Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фотопоглощение молекулярного кислорода на донорной стороне фотосистемы 2 в субхлоропластных мембранных препаратах с разрушенным водоокисляющим комплексом

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Фотопоглощение молекулярного кислорода на донорной стороне фотосистемы 2 в субхлоропластных мембранных препаратах с разрушенным водоокисляющим комплексом"

На правах рукописи

ообоьучо.

Яныкин Денис Валерьевич

Фотопоглощение молекулярного кислорода на донорной стороне фотосистемы 2 в субхлоропластных мембранных препаратах с разрушенным водоокисляющим комплексом

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

1 Я ГАИ 2013

Пущино-2013

005059467

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте фундаментальных проблем биологии Российской академии наук

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Климов Вячеслав Васильевич

Официальные оппоненты: Любимов Валерий Юрьевич,

доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт фундаментальных проблем биологии Российской академии наук, ведущий научный сотрудник

Мамедов Махир Джафар оглы, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А. Н. Белозерского, ведущий научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт биохимии имени А. Н. Баха Российской академии наук

Защита состоится «14» июня 2013 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 002.066.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте фундаментальных проблем биологии Российской академии наук по адресу: 142290, Московская обл., г. Пущино, ул. Институтская, д. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института фундаментальных проблем биологии Российской академии наук.

Автореферат разослан «2-2;» апреля 2013 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г. Н. Назарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Фотосинтетическое окисление воды - это фундаментальный биологический процесс, который является основным источником как электронов, используемых для фиксации СОг, так и молекулярного кислорода. Этот процесс происходит в мультикомпонентном пигмент-белковом комплексе, называемом фотосистемой 2 (ФС2). ФС2 состоит из двух основных функциональных блоков: фотохимического реакционного центра (РЦ), где происходит превращение энергии света, поглощенного хлорофиллом, в энергию разделенных зарядов и образуется самый сильный биологический окислитель катион-радикал первичного донора электрона -хлорофилла Р680+" (с редокс потенциалом, равным 1,1-1,27 В [Климов с соавт., 1979; Rappaport et al., 2002; Ishikita et al., 2005; Allakhverdiev et al., 2010]), и водоокисляющего комплекса (BOK), имеющего в своём составе каталитическое неорганическое ядро - Mr^CaOs-ioiacTep. Р680*" окисляет ВОК с образованием ряда промежуточных S-состояний (S0, Sb S2, S3, и S4), причём переход от S4 к So-состоянию сопровождается окислением двух молекул воды и образованием 02.

02 не только образуется в ФС2, но и взаимодействует с компонентами электронтранспортной цепи ФС2 с образованием активных форм кислорода (АФК) - синглетного кислорода ('02), супероксидного анион-радикала (02'~), пероксида водорода (Н2О2) и гидроксильного радикала (НО'). Светозависимое взаимодействие Ог с компонентами ФС2 было показано Бекиной с соавторами [Бекина с соавт., 1976]. Впоследствии были выявлены конкретные переносчики электрона в ФС2, с которыми взаимодействует 02 и идентифицированы образующиеся АФК. В ФС2 *02 образуется в основном при взаимодействии 3Ог с 3Р680*. Образование 3Р680* происходит в РЦ ФС2 при недостатке акцептора электрона, что способствует рекомбинации зарядов в паре P680"+Pheo*~ с образованием 3Р680* [Okamura et al., 1987; Telfer et al., 1988]. Известно, что 02 взаимодействует с восстановленными переносчиками электрона на акцепторной стороне ФС2 (первичным акцептором электрона Pheo'- и первичным и вторичным хиноновыми акцепторами электрона, Qa и QB~) с образованием 02'" и Н202. [Бекина с соавт., 1976; Klimov et al., 1993; Ananyev et al., 1994; Застрижная с соавт., 1997; Cleland and Grace, 1999; Pospisil et al., 2004]. Существуют доказательства возможности переноса электрона на 02 с пула пластохинона [Mubarakshina and Ivanov, 2010] и от цитохрома Ь559 [Pospisil et al., 2006]. Было показано, что фотообразование Н202 может происходить на донорной стороне после модификации ВОК ФС2 [Ананьев и Климов, 1988; Ананьев и Климов, 1989; Wydrzynski et al., 1989; Ananyev et al., 1992; Klimov et al., 1993]. Как полагают, при восстановлении Н202 как связанными с ФС2, так и свободными ионами переходных металлов в реакции Фентона образуется гидроксильный радикал [Pospisil, 2012].

При повреждении ВОК фотосистема 2 становится чувствительна к действию света высокой интенсивности, что приводит к нарушению структурно-функциональной организации (фотоингибированию), которое

происходит по так называемому "донорному" механизму через образование долгоживущих катион-радикала Р680" и Туг7.", способных окислять хлорофиллы, каротипоиды и аминокислоты [Те1Гег с1 а1., 1988; КПтоу й а1., 1990; ^егесЬоИе!^., 1990].

Ранее было обнаружено, что после инкубации препаратов ФС2 при щелочных значениях рН, приводящей к разрушению ВОК, наблюдается значительная активация фотопоглощения 02 [Хоробрых с соавт., 2002]. Было предположено, что фотопоглощение 02, наблюдаемое в . ФС2 с модифицированным ВОК, вызвано протеканием двух процессов: как восстановлением 02 переиосчиками электрона на акцепторной стороне ФС2 с образованием 02" , так и взаимодействием 02 с радикалами органических молекул, образующихся в результате их окисления Р680+" или ТутХ' на донорной стороне ФС2. Механизм фотопоглощения 02 на донорной стороне ФС2 с повреждённым ВОК и возможная роль этого процесса в функционировании ФС2 не выяснены, и исследование этой проблемы, представляющей значительный научный интерес, было предметом данной работы.

Цель и задачи. Цель работы — изучение механизма фотопоглощения 02 в препаратах ФС2, не содержащих ВОК (апо-ВОК-ФС2).

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Оценить вклад акцепторного и донорного участков ФС2 в фотопоглощение 02 при непрерывном и импульсном освещении апо-ВОК-ФС2.

2. Оценить квантовую эффективность поглощения 02 при импульсном освещении апо-ВОК-ФС2.

3. Исследовать влияние экзогенных Мп2+ и Са2+, основных кофакторов функционального Мп4Са05-кластера, на поглощение 02 при импульсном освещении апо-ВОК-ФС2.

4. С использованием флуоресцентной метки, с высокой специфичностью взаимодействующей с пероксидами, исследовать возможность фотообразования гидропероксидов на донорной стороне апо-ВОК-ФС2.

Научная новизна. Исследование фотопоглощения 02 в апо-ВОК-ФС2 при непрерывном и при импульсном освещении показало, что большая (около 70%) часть фотопоглощения 02 связана с донорной стороной ФС2. При освещении препаратов апо-ВОК-ФС2 микросекундными вспышками света фотопоглощение 02 происходит с высокой квантовой эффективностью, сравнимой с фотовыделением 02 в препаратах до удаления ВОК. Обнаружена значительная активация (до 85%) поглощения 02 при импульсном освещении апо-ВОК-ФС2 при добавлении Мп2+ в каталитических концентрациях (1-100 атомов Мп на один РЦ ФС2), которая не наблюдалась при добавлении других экзогенных доноров электрона для ФС2 (К4[Ре(СМ)б], дифенилкарбазида, а также ионов Ре2+, У7+, Сг2+). Показано, что добавление Са2+ (одного из компонентов ВОК) вызывает дополнительную активацию фотопоглощения 02 в присутствии Мп2+, что не проявляется при добавлении другого двухвалентного катиона М§2+. Впервые приведены экспериментальные доказательства фотообразования гидропероксидов на донорной стороне апо-

В0К-ФС2. Показано, что при освещении препаратов апо-ВОК-ФС2 образуется два типа гидропероксидов: гидрофильной и гидрофобной природы.

Практическая значимость. Полученные результаты расширяют и углубляют представления о механизмах взаимодействия кислорода с компонентами ФС2 растений, механизмах повреждения фотосинтетического аппарата, а также важны для оценки возможностей использования ФС2 в биотехнологических и биотехнических системах. Материалы диссертации могут быть использованы в лекциях и семинарских занятиях по биохимии и физиологии растений.

