Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение влияния мутаций в белке PsbO на активность водоокисляющего комплекса в Chlamydomonas reinhardtii

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение влияния мутаций в белке PsbO на активность водоокисляющего комплекса в Chlamydomonas reinhardtii"

005538833

На правах рукописи

Пиголев Алексей Васильевич

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ МУТАЦИЙ В БЕЛКЕ РвЬО НА АКТИВНОСТЬ ВОДООКИСЛЯЮЩЕГО КОМПЛЕКСА В СІїІатусІотопаз гешІїагМі

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

21 НОЯ 2013

Пущнно - 2013

005538833

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте фундаментальных проблем биологии Российской академии наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Климов Вячеслав Васильевич

Официальные оппоненты: Рукавцова Елена Борисовна

доктор биологических наук,

Филиал Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, старший научный сотрудник

Ладыгин Владимир Георгиевич доктор биологических наук.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт фундаментальных проблем биологии Российской академии наук, ведущий научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего

профессионального образования Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского

Защита состоится 19 декабря 2013 г. в _ на заседании диссертационного совета

Д 002.066.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте фундаментальных проблем биологии Российской академии наук по адресу: 142290, г. Пущино, Московской обл., ул. Институтская, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института фундаментальных проблем биологии Российской академии наук

Автореферат разослан «_» ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Назарова Галина Николаевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Фотосистема 2 (ФС-2) - единственный в природе ферментативный комплекс, способный окислять воду, что позволяет растениям и цианобактериям использовать ее в качестве донора электронов при фотосинтезе. Окисление происходит на люменальной стороне ФС-2 в водоокисляющем комплексе (ВОК), в каталитический центр которого входит четыре атома марганца и атом кальция (Мп4Са05-кластер). Лигандами атомов марганца и кальция являются белки D1 и СР43 [Umena et al., 2011], и в таком составе ФС-2 (вместе с белками D2, СР47, цитохромом Ь559 и Psbl) может окислять воду в экспериментальных условиях. Однако подобный комплекс не стабилен и быстро инактивируется. Для его устойчивой работы необходимо присутствие внешних белков ВОК, связанных с донорной стороной ФС-2 [Bricker et al., 2012]. У высших растений и зеленых водорослей такими белками являются PsbO, PsbP и PsbQ, функция которых заключается в регуляции и стабилизации работы Mn-кластера. Центральную роль при этом играет белок PsbO, который непосредственно влияет на состояние Мп-кластера.

Согласно эволюционным представлениям, белок PsbO - единственный белок ВОК, который есть у всех оксигенных организмов. Его включение в составе ВОК, по-видимому, произошло одновременно с возникновением у ФС-2 способности окислять воду, и у первых примитивных цианобактерий PsbO был единственным внешним белком, связанным с Mn-кластером [De Las Rivas et al., 2004]. При исследовании структуры и функции ВОК было установлено, что PsbO не образует связей с атомами марганца, однако его присутствие необходимо для нормального функционирования Mn-кластера в цикле окисления воды. Наиболее распространена гипотеза о том, что PsbO функционирует в качестве барьера между Mn-кластером и люменом хлоропластов, защищая каталитический центр от активных химических соединений (восстановители, металлы, ионы ОН" и пр.) [Williamson, 2008; Popelkova and Yocum, 2011]. Кроме того, из-за своего положения он может регулировать доступ ионов хлора, кальция, бикарбоната к ВОК и обеспечивать их удержание рядом с Mn-кластером, а также участвовать в отведении протонов из зоны реакции, формируя канал для их удаления. Тем не менее, несмотря на почти 30 лет исследований (с 1981 г.) функциональная роль белка PsbO в процессе фотосинтетического окисления воды остается неопределенной.

Один из подходов в решении данной проблемы - применение сайт-направленного мутагенеза. Важным фактором при этом является выбор модельной системы для исследования. В случае с PsbO наибольшее

распространение получил метод изучения мутаций в условиях in vitro [Motoki et al., 2002; Williamson, 2008]. Однако, при таком подходе при анализе эффекта отдельных мутаций приходится разрушать нативный комплекс ФС-2, а также невозможно проследить влияние мутации на биогенез ВОК. Получить ответ на эти вопросы можно только при работе с живыми организмами, исследуя эффект мутаций in vivo. До настоящего момента единственным объектом таких исследований были цианобактерии Synechocystis sp. [Burnap et al., 1994; Eaton-Rye, 2005]. Однако, учитывая значительную разницу в белковом составе ВОК между растениями и цианобактериями, а также и определенное различие в функции PsbO у этих организмов, переносить полученные результаты на растения не совсем корректно. Так, для активности ВОК у прокариотических организмов важное значение имеет белок PsbV, вследствие чего у цианобактерий (в отличие от высших растений и водорослей) инактивация PsbO не приводит к прекращению выделения кислорода. При определенных условиях в клетках ApsbO штамма цианобактерий скорость выделения 02 может составлять > 50% от клеток дикого типа и полностью подавить выделение кислорода можно только в случае двойной мутации: ApsbO:A.psbV. Поэтому особый интерес представляет работа с эукариотическими организмами.

Работа с растениями осложняется тем, что ApsbO мутант у них нежизнеспособен, и кроме того мутации в белке делают ФС-2 чувствительной к фотоинактивации [Yi et al., 2005]. Решить описанные выше проблемы можно при использовании в качестве объекта исследования одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii. Как и высшие растения, хламидомонада является эукариотом с аналогичным белковым составом ВОК, и, в дополнении к этому, водоросль обладает уникальным метаболизмом. В отличие от высших растений, которые для роста нуждаются в свете (облигатные фототрофы), зеленая водоросль С. reinhardtii способна расти в темноте (гетеротрофно) на ацетате и в тоже время формировать зеленый активный хлоропласт [Harris, 2001]. Эта особенность позволяет изучать функциональное состояние и биогенез комплекса ФС-2 in vivo, исключая повреждение ВОК вследствие фотоинактивации.

Использование не содержащего PsbO мутанта С. reinhardtii также могло бы помочь решить один из вопросов, связанный с участием белка PsbO в формировании стабильного комплекса ФС-2, и теми различиями, которые наблюдаются в биогенезе ФС-2 для прокариотических (цианобактерии) и эукариотических организмов (растения и зеленые водоросли). Так, у

цианобактерий ФС-2 собирается и в отсутствие белка PsbO, тогда как у высших растений и зеленых водорослей инактивация гена, кодирующего белок PsbO, приводит к потере комплекса ФС-2 и отсутствию роста клеток в фотоавтотрофных условиях [Mayfield et al., 1987; Philbrick et al., 1991].

Цели и задачи. Целью работы было исследование роли белка PsbO и некоторых его аминокислотных остатков (Lys223 и Lys226, расположенных на обращенной в люмен стороне белка, которые могли бы участвовать в формировании канала, соединяющего Mn-кластер с внутритилакоидным пространством) в стабилизации и функциональной активности ВОК фотосистемы 2 в клетках С. reinhardtii.

В процессе исследования решались следующие задачи:

1. Характеристика ApsbO мутанта С. reinhardtii, в том числе структурно-функционального состояния ФС-2, с выяснением возможности образования фотохимически активного комплекса ФС-2 в клетках темновой (гетеротрофной) культуры С. reinhardtii в отсутствие белка PsbO.

2. Разработка генетической системы для сайт-направленного мутагенеза белка PsbO фотосистемы 2 in vivo в эукариотических организмах с использованием зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii.

3. Внесение направленных аминокислотных замен К223Е и К226Е в структуру белка PsbO фотосистемы 2 и исследование влияния этих мутаций на стабильность и функциональную активность ВОК в клетках С. reinhardtii.

Научная новизна работы. Разработана генетическая система для сайт-направленного мутагенеза белка PsbO фотосистемы 2 in vivo с использованием эукариотического оксигенного организма - зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii, что позволяет выращивать клетки мутантов по белку PsbO в темноте и изучать биогенез ФС-2, избегая повреждений в результате фотоинактивации. С использованием этой системы получены мутантные штаммы С. reinhardtii с одиночными заменами в белке PsbO (К223Е и К226Е -LGAKPPK) консервативных аминокислотных остатков, которые могут участвовать в формировании канала, соединяющего Mn-кластер с внутритилакоидным пространством. Впервые показано, что эукариотические фотосинтезирующие организмы способны формировать стабильный комплекс ФС-2 в отсутствие белка PsbO, что подтверждается результатами определения содержания белка D1 и пигментного состава клетки. Несмотря на отсутствие фотосинтетического выделения кислорода, в клетках темновой культуры

ApsbO штамма С. reinhardtii выявлена фотохимическая активность, анализ которой показывает, что отсутствие выделения кислорода может быть связано с нарушениями в организации марганцевого кластера ВОК. Впервые показано, что в результате одиночной аминокислотной замены К226Е происходит нарушение стабильности белка, что приводит к развитию ApsbO фенотипа со значительно сниженным содержанием белка в клетке. Показано, что мутация в позиции К223Е вызывает снижение скорости выделения кислорода и отношения Fv/Fm, что, по-видимому, связано с изменением структуры белка, приводящем к увеличению доступности Mn-кластера для эндогенных восстановителей.

