Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Электрогенные реакции переноса зарядов в ядерных комплексах фотосистемы 2 с разрушенными и реконструированными кислород-выделяющими комплексами

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Электрогенные реакции переноса зарядов в ядерных комплексах фотосистемы 2 с разрушенными и реконструированными кислород-выделяющими комплексами"

На правах рукописи

ПЕТРОВА Ирина Олеговна

ЭЛЕКТРОГЕННЫЕ РЕАКЦИИ ПЕРЕНОСА ЗАРЯДОВ

В ЯДЕРНЫХ КОМПЛЕКСАХ ФОТОСИСТЕМЫ 2 С РАЗРУШЕННЫМИ И РЕКОНСТРУИРОВАННЫМИ КИСЛОРОД-ВЫДЕЛЯЮЩИМИ КОМПЛЕКСАМИ

03.01.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 2 ПАВ 2014

Москва-2014

005548484

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»

Научный руководитель:

доктор биологических наук Мамедов Махир Джафар оглы

Официальные оппоненты:

Креславский Владимир Данилович, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт фундаментальных проблем биологии» Российской академии наук

Неверов Константин Викторович, кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биохимии имени А.Н. Баха» Российской академии наук

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт химической физики имени H.H. Семенова» Российской академии наук

Защита состоится «2? » О и_ 2014 года в/^/Уч на заседании

Диссертационного совета Д 501.001.96 при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» по адресу 119234, Москва, Ленинские горы, дом 1, стр. 24, кафедра биофизики биологического факультета /¡^у^ ~с ^-¿/О -

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций) и на сайте http ://www.bio .msu.ru/.

Автореферат разослан «_»_2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук М.Г. Страховская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Жизнь на Земле в современном виде невозможна без оксигенного фотосинтеза, в ходе которого в атмосферу выделяется кислород и происходит запасание солнечной энергии в виде энергии химических связей. Световые стадии фотосинтеза у цианобактерий, водорослей и высших растений осуществляются в тилакоидных мембранах, являющихся местом локализации трёх окислительно-восстановительных ферментов (фотосистема 2, цитохромный Ь^-комплскс, фотосистема 1) и АТФ-синтазы.

Основная функция пигмент-белкового комплекса фотосистемы 2 (ФС 2) -преобразовывать энергию света в энергию разделенных зарядов в реакционных центрах (РЦ) с последующим осуществлением двух важнейших химических реакций: окисление воды с выделением молекулярного кислорода, как побочного продукта (2 Н20 —» 4 е~ + 4 Н+ + 02), и восстановление пластохинона до пластогидрохинона (2 PQ + 4 е" + 4 Н+ —> 2 PQH2). Эти реакции разделены в пространстве и происходят на различных сторонах ФС 2.

Кислород-выделяющий комплекс (КВК) ФС 2, который расположен на донорной стороне фермента, является самым лабильным участком в электрон-транспортной цепи и легко подвергается окислительному повреждению [Diner & Babcock, 1996]. В состав КВК входит неорганическое каталитическое ядро (МщСаОз-кластер), близлежащие аминокислотные лиганды и четыре молекулы воды.

В различных стрессовых условиях наблюдается экстракция ионов марганца из сайта связывания КВК с последующим ингибированием окисления воды и выделения молекулярного кислорода. Функция КВК in vivo может восстанавливаться в результате ре-синтеза субъединицы D1 каждые 30 мин - 1 ч [Nixon et al., 2010; Komenda et al., 2012; Vinyard et al., 2013], с последующим включением в нее соответствующих кофакторов. Для реконструкции in vitro функционально активного каталитического сайта окисления воды в комплексах ФС 2, лишенных марганцевого кластера (апо-КВК-ФС 2), необходимо, чтобы среда инкубации содержала ионы Мп2+, Са2+, СГ и экзогенный акцептор электронов ([Dasgupta et al., 2008] и ссылки там же). Процесс светозависимого окислительного встраивания ионов Мп2+ в апо-КВК-ФС 2 называется фотоактивацией, а препараты с активным КВК - фотоактивированными.

Известно, что мембранное окружение важно для сборки, стабильности и функционирования белков. Липид-белковые взаимодействия играют ключевую роль в структурно-функциональных взаимоотношениях в многосубъединичном комплексе ФС 2 [Mizusawa & Wada, 2012]. Тилакоидная мембрана отличается уникальным липидным составом по сравнению с другими биологическими мембранами [Murata et al., 1997]. В частности, эта мембрана содержит большое количество (~90 %) анионного сульфохиновозилдиацилглицерина (SQDG) и незаряженных гликолипидов, таких как моногалактозилдиацилглицерин (MGDG) и дигалактозилдиацилглицерин (DGDG), в то время как доля фосфатидилглицерина составляет -10%. Известно, что многие мембранные белки проявляют максимальную функциональную активность при правильной

ориентации в липидном бислое [Rigaud & Levy, 2003]. В частности, встраивание в мембрану является одним из подходов к выявлению механизма функционирования мембранных белков, осуществляющих векторный перенос зарядов.

К наиболее актуальным проблемам в изучении функционирования ФС 2 относится выяснение молекулярного механизма сопряженного переноса электронов и протонов при каталитическом окислении воды и функционирования хинон-акцепторного участка в фотоактивированных препаратах апо-КВК-ФС 2. Измерение в стационарных условиях дает только суммарное представление о светозависимых процессах в ФС 2. Регистрация генерации трансмембранной разности электрических потенциалов (А1Р) с помощью прямого электрометрического метода при единичном обороте ФС 2 позволяет исследовать молекулярные механизмы отдельных реакций переноса зарядов. Прямая электрометрия исключительно чувствительна и позволяет регистрировать внутрибелковый перенос заряда на расстояние <1 А в направлении, перпендикулярном плоскости мембраны, а также выявлять кинетики и относительные вклады в суммарную величину АЧ7 (диэлектрически взвешенные расстояния между кофакторами) отдельных электрогенных (векторных) реакций.

Цели и задачи работы. Целью работы являлось детальное изучение электрогенных реакций переноса зарядов в фотоактивированных препаратах апо-КВК-ФС 2. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать реакции переноса электронов в ядерных комплексах ФС 2 с разрушенными (апо-КВК-ФС 2) и реконструированными кислород-выделякмцими комплексами в растворе и в протеолипосомах.

2. Исследовать электрогенные реакции, обусловленные S-переходами КВК, в протеолипосомах, содержащих фотоактивированные препараты апо-КВК-ФС 2.

3. Исследовать электрогенные реакции, обусловленные переносом зарядов на хинон-акцепторном участке, в протеолипосомах, содержащих фотоактивированные препараты апо-КВК-ФС 2.

Научная новизна работы. Исследование кинетики индукции флуоресценции хлорофилла показало, что время жизни фазы J-P, соответствующей переносу электрона на терминальный хинонный акцептор, в фотоактивированных препаратах апо-КВК-ФС 2 в растворе составляет около 320 мс, а в протеолипосомах — 20 мс или 9 мс в зависимости от природы липидов. Эти данные свидетельствуют о том, что липидное окружение стимулирует стационарную скорость переноса электронов от марганцевого кластера к терминальному акцептору пластохинону, что коррелирует с данными по измерению скорости выделения кислорода.

Впервые на протеолипосомах, содержащих фотоактивированные препараты апо-КВК-ФС 2, с помощью прямого электрометрического метода показано, что в адаптированных к темноте образцах в ответ на первую, вторую и третью лазерные вспышки света в кинетике электрического ответа помимо быстрой генерации мембранного потенциала появляются дополнительные

электрогенные фазы с характерными временами ~40 мкс, ~220 мкс и ~5 мс. Быстрая генерация мембранного потенциала связана с переносом электрона от редокс-активного тирозина Yz к первичному хинонному акцептору QA. Дополнительные фазы были приписаны переходам Si—>S2 (переносу электрона от Мп к нейтральному радикалу тирозина Yz) и S2-*S3 и S4—>S0 (переносу протонов в противоположную сторону от МщСа-кластера или от его ближайшего окружения в водную фазу). Отсутствие дополнительной генерации АЧ7 при переходе S0—>S| указывает на то, что перенос протона при этом переходе является электрически нейтральным. Электрически нейтральным также является перенос протона при переходе S3—>S4.

В фотоактивированных препаратах апо-КВК-ФС 2 при реконструкции функции QB путем добавления децилпластохинона в среду измерения в ответ на вторую вспышку света было продемонстрировано наличие дополнительных электрогенных фаз, обусловленных протонированием дважды восстановленной формы QB и переходом S2—>S3 КВК. Этот результат свидетельствует о сопряжении переноса зарядов на донорном и акцепторном участках комплексов ФС 2.

