Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метаболитная и циркадная регуляция экспрессии генов, кодирующих белки реакционного центра фотосистемы II у цианобактерий

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Метаболитная и циркадная регуляция экспрессии генов, кодирующих белки реакционного центра фотосистемы II у цианобактерий"

од

На правах рукописи

ЛЕБЕДЕВА Надежда Владимировна

МЕТАБОЛИТЫ А Я И ЦИРКАДНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ БЕЛКИ РЕАКЦИОННОГО ЦЕНТРА ФОТОСИСТЕМЫ Н, У ЦИАНОБАКТЕРИЙ

(03.00.12) Физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1997

Работа выполнена в Институте физиологии растений им.К.А.Тимирязев Российской Академии Наук.

Научный руководитель:

профессор, доктор биологических наук СЕМЕНЕНКО В.Е.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук КЛЯЧКО Н.Л.

доктор биологических наук ЮРИНА Н.П.

Ведущая организация: Институт молекулярной генетики РАН

Защита диссертации состоится 22 мая 1997г. в 13 часов на заседани) Специализированного диссертационного совета по присуждению учено) степени кандидата биологических наук (К 002.45.01) при Институт физиологии растений им.К.А.Тимирязева РАН по адресу: 112276 Москва Ботаническая ул. 35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИФР РАН.

Автореферат разослан " апреля 1997г.

Ученый секретарь Л //у

диссертационного совета

кандидат биологических наук /\\ 11 М.И.АЗАРКОВИЧ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение молекулярных механизмов регуляции фотосинтеза является одной из актуальных проблем современной физиологии растений (Курсанов 1972, 1976; Мокроносов 1982; Семененко 1982, 1988). Это обусловлено тем, что многие внешние и внутренние факторы и соответствующие регуляторные системы в растении стимулируют или, напротив, ограничивают фотосинтетическуга продуктивность, действуя с самых начальных этапов экспрессии генов, кодирующих белки фотосинтетического аппарата (Семененко 1988; Gruissem and Tonkyn 1993).

Изучение фотосинтеза проводится с активным использованием цианобактерий - микроорганизмов, имеющих оксигенный фотосинтез по типу эукариотических фотосинтетиков и являющихся эволюционными предшественниками пластид. Благодаря небольшому размеру клеток и генома, существованию у ряда видов естественной компетентности и процесса гомологичной рекомбинации, цианобактерии стали удобными объектами как для биофизических, так и для молекулярно-генетических исследований фотосинтеза (Bryant 1994; Shestakov and Reaston 1987). Именно у цианобактерий впервые были открыты многие гены, кодирующие белки фотосинтетическкх центров, а также определены их функции (Williams 1988; Brayan etal. 1994).

На экспрессию генов, кодирующих белки фотосистем I и II, и сборку реакционных центров оказывают влияние самые разнообразные факторы (свет, температура, метаболиты, ионы, гормоны). В связи с тем, что в большинстве случаев фотосистема II (ФСП), которая отвечает за жизненно-важную реакцию образования кислорода, реагирует на внешние и внутриклеточные изменения бысгрее и более выраженно, чем фотосистема I (ФС1), она чрезвычайно интенсивно исследуется (Климов 1973; Семененко и др. 1992; Barry et al. 1994; Schneegurt et al. 1994).

Для активации экспресси генов, кодирующих белки ФСН, и сборки реакционного центра (РЦП) решающее значение имеет световая регуляция. Однако известно, что на функционирование ФСН оказывает влияние глюкоза, накапливающаяся в процессе фотосинтеза (Зверева 1980; Зверева и др. 1980; Семененко и др. 1979; Чемерис и др. 1996), и этот тип метаболитной регуляции представляет собой механизм, с помощью которого клетка настраивается на изменения внутренних условий (синтез Сахаров в процессе фотосинтеза), и с помощью которого происходит адаптация клеточного метаболизма к ряду внешних факторов (свет; температура и пр.) (Семененко 1975; 1982). Кроме того, реакции, проводимые ФСН, могут находиться под контролем глобального типа регуляции - биологических часов клетки (Sweeney 1987). Нами было выдвинуто предположение, что в целях экономичности внутриклеточных процессов такие типы регуляции, как глюкозный и циркадный, должны влиять непосредственно на экспрессию

генов, кодирующих белки фотосистемы II, действуя уже на самом начальном этапе - транскрипции.

Косвенным подтверждением такой гипотезы служат эксперименты, показавшие, что глюкоза вызывает специфическое подавление транскрипции генов, кодирующих ферменты, участвующие в фотосинтетических процессах (Sheen 1990, 1994), и что экспрессия некоторых 'фотосинтетических' (кодирующих ферменты фотосинтеза и структурные белки фотосинтетического аппарата) генов регулируется циркадным ритмом (Anderson and Kay 1995; Kondo 1993). Вместе с тем целенаправленного изучения метаболитной и циркадной регуляции транскрипции генов, кодирующих белки ФСП, проведено не было.

В данной работе представлены результаты исследования того, как у цианобактерий глюкоза и циркадные ритмы влияют на экспрессию генов, кодирующих белки реакционного центра фотосистемы II (РЦН).

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение регуляции экспрессии генов, кодирующих белки реакционного центра фотосистемы II, а именно: метаболитной feedback регуляции продуктами фотосинтетического восстановления углерода (глюкоза) и циркадной регуляции.

Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:

1. Изучить действие стереохимического аналога глюкозы - 2-дезокси-Д-глюкозы (2дДг), - на рост и фотосинтетическое выделение кислорода у цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803.

2. Получить мутанты Synechocystis sp.PCC 6803 с нарушенной системой feedback регуляции фотосинтеза глюкозой (2ftIJrResCRS, Шитова 1994).

3. Осуществить сравнительное изучение действия 2дДг на аккумуляцию мРНК генов, кодирующих DI и Dil белки РЦН (psbA и psbD соответственно) у дикого штамма и регуляторных мутантов Synechocystis.

