008). Эти нуклеотиды формируют измененный инвертированный повтор и напоминают консенсусные последовательности, фланкирующие транспозоны Тс 1/mariner (Duharcourt et al., 1998). В геноме Euplotes crassus представлены транспозоны этого семейства. Такие транспозоны, как и ВЭП, располагаются между прямыми повторами 5'-ТА-3' и при формировании МАК вырезаются с образованием колец (Jahn, Klobutcher, 2002; Betermier et al., 2000). Для некоторых ВЭП доказано транспозонное происхождение, происхождение других пока до конца неясно, но это сходство породило гипотезу, что ныне существующие ВЭП также произошли от трапспозонов, но позже сильно деградировали в процессе эволюции генома (Duharcourt et al., 1998). Будучи транскрипци-онно неактивным, геном МИК является прекрасной мишенью для трапспозонов, однако жизнеспособность клеток напрямую зависит от точности вырезания ВЭП в процессе развития МАК.
Одновременно с эксцизией ВЭП происходит и другой раунд дими-нуции хроматина, сопровождающий фрагментацию хромосом МИК. Для двух групп инфузорий удалось установить, что является сигналом фрагментации хромосом. В первом случае у Т. thermophyla и родственных видов был обнаружен 15 н. консенсус 5'-AAAGAGGTTGGTTTA-3', получивший название Cbs (chromosome breakage sequence) (Yao et al., 1987). Эксперименты по трансформации показали, что делеция или мутационное изменение этого консенсуса предотвращают фрагментацию, а его встраивание создает сайт фрагментации в месте встраивания. При фрагментации сам консенсус удаляется. Считают, что в сайте фрагментации создается двунитевой разрыв, а образовавшиеся концы хромосом деградируют под действием нуклеаз до тех пор, пока не начинается синтез теломерных повторов de novo (Jahn, Klobutcher, 2002). Иная ситуация наблюдается в случае инфузории Euplotes crassus. Будущая макронуклеарная ДНК в хромосомах МИК этих инфузорий разделена «спейсерной» ДНК, элиминирующейся в процессе формирования МАК. Возле сайтов фрагментации этой инфузории располагаются Юн. последовательности 5'-HATTGAAaHH-3' (Н = А, Т или С), называемые E-Cbs — Euplotes chromosome breakage sequence. После разрезания E-Cbs остаются в составе ДНК МАК, причем консенсус 5'-TTGAA-3', как правило, располагается на расстоянии 17 н. от сайта присоединения теломерных повторов (Jahn, Klobutcher, 2002). Интересно, что в геноме МАК эуплотеса также удается обнаружить последовательности, похожие на E-Cbs - на данный момент остается неясным, являются ли они дополнительными факторами, влияющими на фрагментацию (Jahn, Klobutcher, 2002).
На данный момент не удалось установить, что является сигналом фрагментации хромосом МИК парамеций. Однако известно, что по крайней мере в некоторых случаях возможно образование нескольких альтернативных продуктов фрагментации. Так, на клонах 156и 168 P. primaurelia было показано, что в геноме МАК этого вида содержатся три молекулы ДНК, две из которых (около 230 т. п.н. и около 250 т.п.н.) представляют собой правую и левую части третьей (около 450 т.п.н.) (Сагоп, 1992). Поскольку в геноме МИК представлена только одна копия последовательности, гомологичной молекуле 3 (450 т.п.н.), очевидно, что данные три молекулы были сформированы в результате альтернативной фрагментации исходной хромосомы МИК. Утверждается, что в каждой клетке парамеций удается обнаружить оба варианта фрагментации, что, в свою очередь, говорит о том, что перед началом реаранжировки генома исходная единственная хромосома МИК должна быть амплифицирована (Le Mouel et al., 2003). Более того, каждая из трех молекул также представлена в нескольких размерных вариантах. Детальный анализ последовательности размером 21 т.п.н., располагающейся в МИК между последовательностями молекулы 1 (230 т.п.н.) и молекулы 2 (250 т.п.н.), показал, что в ней содержатся один участок с минисателлитной ДНК и один фрагмент транспозона семейства Тс 1/mariner. Оказалось, что во всех размерных вариантах всех трех молекул МАК обе эти последовательности отсутствуют. Причем в меньших по размеру вариантах молекулы 3 отсутствует и участок ДНК между этими двумя последовательностями, то есть они были элиминированы как единая молекула, а в больших — каждая последовательность была удалена отдельно. В больших размерных вариантах молекул 1 и 2 ближайшая к кодирующей части каждой молекулы последовательность деле-тирована, а на месте другой сформированы теломеры; в меньших — тело-меры образованы на месте ближайшей последовательности. Таким образом, в данном случае потенциальные области вырезания-сшивания и области присоединения теломеров совпадали. Анализ этих участков молекул показал, что и в случае вырезания-сшивания, и в случае присоединения теломеров разрезание происходит между короткими (2-8 п.н.) прямыми повторами, состоящими из чередующихся тиминов и аденинов и содержащими динуклеотид 5'-ТА-3'. Один из повторов сохраняется в геноме МАК. Следовательно, данные последовательности могут, как и ВЭП, быть рудиментами транспозонов. Надо сказать, что внутри каждого из описанных шести вариантов образующихся молекул также есть несколько незначительно отличающихся размерных субвариантов. То есть, сайты делети-рования и присоединения теломерных повторов также не являются строгими и могут отличаться на несколько сотен пар нуклеотидов. На основании полученных данных авторы предполагают, что между прямыми повторами происходит разрезание, «ненужные» последовательности ДНК элиминируются, а оставшиеся молекулы либо сшиваются (то есть происходит вырезание), либо к ним присоединяются теломеры (то есть происходит фрагментация). Таким образом, наряду с точным вырезанием IES при формировании генома МАК может происходить также неточное вырезание последовательностей, приводящее в некоторых случаях к фрагментации. В то же время, наличие коротких прямых повторов, содержащих динуклео-тид 5'-ТА-3', во всех случаях говорит о том, что механизмы всех вариантов реаранжировки могут иметь общие молекулярные основания. Не удалось установить, есть ли в случае неточного вырезания консенсусная последовательность ковнутри от динуклеотида 5'-ТА-3' (как в случае IES), так как в этом случае в прямых повторах присутствует несколько таких динуклеотидов. Факультативное сшивание фланкирующих последовательностей при фрагментации не показано для остальных молекул МАК, но для многих из них было показано альтернативное присоединение теломе-ров. Возможно, при более детальном анализе некоторых молекул также удастся обнаружить альтернативные варианты фрагментации (Le Моиё1 et al., 2003). При исследовании четырех субклонов клона 156 P. primaurelia с помощью электрофоретического разделения ДНК и последующей блот-гибридизации было показано, что во всех случаях были представлены практически все альтернативные варианты молекул 1, 2 и 3, описанные выше — была получена сходная серия сигналов для разных клонов. В то же время интенсивность сигналов гибридизации, демонстрирующая количественное соотношение разных вариантов молекул в геноме, отличалась у всех клонов (Сагоп, 1992). Также в некоторых случаях наблюдались некоторые незначительные отличия и в размерах молекул. То есть, в разных клонах с разной частотой реализовались те или иные варианты процессин-га данной хромосомы после прохождения конъюгации.