Практическая значимость исследования. Полученные результаты расширяют и углубляют представления о механизмах реконструкции кислород-выделяющего комплекса апо-КВК-ФС 2 in vitro и могут быть использованы для создания искусственных систем, способных преобразовывать солнечную энергию, в том числе осуществлять фотолиз воды с образованием водорода и кислорода. Материалы диссертации могут быть использованы в лекциях и семинарских занятиях по биохимии, биофизике и физиологии растений.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на семинаре отдела биоэнергетики НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ. Основные положения работы изложены на VI съезде Российского Фотобиологического Общества (п. Шепси, 2011), 22nd IUBMB & 37th FEBS Congress (Севилья, 2012), Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2012, 2013), International Meeting "Photosynthesis research for sustainability" (Баку, 2011, 2013) и Молодежной конференции «Биофизика биоэнергетических процессов» (Звенигород, 2013). Результаты работы были отмечены премией им. А.Д. Каулена за лучшую работу молодых ученых НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского (2011).

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 4 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 6 тезисов докладов в материалах конференций. Основная экспериментальная работа (выделение ядерных комплексов фотосистемы 2 и комплексов фотосистемы 2, лишенных марганца, приготовление протеолипосом, измерение кинетики индукции флуоресценции, измерение кинетики генерации трансмембранной разности потенциалов с помощью прямого электрометрического метода) выполнена автором самостоятельно. Постановка задач и выбор стратегии их решения проводились вместе с М.Д. Мамедовым. Обработка результатов исследований проводилась вместе с В.Н. Курашовым. Обсуждение результатов проводилось

вместе с А.Ю. Семеновым. Техническое обеспечение измерительной установки осуществлялось A.A. Заспа.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа содержит 29 рисунков и 7 таблиц. Список литературы включает 147 источников.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Раздел 1.1 дает общее представление о фотосинтезе и устройстве фотосинтетического аппарата у высших растений. В Разделе 1.2 представлены данные о структуре ФС 2 с особым вниманием к описанию КВК и хинон-акцепторного участка (Рис. 1.). Раздел 1.3 включает описание функций ФС 2, преимущественно цикла Кока и связанных с ним реакций переноса протонов, а также переноса зарядов с участием хинонов. Особое внимание также уделено механизму генерации мембранного потенциала в ФС 2. Раздел 1.4 посвящен процессу фотоактивации in vivo и in vitro.

Рис. 1. Редокс-кофакторы ядерного комплекса ФС 2 [Мамедов и др.,

2012].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Ядерные комплексы ФС 2, содержащие весь набор функциональных кофакторов, включая вторичный хинонный акцептор СЬ, выделяли из шпината в присутствии глицинбетаина. Комплексы ФС 2, лишённые марганцевого кластера (апо-КВК-ФС 2), получали путём обработки интактных комплексов 0,9 М буфером Тле-НС! (рН 8,0) в течение 30 мин при комнатной температуре.

Липосомы из азолсктина (L-a-лецитин, тип II-S, Sigma) получали в результате озвучивания суспензии лииидов в срсдс, содержащей 50 мМ HEPES-NaOH (pH 7,5) и 0,8% ß-D-октилглюкозида до просветления. Липосомы из смеси тилакоидных липидов получали из липидов тилакоидов шпината (Lipid Products Company, Redhill, UK). Протеолипосомы готовили путем смешивания липосом с ФС 2 в соотношении липид:белок 50:1 по весу. Удаление детергента осуществлялось на колонке с сефадексом G-25, уравновешенной соответствующим буфером.

Светозависимой реконструкции функционально-активного КВК в препаратах апо-КВК-ФС 2 достигали следующим образом: протеолипосомы, суспендированные в среде, содержащей 300 мМ сахарозы, 10 мМ NaCl, 5 мМ СаС12, 10 мкМ МпС12, 25 мМ MES-NaOH (pH 6,5), инкубировали в течение 3 мин при перемешивании под слабым постоянным освещением (20 мВ/см2).

Кинетику индукции флуоресценции образцов измеряли при помощи флуориметра FL3000 (Photon Systems Instruments, Чехия) в кювете толщиной 10 мм при интенсивности света, равной 2000 mkEm'V (л. = 625 им), при температуре 22±1°С. Концентрация хлорофилла в образцах ФС 2 составляла 10 мкг/мл.

Исследования кинетики генерации A4' в ответ на вспышку света проводили с помощью прямого электрометрического метода. Суть метода сводится к регистрации разности электрических потенциалов по разные стороны коллодиевой плёнки, пропитанной раствором фосфолипидов в декане, со встроенными в нее замкнутыми белково-липидными везикулами, сохраняющими внутреннюю водную полость. Разность потенциалов измеряли при помощи экранированных от свста хлорсеребряных электродов, соединенных через операционный усилитель фирмы «Burr Brown» 3554 ВМ (США) с аналого-цифровым преобразователем «CompuScope 8012А» и персональным компьютером.

Для возбуждения образцов использовался неодимовый лазер «Quantel YG-481» (Франция) (длина волны 532 нм, полуширина импульса 12 не, интенсивность импульса 50 мДж).

Скорость выделения кислорода измеряли с помощью кислородного электрода Кларка.

Анаэробное редокс-титрование проводили с использованием платинового и хлорсеребряного электродов, соединенных с вольтметром В7-27АЛ.

Кинетический анализ сигналов проводили при помощи программы Graph Explorer и Pluk [Kalaidzidis, 1997], а так же програмы Origin 8.0 (Macrocal, USA). Аппроксимация экспонентами проводилась методом последовательного спуска.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Ядерные комплексы ФС 2 с поврежденным и реконструированным КВК в растворе и в липосомах.

Удаление ионов марганца из КВК приводит к экстракции кальция и периферических белков с последующим ингибированием реакции окисления воды и выделения кислорода. Исследования процесса реконструкции КВК ш vitro в основном проводились в различных препаратах ФС 2 в растворе.

Нами была исследована реакция переноса электрона от донора на пластохинон, являющийся терминальным акцептором электрона с помощью измерения кинетики индукции флуоресценции в ядерных комплексах ФС 2 с поврежденным (апо-КВК-ФС 2) и реконструированным КВК в растворе или в липосомах. Последние были получены либо из фосфолипидов (азолектин), либо из смеси тилакоидных лигшдов. Исследования кинетики световой индукции флуоресценции хлорофилла позволяют получить подробную информацию о состоянии электрон-транспортной цепи. Кривые индукции флуоресценции изолированных ядерных комплексов ФС 2, так же, как и в случае мембранных фрагментов [Pospisil & Dau, 2000], обладают двухфазной кинетикой (так называемые фазы О-J и J-P) без промежуточной фазы 1, в отличие от хлоропластов и тилакоидных мембран. Начальная (фотохимическая) фаза 0-J соответствует восстановлению первичного хинонного акцептора Qa, в то время как фаза J-P обусловлена восстановлением терминального пластохинона на акцепторной стороне ФС 2. Известно, что в мембранных фрагментах, обогащенных комплексами ФС 2, константа скорости фазы J-P зависит от скорости переноса электронов от марганцевого кластера к пулу пластохинона и прямо пропорциональна стационарной скорости выделения кислорода; полное подавление фазы J-P соответствует полному ингибированию выделения кислорода [Pospisil & Dau, 2000]. Следует отметить, что амплитуда и характерное время фазы J-P различаются в разных препаратах. Интенсивность флуоресценции на уровне Р зависит от скорости восстановления и от размера пула пластохинона [Kurreck et al., 2000]. Число молекул пластохинона на РЦ ФС 2 различается в различных препаратах. В ядерных комплексах ФС 2, использованных в настоящей работе, заполненность сайта Qb не определялась, но можно предположить, что она низка, так как характерное время фазы J-P приблизительно в 2 раза выше, чем в мембранных фрагментах, обогащенных ФС 2 [Pospisil & Dau, 2000]. При этом нельзя исключать наличия пластохинонов в сайте Qc в ФС 2 [Kaminskaya et al., 2007].

В случае интактных ядерных комплексов ФС 2 в растворе, после включения возбуждающего света уровень J на индукционной кривой достигается за ~2 мс, в то время как уровень Р достигается за ~1 с (Рис. 2). Совершенно другая картина наблюдается в препаратах апо-КВК-ФС 2. Удаление периферических белковых субъединиц и неорганических кофакторов КВК вызывает полное исчезновение фазы J-P и появление провала сразу после фотохимической фазы. Этот провал может свидетельствовать об удалении

марганца, как заключили Ро$рШ1 & Эаи [2000] на основании данных, полученных с помощью измерения кинетики индукции флуоресценции на мембранных фрагментах, обогащенных ФС 2. Подавление амплитуды фазы может служить качественным индикатором ингибирования кислород-выделяющей активности. Отметим, однако, что в комплексах апо-КВК-ФС 2, возрастание флуоресценции, возможно, соответствует не стадии а стадии К, которая отражает однократное разделение зарядов в РЦ с тирозином Уг в роли донора электронов, как было показано в экспериментах на листьях с разрушенным КВК ФС 2 [ТоШ е1 а1., 2007].