4. Провести сравнительное изучение действия 2дДг на экспрессию (на уровне накопления мРНК) 'фотосинтстических' psbA и psbD генов и 'нефотосинтетического' desA гена (кодирует десатуразу жирных кислот, катализирующую образование двойной связи в положении Д12) у дикого штамма и регуляторных мутантов Synechocystis.

5. Используя штаммы одноклеточных цианобактерий, выяснить, подвержена ли экспрессия генов, кодирующих белки РЦН, циркадной регуляции на этапе накопления специфических мРНК.

6. Сконструировать илазмиды, предназначенные для изучения глюкозной и циркадной регуляции промоторной активности генов в клетках цианобактерий.

7. Клонировать в созданных плазмидах промоторы генов, кодирующих белки РЦН, и генов, не связанных с фотосинтезом. Выяснить подвержена ли активность работы данных промоторов циркадной регуляции.

Научная новизна. На примере Synechocystis sp. РСС 6803 впервые показано существование механизма глюкозной feedback регуляции фотосинтеза у

цианобактерий, сходного с таковым у высших растений и эукариотических водорослей.

Получены мутанты Synecliocystis sp.PCC 6803, с нарушенной системой негативной регуляции фотосинтеза конечным продуктом фотосинтетического восстановления углерода - глюкозой. В результате сравнительного изучения экспрессии генов, кодирующих белки РЦН (psbA, psbD), и 'нефотосинтетического' гена (desA), у дикого типа и регуляторного 2дД1 Rc,CRS(4) мутанта Synechocystis впервые выявлено специфическое регуляторное действие глюкозы на транскрипцию генов фотосистемы И, но не на транскрипцию desA гена.

На фотоавтотрофной цианобактерии Synechococcus sp. РСС 7942 проведены опыты, обнаружившие, что накопление мРНК psbAI, psbAII, psbAIII генов, кодирующих различные формы DI белка РЦН (Kulkarni and Golden 1994), происходите циркадной периодичностью (24-часовым ритмом). Анализ количественных изменений мРНК psbAs генов при различных условиях культивирования Synechococcus впервые показал, что биологические часы способны функционировать в клетке даже когда частота деления цианобактерии составляет всего лишь 5-6 часов (4-5 делений в сутки).

Для более детального изучения механизмов метаболитной и циркадной регуляции экспрессии генов цианобактерии на уровне транскрипции созданы плазмиды для клонирования промоторов перед маркерными генами (кодируют неомицинфосфотрансферазу; люциферазу морских биолюминесцентных бактерий), лишенными собственного промотора. В одном из созданных векторов перед маркерными /мхЛЯ-генами проклонированы промоторные области psbAI, psbAIII, glnA (кодирует глютамин-синтетазу), rrnA (оперон, кодирующий субъединицы рибосомы) генов Synechococcus и обнаружена циркадная периодичность работы данных промоторов.

Практическая значимость. Представленные результаты могут быть использованы для развития исследований в области молекулярных механизмов эндогенной регуляции экспрессии генов фотосинтеза. Созданные плазмиды могут применяться для изучения регуляции экспрессии генов на уровне активности промоторов и создания новых векторов.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на 3 Конференции по физиологии растительной клетки (Россия, Москва 1988), 5 Международном симпозиуме молодых ученых (Болгария, Варна 1990), на русско-американском семинаре по проблемам фотосинтеза (Россия, Пущино 1992), на IX Международном конгрессе по фотосинтезу (Япония, Нагойя 1992), на конференции техасского отделения американского общества микробиологов (США, Колледж Стейшн 1994), на 4 конференции Международного общества по изучению биологических ритмов (США, Джэксонвиль 1994), на конференции по проблемам молекулярной биологии

(США, Смифиль 1994), на 1 Европейском фикологическом конгрессе (Германия, Кельн 1996).

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, из 3 глав экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на /Л/ страницах машинописного текста и содержит / рисунок и 3 таблиц.

Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили одноклеточные цианобактерии -фотогетеротрофный штамм Synechocystis sp.PCC 6803 (штамм получен от чл.-корр. Шестакова C.B., каф. генетики, Биофак, МГУ) и фотоавтотрофный штамм Synechococcus sp.PCC 7942 (проф. Сыозан Голден, Биофак, Техасский А@М Университет, США).

Данные штаммы являются пресноводными цианобактериями. Они хорошо изучены на молекулярно-генетическом уровне, легко трансформируемы и широко используются в физиологических и молекулярно-генетических исследованиях (Shestakov and Reaston 1987; Williams 1988; Лось 1996).

Выращивание цианобактерий проводили в стерильных условиях на среде BG-11 (Бибикова 1987) при температуре 28°С и интенсивности света 100 цЕ-м-2 с для Synechocystis, и 30°С и 120 цЕ м^с1 для Synechococcus. Специальные условия отмечены в тексте.

2дДг-резистентные мутанты Synechocystis выращивали на агаризованной среде BG-11 с 3 мМ 2-дезокси-Д-глюкозы (раствор 2дЦг стерилизовали фильтрованием через бактериальные фильтры Синпор 2 (Чехословакия)).

Фотосинтетическое выделение кислорода суспензией интактных клеток цианобактерий измеряли электродом Кларка при 30°С. Предварительно клетки осаждали центрифугированием и ресуспендировали в свежей среде BG-11 в концентрации OD730=0.2.

Поглощение глюкозы и 2-дезокси-Д-глюкозы изучали с использованием С|4-меченых соединений (С14-глюкоза - удельная активность 250 Кюри/ммоль, Чехословакия; 2-дезокси-Д-(1-С|4)глюкоза - удельная активность 50-60 мКюри/ммоль, Amersham, Англия) по методу Beauclerk/Smith (Beauclerk, Smith 1978).

РНК выделяли из 100 мл цианобактериальной культуры (при плотности клеток OD73o=0.3-0.7) фенольным методом (Synechocystis 6803 - Mohammed and Jansson 1989; Synechococcus 7942 - Kulkarni and Golden 1994). Выделенную РНК разделяли на горизонтальном формальдегид-содержащем геле (трис-боратный буфер), переносили на мембрану GeneScreen Plus, фиксировали на мембране 2-часовой инкубацией при 80°С и затем проводили анализ мРНК методом нозерн-гибридизации с использованием специфических ДНК и РНК зондов (Маниатис и др. 1984).