Практическая значимость работы. Разработанная генетическая система является удобной основой для изучения роли белка PsbO в эукариотических организмах и, кроме того, расширяет представления о механизме функционирования водоокисляющего комплекса ФС-2: позволяют лучше понять механизм биогенеза ФС-2, а также роль внешних белков в обеспечении стабильности и функциональной активности каталитического центра ВОК.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международной конференции "Light Energy Conversion in Photosynthesis" (Пущино, 2008); на итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 г. в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2008); на VII съезде общества физиологов растений России, международной конференции «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, 2011); на VI съезде Российского фотобиологического общества (пос. Шепси, Краснодарский край, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них: 2 в реферируемых российских научных журналах (из списка ВАК), и 4 в сборниках тезисов конференций.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.

Диссертация изложена на_страницах текста и включает 27 рисунков и 8

таблиц. Список литературы содержит 236 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования. В качестве объектов исследования использовали водоросли С. reinhardtii штамма ApsbO и дикого типа (137с). Культуры водорослей выращивали на трис-ацетат-фосфатной среде pH 7,0 (ТАР) [Harris, 1989] при постоянном перемешивании, используя два режима: в "темноте" (0,05—0,1 мкмолей-м^-с"1) и при постоянном освещении (40-100 мкмолей-м"2-с-1). Измерения активности ФС-2 проводили на культурах в экспоненциальной фазе роста, с плотностью 2-4 х 106 клеток/мл. Подсчет клеток проводили с помощью камеры Горяева. Содержание пигментов определяли при помощи спектрофотометрического анализа в 80% ацетоне [Lichtenthaler, 1987]. Скорость выделения кислорода измеряли полярографическим способом при помощи электрода Кларка. Переменную флуоресценцию хлорофилла ФС-2 (AF) измеряли с использованием специализированного ХЕ-РАМ флуориметра ("Walz", Германия), регистрируя сигнал в программе PowerGraphProfessional 3.3. Фотохимическую эффективность ФС-2 рассчитывали в соответствии с соотношением Fv/Fm = (Fm - F0)/Fm, где F0 - выход флуоресценции в "темноте" (на слабом измерительном свету), Fm - максимальный уровень флуоресценции при насыщающей вспышке света (> 4500 мкмолей-м"2-с*') [Schreiber et al, 1995; Корнеев, 2005; Baker, 2008]. Для получения рекомбинантных ДНК использовали стандартные методы молекулярной биологии (сайт-направленный мутагенез с использованием ПЦР, гидролиз рестриктазами, лигирование фрагментов ДНК). Выделение плазмиды из культуры бактерий проводили методом щелочного лизиса. Перенос плазмиды в E.coli осуществляли методом трансформации СаСЬ-компетентных клеток. Электрофорез ДНК проводили в агарозном геле, в буфере, содержащем этидиум бромид (0,5 мг/л). Выделение геномной ДНК из С. reinhardtii осуществляли с использованием ионообменной смолы Chelex-100 [Cao et al., 2009]. ПЦР-анализ на встраивание маркерного гена parR проводили в реакционной смеси, содержащей 0,5-1 мкг геномной ДНК С. reinhardtii в качестве матрицы. Денатурирующий электрофорез белков проводили в 15 %-ом ПААГ-геле согласно методу Лэммли [Laemmli, 1970]. Полипептидный состав анализировали с использованием антител против белков комплексов ФС-1 и ФС-2. Выделение препаратов тилакоидных мембран и субхлоропластных частиц ФС-2 из С. reinhardtii проводили по методике [Berthold et al., 1981] с модификациями. Для разрушения клеток использовали метод растирания водорослей со стеклянными бусами (0,5 мм Zirconia/Silica

beads, Biospec). Трансформацию клеток C.reinhardtii проводили с применением стеклянных бус [Kindle, 1990; Nelson and Lefebvre, 1995], для удаления клеточной стенки использовали инкубацию с раствором автолизина [Buchanan and Snell, 1988]. Селекцию трансформантов проводили на среде с паромомицином (20 мкг/мл).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Общая характеристика ФС-2 в клетках штамма ApsbO С. reinhardtii.

В ходе исследования было установлено, что независимо от условий выращивания клетки ApsbO штамма С. reinhardtii не способны к фотосинтетическому выделению кислорода. В то же время, структурное и функциональное состояние ФС-2 в клетках мутанта зависело от условий инкубации. Инкубация на свету приводила к утрате большей части комплексов ФС-2 в клетках штамма ApsbO. Это подтверждается данными иммуноблот-анализа (рис. 1), которые свидетельствуют о существенном снижении содержания белка D i (PsbA) в клетках мутанта.

Рис. 1. Гель-электрофорез фракции ти-лакоидных мембран хлоропластов клеток С. геіпРіаг&іі дикого типа и штамма ДрзЬО (С - световая культура, Т - темновая культура), а - окрашивание геля проводили с помощью Кумасси И.-250. б - Иммуноблот-анализ белков РэЬО, РэЬА (ЛІ) и РэаО, входящих в состав пигмент-белковых комплексов ФС-2 и ФС-1 хлоропластов.

ФС-2

ФС-1

Изменения в содержании белка Db в свою очередь, сопровождаются изменениями в пигментном составе клетки. При инкубации культуры мутанта на свету содержание хлорофилла в клетке уменьшалось практически вдвое (табл.1). Помимо снижения уровня суммарного хлорофилла (а + Ь) для штамма ApsbO было характерно более низкое отношение хлорофиллов а/Ъ (изменение,

и

Мутант ДрхІЮ Дикий тип

С T С T

б

Мутант bpshO Дикий тип

С T С Т

связанное с увеличением доли комплекса светособирающей антенны в составе мембраны хлоропласта в отсутствие ФС-2).

Табл. 1. Параметры, характеризующие удельную скорость роста культуры, содержание пигментов и функциональную активность ФС-2 в культурах клеток дикого типа и штамма А/мбО С. гетИагЛИ в конце экспоненциальной фазы роста.

Штамм и условия культивирования Удельная скорость роста, отн. сд. Максимальное количество Хл (а + Ь), м кг/мл Хл (а + Ь). мкг/10й клеток Хла/Ь Каротино-иды.мкг/106 клеток Хл (а + />)/ка-ротиноиды Фотосин-тет. выделение о.

Дикий тии-све- 0.112 29.3 2.24 2.93 0.53 4.21 +++ 0.73

товая культура

Д/?$ЬО-световая 0.039 16.5 1.23 2.41 0.36 3.41 0 0.05

культура

Дикий тип-тем- 0.035 12.2 1.77 3.17 0.48 3.69 + 0.56

новая культура

Л/>л/>0 темно- 0.018 9.8 1.67 3.30 0.44 3.79 0 0.37

там культура

Чрезвычайно низкая величина фотоиндуцированных ДГ у световой культуры ЛрзбО штамма (отношение не превышает 0,05, см. рис. 2), а

также отсутствие способности к фотосинтетическому выделению 02 прямо указывают на отсутствие фотохимической активности ФС-2 в клетках мутанта.

\

2.0

= 1.5

Рис. 2. Кинетика фотоиндуцированных изменений выхода флуоресценции хлорофилла (Л/7), измеренная на клетках световых культур дикого типа (!) и штамма Ар.чЬО (2) С. гсчпкагскИ. Треугольниками указаны моменты включения измерительного света; стрелками вверх и вниз указаны моменты, соответственно, включения и выключения действующего света (1500 мкмолей м"2 с"').

§1.0

0.5

0

Рис. 3. Кинетика фотоиндуцированных изменений выхода флуоресценции хлорофилла (АР), измеренная на клетках темновых культур дикого типа (7) и штамма ДрзЬО (2) С. гетИагЛЦ. Треугольниками указаны моменты включения измерительного света; стрелками вверх и вниз указаны моменты, соответственно, включения и выключения действующего света (1500 мкмолей м^ с"1).