) Г 11/Т!<01а11!Д 1/1

1Е-4 1Е-3 0,01 0,1 1 10

Время, с

Рис. 2. Кривые индукции флуоресценции ядерных комплексов ФС 2 в растворе в отсутствие искусственных акцепторов электронов. Среда инкубации содержит 25 мМ МЕБ-ЫаОН (рН 6,5), 300 мМ сахарозы, 10 мМ 1ЧаС1 и 5 мМ СаСЬ. МпСЬ добавляли только к препаратам апо-КВК-ФС 2. Концентрация хлорофилла - 10 мкг/мл.

Добавление небольшого количества МпС12 в соотношении 4,0 иона марганца на РЦ ФС 2 вызывает увеличение амплитуды фотохимической фазы О-З с последующим восстановлением фазы ,1-Р в препаратах апо-КВК-ФС 2 (Рис. 2). В этих условиях относительная стационарная скорость выделения кислорода составляет до 60% от контроля (Таблица 1). Отметим, что дальнейшее увеличение соотношения Мп/РЦ не влияет на кинетику флуоресценции, в то время как при соотношении 2,0 иона марганца на 1 РЦ степень восстановления кислород-выделяющей активности и скорость выделения кислорода пренебрежимо малы (не показано). Эти данные

позволяют заключить, что каждый активный КВК требует 4 ионов марганца для максимальной активности.

Восстановление кислород-выделяющей активности ФС 2 также зависит от концентрации ионов кальция и бикарбонат-ионов, экзогенного акцептора электронов, метода удаления неорганических кофакторов, присутствия или отсутствия периферических белков с молекулярными массами 17, 23 и 33 кДа [Т>а8^р1а е( а1., 2008].

Таблица 1. Характерные времена фазы 1-Р и относительные скорости выделения кислорода для различных препаратов. Кинетика флуоресценции хлорофилла была аппроксимирована суммой двух экспоненциальных функций Р(1)=Р0+А,(1-е"1/11)+А2(1-еч/т2), где Р0 - флуоресценция в момент О, А] и А2 -амплитуды, Т] и т2 - характерные времена фаз 0-1 и 1-Р, соответственно. Т[ изменялось незначительно.

Препараты ФС 2 с активным квка Фотоактивированная апо-КВК-ФС 2б

т2, мс т2, мс 02, % от интактной ФС 2

Ядерные комплексы ФС 2 в растворе 200 320 60

Ядерные комплексы ФС 2 в липосомах из азолектина 140 20 55 (68)в

Ядерные комплексы ФС 2 в липосомах из смеси тилакоидных липидов 140 9 57 (71)"

а Относительная скорость выделения кислорода (-1500 мкмоль 02 х мг-1 (Хл) х препаратами ФС 2 с активным КВК в растворе и в протелипосомах принималась за 100%. 6 Относительная скорость выделения кислорода препаратами апо-КВК-ФС 2

была равна 30^50 мкмоль 02 х мг~' (Хл) х чЛ 8 Числа в скобках представляют собой относительные скорости выделения кислорода, в случае, если все комплексы ФС 2 были бы ориентированы в протеолипосомах донорной стороной наружу.

В настоящей работе измерение кинетики индукции флуоресценции также было применено к ядерным комплексам ФС 2, встроенным в липосомы из азолектина (фосфолипидов соевых бобов) и из смеси липидов тилакоидов шпината (МОБО/ТЮБО/БСШО/РО) (Рис. 3). Данная смесь тилакоидных липидов аналогична по составу тилакоидной мембране, из которой выделяют ФС 2 [Мига1а ег а1., 1997].

Встраивание ядерного комплекса ФС 2 в липосомы требует сохранения его активности во время контакта с детергентом, используемым для получения липосом. Существуют различные способы приготовления протеолипосом [Rigaud & Levy, 2003]. Мы использовали гель-фильтрацию для удаления детергентов, так как она сокращает время взаимодействия между ядерными комплексами ФС 2 и детергентом.

ФС 2 с активным КВК

Время, с

Рис. 3. Кривые индукции флуоресценции ядерных комплексов ФС 2 в протеолипосомах в отсутствие искусственных акцепторов электронов. Условия как на Рис. 2. Поскольку кривые индукции флуоресценции для изолированных ядерных комплексов ФС 2 с активным КВК, встроенных в липосомы из азолектина и из тилакоидных липидов, практически не различаются, на рисунке представлена только кривая индукции флуоресценции ФС 2 для липосом из азолектина.

Как видно из Рис. 2 и 3, амплитуда фазы 1-Р в кинетике индукции флуоресценции в ядерных комплексах ФС 2 с активным КВК в растворе и в протеолипосомах практически одинакова, хотя в случае протеолипосом время жизни фазы ,1-Р меньше (Таблица 1). Следует отметить, что, по данным полярографических измерений, проведенных нами, относительные скорости выделения кислорода в этих препаратах также одинаковы (не показано). Увеличение амплитуды фазы ,1-Р в присутствии экзогенного МпС12 в препаратах апо-КВК-ФС 2, встроенных в липосомы из азолектина,

свидетельствует о частичном восстановлении кислород-выделяющей активности фермента (Рис. 3). В этих условиях относительная скорость выделения кислорода в протеолипосомах составляла до ~55% от таковой в препаратах ФС 2 с активным КВК.

Более низкий уровень восстановления кислород-выделяющей активности в протеолипосомах по сравнению с комплексами ФС 2 в растворе связан с тем, что ~20% ядерных комплексов ФС 2 ориентированы донорной стороной внутрь протеолипосомальной мембраны, являющейся непроницаемой для ионов марганца [Mamedov et al., 2006]. Поэтому эта фракция комплексов ФС 2 не вносит вклад в фазу J-P. Однако если бы 100% ядерных комплексов ФС 2 были ориентированы донорной стороной наружу протеолипосомальной мембраны, относительная скорость выделения кислорода увеличилась бы (Таблица 1).

Более высокая скорость фазы J-P в протеолипосомах из азолектина (т ~20 мс) по сравнению с препаратами ФС 2 в растворе (т ~320 мс) свидетельствует о том, что липидное окружение увеличивает скорость переноса электронов от КВК к терминальному акцептору (пластохинону) в ФС 2.

В дальнейшем нами были изучены реакции переноса электронов в ядерных комплексах ФС 2 с активным и поврежденным КВК, встроенных в липосомы из смеси тилакоидных липидов (Рис. 3). В этих условиях кинетика индукции флуоресценции была практически такой же, как в протеолипосомах из азолектина. При добавлении марганца (4,0 Mn/РЦ) амплитуда фазы J-P и относительная скорость выделения кислорода частично восстанавливаются по сравнению с апо-КВК-ФС 2 (Таблица 1). Ориентация комплексов ФС 2 в липосомах, полученных из смеси тилакоидных липидов, была такой же, как и в случае липосом из азолектина (~20% комплексов ФС 2 не вносят вклад в фазу J-P).

Как видно из Таблицы 1, характерное время фазы J-P в протеолипосомах из тилакоидных липидов намного меньше (т ~9 мс) по сравнению с препаратами ФС 2 в растворе.

У различных липидов различные физические свойства и, как следствие, морфология и размер везикул, что может оказывать значительное влияние на функционирование белка [Rigaud & Levy, 2003]. Возможно, поэтому время жизни фазы J-P в ядерных комплексах ФС 2, встроенных в липосомы из смеси тилакоидных липидов, приблизительно в 2 раза меньше, чем в липосомах из азолектина.

Основное различие между раствором и липосомами, вероятно, заключается в характере их взаимодействия с ферментом. Ускорение фазы J-P в протеолипосомах с ядерными комплексами ФС 2 позволяет предполагать, что конформация ФС 2 в мембранном липидном окружении может быть иной, нежели в растворе.

Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что липидное окружение увеличивает стационарную скорость переноса электронов от марганцевого кластера к терминальному хинонному акцептору в комплексах ФС 2 и этот эффект проявляется в большей степени в случае липосом, полученных из тилакоидных липидов. Влияние липидов, вероятно, связано с

поддержанием оптимальной конформации белка для эффективного функционирования.

2. Электрогенные реакции, обусловленные в-переходами КВК, в протеолииосомах, содержащих фотоактивированные препараты апо-КВК-ФС 2

Изучение сопряжения реакций внутрибелкового переноса электрона и протона представляется сложной задачей. Тем не менее, его можно исследовать с помощью измерения генерации трансмембранной разности электрических потенциалов (Л1Р), используя прямой электрометрический метод [Мамедов и др., 1999] и электрохромный сдвиг полос поглощения каротиноидов [Наитапп й а1., 1997]. Результаты, полученные ранее на протеолипосомах, содержащих интактные ядерные комплексы ФС 2, а также на тилакоидах из высших растений, позволили исследовать электрогенные реакции, соответствующие различным Б-переходам КВК.