Операции по созданию новых плазмил и клонированию проводили с применением стандартных методик, описанных в книге Манигтиса "Молекулярное клонирование" (1984). Для субклонирования использовали штаммы E.coli HB 101 и DH 1. Для операций но клонированию использовали ферменты фирм: НПО 'Вектор', Amersham, Biolab, Boehringer, Promega.

Измерение люминесценции трансформантов Svnechococcus sp. РСС 7942. содержащих маркерный ген люциферазы проводили двумя методами:

1) метод с использованием компьютеризированной фоточувствительной камеры (Kondo, Ishiura 1994);

2) метод с использованием сцинтилляционного счетчика (Н.В.Лебедева и проф.С.Голден) для измерения свечения жидких культур штаммов Synechococcus со слабой биолюминесценцией, недетектируемой фоточувствительной камерой.

10 мл жидкой культуры осаждали центрифугированием и ресуспендировали в свежей среде BG-11 до 00730=0.5-0.6. Полученную суспензию (0.5 мл) помещали в сцинтилляционный флакон, содержащий 0.3 мл раствора п-деканала (3% деканал в растительном масле). Закрытый флакон выдерживали 30 минут в полной темноте для полного насыщения клеток цианобактерий парами альдегида и снижения флюоресценции хлорофилла. Затем на сцинцилляционном счетчике Beckmann LS 3801 производили измерение свечения с использованием диагностической программы 'РМТ singles test'.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

I. Метаболитная регуляция фотосинтеза у цианобактерии Synechocystis sp.PCC 6803

По существующей гипотезе feedback регуляции фотосинтеза конечные продукты фотосинтетического восстановления углерода (глюкоза), накапливаясь в избытке в хлоропласте (в клетке) и включая работу специфических регуляторных белков, способны подавлять экспрессию генов, кодирующих белки, связанные с фотосинтезом (Семененко 1975, 1988; Sheen 1990). Выдвинуто предположение, что в feedback регуляции фотосинтеза основную роль играет структура молекулы углевода (Семененко 1982; 1988; Купцова 1983). Поэтому для изучения механизмов гшокозной регуляции целесообразно применение слабо- и неметаболизируемых аналогов глюкозы, которые способны проникать в хлоропласт (компартмент фотосинтетических реакций, геном которого содержит множество 'фотосинтетических' генов), не претерпевая метаболических изменений (Семененко 1975; 1988).

2-дезокси-Д-пиокоза, являясь слабометаболизируемым соединением, вызывает у эукариотических фотосинтезирующих организмов подавление фотосинтетического выделения кислорода, снижение количества суммарной

Рис. 1. Влияние 2-дезокси-Д-глгакозы на фотосинтетическое выделение кислорода клетками БупесИосуяИз ер. РСС 6803. Ось-Х - время (минуты); Ось-У - интенсивность выделения Ог клетками ЗупесИосузиз (относительные единицы).

момент внесения 5мМ 2дЦг

момент отмывки от 2дДг

I

\

/

Ч—

время(мин)

Рис.2. Влияние 2-дезокси-Д-глюкозы на содержание суммарной РНК в клетках культуры Synechocystis sp. РСС 6803. Ось-Х - время (часы); ось-У - содержание РНК в пробе, выделенной из 100 мл жидкой культуры. "0" - момент внесения в среду культивирования 5мМ 2дДг.

содержание суммарной РНК (м кг/мл)

50 40 30 20 Ю 0

■+5mM 2dDg

иремя (часы)

РНК, снижение содержания и активности фотосинтетических ферментов, причем эти процессы полностью обратимы при удалении 2дДг из культуральной среды (Зверева и др. 1980; Семененко и др. 1979; Шитова и др. 1994). На прокариота Synechocystis sp. РСС 6803 2дДг влияет аналогично (Рис.1; Рис.2). Предположительно, такое обширное ингибирование жизненно-важных клеточных процессов у фотосинтезирующих организмов происходит из-за первоначального специфического подавления экспрессии 'фотосинтетических' генов (Семененко 1988; Sheen 1990).

Известно, что у Chlorella глюкоза и ее аналоги подавляют работу ФСН (Зверева 1980; Зверева и др. 1980; Семененко и др. 1979; Чемерис и др. 1996), однако прямых экспериментальных данных, указывающих на влияние глюкозы и ее аналогов на накопление первичных транскриптов генов, кодирующих структурные белки фотосинтетического аппарата, до настоящего времени получено не было. Поэтому существенный интерес представляло получить мутанты фотосинтезирующего организма, дефектные по глюкозному регуляторному механизму, и исследовать как у дикого типа и полученных регуляторных мутантов в норме и в присутствии аналога глюкозы экспрессируются гены, кодирующие белки реакционного центра ФСП, и гены, кодирующие не связанные с фотосинтезом белки.

В качестве объекта исследований была выбрана широко применяемая для молекулярно-генетических исследований фотосинтетического аппарата, одноклеточная фотогетеротрофная цианобактерия - Synechocystis sp. РСС 6803.

Получение и отбор мутантов Synechocystis sp. РСС 6803 с нарушенной системой feedback регуляции фотосинтеза глюкозой.

Для получения и отбора мутантов Synechocystis sp. РСС 6803 с нарушенной системой метаболитной регуляции фотосинтеза был использован метод, ранее разработанный для получения аналогичных мутантов одноклеточной зеленой водоросли Chlorella (Семененко, Шитова и др. 1991; Шитова и др. 1994).

Метод заключался в высеве клеток дикого типа на агаризованную среду BG-11, содержащей 0.05, 0.07 и 0.1% 2-дезокси-Д-глюкозы (3, 4.5 и 6 мМ соответственно). Были получены спонтанные мутанты Synechocystis 6803, способные расти в присутствии 2дДг в среде. Частота появления спонтанных мутаций при концентрации 2дДг ЗмМ равнялась -10 6.

