Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Электрогенный перенос электрона на донорном участке пигмент-белкового комплекса фотосистемы 2

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Электрогенный перенос электрона на донорном участке пигмент-белкового комплекса фотосистемы 2"

На правах рукописи

004605216

Курашов Василий Николаевич

ЭЛЕКТРОГЕННЫЙ ПЕРЕНОС ЭЛЕКТРОНА НА ДОНОРНОМ УЧАСТКЕ ПИГМЕНТ-БЕЛКОВОГО КОМПЛЕКСА ФОТОСИСТЕМЫ 2

03.01.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва 2010

1 7 И ЮН 2010

004605216

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского и на кафедре биофизики биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова

Научные руководители: доктор биологических наук

Мамедов Махир Джафар оглы

доктор биологических наук Нокс Пётр Петрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Красновский Александр Александрович

кандидат физико-математических наук Трубицин Борис Вячеславович

Ведущая организация: Институт химической физики

им. H.H. Семенова РАН

Защита состоится 10 июня 2010 г. в часов Ос? минут на заседании Диссертационного совета Д 501.001.96 при кафедре биофизики биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, аудитория «Новая»

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « » Учёный секретарь

Диссертационного совета /

кандидат биологических наук

2010 г.

М.Г. Страховская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Фотосинтез - процесс, с помощью которого фототрофные организмы преобразуют энергию излучения Солнца в энергию химически стабильных органических соединений. В результате фотосинтеза ежегодно происходит выделение 150-200 млрд. тонн молекулярного кислорода в атмосферу Земли и образуется около 200 млрд. тонн первичной биомассы (Barber 2007).

Первичные процессы фотосинтеза в цианобактериях, водорослях и высших растениях осуществляются в тилакоидных мембранах, где локализованы трансмембранные белковые комплексы фотосистемы 2 (ФС 2), цитохрома b(f и фотосистемы 1. Светозависимое окисление воды и выделение молекулярного кислорода катализируется комплексом ФС 2, представляющим собой Н20-пластохинон-оксидоредуктазу, механизм функционирования которой до сих пор является предметом интенсивных исследований. Сложность исследования функционирования этого фермента обусловлена его лабильностью, а также тем, что суммарный процесс включает ряд сопряженных реакций: светоиндуцированное разделение зарядов между первичным донором электронов Peso и первичным хинонным акцептором QA, последующее одноэлектронное восстановление Рб8о+ редокс-активным аминокислотным остатком Yz (тирозин 161 D1-полипептида реакционного центра), двухэлектронное восстановление вторичного хинонного акцептора QB и четырехэлектронное окисление молекулы воды.

Одной из наиболее актуальных проблем в изучении функционирования ФС 2 является выяснение механизма переноса зарядов на донорном участке фермента, содержащем кластер Мп4Са, его лигандное окружение и близлежащий тирозин Yz. Перспективным подходом в этих исследованиях является изучение механизма генерации трансмембранной разности электрических потенциалов (Д*Р) комплексами ФС 2 в условиях однократного срабатывания фермента, что существенно облегчает интерпретацию наблюдаемых явлений по сравнению со стационарными процессами.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось исследование механизмов переноса электрона на донорном участке пигмент-белкового комплекса ФС 2 с помощью флуориметрических и прямого электрометрического методов.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать особенности реакции переноса электронов в ядерных комплексах ФС 2, лишенных марганцевого кластера [ФС 2 (-Мп)] и сопоставить полученные данные с результатами для нативных комплексов ФС 2.

2. Исследовать механизм реакции переноса электрона между реконструированным марганцем и радикалом тирозина У г в комплексах ФС 2 (-Мп).

3. Изучить реакцию переноса электрона от марганца к тирозину У г' в препаратах ФС 2 (-Мп) с блокированным железом высокоаффинным сайтом связывания марганца.

4. Исследовать влияние различных экзогенных доноров электронов и синтетических марганец-содержащих комплексов на кинетику генерации мембранного потенциала.

5. Описать механизм восстановления тирозина У2' от искусственных доноров электронов.

Научная новизна работы.

В условиях реконструкции транспорта электрона в присутствии экзогенного Мп2+ в препаратах ФС 2 (-Мп) было продемонстрировано наличие дополнительной электрогенной фазы, обусловленной восстановлением редокс-активного тирозина У2" от Мп. Было выявлено два участка окисления марганца и показано, что перенос электрона через низкоаффинный сайт не сопряжен с образованием мембранного потенциала. Обнаружено, что электрогенный характер восстановления тирозина У г' не является специфичным для марганца, а имеет место и в случае искусственных доноров электронов (дифенилкарбазид, синтетический трехъядерный марганцевый комплекс). При этом наблюдаемая

значительная по амплитуде дополнительная электрогенная стадия свидетельствует о достаточно низкой диэлектрической проницаемости на участке белка между и границей белок-вода. Предложена модель, согласно которой низкомолекулярный донор электронов гидроксиламин может диффундировать через каналы на донорной стороне белка к марганец-связывающему сайту с последующим восстановлением У2\

Практическая значимость исследования. Полученные результаты существенно расширяют и углубляют современный уровень знаний о механизмах функционирования пигмент-белкового комплекса ФС 2 и важны для понимания процессов переноса зарядов на донорной стороне ФС 2. Результаты могут быть использованы в биотехнологии для создания эффективных искусственных систем, преобразующих и запасающих солнечную энергию; в устройствах, осуществляющих фотолиз воды с образованием водорода и кислорода.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на международной конференции «Фотосинтез в пост-геномную эру: структура и функции фотосистем» (г. Пущино, Московская область, 2006); 16-ой международной ежегодной конференции по фотосинтезу «Норд-Вест» (г. Мюльхайм, Германия, 2007); V Съезде Российского фотобиологического общества и международной конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе» (г. Пущино, 2008); XIX Пущинских чтениях по фотосинтезу и Всероссийской конференции «Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах» (г. Пущино, 2009).

