Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Хемилюминесцентное исследование функционирования марганцевого кластера фотосистемы и растений

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Хемилюминесцентное исследование функционирования марганцевого кластера фотосистемы и растений"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ И ФОТОСИНТЕЗА

РГБ ОД

1 3 Ч На правах рукописи

УДК 577.152.5

ПУТРЕНКО ИГОРЬ ИВАНОВИЧ

ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ МАРГАНЦЕВОГО КЛАСТЕРА ФОТОСИСТЕМЫ II РАСТЕНИЙ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Пущино - 1996

Работа выполнена в Институте почвоведения и фотосинтеза РАН

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.В. Климов

кандидат биологических наук Г.М. Ананьев

доктор химических наук, профессор Г.Г. Комиссаров

доктор биологических наук А.Н. Мальян

Ведущее учреждение: Институт биохимии им. Баха РАН

Защита диссертации состоится " " инэнл 1996 г. в /ч час. на заседании специализированного совета Д.200.29.01 в Институте почвоведения и фотосинтеза РАН по адресу: 142292, Пущино, ИПФС РАН, конференцзал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИПФС РАН

Автореферат разослан " 2 5 " 1995 р.

Учёный секретарь Специализированного Совета доктор биологических наук

Б.Н. Иванов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Фотосинтетическое окисление воды, сопровождающееся вы-елением молекулярного кислорода в атмосферу, осуществляется в мембраносвязан-ом пигмент-белковом комплексе, называемым фотосистемой II (ФСН). Фундаменталь-:ая модель механизма фотосинтетического окисления воды, предложенная Жолио с оавт. (Joliot et al., 1969), предполагает, что водоокисляющий комплекс последова-ельно окисляется, проходя через 5 промежуточных состояний, известных как Sj-coc-ояния (¡=0-4), для того чтобы накопить энергию четырех фотонов, необходимую для кисления двух молекул НгО. Водоокисляющий комплекс, возможно, включает етыре иона марганца, часть из которых (или все) функционируют как катализаторы, лклически меняющие окислительно-восстановительное состояние (Debus, 1992).

Однако, структура и лигандное окружение марганцевого кластера водоокисляю-lero комплекса в различных S-состояниях и механизм окисления воды остаются [редметом дискуссий из-за трудности непосредственного измерения химического и лектронного состояния марганца в каждом S-состоянии. Основными методами в ис-ледовании данных проблем являются оптические и ЭПР методы, а интерпретация «зультатов основывается на анализе структуры аналогичных синтетических поли-дерных комплексов марганца.

Ранее Ананьевым и Климовым (1989) была обнаружена медленная хемилюминес-[енции системы люминол-пероксидаза, индуцируемая освещенными частицами ФСП, ;оторую интерпретировали как результат взаимодействия хемилюминесцентной сис-емы с окисленными состояниями марганца водоокисляющего комплекса ФСИ (S2 и >3 состояния). В тоже время, оставался непонятным конкретный механизм образова-[ия данного свечения, а также тот факт, что окисленный до трех- и четырехва-[ентного состояния марганец, присутствующий и в So, S| и S2 состояниях водо-1Кисляющего комплекса, не участвует в индукции хемилюминесценции. Исследование :ышеуказанных проблем могло бы пролить свет на структурную и функциональную |рганизацию водоокисляющего комплекса ФСП.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы было исследование механизма |бразования медленной хемилюминесценции люминола, индуцируемой марганцевым ластером ФСИ. Основными задачами являлось:

1) Разработать подход с использованием хемилюминесцентного метода (люминол-[ероксидазная система) для изучения структуры и функций марганцевого кластера t>CII;

2) Определить активные формы кислорода, непосредственно участвующие в обра-овании медленной хемилюминесценции люминола, индуцируемой препаратами ФСН;

3) Изучить роль марганца ФСИ в образовании активных форм О2 и зависимость ;анной способности от S-состояний водоокисляющего комплекса.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований разработан но вый подход в изучении структурной и функциональной организации водоокисляющегс комплекса ФСН с использованием хемилюминесцентного метода. Показано, что пе роксид водорода и молекулярный триплетный кислород являются инициаторами мед ленной хемилюминесценции, индуцируемой препаратами ФСН. Обнаружена люминол оксидазная активность водоокисляющего комплекса ФСН. Данная активность наблю дается при взаимодействии Мп-кластера с гидроксильными ионами и максимальна £ присутствии ионов НРО42". Показано, что оксидазная активность водоокисляющегс комплекса в Эз-состоянии превышает в 2-6 раз оксидазную активность в Эц^ состояниях. Обнаружена способность координационных соединений марганца в присутствии ионов НРО42" и фосфатного комплекса Мп(П) катализировать образование Н2О2 из О2 при участии люминола в качестве донора электронов, которая зависит от типа лиганда, входящего в структуру комплекса, и типа растворителя (апротонный или протонный). Установлено, что при 82-83 переходе происходит изменение в ли-гандном окружении Мп-кластера водоокисляющего комплекса, связанное с гистиди-новым остатком белка 01 и/или включение дополнительных атомов кислорода из субстратных молекул Н2О в структуру кластера.

Научная и практическая значимость работы. Полученные результаты могут иметь существенное значение в понимании организации и функционирования водоокисляющего комплекса ФСН и механизма окисления воды, а также в изучении эволюционного развития ФСН. Разработанный подход с использованием люминол-пероксидазной системы позволяет использовать хемилюминесцентный метод в изучении активного сайта как водоокисляющего комплекса ФСН, так и других марганец-содержащих ферментов. Обнаруженная способность соединений марганца катализировать образование Н2О2 может представлять интерес при разработке синтетических моделей активных сайтов марганец-содержащих ферментов и изучении путей образования радикальных форм кислорода в растительной клетке.