Приведенные результаты свидетельствуют о том, что мутация в PsbO у клеток световой культуры С. reinhardtii приводит к развитию характерного фенотипа, дефицитного по ФС-2. Подобное описание световой культуры мутантного штамма ApsbO С. reinhardtii было сделано ранее [Mayfíeld et al., 1987], однако причина потери ФС-2 не была установлена. Для объяснения роли PsbO было высказано предположение о том, что он необходим для формирования комплекса ФС-2 и выполняет определенную структурную роль. Согласно другому предположению, роль белка заключается в стабилизации нативного комплекса ФС-2 и защите его от протеолитической деградации. Так, например, инактивация генов, кодирующих белки, входящие в состав "ядерного" комплекса ФС-2 С. reinhardtii, приводит к деградации "неправильно" сформированного комплекса ФС-2 протеазами даже в темноте [Moráis et al., 1998]. Кроме того, причиной нестабильности комплекса ФС-2 может быть повышенная чувствительность к действию света. В таком случае нестабильность комплекса может быть составной частью процесса фотоинактивации. Для проверки существующих предположений мы выращивали наш штамм в темноте в условиях, исключающих фотоингибирующее действие света.

Формирование устойчивого комплекса ФС-2. В нашей работе впервые показано, что в отсутствие белка PsbO эукариотические фотосинтезируюгцие организмы способны к формированию фотохимически активного и стабильного реакционного центра ФС-2. Несмотря на то, что темновая культура клеток ApsbO не способна к фотосинтетическому выделению кислорода, другие характеристики свидетельствуют о присутствии в них стабильного фотохимического реакционного центра ФС-2.

В отличие от выросших на свету клеток, физиологические показатели темновой культуры мутанта ApsbO практически не отличаются от дикого типа. Представленные в табл. 1 данные указывают на то, что отсутствие PsbO не сказывается на содержании пигментов в клетке. Концентрация хлорофилла в темноте у мутанта в клетке выше, чем на свету и практически не отличается от таковой в клетках темновой культуры дикого типа. При этом соотношение хлорофилла а/Ь увеличивается (что характерно для темновых культур [Hoober et al., 1998]) и не отличается от темновой культуры дикого типа, что свидетельствует о возрастании содержания ФС-2. Сходство приведенных показателей в темновых культурах мутанта и дикого типа свидетельствует об отсутствии серьезных перестроек в пигмент-белковых комплексах фотосинтетического аппарата клетки. Дополнительным подтверждением этому

служат данные о том, что концентрация белка Б! в клетках мутанта приближается к концентрации этого белка в клетках дикого типа (рис. 1).

Исследование фотоиндуцированных Л/? показывают, что в клетках темновой культуры ДрвЬО штамма наблюдается фотохимическая активность РЦ фотосистемы 2. Об этом свидетельствует наличие А/7-, сравнимых с измеренными на клетках дикого типа (рис. 3). Изменения в кинетике ДР в присутствии специфического ингибитора ФС-2 (диурона) в клетках темновой культуры штамма ДрэЬО полностью совпадают с изменениями, обычно получаемыми на ФС-2 с функционально активной акцепторной стороной ФС-2 (рис.4).

Рис. 4. Кинетика фотоиндуцированных Д/7, измеренная на клетках темновой культуры штамма АрзЬО С. геткагЛи в отсутствие других добавок (контроль) и в присутствии 10 мкМ диурона (Диурон). Флуоресценцию возбуждали с помощью измерительного света; стрелками вверх и вниз указаны моменты,

соответственно, включения и выключения действующего света (X > 650 нм; 1500 мкмолей-м"2-с"').

Анализируя эти результаты можно сделать вывод, что клетки Дрт&О, выращенные в темноте, содержат комплекс ФС-2, сохранивший не только функционально активный РЦ, но и нативную структурно-функциональную организацию акцепторной стороны ФС-2.

В то же время, ряд изменений, выявленных на кривой свидетельствует о нарушении в донировании электронов от ВОК к РЦ ФС-2. На это указывают такие парамеры, как снижение величины и пониженная скорость

достижения /•',„, которые характеризуют скорость поступления электронов от ВОК (рис. 5). Дополнительным указанием на то, что в клетках мутантного штамма ДртЮ поврежден Мп-содержащий ВОК, служит наличие промежуточного пика увеличения Т7 на участке темновой релаксации (рис. 5) (также проявляющийся при ингибировании донорной стороны ФС-2 с помощью гидроксиламина или термоинактивации [Егорова и Бухов, 2002]).

Приведенные данные свидетельствуют о том, что причина, вследствие которой реакционный центр ФС-2 в клетках мутанта не способен к

фотоокислению воды, заключается в нарушении структурно-функциональной организации ВОК.

Таким образом, впервые показано, что в отсутствие белка РэЬО эукариотические фотосинтезирующие организмы способны формировать стабильный, фотохимически активный комплекс ФС-2.

Важно отметить, что полученные результаты позволяют использовать гетеротрофную культуру клеток ДртЮ С. геіпііагсіїіі в качестве модельной системы для сайт-направленного мутагенеза МСБ, в частности, для оценки значимости некоторых консервативных аминокислотных остатков для функционирования ВОК и биогенеза комплекса ФС-2

Рис. 5. Кинетика фотоинду-цированных ЛР в клетках темновой культуры штамма С. гетИагАИ. Стрелки 1 и ^ показывают включение и выключение действующего света, соответственно. Интенсивность флуоресценции при Б о принята за единицу. На вставке А показана быстрая фаза индукционной кривой (ОШР).

40 60 80 100 120 140 160 Время, сек.

0 1 10

Время, сек.

Выбор аминокислотных мишеней для сайт-направленного мутагенеза белка PsbO. Состояние ВОК в отсутствие внешних белков во многом зависит от состава среды, в которой он находится. Важную роль в этих условиях играет содержание ионов СГ, Са2+, а также значение рН среды. Следовательно можно предположить, что функция белка PsbO может заключаться в регуляции взаимодействия ВОК со средой люменального пространства хлоропластов.

Согласно данным рентгеноструктурного анализа ФС-2, белок PsbO располагается на донорной стороне ФС-2 таким образом, что закрывает неорганическое ядро ВОК и ограничивает его от внутритилакоидного пространства [Guskov et al., 2009]. Из-за своего положения он может регулировать доступ кофакторов (хлора, кальция, бикарбоната) к ВОК и обеспечивать их удержание в области Mn-кластера. Кроме того, PsbO может участвовать в отведении протонов из зоны реакции, формируя канал для удаления Н+ [De Las Rivas et al., 2004; Shutova et al., 2007].

Анализ структуры РэЬО позволяет выделить один из участков белка, который мог бы формировать гидрофильный канал, соединяющий ВОК и люмен (рис. 6). Предполагаемый канал находится во «впадине», образуемой складкой между двумя доменами белка, и состоит из консервативных участков последовательности РэЬО. На стороне, выходящей к Мп-кластеру, канал сформирован последовательностью Я152-11162. На другой стороне, обращенной к люмену, в его формировании может принимать участие петля 80ГЮМСА11ЕРН (для цианобактерии Ткегтозупескососсш elongatus), расположенная между [313- и (314-тяжами.

Мп-кластер

Рис. 6. Пространственная организация белка PsbO в комплексе ФС-2 цианобактерии T.elongatus (файл 3BZl.pdb из Protein Data Bank). Прерывистой стрелкой обозначен предполагаемый путь транспорта протонов от Mn-кластера в люменальное пространство тилакоида. Остатки His228 и His231, расположенные ближе к люмену, подчеркнуты.

Наиболее близко к Мп-кластеру расположены остатки R 152(151) и R 162( 161), которые вероятно регулируют потребность ВОК в ионах СГ [Popelkova et al., 2006]. Однако, замены этих аминокислот влияют на связывание PsbO с ФС-2 [Motoki et al., 2002; Popelkova et al., 2006]. Проводя такие замены in vivo, в клетках Chlamydomonas reinhardtii, можно ожидать полной деградации всего ВОК, что исключает возможность определения специфической функциональной роли этих аминокислот. Более подходящими кандидатами для сайт-направленного мутагенеза являются аминокислоты с другой стороны канала, обращенной в люмен, например, остатки Lys223 и

Ьув226. У цианобактерий такими аминокислотными остатками являются 11 ¡й228 и [ Пз231. Однако, сравнение С-концевых последовательностей РвЬО (рис. 7) показывает, что у высших растений и водорослей гистидины консервативно замещены лизинами. Кроме того, Ьув223 и Ьув226 -единственные заряженные аминокислоты в той части петли, которая граничит с люменом - ЬСАКРРК. В связи с этим данные положительно заряженные аминокислотные остатки были выбраны в качестве мишеней для сайт-направленного мутагенеза, с заменой на отрицательно заряженный остаток глутаминовой кислоты.