Работа была апробирована на теоретическом семинаре отдела биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ и на кафедре биофизики биологического факультета МГУ.

По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 4 - в реферируемых журналах.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 109 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и

методы, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы; список литературы включает 164 источника.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Ядерные комплексы ФС 2, содержащие весь набор функциональных кофакторов, включая вторичный хинонный акцептор QB, выделяли из шпината в присутствии глицинбетаина. Комплексы ФС 2, лишённые марганцевого кластера [ФС 2 (-Мп)] получали путём обработки нативных комплексов 0,9 М Tris буфером (рН 9,0) в течение 30 мин при комнатной температуре. Образцы с блокированным высокоаффинным сайтом связывания марганца [ФС 2 (-Mn+Fe)] были получены путём инкубации ФС 2 в присутствии 15 мкМ FeS04 при слабой интенсивности света (15 мкЕ/м2-с) (Semin and Seíbert, 2002).

Липосомы получали в результате озвучивания суспензии азолектина (L-a-лецитин, тип II-S, Sigma) в среде, содержащей 50 мМ HEPES-NaOH (рН 7,5) буфера и 1,4% холата натрия до просветления. Протеолипосомы готовили путем смешивания липосом с ФС2 в соотношении лшщц:белок 50:1 по весу. Удаление детергента осуществлялось на колонке с сефадексом G-25, уравновешенной соответствующим буфером.

Кинетику индукции и переменную флуоресценцию образцов измеряли при помощи флуорометра FL3000 (Photon Systems Instruments, Чехия) в кювете толщиной 10 мм при 20°С. Интенсивности измерительного и действующего света при регистрации переменной флуоресценции составляли 6,6 мВт/м2 (^ = 617нм) и 60 Вт/м2 (X = 625 нм), соответственно. Кинетику индукции флуоресценции измеряли при интенсивности света равной 130 Вт/м2 (X = 625 нм). Концентрация хлорофилла в образцах ФС 2 составляла 10 мкг/мл.

Исследования кинетики генерации AVF в ответ на вспышку света проводили с помощью прямого электрометрического метода. Суть метода сводится к регистрации разности электрических потенциалов по обе стороны коллодиевой

плёнки, пропитанной раствором фосфолипидов в декане, со встроенными в нее замкнутыми белково-липидными везикулами, сохраняющими внутреннюю водную полость. Разность потенциалов измеряли при помощи экранированных от света хлорсеребряных электродов, соединенных через операционный усилитель фирмы «Burr Brown» 3554 ВМ (США) с аналого-цифровым преобразователем «CompuScope 8012А» и персональным компьютером.

Для возбуждения образцов использовался неодимовый лазер «Quantel YG-481» (Франция) (длина волны 532 нм, полуширина импульса 12 не).

Анализ полученных кривых проводили при помощи программных пакетов Pluk (Kalaidzidis et al., 1997) и Origin 7.5 (OriginLab Corporation, США). Аппроксимация кинетик фотоэлектрического ответа проводилась методом последовательных приближений.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Транспорт электрона на донорном участке ФС 2 и его реконструкция в препаратах, лишённых марганцевого кластера

Ядерные комплексы ФС 2 представляют собой минимальную структурно-функциональную единицу, способную катализировать окисление воды. В нативных препаратах ядерных комплексов ФС 2 наличие Мп4Са кластера предотвращает реакцию окисления экзогенных доноров электронов редокс-активным аминокислотным остатком - тирозином Yz. Поэтому для исследования реакции переноса зарядов на донорном участке фермента в присутствии экзогенных доноров электрона нами были использованы ядерные комплексы ФС 2 (-Мп). Экстракция ионов Мп сопровождается также удалением иона Са2+ и трёх периферических белков, локализованных на донорном участке ФС 2.

На рис. 1 показаны светоиндуцированные изменения переменной флуоресценции (AF) в нативных ядерных комплексах и в ФС 2 (-Мп). Видно,

что экстракция Мп приводит к значительному уменьшению^. Это, вероятно, обусловлено отсутствием донирования электрона на фотоокисленный первичный донор электронов Рбво- Добавление Мп2+ в соотношении 4 иона Мп на один РЦ приводит к увеличению максимального уровня флуоресценции (Рш), что может свидетельствовать о существенном восстановлении электронного транспорта к Р680+-

Нативный ядерный комплекс ФС 2

41

ч з- <и

I- о к S ? 20) AF ФС 2 -Мп + 1 мкМ MnCI2

ZI о ш О. О >. § 1- Fo ы ФС 2 -Мп

0-

т-1-|-1-1-1-1-1-1

О 30 60 90 120

Время, с

Рис. 1. Фотоиндуцированные изменения переменной флуоресценции в нативных ядерных комплексах и в комплексах ФС 2 (-Мп). Среда инкубации: 25 мМ HEPES (рН 7,5), 300 мМ сахарозы и 15 мМ NaCl. Концентрация хлорофилла 10мкг/мл. Короткая стрелка соответствует измерительному свету, длинные стрелки вверх и вниз - включению и выключению возбуждающего света, соответственно.

Кроме того, реконструкция электронного транспорта на донорном участке фермента также была продемонстрирована с помощью регистрации кинетики индукции флуоресценции (данные не представлены).