семинарах по фотосинтезу (Берлин, 1993; Пущино, 1995), международной конференции "Мембранная биоэнергетика" (Москва, 1995), втором симпозиуме ОФР "Физико-химические основы физиологии растений" (Пенза, 1996).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (объекты и методы исследования, результаты и обсуждение), заключения, выводов и списка цитируемой литературы.

Материалы диссертации докладывались на германо-российских

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературных данных составляет первую часть диссертации. В нём изложены современные представления о структурно-функциональной организации водо-экисляющего комплекса фотосистемы II.

Объекты и методы исследования описаны в экспериментальной части работы. В экспериментах использовали Ог-выделяющие субхлоропластные препараты ФСН, выделенные из шпината с помощью Тритона Х-100 (Berthold et al., 1981) с модификациями (Ford and Evans, 1983). Выделения Ог частицами ФСН измеряли с помощью горизонтального электрода типа Кларка.

Измерение ХЛ люминола (А.тах=425 нм) проводили на установке, описанной ранее (Ананьев и Климов, 1989), с использованием реакционной среды, содержащей 200 мМ фосфатный буфер, рН 8,0-8,5, и 0,5-1 мМ пероксидазу.

Фотоиндуцированные изменения выхода флуоресценции (AF) измеряли при помощи установки, описанной ранее (Карапетян и др., 1973). Содержание Мп в частицах ФСН определяли с помощью атомно-абсорбционного спектрофотометра AAS-503 («Perkin-Elmer>>, США).

В работе также использовались синтетические координационные комплексы марганца, предоставленные профессором Ч. Дисмюксом (Tang et al., 1993).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Хемилюминесценция люминола. индуцируемая препаратами ФСН. Внесение неосвещенных или освещенных одной вспышкой света частиц ФСН, адаптированных к темноте в течение 30 мин при 4 °С, в систему люминол-пероксидаза индуцирует медленно возгорающуюся ХЛ (назовем ее сигнал В'), максимум интенсивности которой приходится на 3-5 мин после смешивания (рис. 1). Частицы ФСН, освещенные пятью вспышками света, индуцируют ХЛ, состоящую из быстрой (сигнал А) и медленной (сигнал В) компонент, максимальных соответственно через 0,2-0,3 сек и 60-90 сек после начала измерения. Сигнал А обусловлен Н2О2, образующейся в результате восстановления О2 компонентами акцепторной части ФСН (Ананьев и Климов, 1988) и в нашей работе не рассматривается. Величина (площадь) сигнала В превосходит величину сигнала В' в 2-6 раз. Частицы ФСН, к которым перед освещением добавлен 20 мкМ диурон, ингибитор транспорта электронов в ФСН, индуцируют только сигнал В'. Таким образом, разность между сигналами В и В' (сигнал АВ) является светоиндуцируемой и зависимой от переноса электронов в ФСН.

Как показано на рис. 2 (зависимость 1) величина сигнала АВ зависит от числа вспышек света. Модель Кока (Forbush et al., 1971) была использована для того, чтобы определить с каким S-состоянием связан сигнал АВ. Расчет проводился по формуле: Si=(l-a-/>)Si_i+aSi+/5Si.2, где а - представляет промахи, а >5 - двойные попадания. В

3

м

■0,5

т т 1-

■0 180 сеу

Рис. 1. Хемилюминесценция системы люминол - пероксидаза, индуцируемая 10 иМ раствором Н2О2 (1), частицами ФС11, выдержанными 30 мин в темноте (2), освещенными одной вспышкой света (3), освещенными пятью вспышками света (4), освещенными пятью вспышками света в присутствии 20 мкМ диурона (5). Стрелками обозначен момент впрыскивания частиц в реакционную среду

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Число вспышек

Рис. 2. Сигнал ДВ (1) и вычисленная популяция Эз-состояния водоокисляющего комплекса (50=30%, в^О0/», а=0,54, р=0,03, Эг-Э, - 15%, Бз-Бг - 20%) (2) в зависимости от числа вспышек света

наших экспериментах измерение производилось через 10 сек после освещения образца. Поэтому вычисления отражают ожидаемый 1040% переход S2 и S3 в низшие S-состояния водоокисляющего комплекса, который происходит в течение данного периода времени (Messinger and Renger, 1994; Joliot et al., 1971). Конечный результат представлен в виде зависимости 2 (рис. 2), которая является распределением вычисленной популяции Бз-состояния при условии что а=0,54, /5=0,03, Sq=25% и Sj=75% (начальное распределение S-состояний в темноте) и коэффициенты распада -0,15 и 0,2 для S2-S, и S3-S2 переходов, соответственно.

Сигналы В' и В ингибируются при удалении Мп из частиц ФСН с помощью обработки 20 мМ ТЕМЕД и не восстанавливаются при последующем добавлении 40 мкМ аскорбата Na - искусственного донора электронов для ФСН (не показано), что свидетельствует о связи медленной ХЛ, индуцируемой частицами ФСП, как освещенными, так и неосвещенными, с Мп водоокисляющего комплекса.

Полученные результаты показывают, что медленная ХЛ, индуцируемая неосвещенными и освещенными частицами ФСН, схожа по механизму образования и отличается лишь тем, что в отличие от сигнала В' сигнал ДВ является фотозависимым. Сигнал В', на который практически не влияет изменение соотношения Sq/Si состояний и появление Зг-состояния в ответ на первую вспышку (популяция S3-c0-стояния на первую вспышку, возникающая в результате двойных попаданий, незначительна, поэтому ею можно пренебречь), СВЯЗаН С Sq, Sb $2*СОСТОЯНИЯМИ. Причем величина сигнала В' для каждого из этих состояний одинакова. Сигнал ДВ, незначительный на первую и резко возрастающий на вторую вспышку света, связан с 53-состоянием водоокисляющего комплекса. Это подтверждается тем фактом, что теоретически рассчитанные изменения популяции 5з-состояния в зависимости от числа вспышек при определенных значениях а и /5 близки к изменениям сигнала ДВ. Достаточно высокое значение а (промахи), равное 0,54, вероятно, связано с высокой оптической плотностью образца.