Апробация. Материалы диссертации были представлены на XVIII Пущинских чтениях по фотосинтезу и Всероссийской конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе» (2005); на XIX Пущинских чтениях по фотосинтезу и Всероссийской конференции «Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах», посвященной 100-летию со дня рождения В.Б. Евстигнеева (2009); на 14-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (2010); на 15-ом Международном конгрессе по фотосинтезу (г. Пекин, Китай, 2010); на Международной конференции "Photosynthesis Research for Sustainability" (г. Баку, Азербайджан, 2011); на VI съезде Российского фотобиологического общества (пос. Шепси, Краснодарский край, 2011); на XX Пущинских чтениях по фотосинтезу и Всероссийской конференции «Разнообразие путей электронного транспорта и углеродного метаболизма при фотосинтезе» (2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 2 статьи в зарубежных рецензируемых журналах и 6 тезисов докладов в материалах конференций.

Структура. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 133 страницах машинописного текста, включает 39 рисунков, 1 таблицу; библиография содержит 392 ссылки.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор литературных данных составляет первую часть диссертации и содержит современные представления о структурно-функциональной организации ФС2, механизме фотосинтетического окисления воды, химической природе АФК, и их образовании в ФС2, механизмах фотоингибирования ФС2 и фотоактивации водоокисляющего комплекса ФС2.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Тилакоиды выделяли из листьев шпината (Spinacea oleracea L.) по методике, описанной ранее [Miyake et al., 1994]. Субхлоропластные мембранные фрагменты, обогащенные ФС2 (ВВУ-частицы), выделяли по методу Бертольда с соавторами [Berthold et al., 1981] с модификациями [Ford

and Evans, 1983]. Удаление функционального марганца и других компонентов ВОК (Са2+ и водорастворимых белков) производили при помощи обработки препаратов ФС2 в среде с высокими значениями рН [Baranov et al., 2004].

Общее содержание хлорофилла определяли по методу Арнона [Arnon, 1949].

Определение количества Мп в препаратах ФС2 проводили с использованием атомно-абсорбционного спектрометра "КВАНТ-2А".

Фотоиндуцированные изменения выхода флуоресценции хлорофилла а (AF), связанные с фотовосстановлением первичного хинонового акцептора электрона ФС2 — QA, измеряли при комнатной температуре с помощью флуориметра ХЕ-РАМ (Walz, Germany). Действующий свет, который получали пропусканием белого света через фильтр BG-39, подавался через световод на кварцевую кювету (10*10 мм), помещённую в специальную камеру ED-101US/M ("Walts"); интенсивность света составляла 450 мкмолей фотонов • с"1 • м"2.

Скорость фотовыделения и фотопоглощения 02 в препаратах ФС2 определяли амперометрическим методом в термостатируемой ячейке с электродом Кларка при 25°С при освещении (А>650 нм, 1400-1500 мкмолей фотонов • с'1 • м'2) на полярографе LP7e (Чехия).

Для измерения выделения и поглощения 02 в BBY-частицах при импульсном освещении использовали горизонтальный электрод Кларка диаметром 5,5 мм, покрытый специальной мембраной толщиной 1 мкм [Ананьев с соавт., 1988; Ananyev et al., 1992].

Для определения фотообразования гидропероксидов в ФС2 была использована флуоресцентная метка 2-(4-дифенилфосфонилфенил)-9-(1-гексилгептил)анфра[2,1,9-úfe/6,5,10-d'e /']диизохшголип-1,3,8,10-тетраон (SPY-HP) [Soh et al., 2006]. Препараты ФС2, как необработанные, так и после удаления марганца, ресуспендировали в среде, содержащей 50 мМ MES-NaOH (рН 6,5) и 35 мМ NaCl, до концентрации хлорофилла, равной 50 мкг • мл"1, разделяли на две равные части. Одну часть помещали в темноту при 20°С, другую часть освещали светом {к > 650 нм). После этого 100 мкл освещенных или неосвещённых образцов добавляли к 900 мкл 2,7 мкМ раствора Spy-HP и инкубировали при температуре 37 °С в темноте в течение 5 мин или 3 часов, затем центрифугировали при 12000 оборотов в мин в течение 2 мин. В супернатанте измеряли спектр флуоресценции (530-620 нм, 524) на спектрофлуориметре Сагу Eclipse (Varían, США). Разница между спектрами флуоресценции освещённых и неосвещённых препаратов обозначена как спектр флуоресценции "свет минус темнота".

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование поглощения 02 при непрерывном освещении апо-ВОК-ФС2

При освещении функционально активных препаратов ФС2 в присутствии экзогенных акцепторов электрона 100 мкМ 2,6-дихлор-п-бензохинона (БСВ(3) и 1 мМ К3[Ре(СЫ)6]' наблюдается фотосинтетическое выделение 02 со скоростью 520±16 мкмолей 02 • (мг Хл)"1 • ч"1. Освещение таких препаратов в отсутствие экзогенных акцепторов электрона вызывает незначительное фотопоглощение 02 (менее 2 мкмолей 02 • (мг Хл)"1 • ч"1) (рисунок 1, кривая 1). В результате удаления ВОК из препаратов ФС2 (апо-ВОК-ФС2) происходит шестикратное увеличение фотопоглощения 02 (11-12 мкмолей 02 • (мг Хл)'1 • ч"1) (рисунок 1, кривая 2). Добавление к апо-ВОК-ФС2 20 мкМ диурона (БСМи), ингибитора транспорта электрона между первичным и вторичным хшкшовыми акцепторами электрона ФС2, (2А и <3в, приводит к практически

полпому подавлению фотопоглощения 02 (рисунок 1, кривая 3), что свидетельствует о необходимости переноса электрона в ФС2 для фотопоглощения 02. Добавление 100 мкМ БСВС) совместно с 1 мМ феррицианидом калия, которые с высокой эффективностью принимают электроны от

Рисунок 1. Кинетические кривые фотопоглощения 02 в препаратах ФС2 до (1) и после (2-6) удаления Мп. Измерения были проведены в среде, содержащей 50 мМ МЕБ-КаОН (рН 6,5) и 35 мМ №С1, при 20 мкг Хл • мл"1 в отсутствие (1-2) и в присутствии (3-6) добавок: 20 мкМ ЭСМи (3), 100 мкМ ОСВО и 1 мМ КзР^ООб] (4), 500 мкМ К4[1те(СЫ)й] (5), 100 мкМ ОСВ<3, 1 мМ К3[Ре(СЙ)6] и 500 мкМ К4[Ре(СЫ),;] (б). В скобках над кривыми показали скорости фотопоглощения 02 (мкмоль 02 • (мг Хл)'1 • ч"

). | и | - включение и выключение освещения (>>650 нм, 1400 мкмолей фотонов • с"1 • м"2), соответственно.

восстановленных хиноновых акцепторов электрона ФС2, подавляет скорость фотопоглощения 02 приблизительно на 30% (рисунок 1, кривая 4). В присутствии экзогенного донора электрона, 500 мкМ ферроциапида калия, фотопоглощение 02 подавлялось на 70-75% (рисунок 1, кривая 5). Совместное добавление искусственных акцепторов и доноров электрона к апо-ВОК-ФС2 приводит к практически полному ингибированию фотопоглощения 02 (рисунок 1, кривая б).

Далее нами была подробно исследована зависимость скорости фотопоглощения кислорода от концентрации искусственных акцепторов фСВС? и К3[Рс(СК)6]) и доноров (К4[Тс(СМ)б], дифенилкарбазида (ЭРС), и МпС12) электрона для ФС2. Показано, что при насыщающих концентрациях искусственных акцепторов электрона для ФС2 скорость фотопоглощения 02 остаётся довольно высокой и составляет около 70% от первоначального уровня, что свидетельствует о том, что около 70% фотопоглощения 02, наблюдаемого в присутствии экзогенных акцепторов электрона происходит не на акцепторной стороне ФС2, а может быть отнесено к донорной части ФС2. Для подтверждения этого предположения нами были проведены эксперименты с использованием искусственных доноров электрона. Показано, что по мере увеличения концентрации донора электрона фотопоглощение Ог постепенно уменьшается до стационарного уровня, который составляет 29%, 43% и 35% от контроля при добавлении К4[Те(СМ)б], ОРС и МпС12, соответственно.