Далее на концы образовавшихся при фрагментации молекул ДНК достраиваются теломерные последовательности ДНК. Наконец, происходит выборочная амплификация фрагментов. Сформированный в ходе таких перестроек геном МАК состоит из набора фрагментов ДНК различной длины, представленных различным числом копий, обладающих теломера-ми и способностью к репликации. Его нельзя назвать полиплоидным, поскольку часть ДНК при этом утрачивается (Coyne et al., 1996). В нём практически отсутствуют повторы, некодирующие элементы генома и транспо-зонные последовательности, характерные для микронуклеарного генома.
Электрофоретический анализ генома МАК как метод сравнительного исследования видов-двойников у инфузорий
Сложность и нетривиальность организации генома МАК - в частности, отсутствие в нем хромосом как цитологических структур на всех стадиях жизненного цикла — не позволяют использовать стандартные методы цитогенетики для изучения этого ядра. Электрофоретическое разделение молекул ДНК МАК - единственный способ «увидеть» молекулярное строение генома этого ядра.
Электрофорез
Несмотря на то, что фрагментация хромосом при развитии МАК — общий процесс для всех инфузорий, протекает он по-разному в разных группах этих протестов. У брюхоресничных инфузорий (стилонихия, эуп-лотес), например, средний размер фрагментов ДНК в МАК составляет 2 т.п.н., и большая часть этих фрагментов содержит только по одному гену (Prescott, 1994). Небольшие размеры макронуклеарных молекул ДНК Sty-lonychia позволяют исследовать их с помощью обычного электрофореза. В 1983 году было проведено такое сравнительное исследование видовдвойников S. lemnae и S. mytilus (Steinbriick, Schlegel, 1983). Обычным электрофорезом была разделена как тотальная клеточная ДНК представителей двух видов, так и рестрицированная ДНК МИК (в последнем случае были исследованы отдельные полосы, которые образуют при разделении в геле некоторые семейства повторов). Во всех случаях использовали по несколько клонов каждого вида. По паттерну разделения рестрицированной ДНК МИК виды четко различались. В этом случае наблюдали и некоторые внутривидовые отличия, но значительно менее выраженные, чем межвидовые. Авторы утверждают, что результаты разделения тотальной ДНК (фактически речь идет о ДНК МАК, так как хромосомы МИК не могут быть разделены электрофоретически) также позволяют отличить виды друг от друга, хотя различия между видами не кажутся очень явными: паттерны всех клонов выглядят очень похоже, и уровень отличий внутри вида сопоставим с межвидовым. Поскольку у всех гипотрих, в том числе и стило-нихий, при формировании МАК хромосомы фрагментируются фактически на отдельные гены, возможность альтернативной фрагментации существенно ограничена, и наблюдаемые отличия скорее могут быть связаны с разной степенью амплификации некоторых молекул.
Пульс-электрофорез
Макронуклеарные минихромосомы тетрахимен находятся в размерном диапазоне от 100 до 2000 т.п.н. (Conover, Brunk, 1986а). Размер макро-нуклеарной ДНК парамеций может составлять от 50 до 2000 т.п.н. (Rautian, Potekhin, 2002). Таким образом, минихромосомы МАК этих инфузорий находятся за пределами разрешения обычного электрофореза. Проблему их эффективного разделения удалось решить с помощью метода пульс-электрофореза (ПЭФ), основанного на чередовании двух (или более) электрических полей, имеющих разное направление. Этот метод позволяет разделять в геле молекулы ДНК размером от 50 т.п.н. до 10 млн.п.н. (Maule, 1996) - диапазон, в который хорошо укладываются макронуклеарные минихромосомы парамеций, тетрахимен и многих других инфузорий (см. Rautian, Potekhin, 2002).
В 1986 году был проведен сравнительный анализ генома МАК разных видов комплекса Т. pyriformis методом пульс-электрофореза (ПЭФ) и гибридизации полученных ПЭФ-паттернов с зондами из генов гистона Н4, убиквитина и 5S рибосомной РНК (Conover, Brunk, 1986b). При разделении тотальной ДНК с помощью ПЭФ отличий между разными клонами внутри одного вида практически не наблюдали (показано на примере Т. thermophyla), в то время как ПЭФ-профили разных видов комплекса в некоторых случаях отличались очень заметно. При гибридизации разделенной ПЭФ ДНК разных видов комплекса с геном убиквитина наблюдали несколько вариантов распределения сигналов. Однако по результатам гибридизации нельзя было однозначно детерминировать виды, так как некоторые варианты гибридизационного паттерна оказывались сходными для двух-трех разных видов. В некоторых случаях у нескольких видов совпадало по одному или по два из трех сигналов. При локализации гена гистона Н4 значительных отличий для разных видов выявить не удалось — во всех случаях наблюдали по два сигнала, нижний из которых у пятнадцати видов соответствовал фрагменту ДНК размером 580 т.п.н., а у пяти - варьировал в диапазоне от 500 до 700 т.п.н. При сравнительном анализе результатов гибридизации шести разных клонов Т. thermophyla с генами убиквитина и 5S рРНК явных различий авторы не обнаружили (Conover, Brunk, 1986b).