При анализе 2дДг-резистентных мутантов оказалось, что основная часть мутантов содержала повреждения механизма транспорта экзогенной глюкозы в клетку и характеризовалась полной или частичной утратой способности переноса экзогенной глюкозы и ее аналогов внутрь клеток (2jiflrResGT мутанты - glucose transport; Шитова и др. 1994).

Табл. 1. Характеристика 2дДг-резистентных мутантов Synechocystis sp. РСС

6803.

штамм Synechocystis эффективность фотосинтетическое

поглощения иС-2- выделение Ог

дезокси-2-глюкозы

дикий тип 10срт/(кл етка/мин)х 103 100% 100%

мутант 1 4% не измерялось

мутант 2 12% не измерялось

мутант 3 8% не измерялось

мутант 4 89% 80%

мутант 5 13% не измерялось

мутант 6 5% не измерялось

мутант 7 67% 56%

мутант 8 Т/о не измерялось

мутант 9 8% не измерялось

мутант 10 10% не измерялось

Лишь несколько из полученных и исследованных 2дДrR cs - м ута нто в сохранили свойственную исходному штамму способность транспортировать экзогенную глюкозу и ее аналоги в клетку, и вместе с тем отличались способностью осуществлять фотосинтез в присутствии 2-дезокси-Д-глюкозы (Табл.1). Именно такие мутанты, по нашей гипотезе, должны содержать повреждения механизма feedback регуляции фотосинтеза глюкозой, и были отнесены нами к типу регуляторных 2^rRcsCRS (chloroplast regulation system - Шитова и др. 1994) мутантов. Для дальнейших исследований был отобран штамм Synechocystis 2^rResCRS(4), который сохранил высокую активность фотосинтетического выделения О2 в присутствии 2дДг при значительном уровне транспорта экзогенной глюкозы или ее аналога внугрь клеток (Табл.1).

Действие 2дДГ на количество мРНК фотосинтетических р.чЬА и psbD генов и нефотосинтетического desA гена у дикого штамма Synechocystis sp. РСС 6803 и 2,nflrRCRS мутанта.

Двумя основными белками, входящими в реакционный центр фотосистемы II, являются psbA/32 kD и psbD/34 kD белки. psbA и psbD гены цианобактерий обычно представлены мультигенными семействами. В геноме Synechocystis sp. РСС 6803 присутствуют три psbA гена и два psbD гена, которые по-разному экспрессируются в условиях различной освещенности и кодируют различные формы DI и Dil белков (Mohamed and Jansson 1989).

Методом нозерн-блот анализа нами было обнаружено, что у дикого типа Synechocystis после внесения в среду культивирования 2дДг (до конечной концентрации 0.3 мМ) происходит резкое снижение количества транскриптов

Рис.3. Результаты нозерн-блот анализа содержания мРНКрзЪА генов в диком типе и 2дДгк" мутанте ЗупесЬосузйз эр. РСС 6803 после добавления в культуральную среду 2-дезокси-Д-глюкозы (5мМ в момент времени - "0"). Радиоактивно-меченая проба - фрагмент рхЬЛШ гена БупесИосузИз 6803.

дикии тип

0.5 мкг суммарной РНК в пятне

1.5 мкг суммарной РНК в пятне

мутант

5ч

] .5 мкг суммарной РНК в пятне время после внесения 2дДг

Рис.4. Результаты нозерн-блот анализа содержания мРНК рнЪй генов в диком типе и 2дДгКс5 мутанте Бупескосу.чИз эр. РСС 6803 после добавления в культуральную среду 2-дезокси-Д-глюкозы (5мМ). Количество РНК на дорожке геля - 7 мкг; радиоактивно-меченая проба - фрагментрзЬБ! гена Зупес/юсузПя 6803.

дикий тип мутант

0 1 ч 5ч 0 5ч время после

внесения 2дДг

Рис.5. Результаты нозерн-блот анализа содержания мРНК с1е$А гена в диком типе и 2дДгКм мутанте ЗупесИосузШ зр.РСС 6803 после добавления в культуральную среду 2-дезокси-Д-глюкозы (5 мМ в момент времени "О"). Количество суммарной РНК на дорожке геля - 7 мкг; радиоактивно-меченая проба - фрагмент ска А гена ЗупесИосузНз 6803. (Фотография нозерн-блота увеличена на копировальной машине).

дикии тип

мутант

1.3 кЬ

мРНК (¡еяА гена

0 20мин Зч 12ч

О 20мин Зч 12ч

время после внесения 2дДг

Рис.6. Результаты сканирования нозерн-блотов с рис.5. Ось-У относительные единицы.

дикии тип

мутант

!?0 .

00 1-

¡¿Я®! . ...

_____ла :с

0 20мин Зч 12ч 0 20мин Зч 12ч

время после внесения 2дДг

psbAs (Рис.3) и psbDs генов (Рис.4). В то же время количество мРНК desA гена, продукт которого - фермент десатураза (катализирует внесение двойных связей в жирные кислоты),- лишь косвенно связан с фотосинтезом, даже несколько возрастает в первые 3 часа (Рис.5; Рис.6), но затем снижается, что, видимо, происходит из-за угнетения жизнедеятельности микроорганизма в присутствии 2дДг (Рис.6). Эти результаты могут свидетельствовать о существовании специфического ингибирования экспрессии фотосинтетических генов аналогом глюкозы, которое в итоге блокирует все клеточные процессы. Такое предположение подтверждается тем, что у полученного регуляторного мутанта цианобактерии (Synechocystis 2z^rRcsCRS (4)), у которого, как было показано, фотосинтез не подавляется аналогом глюкозы (Табл.1), количество мРНК psbA и psbD генов не снижается после добавления 2дДг в культуральную среду (Рис.3; Рис.4), и количество мРНК desA гена возрастает как и у дикого типа (Рис.5; Рис.6). Этот факт доказывает существование механизма глюкозной регуляции фотосинтеза на уровне транскрипции фотосинтетических генов и нарушение такого механизма у регуляторных 2^fl(rResCRS мутантов цианобактерии.