Известно, что после удаления марганца из препаратов ФС2 фотоиндуцированные ДР, связанные с фотонакоплением восстановленного первичного хинонового акцептора электрона Од, не велики вследствие того, что такие препараты ФС2 не способны накапливать восстановленный (¿А (<2а ) в отсутствие экзогенного донора электрона. При добавлении доноров электрона выход АР многократно увеличивается в результате увеличения переноса электрона на Р680*", что способствует фотонакоплению Ра" [КНшоу й а1., 1982]. На рисунке 2 представлены зависимости скорости фотопоглощения 02 (кривая 1) и ДР (кривая 2) в апо-ВОК-ФС2 от концентрации экзогенного МпС12. На этом рисунке видно, что восстановление амплитуды фотоиндуцированных ДБ апо-ВОК-ФС2 при увеличении концентрации МпС12 сопровождается

Рисунок 2. Зависимость скорости фотопоглощения 02 при постоянном освещении (1) и фото индуцируемых 3 ДР (2) в апо-ВОК-ФС2 от р: концентрации экзогенного МпС12. Измерения фотопоглощения 02 и ДР были проведены в среде, содержащей 50 мМ МЕЗ-ИаОН (рН 6,5) и 35 мМ ЫаС1, при 20 и 10 мкгХл-мл"1, о 5 ю 15 :о 25 зо :оо соответственно.

Концентрация МпСЬ, мкМ

уменьшением фотопоглощения 02. Эти данные можно интерпретировать в пользу того, что часть (около 70%) фотопоглощения 02 происходит на донорной стороне ФС2, в условиях нарушения донирования электрона на РбвО^. Добавление каталазы лишь незначительно (на 2-5%) подавляет скорость фотопоглощения 02 в апо-ВОК-ФС2, следовательно, лишь небольшая часть поглощаемого 02 идёт на фотообразование пероксида водорода.

Е О О ¿5

йО

1,0 0.» 0,6 0.4 <У 0.0

Исследование поглощения 02 в апо-ВОК-ФС2 при импульсном освещении

Значительный интерес представляет изучение фотопоглощения 02 в апо-ВОК-ФС2 при освещении отдельными насыщающими микросекундными вспышками света, поскольку при этом в одном фотохимическом РЦ ФС2 происходит однократное фоторазделение зарядов, приводящее к появлению лишь одного положительного и одного отрицательного окислительно-восстановительных эквивалентов.

При освещении нативпых препаратов ФС2 серией микросекундных насыщающих вспышек света в присутствии экзогенного акцептора электрона феррицианида калия (1 мМ) наблюдается выделение 02 с типичным периодом 4 и максимумом выделения на 3-ю вспышку, в то время как в ответ на первую вспышку не наблюдается ни выделения, ни поглощения 02 (рисунок 3, кривая 1). После удаления марганца из препаратов ФС2 фотовыделения 02 не

происходит, а наблюдается

" фотопоглощение 02 с максимумом на 1-ю вспышку (кривая 2), которое практически полностью ингибируется при добавлении 20 мкМ БСМи (кривая 3). Амплитуда фотопоглощения 02 в ответ на 1-ю вспышку, была сравнима с амплитудой фотовыделения 02 в

Рисунок 3. Кинетические кривые выделения и поглощения 02 в ответ на серию микросекундных насыщающих вспышек света в препаратах ФС2 до (1) и после (2-4) удаления Мп. Измерения были проведены в среде, содержащей 50 мМ МЕЗ-ЫаОН (рН 6,5) и 35 мМ №01, в отсутствие каких-либо добавок (2) и в присутствии 1 мМ Кз[Ре(СЫ)б] (1) 20 мкМ БСМи (3) и 10 мкМ МпС12 (что соответствует 4 атомам Мп на один РЦ ФС2) (4). Концентрация хлорофилла при измерении составляла 500 мкг • мл'1. | показывают вспышки света, цифры под стрелками соответствуют номеру вспышки.

нативных препаратах ФС2 в присутствии экзогенных акцепторов электрона, регистрируемого на 3-ю вспышку.

Если считать, что выход 02 на третью насыщающую вспышку света в нативных препаратах ФС2 составляет 1 молекулу на один РЦ ФС2, то среднее количество 02, поглощаемого на первую вспышку, в препаратах ФС2,

лишённых марганца, составляет 0,8 - 0,9 молекул 02 на один РЦ. Эти данные показывают, что фотопоглощение 02 в апо-ВОК-ФС2 происходит с высокой эффективностью, близкой к таковой фотосинтетического окисления воды.

На рисунке 4 (кривая 1) показано влияние DCBQ на фотопоглощение 02 в апо-ВОК-ФС2 в ответ на первую вспышку света. Как видно из рисунка, добавление DCBQ (10 мкМ) приводит к 35%-ому ингибированию фотопоглощения 02. Экзогенный донор электрона K4[Fe(CN)6] (10 мкМ) существенно (на 80-85%) подавляет фотопоглощение 02 (рисунок 4, кривая 2). Подобное действие оказывает другой экзогенный донор электрона, DPC. При насыщающей концентрации DPC (100-200 мкМ) наблюдается уменьшение фотопоглощения 02 на 65-70%. Совместное добавление экзогенных донора (10 мкМ K4[Fe(CN)6]) и акцептора (100 мкМ DCBQ) электрона приводит к полному подавлению фотопоглощения 02, указывая на то, что фотопоглощение 02 происходит при окислительно-восстановительном взаимодействии 02 с компонентами ФС2.

Рисунок 4. Зависимость фотопоглощения 02 в апо-ВОК-ФС2 при освещении первой микросекундной вспышкой света от концентрации DCBQ (1) и K4[Fe(CN)<¡] (2). Измерения проводили в среде, содержащей 50 мМ MES-NaOH (рН 6,5) и 35 мМ NaCl, при концентрации хлорофилла 500 мкг • мл"1. 100% -фотопоглощение 02 в апо-ВОК-

ФС2 в ответ на первую вспышку света в отсутствие добавок.

Хотя действие экзогенных доноров и акцепторов электрона на фотопоглощение 02 в апо-ВОК-ФС2 при импульсном освещении несколько отличается от их действия при непрерывном освещении апо-ВОК-ФС2, можно отметить одну и ту же закономерность: фотопоглощение 02 — это результат реакций, протекающих как на акцепторной, так и на донорной стороне ФС2, причём значительный вклад (около 70%) в наблюдаемое фотопоглощение 02 вносит донорная сторона ФС2.

Ранее был предположен следующий возможный механизм фотопоглощения

02 на донорной стороне ФС2 [Хоробрых с соавт., 2002]. Нарушение донирования электрона к Р6804" приводит к окислению близлежащего окружения Р680+' и образованию органических радикалов, R". Такие радикалы,

как известно, эффективно взаимодействуют с 02 с образованием

соответствующих пероксил-радикалов (ROO"), поскольку 02 выигрывает конкуренцию за R" у всех реагентов [Hawkins and Davies, 2001; Denisov and Afanas'ev, 2005]. В дальнейшем, в результате протонирования ROO' образуются гидропероксиды (ROOH) (реакция 1).

100-

*

»)■

о

О S 60-

я

в>

g 40-

к

¡а 20-

е

Концентрация K4[Fe(CN)<s], мкМ

О 20 40 60 80 100 1000 ----,-,---,---,---,—/Ai—'

í\

í \

i. \

0 20 40 60 80 100

Концентрация DCBQ, мкМ

Таким образом, если предположить, что фотопоглощение 02 есть сумма двух процессов: восстановление 02 на акцепторной стороне и его окислительно-восстановительное взаимодействие на донорной апо-ВОК-ФС2 (согласно схеме, описанной выше), то на каждую молекулу 02, поглощённую на донорной стороне (реакция 1), будет поглощаться 1/2 молекулы 02 на акцепторной стороне (реакция 2). - ё - н+ + о2 + ё + н+ RH-» R* —♦ ROO -► ROOH (1)

о2Иог^ V2H202 + '/202 (2)

В таком случае, вклад донорной и акцепторной сторон в фотопоглощение 02 в апо-ВОК-ФС2 будет составлять около 70% и 30%, соответственно. Это согласуется с экспериментально полученными данными по измерению скорости поглощения 02 при непрерывном освещении препаратов ФС2 при добавлении экзогенных акцепторов и доноров электрона.

Исследование влияния нонов Мп2+ и Са2+ на фотопоглощение 02 при импульсном освещении апо-ВОК-ФС2

Обнаружено, что МпС12 в узкой области концентраций (от 1 мкМ до 100 мкМ) активирует поглощение 02, регистрируемое при освещении апо-ВОК-ФС2 серией микросекундных насыщающих вспышек света (рисунок 3, кривая 4; рисунок 5). Максимального значения (до 85%) стимуляция фотопоглощения 02 в апо-ВОК-ФС2 достигает при добавлении 5-10 мкМ МпС12 (что соответствует 2-4 атомам Мп на один РЦ ФС2). По мере увеличения концентрации Мп2+ до 20-100 мкМ активирующий эффект Мп2+ значительно понижается, а при больших концентрациях Мп2+ (> 200-400 мкМ) наблюдается ингибирование фотопоглощения 02 (рисунок 5). В зависимости от образца, концентрация Мп2+, при которой проявляется максимальный активирующий эффект, варьирует от 10 мкМ до 100 мкМ.