Сотрудниками нашей лаборатории был проведен сравнительный анализ ПЭФ-профилей разных морфологических видов рода Paramecium (Rautian, Potekhin, 2002). Было показано, что каждый морфологический вид в пределах рода Paramecium обладает четким, отличным от других, воспроизводимым ПЭФ-профилем, в то время как у разных клонов в пределах одного морфологического вида профили в целом совпадают и отличаются лишь отдельными деталями. Сравнивая полученные данные с результатами ПЭФ-анализа геномов тетрахимен (Conover, Brunk, 1986b), можно утверждать, что отличия в ПЭФ-профилях разных морфологических видов парамеций сопоставимы с отличиями каждого из них от ПЭФ-профиля, например, Т. thermophyla. Таким образом, на уровне морфологических видов одного рода отличия в организации геномов МАК настолько велики, что проследить закономерности эволюционных изменений не представляется возможным. В то же время разные клоны одного вида отличий практически не демонстрируют (Conover, Brunk, 1986b; Потехин и др., 1999).
Таким образом, если отличия в организации генома МАК по данным электрофоретического анализа у разных морфологических видов (по крайней мере, у парамеций) очень значительны, то для генетических видов однозначной картины нет: виды-двойники S. lemnae и S. mytilus практически не отличаются, а виды-двойники комплекса Т. pyriformis отличаются очень заметно.
Представляемая работа является первым сравнительным исследованием видов-двойников комплекса P. aurelia с использованием метода ПЭФ.
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ
Целью настоящей работы являлось исследование изменчивости генома макронуклеуса инфузорий на ранних этапах видообразования. В качестве объекта исследования был выбран комплекс видов-двойников Р. aurelia.
Нами были поставлены следующие конкретные задачи: 1. На модели P. tetraurelia проанализировать ПЭФ-профиль и локализовать на нем несколько генов, сопоставив полученные результаты с данными се-квенирования генома МАК этого вида (http://paramecium.cgm.cnrs-gif.fr/db/index). Показать, что электрофоретический кариотип отражает реальную молекулярную организацию генома МАК.
2. Изучить возможные изменения ПЭФ-профиля МАК в ряду клеточных поколений. Для этого получить синхронные культуры (все клетки которых находятся на одной стадии жизненного цикла) и сравнить ПЭФ-профили синхронизированного клона на разных этапах «старения» МАК.
3. Провести сравнительный анализ ПЭФ-профилей видов-двойников комплекса P. aurelia: определить уровень внутри- и межвидового полиморфизма по данному признаку, а также его связь с географическим происхождением клонов; локализовать несколько сцепленных у P. tetraurelia генов на ПЭФ-профилях разных видов комплекса P. aurelia.
4. Сопоставить полученные результаты с опубликованными молекулярными филогениями комплекса P. aurelia. Определить, сопровождается ли дивергенция видов-двойников комплекса P. aurelia возникновением и накоплением изменений в геноме МАК.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ I. Материалы
Использованные культуры.
Клоны, использованные для выполнения работы, представлены в Таблице 1. Все эти клоны поддерживаются в Коллекции клонов инфузорий рода Paramecium лаборатории кариологии одноклеточных биолого-почвенного факультета СПбГУ. Некоторые клоны были предоставлены проф. Е. Пржибош (Краков, Польша), проф. X. Шмидтом и М. Симоном (Кайзерслаутерн, Германия), проф. Х.-Д. Герцем (Штутгарт, Германия), Ж. Коэном (Жиф-сюр-Иветт, Франция), К. Ауфдерхайде (Техасский Университет, США).
Видовая принадлежность всех клонов была определена (или проверена) в ходе выполнения работы методом скрещиваний с клонами-тестерами; эту часть работы осуществила проф. Ева Пржибош.
Таблица 1. Использованные в работе клоны P. aurelia
Клон Где вьщелен Кем предоставлен
P. primaurelia
156 Нью-Хейвен, США X. Шмидт
60 Берлингтон, Вермонт, США X. Шмидт
AZ9-3 Астраханский заповедник, Россия
AZ11-13 Астраханский заповедник, Россия
AZ12-19 Астраханский заповедник, Россия
AZ15-8 Астраханский заповедник, Россия
В7-6 Волгоградская область, Россия
КК2-7 Куршская коса, Калининградская область, Россия
P. biaurelia
ГА62-1 Республика Алтай, Россия
223-7 р. Волга, Тверская область, Россия
7К Северная Каролина, США X. Шмидт
АБ7-16 Бостон, США
Кр133-2 Красноярск, Россия
В1-4 Волгоградская область, Россия
РР2-1 Ропша, Ленинградская область, Россия
P. triaurelia
152 Нью-Хейвен, США X. Шмидт
Кр 128-1 Красноярск, Россия
Кр155-27 Красноярск, Россия
Кр 149-1 Красноярск, Россия
ВЗ-1 Волгоградская область, Россия
В10-12 Волгоградская область, Россия
В10-7 Волгоградская область, Россия
P. tetraurelia
ST Словакия Е. Пржибош
172 Перу X. Шмидт
51S Индиана, США X. Шмидт
Ир7-1 Омск, Россия
ПФ15 Париж, Франция
SM Мадрид, Испания Е. Пржибош
Syd Сидней, Австралия Е. Пржибош
Hp7-1 Новороссийск, Россия d4-2 Лабораторный клон, полученный в результате скрещиваний нескольких клонов (в начале «родословной» -клон 51S) Ж. Коэн
P. pentaurelia
AZ9-4 Астраханский заповедник, Россия
AZ6-24 Астраханский заповедник, Россия
AZ13-3 Астраханский заповедник, Россия
AZ17-10 Астраханский заповедник, Россия
AZ17-12 Астраханский заповедник, Россия
PA 81-8 Алтайский край, Россия
PA 87-2 Алтайский край, Россия
87 Пенсильвания, США Е. Пржибош
P. sexaurelia
AZ5-1 Астраханский заповедник, Россия
AZ8-4 Астраханский заповедник, Россия
AZ11-26 Астраханский заповедник, Россия
159 Пуэрто-Рико Е. Пржибош
G Греция Е. Пржибош