2. Хемилюминесиенция люминола. индуцируемая синтетическими комплексами марганца. Ранее (Ананьев и Климов, 1989) было показано, что МпС1г индуцирует ХЛ люминола (tmax=l мин), вероятно, схожую по природе с сигналом В. Возникновение медленной ХЛ, индуцируемой частицами ФСН, как указывалось выше, также связано с Мп. Поэтому изучение природы ХЛ, индуцируемой ионами Мп, как акваионами, так и координированными различного рода лигандами, могло бы пролить свет на механизм образования медленной ХЛ. В нашей работе помимо МпС1г были использованы следующие синтетические комплексы Мп: ((phen)2Mn'"(u-0)2Mnlv(phen)2)3+ (комплекс 1), где phen = 1,10-фенантролин; ((bipy)2MnII,(n-0)2MnIV(bipy)2)3+ (ком-

плекс 2), где Ыру = 2,2'-дипиридин; (Мпш(рЬеп)з)3+ (комплекс 3); (НВРг3)Мпш(ц-0)(ц-02С11)2Мпш(НВР2з) (комплекс 4), где И = СН3, НВРг3 = гидротрис-(пиразолил)борат; ((ТАСК)Мп1и(й-0)2(|Д-02СН)Мп1У(ТАСК))2+ (комплекс 5), где ТАСЫ = 1,4,7-триазациклононан, И = СНз; и ((ТАСЫ)4Мп41УОб)4+ (комплекс 6). Данные комплексы также использовались для имитации активных центров Мп-каталазы (КЬап£и1оу е1 а1., 1993) и водоокисляюшего комплекса ФСН (Ресогаго е! а!., 1994). Поэтому их можно рассматривать, в какой-то степени, как искусственные модели Мп-кластера ФСН, а механизм индукции ХЛ ими соотносить с механизмом индукции ХЛ природным Мп-кластером.

Индуцируемая данными комплексами ХЛ максимальна через 2-5 сек после начала измерения, а длительность составляет от 10 до 60 мин. Необходимо отметить, что все вышеуказанные соединения Мп индуцируют ХЛ люминола в отсутствие добавок Н202 в реакционную среду. Интенсивность ХЛ, индуцируемой комплексами, растворенными перед измерением в ОМБО, превышает интенсивность ХЛ, индуцируемой комплексами, растворенными в Н20, за исключением комплекса 3 (не показано). Это связано с тем, что в водной фазе происходит гидролиз комплексов Мп (51уага]а Ы а1., 1989).

3. Участие кислорода и его активных форм в индукции хемилюминесиенции люминола. Как известно (Токмаков, 1993), ХЛ люминола в протонной среде может быть вызвана триплетным и, возможно, синглетным 02, а также его восстановленными ад-дуктами: супероксидным и гидроксильным радикалами, Н202. Однако 100 мМ этанол (ловушка гидроксильных радикалов) и 1 мМ №N3 (тушитель синглетного кислорода), добавленные в реакционную среду, не оказывали заметного влияния на сигналы ДВ и В', и ХЛ, индуцируемую соединениями Мп.

Таблица 1

Концентрация белков, находящихся в реакционной среде (рН 8,5) и ингибирующих на 50% ХЛ люминола, индуцируемую Н202, соединениями Мп и частицами ФСП

Инициаторы ХЛ люминола /50, мкМ

каталаза цитохром с гемоглобин пероксидаза альбумин

1 мкМ Н202 0,16 16,1 5,1 9,2

40 мкМ МпС12 0,15 15,8 4,8 10,1

10 мкМ комплекс 4 0,17 16,8 5,3 9,4

Частицы ФСН сигнал ДВ 0,14 17,5 4,9 9,8

сигнал В' 0,15 17,1 ' 4,7 10,5

"Ингибирование не наблюдалось 6

Цитохром с, диспропорционирующий супероксидные радикалы, и каталаза, добавленная в реакционную среду, ингибируют ХЛ люминола, индуцируемую как препаратами ФСН (сигналы В' и ДВ), так и соединениями Мп (таблица ! ). Однако эффективность ингибирования ХЛ каталазой на два порядка выше, чем цитохромом с. Вместе с тем, гемсодержащие белки (в отличие от альбумина), такие как гемоглобин и перок-сидаза, ингибируют ХЛ в концентрациях, близких к таковой для цитохрома с. Все гемсодержащие белки подавляют ХЛ, индуцируемую 1 мкМ Н2О2, в концентрациях, близких к таковым для ХЛ, индуцируемой частицами ФСП и соединениями Мп.

Каталаза, добавленная к препаратам ФСН или соединениям Мп до измерения ХЛ, практически не влияла на свечение в концентрации 0,06 мкМ. В тоже время, при добавлении каталазы в указанной концентрации к контрольной 1 мкМ Н2О2 до измерения ХЛ, свечения не наблюдалось.