Циано-бактерии

Высшие растения

Т. elongatus s. elongatus A. variabilis

С. reinhardtii

V. carteri

Е. gracilis

S. moellendorffii

S. tuberosum

P. sativum

S. oleracea

----I----I ----I----I ----I----

200 210 220 VAKVDGRTGE IAGTFESEQL SDDDMGAffll VAKVDGRTGE IAGTFESEQL SDDDMGftffil IAKVDSSSGE IAGTFESEQP SDTDLGAgI VAKVDPVTGE IAGVFESIQP SDTDLGAgPP I VAKVNTATGE IAGVFESIQP SDTDLGAgPP j VAKVNAETGE IAGVFESIQP SDTDLGAgVP і VAESNTATGE IAGVFESIQP SDTDLGSgAP і VTKSNPQTGE VIGVFESIQP SDTDLGAgTP І VTQTKPETGE VIGVFESIQP SDTDLGAgA! VTSSKPETGE VIGVFQSLQP SDTDLGAHV:

,1----I ----I . . .

240

KIQGVFY ASIEPA-KIQGVFY ASIEPA-

KIRGIFY ARVE---

DIKVTGLWY AQLK---

3IKITGLWY GQLSQ— 3IKTSGVWY AQISPSK

KIQGIWC AQLD---

DVKIQGIWY AQLES--DVKIQGVWY AQLES— DVKIEGVWY AQLEQQ-

246

246 250

239

240 245 244 248 248

247

Э 12

013

P14

Рис. 7. Сравнение аминокислотных последовательностей С-концевой области белка PsbO из разных видов цианобактерий, водорослей и высших растений. Темным цветом выделены аминокислотные остатки лизина в положениях 223 и 226 у Chlamydomonas reinhardtii, соответствующие гистидину в положениях 228 и 231 у цианобактерии Т. elongatus.

Получение штаммов С. reinhardtii псевдодикого типа (pWT) и с мутациями К223Е И К226Е в белке PsbO водоокисляющего комплекса ФС-2. С помощью трансформации ApsbO клеток С. reinhardtii с использованием гена, кодирующего PsbO, были получены клетки псевдодикого типа (pWT). Данные клетки использовались в качестве контроля для мутантов по гену psbO. В качестве источника гена использовали плазмиду р190, которая содержит вставку геномной ДНК С. reinhardtii (pUC \ 9\ЕсоШ1 Kpnl) [Mayfield and Kindle, 1990]. Схема вектора для трансформации С. reinhardtii представлена на рис. 8.

ПЦР

Bst1107l \ / ЕС0911

гН

EcoRI

PsbO

р190

Smal

—I —

EcoRI

pSH03

Рис. 8. Схема вектора pSI103::psbC> для трансформации ApsbO клеток С. reinhardtii

Фрагмент с рзЬО был вырезан по сайтам рестрикции ЕсоК) /Бта ] (~ 7940 пар оснований) и клонирован в плазмиду рБ1103 (РагЯ) - вектор для трансформации С. геЫшгЖи. Полученную конструкцию 103 :ркЬСЗ использовали для трансформации АрзЬО клеток С. геткагЛи. Замены аминокислотных остатков в гене рхЬО проводили с помощью ПЦР. Для этого синтезировали фрагмент &/11071/.ЕСО911 гена рхЬО, находящийся в его С-концевой части. Для получения мутаций использовали праймер для участка Есо911:

1071: 5'-ОАТСТАТАССАОСТССОАТСТСАС

и Яу 1 -Есо911-К223Е:5'- СССССТСАССТТОАТСТССТСССОООСТССОСОСССАС

и Ку2-£со91 1-К226Е: 5'-ОССССТСАССТТОАТОТСС1ССООСООСТТ

(сайты рестрикции выделены жирным шрифтом, места замены оснований подчеркнуты). Полученные фрагменты (~ 455 п.о.) использовали для замещения исходной нуклеотидной последовательности в плазмиде р190. Затем модифицированный ген рэЬО клонировали в вектор рЗПОЗ (аналогично тому, как получали клетки р\\гГ-типа).

Первичный скрининг трансформантов проводили на селективной среде с паромомицином (20 мкг/мл). В клетках всех трансформированных штаммов методом ПЦР была обнаружена вставка плазмидной ДНК с геном устойчивости к паромомицину - маркеру трансформации (рис. 9). При помощи Вестерн-блот анализа была подтверждена экспрессия РэЬО в клетках (рис. 10).

В качестве контроля в работе использовали клетки р\¥Т-типа, которые были получены после трансформации клеток АраЪО штамма нативным геном рхЬО из С. гетИагс1Ш.

м

(кЬ) ДрїЬО р\УТ К223Е К226Е -ДНК

Рис. 9. ПЦР-анализ геномной ДНК клеток С. гетИагсІНі на наличие маркерного гена устойчивости к паромомицину. Для анализа использовали клетки рШТ-типа, АрвЬО штамма, мутантов К223Е и К226Е. С помощью пары праймеров (51-ООСОАТТССССТАССТСОТОТ ТС и З'-ССТСОТССАСАТССТС-СААСГСО) синтезировали фрагмент гена рагИ размером 270 п.о. М - маркер молекулярного веса; -ДНК - контроль, ПЦР без ДНК.

Рис. 10. Иммуноблот-анализ содержания белка РвЬО в клетках С. гетИагЛп р\\Т-типа, ДрвЬО, К223Е и К226Е (световая и темновая культуры) штаммов, выращенных на среде ТАР. Количество пробы для анализа соответствовало содержанию белка в (1-1,5) • 106 клеток для р\¥Т-типа и К223Е-штамма и (34) • 106 для клеток АряЬО штамма и К226Е

Показано, что полученные в результате трансформации клетки рЖГ-типа полностью восстанавливали фенотип, соответствующий дикому типу С. геткагски. Полученные клетки р\УТ были способны к фотосинтетическому выделению кислорода и к росту в фотоавтотрофных условиях. Степень восстановления активности ФС-2, которую оценивали по отношению /\.//<т, в клетках р\УТ составляла 0,75-0,80, что характерно и для клеток дикого типа (137С+).

Функциональная характеристика РбЬО мутанта К226Е С. гетИагЖИ.

Замена Ьуз226 в белке РвЮ на глутаминовую кислоту приводила к развитию фенотипа, характерного для штамма Др^бО клеток С. гетИагёШ. Следствием мутации было практически полное отсутствие фотосинтетической активности ФС-2. Клетки мутанта К226Е не выделяли кислород и не могли расти в фотоавтотрофных условиях. Значение /ч/^т У световой культуры составляло 0,1-0,2, что характерно для АрэЬО. Таким образом, по своим функциональным характеристикам клетки К226Е аналогичны /\psbO, у которых белок отсутствовал. При инкубации К226Е в темноте значение /чУ/ч,, увеличивалось до 0,25-0,35, что характерно для мутанта ДрэЬО в тех же условиях. Экспрессия белка РвЬО в клетках мутанта К226Е была подтверждена с помощью иммуноблот-анализа (рис. 10). В клетках штамма К226Е детектировался белок РвЬО, в отличие от использовавшихся в качестве контроля клеток исходного штамма Однако анализ содержания белка показывает, что мутантная

форма РбЬО К226Е в С. геткагЛп нестабильна, и белок накапливался в клетках мутанта в низкой концентрации (рис. 10). Для детекции белка требовалось увеличить количество пробы в 3 раза по сравнению с клетками р\¥Т и К223Е-штамма. По-видимому, замена аминокислоты в этом положении дестабилизировала структуру белка и приводила к его деградации.

Таким образом, показано, что единственная замена К223Е в белке Г'зЬО приводит к драматическим последствиям для функционирования белка в

р\УТ йгаЬО К223Е К.226Е К226Е +свет -свет

РвЬО

клетке. Анализ структуры PsbO позволяет предположить причину изменения стабильности формы К226Е белка PsbO и развития Д/иЮ-фенотипа. Положение Lys226 (His231 у цианобактерий) в аминокислотной последовательности белка таково, что он находится непосредственно перед началом С-концевого ß-тяжа - К DIKVTGLWYAOLK (рис. 7), который, как было ранее установлено, необходим для связывания PsbO с комплексом ФС-2 [Betts et al., 1998]. Известно, что удаление 2-4 аминокислот, расположенных на карбоксильном конце PsbO, блокирует процесс связывания белка с ФС-2. Кроме того, С-концевой участок является структурным элементом основного домена PsbO - ß-барреля, важного для стабильности белка. Вследствие этого несмотря на то, что К226 удален от С-конца на расстояние в 13 аминокислотных остатков, замена в этом участке может препятствовать нормальному сворачиванию белка, что ведет к нарушению связывания белка с ФС-2 и к последующей его деградации.