CB 24-1 Пекин, Китай
P. septaurelia
AZ3-1 Астраханский заповедник, Россия
AZ6-23 Астраханский заповедник, Россия
AZ4-4 Астраханский заповедник, Россия
AZ8-3 Астраханский заповедник, Россия
AZ5-2 Астраханский заповедник, Россия
AZ8-20 Астраханский заповедник, Россия
ГФг-1 Фрайбург, Германия
P. octaurelia
K9 Германия М. Симон
565 Уганда М. Симон
IEE Израиль Е. Пржибош
138 Флорида, США Е. Пржибош
P. novaurelia
TP-9 Санкт-Петербург, Россия
BJI4-8 Владимир, Россия
Из-16 Измаил, Украина
Nov Германия Х.-Д. Герц
B9-1 Волгоградская область, Россия
АБ8-22 Бостон, США
P. decaurelia
93-21 Ярославская область, Россия
GA1-15 Республика Алтай, Россия
65-8 Ярославская область, Россия
JN Япония Е. Пржибош
P. undecaurelia
219 США Е. Пржибош
P. dodecaurelia
ТЕ Тенерифе, Канарские острова Е. Пржибош
TR Италия Е. Пржибош
IE о-в Эльба, Италия Е. Пржибош
G Германия Е. Пржибош
РК Краков, Польша Е. Пржибош
256-2 Ярославская область, Россия
КА Казахстан Е. Пржибош
RS Улан-Уде, Россия Е. Пржибош
УВ1-3 Винница, Украина
246 Миссисипи, США Е. Пржибош
Н Гавайские остова Е. Пржибош
J4 Япония Е. Пржибош
J5 Япония Е. Пржибош
112-2 Вологодская область, Россия
P. tredecaurelia
321 Мексика Е. Пржибош
209 Париж, Франция Е. Пржибош
IKM Израиль Е. Пржибош
P. quade- caurelia Намибия Е. Пржибош
N1A Австралия Е. Пржибош
328
P. sonneborni Техас, США К. Ауфдерхайде
II. Методы
Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Некрасова, Ирина Владимировна
Итак, впервые проведено детальное сравнение геномов МАК всех видов-двойников комплекса P. aurelia методом ПЭФ. Исследован внутривидовой и межвидовой полиморфизм электрофоретических кариотипов, влияние «старения» МАК на молекулярную организацию генома этого ядра, проанализированы связи географической и репродуктивной изоляции с возникновением изменений в молекулярной организации генома МАК. Полученные результаты позволили сделать следующие ВЫВОДЫ:
1. ПЭФ-профиль отражает распределение молекул ДНК в макронуклеусе по размеру, является стабильной воспроизводимой характеристикой клона и может быть использован для сравнительного анализа разных клонов P. aurelia. «Старение» макронуклеуса не приводит к изменению электрофоретического кариотипа клона.
2. Большинство молекул ДНК в макронуклеусе P. tetraurelia амплифи-цированы примерно в равной степени. Блоки ПЭФ-профиля могут быть как мономолекулярными, так и сформированными разными молекулами ДНК, близкими по размеру.
3. Размер высокомолекулярных фрагментов ДНК макронуклеуса у разных видов комплекса P. aurelia может несколько различаться; при этом группы сцепления, как правило, сохраняются.
4. В комплексе видов P. aurelia выявлено 12 вариантов электрофоретических кариотипов: девять являются видоспецифичными, три встречаются у представителей нескольких видов. Существует приуроченность определенных вариантов к географическим территориям.
5. Степень сходства электрофоретических кариотипов разных клонов P. aurelia хорошо согласуется с наиболее полным молекулярно-филогенетическим древом комплекса P. aurelia (Hori et al., 2006) и данными о возможности межвидовых скрещиваний (Wichtermann, 1986).
6. Дивергенция видов комплекса P. aurelia сопровождается возникновением различий в организации генома макронуклеуса.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Некрасова, Ирина Владимировна, Санкт-Петербург
1. Бородин П.М., Рогачева М.Б. Домовая землеройка на пути к видообразованию // Природа. 2002. № 9. С. 3-12.
2. Кайданов JI.3. Генетика популяций // М., «Высшая школа». 1996. 320 с.
3. Майр Э. Популяции, виды и эволюция // М., «Мир». 1974. 460 с.
4. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование // М., «Мир». 1984. 479 с.
5. Межевая Е.В., Бериташвили Д.Р., Степанова В.П., Яровой Б.Ф., Захаров И.А. Изучение интеграции плазмиды pYF91 в дрожжевые хромосомы методом пульс-фореза // Биополимеры и клетка. 1991. Т. 60. № 3. С. 90-93.
6. Некрасова И.В., Потехин А.А., Пржибош Е., Раутиан М.С. Сравнительное описание электрофоретических кариотипов макронуклеуса видов-двойников Paramecium primaurelia и Paramecium novaurelia И Цитология. 2008. Т. 50. № 10. С. 913-922.
7. Осипов Д.В. Типы спаривания клонов Paramecium caudatum из водоемов некоторых районов Советского Союза // Вестник ЛГУ. 1963. № 21. Биология. Вып. 4. С. 106-116.
8. Осипов Д.В. Проблемы гетероморфизма ядер у одноклеточных организмов // Л., «Наука». 1981. 257 с.
9. Паевский В.А. Трудная жизнь пернатых многоженцев // Природа. 2004. № 7-8.
10. Ю.Писанец Е. М. Таксономические взаимоотношения серых жаб (Ви/о Bufo complex) и некоторые теоретические и практические проблемы систематики // Вестник зоологии (Киев). 2002. Т. 36. № 1. С. 61—68.
11. П.Полянский Ю.И. Некоторые генетические аспекты проблемы структуры вида и видообразования у агамно размножающихся простейших // В: Кариология и генетика простейших / Осипов Д.В.,
12. Райков И.Б., Юдин A.JI. (ред.). Ленинград: Издательство «Наука». 1976. С. 5-18.
13. Потехин А.А. Исследование генома макронуклеуса инфузорий рода Paramecium методом пульс-электрофореза в норме и при внутриядерной бактериальной инфекции // Автореф. дисс. на соиск. уч. ст. канд. биол. наук. 2002. Санкт-Петербург.
14. Райков И.Б. Ядро простейших. Морфология и эволюция // JL: Наука. 1978. 378 с.
15. Сковородкин И.Н. Приспособление для обездвиживания мелких биологических объектов при их светооптическом изучении // Цитология. 1990. Т. 32. № 3. С. 301-302.