На рис. 2 (кривая 1) показан электрический ответ протеолипосом, содержащих ядерные комплексы ФС 2 (-Мп) при возбуждении единичными лазерными вспышками. Быстрая генерация AVF за время короче временного разрешения измерительной установки (~100 не) обусловлена переносом

электрона от Р680 к первичному хинонному акцептору QA, с последующим ревосстановлением Р680+ тирозином Yz* (Semenov et al., 2006).

Время, мс

Рис. 2. Кинетика фотоэлектрических ответов в лротеолипосомах, содержащих ядерные комплексы ФС 2(-Мп) в отсутствие (1) и в присутствии 10 мкМ МпСЬ (2). На вставке показан результат вычитания кривой 1 из кривой 2. Среда инкубации как на рис. 1.

В отсутствие экзогенных доноров и акцепторов электронов, кинетика спада фотоэлектрического ответа хорошо аппроксимируется двухэкспоненциальной кривой с характеристическими временамит ( -0,24 мс (амплитуда А1 -14%) и т2 -250 мс (амплитуда А2 -86%). Основная компонента спада 2 обусловлена рекомбинацией электрона между и У г'- Минорная компонента ть вероятно, обусловлена рекомбинацией электрона между Р68о+ и (3А~ во фракции комплексов с поврежденным переносом электрона от У2 на Рб8о+-

При добавлении Мп наблюдается существенное замедление кинетики спада ДУ, которая аппроксимируется двумя экспонентами ст | -486 мс (—30%) их 2 ~2 с (-70%) (кривая 2) и, вероятно, обусловлена пассивной утечкой через липосомальную мембрану. Кроме того, замедление кинетики спада на коротких

временах (<100 мкс) в присутствии Мп, вероятнее всего, свидетельствует о появлении в этих условиях фазы нарастания Л*?, замаскированной быстрой компонентой спада, природа которой не вполне понятна. Эта фаза нарастания ЛЧК выявляется при вычитании кинетики фотоэлектрического ответа в отсутствие Мп из кинетики фотоответа в его присутствии и представлена на вставке на рис. 2.

Наличие дополнительной генерации АЧ* (т -20 мкс), обусловлено векторным переносом электрона от Мп2+ к Yz*. Следует отметить, что относительная величина этой электрогенной стадии (~5% от быстрой фазы) совпадает с величиной электрогенеза, обусловленного восстановлением Yz" от марганцевого кластера в препаратах фотосистемы 2 с активным комплексом окисления воды (Haumann et al., 1997; Мамедов и др., 1999). Это позволяет предположить, что диэлектрическая проницаемость е на участке от сайта связывания Мп до Yz в препаратах ФС 2, лишенных марганца, остается такой же, как и в нативных ядерных комплексах.

2. Исследование низкоаффинного сайта окисления марганца

Исследование окисления экзогенных катионов марганца, дифенилкарбазида (ДФК) и аниона йода на мембранных фрагментах ФС 2, лишенных марганцевого кластера позволило авторам работы (Blubaugh and Cheniae, 1990) заключить, что донорная сторона фермента содержит два отдельных сайта связывания марганца, характеризующихся разными константами скоростей окисления. Следует отметить, что поскольку основной путь переноса электрона осуществляется с участием тирозина Yz (высокоаффинный сайт), исследование низкоаффинного сайта долгое время оставалось невозможным.

Ранее также было установлено, что катионы Fe2+ с высокой эффективностью блокируют высокоаффинный сайт на мембранных препаратах ФС 2 (-Мп) (Semin and Seibert, 2004). Это позволяет использовать катионы железа для

изучения реакции окисления доноров электронов в низкоаффинном сайте комплексов ФС 2 (-Мп).

В блокированных ионами железа препаратах ФС2 (-Мп+Ре), добавление катионов марганца в концентрации, насыщающей высокоаффинный сайт (К„ в области 10 мкМ), практически не приводит к изменению переменной флуоресценции (рис. 3). Этот результат подтверждает факт блокирования высокоаффинного сайта катионом железа. Добавление существенно большей концентрации марганца (100 мкМ), сопоставимой с Км для низкоаффинного сайта окисления марганца сопровождается увеличением переменной флуоресценции. Эти данные свидетельствуют о переносе электрона на донорном участке фермента, минуя высокоаффинный сайт окисления марганца.

ш

I H

0

к

s и

1

CD

ГГ О

аз а.

0 >>

1

3-

2-

AF

ш

ЛЧ,

+100 мкМ Мп ФС 2 -Mn+Fe

20

-г-40

60

-Г"

80

—I—

100

120

Время, с

Рис. 3. Фотоиндуцированные изменения флуоресценции хлорофилла в нативных ядерных комплексах ФС 2 и в комплексах ФС 2 (-Mn+Fe) в отсутствие и в присутствии марганца. Среда инкубации: 25 мМ MES (рН 6,5) 300 мМ сахарозы и 15 мМ NaCl. Остальные условия как на рис. 1.

Как и в случае измерения переменной флуоресценции, добавление низких концентраций марганца к препаратам ФС 2 -(Мп) с блокированным высокоаффинным сайтом практически не влияет на кинетику индукции

флуоресценции (данные не представлены). Однако добавление Мп2+ в концентрации 100 мкМ приводит к восстановлению кинетики флуоресценции. Таким образом, результаты, полученные с помощью флуоресцентных методов, свидетельствуют о наличии двух сайтов окисления марганца в ФС 2.

В дальнейших экспериментах с помощью прямого электрометрического метода было исследовано влияние экзогенного Мп2+ на генерацию Л*Р в препаратах ФС 2 (-Мп+Ре). Поскольку эффективность донирования электрона от Мп2+ к окислителю через высоко- и низкоаффинный сайты окисления при нейтральном значении рН больше, чем при низких значениях рН, регистрация осуществлялась при рН 7,5.