Мп2+/РЦ

200 400

0 25 50 75 100 5001000

Концентрация МпСЬ, мкМ

Рисунок 5, Зависимость поглощения 02 в апо-ВОК-ФС2 в ответ на первую вспышку света от концентрации МпС12. Измерения проводили в среде, содержащей 50 мМ \iES-NaOH (рН 6,5) и 35 мМ №С1, при концентрации хлорофилла 500 мкг • мл"1. 100% фотопоглощение 02 в апо-ВОК-ФС2 в ответ на первую вспышку света в отсутствие добавок.

Как известно, в препаратах ФС2, лишённых ВОК, повышается чувствительность к ингибирующему действию света. Ранее было показано, что

фотоингибирование приводит к необратимой потере способности ФС2 к реактивации фотопереноса электрона на донорной стороне ФС2 с помощью экзогенного Mn2+ [Klimov et al., 1990]. В настоящей работе показано, что 5-ти минутное предосвещение апо-ВОК-ФС2 постоянным светом (X > 650 нм, 900 мкМ фотонов • с"1 • м"2) подавляло фотоиндуцированную реактивацию AF с помощью экзогенного Мп2+ и вызывало уменьшение поглощения 02, при импульсном освещении апо-ВОК-ФС2. Кроме того, ингибирующее предосвещение препаратов подавляло оба эффекта марганца: активацию фотопоглощения при низких концентрациях Мп2+ и ингибирование фотопоглощения при высоких концентрациях. Полученные данные свидетельствуют о том, что для проявления этих эффектов Мп2+ необходима функционально активная донорная сторона ФС2, способная к окислительно-восстановительному взаимодействию с экзогенным Мп2+.

Предположено, что Мп2+-индуцируемая активация фотопоглощения 02, регистрируемого при импульсном освещении апо-ВОК-ФС2, может быть вызвана следующими возможными реакциями.

а) Связывание Мп2+ с апо-ВОК-ФС2 может приводить к структурным изменениям в ФС2, которые, в свою очередь, могут вызывать увеличение фотопоглощения 02 на акцепторной и/или донорной стороне ФС2.

б) Активация поглощения 02 при импульсном освещении апо-ВОК-ФС2 при добавлении Мп2+ может происходить в результате окисления органических молекул с помощью Мп3+, который образуется при фотоокислении Мп2+.

в) Мп2+-индуцируемая активация фотопоглощения 02 может происходить благодаря окислительно-восстановительному взаимодействию Мп с АФК (гидропероксиды, 02"~, Н202), формирующимися при импульсном освещении апо-ВОК-ФС2, с образованием радикалов, которые могут вызывать дополнительное поглощение 02.

г) Мп2+ -индуцируемая активация фотопоглощения 02 в апо-ВОК-ФС2 может отражать участие 02 или его активных форм в формировании неорганического ядра ВОК (МщСаСН-кластера), в частности, (Мп3+)2(сП-ц-оксо) комплекса, который является ключевым промежуточным соединением в фотосборке марганцевого кластера.

Для изучения природы Мп2+-индуцируемой активации фотопоглощения 02 в апо-ВОК-ФС2 было проведено исследование действия двухвалентных ионов металлов (Ме2+) двух типов на поглощение 02 при импульсном освещении препаратов: (1) непереходных металлов, имеющих электронную конфигурацию ns2, таких как Mg, Са, Sr и (2) переходных металлов, имеющих, как и Мп, электронную конфигурацию ns2{n-l)ef, таких как Со, Fe, V and Сг. Показано, что добавление Mg2+, Са2+ и Sr2+ не влияет на поглощение 02 при импульсном освещении апо-ВОК-ФС2. Это может указывать на то, что Мп2+-индуцируемая активация фотопоглощения 02 в апо-ВОК-ФС2 не вызвана структурными изменениями в ФС2, которые могли бы иметь место при увеличении концентрации ионов металлов. По всей видимости, эффект марганца связан с участием Мп2+ и/или Мп3+, образующегося в результате фотоокисления добавленного Мп2+, в окислительно-восстановительных реакциях на донорной

стороне ФС2. Добавление Со2+, имеющего высокий потенциал окисления (Е° для Со2+/Со3+ составляет 1,808 В), не влияет на фотопоглощение 02 в апо-ВОК-ФС2 при импульсном освещении. Добавление F с'', V2+ и Сг2+, имеющих низкий окислительный потенциал (Е° для Fe2+/Fe3+, V2+/V3+ и Cr2+/Cr3+ составляет 0,771, 0,255 и -0,407 В, соответственно), подавляет фотопоглощение 02 в апо-ВОК-ФС2 при импульсном освещении. Добавление Fe2+ и V2+, в отличие от Со2+, приводило к восстановлению AF в ФС2. Однако, в отличие от Мп2+, который также способен донировать электроны на РЦ ФС2, другие ионы ns2(n-l){f типа (Co2f, Fe2+, V2+ и Сг2+) не активируют фотопоглощение 02 во всём диапазоне исследуемых концентраций (до 2,5 мМ Ме2+).

Как отмечалось выше, Мп2+-индуцируемая активация фотопоглощения 02 при импульсном освещении апо-ВОК-ФС2 может отражать участие 02 в фотоформировании неорганического ядра ВОК, в частности, в формировании (Мп3+)2(сН-ц-оксо) комплекса. Известно, что Са2+ является необходимым кофактором для сборки Мп4Са05-кластера и для 02-выделяющей активности ВОК ФС2 [Ananyev and Dismukes 1997; Baranov et al. 2004; Tyryshkin et al. 2006]. Мы рассмотрели действие ионов Са2+ на Мп2+-иидуцируемую активацию фотопоглощения 02 в апо-ВОК-ФС2. Выявлено, что Са2+ активирует поглощение 02 при импульсном освещении апо-ВОК-ФС2 в присутствии Мп2+. Показано, что эффект Са2+ зависит от концентрации добавленного Мп2+: он достигает максимального значения при ~5 мкМ Мп2+, а с увеличением концентрации уменьшается и исчезает при 100 мкМ Мп2+, когда Мп2+-индуцируемая активация фотопоглощения 02 достигает максимального значения. Кроме того, в присутствии Са2+, для максимального проявления Мп2+-индуцируемой активации требуются более низкие концентрации Мп2+. Показано, что в присутствии 5 мкМ Мп2+ стимулирующий эффект Са2+ возрастает при концентрации Са2+ от 2,5 до 7,5 мкМ (1-3 Са2+ на один РЦ ФС2), а при дальнейшем увеличении концентрации эффект Са2+ уменьшается и исчезает при достижении 100 мкМ Са2+. В то же время, в отсутствие Мп2+ кальций не оказывает влияния на фотопоглощение 02.

При замене Са2+ на Mg2+ активации поглощения 02 в апо-ВОК-ФС2 при импульсном освещении не наблюдается как в отсутствие, так и в присутствии Мп2+ в среде, и даже наблюдается некоторое снижение Мп2'-индуцированной активации фотопоглощения 02 (рисунок 6, кривая 2). Последующее добавление ионов Са2+ приводит к уменьшению ингибирующего эффекта магния и дальнейшей активации Мп2+-индуцируемого поглощения 02 при импульсном освещении апо-ВОК-ФС2. При этом, в присутствии Mg2+ требуется 14-ти кратное увеличение концентрации Са2+ для достижения максимальной активации фотопоглощения 02 (10 мкМ и 140 мкМ Са2+ в отсутствие и в присутствии 100 мкМ Mg2+, соответственно) (рисунок 6).

Са2'/РЦ 100 200

300

400

170

О

160

150

К 140

130

¿ш ч> У

Обнаруженный нами эффект Са2+ может свидетельствовать в пользу того, что фотопоглощение 02 в препаратах связано с процессом реконструкции Мп4Са05-кластера ВОК, поскольку этот

I

Ч-

0

1000

эффект был свойственен только для Са2+, который, в отличие от других двухвалентных ионов пб2 типа, необходим для

восстановления кислород-вьщеляющей активности ВОК (хотя не исключена возможность того, что на первых стадиях сборки этого энзиматического центра

усиливается фотодеструкция донорной стороны ФС2, которая сопровождается

фотопоглощением 02). Можно предположить, что

обнаруженный нами эффект Са2+ на Мп2'-активируемое фотопоглощение 02 в апо-ВОК-ФС2 обусловлен действием Са2+ на участок связывания Мп2+ в апо-ВОК-ФС2.