16. Тимофеева А.С., Раутиан М.С. Определение размера генома внутриядерной симбиотической бактерии Holospora undulata методом пульс-электрофореза // Цитология. 1997. Т. 39. № 7. С. 634639.
17. Янковский А.В. Предлагаемая классификация рода Paramecium Hill. 1752 (Ciliophora) // Зоологический журнал. 1969. Т. 48. № 1. С. 30-40.
18. Янковский А.В. Ядерный аппарат Ciliophora. I. Полиплоидия микронуклеуса у инфузорий как видовой признак // Генетика. 1972. Т. 8. № 4. С. 78-84.
19. Adams J.P., Allen S.L. Genetic polymorphism and differentiation in Paramecium II Izoenzymes IV: Genetics and Evolution. Academic Press. New-York. 1975. P. 867-882.
20. Amann R.I., Ludwig W., Schleifer K.H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation // Microbiol. Rev. 1995. V. 59. P. 143—169.
21. Ammermann D., Schlegel M. Characterization of two sibling species of the genus Stylonychia (Ciliata, Hypotricha): S. mytilus Ehrenberg, 1838 and S. lemnae n. sp. I. Morphology and reproductive behavior // J. Protozool. 1983. V. 30. № 2. P. 290-294.
22. Arnaiz О., Cain S., Cohen J., Sperling L. ParameciumDB: a community resource that integrates the Paramecium tetraurelia genome sequence with genetic data //Nucleic Acids Res. 2007. V. 35: Database issue D439-D444.
23. Baird S.E., Klobutcher L.A. Differential DNA amplification and copy number control in the hypotrichous ciliate Euplotes crassus II J. Protozool. 1991. V. 38. № 2. P. 136-140.
24. Barth D., Krenek S., Fokin S.I., Berendonk T.U. Intraspecific genetic variation in Paramecium revealed by mitochondrial cytochrome С oxidase I sequences // J. Eukaryot. Microbiol. 2006. V. 53. №1. P. 20-25.
25. Barth D., Przybos E., Fokin S.I., Schlegel M., Berendonk T. U. Cytochrome b sequence data suggest rapid speciation within the Paramecium aurelia species complex // Mol. Phylogenet. Evol. 2008. doi: 10.1016/j .ympev.2008.08.007.
26. Beale G.N., Knowles J.K.C. Interspecies transfer of mitochondria in Paramecium aurelia II Mol. Gen. Genet. 1976. V. 143. № 2. P. 197-201.
27. Berger J.D. Regulation of macronuclear DNA content in Paramecium tetraurelia II J. Protozool. 1979. V. 26. № 1. P. 18-28.
28. Berger J.D. Riding the ciliate cell cycle—a thirty-five-year prospective // J. Eukaryot. Microbiol. 2001. V. 48. № 5. P. 505-518.
29. Betermier M., Duharcourt S., Seitz H., Meyer E. Timing of developmentally programmed excision and circularization of Paramecium internal eliminated sequences // Mol. Cell. Biol. 2000. V. 20. № 5. P. 1553-1561.
30. Carle G.F., Olson M.V. An electrophoretic caryotype for yeast // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V.82. № 11. P. 3756-3760.
31. Сагоп F. A high degree of macronuclear chromosome polymorphism is generated by variable DNA rearrangements in Paramecium primaurelia during macronuclear differentiation // J. Mol. Biol. 1992. V. 225. № 3. P. 661-678.
32. Caron F., Meyer E. Molecular basis of surface antigen variation in Paramecium II Annu. Rev. Microbiol. 1989. V. 43. P. 23-42.
33. Catania F., Wurmser F., Potekhin A.A., Przybos E., Lynch M. Genetic diversity in the Paramecium aurelia species complex // Mol. Phylogenet. Evol., in press.
34. Chen T.T. Polyploidy and its origin in Paramecium II Journ. Heredity. 1940. V. 31. № 4. P. 175-184.
35. Chen Z., Song W. Characterization and identification of the Diophrys species (Protozoa, Ciliophora, Hypotrichida) based on RAPD fingerprinting and ARDRA riboprinting // Europ. J. Protistol. 2002. V. 38. №4. P. 383-391.
36. Chen Z., Song W., Warren A. Studies on six Euplotes spp. (Ciliophora: Hypotrichida) using RAPD fingerprinting, including a comparison with morphometric analyses // Acta Protozool. 2000. V. 39. № 3. P. 209 216.
37. Chen Z., Song W. Warren A. Species separation and identification of Uronychia spp. (Hypotrichia: Ciliophora) using RAPD fingerprinting and ARDRA riboprinting // Acta Protozool. 2003. V. 42. № 1. P. 83 90.
38. Coleman A.W. Paramecium aurelia revisited // J. Eukaryot. Microbiol. 2005. V. 52. №1. P. 68-77.
39. Conover R.K., Brunk C.F. Macronuclear DNA molecules of Tetrahymena thermophila II Mol. Cell. Biol. 1986a. V. 6. № 3. P. 900-905.
40. Conover R.K., Brunk C.F. Characterization of the macronuclear DNA of different species of Tetrahymena I I J. Mol. Evol. 1986b. V. 24. P. 143151.
41. Coyne R.S., Chalker D.L., Yao M.C. Genome downsizing during ciliate development: nuclear division of labor through chromosome restructuring // Annu. Rev. Genet. 1996. V. 30. P. 557-578.
42. Diller W.F., Earl P.R. Paramecium jenningsi, n. sp. // J. Protozool. 1958. V. 5. № 2. P. 155-158.
43. Doerder F.P. Nuclear wars: the relationship between the micronucleus and the macronucleus in ciliate protists // Europ. J. Protistol. 1996. V. 32. № LP. 14-18.
44. Duharcourt S., Keller A., Meyer E. Homology-dependent maternal inhibition of developmental excision of internal eliminated sequences in Paramecium tetraurelia И Mol. Cell. Biol. 1998. V. 18. №> 12. P. 70757085.