Во второй части работы прямой электрометрический метод впервые был применен для изучения электрогенеза, связанного с реакциями переноса электронов и протонов при Б-переходах в фотоактивированных комплексах апо-КВК-ФС 2, встроенных в липосомы.

На Рис. 4 показаны кинетические кривые генерации А>Р в протеолипосомах, содержащих адаптированные к темноте фотоактивированные комплексы апо-КВК-ФС 2 в ответ на первую лазерную вспышку. Знак Д¥ показывает, что внутри протеолипосом отрицательный заряд [Оор1а а а1., 2008]. Отсутствие влияния дитионита натрия, не проникающего через мембрану, на амплитуду электрического сигнала, свидетельствует об асимметричной ориентации ядерных комплексов ФС 2 в липосомах (-80% комплексов обращены донорной стороной наружу). Максимальная по амплитуде быстрая фаза, время нарастания которой меньше временного разрешения нашей измерительной системы (-100 не), соответствует разделению зарядов в РЦ ФС 2 между Р680 и С>А с последующим восстановлением Р680+ путем переноса электрона от редокс-активного тирозина У2 (У2Х>А~)-

После темновой адаптации интактных ядерных комплексов ФС 2, встроенных в липосомы, все КВК синхронизируются в состоянии Б,, и максимальное выделение кислорода наблюдается в ответ на третью и седьмую вспышки света [Наитапп е! а1., 1997]. Что касается адаптированных к темноте фотоактивированных комплексов апо-КВК-ФС 2, то значительное выделение кислорода происходит уже на вторую вспышку с пиком на третью и четвертую вспышки света (не показано). При этом после шестой вспышки света никакой осцилляции не наблюдается. Аналогичные данные были получены ранее на мембранных фрагментах, обогащенных ФС 2 [КоШ^ е1 а1., 2012]. Однако мы не можем однозначно применять данные о Б-переходах КВК на основании результатов измерения скорости выделения кислорода в ответ на серию вспышек света (полуширина вспышки 120 мке) к результатам, представленным

в настоящей работе, так как в качестве источника света в случае прямого электрометрического метода используется импульсный лазер (полуширина импульса 12 не).

Как видно из Рис. 4, добавление марганца к апо-КВК-ФС 2 в условиях фотоактивации вызывает значительное замедление кинетики спада из-за предотвращения рекомбинации зарядов и появление небольшой дополнительной электрогенной фазы в субмиллисекундном временном диапазоне. Последнее демонстрирует эффективное взаимодействие между марганцем и тирозином У

Ь\< о."

Время, мс

Рис. 4. Электрические ответы, индуцированные первой лазерной вспышкой в протеолипосомах, содержащих комплексы апо-КВК-ФС 2 (1) и адаптированные к темноте фотоактивированные комплексы апо-КВК-ФС 2 (2). Кинетические кривые были нормированы по амплитуде быстрой электрогенной фазы, приписываемой образованию Уг'С^д ■ Препараты апо-КВК-ФС 2 суспендировали в среде измерения, содержащей 300 мМ сахарозы, 5 мМ СаС12, 10 мМ ЫаС1 и 25 мМ МЕЗ-ИаОН при рН 6,5. Для фотоактивации препаратов в среду было добавлено 10 мкМ МпС12. К3[Ре(СМ)6] использовался как акцептор электронов в концентрации 1 мМ. На вставке показана разность электрических ответов между комплексами ФС 2 с поврежденным и реконструированным КВК. Все эксперименты производились при комнатной температуре (22 ± 1°). Здесь и далее стрелка обозначает момент лазерной вспышки.

Разность между сигналами, индуцированными первой вспышкой света в присутствии и в отсутствие марганца, демонстрирует генерацию А1?, обусловленную переносом электрона от марганца на У2\ Эта разность представлена на вставке к Рис. 4 и имеет характерное время (т) -40 мкс и относительную амплитуду -3% от амплитуды фазы, соответствующей образованию У2'С>А . Полученное значение т близко к характерному времени окисления иона Мп радикалом У2' [КигазЬоу е1 а1., 2009], что соответствует переходу 81—>82 в ядерных комплексах ФС 2 с активными КВК [Наитатт е1 а1., 1997; Мамедов и др., 1999]. Следует отметить, что при переходе 8]—>82 не происходит выброс протона на донорном участке и накапливается положительный заряд [Эаи & Наитапп, 2007; Ио§исЫ е1 а1., 2008]. Таким образом, можно предположить, что векторный перенос электрона от марганца на тирозин У2" в ответ на первую вспышку света соответствует переходу 81—>82 в фотоактивированных препаратах апо-КВК-ФС 2. Следует отметить, что кинетика перехода 81—>Б2 практически не меняется в присутствии Б20 (не показано).

ш 5

<а

-2-

_4.

Ьу

А

о,о

0,0 0,5 1,0 1,5 Время, мс

5 вспышка 2 вспышка

0,5

1,0 Время, мс

1,5

2,0

Рис. 5. Электрические ответы, индуцированные второй и пятой лазерными вспышками (А), и их разность (Б) в адаптированных к темноте фотоактивированных комплексах апо-КВК-ФС 2. Кинетические кривые здесь и на Рис. 6 были нормированы по амплитуде быстрой фазы, обусловленной образованием У2'С>А" в ответ на пятую вспышку. Интервал между вспышками света составлял 0,5 с.

Кривые генерации ДЧР, индуцированной второй (переход 82—>83) и пятой вспышками света в адаптированных к темноте фотоактивированных препаратах

апо-КВК-ФС 2, после нормирования быстрой стадии генерации ДЧ', соответствующей образованию У2'С>А~, показаны на Рис. 5А. Пятая вспышка света, в основном, индуцирует переход 8]—<-82. Она соответствует первой вспышке, но без возможного вклада реакции переноса электрона между С>Л и негемовым железом, локализованным между хинонными акцепторами [Наитапп й а1., 1997; Mamedov й а1., 2006]. Поэтому разность между кинетическими кривыми, индуцированными второй и пятой вспышками (Рис. 5Б), отражает разность между электрическими ответами на вторую и первую вспышки. Электрический ответ, индуцированный первой вспышкой, обусловлен переносом электронов от У7 на С?Л и последующим восстановлением тирозина У-/ марганцем. Таким образом, вычитание кинетической кривой, индуцированной цервой вспышкой, из кинетических кривых, индуцированных последующими вспышками, убирает вклад, связанный с переносом электрона Мп—и У2—>()Л.

Можно предположить, что дополнительный электрогенез, наблюдаемый в ответ на вторую и третью лазерные вспышки, обусловлен переносом протонов в противоположную сторону от субстратной молекулы воды или аминокислот вблизи от марганцевого кластера в водную фазу. Анализ электрических ответов, индуцированных второй и пятой лазерными вспышками (Рис. 5Б) показывает, что экспоненциальная фаза имеет характерное время -220 мке, в то время как ее амплитуда составляет -6,8% от амплитуды фазы, соответствующей образованию В присутствии Б20 скорость этой

реакции уменьшается в -1,7 раз (не показано). Следует отметить, что кинетические кривые, индуцированные второй и пятой вспышками, практически неразличимы вплоть до 0,1 мс, а кинетические кривые, индуцированные первыми вспышками в присутствии и в отсутствие марганца (Рис. 4), различаются уже после 0,05 мс.

Дополнительная электрогенная фаза в кинетике электрического ответа, индуцированного второй вспышкой света (82—>83) в ядерных комплексах ФС 2 с активным КВК и в тилакоидах при рН 6,5, имеет т ~270 и -300 мке, соответственно [Наитапп е1 а1., 1997]. Эта кинетическая стадия была приписана выбросу протона в водную фазу вследствие изменения рК и депротонирования неидентифицированного аминокислотного остатка, локализованного вблизи от марганцевого кластера. Мы предполагаем, что дополнительная электрогенная фаза с т -220 мке в кинетике электрического ответа в случае фотоактивированных апо-КВК-ФС 2 соответствует переносу протона от марганцевого комплекса в водную фазу при переходе Б2—>83.

Генерация в ответ на третью и пятую вспышки света показана на Рис. 6А. Разность кинетических кривых (3 всп - 5 всп) (Рис. 6Б) демонстрирует более медленную дополнительную электрогенную компоненту с характерным временем -5 мс и относительной амплитудой -5% от амплитуды фазы, соответствующей образованию Уг'С^л •

В комплексах ФС 2 с активным КВК основной особенностью образования состояния 84 КВК является депротонирование аминокислотного остатка вблизи марганцевого комплекса с характерным временем -200 мке, а конечный

переход цикла Б4—соответствует выделению кислорода и еще одного протона [Баи & Наитапп, 2007].