Полученные нами результаты показывают, что ХЛ, индуцируемая частицами ФСИ (сигналы В' и ДВ) и используемыми нами соединениями Мп, подавляется каталазой в более низкой концентрации чем другими гемсодержащими белками и, следовательно, индуцирована Н2О2. Ингибирующее действие гемоглобина, цитохрома с и перокси-дазы, вероятно, связано с наличием у них гемового Fe, способного, как известно (Wang, 1955), к окислительно-восстановительному взаимодействию с Н2О2. Тот факт, что 0,06 мкМ каталаза, эффективно разлагающая Н2О2, не ингибирует ХЛ при добавлении к частицам ФСН и соединениям Мп до впрыскивания их в реакционную среду, объясняется тем, что образование Н2О2, обуславливающей данное свечение, связано с процессами, происходящими после внесения образцов в реакционную среду.

Участие пероксидазы является необходимым условием окисления люминола перекисью водорода (Cormier and Prichard, 1968). Однако сигналы ДВ и В', и ХЛ, индуцируемая Мп комплексами, наблюдались и в отсутствие пероксидазы, при этом интенсивность свечения составляла 5-20% от таковой, регистрируемой в присутствии пероксидазы. Пероксидазо-независимая ХЛ не подавляется каталазой, цитохромом с, этанолом и NaNî и, следовательно, вызвана триплетным Ог-

Таким образом, медленная ХЛ, индуцируемая частицами ФСП, и ХЛ, индуцируемая комплексами Мп, вызваны триплетным О2 и его восстановленным аддуктом Н2О2, образовывающейся в процессе измерения.

4. Зависимость интенсивности хемилюминесценции люминола от типа буфера в реакционной среде. Для проявления медленной ХЛ, индуцируемой частицами ФСИ и соединениями Мп, необходимо присутствие пероксидазы. Это позволяет оценивать данное свечение количественно, т.е. площадь сигнала ХЛ соотносить с площадью сигнала от контрольной 1 мкМ Н2О2, измеренного в соответствующей реакционной

7

среде. В таблице 2 показана интенсивность ХЛ люминола, индуцируемой частицами ФСН (сигналы В' и ДВ) и соединениями Мп, выраженная в количестве молекул Н2О2 соответственно на один реакционный центр или атом Мп, в присутствии в реакционной среде 200 мМ фосфатного, 1 М Tris, 50 мМ Hepes буферов, рН 8,5, и 200 мкМ ЭДТА в различных сочетаниях. Так как сигнал ДВ связан с Бз-состоянием, его интенсивность также выражена и в количестве молекул Н2О2 на один водоокисляющий комплекс, находящийся в Бз-состоянии. В наших экспериментах после освещения десятью вспышками света распределение S-состояний составляет 0,25:0,25:0,25:0,25. Поэтому концентрация водоокисляющего комплекса в Бз-состоянии составит 25% от концентрации РЦ. Сигнал В' рассчитан на один реакционный центр для адаптированных к темноте частиц, когда Sq+Sj=100%. Интенсивность сигналов В' и ДВ различна в различных реакционных средах.

Таблица 2

Зависимость ХЛ люминола, выраженная в молекулах Н2О2 (см. текст) на атом Мп (соединения Мп) или на РЦ (частицы ФСН, неосвещенные или освещенные десятью вспышками света), от типа буфера в реакционной среде в присутствии или> отсутствие 200 мкМ ЭДТА.а

Тип буфера в реакционной среде '

Инициаторы 200 мкМ 200 мкМ 1 М 1 М Tris-HCl 50 мкМ 50 мкМ

ХЛ люминола фосфат фосфат + Tris- + Hepes Hepes +

200 мкМ НС! 200 мкМ 200 мкМ

ЭДТА ЭДТА ЭДТА

комплекс 1 0,35 (0,5)" 0,15 (0,4) 0(0) 0,02 (0,06) 0(0) 0,01 (0,07)

комплекс 2 0,32 (0,8) 0,02 (0,15) 0(0) 0,01 (0,01) 0,01 (0,01) 0,01 (0,01)

комплекс 3 1,5 (1,4) 0,5 (0,4) 0(0) 0,1 (0,01) 0,14 (0) 0,08 (0,02)

комплекс 4 0,2 (0,7) 0,02 (0,15) 0(0) 0,01 (0,03) 0(0) 0 (0,01)

комплекс 5 0,02 (0,2) 0 (0,01) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0)

комплекс 6 0(0,01) 0 (0,03) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0)

40 мкМ МпС12 0,06 О4 0» 0» 0» О6

Частицы ФСН

(сигнал ДВ) 0,15 (0,6) 0,09 (0,35) 0» 0,05(0,2) 0» о6

(сигнал В') 0,04 0,02 0" 0,01 0» о4

"Значения в скобках указаны для соединений Мп, растворенных до измерения в ОМБО, без скобок - в Н2О; для частиц ФСН значения в скобках показывают величину сигнала, рассчитанную на водоокисляющий комплекс в Бз-состоянии; 'Возможно не нулевое значение, т.к. вследствие длительности ХЛ и маленькой амплитуды сигнала он может не регистрироваться.

ХЛ люминола, индуцируемая 40 мкМ МпС1г, наблюдается только при наличии фосфатного буфера в реакционной среде (таблица 2). Присутствие в реакционной

среде 200 мкМ ЭДТА, хелатирующего Мп(И), ингибирует это свечение. Если перед началом измерения МпОг инкубировали в 200 мМ фосфатном буфере при рН 8,5 в течение 5 мин, то наблюдалось смещение максимума ХЛ с 60 сек до 45 сек, .при этом интенсивность свечения увеличивалась незначительно (не показано). Интенсивность ХЛ, индуцируемой Мп комплексами и частицами ФСИ, максимальна в фосфатном буфере (таблица 2). Добавление ЭДТА в реакционную среду с фосфатным буфером частично ингибирует данное свечение (за исключением комплекса 6). Общим во всех случаях, когда инициаторами ХЛ служат частицы ФСН и комплексы 1-4, является тот факт, что в присутствии Тпэ-буфера в реакционной среде свечения не наблюдается, а последующее добавление ЭДТА приводит к появлению свечения во всех случаях.