-5-

т 2

Э-<

-10-

-15-

—!—

0,0

ЧН

0,1

—I—

200

400

Время, мс

Рис. 4. Кинетика фотоэлектрических ответов в протеолипосомах, содержащих ядерные комплексы ФС 2(-Мп+Ре) в отсутствие (1) и в присутствии (2) 100 мкМ МпСЬ. Среда инкубации как на рис. 3.

На рис. 4 показаны фотоэлектрические ответы протеолипосом, содержащих ядерные комплексы ФС 2 (-Мп+Ре) в отсутствие (кривая 1) и в присутствии 100 мкМ МпС12 (кривая 2). Добавление катионов железа в концентрации, необходимой для блокирования высокоаффинного сайта окисления Мп, не влияло на кинетику генерации мембранного потенциала. Спад

фотоэлектрического ответа (кривая 1) характеризуется экспонентами с -0.13 мс (А, -23%), т2 -29 мс (А2 -27%) и т3 -217 мс (А3 -50%). Компоненты с т -29 мс и 217 мс, вероятно, отражают реакцию рекомбинации электрона между Qa" и Yz\ в то время как быстрая (-0,13 мс) компонента характеризует процесс рекомбинации между QA~ и PéSo+-

В отличие от препаратов ФС 2 (-Мп) в ядерных комплексах ФС 2 (-Mn+Fe), добавление марганца приводит только к замедлению кинетики спада фотоэлектрического ответа (кривая 2). Разложение кинетической кривой спада фотоэлектрического ответа выявляет две экспоненты с х -23 мс (-17%) и 760 мс (-83%). Минорная фаза с х -23 мс, вероятно, обусловлена наличием фракции реакционных центров с повреждённым донорным участком. Медленная фаза (-760 мс), наблюдаемая лишь при высокой концентрации ионов марганца, по-видимому, связана с предотвращением рекомбинации электрона между QA~ и Yz* в результате донирования электрона от Мп, связанного в низкоаффинном сайте. Отсутствие дополнительного электрогенеза в кинетике фотоэлектрического ответа указывает на электронейтральную природу реакции переноса электрона между марганцем, связанным в низкоаффинном сайте и тирозином Yz*. Это может быть связано с различным расположением высоко- и низкоаффинного сайтов относительно тирозина Yz.

3. Влияние экзогенных доноров электронов на кинетику генерации А Y

При исследовании донорного участка ФС 2 наиболее часто используемыми искусственными донорами электронов являются 1,5-дифенилкарбазид (ДФК) и гидроксиламин (NH2OH). Однако до сих пор вопрос о возможном электрогенном характере восстановления фотоокисленного РЦ ФС 2 от этих доноров не был исследован. Кроме того, если для ДФК окислителем в образцах ФС 2 (-Мп) является радикал тирозина Yz*, то для NH2OH природа окислителя

не ясна. Эти обстоятельства побудили нас исследовать перенос электрона от ДФК и NII2OH к реакционному центру на протеолипосомах с ядерными комплексами ФС 2 (-Мп) прямым электрометрическим методом.

На рис. 5 продемонстрированы фотоэлектрические ответы протеолипосом, содержащих ядерные комплексы ФС2 (-Мп) в отсутствие (кривая 1) и в присутствии искусственного донора электрона для Yz* - ДФК (кривая 2) в ответ на единичные вспышки света. Амплитуда быстрой фазы, время нарастания которой меньше времени нашей измерительной системы (<100 не) соответствует разделению зарядов в реакционном центре ФС 2 между P6so и QA с последующим ревосстановлением Р68о+ путем переноса электрона от тирозина Yz. Кинетика спада ДЧ7 аппроксимируется двумя экспоненциальными компонентами, характеризующимися постоянными времени ii ~5 мс (относительная амплитуда А] -6%) ит2 ~230 мс (А2 -94%), и обусловленными рекомбинацией зарядов между QA~ и Yz'.

Время, мс

Рис. 5. Фотоэлектрический ответ протеолипосом, содержащих ядерные комплексы ФС 2 (-Мп) из шпината в отсутствие (1) и в присутствии 50 мкМ ДФК. Среда инкубации как на рис. 1. Стрелкой указан момент лазерной вспышки.

Добавление в среду инкубации 50 мкМ ДФК, как видно из кривой 2, приводит к замедлению спада А Ч* и появлению дополнительного электрогенеза в миллисекундной шкале времени. Кинетика спада ДЧ* характеризуется двумя экспоненциальными фазами СТ] ~10 мс (А] ~9%) их 2 -930 мс (А2 -91%). Можно предположить, что наблюдаемая в таких условиях быстрая компонента спада (Т]) обусловлена рекомбинацией зарядов между С)А~ и У2", в то время как медленная основная компонента ( 2) отражает пассивную проницаемость протеолипосомальной мембраны.

Характерное время дополнительной фазы нарастания Д4У равно ~3 мс, а ее амплитуда составляет -17% от амплитуды фазы, соответствующей образованию ДЧУ при переносе электронов между У г и (3А. Мы предполагаем, что дополнительная фаза генерации фотопотенциала, наблюдаемая в присутствии ДФК, отражает электрогенную реакцию переноса электрона между ДФК и тирозином Уг*.

Следует отметить, что величина амплитуды дополнительной фазы нарастания ДЧ* в присутствии ДФК (-17%) меньше, чем в присутствии ТМФД (-30%) (вор1а й а1. 2008). Однако, наличие быстрой компоненты спада ДТ, наблюдавшейся в отсутствие ДФК (т1~5 мс, Ах~6%) и сопоставимой по времени фазы нарастания ДЧ* при его добавлении, может приводить к занижению реальной амплитуды нарастания.