250 500 750 Концентрация СаС12, мкМ

Рисунок 6. Зависимость поглощения 02 в апо-ВОК-ФС2 в ответ на первую вспышку света от концентрации экзогенного СаС12 в присутствии 10 мкМ МпС12 (1) и 10 мкМ МпС12 совместно с 100 мкМ MgCl2 (2). Измерения проводились в среде, содержащей 50 мМ МЕЗ-ИаОН (рН 6,5) и 35 мМ №С1, при концентрацик хлорофилла 500 мкг • мл"1. 100% - поглощение 02при импульсном освещении безмарганцевых препаратов ФС2 в отсутствие добавок.

Экспериментальные доказательства фотообразования гидропероксидов на донорной стороне апо-ВОК-ФС2

Была проведена экспериментальная проверка предположения о том, что фотопоглощение 02 в апо-ВОК-ФС2 сопровождается образованием гидропероксидов на донорной стороне ФС2 в реакции взаимодействия 02 с радикалами органических молекул, R\ образующимися в результате окисления органических молекул катион-радикалом Р680*" или TyrZ". Для определения гидропероксидов в ФС2 мы использовали флуоресцентную метку Spy-HP (2-(4-

дифенилфосфонилфенил)-9-(1-гексилгептил)анфра[2,1,9-(/е/6,5,10-с?,е/'1диизо-

хинолин-1,3,8,10-тетраон) [Soh et al., 2006]. Известно, что Spy-HP вступает в реакцию с гидропероксидами с образованием окисленного продукта, Spy-НРОх, что приводит к значительному увеличению флуоресценции. В качестве контроля было изучено влияние известных гидропероксидов (тетр-бутилгидропероксида (ТБГ) и 3-хлорпербензойной кислоты (ХБК)) и Н202 на флуоресценцию Spy-HP. Полученные данные показывают, что взаимодействие

Spy-HP с гидропероксидами зависит от типа гидропероксида: для выявления липофильного гидропероксида (LP-ООН; например, ХБК) достаточно инкубации в течение 5 мин при использовании низких концентраций гидропероксида, тогда как для регистрации гидрофильного гидропероксида (НР-ООН; например, ТБГ) и Н202 требуется более длительная инкубация (несколько часов) и высокая концентрация гидропероксида.

Для определения фотообразования гидропероксидов в ФС2 был использован подход, подробно описанный в главе "Материалы и методы".

На рисунке 7 представлен дифференциальный "свет минус темнота" спектр флуоресценции Spy-HP. Освещение в течение 3 мин необработанных препаратов ФС2 незначительно увеличивает интенсивность флуоресценции Spy-HP (рисунок 7, кривая 1), в то время как в случае апо-ВОК-ФС2 освещение приводит к существенному (8-кратному) возрастанию флуоресценции Spy-HP (рисунок 7, кривая 2). Для выяснения природы образующихся в апо-ВОК-ФС2 гидропероксидов была изучена зависимость флуоресценции Spy-HP от времени инкубации флуоресцентной метки с предварительно освещенными препаратами (рисунок 8, кривая 1). На графиках можно выделить две компоненты: быструю - нарастание флуоресценции в первые 5 мин инкубации предосвещённых препаратов ФС2 в присутствии флуоресцентной метки, и медленную -нарастание флуоресценции в последующее время инкубации. На основе данных о том, что скорость реакции гидропероксидов с Spy-HP зависит от их гидрофобности, быстрая компонента была отнесена к фотообразованию липофильных, а медленная — гидрофильных гидропероксидов в апо-ВОК-ФС2. Для того, чтобы оценить возможный вклад 02*~ и пероксида водорода, образующихся при освещении препаратов ФС2, в исследуемый эффект, эксперименты были проведены в присутствии супероксиддисмутазы (SOD) и каталазы. Как видно на рисунке 8 (кривая 2), присутствие этих ферментов во время освещения ФС2 не подавляет рост флуоресценции Spy-HP, а приводит даже к незначительному повышению интенсивности флуоресценции, что может быть вызвано удалением Н202, который может служить донором электрона для ФС2. Полученные данные свидетельствуют о том, что флуоресценция Spy-HP, вызванная длительной инкубацией флуоресцентной метки с освещенными

Длина волны, нм

Рисунок 7. Дифференциальные «свет-минус темнота» спектры

флуореценции SPY-HP = 524 нм), при добавлении необработанных препаратов ФС2 (1) и апо-ВОК-ФС2 (2). Образцы освещали светом (?>600 нм, 1500 мкмолей фотонов • с"1 • м"2) в течение 3 мин. Время инкубации образцов в реакционной среде, содержащей Spy-HP, составляло 5 мин.

препаратами ФС2, не связана с фотообразованием 02"~ или Н202 в апо-ВОК-ФС2. В дальнейшем, чтобы исключить влияние пероксида водорода на флуоресценцию Spy-HP, все эксперименты проводили в присутствии SOD и катал азы.

Было исследовано влияние диурона, доноров (DPC и K4[Fe(CN)6j) и акцептора (K3[Fe(CN)6]) электрона на фотообразование гидропероксидов в апо-ВОК-ФС2. Значительное (70-75%-ое) подавление фотообразования LP-ООН и НР-ООН 50 мМ диуроном свидетельствует о том, что данная реакция связана с электронным транспортом в ФС2. Небольшое ингибирование (-10%) образования LP-ООН и НР-ООН при добавлении K3[Fe(CN)e] к апо-ВОК-ФС2 может быть объяснено возможным образованием незначительных количеств ROOH из АФК на акцепторной стороне ФС2 или донированием электрона от продукта фотовосстановленния K3[Fe(CN)6] на ФС2, что может привести к подавлению фотообразования ROOH на донорной стороне ФС2. Полученные результаты свидетельствуют о том, что образование ROOH на акцепторной стороне ФС2, если таковое имеется, очень мало и не сопоставимо с общим

Рисунок 8. Зависимость

флуоресценции Spy-HP (Х.^ = 524 нм, ^-ип = 538 нм) от времени инкубации апо-ВОК-ФС2 в спиртовом растворе флуоресцентной метки. Препараты апо-ВОК-ФС2 освещали (Х>600 нм, 1500 мкмолей фотонов • с"1 • м"2) в течение 3 минут в отсутствие (кривая 1) и присутствии (кривая 2) SOD (200 ФЕ • мл"1) и каталазы (500 ФЕ • мл"1) и, затем, инкубировали с раствором Spy-HP в этаноле при 37°С указанное количество времени.

Добавление донора электрона DPC к апо-ВОК-ФС2 перед освещением приводит к значительному (80-90%) подавлению фотообразования как LP-ООН, так и НР-ООН. Можно предположить, что донор электрона препятствует фотонакоплению Р680*" или TyrZ", подавляя таким образом образование органических пероксидов в апо-ВОК-ФС2. Добавление другого донора электрона, IC,[Fe(CN)6], к апо-ВОК-ФС2 оказывало аналогичное влияние на фотообразование ROOH.

Показано, что добавление DPC и K4[Fe(CN)6] к препаратам апо-ВОК-ФС2 после их освещения не влияет на период полураспада гидропероксидов, равный приблизительно 12 мин Таким образом, подавление формирования гидропероксидов в апо-ВОК-ФС2 с помощью DPC и K4[Fe(CN)6] происходит исключительно за счёт донирования электрона о них на ФС2. Эти результаты соответствуют данным, полученным при изучении фотопоглощения 02 в апо-

количеством регистрируемых ROOH.

30 60 90 120 150 180

Время инкубации, мин

В0К-ФС2, и подтверждают нашу гипотезу о том, что фотопоглощение 02 на донорной стороне ФС2 приводит к образованию ROOH.

При добавлении FeCl2 (реагента Габера-Вейса, который вызывает разложение пероксидов по реакции Фентона) к препаратам апо-ВОК-ФС2 после их освещения увеличения флуоресценции, вызванной образованием Spy-НРОх при взаимодействии Spy-HP с гидропероксидами, практически не происходит. В то же время, РеС12 не влияет на флуоресценцию Spy-HPOx, образованную в реакции Spy-HP с 0,5 мкМ ХБК. Эти данные подтверждают образование пероксидов при освещении апо-ВОК-ФС2.