Как видно из разности электрических сигналов на третью и пятую вспышки (3 всп - 5 всп) в кинетике генерации АТ фотоактивированными препаратами апо-КВК-ФС 2 отсутствует дополнительная субмиллисекундная компонента, но присутствует более медленная компонента с т ~5 мс (Рис. 6Б). Скорость этой медленной компоненты уменьшается в ~1,4 раза в присутствии БгО (не показано). Можно предположить, что перенос протона при переходе Бз—>Б4 является электронейтральным, в то время как перенос протона при переходе Б4—>Бо сопряжен с образованием А'Р. Следует отметить, что характерное время перехода Б4—>Б0 составляло -1,2 мс в тилакоидах [Наитапп й а1., 1997] и мембранных фрагментах, обогащенных ФС 2 [Наитапп е1 а1., 2005], и ~4,6-6 мс в ядерных комплексах ФС 2 с активным КВК [Мамедов и др., 1999].

Ьу

еа

£н <

о4*

-2-

-4

-6

10 20 Время, мс

5 вспышка

з вспышка

—Го

10

20

30

Время, мс

Рис. 6. Электрические ответы, индуцированные третьей и пятой лазерными вспышками (А), и их разность (Б) в адаптированных к темноте фотоактивированных комплексах апо-КВК-ФС 2.

Близкие значения относительных амплитуд электрогенных фаз с существенно различающимися кинетиками реакций переноса протонов при переходах Бг—>Бз и Б4—>Бо означают, что протоны переносятся на приблизительно одинаковые диэлектрически взвешенные расстояния, но, по-видимому, различными путями.

Переход Бо—»^, индуцированный четвертой вспышкой, вероятно, включает реакцию окисления марганцевого кластера радикалом тирозина У2", а также депротонирование аминокислотного остатка вблизи марганцевого кластера для компенсации зарядов [Наитапп е1 а1. 2005; Баи & Наитапп, 2007]. Вычитание электрического ответа на пятую вспышку из электрического ответа на четвертую вспышку дает практически нулевую разность (не показано). Поскольку пятая вспышка рассматривается как аналог первой, то электрические ответы в обоих случаях связаны с разделением заряда между Р680 и Од, а также с восстановлением Р680+ тирозином У7 и последующим ревосстановлением У2" марганцем. Кроме того, индуцированный четвертой вспышкой света переход Бо—>8] включает выделение одного протона. Отсутствие разницы между кинетиками генерации А1? в ответ на четвертую и пятую лазерные вспышки свидетельствует о том, что выброс протона при переходе 80—не является электрогенным.

Таблица 2. Относительные амплитуды и характерные времена электрогенных реакций КВК ФС 2_

Препараты Электрогенез, % от образования YZ*QA (= 100%)

s2 —* s3 S4 —> So

Ядерные комплексы ФС 2 с активным КВК 2,5 (65 мке) 6,2 (270 мке) 5,0 (4,6 мс)

Фотоактивированные комплексы апо-КВК-ФС 2 3,0 (40 мке) 6,8 (220 мке) 5,0 (5,0 мс)

Тилакоиды3 Нет данных 13,0 (300 мке) 8,0(1,3 мс)

а См. [Haumann et al., 1997].

Амплитуды электрогенных реакций приведены в процентном отношении к быстрой фазе, соответствующей образованию YZ'QA~ (=100%). В скобках приведены характерные времена реакций.

Полученные результаты показывают, что кинетики и относительные амплитуды электрогенных фаз при S-переходах в фотоактивированных комплексах апо-КВК-ФС 2 сравнимы с таковыми для комплексов ФС 2 с активным КВК (Таблица 2). Практически полная реконструкция электрогенных реакций при переходах Si—»S2, Sj—>S3 и S4—>S0 наблюдается даже в отсутствие периферических белков, что свидетельствует о том, что S-состояния КВК являются стабильными, по крайней мере, до 0,5 с. В то же время высококонсервативный периферический марганец-стабилизирующий белок (33 кДа) считается необходимым для поддержания максимальной скорости выделения кислорода [De Las Rivas et al., 2004; Dasgupta et al., 2008]. Действительно, относительная скорость выделения кислорода при реконструкции КВК в наших экспериментах не превосходила ~55%. Отсюда

можно заключить, что полной реконструкции электрогенных реакций, обусловленных 8-переходами, недостаточно для достижения полного восстановления функции КВК.

Таким образом, в адаптированных к темноте препаратах электрогеннные реакции, наблюдаемые в ответ на первую, вторую и третью лазерные вспышки, вероятно, связаны с переходами 8!—>Б2 (перенос электрона от Мп на У2'), Бг—»Бз и 84—»Бо (перенос протона в противоположном направлении - от марганцевого кластера или его ближайшего белкового окружения в водную фазу) (Рис. 7). Отсутствие дополнительной фазы генерации мембранного потенциала в кинетике электрического ответа на четвертую лазерную вспышку указывает на то, что перенос протона при переходе Бо—>8] является электронейтральным.

Первая вспышка

Третья вспышка

Рис. 7. Схема переходов между Б-состояниями комплекса окисления воды в фотоактивированных препаратах апо-КВК-ФС 2. Проценты - относительный вклад электрогенных реакций. В адаптированных к темноте образцах КВК преимущественно находится в состоянии Б,.

3. Электрогенные реакции, обусловленные переносом зарядов на хинон-акцепториом участке, в протеолнпосомах, содержащих фотоактивированные препараты апо-КВК-ФС 2

С помощью прямого электрометрического метода было исследовано функциональное сопряжение донорной и акцепторной стороны комплексов ФС 2 с поврежденными и реконструированными КВК.

Следует отметить, что марганцевый кластер не реконструируется как функциональная единица до того, как произошло изменение на акцепторной стороне [Semin & Seibert, 2004; Dasgupta et al., 2008]. Попытки исследовать генерацию A4*, связанную с S-переходами КВК в фотоактивированных комплексах апо-КВК-ФС 2 в присутствии экзогенного акцептора электронов феррицианида калия для QA~ были успешны (см. предыдущий раздел).

Среднеточечный потенциал (Еш) первичного хинонного акцептора QA (Qa/Qa") является одним из ключевых параметров для выявления энергетических и кинетических характеристик ФС 2 [Krieger et al., 1995; Shibamoto et al., 2010] и связан с активностью КВК. Этот параметр был измерен в различных препаратах различными методами [Shibamoto et al., 2000 и ссылки в них]. Полученные из литературы значения Em(QA/QA~) демонстрировали большой разброс, принимая значения около -300, -100, 0 и +100 мВ против стандартного водородного электрода [Wydrzynski & Satoh, 2005].

В настоящей части работы нами было проведено редокс-титрование амплитуды генерации АШ в ответ на первые лазерные вспышки, связанной с переносом электронов от Yz на QA и от Мп на QA в адаптированных к темноте комплексах ФС 2 с поврежденными и реконструированными КВК, соответственно. Уменьшение амплитуд электрических ответов апо-КВК-ФС 2 при равновесном восстановлении QA, показало, что Em QA (+65 мВ) не меняется при добавлении МпС12 и СаС12 в темноте (не показано). Однако инкубация препаратов на свету в присутствии этих солей вызывает сдвиг Ет в отрицательную сторону. Экспериментальные точки накладываются на теоретическую кривую Нернста для одноэлектронной реакции с Ет, равным -150 мВ (не показано).

Что касается причин различия значений Em (QA/QA~), обсуждаемых в литературе, вопрос остается открытым. Однако следует отметить, что, несмотря на предпринятые попытки, нам не удалось измерить среднеточечный потенциал Qa в отсутствие редокс-медиаторов, как это было сделано в случае мембранных фрагментов ФС 2 в работе [Krieger et al., 1995]. Что касается сопоставления результатов, полученных в работе [Shibamoto et al., 2010], с нашими результатами, наблюдаемое небольшое различие (-160 мВ и -150 мВ), вероятно, обусловлено отсутствием периферических белков в наших препаратах. Таким образом, полученные нами результаты наглядно свидетельствуют о том, что состояние донорной стороны ФС 2 оказывает непосредственное влияние на свойства хинон-акцепторного участка фермента.

Ядерные комплексы ФС 2, ассоциированные с коллодиевой пленкой, необходимой для измерения А1?, не содержат вторичного хинонного акцептора Qb. Возможность реконструкции функции QB в протеолипосомах с фотоактивированными апо-КВК-ФС 2 позволила нам изучить реакции переноса электронов на акцепторной стороне. Функция QB была реконструирована путем добавления спиртового раствора децилпластохинона (dPQ) к препаратам ФС 2. Пластохинон и дсцилпластохинон имеют одинаковые значения Ет и рК, но dPQ более гидрофилен и имеет более высокий коэффициент распределения в системе липид/вода [Rich & Harper, 1990].