Следует отметить, что участие глюкозы в негативной регуляции экспрессии генов фотосинтеза показано в настоящее время и у высших растений (Sheen 1990; 1994).

2. Циркадная регуляция экспрессии генов, кодирующих белки фотосистемы П, у Synechococcus sp.PCC 7942

Результаты исследований, проведенных на высших растениях и эукариотических водорослях, свидетельствуют, что фотосинтез и/или его частные реакции (выделение кислорода; поглощение СО2; ток электронов через фотосистемы; накопление мРНК ряда генов, кодирующих белки фотосинтетического аппарата) могут быть под контролем биологических часов клетки (Sweeney 1987).

У прокариот циркадные ритмы обнаружены недавно (Grobbelar et al. 1986) и лишь у фотосинтезирующих микроорганизмов - цианобактерии. Примечательно, что 24 часовой ритм имеют идущие в противофазе процессы азотфиксации и фотосинтеза, связанные с циркадно-идущим синтезом/распадом гранул, состоящих из глюкозного полимера (Shneegurt et al. 1994). Предположительно, биологические часы контролируют работу реакционного центра фотосистемы II, функционирование которой определяет скоординированность течения процессов фотосинтеза и азотфиксации (Shneegurt et al. 1994).

В 1993 г. было обнаружено (Kondo et al. 1993), что изменение количеств мРНКpsbAI гена (кодирует форму 1 DI белка РЦН при росте цианобактерии на свету низкой интенсивности) у одноклеточной фотоавтотрофной цианобактерии Synechococcus sp. РСС 7942 имеет 24-часовую периодичность.

Это наблюдение послужило причиной более подробных исследований, так как для изучения регуляции экспрессии генов ФСН необходимо было определить влияют ли биологические часы лишь на экспрессию psbAI гена, или 24-часовым ритмам подвержена экспрессия и других генов, кодирующих белки ФСП, а также и 'нефотосинтетических' генов.

С помощью нозерн-блот анализа было изучено накопление мРНК psbAI гена одновременно с мРНКpsbAII и psbAIIl генов, кодирующих формы белка DI, функционирующие в РЦП на свету высокой интенсивности, при культивировании Synechococcus в разных условиях освещения.

При роете Synechococcus в условиях накопительной культуры на свету низкой интенсивности (120 рЕм^с-1) количество транскрипта psbAI гена изменялось с циркадной периодичностью (Рис.7). В период измерений мРНК культура находилась на линейной и выхода на стационарную фазах роста, когда время удвоения клеточной культуры цианобактерии составляет 20-40 часов.

Анализ количественных изменений мРНК psbAII и psbAHI генов проводили при росте цианобактерии в турбидостате (с автоматическим разбавлением до OD73o=0.5-0.6) на свету высокой интенсивности (350 рЕм-2с-')- Именно при таких условиях освещения в РЦП функционирует форма 32 kD белка, кодируемая psbAII w psbAIIl генами (Kulkami and Golden 1994).

Было обнаружено, что количество мРНК psbAII и psbAIIl генов, как и мРНК psbAI гена, изменяется с циркадной периодичностью (Рис.8). Причем циркадные пики максимального содержания psbAII и psbAIIl мРНК сходны между собой и не совпадают с пиком максимального содержания psbAI мРНК (Рис.8). Кроме того наличие 'первого' пика в количественных изменениях psbAII мРНК (Рис.8, 'первый' пик можно наблюдать через 4 часа после включения света высокой интенсивности) демонстрирует влияние света высокой интенсивности на экспресию psbAII гена, и показывает существование взаимосвязи светового и циркадного типов регуляции на этапе накопления мРНК.

У эукариотических одноклеточных зеленых водорослей циркадно-текущие процессы теряют свою периодичность, если время деления становится меньше, чем 24 часа (Sweeney 1987). В нашем же случае, прокариотический организм - Synechococcus, - имел циркадный ритм накопления мРНК psb As генов при времени деления, равной на свету высокой интенсивности 5-6 часам. Данный факт впервые говорит о возможности функционирования биологических часов клетки в условиях 'быстрого роста' и о существовании различий в механизмах циркадного ритма у эукариот и прокариот.

Предварительные опыты по изучению накопления мРНК psbDs генов Synechococcus, а также мРНК 'нефотосинтетических' генов: gin А (кодирует глютамин-синтетазу; Cohen-Kupiec et al. 1993), rr/iA (оперон, кодирующий рибосомальные субъединицы; Kumano et al. 1986), gnd (кодирует 6-фосфоглюконат-дегидрогеназу - фермент гексозо-монофосфатного шунта;

С1;ст 12 'I 12 ,, спет 12 ч 24 ч

шикон темнота низкой темнота свет 1ШТСМСШШОСТК ИИТСИСШШОСТП НИЗКОЙ

ИИТСИСШШОСТП

Рис.7. Изменение количества мРНКрзЬА1 гена при росте БупесИососсиз эр. РСС 7942 в накопительной культуре. Культура данной цианобактерии выращивалась в сосуде в объеме 3 литра при низкой интенсивности света (120 цЕ-М"2с-1). После достижения культурой лог-фазы роста чередованием 12 часовых периодов свет/темнота производилась синхронизация, за которой следовал рост при неизменных условиях (низкая интенсивность света). Время '0' (являющееся началом отбора проб для выделения мРНК) - соответствует окончанию второго темнового периода и началу роста цианобактериальной культуры при неизменных условиях. Ось X = время (часы); осьУ = количество мРНК/«6Л/гена (относительные единицы).