В отличие от ДФК, как было показано нами в работе (Оор1а е1 а1. 2008), дополнительная электрогенная фаза в присутствии редокс-медиаторов ТМФД и ДХФИФ становится хорошо заметной лишь при весьма высоких их концентрациях (1-8 мМ). При меньших концентрациях восстановление тирозина У7' не дает видимого вклада в кинетику генерации фотопотенциала, что объясняется низкой скоростью медленного нарастания ДЧ*, маскирующегося процессами разряда ДЧ/ (данные не приведены).

Нами было также изучено влияние низкомолекулярного ]МН2С)Н на кинетику генерации АЧУ в протеолипосомах, содержащих ядерные комплексы ФС 2 (-Мп).

Время, мс

Рис. 6. Фотоэлектрический ответ протеолипосом, содержащих ядерные комплексы ФС 2 (-Мп) в отсутствие (1) и в присутствии 100 мкМ МЬОН. Условия как на Рис. 1.

На рис. 6 в двух временных масштабах показано образование АЧ* на протеолипосомах с ФС 2 (-Мп) в отсутствие (кривая 1) и в присутстви и (кривая 2) 100 мкМ НН2ОН в ответ на единичные вспышки света. Замедление кинетики спада в присутствии >1Н2С)Н [(Т] ~25 мс (А1 ~5%), т2 ~720 мс (А2 ~95%)] по сравнению с контролем 1 ~3.5 мс (А] -5%), т2 -230 мс (А2 -95%)] свидетельствует о предотвращении рекомбинации зарядов в РЦ ФС 2 за счет эффективного переноса электрона между ЫН2ОН и РЦ ФС 2.

Для объяснения различного влияния ДФК и 1ЧН2ОН на электрогенез в ФС 2 нами была рассмотрена структура белка на донорном участке. На основании данных рентгеноструктурного анализа кристаллов ФС 2 недавно было выявлено несколько каналов, ведущих от границы донорного участка белка к Мп4Са кластеру (Сиэкоу ^ а1., 2009). Из них три канала имели минимальный

ван-дер-ваальсовый диаметр ~2,7 А. Было предположено, что эти каналы служат для транспорта кислорода и молекул воды между каталитическим сайтом комплекса окисления воды и люменом.

При удалении Мп4Са кластера также происходит удаление трёх периферических субъединиц ФС 2. С целью выявления возможных гидрофильных каналов нами было проведено моделирование структуры ФС 2 в отсутствие периферических белков. Моделирование каналов проводилось с помощью программы Caver 2.0 v0.003 (Medek et al. 2007). Было показано, что минимальный диаметр канала 1 составляет ~3 А, а каналов 2 и 3 - ~2 А. Очевидно, что размеры ДФК существенно превышают диаметр этих каналов, в то время как размеры молекулы NH2OH позволяют ему свободно диффундировать через обнаруженные каналы.

"1 H

m

Р680

дфк

ШШШ/г

NH2OH

Рис. 7. Схема транспорта электрона на донорном участке ФС 2 (-Мп) в присутствии ДФК и КНзОН. Сплошными стрелками показаны электрогенные стадии переноса электрона, пунктирная стрелка демонстрирует диффузию МН2ОН через один из гидрофильных каналов от поверхности белка к сайту связывания МщСа-кластера.

На Рис. 7 схематически представлена предполагаемая схема восстановления фотоокисленного под действием лазерной вспышки от ДФК и МН2ОН. Согласно схеме донирование электрона от ДФК к У2* сопровождается образованием ДТ за счет векторного внутрибелкового переноса электрона от

сайта связывания ДФК на границе белок-вода к погруженному вовнутрь пигмент-белкового комплекса Уг. В то же время ЫН2ОН диффундирует через один из трех каналов диаметром ~2,0-3,0 А, обнаруженных в структуре кристалла ФС2 и ведущих от границы белка к сайту связывания Мп4Са кластера, а затем восстанавливает Уг".

Как видно из рис. 6, добавление ЫН2ОН не приводит к появлению дополнительной фазы нарастания А1Р, однако небольшая компонента с характерным временем т —3,5 мс замедляется до 25 мс. Этот результат может объясняться как предотвращением рекомбинации зарядов между 0А~ и Ух' в результате электронейтрального донирования электрона от >1Н2ОН, так и появлением небольшой фазы нарастания Д*Р, обусловленной электрогенным донированием электрона от сайта связывания ЫН2ОН на У/ и компенсирующейся спадом ЛЧ' в том же временном диапазоне. Последнее предположение может быть подкреплено тем, что, как отмечалось выше, добавление экзогенного Мп к аналогичным препаратам приводило к появлению близкой по амплитуде, но более быстрой электрогенной стадии. Сайт связывания ЫН2ОН может быть близок к сайту связывания Мп, поскольку каналы сходятся вблизи Мп4Са кластера.

Полученные результаты дают новую важную информацию о механизмах образования АУИ на донорном участке комплексов ФС 2. Они показывают, что эффективное восстановление окисленного Уг* от искусственных доноров электронов в препаратах РЦ ФС 2, лишенных Мп4Са кластера, может быть как электрогенным, так и неэлектрогенным. В первом случае более гидрофобные доноры (ДФК и ТМФД) восстанавливают У2" электрогенным образом за счет векторного переноса электрона от сайта связывания на границе белок-вода, а во втором случае более гидрофильные и низкомолекулярные доноры (ЫН2ОН) могут диффундировать через каналы с минимальным диаметром 2,0-3,0 А, ведущие от люменальной поверхности белка к сайту связывания Мп4Са кластера, а затем восстанавливать У2*. При этом перенос электрона от ИН2ОН к

Уг" либо может быть электронейтральным, либо вносить незначительный по сравнению с гидрофобными донорами вклад в наблюдаемый электрогенез.