На Рис. 8 показаны электрические ответы, индуцированные вторыми лазерными вспышками в адаптированных к темноте фотоактивированных комплексах апо-КВК-ФС 2 в присутствии dPQ. Как уже было отмечено ранее, быстрая кинетически неразрешимая компонента генерации A4J соответствует переносу электрона от редокс-активного тирозина Yz на хинонный акцептор Qa [Semenov et al., 2008]. Отсутствие дополнительного электрогенеза в ответ на первую лазерную вспышку (не показано) предполагает, что реакция протон-сопряженного переноса электрона между QA и негемовым железом (Fe3+) не происходит. При этом в кинетике электрического ответа на вторую вспышку света в присутствии dPQ наблюдается дополнительная электрогенная фаза. Разложение этой фазы демонстрирует наличие по крайней мере двух фаз с характерными временами -185 мке и 0,5 мс. Что касается природы этих реакций, они могут быть вызваны комбинацией различных процессов, таких как переход S2—>S3 КВК, протонирование дважды восстановленного QB и быстрые структурные перестройки, сопровождающие восстановление QB.

2-, О-1 -2-< -4-

-6-80,0 0,5 1,0 1,5 2,0 Время, мс

Рис. 8. Электрические ответы, индуцированные вторыми лазерными вспышками, в адаптированных к темноте фотоактивированных комплексах апо-КВК-ФС 2 в присутствии 30 мкМ с1Р0 ±10 мкМ ОСМ11.

Отметим, что электрогенная фаза, индуцированная второй лазерной вспышкой и связанная с переходом КВК 32—>83 (а именно, с выделением протона в водную фазу), была нами обнаружена в фотоактивированных

hv

I

Al 00

0,4-

0,0

^ -0.4 <1

-0,8

(+dPQ) - (+dPQ+DCMU)

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Время, мс

+dPQ+ DCMU +dPQ

комплексах апо-КВК-ФС 2 в присутствии феррицианида. Характерное время этой дополнительной фазы (-220 мкс) близко к характерному времени более быстрой дополнительной фазы в присутствии dPQ (-185 мкс). Что касается медленной электрогенной фазы с т -0,5 мс, то она, вероятно, отражает реакцию протежирования Qq2~. В пользу последнего свидетельствует влияние DCMU, ингибитора переноса электрона между QA и QB, на кинетику медленной фазы. Добавление DCMU устраняет более медленную фазу, оставляя только более быструю (Рис. 8Б). Следовательно, только фаза с характерным временем -0,5 мс связана с протонированием дважды восстановленного Qb.

С другой стороны, добавление dPQ к апо-КВК-ФС 2 без фотоактивации не приводит к появлению дополнительного электрогенеза в микросекундной или миллисекундной шкале времени.

Таким образом, впервые с помощью прямого электрометрического метода на протеолипосомах, содержащих фотоактивированные препараты апо-КВК-ФС 2, показано сопряжение переноса зарядов на донорном и акцепторном участке ФС 2.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Целью диссертационной работы явилось изучение генерации ДТ, обусловленной переносом зарядов в фотоактивированных ядерных комплексах апо-КВК-ФС 2. Использованный прямой электрометрический метод позволяет проводить измерения кинетики генерации ДЧ* в режиме однократного срабатывания фермента, что существенно облегчает интерпретацию наблюдаемых явлений.

Работа была проведена на изолированных ядерных комплексах ФС 2 из шпината, являющихся минимальными функциональными единицами, способными катализировать окисление воды и восстановление пластохинона. Локализация кислород-выделяющего комплекса вблизи наружной поверхности протеолипосомальной мембраны позволяет изучать механизм реконструкции КВК в препаратах апо-КВК-ФС 2 в присутствии неорганических ионов (Мп2+ и Са2+).

В нервом разделе экспериментальной части работы проведено сопоставление результатов, полученных с помощью измерения кинетики индукции флуоресценции хлорофилла в комплексах ФС 2 с поврежденными и реконструированными КВК в растворе и липосомах из различных типов липидов. Полученные данные позволяют заключить, что липидное окружение увеличивает стационарную скорость переноса электронов от марганцевого кластера к терминальному хинонному акцептору в комплексах ФС 2, что, вероятно, связано с оптимальной конформацией белка.

Во втором разделе экспериментальной части с помощью прямого электрометрического метода на протеолипосомах впервые был исследован механизм генерации AVP, обусловленной переносом зарядов при S-переходах кислород-выделяющего комплекса в ответ на единичные вспышки света в

фотоактивированных комплексах апо-КВК-ФС 2. Показано, что переходы $1—>82, 52—»Бз и 84—»-Бо и Бо—»Б] сопряжены с образованием Д4?, в то время как переход Бз—>-84 является электрически нейтральной реакцией.

В третьем разделе экспериментальной части прямой электрометрический метод впервые был успешно использован для изучения функционального сопряжения донорной (электрогенез при переходе КВК 82—>83) и акцепторной (электрогенное протонирование дважды восстановленного СЬ) сторон фотоактивированного комплекса апо-КВК-ФС 2.

ВЫВОДЫ

1. С помощью исследования кинетики индукции флуоресценции хлорофилла в ядерных комплексах ФС 2 с разрушенными (апо-КВК-ФС 2) и реконструированными (фотоактивированными) кислород-выделяющими комплексами в растворе и в протеолипосомах показано, что липидное окружение увеличивает стационарную скорость переноса электронов от марганцевого кластера к терминальному хинонному акцептору, что коррелирует с данными по измерению скорости выделения кислорода. Этот эффект проявляется в большей степени в случае липосом, полученных из тилакоидных липидов. Выдвинуто предположение, что влияние липидов связано с поддержанием оптимальной конформации ФС 2 для эффективного функционирования.

2. Впервые с помощью прямого электрометрического метода на протеолипосомах, содержащих фотоактивированные препараты апо-КВК-ФС 2, показано, что в адаптированных к темноте образцах в ответ на 1-ую, 2-ую и 3-ю вспышки лазера в кинетике фотоэлектрического ответа помимо быстрой генерации мембранного потенциала, обусловленной переносом электрона от редокс-активного тирозина У2 к первичному хинонному акцептору С>А, появляются дополнительные электрогенные фазы в микро-/миллисекундном временном диапазоне. Эти дополнительные фазы приписаны переходам Б^Бг (перенос электрона от Мп на У7'), 82->83 и 84->80 (перенос протонов в противоположном направлении - от марганцевого кластера или его ближайшего окружения в водную фазу) кислород-выделяющего комплекса.

3. Отсутствие дополнительной генерации мембранного потенциала в субмиллисекундном временном диапазоне в ответ на 3-ую (переход 83->84) и 4-ую (переход Бо-^) лазерные вспышки свидетельствует об электрически нейтральном переносе протонов. Заключено, что перенос только двух из четырех протонов, освобождаемых в результате каталитического окисления двух молекул воды, сопряжен с генерацией мембранного потенциала.

4. Впервые в фотоактивированных препаратах апо-КВК-ФС 2 при реконструкции функции вторичного хинонного акцептора Он путем добавления

децилпластохинона в среду инкубации в кинетике электрического ответа обнаружены дополнительные электрогенные фазы, обусловленные переходом S2—»S3 кислород-выделяющего комплекса и протонированием дважды восстановленной формы QB. Эти данные свидетельствуют о функциональном сопряжении донорного и акцепторного участков ФС 2 и, несомненно, расширяют современные представления о механизме фотоактивации комплекса окисления воды в целом.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Мамедов М.Д., Курашов В.Н., Петрова И.О., Заспа А А., Семенов А.Ю. Перенос электронов между экзогенным донором и реакционным центром фотосистемы 2. // БИОХИМИЯ. 2010. Т. 75. № 5. С. 675 - 681.

2. Petrova I.O., Kurashov V.N., Semenov A.Yu., Mamedov M.D. Manganese-depleted/reconstituted photosystem II core complexes in solution and liposomes. // Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 2011. T. 104. C. 372-376.

3. Мамедов М.Д., Курашов B.H., Петрова И.О., Семенов А.Ю. Трансмембранная разность электрических потенциалов в пигмент-белковом комплексе фотосистемы 2. // БИОХИМИЯ. 2012. Т. 77. № 9. С. 1144 - 1154.

4. Петрова И.О., Курашов В.Н., Заспа A.A., Семенов А.Ю., Мамедов М.Д. Реакции векторного переноса зарядов на донорном участке лишенных марганца и реконструированных ядерных комплексов фотосистемы 2. // БИОХИМИЯ. 2013. Т. 78. №. 4. С. 513 - 521.

Тезисы докладов

1. Петрова И.О., Курашов В.Н., Семенов А.Ю., Мамедов М.Д. Реконструкция комплекса окисления воды в комплексах фотосистемы 2, лишенных марганца, in vitro. // VI съезд Российского Фотобиологического Общества. Пос. Шепси. 2011. Сборник тезисов. С. 22.

2. Петрова И.О., Курашов В.Н., Мамедов М.Д., Семенов А.Ю. Реакции векторного переноса заряда на донорной стороне фотоактивированных комплексов апо-КОВ-фотосистемы 2. // XVI Международная Пущинская школа-конференция «Биология - наука XXI века». Пущино. 2012. Сборник тезисов. С. 475.