4-

I—N

Рис. 3. Фотоиндуцированные изменения выхода флуоресценции, измеренные в среде, содержащей 200 мкМ люминол, 0,5 мкМ пероксидазу и различные добавки: 200 мМ фосфат, рН 8,5 (1); 200 мМ фосфат, рН 8,5, и 200 мкМ ЭДТА (2); 1 M Tris-HCI, рН 8,5 (3); 1 M Tris-HCI, рН 8,5, и 200 мкМ ЭДТА (4); 50 мМ Hepes-NaOH, рН 8,5 (5); 50 мМ Hepes-NaOH, рН 8,5, и 200 мкМ ЭДТА (6). Штрих - кинетика флуоресценции, измеренная в среде, содержащей 35 мМ NaCI и 40 мМ Mes, рН 6,5. Д - включение измерительного света (480 нм, 0,1 Вт/м2). Стрелками обозначено включение (Î) и выключение (4-) действующего света (Х>600 нм, 100 Вт/м2). AF измеряли через 2 мин инкубации частиц в измерительной среде

Как показано на рис. 3, используемые среды оказывают различное по степени модифицирующее действие на донорную часть ФСН. Об этом можно судить по уменьшению скорости и величины фотоиндуцированных изменений выхода флуоресценции хлорофилла, связанных с фотовосстановлением Qa, измеренных в этих средах. Однако корреляции между интенсивностью медленной ХЛ люминола, индуцируемой частицами ФСН, и степенью повреждения донорной части ФСН не наблюдается. Так, когда в среде измерения находится Tris-HCI или Hepes-NaOH+ЭДТА, повреждение водоокисляющего комплекса максимальное, а сигналов В' и ДВ не наблюдается. Не наблюдается также медленной ХЛ когда Hepes-буфвр присутствует в среде измерения и повреждение донорной части ФСН минимальное. С другой стороны, Tris, Hepes, ЭДТА и фосфат могут иметь окислительно-восстановительное взаимодействие с Mn(II) и Mn(III), ме.няя его свойства (Stadtman et al., 1990; Archibald and Fridovich, 1982; Frasch and Sheniae, 1980; Rickert et al., 1991). Это может быть подтверждено экспериментами, где проводилось измерение ЕР пары Мп(Н)/Мп(Ш) (Казакова, персональное сообщение). Данный потенциал, измеренный в присутствии 0,5 М Tris и 50 мМ Hepes, был ниже чем ЕР для акваиона Мп на 0,2 В и 0,1 В, соответственно, что свидетельствует о комплексообразовании между Мп и этими соединениями. Таким образом, тот факт, что интенсивность ХЛ, индуцируемой координационными комплексами Мп, имеет сходную зависимость от типа буфера в реакционной среде с интенсивностью медленной ХЛ, свидетельствует о: 1) появлении доступности Мп-кластера ФСН для водной фазы; 2) сохранении координационной структуры Мп-кластера при его взаимодействии с реакционной средой. При этом сигналы В' и ДВ индуцированы Н2О2, в образовании которой принимает участие Мп с определенной электронной конфигурацией.

5. Роль реакционной хемилюминесцентной среды в образовании H^Oq. Как было показано выше, одним из инициаторов медленной ХЛ является Н2О2, образующаяся непосредственно в процессе измерения ХЛ. Поэтому интересно выяснить, как изменяется активность препаратов ФСН при их взаимодействии с реакционной хемилюминесцентной средой, имеющей относительно высокое значение рН 8,5. Как показано на рис. 4, уже после первых секунд инкубации препаратов ФСН в реакционной среде наблюдается снижение их 02-выделяющей активности. Причем выделение О2 при постоянном освещении ингибируется значительно быстрее, чем выделение Ог на третью вспышку света. Содержание Мп в частицах после 5 мин инкубации уменьшается на 15%. Фотоиндуцированные изменения выхода флуоресценции хлорофилла после 5 мин инкубации подавляются на 30%. Таким образом, в процессе измерения ХЛ происходит модификация Мп-кластера водоокисляющего комплекса, приводящая к увеличению его доступности. В тоже время, при этом не происходит полного 10

Рис. 4. Зависимость скорости выделения О2 частицами ФСН при постоянном освещении (1) и на третью насыщающую вспышку света (2), отношения величины фотоиндуцированных изменений выхода флуоресценции хлорофилла (АР) к постоянной флуоресценции (Ио) (3), содержания Мп в частицах ФСН (100% соответствует 4 Мп/250 молекул хлорофилла) (4) от времени инкубации в хемилюминесцентной среде. Содержание Мп и выделение О2 измеряли после инкубации частиц в хемилюминесцентной среде, содержащей 50 мМ фосфатный буфер, рН 8,0, а АР - после инкубации в среде, содержащей 200 мМ фосфатный буфер, рН 8,5

8.0 2.1 2.4 8.6 1.8 9.0 3.2

рН реакционной среды

Рис. 5. Зависимость интенсивности хемшпоминесценции системы люминол - пероксидаза, индуцируемой 1 мкМ Н2О2 (1), 40 мкМ МпС1г (2), 10 мкМ комплексом 4 (3), и зависимость сигналов В' (4) и ДВ (5) от рН реакционной среды

разрушения кластера и значительного выхода Мп из мембраны. Вполне вероятно, что конформациоиное состояние модифицированного Mn-кластера отличается от натив-ной конформации, так как такие редокс агенты как фосфат и ЭДТА взаимодействуют с Мп водоокисляющего комплекса, что будет сказываться на его электронной конфигурации.