рэЪА! шША

(я» я» «к т чда *т рр 1«р ч»

ргбАЯтША

р$ЪА1П гаША (

^/ослги Ш1ШП

рвЬАИ шША рэЬАШ тНКА

Г г I/ Ак* ' Ь $

о 4 8 16 20 24 28 32 36 40 44 48 постоянный свет высокой интенсивности

1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-Г

0 4 8 16 20 24 28 32 36 40 44 48

свет 12 ч 12 ч 12 ч 24 часа слет постоянный свет

низкой темнота свет темнота низкой интенсивности высокой интенсивности

интенсивности низкой

интенсивности

Рис.8. Изменения количеств мРНК рзЬА1, рзЬАП и рзЪАШ генов в течение времени при росте ЭупесЬососсиз эр. РСС 7942 на свету высокой интенсивности. В ходе эксперимента культура, росшая в турбидостате при постоянном разбавлении (СЮ7зо=0.5-0.6) и низкой интенсивности света (-120 цЕ м-2-е-'), была синхронизирована двухкратным чередованием циклов 12 часов свет/12 часов темнота. После чего культура росла 24 часа на свету низкой интенсивности, и затем, в момент времени, обозначенный '0'. пепеппттиггяп, ия плст ип лчитч оч™^™"» — /->сл ..ТГ....1—1\ /->-- V _

Broedel and Wolf J 990),- на свету низкой и высокой интенсивности, показали, что изменения количеств данных мРНК не имеют циркадной ритмичности, как это происходит в случае с мРНК psbAs генов, и носят характер нерегулярных флуктуации.

На основе полученных результатов было сделано заключение, что экспрессия генов Synechococcits sp. РСС 7942, кодирующих основной белок РЦ11 - DI, регулируется биологическими часами клетки на уровне накопления специфических мРНК, и этот факт необходимо учитывать при изучении psbA генов данного объекта и psbA генов других фотосинтезирующих организмов.

3. Конструирование плазмид для анализа регуляции промоторной активности в клетках цианобактерий.

Один из ключевых моментов регуляции экспрессии генов, кодирующих белки фотосинтетического аппарата, проявляется на этапе 'включения/выключения' транскрипции гена. Таким образом, наблюдаемые изменения в количестве специфических мРНК могут происходить как из-за изменений частоты транскрипции гена, вызванных действием регуляторных белков (транс-факторов), так и из-за изменений механизмов деградации специфических мРНК (Gruissem and Tonkyn 1993).

Для более точного ответа на вопрос 'чем именно вызвано изменение количества мРНК' и детального изучения регуляторных событий на уровне транскрипции широко используются специальные плазмиды для клонирования исследуемых промоторов перед маркерными генами, лишенными собственного промотора. Такие плазмиды позволяют изучать регуляцию транскрипции гена на уровне промоторной активности, а также локализовать регуляторные сайты промотора (цис-последовательности) и связывающиеся с ними регуляторные белки (транс-факторы).

I. С целью изучения метаболитной регуляции на уровне транскрипции гена был сконструирован автономно-реплицирующийся в Synechocystis многокопийный вектор pSE-pKM, позволяющий клонировать изучаемый промоторный фрагмент перед маркерным геном (лишенным собственного промотора), кодирующим неомицинфосфотрансферазу (nptll) (определяет устойчивость к канамицину). Вектор был создан на базе плазмиды pSE 76 (Бибикова 1987). Схема вектора представлена на рис.9.

Для проверки работы вектора в нем был проклонирован промоторно-активный фрагмент хлоропластной ДНК одноклеточной зеленой водоросли Dunaliella salina (Лось 1989).

II. Для исследования циркадной регуляции на уровне транскрипции была создана серия интегративных плазмид, позволяющих клонировать в Synechococcus sp. РСС 7942 промоторные фрагменты перед маркерными генами (лишенными собственного промотора), кодирующими люциферазу

Рис.9. Схематические изображения плазмид, сконструированных для анализа промоторной активности в клетках цианобактерий.

Схема автономно-реплицирующейся в Synechocystis sp. РСС 6803 плазмиды pSE-PKM.

Sali

уникальные

сайты рестрикции, -

позволяющие клонировать промоторные фрагменты перед маркерным геном

Smal Koni Sstl

Synechocystis

Схема интегративной плазмиды Synechococcus sp. РСС 7942 -рАМ 1293.

уникальные сайты рестрикции для клонирования промоторов (Smal, Kpnl)

участок хромосомной ДНК

Synechococcu

участок

хромосомной

ДНК

Synechococcus

морских биолюминесцентных бактерий (htxAB-тены). Наличие luxAB генов вызывает свечение объекта, и такой маркерный признак прост и удобен для идентификации, что особенно ценно для многодневных исследований.

Созданные векторы содержат в качестве маркерных:

1) luxAB гены Vibrio harveyi (плазмиды рАМ 1293 и рАМ 1414), и в этом случае необходимо экзогенное добавление субстрата гаоциферазы (п-деканал). Схема плазмиды рАМ 1293 представлена на рис. 9;

2) luxCDABE гены (плазмида рАМ 1387). Тогда возможно свечение цианобактерий за счет субстрата, синтезируемого внутри клетки.

3) luxCD-E гены Xhenorabdopolus luniinescens были также проклонированы отдельно от luxAB генов (рАМ 1420), в автономнореплицирующемся векторе Synechococcus - рАМ 430 (Golden and Sherman 1983), что обеспечило наиболее интенсивный синтез субстрата для люциферазы, особенно в том случае, если luxCD-E- гены экспрессируются под контролем сильного цианобактериального промотора (плазмида рАМ 1518).

В плазмиде рАМ 1293 перед luxAB генами были проклонированы промоторные фрагменты psbAI, psbAIII, glnA, rrnA генов (Рис.10). Штаммы Synechococcus, содержащие данные конструкции, имели циркадный характер свечения (Рис.10). После синхронизации работы биологических часов чередованием 12 часовых периодов свет/темнота данные клоны имели одинаковую фазу пиков свечения (Рис. 10; первый пик приходится на 12 часов), и были обозначены как 'psbAI тип' (Kondo et al. 1993).

Результаты анализа свечения 800 клонов, полученных при встраивании luxAB генов в самые разнообразные участки хромосомы Synechococcus показали, что, абсолютно все штаммы с luxAB генами имеют циркадный характер биолюминесценции, и существуют штаммы, имеющие фазу пиков свечения, отличающуюся от 'psbAI типа' (Liu et al. 1994). Эти данные свидетельствуют о наличии глобального циркадного контроля транскрипции генов Synechococcus.