3. Petrova I., Kurashov V. and Mamedov M. Reconstruction of electrogenic charge transfer reactions on the donor side of the Mn-reassembled apo-water oxidation complex of photosystem II. // 22nd IUBMB & 37th FEBS Congress. Севилья, Испания. FEBS Journal. 2012. T. 279. Приложение 1. С.119.

4. Петрова И.О., Курашов В.Н., Семенов А.Ю., Мамедов М.Д. Фотоактивация комплекса окисления воды в ядерных комплексах фотосистемы 2, лишенных марганца, in vitro. // XVII Международная

Путинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века". Пущино. 2013. Сборник тезисов. С. 497.

5. Petrova I., Kurashov V., Zaspa A., Semenov A., Mamedov М. Vectorial charge transfer due to S-state transitions of the water-oxidizing complex in photoactivated apo-WOC-PS 2 core complexes. // International Meeting "Photosynthesis research for sustainability". Баку, Азербайджан. 2013. Сборник тезисов. С. 51.

6. И.О. Петрова, В.Н. Курашов, А.Ю. Семенов, М.Д. Мамедов. Реконструкция комплекса окисления воды в ядерных комплексах фотосистемы 2, лишенных Мп4Са-кластера // Молодежная конференция «Биофизика биоэнергетических процессов». Звенигород, 2013. Сборник тезисов. С. 18.

КОПИ-ЦЕНТР св.: 77 007140227 Тираж 100 г. Москва, ул. Енисейская, д. 36, тел.: 8-499-185-79-54,8-906-787-70-86 wivw.kopirovka.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Петрова, Ирина Олеговна, Москва

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова ФАКУЛЬТЕТ БИОИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ

На правах рукописи

04-201457585

Петрова Ирина Олеговна

ЭЛЕКТРОГЕННЫЕ РЕАКЦИИ ПЕРЕНОСА ЗАРЯДОВ

В ЯДЕРНЫХ КОМПЛЕКСАХ ФОТОСИСТЕМЫ 2 С РАЗРУШЕННЫМИ И РЕКОНСТРУИРОВАННЫМИ КИСЛОРОД-ВЫДЕЛЯЮЩИМИ КОМПЛЕКСАМИ

03.01.02 - биофизика

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук М.Д. Мамедов

Москва-2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...................................................................................................................................................3

1. ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................................................................5

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................................................................................10

2.1. Фотосинтез.................................................................................................................................................................10

2.2. Структура комплекса фотосистемы 2.........................................................................................................................14

2.3. Функционирование комплекса ФС 2..........................................................................................................................28

2.4. Фотоактивация ФС 2..................................................................................................................................................46

2.5. Заключение.................................................................................................................................................................62

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..........................................................................................................................................63

3.1. Препаративные методы...............................................................................................................................................64

Выделение мембранных фрагментов, обогащенных ФС2...................................................................................64

Выделение ядерного комплекса ФС2 с активным КВК..........................................................................................65

Выделение комплекса ФС2, лишенного марганцевого кластера (апо-КВК-ФС 2)..............................................66

Приготовление протеолипосом, содержащих ядерные комплексы ФС2...........................................................66

Фотоактивация КВК.................................................................................................................................................67

3.2. Аналитические методы...............................................................................................................................................69

Флуоресценция............................................................................................................................................................69

Полярографический метод измерения кислорода.................................................................................................69

Прямой электрометрический метод регистрации ДЧ>........................................................................................69

Редокс-титрование первичного хинонного акцептора QA..................................................................................72

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.............................................................................................................................74

4.1. Характерные особенности ядерных комплексов ФС 2.................................................................................................74

4.2. Ядерные комплексы ФС 2 с поврежденным и реконструированным КВК в растворе и влипосомах...........................77

4.3. Электрогенные реакции, обусловленные S-переходами КВК, в протеолипосомах, содержащих фотоактивированные

препараты апо-КВК-ФС 2...................................................................................................................................................85

4.4. Электрогенные реакции, обусловленные переносом зарядов на хинон-акцепторном участке, в протеолипосомах,

содержащих фотоактивированные препараты апо-КВК-ФС 2............................................................................................99

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ..........................................................................................................................................................109

6. ВЫВОДЫ.................................................................................................................................................................111

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................................................................................113

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ФС 1 фотосистема 1

ФС 2 фотосистема 2

РЦ реакционный центр

Dl, D2 белки ФС 2, формирующие РЦ и содержащие редокс-компоненты

переноса зарядов

Cyt Ь559 цитохром Ь559, интегральный компонент РЦ

КВК кислород-выделяющий комплекс

PsbO марганец-стабилизирующий периферический белок с

молекулярной массой около 33 кДа

РСА рентгеноструктурный анализ

НАДФ никотинамидадениндинуклеотидфосфат

DCMU 3-(3,4,-дихлорфенил)-1,1 -диметилмочевина

ТМФД К,К,М'>Г-тетраметил-и-фенилендиамин

ДХФИФ 2,6-дихлорфенолиндофенол

ДХБХ 2,6-дихлор-я-бензохинон

ДАД 2,3,5,6-тетраметил-и-фенилендиамин

ФМС феназинметосульфат

ДФК 1,5-дифенилкарбазид

Р680 первичный донор электрона РЦ ФС 2

Pheo феофитин

Chi хлорофилл

Yz редокс-активный тирозин-161 DI-субъединицы

Qa, Qb первичный и вторичный хинонные акцепторы, соответственно

PQ, PQH2 пластохинон и пластогидрохинон, соответственно

Мп марганец

MGDG моногалактозилдиациглицерин

DGDG дигалактозилдиациглицерин

SQDG сульфохиновозилдиацилглицерин

PG фосфатидилглицерин

MES 2-(К-морфолино)этансульфоновая кислота

HEPES К-(2-гидроксиэтил)пиперазин-М'-(2-этан-сульфоновая кислота)

TRIS трис(гидроксиметил)аминометан

Ет среднеточечный окислительно-восстановительный потенциал (мВ)

tf/2

полувремя реакции

время, за которое амплитуда ответа изменяется в е раз

ЛТ

трансмембранная разность электрических потенциалов

FTIR

ИК-Фурье-спектроскопия

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Жизнь на Земле в современном виде невозможна без оксигенного фотосинтеза, в ходе которого в атмосферу выделяется кислород и происходит запасание солнечной энергии в виде энергии химических связей. Световые стадии фотосинтеза у цианобактерий, водорослей и высших растений осуществляются в тилакоидных мембранах, являющихся местом локализации трёх окислительно-восстановительных ферментов (фотосистема 2, цитохромный Ь6£-комплекс, фотосистема 1) и АТФ-синтазы. Основная функция пигмент-белкового комплекса фотосистемы 2 (ФС 2) - запасать энергию света в виде разделенных зарядов в реакционных центрах (РЦ), с последующим осуществлением двух важнейших химических реакций: окисление воды с выделением молекулярного кислорода, как побочного продукта (2 НгО —> 4 е~ + 4 H4" + О2), и восстановление пластохинона до пластогидрохинона (2 PQ + 4е~+4Н+—»2 PQH2). Эти реакции разделены в пространстве и происходят на различных сторонах ФС 2.

Кислород-выделяющий комплекс (КВК) ФС 2, который расположен на донорной стороне фермента, является самым лабильным участком в электрон-транспортной цепи и легко подвергается окислительному повреждению [Diner & Babcock, 1996]. В состав КВК входит неорганическое каталитическое ядро (Мп4Са05-кластер), близлежащие аминокислотные лиганды и четыре молекулы воды.

В различных стрессовых условиях наблюдается экстракция ионов марганца из сайта связывания КВК с последующим ингибированием окисления воды и выделения молекулярного кислорода. Функция КВК in vivo может восстанавливаться в результате ре-синтеза субъединицы D1 каждые 30 мин -1ч [Nixon et al., 2010; Komenda et al., 2012; Vinyard et al., 2013], с последующим включением в нее соответствующих кофакторов. Для реконструкции in vitro

функционально активного каталитического сайта окисления воды в комплексах ФС 2, лишенных марганцевого кластера (апо-КВК-ФС 2), необходимо, чтобы среда инкубации содержала ионы Мп2+, Са2+, СГ и экзогенный акцептор электронов ([Dasgupta е1 а!., 2008] и ссылки там же). Процесс светозависимого окислительного встраивания ионов Мп2+ в апо-КВК-ФС 2 называется фотоактивацией, а препараты с активным КВК - фотоактивированными.

Известно, что мембранное окружение важно для сборки, стабильности и функционирования мембранных белков. Липид-белковые взаимодействия играют ключевую роль в структурно-функциональных взаимоотношениях в многосубъединичном комплексе ФС 2 рУИгшаша & Wada, 2012]. Тилакоидная мембрана отличается уникальным липидным составом по сравнению с другими биологическими мембранами [Мига1а е1 а1., 1997]. В частности, эта мембрана содержит большое количество (-90 %) анионного

сульфохиновозилдиацилглицерина (ВС^Бв) и незаряженных гликолипидов, таких как моногалактозилдиацилглицерин (МвБв) и дигалактозилдиацилглицерин (БОБв), в то время как доля фосфатидилглицерина составляет -10%.