Как показано на рис. 5, интенсивность ХЛ, индуцируемой 40 мкМ МпС12, 10 мкМ комплексом 4 и 1 мкМ Н2О2, увеличивается примерно в 10 раз при увеличении pH реакционной среды от 8,1 до 9,0. Это связано с тем, что ХЛ люминола, протекающая только в щелочной среде, максимальна при pH 10-11 (Bostick and Hercules, 1975). В тоже время, интенсивность сигналов ДВ и В' возрастает примерно в 50 раз при переходе от pH 8,1 к pH 9,0 (кривые 4 и 5).Как было показано ранее (Fine and Frasch, 1992), ионы Cl" предотвращают взаимодействие ионов ОН' с Мп водоокисляющего комплекса. Возможно, что замещение слабого поля CI" лиганда сильным полем ОН" лиганда сказывается на электронной конфигурации Mn-кластера и влияет на интенсивность медленной ХЛ.

Таким образом, относительно высокое значение pH среды (8,5) обеспечивает доступность Мп-кластера для внешней фазы. Ионы ОН" также, наряду с ионами НРО42", создают электронную конфигурацию Mn-кластера, оптимальную для его участия в образовании Н2О2.

6. Оксидазная активность водоокисляющего комплекса фотосистемы II и синтетических комплексов марганца. Каким же образом может возникать Н2О2 при участии координированного Мп? Расчеты показывают, что используемые в работе комплексы Мп не способны термодинамически окислить Н2О или быть окисленными молекулярным О2. Так, E°re¡¡ (III,IV/III,III) комплексов 1 и 2, E°re¡¡ (III/II) комплекса 3 и E°red (IV.IV/IV,III) комплекса 6, измеренные в протонной среде при pH 7, составляют 0,16-0,78 В относительно водородного электрода (Manchanda et al., 1995). При этом Е°ох (pH 7) при двухэлектронном окислении Н20 (2Н20=Н202+2Н++2е) равен 1,23 В (Pourbaix, 1966). Е°ох (III,IV/IV,IV) комплексов 1 и 2 и Е°ох (III/IV) комплекса 3 составляют 0,74-0,76 В (Казакова, персональное сообщение). В тоже время, EPre¡¡ при одноэлектронном восстановлении О2 (02+Н++е=Н02) равен -0,43 В, а при двухэлектронном (02+2Н++2е=Н202) составляет 0,24 В (Pourbaix, 1966). Для водоокисляющего комплекса ФСП E°re¡¡ox для S.pSi, So-S^ SrS2 и S2-S3 переходов составляют 0,32-0,93 В (Brudvig and de Paula, 1987). Таким образом, чтобы вышеуказанные реакции происходили, необходимо преодоление термодинамического барьера в различных случаях от 0,1 до 1,4 эВ (2,3-32,2 ккал/моль). Такое снижение Е°ш и, тем более, повышение E°re¡¡ маловероятно даже если учесть лигандИрование комплекса Мп ионами фосфата. Данный вывод подтверждается экспериментами, когда освещен-12

ные частицы ФСП или комплекс 4 предварительно инкубировали в 200 мМ фосфатном буфере, рН 8,5, в отсутствие или в присутствии люминола или пероксидазы. Таким образом, смещение максимума свечения до 0,2-0,3 сек с одновременным увеличением его амплитуды могло свидетельствовать об образовании Н2О2 в процессе инкубации.

Рис. 6. Хемилюминесценция системы люминол - пероксидаза, индуцируемая освещенными пятью вспышками света частицами ФСИ (А) и 10 мкМ комплексом 4, растворенным перед измерением в Н2О (Б). Контрольное измерение (1). Частицы ФСН и комплекс 4 предварительно инкубированы соответственно 5 и 2 мин в 200 мМ фосфатном буфере, рН 8,5 (2), в 200 мМ фосфатном буфере (рН 8,5) + 10 мкМ пероксидаза (3), в 200 мМ фосфатном буфере (рН 8,5) + 2,4 мМ люминол (4)

Как показано на рис. 6, кинетика ХЛ, индуцируемой комплексом 4, предварительно инкубированном в фосфатном буфере, не отличается от таковой, индуцируемой комплексом 4, растворенным перед измерением в воде. Кинетика и амплитуда сигнала В после инкубации частиц ФСН в фосфате изменяется незначительно. Это также исключает возможность образования Н2О2 в результате структурной перестройки комплекса при разрушении ц-оксомостиков или гидролизе. Сигнал' А уменьшается примерно в 5 раз, что, вероятно, связано с каталазной активность ФСИ (Velthuys and Kok, 1978) и/или со взаимодействием Н2О2 с компонентами фотосинтетической мембраны. Добавление 10 мкМ пероксидазы не вызывает дополнительного эффекта; Н2О2, обуславливающая сигнал А, в этом случае полностью разлагается с участием пероксидазы. Добавление 2,4 мМ люминола инги-бирует сигнал В примерно на 70% и значительно изменяет кинетику XJI, индуцируемой комплексом 4 (смещение максимума с 5 сек до 0,3 сек и четырехкратное увеличение амплитуды), при этом общая сумма свечения (площадь сигнала ХЛ) меняется незначительно, что говорит об участии люминола в образовании Н2О2. Инги-бирование сигнала В связано с тем, что генерируемая до измерения Н2О2 разлагается частицами ФСИ.