45. Duret L., Cohen J., Jubin C., Dessen F., Gout J.-F., Mousset S., Aury J.-M., Jaillon О., Мэё1 В., Arnaiz О., Betermier M., Wincker P., Meyer E., Sperling L. Analysis of sequence variability in the macronuclear DNA of
46. Paramecium tetraurelia: a somatic view of the germline // Genome Res. 2008. V. 18. P. 585-596.
47. Fokin S.I., Chivilev S.M. Paramecium morphometric analysis and taxonomy //Acta Protozool. 2000. V. 39. № 1. p. 1-14.
48. Forney J., Rodkey K. A repetitive DNA sequence in Paramecium macronuclei is related to the beta subunit of G proteins // Nucl. Acids Res. 1992. V. 20. № 20. P. 5397-5402.
49. Forney J.D., Yantiri F., Mikami K. Developmentally controlled rearrangement of surface protein genes in Paramecium tetraurelia II J. Eukaryot. Microbiol. 1996. V. 43. № 6. P. 462-467.
50. Gates M. A., Berger J. Morphometric inseparability of Paramecium primaurelia and P. pentaurelia II Trans. Amer. Microsc. Soc. 1976. V. 95. № 3. P. 507-514.
51. Gates M.A., Powelson E.E., Berger J. Syngenic ascertainment in Paramecium aurelia II Syst. Zool. 1974. V. 23. № 4. P. 482-489.
52. Gilley D., Preer J.R., Aufderheide K.J., Polisky B. Autonomous replication and addition of telomerelike sequences to DNA microinjected into Paramecium tetraurelia macronuclei I I Mol. Cell. Biol. 1988. V. 8. № 11. p. 4765-4772.
53. Gilman L.C. Mating types in diverse races of Paramecium caudatum // Biol. Bull. V. 80. P. 384-402.
54. Godiska R. Structure and sequence of the H surface protein gene of Paramecium and comparison with related genes // Mol. Gen. Genet. 1987. V. 208. № 3. P. 529-536.
55. Godiska R., Aufderheide K.J., Gilley D., Hendrie P., Fitzwater Т., Preer L.B., Polisky В., Preer J.R. Transformation of Paramecium by microinjection of a cloned serotype gene // Proc. Nath. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. № 21. P. 7590-7594.
56. Gratias A., Lepere G., Gamier O., Rosa S., Duharcourt S., Malinsky S., Meyer E., Betermier M. Developmentally programmed DNA splicing in
57. Paramecium reveals short-distance crosstalk between DNA cleavage sites //Nucleic Acids Res. 2008 V. 36. № 10. P. 3244-3251.
58. Haggard B.W. Interspecies crosses in Paramecium aurelia (syngen 4 by syngen 8) // J. Protozool. 1974. V. 21. №1. P. 152-159.
59. Hakes L., Pinney J.W., Lovell S.C., Oliver S.G., Robertson D.L. All duplicates are not equal: the difference between small-scale and genome duplication // Genome Biol. 2007. V. 8. № 10. R209.
60. Hori M., Tomikawa I., Przybos E., Fujishima M. Comparison of the evolutionary distances among syngens and sibling species of Paramecium II Mol. Phylogenet. Evol. 2006. V. 38. P. 697-704.
61. Hoshina R., Hayashi S., Imamura N. Intraspecific genetic divergence of Paramecium bursaria and re-construction of the paramecian phylogenetic tree //Acta Protozool. 2006. V. 45. P. 377-386.
62. Jahn C.L., Klobutcher L.A. Genome remodelling in ciliated protozoa // Annu. Rev. Microbiol. 2002. V. 56. P. 489-520.
63. Jennings H.S. Genetics of Paramecium bursaria. I. Mating types and groups, their interrelations and distribution; mating behavior and self sterility // Genetics. 1939. V. 24. № 2. P. 202-233.
64. Jerome C.A., Lynn D.H. Identifying and distinguishing sibling species in the Tetrahymena pyriformis complex (Ciliophora, Oligohymenophorea) using PCR/RFLP analysis of nuclear ribosomal DNA // J. Eukaryot. Microbiol. 1996. V. 43. № 6. P. 492-497.
65. Karrer K.M. Tetrahymena genetics: two nuclei are better than one // Methods Cell Biol. 1999. V. 62. P. 127-186.
66. Katz L.A. Evolution of nuclear dualism in ciliates: a reanalysis in light of recent molecular data II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. V. 51. P. 1587-1592.
67. Khadem N., Gibson I. Enzyme variation in Paramecium caudatum II J. Protozool. 1985. V. 32. № 4. P. 622-626.
68. Kim C.S., Preer J.R., Polisky B. Bacteriophage X DNA fragments replicate in the Paramecium macronucleus: absence of active copy number control I I Dev. Genet. 1992. V. 13. № 2. P. 97-102.
69. Kink J.A., Maley M., Preston R., Ling K., Wallen-Friedman M., Saimi Y., Kung C. Mutations in Paramecium calmodulin indicate functional differences between the C-terminal and N-terminal lobes in vivo // Cell. 1990. V. 62. № l.P. 165-174.
70. Landry P.-A., Lapointe F.-J. RAPD problems in phylogenetics // Zool. Scripta. 1996. V. 25. №. 4. P. 283-290.
71. Le Моиё1 A., Butler A., Caron F., Meyer E. Developmentally regulated chromosome fragmentation linked to imprecise elimination of repeated sequences in paramecia // Eukaiyot. Cell. 2003. V. 2. № 5. P. 1076-1090.
72. Lynn D.H., Striider-Kypke M. C. Species of Tetrahymena identical by small subunit rRNA gene sequences are discriminated by mitochondrial cytochrome с oxidase I gene sequences // J. Eukaryot. Microbiol. 2006. V. 53. №5. P. 385-387.
73. Machelon V., Demar C. Electrophoretic variations among the genus Euplotes (Ciliata, Hypotrichida): comparative data for the sibling species complex Euplotes vannus and survey of infrageneric variability // J. Prolozool. 1984. V.31. № 1. P. 74-82.
74. Maciejewska A. Sibling species within Paramecium jenningsi revealed by PCR-RFLP // Acta Protozool. 2006. V. 45. P. 387-393.
75. Maciejewska A. Relationships of new sibling species of Paramecium jenningsi based on sequences of the histone H4 gene fragment // Europ. J. Protistol. 2007. V. 43. № 2. P. 125-130.