Предположение о том, что наблюдаемые нарушения связаны с изменением структуры PsbO и не являются следствием фотоинактивации, подтверждается снижением содержания белка и в темновой культуре К226Е-штамма. Если бы количество белка в клетке снижалось из-за фотоинактивации ФС-2, то при инкубации в темноте его содержание должно было соответствовать таковому в клетках pWT-типа.

Функциональная характеристика PsbO мутанта К223Б С. reinhardtiL Экспрессия модифицированного PsbO в клетках К223Е была подтверждена с помощью Вестерн-блот-анализа (рис. 10). Клетки мутанта К223Е были способны к фотоавтотрофному росту и к фотосинтетическому выделению кислорода. Скорость фотосинтетического выделения кислорода для мутанта К223Е составляла 210 мкмоль 02 / (мг Хл ■ ч), что на 15-20% ниже таковой для клеток pWT-типа. Добавление в среду измерения искусственных акцепторов электронов для ФС-2 не меняло указанного соотношения. Следует отметить, что заметных различий в пигментном составе клеток мутанта К223Е по сравнению с клетками pWT-типа также не выявлено.

Анализ переменной флуоресценции указывает на ряд изменений в активности ФС-2 в клетках мутанта К223Е. Как в световой, так и в темновой культуре наблюдалось заметное снижение отношения Fy/Fm (рис. 11).

Рис. 11. Кинетика фотоинду-цированных ДБ, измеренная на клетках р\\Т-типа и К223Е С. гетИагскп, выращенных на среде ТАР (7, 2 - световые; 3, 4 - темновые культуры). Интенсивность флуоресценции, соответствующая /"о, принята за единицу. Для определения рт клетки освещали 1-секундными вспышками

насыщающего света интенсивностью 4500 мкмолей / (м2 • с). На вставке А показано наличие дополнительного максимума на кривой темнового спада переменной флуоресценции в клетках световой культуры К223Е.

У клеток мутанта К223Е, выращенных на свету, показатель эффективности преобразования энергии в ФС-2 (/\,^т) составлял 0,7 (85% от /ч/^п, для клеток псевдодикого типа, равного 0,8). При выращивании в темноте это соотношение для К223Е и р\¥Т снижалось до 0,61 и 0,71, соответственно.

Кроме того, у К223Е наблюдались также изменения в кинетике темновой релаксации переменной флуоресценции. Замедление темнового спада у выращенного на свету мутанта К223Е сопровождается появлением переходного максимума на участке медленной компоненты релаксации /ч (вставка на рис. 11). Время релаксации переменной флуоресценции до 7*0 составляет 0,4 с для обеих культур, и разница заметна только на участке дополнительного максимума. Как отмечалось ранее, «дополнительный» максимум на участке темновой релаксации Ру, по-видимому, связан с повреждением Мп4Са-кластера водоокисляющего комплекса. Следует подчеркнуть, что речь идет о световой культуре, выращенной на среде с ацетатом. Для темновых культур, у которых Мп-кластер и реакционный центр ФС-2 полностью не сформированы, подобная кинетика вполне типична и для дикого типа (рис. 11).

Предположение о том, что изменения в кинетике темновой релаксации флуоресценции мутанта К223Е связаны с нарушениями на донорной стороне ФС-2, подтверждается анализом спада флуоресценции после 1-секундной насыщающей вспышки света в присутствии диурона, блокирующего перенос электронов между Рд' и пулом пластохинонов. Кинетика релаксации Рч в этом случае будет отражать рекомбинацию зарядов между восстановленным Од и окисленными компонентами донорной стороны ФС-2.

5.5 -

5.0 -

«ч 4.5

4» 4.0 •

| 3.5 -

0? 3 3.0 -

§ 2.5 ■

Ё. 2.0 -

а е; 1.5

в 1.0. р

1

0

Время, сек.

Время, с

Рис. 12. Кинетика темновой релаксации переменной флуоресценции (F,) в клетках световых культур pWT и К223Е С. reinhardíii после 1-секундной вспышки действующего света интенсивностью 4500 мкмолей / (м2 • с). Измерения проводили в отсутствие (а) и присутствии (б) диурона (10 мкм).

В среде без диурона (рис. 12) скорость кинетики темновой релаксации Fv у штаммов pWT и К223Е практически одинакова, кроме участка с «дополнительным» максимумом (вставка), и большая часть флуоресценции (90-95%) релаксировала в течение первых 400 мс.

Время 50%-ной релаксации Fv составляло 310 мс. В присутствии диурона скорость темнового спада Fv замедляется и время достижения F0 увеличивается. В этом случае более заметными становятся различия между штаммами. У мутанта кинетика спада замедляется и время релаксации до 50%-ного уровня флуоресценции составляет 670 мс по сравнению с 530 мс для pWT. Особенно заметны различия становятся для медленного компонента спада оставшихся 20-30% /\ (которая отражает релаксацию QA~ с S2-S3-состояниями ВОК [Liu et al., 2007]). Таким образом, можно сделать вывод, что действие замены К223Е затрагивает состояние водоокисляющего комплекса.

Исследование процессов фотоипактивации на клетках и препаратах ФС-2 из К223Е мутанта. Гипотезу об участии К223 в транспорте протонов от Mn-кластера в люмен можно экспериментально проверить по чувствительности ФС-2 к фотоинактивации. Увеличение интенсивности света должно приводить к увеличению активности РЦ и, как следствие, вызывать закисление люмена и повреждение ВОК. Поэтому, если удаление протонов затруднено, к примеру, вследствие мутации, это может вызвать повреждение ФС-2 и снизить ее активность. Для проверки предположения являются ли клетки К223Е более чувствительными к фотоинактивации, по сравнению с pWT, их освещали светом интенсивностью 665 мкмолсй-м~2-с"' в течение 25 минут. После этого сравнивали два параметра: величину Fv/Fm и скорость темновой релаксации Fv. Величина FJFm снижалась только для клеток, выросших в темноте. Анализ кинетики спада, измеренной с диуроном, также

не указывает на большую чувствительность к освещению у мутанта. После фотообработки скорость темновой релаксации уменьшалась, но кривые спада флуоресценции по своим параметрам еще больше сближались, чем это было до освещения (рис. 13).

Свет с интенсивностью 665 мкмолей-м"2-с"' вызывал умеренные изменения в работе ФС-2, но не приводил к сильным повреждениям фотосинтетического аппарата. Об этом можно судить по тому факту, что значение Fv/Fот практически не менялось. Чтобы изучить эффект фотоинактивации в более жестких условиях был предпринят эксперимент, в ходе которого на клетки воздействовали сильным инактивирующим светом (2500 мкмолей-м"2-с"')

Время, сек. Время, сек.

Рис. 13. Чувствительность к фотоинактивации клеток pWT-типа и К223Е мутанта после 25-минутной обработки светом интенсивностью 665 мкмолей /(м2 • с). Кинетика темнового спада Fv измерена после 1-секундной вспышки действующего света интенсивностью 4500 мкмоль /(м2 • с) в присутствии диурона (10 мкм). А - кинетика до обработки светом; В -после 25-минутного освещения постоянным светом интенсивностью 665 мкмолей / (м2 • с).

Через 90 минут после начала освещения в клетках обоих штаммов наблюдалась значительная (в 60%) потеря в величине отношения Fv/Fm. Однако, и в этом случае различий между штаммами не отмечалось, в том числе и в динамике фотоинактивации. Следует отметить, что изменения в функциональной активности ФС-2, которые мы наблюдали на световой культуре мутанта (снижение Fv/Fm, замедление кинетики спада Fv в присутствии диурона), также присутствовали у культуры, выращенной в темноте, и не усиливались при освещении. Опираясь на приведенные результаты можно сделать вывод, что наблюдаемые изменения в работе ВОК не связаны с фотоинактивацией Мп-кластера.