Для того чтобы локализовать регуляторные сайты, ответственные за циркадную регуляцию на уровне транскрипции гена, было проведено клонирование различных фрагментов промоторной области psbAI гена Synechococcus перед luxAB генами плазмиды рАМ 1414. Были созданы следующие конструкции (Табл.2; 1 и 2 столбцы).

Штаммы Synechococcus, трансформированные вышеперечисленными конструкциями, имели циркадный характер свечения и фазы пиков максимального свечения были идентичны таковой у штамма Synechococcus (рАМС 149), содержащего (-\00/+l70)psbAI-iuxAB (Kondo et al. 1993). Однако интенсивность биолюминесценции была высокой лишь у рАМС 149 и рАМ 1465-содержащего штамма, и была существенно меньше (-в 100 раз) у штаммов, с рАМ 1461, 1472, 1501 плазмидами (Табл.2).

Рис.10. Свечение штаммов БупесИососсш Бр. РСС 7942, содержащих конструкцию 'промоторный фрагмент-/ых/1 В гены'.

ген проклонированный перед кривая биолюминесценции

/ых/15-генами промоторный Ось-Х=время (часы);

фрагмент ('-' и '+' даны Ось-У=биолюминесценция

относительно точки начала (относительные единицы,

транскрипции)

индивидуальные для каждого штамма)

р*ЬА1 (-100/+170)

(Котика а1. 1993)

р5ЬАШ (-38/+39)

рзЪЛШ (-38/+1)

glnA

ггпА

(-2000/+400)

(-141/+53)

А. * » : Ч * Л ? /Л * ч ✓ —.-—.

/ ^ и * 1 г •Л^ш.

/Ч 1.. V Ч 1- N. и —

* I ■ г

—I—

Ч;

-5КГ-V

24 48 72 96

время после синхронизации биологических часов

'Габл.2. Интенсивность свечения штаммов ЭупеЫтсоссиз, содержащих различные фрагменты промоторной областиряЬАI гена перед 1ихАВ генами.

название плазмиды промоторный фрагмент, проклонированный перед lux AB генами интенсивность свечения штамма (100% - интенсивность свечения рАМС 149)

штамм рАМС 149 (Kondoetal. 1993) (-100/+170) 100%

рАМ 1461 (-43/+43) 1%

рАМ 1472 (-40/+230) 1%

рАМ 1501 (-I83/+43) 1%

рАМ 1465 (-1190/+230) 100%

Полученные данные говорят о присутствии в промоторной области рзЬА1 гена регуляторных последовательностей, ответственных за амплитуду циркадного ритма. Причем для ярко-выраженной амплитуды необходимо одновременное присутствие как последовательностей транскрибируемой ("+") области, так и нетранскрибируемой ("-"). Однако тот факт, что ниркадная периодичность экспресии, измеряемая по активности маркерного признака (свечение), не исчезает даже в случае минимального промоторного фрагмента рзЬА1 гена((-43/+43) в плазмиде рАМ 1461) и фаза ритма свечения не меняется при делениях промотора, свидетельствует об отсутствии специфических, ответственных за фазу циркадного ритма, регуляторных сайтов промотора, и подтверждает возможность существования у Бупаскососсш глобального контроля транскрипции, который может являться результатом циркадного характера работы РНК-полимеразы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разнообразные факторы, влияющие на работу фотосистемы II (свет, глюкоза, метаболиты, температура, циркадные ритмы и пр.), воздействуют как на функционирование самих фотосинтетических комплексов, так и на экспрессию генов, кодирующих входящие в их состав белки, в том числе белки ФС II. Регуляция, происходящая на молекулярном уровне, обеспечивает экономичность внутриклеточных процессов,

'включая'/'выключая' гены, когда это необходимо организму, и создает, таким образом, пластичность настройки метаболизма на изменения внешней и впузренней среды.

Эксперименты, представленные в данной работе, показали, что такой фактор, как конечный продукт фотосинтеза - глюкоза, может регулировать гранскрипцию генов, кодирующих белки реакционного центра фотосистемы П. Кроме того, транскрипция этих же генов находится под контролем

биологических часов клетки. Предположительно, регуляция транскрипции опосредована специфическими регуляторными белками (транс-факторами), которые, работая в комплексе с РНК-полимеразой, связываются с соответствующими областями промотора (цис-последовательностями) и обеспечивают необходимый уровень транскрипции гена.

Особенно важно, что конечный уровень транскрипции гена определяется действием комплекса внешних и внутренних воздействий. Таким образом, знания о глюкозном и циркадном типах регуляции экспрессии гена помогают формировать общую картину событий, происходящих на молекулярном уровне. Результаты проведенных нами исследований шире раскрывают многообразие регуляторных механизмов, определяющих транскрипцию генов, кодирующих белки реакционного центра ФС II, и являются базой для дальнейших экспериментов.

ВЫВОДЫ

1. Исследовано действие слабометаболизируемого аналога глюкозы - 2-дезокси-Д-глюкозы,- на фотосинтетическую активность одноклеточной фотогетеротрофной цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803. Показано, что, также как и в случае эукариотических фотосинтезирующих организмов, 2дДг обратимо ингибирует фотосинтетическое выделение О2 у прокариота Synechocystis.

2. Установлено, что при добавлении 2дДг в среду для роста Synechocystis sp. РСС 6803 , происходит активное поглощение 2дДг клетками цианобактерии и последующее немедленное снижение количества мРНК 'фотосинтетических' генов psbAs и psbDs. В то же время количество мРНК 'нефотосинтетического' гена des А в этих условиях падает только спустя несколько часов после добавления 2дДг, что является результатом общего ингибирования жизнедеятельности клетки специфическим подавлением работы фотосинтетического аппарата.

3. Получены спонтанные мутанты Synechocystis sp. РСС 6803, устойчивые к 2дДг. Для дальнейшего изучения регулягорной роли глюкозы отобраны мутанты (названные регуляторными или 2лДгк"С118-мутантами), не утратившие способность транспорта экзогенной глюкозы и ее аналога внутрь клетки и сохранившие при этом уровень фотосинтетической активности, сопоставимый с таковым у дикого штамма.