Чтобы оценить количество образованных в апо-ВОК-ФС2 LP-ООН и НР-ООН, исследовали зависимость фотообразования обоих типов гидропероксидов от интенсивности света. "Световые кривые" образования LP-ООН и НР-ООН выходят на плато при различных интенсивностях света (25 и 750 мкмолей фотонов • с"1 • м'2, соответственно). При освещении апо-ВОК-ФС2 течение 3 мин при интенсивности освещения 750 мкмолей фотонов • с"1 • м"2 образуются -4 молекулы липофильных гидропероксидов на один РЦ ФС2 со скоростью —0,37 мкмолей • (мг Хл)"1 • ч"1 и —200 молекул гидрофильных гидропероксидов на один РЦ ФС2 со скоростью -18 мкмолей • (мг Хл)"1 • ч"1. Суммарная скорость фотообразования гидропероксидов (18,37 мкмолей • (мг Хл)"1 • ч"1) сопоставима со скоростью фотопоглощения 02 в апо-ВОК-ФС2 (11-12 мкмолей • (мг Хл)"1 • ч"1).

Таким образом, с использованием новой флуоресцентной метки для регистрации гидропероксидов (Spy-HP), показано, что фотообразование ROOH происходит на донорной стороне апо-ВОК-ФС2 и зависит от электронного транспорта в ФС2. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что фотообразование гидропероксидов в апо-ВОК-ФС2 происходит при взаимодействии 02 с радикалами органических молекул, R', образующимися на донорной стороне ФС2 в результате окисления органических молекул катион-радикалом Р6804" или TyrZ'. Выявлено два типа гидропероксидов, образующихся на донорной стороне ФС2: липофильной и гидрофильной природы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований было обнаружено, что удаление марганца из ВОК препаратов ФС2 приводит к значительному увеличению фотопоглощения 02, которое подавляется ингибитором электронного транспорта диуроном, что свидетельствует о необходимости фотопереноса электрона в ФС2 для протекания этого процесса. Показано, что большая часть поглощения 02 (около 70%), наблюдаемого при непрерывном и импульсном освещении апо-ВОК-ФС2, связана с донорной стороной ФС2 и может быть вызвано взаимодействием 02 с радикалами, образующимися при фотоокислении органических молекул катион-радикалом Р680^ или TyrZ". Это предположение нашло подтверждение в экспериментах с использованием новой флуоресцентной метки Spy-HP, специфичной для гидропероксидов, которая впервые была применена для фотосинтетических объектов. Впервые представлены экспериментальные доказательства фотообразования гидропероксидов на донорной стороне апо-ВОК-ФС2. Обнаружено, что при освещении в течение 3 мин препаратов апо-ВОК-ФС2 образуются гидропероксиды гидрофильной и гидрофобной природы, в количестве ~4 и -200 молекул на один РЦ ФС2, соответственно. Предположено, что формирование гидропероксидов может инициировать фотоингибирование по так называемому "донорному механизму".

Показано, что при импульсном освещении апо-ВОК-ФС2, наблюдается фотопоглощение 02 с максимумом на первую вспышку, и его амплитуда сравнима с амплитудой флеш-индуцированного фотосинтетического выделения 02, измеренного в препаратах ФС2 до удаления марганца, что свидетельствует о высокой квантовой эффективности фотопоглощения 02. Обнаружено, что поглощение 02 при импульсном освещении апо-ВОК-ФС2 стимулируется каталитическими концентрациями Мп2+ (2,5-250 мкМ или 1-100 Mn/РЦ), в то время как более высокие концентрации Мп2+ (> 200-400 цМ) ингибировали фотопоглощение 02 (так же, как и другие доноры электрона для ФС2: ферроцианид калия и дифенилкарбазид). Показано, что для протекания процесса фотопоглощения 02 в апо-ВОК-ФС2 при импульсном освещении, а также для его активации экзогенным Мп2+ необходима функционально активная донорная сторона ФС2, способная к окислительно-восстановительному взаимодействию с экзогенным Мп2+. Обнаружена дополнительная активация Мп2+-индуцируемого фотопоглощения 02 при добавлении Са2+, которая не наблюдается при добавлении катионов других двухвалентных металлов. Полученные данные позволяют сделать предположение о том, что фотопоглощение 02 в апо-ВОК-ФС2 может отражать не только процессы, приводящие к фотоингибированию ФС2, но и вероятное участие 02 (или его активных форм) в фотоформировании неорганического ядра ВОК ФС2.

ВЫВОДЫ

1. На препаратах ФС2, не содержащих водоокисляющего комплекса (препараты апо-ВОК-ФС2), выделенных из хлоропластов шпината, выявлено фотопоглощение 02 как при непрерывном, так и при импульсном освещении, которое подавляется специфическим ингибитором электронного транспорта -диуроном, что свидетельствует о связи фотопоглощения 02 с переносом электрона в ФС2.

2. Показано, что большая (около 70%) доля фотопоглощения 02 в препаратах апо-ВОК-ФС2 связана с донорной стороной ФС2, о чём свидетельствуют данные о влиянии на фотопоглощение 02 экзогенных доноров и акцепторов электрона, и вероятно обусловлена взаимодействием 02 с радикалами, образованными при фотоокислении органических молекул катион-радикалом Р680+' или Туг?/.

3. Показано, что при освещении серией микросекундных вспышкек света амплитуда фотопоглощения 02 в препаратах апо-ВОК-ФС2 сравнима с амплитудой фотовыделения 02 в препаратах до удаления ВОК, что свидетельствует о высокой квантовой эффективности фотопоглощения 02.

4. Обнаружено, что в отличие от других экзогенных доноров электрона для ФС2 (К4[Ре(СЫ)б], дифенилкарбазида, а также катионов Ре2+, У2*, Сг2+), добавление Мп2+ в микромолярных концентрациях активирует (до 85%) флеш-индуцированное поглощение 02 в препаратах апо-ВОК-ФС2, которое подавляется при потере способности донорной стороны ФС2 к окислительно-восстановительному взаимодействию с экзогенным Мп2+.

5. Впервые приведены экспериментальные доказательства фотообразования гидропероксидов на донорной стороне апо-ВОК-ФС2. Показано, что при освещении препаратов апо-ВОК-ФС2 образуется два типа гидропероксидов: гидрофильной и гидрофобной природы.

6. На основании полученных данных сделано предположение о том, что фотопоглощение 02 на препаратах ФС2, не содержащих водоокисляющего комплекса, может отражать не только процессы, приводящие к фотоингибированию ФС2, но и вероятное участие 02 (или его активных форм) в формировании неорганического ядра ВОК.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Yanykin D.V., Khorobrykh А.А., Khorobrykh S.A., Klimov V.V. (2010) Photoconsumption of molecular oxygen on both donor and acceptor sides of photosystem II in Mn-depleted subchloroplast membrane fragments. Biochimica et Biophysica Acta 1797, p. 516-523.

2. Khorobrykh S.A., Khorobrykh AA., Yanykin D.V., Ivanov B.N., Klimov V.V., and Mano J., (2011) Photoproduction of Catalase-Insensitive Peroxides on the Donor Side of Manganese-Depleted Photosystem II: Evidence with a Specific Fluorescent Probe. Biochemistry 50, p. 10658-10665.

3. Хоробрых AA, Хоробрых C.A., Яныкин Д.В., Иванов Б.Н., Климов В.В. и Jun'ichi Mano (2011) Фотообразование органических пероксидов на донорной стороне ФС2, не содержащей водоокисляющего комплекса. VI съезд Российского фотобиологического общества, пос. Шепси, 15-22 сентября, НИА-Природа, Материалы съезда, с. 32.

4. Яныкин Д.В., Хоробрых А.А., Хоробрых С.А., Климов В.В. (2009) Фотопоглощение кислорода при постоянном и импульсном освещении препаратов фотосистемы 2 после полного удаления марганца. XIX Пущинские чтения по фотосинтезу и Всероссийская конференция «Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах», посвященная 100-летию со дня рождения В.Б. Евстигнеева, ООО «Петроруш», Программа конференции, тезисы докладов, с. 69.

5. Яныкин Д.В., Хоробрых А.А., Хоробрых С.А., Климов В.В. (2010) Исследование фотопоглощения кислорода на донорной стороне фотосистемы 2 после разрушения водоокисляющего комплекса. 14-ая Международная Пущинская Школа-Конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, Сборник тезисов, т. 2, с. 346.