Влияние доноров электронов на кинетику ВОК. Известно, что многие вещества - доноры электронов, обладают способностью ингибировать работу ВОК фотосистемы 2 [Mei and Yocum, 1993; Kuntzleman and Yocum, 2005]. При взаимодействии с Mn-кластером редуктанты способны восстановить марганец

до степени окисления Мп2+, ингибируя выделение кислорода. Скорость инактивации будет во многом зависеть от доступности Mn-кластера, что определяется как размерами самой молекулы - донора электронов, так и от структуры белкового окружения ВОК. Частичное удаление внешних белков ВОК или их модификация открывают Mn-кластер для редуктантов и делают его более доступным для ингибирования [Ghanotakis et al., 1984с; Kuntzleman et al., 2004; Kuntzleman and Yocum, 2005]. В нашем исследовании мутация (К223Е) могла затронуть структуру одного из предполагаемых каналов, соединяющих ВОК с люменом. Проверить данное предположение можно исследуя влияние доноров электронов на кинетику инактивации ВОК.

Одним из широко используемых доноров электронов для ФС-2 в экспериментальных условиях является ТМФД (тетраметил-п-фенилендиамин), с редокс-потенциалом, равным 0,276 В. Воздействие ТМФД на нативные препараты ФС-2 (без удаленных белков и прочих модификаций) позволяет судить о доступности ВОК и РЦ [Kuntzleman and Yocum, 2005]. При исследовании ФС-2 дикого типа с помощью переменной флуоресценции эффект ТМФД проявляется в незначительном снижение параметра Fo (2-5%) и отношения Fv/Fm (на 5-10%). Также регистрируется замедление скорости темнового спада флуоресценции Fv. Как правило, для проявления подобных эффектов достаточно концентрации ТМФД в 150 мкМ (речь идет о непродолжительной инкубации, в течение 1-2 мин.). С целью усиления наблюдаемого эффекта концентрацию вещества в ходе эксперимента увеличивали до 500 мкМ. Отмечены были следующие изменения: наблюдалось незначительное снижение уровня F0 (~ 2-3 %); снижение отношения Fv/Fm в среднем на 10-12% (с 0,67 до 0,59); кроме того, регистрировалось значительное замедление скорости темнового спада Fv (см. рис. 14). Более выраженные изменения в кинетике темновой релаксации Fv наблюдались в случае с препаратами ФС-2, выделенными из мутанта. Анализ уровня F'„ через 25 секунд после вспышки насыщающего света показывает, что замедление скорости спада Fv в клетках мутанта относительно контроля было на 18-20 % выше (рис. 14). Похожие результаты были получены и при добавлении к препаратам ФС-2 другого донора электронов - ферроцианида калия. Темновая инкубация препаратов ФС-2 в присутствии 1 мМ ферроцианида калия в течение 10 минут приводила к значительному (на 50-60%) снижению скорости выделения кислорода, причем этот эффект был также на 15-20% выше у мутанта по сравнению с псевдодиким типом.

Обнаруженный эффект действия редуктантов (ТМФД и ферроцианида) на активность ВОК указывает на изменившуюся доступность Mn-кластера в клетках К223Е мутанта, что и может приводить к тем повреждениям в работе ВОК, которые мы наблюдали в условиях /и vivo. В частности, к таким, которые были обнаружены у темновой культуры К223Е штамма, когда нарушения в ВОК отмечались и в отсутствие повреждения светом. По-видимому, мутация в этом участке белка и приводит к увеличению доступности Mn-кластера для эндогенных доноров электронов.

Рис 14. Кинетика темновой релаксации переменной флуоресценции (Ку) в препаратах ФС-2 клеток р\УТ и К223Е штаммов С. гетЪагЛп после 1-секундной вспышки действующего света интенсивностью 4500 мкмолей/(м2с). Измерения проводили в отсутствие (а) и в присутствии (б) ТМФД (500 мкм).

Полученные в результате изучения мутантных штаммов С. гетИаЫШ данные позволяют сделать вывод о важности аминокислотных остатков, расположенных на люменальной поверхности белка РбЬО (К223 и К226), для функциональной активности белка, в том числе, для поддержания стабильности РбЬО - К226 (Д/иЮ фенотип), а также для регуляции взаимодействия между люменом и ВОК - К223Е.

выводы

1. Впервые показано, что эукариотические фотосинтезирующие организмы способны формировать стабильный комплекс ФС-2 в отсутствие белка PsbO, что подтверждают результаты определения содержания белка D1 и пигментного состава клетки. В клетках темновой культуры ApsbO штамма С. reirihardtii была выявлена фотохимическая активность ФС-2 50% от дикого типа), анализ которой показывает, что отсутствие выделения кислорода в клетках ДpsbO мутанта может быть связано с нарушениями в организации марганцевого кластера ВОК.

2. Разработана генетическая система сайт-направленного мутагенеза белка PsbO ФС-2 in vivo в эукариотических организмах, с использованием клеток Chlamydomonas reirihardtii.

3. При помощи сайт-направленного мутагенеза получены мутантные штаммы С. reinhardtii с одиночными заменами консервативных аминокислотных остатков Lys223 и Lys226 (К223Е и К226Е - LGAKPPK), которые находятся на обращенной в люмен стороне белка PsbO, и могут участвовать в формировании канала, соединяющего Mn-кластер с внутритилакоидным пространством. Для использования в качестве контроля были получены клетки псевдодикого типа (pWT).

4. Обнаружено, что в результате одиночной аминокислотной замены К226Е происходит нарушение стабильности белка PsbO, что приводит к развитию ДpsbO фенотипа (отсутствие фотоавтотрофного роста и фотосинтетической активности ФС-2) со значительно сниженным содержанием этого белка в клетке.

5. Показано, что мутация К223Е приводит к снижению фотосинтетической активности ФС-2 на 10-20 %, по сравнению с контролем, что может быть связано с изменением структуры PsbO, приводящем к увеличению доступности Mn-кластера для эндогенных восстановителей.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Пиголев А.В., Жармухамедов С.К., Климов В.В. Мутант ApsbO Chlamydomonas reinhardtii способен к формированию фотохимически активного реакционного центра фотосистемы 2 // Биологические мембраны. 2009. Т. 26 № 1.С. 31-40.

2. Пиголев А.В., Тимошевский Д.В., Климов В.В. Влияние аминокислотных замен К223Е и К226Е в белке PsbO фотосистемы 2 на стабильность и функциональную активность водоокисляющего комплекса в клетках Chlamydomonas reinhardtii II Биохимия. 2012. Т. 77 № 1. С. 90-98.

Материалы конференций и тезисы докладов:

1. Pigolev А.V., Zharmukhamedov S.K., Klimov V.V. Functional characteristic of Photosystem II in dark grown ApsbO mutant Chlamydomonas reinhardtii // International Conference "Light Energy Conversion in Photosynthesis", 2008, Pushchino, June 8-13. Abstracts, p. 97.

2. Шувалов B.A., Климов B.B., Пиголев A.B. Исследование молекулярных механизмов первичного преобразования световой энергии при фотосинтезе // Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», Москва, 8-10 декабря 2008 г., Сборник тезисов, с. 163-164.

3. Пиголев А.В., Жармухамедов С.К., Климов В.В. Мутант ApsbO Chlamydomonas reinhardtii способен к формированию фотохимически активного реакционного центра фотосистемы 2 // VII Съезд общества физиологов растений России, Международная конференция «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» 4-10 июля 2011г., Нижний Новгород, Россия. Материалы докладов, т. 2, с. 557-558.

4. Пиголев А.В., Тимошевский Д.В., Климов В.В. Влияние аминокислотных замен К223Е и К226Е в белке PsbO фотосистемы 2 на стабильность и функциональную активность водоокисляющего комплекса в клетках Chlamydomonas reinhardtii IIVI Съезд Российского фотобиологического общества, пос. Шепси, 15-22 сентября 2011 г. Сборник тезисов, с. 23.

Подписано в печать 08.11.2013г. Печать лазерная

Заказ № 4790 Тираж: 100 экз.