4. Влияние синтетических марганец-содержащнх комплексов на кинетику генерации Д*Р

В последние годы для реконструкции функции КВК очень широко применяются различные синтетические одно-, двухъ- и трехъядерные марганцевые комплексы. Однако вопрос о молекулярном механизме фотоактивации до сих пор остается открытым. Также остается не ясной природа взаимодействия между ФС 2 и различными синтетическими марганцевыми комплексами.

«1 О о и \ / \

-) Мп ф МгГ^Го ^

Ме (I = С5Н5Ы) 173-1 (комплекс-1)

Мв (Ь = С5Н5Ы) Ме 173-2 (комплеко-2)

Рис. 8. Структуры синтетических трёхъядерных марганцевых комплексов.

В этом разделе диссертационной работы исследовалось влияние двух синтетических трёхъядерных Мп-содержащих комплексов на кинетику фотоэлектрических ответов протеолипосом, содержащих препараты ФС 2 (-Мп). Эти комплексы представляют собой триподные органические молекулы, хелатирующие три атома марганца. Комплексы были синтезированы в

лаборатории профессора Нагато (Оказаки, Япония) и получили обозначения 173-1 (комплекс-1) и 173-2 (комплекс-2).

На рис. 8 показаны структурные формулы этих веществ. С помощью ЯМР спектроскопии с использованием изотопа фосфора 19Р было продемонстрировано, что при взаимодействии этих синтетических Мп-комплексов с мембранными фрагментами ФС 2 происходит распад триподных лигандов е1 а1„ 2008).

На рис. 9 показан фотоэлектрический ответ протеолипосом, содержащих препараты ФС2 (-Мп) в отсутствие (кривая 1) и в присутствии (кривая 2) синтетического комплекса-1.

Время, мс

Рис. 9. Образование мембранного потенциала в протеолипосомах, содержащих ядерные комплексы ФС 2 (-Мп) в отсутствие (1) и в присутствии 1 мкМ комплекса (2); на вставке показан результат вычитания кривой 1 из кривой 2. Среда инкубации как на рис. 3.

Видно, что в присутствии 1 мкМ марганцевого комплекса-1 в кинетике фотоэлектрического ответа помимо быстрой неразрешимой фазы, связанной с переносом электрона между Хг и Од, наблюдается появление дополнительной генерации мембранного потенциала и существенное замедление кинетики

спада. Экспоненциальный анализ показывает, что кинетика дополнительной медленной электрогенной фазы описывается экспонентой с т -160 мс (-25% от амплитуды фазы, связанной с процессом рекомбинации зарядов между Уг* и Оа"). Однако, при вычитании кривой 1 из кривой 2 на субмиллисекундных временах выявляется также фаза с х -50 мкс (-4% от амплитуды Уг'С>А~)-

Сходство кинетик и амплитуд быстрых электрогенных фаз в присутствии МпС12 (рис. 2, вставка) и синтетического комплекса-1 (рис. 9, вставка) позволяют предположить, что эти фазы обусловлены восстановлением тирозина У2' путем переноса электрона от Мп, находящегося в высокоаффинном сайте. В случае комплекса-1 связывание марганца с этим сайтом в ФС 2 происходит после высвобождения триподных лигандов. Более медленная электрогенная фаза (х -160 мс), вероятно, отражает перенос электрона от синтетического комплекса-1, ассоциированного с границей белок-вода, к окисленному марганцу в Мп-связывающем сайте. Замедление спада фотоэлектрического ответа объясняется тем, что в образцах комплексов ФС 2 (-Мп) происходит предотвращение окисления С2а~ тирозином вследствие быстрого восстановления Уг" путем переноса электрона от марганца. В кинетике спада А1? были выявлены две компоненты: Т1 -1,4 с (-90%) и долгоживущая компонента (-10%), отражающие пассивный разряд через протеолипосомальную мембрану.

Следует отметить, что суммарная амплитуда дополнительных электрогенных фаз, наблюдаемых в присутствии синтетического комплекса-1 составляет -30% от общего фотоэлектрического ответа, что близко к амплитуде электрогенной фазы, обусловленной переносом электрона от восстановленного ТМФД на У2". Более медленная кинетика электрогенной фазы (т -160 мс), наблюдаемая в случае синтетического комплекса-1, вероятно, обусловлена структурными особенностями этого соединения и наличием в нём общего положительного заряда, что может препятствовать образованию оптимального для переноса электрона комплекса с белком.

Рис. 10. Взаимодействие трёхъядерного синтетического марганцевого комплекса-1 с ФС 2 (-Мп).

На рис. 10 показано взаимодействие триподного комплекса-1 с ядерным комплексом ФС 2, лишённым марганца. Стрелками показан перенос электрона между функциональными кофакторами ФС 2, а также перенос электрона от связанного с поверхностью комплекса-1 к окисленному марганцу в высокоаффинном сайте.

Нами также было изучено влияние синтетического комплекса-2 на кинетику генерации Добавление этого комплекса приводило к замедлению кинетики спада фотоответа, свидетельствующему о переносе электрона к Уг*, но дополнительного нарастания АЧ7 при этом не наблюдалось. Отсутствие дополнительной электрогенной фазы в кинетике фотоэлектрического ответа может быть связано с тем, что после распада триподных лигадов, марганец встраивается в низкоаффинный сайт и электронейтрально восстанавливает У/.