4. Показано, что, в отличие от дикого типа, у 2дДгКкС115-мутанта Synechocystis 2-дезокси-Д-глюкоза не вызывает снижения количеств мРНК 'фотосинтетических' psbAs и psbDs генов и мРНК 'нефотосинтетического' desA гена.

5. Обнаружено, что количественные изменения мРНК psbA-генов могут носить циркадный характер. Так, у Synechococcus sp. РСС 7942 при

неизменных условиях роста наблюдаются 24-часовые флуктуации количеств мРНКpsbAI, psbAII иpsbAIU генов.

6. Анализ количественных изменений мРНК psbA генов у Synechococcus, растущего на свету высокой интенсивности, впервые продемонстрировал, что биологические часы клетки могут функционировать у организма, время удвоения числа клеток которого (5-6 часов) гораздо меньше чем циркадный период (24 часа).

7. Сконструированы специальные плазмиды для клонирования и изучения регуляции промоторов в цианобактериях:

1) Создан автономно-реплицирующийся в Synechocystis sp. РСС 6803 вектор pSE-pKM, позволяющий клонировать изучаемые промоторы перед маркерным геном, кодирующим неомицин-фосфотрансферазу (nptll).

2) Созданы интегративные векторы (рАМ 1293, рАМ 1414, рАМ 1387) для Synechococcus sp. РСС 7942, позволяющие клонировать изучаемые промоторы перед маркерными генами, кодирующими люциферазу морских биолюминесцентных бактерий (Лис-гены).

3) Созданы векторы, обеспечивающие синтез субстрата бактериальной люциферазы в Synechococcus sp. РСС 7942 (рАМ 1387, рАМ 1420).

8. В плазмидах (рАМ 1293, рАМ 1414), содержащих маркерные luxAB гены Vibrio harveyi, проклонированы промоторные фрагменты psbAI,psbAIH, glnA, rrnA генов. Анализ биолюминесценции штаммов Synechococcus, содержащих эти конструкции, свидетельствует о существовании циркадпого контроля транскрипции данных генов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Лебедева Н.В., Лось Д. А. Векторы E.coli с хлоропластными промоторами. Тезисы 3-й Конференции по Физиологии растительной клетки, Москва, Россия 1988.

2. Лось Д.А., Лебедева Н.В., Ссмсненко В.Е. Клонирование фрагментов хлоропластной ДНК Dunaliella salina, обладающих промоторной активностью, в E.coli. Физ.раст. 1989, т.36 N 4, 732-739.

3. Los D.A., Lebedeva N.V., Semenenko V.E. Cloning and functioning of chloroplast promoters in E.coli and Synechocystis. Physiol.Plantarum, 1989, v.76, Fasc.3, Part 3, A121.

4. Lebedeva N.V., Semenenko V.E. The cloning of promotor-like sequences of Dunaliella salina chloroplast DNA in cyanobacterium Synechocystis sp.PCC 6803. Abstracts of The Vth International Youth Simposium on Plant Metabolism Regulation. Varna, Bulgaria 1990.

5. Los D.A., Lebedeva N.V., Elanskaya I.V., Shestakov S.V., Semenenko V.E. Cloning and functioning of chloroplast promoters in E.coli and Synechocystis. In Curr.Research in Photosynthesis (ed. by M.BaltschefTsky), 1990, v.III, 645-648.

6. Lebedeva N.V., Semenenko V.E. The 2-deoxy-D-glucose effect on the mRNA levels of psbD and desA genes in Synechocyslis sp.PCC 6803. Thesises of Russian-American Workshop on Problems of Photosynthesis. Pushchino, Russia 1992.

7. Lebedeva N.V., Semenenko V.E. The 2-deoxy-D-glucose effect on the mRNA levels of psbA, psbD and desA genes in Synechocyslis sp.PCC 6803 and its 2dDg-resistant mutants. The 9th International Congress on Photosynthesis, Nagoya, Japan 1992.

8. Lebedeva N.V., Kondo T., Golden S.S. Circadian expression of psbA genes in Synechococcus sp.PCC 7942 under different growth conditions. The 1994 Fall Meeting of Texas Branch of The American Society for Microbiology, College Station, Texas, USA 1994.

9. Lebedeva N.V., Kondo T., Golden S. Circadian abundance of psbA mRNA in unicellular cyanobacteria under different growth conditions. Abstracts of The 4th Meeting of Society for research in Biological Rhythms, Florida, USA 1994.

10. Golden S.. Ishiura M., Johnson C.H., Kondo T., Lebedeva N., Liu Y., Tsinoremas N. Circadian regulation of gene expression in cyanobacteria. Abstracts of The 4th Meeting of Society for research in Biological Rhythms, Jacksonville, Florida, USA 1994.

11. Liu Y., Tsinoremas N.F., Johnson C.H., Lebedeva N.V., Golden S., Ishiura M., Kondo T. Circadian orchestration of gene expression in cyanobacteria. Genes Dev., 1995, v.9, #12, 1469-1479.

12. Lebedeva N.V., Kondo T., Golden S. Circadian expression of psbA genes in Synechococcus sp.PCC 7942. Abstracts of Molecular Biology Conference at Lost Pines. 1994, Smithville, Texas, USA.

13. Andcrsson C.R., Golden S.S., Ishiura M., Kondo T., Lebedeva N.V., Tsinoremas N. Isolating circadian clock genes from cyanobacteria. Abstracts of Molecular Biology Conference at Lost Pines. 1994, Smithville, Texas, USA.

14. Golden S.S., Ishiura M., Tsinoremas N.F., Aoki S., Kutsuna S., Iwasaki H., Liu Y., Lebedeva N., Andersson C.R., Johnson C.H., Kondo T.. 1996. Molecular genetics of cyanobacterial circadian rhythms. Abstracts of 1st European Phycological Congress (Cologne 1996), p.4.

15. Kondo T., Mori.T., Lebedeva N.V., Aoki S„ Ishiura M., Golden S.S.. 1997. Circadian rhythms in rapidly dividing cyanobacteria. Science, v.275, 224-227.