Типография «FixPrint» ИНН 503900523316 142290, Пущино, м-н «АБ», 22 (4967) 75-97-84 www. fix-print, ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пиголев, Алексей Васильевич, Пущино

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ ПРОБЛЕМ БИОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

О 2 01 ¿г 5 31 S 2

ПИГОЛЕВ АЛЕКСЕЙ ВАСИЛЬЕВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ МУТАЦИЙ В БЕЛКЕ PsbO НА АКТИВНОСТЬ ВОДООКИСЛЯЮЩЕГО КОМПЛЕКСА В Chlamydomonas reinhardtii

03.01.04 - биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор биологических наук профессор В.В. Климов

ПУЩИНО - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...........................................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................................................8

1.1. Структурно-функциональная организация фотосистемы 2.............................................10

1.2. Внешние белки водоокисляющего комплекса фотосистемы 2.......................................11

1.3. Белок РвЬО............................................................................................................................14

1.3.1. Общая характеристика.................................................................................................14

1.3.2. Первичная структура РэЬО..........................................................................................15

1.3.3. Структура РэЬО, связанного с фотосистемой 2........................................................ 19

1.3.4. Связывание РбЬО с фотосистемой 2...........................................................................22

1.4. Функциональная роль РвЬО.................................................................................................24

1.4.1. Функционирование фотосистемы 2 в отсутствие РвЬО............................................24

1.4.2. ЛрБЪО мутации..............................................................................................................24

1.4.3. Взаимодействие РвЬО с ионами.................................................................................26

1.4.3.1. РбЬО и марганец...............................................................................................26

1.4.3.2. Кальций.............................................................................................................27

1.4.3.3. Ионы хлора.......................................................................................................28

1.4.4. Участие РбЬО в транспорте воды и протонов............................................................29

1.4.5. Возможная роль РбЬО в регуляции переходов димер/мономер

комплексов фотосистемы 2.........................................................................................31

1.4.6. ГТФазная активность РвЬО..........................................................................................31

1.5. Сайт-направленный мутагенез РвЬО.................................................................................32

1.6. Общая характеристика С. гетЬагЛи.................................................................................36

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ...........................................................................................40

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...................................................................................40

2.1. Материалы и оборудование.................................................................................................40

2.1.1. Объект исследования....................................................................................................40

2.1.2. Реактивы, среды, антибиотики....................................................................................41

2.2. Методы..................................................................................................................................44

2.2.1. Условия выращивания С. геткагШи...........................................................................44

2.2.2. Определение содержания хлорофилла и каротиноидов в клетках С.геткагёШ ....44

2.2.3. Измерение скорости выделения кислорода................................................................45

2.2.4. Измерение флуоресценции хлорофилла.....................................................................45

2.2.5. Выделение, очистка и манипуляции с плазмидной ДНК.........................................46

2.2.6. Электрофорез ДНК в агарозном геле..........................................................................46

2.2.7. Выделение геномной ДНК для ПЦР-анализа............................................................46

2.2.8. ПЦР-анализ геномной ДНК С. гетИагёШ на наличие маркерного гена................47

2.2.9. Электрофорез белков в полиакриламидном геле......................................................47

2.2.10. Иммуноблоттинг.........................................................................................................48

2.2.11.Выделение тилакоидных мембран и частиц ФС-2

из клеток С. геткагйШ .............................................................................................49

2.2.12. Трансформация клеток С. гетИагЖН........................................................................49

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ..........................................................................51

3.1. Функциональная характеристика и биогенез комплекса ФС-2

в клетках АрзЬО мутанта СЫатуйотопаз геткагёШ......................................................51

3.1.1. Особенности роста культур клеток дикого типа и АряЬО штамма С.геткагйШ ...52

3.1.2. Концентрация пигментов в клетках............................................................................53

3.1.3. Фотосинтетическое выделение кислорода.................................................................54

3.1.4. Анализ полипептидного состава пигмент-белковых комплексов тилакоидных мембран хлоропластов..........................................................................54

3.1.5. Фотоиндуцированные изменения выхода флуоресценции

хлорофилла ФС-2........................................................................................................56

3.1.6. Общая характеристика ФС-2 в клетках АрзЪО С.гетЬагйШ....................................62

3.2. Влияние замен К223Е и К226Е в белке РвЬО на стабильность

и функциональную активность ВОК фотосистемы 2 в клетках С. гетИагёШ ............66

3.2.1. Выбор участка в структуре белка РвЬО для внесения аминокислотных замещений.....................................................................................................................66

3.2.2. Получение штаммов С.геткагйШ с мутациями К223Е и К226Е

в белке РвЬО водоокисляющего комплекса ФС-2...................................................68

3.2.3. Функциональная характеристика мутанта К226Е С.геткагйШ..............................71

3.2.4. Функциональная характеристика мутанта К223Е С.гетЬагйШ...............................72

3.2.4.1. Исследование процессов фотоинактивации на клетках

и препаратах ФС-2 из К223Е мутанта С.гетЬагйШ....................................77

3.2.4.2. Влияние ионов Са2+ на фотохимическую активность ФС-2........................81

3.2.4.3. Влияние доноров электронов на кинетику работы ВОК..............................81

3.3. Заключение...........................................................................................................................85

ВЫВОДЫ.....................................................................................................................................88

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................................................89

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

В OK водоокисляющий комплекс

ДБМИБ 2,5-дибром-3-метил-6-изопропил-р-бензохинон (DBMIB), ингибитор

активности be/f комплекса

ДХБХ 2,6-дихлор-р-бензохинон (DCBQ), акцептор электронов

ГТФ гуанозин-б'-трифосфат

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

ИК инфракрасный

нм нанометр

кДа килодальтон

ПААГ полиакриламидный гель

п.н. пара нуклеотидов

ПЦР полимеразная цепная реакция

РЦ фотохимический реакционный центр

ССК светособирающий комплекс

ТМФД N,N,N' ,N' -тстрамстил-р-фенилендиамин (TMPD), донор электронов

т.п.н. тысяча пар нуклеотидов

Фео феофитин

ФС-1 фотосистема 1

ФС-2 фотосистема 2

Хл хлорофилл

ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭТЦ электрон-транспортная цепь

Ар ампициллин

BBY фрагменты тилакоидных мембран, обогащенные фотосистемой 2

(выделенные согласно [Berthold et al., 1981])

DCMU диурон, ингибитор электронного транспорта в ФС-2

DTT дитиотреитол

Е0/ стандартный редокс потенциал при рН 7,0

Fo начальный («темновой») уровень флуоресценции хлорофилла а

Fm максимальный уровень флуоресценции хлорофилла а

К223Е мутант C.reinhardtii по белку PsbO с заменой лизина (223) на

глутаминовую кислоту

К226Е мутант C.reinhardtii по белку PsbO с заменой лизина (226) на

глутаминовую кислоту

Кт константа Михаэлиса-Ментен

Рб8о первичный донор электрона в фотосистеме 2

Par паромомицин

PsbO марганецстабилизирующий белок, МСБ

Qa и Qq первичный и вторичный хиноновые акцепторы электрона в

фотосистеме 2

SDS додецилсульфат натрия

Yz аминокислотный остаток тирозина 161 белка D1 в фотосистеме 2

ВВЕДЕНИЕ

Фотосистема 2 - единственный в природе фермент, способный окислять воду, что позволяет растениям и цианобактериям использовать молекулы Н2О в качестве донора электронов при фотосинтезе. Для этого ФС-2 генерирует самый сильный биологический окислитель Рб8о+ с редокс-потенциалом ¡Р' = 1,26 В [Rappaport et al., 2002; Nelson and Yocum, 2006; Renger, 2011]. Такого потенциала достаточно, чтобы отнять электроны у молекулы воды (Е0' Н20/02 = 0,81В), однако сам хлорофилл Рбво+ воду не окисляет. Окисление происходит в расположенном рядом с Рбво+ водоокисляющем комплексе ФС-2, в каталитический центр которого входит четыре атома марганца и один атом кальция (Мп4Са05-кластер). Лигандами атомов марганца и кальция являются белки D1 и СР43 [Umena et al., 2011], которые вместе с белками D2, СР47, цитохромом Ь559 и Psbl формируют минимальный комплекс ФС-2 способный окислять воду в условиях in vitro. Однако подобный комплекс не стабилен и быстро инактивируется. Для его устойчивой работы необходимо присутствие внешних белков ВОК, связанных с донорной стороной ФС-2 [De Las Rivas and Barber, 2004; Bricker and Burnap, 2005; Bricker et al., 2012]. У высших растений и зеленых водорослей такими белками являются PsbO, PsbP и PsbQ, функция которых заключается в регуляции и стабилизации работы Мп-кластера. Центральную роль при этом играет белок PsbO, который непосредственно влияет на состояние Мп-кластера [Popelkova and Yocum, 2011; Bricker et al., 2012].