6. Yanykin D.V., Khorobrykh А.А., Khorobrykh S.A., Klimov V.V. (2010) Removal of Mn from the water-oxidizing complex induces oxygen photoconsumption on the donor side of photosystem II. 15th International Congress on Photosynthesis, August 22-27, Beijing, China. Book of abstracts, p 22.

7. Yanykin D.V., Khorobrykh AA., Khorobrykh S.A., Klimov V.V. (2011) Photoconsumption of oxygen on the donor side of PSII after manganese removal from the water-oxidizing complex. International Conference Photosynthesis Research for Sustainability, July 24-30, Baku, Azerbaijan. Abstracts, p 52.

8. Хоробрых C.A., Хоробрых A.A., Яныкин Д.В., Иванов Б.Н., Климов В.В., Mano J. (2012) Нарушение донирования электрона от Мп4Са05 кластера к Р680*" приводит к образованию органических пероксидов на донорной стороне ФС2. XX Пущинские чтения по фотосинтезу и Всероссийская конференция «Разнообразие путей электронного транспорта и углеродного метаболизма при фотосинтезе», Пущино, Программа конференции, тезисы докладов, с. 56.

Подписано в печать: 24.04.2013

Заказ № 8422 Тираж - 120 экз. Печать трафаретная. Объем: 1 усл.п.л. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Яныкин, Денис Валерьевич, Пущино

Содержание

Список сокращений и терминов 4

Введение 7

Глава 1. Обзор литературы 11

1.1 Структурно-функциональная организация фотосистемы 2 12

1.1.1 Светособирающий комплекс фотосистемы 2 13

1.1.1.1 Антенна "ядерного" комплекса фотосистемы 2 13

1.1.1.2 Периферический антенный комплекс 14

1.1.2 Реакционный центр фотосистемы 2 15

1.1.3 Водоокисляющий комплекс фотосистемы 2 20

1.1.3.1 Мп4Са05-кластер 20

1.1.3.2 Дополнительные участки связывания Са2+ и СГ 22

1.1.3.3 Внешние белки водоокисляющего комплекса фотосистемы 2 24

1.1.3.4 Механизм фотосинтетического окисления воды 26 1.1.3.5. Роль ТухХ и ТугО в окислении воды 33 1.1.3.6 Каналы в фотосистеме 2 35

1.2 Активные формы кислорода 36

1.2.1 Синглетный кислород 37

1.2.2 Супероксидный анион-радикал 39

1.2.3 Пероксид водорода 40

1.2.4 Гидроксильный радикал 41

1.2.5 Липидные пероксиды 43

1.3 Образование активных форм кислорода в фотосистеме 2 43

1.3.1 Образование активных форм кислорода, связанное с переносом энергии возбуждения 44

1.3.2 Образование активных форм кислорода, связанное с транспортом электрона в фотосистеме 2 45

1.4 Механизмы фотоингибирования фотосистемы 2 47

1.4.1 Ингибирование ультрафиолетом 49

1.4.2 Ингибирование видимым светом 49

1.4.2.1 Акцепторный тип фотоингибирования 49

1.4.2.2 Донорный тип фотоингибирования 51

1.4.3 Деградация белка 51

1.5 Фотоформирование водоокисляющего комплекса фотосистемы 2 52

Введение

[Рс^бП е1 а1., 2006]. Было показано, что фотообразование Н2О2 может происходить на донорной стороне после модификации ВОК ФС2 [Ананьев и Климов, 1988; Ананьев и Климов, 1989; \Уус1ггуп81а ег а1., 1989; Апапуеу ^ а1., 1992; КНшоу е1 а1., 1993]. Как полагают, при восстановлении Н2О2 как связанными с ФС2, так и свободными ионами переходных металлов в реакции Фентона образуется гидроксильный радикал [Розр1э11, 2012].

При повреждении ВОК фотосистема 2 становится чувствительна к действию света высокой интенсивности, что приводит к нарушению структурно-функциональной организации (фотоингибированию), которое происходит по так называемому "донорному" механизму через образование долгоживущих катион-радикала Р680+' и Тугё', способных окислять хлорофиллы, каротиноиды и аминокислоты [Те1£ег ег а1., 1988; КНшоу ег а1., 1990; ^егесЬок! й а1., 1990].

Ранее было обнаружено, что после инкубации препаратов ФС2 при щелочных значениях рН, приводящей к разрушению ВОК, наблюдается значительная активация фотопоглощения О2 [Хоробрых с соавт., 2002]. Было предположено, что фотопоглощение Ог, наблюдаемое в ФС2 с модифицированным ВОК, вызвано протеканием двух процессов: как восстановлением О2 переносчиками электрона на акцепторной стороне ФС2 с образованием Ог'-, так и взаимодействием Ог с радикалами органических молекул, образующихся в результате их окисления Р680+' или Тугё* на донорной стороне ФС2. Механизм фотопоглощения О2 на донорной стороне ФС2 с повреждённым ВОК и возможная роль этого процесса в функционировании ФС2 не выяснены, и исследование этой проблемы, представляющей значительный научный интерес, было предметом данной работы.

Цель и задачи

Цель работы - изучение механизма фотопоглощения О2 в препаратах ФС2, не содержащих ВОК (апо-ВОК-ФС2).

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить вклад акцепторного и донорного участков ФС2 в фотопоглощение Ог при непрерывном и импульсном освещении апо-ВОК-ФС2.

2. Оценить квантовую эффективность поглощения Ог при импульсном освещении апо-ВОК-ФС2.

3. Исследовать влияние экзогенных Мп и основных кофакторов функционального МщСаО5-кластера, на поглощение Ог при импульсном освещении апо-ВОК-ФС2.

Введение

Баку, Азербайджан, 2011); на VI съезде Российского фотобиологического общества (пос. Шепси, Краснодарский край, 2011); на XX Пущинских чтениях по фотосинтезу и Всероссийской конференции «Разнообразие путей электронного транспорта и углеродного метаболизма при фотосинтезе» (2012). Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 2 статьи в зарубежных рецензируемых журналах и 6 тезисов докладов в материалах конференций.

Глава 1. Обзор литературы

Высшие растения, зелёные водоросли и цианобактерии выполняют комплекс биологических процессов, названный оксигенным фотосинтезом, во время которого происходит трансформация энергии солнечного света в энергию химических связей органических соединений, а также разложение воды и выделение молекулярного кислорода. Концентрация молекулярного кислорода со времени появления оксигенного фотосинтеза выросла в 105 раз, что привело к коренным изменениям на Земле: появилась аэробная атмосфера, образовался озоновый слой, поглощающий большую часть ультрафиолетового излучения. Таким образом, сформировались условия для развития аэробного метаболизма, образовалось множество новых форм жизни. Все эти факторы определяют ключевую роль фотосинтеза в функционировании биосферы.

Фотосинтез растений происходит в клетках, содержащих зелёные пластиды -хлоропласты. Хлоропласт ограничен снаружи двумя слоями мембраны, составляющих оболочку хлоропласта. Внутреннее пространство хлоропласта занимает бесцветный матрикс, называемый стромой, в толще которой находится система замкнутых уплощённых мембран, называемых тилакоидами. Тилакоиды сгруппированы в стопки -граны, которые связаны между собой свободно расположенными мембранами -ламеллами стромы. Мембраны тилакоидов и ламелл стромы состоят из двойного липидного слоя и погружённых в него белковых комплексов: фотосистемы 2 (ФС2), цитохромов 6</, фотосистемы 1 (ФС1), АТФ-синтазы (рисунок 1).

ФС2 расположена в областях межмембранных контактов тилакоидов. ФС1 и АТФ-синтазы расположены преимущественно в частях мембраны, обращённых к строме, то есть в краевых областях мембран тилакоидов, а также в мембранах, окружающих граны. В мембранах происходит преобразование световой энергии и транспорт электронов при фотосинтезе. Строма содержит ферменты цикла Кальвина, катализирующие темновые реакции восстановления СОг до углеводов. Цианобактерии, или сине-зелёные водоросли, не содержат хлоропластов. Фотосинтез у цианобактерий происходит в расположенных параллельными слоями ламеллярных мембранах, пронизывающих всю цитоплазму [Холл, Pao, 1983].

Обзор литературы

"Второстепенный" антенный комплекс образован тремя мономерными Chi-а!Ъ-содержащими белками, Lhcb4 (СР29), Lhcb5 (СР26) и Lhcb6 (СР24), каждый из которых содержит до 5% от общего количества Chi (рисунок 3). В отличие от "основного" светособирающего комплекса, они не фосфорилируются в условиях сильного освещения, так как более тесно связаны с антенным комплексом ядра ФС2. Предполагается, что одной из функций "второстепенного" антенного комплекса является связывание "основного" светособирающего комплекса.