Как было показано выше, кроме Н2О2, инициатором ХЛ, индуцируемой препаратами ФСН и комплексами Мп, является триплетный О2. Подобная ХЛ возникает в системе люминол-КзРе(СЫ)в, где окисление люминола кислородом катализируется координационным соединением Fe (Русин, 1983). Первым шагом ХЛ реакции в данной системе является окисление люминола КзРе(СЫ)б, при котором образуется анион-радикал люминола, взаимодействующий затем с О2. EPrej (рН 7) пары Fe(III)/Fe(II) при координировании Fe ионами CN', составляет 0,22 В (Хьюз, 1983). Таким образом, Е°ох люминола в протонной среде будет < 0,22 В и, следовательно, комплексы Мп и водоокисляющий комплекс ФСИ в S0-S3 состояниях термодинамически способны окислить люминол. В работе (Сычев и Исак, 1990) показана способность фе-нантролинового и других координационных комплексов Мп катализировать окисление кислородом различных органических субстратов. Ранее отмечалось (Русин, 1983), что "перекисный" механизм возникновения ХЛ может быть существенным за счет образования Н2О2 в процессе реакции, т.е. без добавок Н2О2 в качестве исходного реагента. Данная Н2О2 образовывалась при переносе электронов от субстрата на О2 Таким образом, окисление люминола кислородом может сопровождаться образованием Н2О2, которая фиксируется при добавлении пероксидазы. Эта реакция катализируется комплексами Мп и Мп-кластером ФСН. При этом они проявляют оксидазную активность, максимальную в присутствии 200 мМ фосфатного буфера, рН 8,5. Под оксидазной активностью подразумевается конечный результат реакции, т.е. окисление люминола и восстановление кислорода, катализируемое координируемым Мп. Механизм данной реакции может отличаться от таковой, характерной для известных ферментов. Далее термин "оксидазная активность" будет употребляться именно в таком 14

контексте. Ранее для водоокисляющего комплекса ФСН были показаны каталазная (Velthuys and Kok, 1978) и пероксидазная (окисление спиртов) (Frasch et al., 1988) активности. Сообщалось также об L-аминокислотной оксидазной активности ФСН, увеличивающейся в отсутствие Mn-стабилизирующего белка 33 кДа и СаС12 (Bockholt et al., 1991), и супероксиддисмутазной активности, вероятно, частично связанной с цитохромом b559 (Ananyev et al., 1994).

Отдельно необходимо рассмотреть случай с МпС12. Как сообщалось ранее (Archibald and Fridovich, 1982), при лигандировании ортофосфатом ионов Mn(II) образуется координационный комплекс, обладающий супероксиддисмутазоподобной активностью. Это связано со снижением Е° пары Mn(II)/Mn(III) при образовании комплекса. Однако в наших опытах предварительная инкубация МпС12 с фосфатом мало изменяет кинетику XJ1, что отрицает возможность образования Н2О2 при окислении Mn(II) молекулярным кислородом даже при снижении Е° Mn(II) и свидетельствует об участии люминола или пероксидазы в образовании Н2О2. В тоже время, как сообщалось ранее (Сычев и Исак, 1990)), координационные соединения переходных металлов в низших степенях окисления, и в частности Мп(Н), способны обратимо связывать 02. Координированный кислород находится в таких соединениях в активированном состоянии. Под активацией подразумевается изменение спинового состояния О2, т.е. переход в синглетное состояние. Реакционоспособность О2 в таком состоянии намного выше, чем триплетного О2. Окисление субстрата активированным О2 протекает через образование комплекса Мп(Н)-лиганд-02-субстрат. Таким образом, можно предполагать следующую последовательность реакций образования Н2О2 с участием координированного фосфатом Мп(П):

Мп"НР042' + 02 -> (Мп"НР042)02*

(Мп»НР042-)02* + L2" ->• Мп»НР042 + .L- + .02"

Мп"НР042' + .02' + 2Н+ -> МпшНР042' + Н202

где L - люминол.

Как видно из таблицы 2 (раздел 4), не обнаруживается корреляции между интенсивностью ХЛ, индуцируемой комплексами Мп, и такими параметрами как валентность ионов Мп, число атомов Мп в комплексе, тип связи между атомами Мп. Таким образом мы приходим к выводу, что интенсивность ХЛ, индуцируемой Мп комплексами, или степень влияния ионов фосфата на электронную конфигурацию комплекса, зависит от структуры лиганда, координирующего атомы Мп. Лиганды (включая водо-окисляющий комплекс в различных S-состояниях) могут быть построены в ряд в соответствии с их способностью влиять на химические свойства Мп в присутствии НРО42", определяющие оксидазную активность комплекса: phen > bipy > ВОК(5з) > HBPZ3 > BOK(So-2) > TACN. Интересно, что все лиганды по своей структуре являются гетероциклами, включающими атомы N, которые взаимодействуют с атомами Мп. В вышеуказанном ряду водоокисляющий комплекс расположен около HBPZ3, со-