Эти данные важны для понимания молекулярного механизма электрогенеза на донорном участке комплекса ФС 2, а также дают новый взгляд на структуру и функции Мп (и/или Уг) в препаратах ФС 2, лишённых марганца.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Целью диссертационной работы явилось изучение механизмов переноса электрона на донорном участке ФС 2 с помощью методов регистрации переменной флуоресценции, кинетики индукции флуоресценции и трансмембранной разности электрических потенциалов (ДЧ'). Использованный прямой электрометрический метод позволяет проводить измерения кинетики генерации фотопотенциала с разрешением 100 нс в режиме однократного срабатывания фермента, что существенно облегчает интерпретацию наблюдаемых явлений.

Работа была проведена на изолированных ядерных комплексах ФС 2 из шпината, выделенных в присутствии глицинбетаина и содержащих весь набор функциональных кофакторов, включая вторичный хинонный акцептор <3В- Эти образцы представляют собой минимальную функциональную единицу, способную катализировать окисление воды. Локализация комплекса окисления воды вблизи наружной поверхности протеолипосомальной мембраны позволяет изучать взаимодействие между экзогенными донорами электронов и РЦ ФС 2.

В первом разделе экспериментальной части работы представлены результаты исследования переноса электрона на донорном участке ФС 2 с активным комплексом окисления воды и ФС 2, лишенной марганцевого кластера. Была показана возможность реконструкции электрогенной реакции транспорта электрона между марганцем и редокс-активным тирозином в образцах ФС 2 (-Мп).

Во втором разделе экспериментальной части были исследованы препараты ФС 2 с блокированным высокоаффинным Мп-связывающим сайтом (~Мп+Ре). Были выявлены два сайта окисления Мп. Отсутствие дополнительного

23

электрогенеза в кинетике генерации ДТ в препаратах ФС 2 (-Мп+Ре) указывает на электронейтральную природу реакции переноса электрона от Мп, связанного в низкоаффинном сайте, к У/ в 01-субъединице.

Дальнейшие два раздела работы были посвящены исследованию влияния различных экзогенных доноров электронов, таких как дифенилкарбазид и гидроксиламин, а также двух синтетических трехъядерных марганцевых комплексов (173-1 и 173-2) на кинетику генерации фотопотенциала в препаратах ФС 2 (-Мп). Было продемонстрировано наличие дополнительной генерации мембранного потенциала в присутствии ДФК и комплекса 173-1, обусловленной векторным переносом электрона внутри комплекса РЦ. Электронейтральная или небольшая по амплитуде (-5% от быстрой фазы) электрогенная реакция переноса электрона между >Ш2ОН и РЦ ФС 2, вероятно, обусловлена восстановлением Уг" от ИНгОН, диффундировавшего через каналы большого диаметра на донорном участке ФС 2 к сайту связывания Мп4Са кластера.

Полученные данные важны для понимания молекулярных механизмов электрогенеза, связанного с переносом зарядов на донорном участке ФС 2.

выводы

1) Методами регистрации флуоресценции продемонстрирована возможность реконструкции переноса электрона на донорном участке ядерных комплексов ФС 2 из шпината, лишённых Мп4Са кластера [ФС 2 (-Мп)]. На протеолипосомах, содержащих ФС 2 (~Мп), с помощью прямого электрометрического метода показана дополнительная генерация мембранного потенциала (А Ч*), обусловленная переносом электрона от марганца к редокс-активному аминокислотному остатку тирозину У/ в ответ на вспышки лазера. Сходство относительной амплитуды этой электрогенной фазы (~5% от Уг'Ол". х ~50 мкс) с величиной электрогенеза, обусловленного восстановлением У2" марганцевым кластером в препаратах ФС 2 с активным комплексом окисления воды, позволило заключить, что диэлектрическая проницаемость на участке между сайтом связывания Мп и Уг в препаратах ФС 2 (-Мп) остается такой же, как и в нативных ядерных комплексах.

2) С помощью регистрации переменной флуоресценции на ядерных комплексах ФС 2 продемонстрировано наличие двух сайтов окисления экзогенного марганца. С помощью прямого электрометрического метода показано, что в отличие от электрогенной реакции переноса электрона от марганца к тирозину Уг' через высокоаффинный сайт, реакция переноса электрона от марганца к через низкоаффинный сайт не сопряжена с генерацией А1?. Одной из возможных причин может быть различное расположение сайтов окисления марганца относительно У/..

3) Показано, что окисление искусственного донора электрона дифенилкарбазида (ДФК) радикалом тирозина У7' сопряжено с образованием А У (~17% от фазы У^'Олг т ~3 мс). Это обусловлено векторным внутрибелковым переносом электрона от сайта связывания ДФК на границе белок-вода к У/.

4) Замедление спада фотоэлектрического ответа в присутствии гидроксиламина (НН2ОН) по сравнению с контролем свидетельствует об эффективном переносе электрона между ЫН2ОН и реакционным центром ФС 2. При этом перенос электрона от ЫН2ОН к тирозину У/ либо может быть электронейтральным, либо вносить незначительный по сравнению с гидрофобными донорами (ДФК, ТМФД) вклад в наблюдаемый электрогенез. Предложена гипотеза, в соответствии с которой №12ОН способен диффундировать через один из каналов диаметром 2,0-3,0 А, видимых в структуре ФС 2 и ведущих от границы белка к сайту связывания МщСа, с последующим донированием электрона на У2'.

5) В присутствии синтетического трехъядерного марганцевого комплекса-1 выявлена дополнительная генерация Д1Р, обусловленная переносом электрона на донорном участке ФС 2 (-Мп). Наблюдаемая двухфазная кинетика нарастания обусловлена: 1) восстановлением тирозина У г от Мп ^-5% от У2'<За\ Т[ ~50 мкс), встраивающегося в высокоаффинный Мп-связывающий сайт после освобождения от триподных лигандов, и 2) векторным переносом электрона от марганцевого комплекса на поверхности белка к окисленному атому марганца в Мп-связывающем сайте (А2~25%, т2 ~160 мс).