К наиболее актуальным проблемам в изучении функционирования ФС 2 относится выяснение молекулярного механизма сопряженного переноса электронов и протонов при каталитическом окислении воды и функционирования хинон-акцепторного участка в фотоактивированных препаратах апо-КВК-ФС 2. Регистрация генерации трансмембранной разности электрических потенциалов (Д^Р) с помощью прямого электрометрического метода при единичном обороте ФС 2 позволяет исследовать молекулярные механизмы отдельных реакций переноса зарядов, тогда как измерение в стационарных условиях дает только суммарное представление о светозависимых процессах в ФС 2. Прямая электрометрия исключительно чувствительна и позволяет регистрировать внутрибелковый перенос заряда на расстояние <1 А в направлении, перпендикулярном плоскости мембраны, а также выявлять кинетики и относительные вклады в суммарную величину А1? (диэлектрически взвешенные расстояния между кофакторами) отдельных электрогенных (векторных) реакций.

Цели и задачи работы.

Целью работы являлось детальное изучение электрогенных реакций переноса зарядов в фотоактивированных препаратах апо-КВК-ФС 2. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать реакции переноса электронов в ядерных комплексах ФС 2 с разрушенными (апо-КВК-ФС 2) и реконструированными кислород-выделяющими комплексами в растворе и в протеолипосомах.

2. Исследовать электрогенные реакции, обусловленные 8-переходами КВК, в протеолипосомах, содержащих фотоактивированные препараты апо-КВК-ФС 2.

3. Исследовать электрогенные реакции, обусловленные переносом зарядов на хинон-акцепторном участке, в протеолипосомах, содержащих фотоактивированные препараты апо-КВК-ФС 2.

Научная новизна работы

Исследование кинетики индукции флуоресценции хлорофилла а показало, что время жизни фазы I—Р, соответствующей переносу электрона на терминальный хинонный акцептор, в фотоактивированных препаратах апо-КВК-ФС 2 в растворе составляет около 320 мс, а в протеолипосомах - 20 мс или 9 мс в зависимости от природы липидов. Эти данные свидетельствуют о том, что липидное окружение стимулирует стационарную скорость переноса электронов от марганцевого кластера к терминальному акцептору пластохинону, что коррелирует с данными по измерению скорости выделения кислорода.

Впервые на протеолипосомах, содержащих фотоактивированные препараты апо-КВК-ФС 2, с помощью прямого электрометрического метода показано, что в адаптированных к темноте образцах в ответ на первую, вторую и третью лазерные вспышки света в кинетике электрического ответа помимо быстрой генерации мембранного потенциала, обусловленной переносом электрона от редокс-активного тирозина к первичному хинонному акцептору С2а, появляются

дополнительные электрогенные фазы с характерными временами ~40 мкс, -220 мкс и -5 мс. Эти фазы были приписаны переходам Sj—>S2 (переносу электрона от Мп к нейтральному радикалу тирозина Yz) и S2—>S3 и S4—>S0 (переносу протонов в противоположную сторону от Мп4Са-кластера или от его ближайшего окружения в водную фазу), соответственно. Отсутствие дополнительной генерации Д*Р при переходе So—>Si указывает на то, что перенос протона при этом переходе является электрически нейтральным. Электрически нейтральным также является перенос протона при переходе S3—>S4.

В фотоактивированных препаратах апо-КВК-ФС 2 при реконструкции функции QB путем добавления децилпластохинона в среду измерения в ответ на вторую вспышку света было продемонстрировано наличие дополнительных электрогенных фаз, обусловленных протонированием дважды восстановленной формы QB и переходом S2—>S3 КВК. Эти результаты свидетельствуют о сопряженной активации донорного и акцепторного участков комплексов апо-КВК-ФС 2.

Практическая значимость

Полученные результаты расширяют и углубляют представления о механизмах реконструкции кислород-выделяющего комплекса апо-КВК-ФС 2 in vitro и могут быть использованы для создания искусственных систем, способных эффективно преобразовывать солнечную энергию, в том числе осуществлять фотолиз воды с образованием водорода и кислорода. Материалы диссертации могут быть использованы в лекциях и семинарских занятиях по биохимии, биофизике и физиологии растений.

Апробация работы и публикации

Результаты работы были представлены на семинаре отдела биоэнергетики НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ. Основные

положения работы изложены на VI съезде Российского Фотобиологического Общества (п. Шепси, 2011), 22nd IUBMB & 37th FEBS Congress (Севилья, 2012), Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология -наука XXI века" (Пущино, 2012, 2013), International Meeting "Photosynthesis research for sustainability" (Баку, 2011, 2013) и Молодежной конференции «Биофизика биоэнергетических процессов» (Звенигород, 2013). Результаты работы были отмечены премией им. А.Д. Каулена за лучшую работу молодых ученых НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского (2011).

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 4 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 6 тезисов докладов в материалах конференций. Основная экспериментальная работа (выделение ядерных комплексов фотосистемы 2 и комплексов фотосистемы 2, лишенных марганца, приготовление протеолипосом, измерение кинетики индукции флуоресценции, измерение кинетики генерации трансмембранной разности потенциалов с помощью прямого электрометрического метода) выполнена автором самостоятельно. Постановка задач и выбор стратегии их решения проводились вместе с М.Д. Мамедовым. Обработка результатов исследований проводилась вместе с В.Н. Курашовым. Обсуждение результатов проводилось вместе с А.Ю. Семеновым. Техническое обеспечение измерительной установки осуществлялось А.А. Заспа.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. ФОТОСИНТЕЗ

Фотосинтетические организмы - это чудо природы, потому что они способны использовать свет, диоксид углерода и воду для того, чтобы снабжать Землю богатыми энергией углеводами и другими органическими веществами и выделять кислород, которым мы дышим. Фотосинтез — сложный многоступенчатый процесс. Энергия поглощенных фотонов преобразуется в химическую энергию в двух последовательных цепочках реакций: при световых реакциях происходит выделение кислорода как побочного продукта и запасание энергии в виде НАДФ-Н и АТФ, в то время как в цикле Кальвина-Бенсона последние в отсуствие света используются для восстановления С02 до углеводов.

Все фотосинтетические организмы делятся на оксигенные и аноксигенные. Оксигенные фототрофы используют воду в качестве источника электронов и выделяют кислород как побочный продукт. Аноксигенные фототрофы получают электроны из других неорганических или органических молекул и поэтому не выделяют кислород. Из пяти точно определенных фототрофных бактериальных филумов (Бкгшс^ез, СЫогоАех1, СЫогоЫ, Рго1еоЬас1епа и СуапоЬас1епа) только цианобактерии (СуапоЬас1епа) способны осуществлять оксигенный фотосинтез. Кроме того, все эукариотические фототрофы, а именно высшие растения и водоросли, выделяют кислород при фотосинтезе. Оставшиеся четыре филума включают анаэробные организмы, такие как пурпурные несерные бактерии, пурпурные серные бактерии, зеленые серные бактерии, гелиобактерии, которые способны жить только при низких концентрациях кислорода.

У цианобактерий первичные процессы фотосинтеза происходят в организованной системе цитоплазматических мембран [В1апкешЫр, 2002]. Они называются тилакоиды, от греческого 0иА.акост, что значит «мешок».

Тилакоидные мембраны обладают складчатой структурой, что позволяет клетке упаковать поверхность большой площади в маленький объем. Внутреннее пространство тилакоидной мембраны называется люмен, а матрикс, окружающий тилакоиды, называется строма. Мембраны тилакоидов содержат четыре белковых комплекса, участвующих в световых реакциях фотосинтеза: фотосистему 2 (ФС 2), цитохромный комплекс b6f, фотосистему 1 (ФС 1) и АТФ-синтазу. Темновые реакции фотосинтеза протекают в строме с участием растворимых ферментов.

Эукариотические организмы, такие как высшие растения и водоросли, осуществляют фотосинтез в мембранных органеллах, называемых хлоропласты. Хлоропласты окружены оболочкой, состоящей из наружней и внутренней мембран. Он содержит сложно организованную внутреннюю систему, в которую входят мембранные «мешки» - тилакоиды. Тилакоиды хлоропластов, погруженные в строму, образуют хорошо различимые стопки, называемые граны и соединенные между собой межгранными мембранными каналами - ламеллами стромы (Рис. 1.1.). Тилакоидная мембрана высших растений обладает крайне сложной архитектурой. В ней выделяют четыре домена - сердцевина гран (grana core), края гран (margins of the grana), концевые мембраны (end membrane) и ламелла стромы (stroma lamellae). Соотношение этих доменов зависит от организма, условий окружающей среды и, особенно, уровня освещенности [Mamedov & Styring, 2003]. Большая �