держащего пиразол, который отличается по структуре от имидазольной группы гистидина по позиции 2'(3') атома N. Таким образом, при S2-S3 переходе, в отличие от So-Sj и Sj-Sj переходов, происходят изменения в лигандном окружении, оказывающие влияние на интенсивность индуцируемой ХЛ. Эти изменения, вероятно, связаны с азотсодержащим гистидиновым остатком D1 белка, входящим в лигандное окружение Мп в ФСН (Debus et al., 1992). На данный момент принято считать, что при S2-S3 переходе происходит скорее окисление гистидина (или другого органического компонента), чем Mn(III). Наиболее вероятными кандидатами на роль окисляемого гистидина являются His 92, His 190, His 332, His 337 белка D1 (Boussac et al., 1990). Такое окисление может приводить к изменению общего заряда белковой глобулы и изменять её конформацию, что будет сказываться на донорных свойствах гистидина из лигандного окружения. Однако наши результаты не исключают возможность того, что либо вместе с изменениями в лигандном окружении, либо альтернативно данному процессу, при S2-S3 переходе происходит взаимодействие субстратных молекул Н20 с активным сайтом водоокисляющего комплекса. Предполагается, что при таком взаимодействии форма Мп-кластера меняется по типу куб - декаэдр из-за включения двух атомов кислорода в структуру кластера (Larson and Pecoraro, 1992). Такие изменения в конфигурации Мп-кластера также могут сказываться на интенсивности индуцируемой им ХЛ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Молекулярный механизм фотосинтетического окисления воды, в результате которого происходит восстановление пластохинонового пула электронов и выделение кислорода в атмосферу, на данный момент не полностью изучен. Использование широкого спектра методов для изучения данного процесса ограничивается малодоступностью Мп-кластера, входящего в активный сайт водоокисляющего комплекса, для внешней фазы и его нестабильностью при различного рода обработках. В нашей работе используется хемилюминесцентный метод анализа в изучении вышеуказанного процесса. В результате проведенных исследований обнаружена люминол-оксидазная активность водоокисляющего комплекса ФСП, проявляемая при взаимодействии Мп-кластера с гидроксильными ионами и ионами фосфата. Возможность участия люми-нола в качестве альтернативного субстрата для водоокисляющего комплекса, наряду с другими альтернативными субстратами (02', Н202, спирты), позволяет использовать его как функциональную пробу для ФСИ. Вывод об оксидазной активности поддерживает гипотезу Бокхольта с соавт. (Bockholt et al , 1991) о том, что водоокисляющий комплекс при переходе от анаэробного фотосинтеза к аэробному эволюционировал из фермента типа дегидрогеназа/оксидаза, который изначально медиировал транспорт электронов с основных L-аминокислот (например L-аргинин) на пластохиноновый пул, что является важным в понимании эволюционного развития ФСП.

На данный момент существуют различные модели механизма окисления воды. Однако остаются непонятными изменения в структуре водоокисляющего комплекса при различных S-переходах. В данной работе показывается, что при S2-S3 переходе происходят значительные изменения в лигандном окружении Mn-кластера, возможно, связанные с конформационными перестройками белка D1 вследствие окисления гис-тидинового остатка.

На данный момент механизм образования восстановленных форм О2 в системах типа Мп(лиганд)-02-органический субстрат, а также механизм образования Н2О2 с участием Мп-кластера ФСП являются малоизученными. В данной работе на примере системы Мп(лиганд)-02-люминол показана способность координационных соединений марганца катализировать процесс образования Н2О2. Данная реакция протекает в присутствии ионов НРО42" и ингибируется в присутствии Tris и Hepes. Установлено также, что при лигандировании фосфатом ионов Мп(П) происходит образование комплекса, обладающего оксидазной активностью, что представляет интерес при изучении образования радикальных форм О2 в растительной клетке.

Основным итогом данной работы является разработка подхода с использованием хемилюминесцентного метода в изучении структурной и функциональной организации водоокисляющего комплекса ФСИ, и в частности, определении координированности ионов Мп не прибегая к более сложному методу электронного парамагнитного резонанса. В перспективе, использование данного подхода возможно и для изучения других Mn-содержащих ферментов, таких как Мп-супероксиддисмутаза, Мп-рибонуклео-тидредуктаза, Мп-тиосульфатоксидаза, Mn-каталаза и др.

ВЫВОДЫ

1) Разработан новый подход в изучении структурной и функциональной организации водоокисляющего комплекса ФСП с использованием хемилюминесцентного метода.

2) Показано, что пероксид водорода и молекулярный триплетный кислород являются инициаторами медленной XJI, индуцируемой препаратами ФСИ.

3) Обнаружена люминол-оксидазная активность водоокисляющего комплекса ФСИ. Данная активность наблюдается при взаимодействии Mn-кластера с гидроксильными ионами и максимальна в присутствии ионов НРО42"

4) Показано, что океидазная активность водоокисляющего комплекса ФСИ в S3-состоянии превышает в 2-6 раз оксидазную активность в S0-S2 состояниях.

5) Обнаружена способность координационных соединений марганца в присутствии ионов НРО42' и фосфатного комплекса Mn(II) катализировать образование Н2О2 из О2 при участии люминола в качестве донора электронов, которая зависит от типа ли-ганда, входящего в структуру комплекса, и типа растворителя (апротонный или протонный).

6) Установлено, что при S2-S3 переходе происходит изменение в лигандном окружении Mn-кластера водоокисляющего комплекса, связанное с гистидиновым остатком белка D1 и/или включение дополнительных атомов кислорода из субстратных молекул Н2О в структуру кластера.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Путренко ИИ. (1995) Роль марганцевого кластера водоокисляющего компле! фотосистемы 2 в So, S|, S2, Бз-состояниях в . индукции хемилюминесцен1. люминола. Биохимия т. 60, вып. 9, стр.1486-1498.

2. Путренко И.И. (1995) Хемилюминесценция в изучении фотосистемы II высших р тений (аннотация). Электронное приложение, серия "Аграрная наука", вып. стр.2.

3. Putrenko I.I. and Klimov V.V. (1996) The induction of luminol chemiluminescence the manganese cluster of photosystem II. Luminol-oxidase activity of the wa oxidizing complex. Abstr. of Annual Symposium "Physical-chemical basis of ph physiology", Penza, p.36.

4. Putrenko I.I. (1996) Induction of luminol chemiluminescence by the manganese clus of the photosystem II water-oxidizing complex in the So, Sj, S2 and S3 stat Advance Am. Chem. Soc. Abstracts, January 15.

5. Putrenko I.I. (1996) Induction of luminol chemiluminescence by the manganese clus of the photosystem II water-oxidizing complex in the So, Sj, S2 and S3 stat Biochemistry v.35, №9, p.2865-2871.

2.04.96 г. Зак.6985Р. Тир. 70 экз. Усл.печ.л. 1,125.

Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ПНЦ РАН