76. Maule J. Physical mapping by pulsed-field gel electrophoresis I I Methods Mol. Biol. 1996. V. 68. P. 93-121.
77. Mollenbeck M. Genetic relationship of 32 cell lines of the Euplotes octocarinatus species complex revealed by random amplified polymorphic DNA (RAPD) fingerprinting // Mol. Ecol. 1999. V. 8. P. 1971-1979.
78. Nanney D.L. The molecular diversity and evolutionary antiquity of the Tetrahymena pyriformis species complex // Acta Protozool. 1984. Special Congress Vol. Part II. P. 243-266.
79. Nanney D.L., McCoy J.W. Characterization of the species of the Tetrahymena pyriformis complex // Trans. Amer. Microsc. Soc. 1976. V. 95. № 4. P. 664-682.
80. Nanney, D.L., Park, C., Preparata, R., Simon, E.M. Comparison of sequence differences in a variable 23 S rDNA domain among sets of cryptic species of ciliated protozoa // J. Eukaryot. Microbiol. 1998. V.45. № 1. P. 91-100.
81. Nowacki M., Vijayan V., Zhou Y., Schotanus K., Doak T.G., Landweber L.F. RNA-mediated epigenetic programming of a genome-rearrangement pathway//Nature. 2008. V. 451. P. 153-158.
82. Petroni G., Dini F., Verni F., Rosati G. A molecular approach to the tangled intrageneric relationships underlying phylogeny in Euplotes
83. Ciliophora, Spirotrichea) // Mol. Phylogenet. Evol. 2002. V. 22. №1. P. 118-130.
84. Petroni G., Rosati G., Vannini C., Modeo L., Dini F., Verni F. In situ identification by fluorescently labeled oligonucleotide probes of morphologically similar, closely related ciliate species // Microb. Ecol. 2003. V. 45. P.156-162.
85. Phan H.L., Forney J., Blackburn E.H. Analysis of Paramecium macronuclear DNA using pulsed field gel electrophoresis // J. Protozool. 1989. V. 36. № 4. P. 402-408.
86. Potekhin A., Przybos E., Rautian M. Paramecium species of the Upper and Lower Volga River basin, Russia // Folia Biol. (Krakow). 2008. V. 56. № 3-4. P. 203-207.
87. Potekhin A.A., Rautian M.S. Description of the electrokaryotypes of several species belonging to Paramecium aurelia complex // Ann. Genet. 2001. V. 44. Suppl. 1, sl62.
88. Preer J.R. Epigenetic mechanisms affecting macronuclear development ini
89. Paramecium and Tetrahymena И J. Eukaryot. Microbiol. 2000. V. 47. № 6. P. 512-524.
90. Preer J.R. Whatever happened to Paramecium genetics? // Genetics. 1997. V. 145. P. 217-225.
91. Prescott D.M. The DNA of ciliated protozoa // Microbiol. Rev. 1994. V. 58. № 2. P. 233-267.
92. Przybos E. The first habitat of Paramecium novaurelia of the P. aurelia spp. complex in Asia // Folia Biol. (Krakow) 1998. V. 46. № 1-2. P. 9195.
93. Przybos E., Fokin S. Data on the occurrence of species of the Paramecium aurelia complex world-wide I I Protistology. 2000. V. 1. № 4. P. 179-184.
94. Przybos E., Fujishima M., Nakaoka Y. Paramecium decaurelia and Paramecium dodecaurelia from the P. aurelia spp. complex in Japan // Folia Biol. (Krakow). 2003. V. 51. № 3-4. P. 223-224.
95. Przybos E., Greczek-Stachura M., Potekhin A., Rautian M. Strains of Paramecium decaurelia (Ciliophora, Protozoa) from Russia with molecular characteristics of other known strains of the species // Folia Biol. (Krakow). 2007. V. 55. № 3-4. P. 127-132.
96. Przybos E., Hori M., Fokin S.I. Strains of Paramecium quadecaurelia from Namibia, Africa; genetic and molecular studies I I Acta Protozool. 2003. V. 42. P. 357-360.
97. Przybos E., Rautian M.S., Greczek-Stachura M., Potekhin A.A. Polymorphism within Paramecium sexaurelia (Ciliophora, Oligohymenophorea) and description of a new stand of the species in China // Folia Biol. (Krakow). 2007. V. 55. № 3-4. P. 121-125.
98. Przybos E., Barth D., Berendonk T.U. The Paramecium aurelia species complex, frequency and co-occurrence across Europe // Folia Biol. (Krakow). 2008. V. 56. № 1-2. P. 77-81.
99. Przybos E., Tarcz S., Skoblo I. First American stand of Paramecium novaurelia and intra-specific differentiation of the species // Folia Biol. (Krakow). 2007. V. 55. № 1-2. P. 53-63.
100. Przybos E., Skotarczak В., Wodecka B. Phylogenetic relationships of Paramecium jenningsi strains (classical analysis and RAPD studies) // Folia Biol. (Krakow). 2003. V. 51. № 2. P. 130-145.
101. Ramesh M.A., Malik S.B., Logsdon J.M. A phylogenomic inventory of meiotic genes: evidence for sex in Giardia and an early eukaryotic origin of meiosis // Curr. Biol. 2005. V. 15. P. 185-191.
102. Rautian M.S., Potekhin A.A. Electrokaryotypes of macronuclei of several Paramecium species // J. Eukaryot. Microbiol. 2002. V. 49. № 4. P. 296-304.
103. Sadler L.A., Brunk C. F. Phylogenetic relationships and unusual diversity in histone H4 proteins within the Tetrahymena pyriformis complex // Mol. Biol. Evol. 1992. V. 9. № 1. P. 70-84.
104. Scannell D.R., Byrne K.P., Gordon J.L., 1, Wong S., Wolfe K.H. Multiple rounds of speciation associated with reciprocal gene loss in polyploid yeasts // Nature. 2006. V. 440. № 16. P. 341-345.
105. Schlegel M., Meisterfeld R. The species problem in protozoa revisited //Europ. J. Protistol. 2003. V. 39. № 4. P. 349-355.
106. Schmidt HJ. Immobilization antigens // In: Paramecium/ Ii.~ D.Gortz (ed.). Berlin: Springer Verlag. 1988. P. 155-166.
107. Schurko A.M., Logsdon J.M. Using a meiosis detection toolkit to investigate ancient asexual "scandals" and the evolution of sex // Bioessays. 2008 V. 30. № 6. P. 579-89.