"Основной" светособирающий (антенный) комплекс фотосистемы 2 (ССК2) - это важнейший пигмент-белковый комплекс, ассоциированный с ФС2. ССК2 вместе с ФС2 образуют ФС2-ССК2-суперкомплекс (рисунок 3), в котором несколько ССК2 окружают ядро реакционного центра (рисунок 3). ССК2 состоит из трех высоко гомологичных Chl-a/6-содержащих белков (Lhcbl, Lhcb2, Lhcb3 в соотношении 8:3:1), которые могут быть собраны в гомо- и гетеротримеры. Однако, наличие гомотримеров, образованных Lhcb3, обнаружено не было. Обычно к димерному ядерному комплексу ФС2 присоединяется четыре копии тримеров ССК2. Две копии (CCK2-S) прикрепляются к димеру ядра ФС2 (С2) через СР26 и СР29 (соседнего мономера) и две копии (ССК2-М) - через СР24 и СР29, образуя СгЗгМг-суперкомплекс [Boekema et al., 1999]. Суперкомплексы шпината могут присоединять третий тип тримеров CCK2-L, но СгБгМгЬ^г-суперкомплексы очень редки. В условиях избыточного освещения, когда восстанавлен пул пластохинонов, происходят конформационные изменения в цитохром Ьб/f-комплексе (Cyt Ьб/f), что вызывает активацию Cyt ЬбАГ-связанных киназ. Эти ферменты, в свою очередь, участвуют в фосфорилировании ССК2. Фосфорилированные ССК2 способны к движению в плоскости тилакоидной мембраны от ФС2 к ФС1, регулируя таким образом поступление энергии света к этим фотосистемам [Bennett, 1977; Kouril et al., 2005; Lemeille and Rochaix, 2010; Koufil et al., 2012].

1.1.2 Реакционный центр фотосистемы 2

Реакционный центр ФС2 содержит интегральные белки D1 (PsbA) и D2 (PsbD), каждый из которых содержит 5 трансмембранных а-спиралей, которые располагаются в мембране приблизительно параллельно друг другу и образуют структуру с С 2 -симметрией [Barber et al., 1987]. В состав РЦ ФС2 входит третий интегральный белок - цитохром Ь559. На белках D1 и D2 расположены кофакторы переноса электрона в ФС2 - фотоактивная А-цепь: TyrZ, Р680, Chloi, Pheooi, Qa и Qb- Энергия света, поглощенная пигментами светособирающего комплекса ФС2, переносится к первичному донору электрона Р680 -специализированному димеру хлорофиллов а, известному как специальная пара PdiPd2

Обзор литературы

1.1.3.3 Внешние белки водоокисляющего комплекса фотосистемы 2

На люменальной стороне ФС2 находятся три водорастворимых белка, называемых внешними белками ВОК. У высших растений и зелёных водорослей это PsbO (с молекулярной массой 33 кДа), PsbP (23 кДа) и PsbQ (17 кДа). PsbO - единственный белок ВОК, который встречается у всех оксигенных организмов. Аноксигенные фотосинтезирующие бактерии не содержат белков, аналогичных PsbO. Белки ВОК эукариотических фотосинтезирующих организмов кодируются ядерным геномом.

PsbO содержит одну дисульфидную связь, которая способствует поддержанию конформации белка и способности его связывания с ФС2 [Tanaka et al., 1989]. Белок PsbO непосредственно соединяется с белками РЦ ФС2, что стабилизирует МщСаО 5 -комплекс [Ghanotakis et al., 1984а]. Удаление этого белка из ФС2 достигается обработкой 0,8 М Трис-HCl (рН 8,0-8,2) или мочевиной высокой концентрации [Miyao and Murata, 1984а, Miyao and Murata, 1984b]. Обработка препаратов ФС2 0,8 M Трис (рН 8,0-8,2) приводит и к удалению функционального Мп, тогда как обработка 2,6 М мочевиной оставляет МщСаО5-кластер интактным [Ono and Inoue, 1984; Bricker, 1992]. При удалении PsbO из препаратов ФС2 два из четырех ионов марганца каталитического центра окисления воды выходят в среду [Miyao and Murata, 1984b], однако МщСаО 5 -кластер сохраняется, если в среде присутствуют ионы хлора в высокой концентрации (>100 мМ). При этом происходит фотосинтетическое выделение кислорода препаратами ФС2, хотя со значительно меньшей скоростью (20-40 % от исходного уровня) [Miyao and Murata, 1984Ь]. При удалении PsbO наблюдается увеличение времени жизни состояний S2 и S3, а также ингибирование переходов S2—*и S3—>[S4]—>So [Ono and Inoue, 1984; Franzen et al., 1985; Lindberg et al., 1986; Miyao et al., 1987], хотя, согласно другим исследованиям, комплекс ФС2 собирается при темновом выращивании мутанта [Пиголев с соавт., 2009]. У мутанта Chlamydomonas reinhardtii с инактивацией гена psbO (мутант ApsbO) нарушается сборка комплексов ФС2 [Mayfield et al., 1987]. У мутанта ApsbO Synechocystis РСС6803 отсутствие белка PsbO не препятствует сборке функционально активных комплексов ФС2, этот мутант способен к фотоавтотрофному росту и обладает кислородвыделяющей активностью, хотя и с пониженной скоростью [Burnap and Sherman, 1991], но для автотрофного роста он нуждается в повышенных концентрациях ионов кальция и хлора в среде [Philbrick et al., 1991], а также характеризуется повышенной чувствительностью к фотоингибированию [Komendaand Barber, 1995].

Функции PsbO до конца не выяснены. Существует несколько гипотез о функциях

этого белка. На протяжении многих лет возможность участия PsbO в связывании Са2+

рассматривается как одна из функций этого белка. В частности, было показано, что

24

Обзор литературы

метаболиты и компоненты практически не окисляются триплетным кислородом без участия катализаторов. Окисление метаболитов в клетке кислородом происходит, в основном, с участием ферментов. Триплетный кислород, однако, может активно реагировать со свободными радикалами органических молекул, а также с молекулами, находящимися в триплетном состоянии. В этом случае снимается спиновое ограничение. Тем не менее, окисление субстратов триплетным кислородом, даже если снято спиновое ограничение, затруднено. Причиной этого является то, что внешние разрыхляющие орбитали частично заняты и отрыв электрона возможен только от соединений с низким редокс-потенциалом; Ео = -0,16 В для одноэлектронного восстановления молекулы 3Ог [Fee and Valentine, 1977].

Известен ряд форм кислорода, обладающих большой реакционной способностью. Такие формы кислорода получили название активных форм кислорода (АФК). К АФК относят: супероксидный анион-радикал (О2* ), пероксидный анион (О22 ), гидроксильный радикал (НО*), синглетный кислород ('Ог), пероксид водорода (Н2О2), а также соответствующие радикалы органических молекул: пероксидный радикал ROO*), гидропероксид (ROOH) и алкоксильный радикал (RO*). Время жизни органических форм активного кислорода обычно больше, чем "свободных" АФК, и их рассматривают как долгоживущие формы активного кислорода.

1.2.1 Синглетный кислород

Обращение спина одного из неспаренных электронов триплетного кислорода приводит к образованию синглетного кислорода. Существует два вида кислорода в синглетном состоянии: '2+g02 с энергией 37 ккал/моль и ]Ag02 с энергией 23 ккал/моль. В состоянии 12+ёОг валентные электроны с разным спиновым квантовым числом локализованы на различных разрыхляющих орбиталях, а в состоянии ]Ag02 валентные электроны спарены и локализованы на одной из разрыхляющих орбиталей. Молекула синглетного кислорода в 'S+g02 состоянии крайне нестабильна и быстро переходит в Ag02 состояние (за 10й с"1). Тушение 'Ag02 состояния до триплетного - более медленный процесс, чем трансформация 1 S+g02 состояния до !Ag02. Время жизни кислорода в состоянии 'Ag02 в водной среде составляет 3,9 мкс [Rodgers and Snowden, 1982]. В неполярной среде время жизни этого состояния возрастает и составляет 12 мкс для этанола и 24 мкс для бензола. В тяжелой воде время жизни 'Ag02 увеличивается примерно в 20 раз и составляет 68 мкс [Krasnovsky, Jr., 1998]. В различных компартментах клетки время жизни 'Ag02 различно. Так, в липидной мембране время жизни 'Ag02