Согласно эволюционным представлениям белок PsbO является единственным белком ВОК, который есть у всех оксигенных организмов. Его включение в состав ВОК, по-видимому, произошло одновременно с возникновением у ФС-2 способности окислять воду, и у первых примитивных цианобактерий PsbO был единственным внешним белком, связанным с ВОК [De Las Rivas et al., 2004]. Другие внешние белки вошли в состав ВОК позднее, в связи с адаптацией к различным экологическим условиям [De Las Rivas et al., 2004; De Las Rivas et al., 2007]. В ходе исследования структуры и функции ВОК было установлено, что PsbO не образует связей с атомами марганца, однако его присутствие необходимо для нормального функционирования Мп-кластера в цикле окисления воды. Так, удаление белка PsbO из препаратов фотосистемы 2 снижает скорость фотосинтетического выделения кислорода и приводит к постепенному выходу в среду двух из четырех атомов марганца, входящих в состав ВОК [Miyao and Murata, 1984]. Наиболее распространена гипотеза о том, что PsbO функционирует в качестве барьера между Mn-кластером и внутритилакоидным пространством (люменом) хлоропластов, защищая каталитический центр от активных химических соединений (восстановители, металлы, ионы ОН" и пр.) [Williamson, 2008; Popelkova and Yocum, 2011]. Кроме того, из-

за своего положения PsbO может регулировать доступ ионов хлора, кальция, бикарбоната к ВОК и обеспечивать их удержание рядом с Mn-кластером, а также участвовать в отведении протонов из зоны реакции, формируя канал для их удаления. Тем не менее, несмотря на почти 30 лет исследований (с 1981 г.) функциональная роль белка PsbO в процессе фотосинтетического окисления воды остается неопределенной [Bricker and Frankel, 2011; Popelkova and Yocum, 2011; Bricker et al., 2012].

Одним из подходов в решении данной проблемы является метод сайт-направленного мутагенеза, при помощи которого можно изменить аминокислотную последовательность белка, и, следовательно, его структуру и функцию. Важным этапом при выполнении этой задачи является выбор модельной системы для исследования. В случае с PsbO наибольшее распространение получил метод изучения мутаций в условиях in vitro [Motoki et al., 2002; Williamson, 2008]. Для этих целей модифицированный белок PsbO синтезируют в бактериях E.coli, после чего его добавляют к препаратам ФС-2, у которых предварительно был удален собственный белок PsbO. При таком подходе происходит разрушение нативного комплекса ФС-2, а, кроме того, невозможно исследовать влияние мутации на биогенез ВОК ФС-2. Получить ответ на эти вопросы можно только при работе с живыми организмами, создавая мутации in vivo. До настоящего момента единственным объектом таких исследований были цианобактерии Synechocystis sp. [Burnap et al., 1994; Eaton-Rye, 2005]. Однако, учитывая значительную разницу в белковом составе ВОК между растениями и цианобактериями, а также и определенное различие в функции PsbO у этих организмов, переносить полученные результаты на растения не совсем корректно. Поэтому особый интерес представляет работа с эукариотическими организмами со сходным белковым составом.

Работа с растениями осложняется тем фактом, что ApsbO мутант у них не жизнеспособен, и, кроме того, мутации в белке делают ФС-2 чувствительной к фотоинактивации [Yi et al., 2005]. Решить описанные выше проблемы можно при использовании в качестве объекта исследования одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii. Как и высшие растения, хламидомонада является эукариотом с аналогичным белковым составом ВОК, и, кроме того, водоросль обладает уникальным метаболизмом. В отличие от высших растений, которые для роста нуждаются в свете (облигатные фототрофы), зеленая водоросль С. reinhardtii способна расти в темноте (гетеротрофно) на ацетате и, в тоже время, формировать зеленый активный хлоропласт [Harris, 2001; Grossman et al., 2004; Merchant et al., 2007]. Эта особенность позволяет изучать функциональное состояние и биогенез комплекса ФС-2 у эукариот in vivo, исключая повреждение ВОК вследствие фотоинактивации. Другими словами, изучать не

последствия фотоинактивации, а непосредственно влияние аминокислотных замен в белке на эффективность процесса фотосинтетического окисления воды.

Использование не содержащего PsbO мутанта С. reinhardtii, также могло бы помочь решить один из вопросов, связанный с участием белка PsbO в формировании стабильного комплекса ФС-2, и теми различиями, которые наблюдаются в биогенезе ФС-2 для прокариотических (цианобактерии) и эукариотических организмов (растения и зеленые водоросли). Так, у цианобактерий сборка ФС-2 происходит и в отсутствие белка PsbO, тогда как у высших растений и зеленых водорослей инактивация гена, кодирующего белок PsbO, приводит к потере комплекса ФС-2 и отсутствию роста в фотоавтотрофных условиях [Mayfield et al., 1987; Philbrick et al., 1991; Bricker and Frankel, 2011] .

Цели и задачи. Целью работы было исследование роли белка PsbO и некоторых его аминокислотных остатков (Lys223 и Lys226, расположенных на обращенной в люмен стороне белка и которые могут участвовать в формировании канала, соединяющего Мп-кластер с внутритилакоидным пространством) в стабилизации и функциональной активности ВОК фотосистемы 2 в клетках С. reinhardtii.

В процессе исследования решались следующие задачи.

1. Характеристика ApsbO мутанта С. reinhardtii, в том числе структурно-функционального состояния ФС-2, с выяснением возможности образования фотохимически активного комплекса ФС-2 в клетках темновой (гетеротрофной) культуры С. reinhardtii в отсутствие белка PsbO.

2. Разработка генетической системы для сайт-направленного мутагенеза белка PsbO фотосистемы 2 in vivo в эукариотических организмах с использованием зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii.

3. Внесение направленных аминокислотных замен К223Е и К226Е в структуру белка PsbO фотосистемы 2 и исследование влияния этих мутаций в белке PsbO на стабильность и функциональную активность ВОК в клетках С. reinhardtii.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ФОТОСИСТЕМЫ 2 Цианобактерии и растения в качестве доноров электронов при фотосинтезе используют воду. При этом в ходе реакции выделяется кислород, в связи с чем такой тип фотосинтеза получил название оксигенного. Две фотосистемы (1 и 2) работают в этом случае совместно, однако ключевая роль в окислении воды принадлежит ФС-2. Основной функцией ФС-2 является индуцируемое светом окисление воды с переносом электрона на пул пластохинонов, что характеризует ФС-2 как оксидоредуктазу. Уникальность же осуществляемого ФС-2 процесса заключается в величине окислительного потенциала (Е0/>+1,26В), который генерирует реакционный центр, что делает ФС-2 единственным известным в природе ферментом, способном окислять воду [Хелдт, 2011; Rappaport et al., 2002; Whitmarsh and Govindjee, 2002; Muh and Zouni, 2011].

Комплекс ФС-2 высших растений и зеленых водорослей включает более 20 полипептидов (рис. 1), из которых лишь 5 являются периферическими белками (PsbO, PsbP, PsbQ, PsbTn, Psb31) [Pagliano et al., 2013].

hv

Рис. 1 Схема расположения основных компонентов ФС-2 высших растений. Э1 (РзЬА) и Э2 (РзЬЭ) - белки с мол. массой 38 кДа; СР43 и СР47 - прочно связанные с РЦ светособирающие комплексы; РвЬО, РбЬР и РзЬС) - водорастворимые белки системы окисления воды; С>1 Ь559 - цитохром Ь559, имеющий максимум поглощения при 559 нм; Рбво - Димер хлорофилла, первичный донор электрона; РИео - молекула феофитина. первичный акцептор электрона; Ра и С^в - первичный и вторичный хиноновые акцепторы электрона; РС) - пул пластохинона; - вторичный донор электрона (Туг161 белка 01).

Остальные белки являются интегральными и содержат от 1 до 6 трансмембранных спиралей. Условно, все белки, входящие в ФС-2, можно поделить на три группы: 1) белки ядра и группа примыкающих к ним низкомолекулярных белков; 2) белки водоокисляющего комплекса (ВОК); и 3) полипептиды внешней антенны комплекса. Детали строения основных компонентов ФС-2 на настоящий момент хорошо известны благодаря данным рентгеноструктурного анализа ФС-2 цианобактерий [Kamiya and Shen, 2003; Ferreira et al., 2004; Loll et al., 2005b; Guskov et al., 2009; Umena et al., 2011]. В центре пигмент-белкового комплекса находится ядро ФС-2, включающее семь основных белков: Dl, D2, СР43, СР47, белок I, а также а- и ß-субъединицы цитохрома hs¡g. Ключевые функции в работе ФС-2 берут на себя белки D1 и D2, с которыми связаны все основные кофакторы переноса электронов, среди них:

• 6 молекул хлорофилла а, две из которых