108. Simon M., Schmidt H.J. Antigenic variation in ciliates: antigen structure, function, expression // J. Eukaryot. Microbiol. 2007. V. 54. № l.P. 1-7.
109. Skotarczak В., Przybos E., Wodecka В., Maciejewska A. Sibling species within Paramecium jenningsi revealed by RAPD // Acta Protozool. 2004. V. 43. № 1. P. 29-35.
110. Sogin M. L., Ingold A., Karlok M., Nielsen H., Engberg J. Phylogenetic evidence for the acquisition of ribosomal RNA introns subsequent to the divergence of some of the major Tetrahymena groups // EMBO J. 1986. V. 5. № 13. P. 3625-3630.
111. Sonneborn T.M. Methods in the general biology and genetics of Paramecium aurelia II J. Exp. Zool. 1950. V. 113. №1. P. 87-148.
112. Sonneborn T.M. Breeding systems, reproductive methods, and species problem in Protozoa // In: The species problem. V. 50. Washington, Amer. Assoc. Adv. Sci. 1957. P. 155-324.
113. Sonneborn T.M. Methods in Paramecium research // Methods Cell Physiol. 1970. V. 4. P. 241-339.
114. Sonneborn T.M. The Paramecium aurelia complex of fourteen sibling species // Trans. Amer. Microsc. Soc. 1975. V. 94. P. 155-178.
115. Sonneborn T.M., Dippell R.V. Mating reactions and conjugation between varieties of Paramecium aurelia in relation to conceptions of mating type and variety // Physiol Zool. 1946. V.l 9. № 1. P. 1-18.
116. Stalker H. D. The phylogenetic relationships of the species in the DROSOPHILA MELANICA Group // Genetics. 1966. V. 53. № 2. P. 327342.
117. Steinbriick G., Schlegel M. Characterization of two sibling species of the genus Stylonychia (Ciliata, Hypotricha): S. mytilus Ehrenberg, 1838and S. lemnae n. sp. П. Biochemical characterization // J. Protozool. 1983. V. 30. № 2. P. 294-300.
118. Stoeck Т., Przybos E., Schmidt H.J. A combination of genetics with inter- and intra-strain crosses and RAPD-fingerprints reveals different population structures within the Paramecium aurelia species complex//Eur. J. Protistol. 1998. V. 34. P. 348-355.
119. Stoeck Т., Schmidt HJ. Fast and accurate identification of European species of the Paramecium aurelia complex by RAPD-fmgerprints //Microb. Ecol. 1998. V. 35. P. 311-317.
120. Stoeck Т., Przybos E., Kusch J., Schmidt H.J. Intra-species differentiation and level of inbreeding of different sibling species of the Paramecium aurelia complex // Acta Protozool. 2000. V. 39. № 1. P. 1522.
121. Stoeck Т., Welter H., Seitz-Bender D., Kusch J., Schmidt H.J. ARDRA and RAPD-fingerprinting reject the sibling species concept for the ciliate Paramecium caudatum (Ciliophora, Protoctista) // Zool. Scripta. 2000. V. 29. № 1. P. 75-82.
122. Striider-Kypke M. C., Wright A.-D. G., Fokin S. I., Lynn D. H. Phylogenetic relationships of the genus Paramecium inferred from small subunit rRNA gene sequences // Mol. Phylogenet. Evol. 2000a. V. 14. № l.P. 122-130.
123. Striider-Kypke M.C., Wright A.D.G., Jerome C.A., Lynn D.H. Parallel evolution of histophagy in ciliates of the genus Tetrahymena И BMC Evolutionary Biology. 2001. V. 1. № 5. doi:10.1186/1471-2148-1-5.
124. Summerer M., Sonntag В., Sommaruga R. Ciliate symbiont specificity of freshwater endosymbiotic Chlorella (Trebouxiophyceae, Chlorophyta) // J. Phycol. 2008. V. 44. № 1. P. 77-84.
125. Tait A. Enzyme variation between syngens in Paramecium aurelia II Biochem. Genet. 1970. V. 4. P. 461-470.
126. Tarcz S., Przybos E., Prajer M., Greczek-Stachura M. Intraspecific variation of diagnostic rDNA genes in Paramecium dodecaurelia, P. tredecaurelia and P. quadecaurelia (Ciliophora: Oligohymenophorea) // Acta Protozool. 2006. V. 45. P. 255-263.
127. Tsukii Y., Hiwatashi K. Meiotic nondisjunction and aneuploids in intersyngenic hybrids of Paramecium caudatum II Genetics. 1985. V. 111. P. 779-794.
128. Tsukii Y. Genetic diversity among natural stocks of Paramecium caudatum revealed by RAPD markers // Europ. J. Protistol. 1996. V. 32. Suppl. I. P. 165-169.
129. Usuki I., Irie T. Inter- and intrasyngenic variation of Paramecium hemoglobin -1. Paramecium aurelia complex 11 Сотр. Biochem. Physiol. 1983a. V. 75B. № 3. P. 415-420.
130. Usuki I., Irie T. Inter- and intrasyngenic variation of Paramecium hemoglobin II. Paramecium caudatum, Paramecium jenningsi and Paramecium multimicronucleatum II Сотр. Biochem. Physiol. 1983b. V. 75B. № 3. P. 421-424.
131. Wichtermann R. The Biology of Paramecium II New York, London: Plenum Press / 1986. 599 P.
132. Yao M.-C., Zheng K., Yao C.-H. A conserved nucleotide sequence at the sites of developmentally regulated chromosomal breakage in Tetrahymena II Cell. 1987. V. 48. P. 779-788.
-
Некрасова, Ирина Владимировна
-
кандидата биологических наук
-
Санкт-Петербург, 2008
-
ВАК 03.00.25
- Исследование генома макронуклеуса инфузорий рода Paramecium методом пульс-электрофореза в норме и при внутриядерной бактериальной инфекции
- Ревизия рода Paramecium O. F. Műller, 1773
- Исследование компонентов соматических ядер инфузорий: ультраструктура и пространственная организация
- Исследование геномов внутриядерных симбиотических бактерий рода Holospora методом пульс - электрофореза
- Симбиотические системы, формируемые инфузориями рода Paramecium и их внутриядерными бактериями