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Gopta O.A., Tyunyatkina A.A., Kurashov V.N.. Semenov A.Y., Mamedov M.D. Effect of redox mediators on the flash-induced membrane potential generation in Mn-depleted photosystem II core particles. // European Biophysics Journal, 2008, v. 37, p. 1045-1050.

2. Kurashov V.N., Allakhverdiev S.I., Zharmukhamedov S.K., Nagata Т., Klimov V.V., Semenov A.Y., Mamedov M.D. Electrogenic reactions on the donor side of Mn-depleted photosystem II core particles in the presence of MnCl2 and synthetic trinuclear Mn-complexes. // Photochemical and Photobiological Sciences, 2009, v. 8, p. 162-166.

3. Kurashov V.N., Lovyagina E.R., Shkolnikov D.Y., Solntsev M.K., Mamedov M.D., Semin B.K Investigation of the low-affinity oxidation site for exogenous electron donors in the Mn-depleted photosystem II complexes. // Biochimica et Biophysica Acta, 2009, v. 1787, p. 1492-1498.

4. Мамедов М.Д., Курашов B.H.. Петрова И.О., Заспа A.A., Семенов А.Ю. Перенос электрона между экзогенными донорами электронов и реакционным центром фотосистемы 2 //Биохимия, 2010, т. 75, вып. 5, с. 675678.

5. Tyunyatkina A.A., Kurashov V.N., Gopta O.A., Semenov A.Yu., Mamedov M.D. Electrogenic reduction of tyrosine Yzox by exogenous reductants in photosystem II // Abstracts of the International meeting: Photosynthesis in the post-genomic era: Structure and Function of Photosystems, Puschino (Russia) 2006, p. 185.

6. Gopta O.A., Kurashov V.N., Tyunyatkina A.A., Semenov A.Yu., Mamedov M.D. Effect of redox mediators on the flash-induced membrane potential generation in Mn-depleted photosystem II core particles. // Abstracts of the 16th annual photosynthesis workshop Nord-West, Mülheim an der Ruhr (Germany) 2007, p. 39.

7. Kurashov V.N., Zharmukhamedov S.K., Semenov A.Yu., Mamedov M.D. Photovoltage measurements of manganese-depleted/reconstituted photosystem II core complexes incorporated into lipid vesicles // Abstracts of the International conference "Light energy conversion in photosynthesis", Puschino (Russia) 2008, p. 58.

8. Курашов B.H., Петрова И.О., Заспа A.A., Семёнов А.Ю. Мамедов М.Д. Перенос электронов на донорном участке в ядерных комплексах фотосистемы 2, лишённых марганца // Сборник тезисов XIX Пущинских чтений по фотосинтезу и Всероссийской конференции «Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах», посвященные 100-летию со дня рождения В.Б. Евстигнеева, Пущино 2009, с. 36.

Заказ № 159-а/04/10 Подписано в печать 29.04.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

\ ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

www.cfr.ru; е-та'й:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Курашов, Василий Николаевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.!.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Химические реакции фотосинтеза.

1.2. Принципы организации хлоропластов и тилакоидных мембран.

1.3. Структурные особенности ФС 2.

1.3.1. Рентгеноструктурный анализ.

1.3.2. Марганцевый кластер и сайт связывания иона хлора и кальция.

1.3.3. Внутриклеточная сборка МщСа- кластера.

1.4. Сборка Mn4CajClx~K!iacmepa in vitro (фотоактивация).

1.4.1. Комплексы ФС 2, лишённые Мп.

1.4.2. Неорганические кофакторы.

1.4.3. Роль белковых субъединиц в процессе сборки Мп4Са-кластера.

1.5. Функциональные аспекты ФС 2.

1.5.1. Разделение зарядов между Рб8о и Qa.

1.5.2. Выделение молекулярного кислорода: каталитический сайт, кинетика и механизм КВК.

1.5.3. Восстановление Рб80+ путем переноса электрона от Yz.

1.5.4. Реакции переноса электронов в препаратах, лишенных Мп4Са-кластера.

1.5.5. Генерация мембранного потенциала в комплексах ФС 2.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Препаративные методы.

2.1.1. Используемы реактивы.

2.1.2. Выделение мембранных фрагментов, обогащенных ФС 2 (BBY-частиц).

2.1.3. Выделение ядерных комплексов ФС 2 с активным КВК.

2.1.4. Удаление марганцевого кластера.

2.1.5. Фотоактивация.

2.1.6. Блокирование высокоаффинного Мп-связывающего участка.

2.1.7. Электрофорез.

2.1.8. Приготовление протеолипосом, содержащих ядерные комплексы ФС 2.

2.2. Аналитические методы.

2.2.1. Оптические измерения.

2.2.2. Флуориметрические измерения.

2.2.3. Полярографический метод измерения кислорода.

2.2.4. Прямой электрометрический метод регистрации А^.

2.2.5. Кинетический анализ сигналов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Транспорт электрона на донорном участке комплексов ФС 2, лишённых марганцевого кластера и его реконструкция в препаратах, лишённых марганцевогокластера.

3.1.1. Флуориметрические измерения.

3.1.2. Электрометрические измерения.

3.2. Исследование низкоаффинного сайта окисления марганца.

3.3. Влияние экзогенных доноров электронов на кинетику генерации А Ч*

3.4. Влияние синтетических марганец-содерэкащих комплексов на кинетику генерации А Ч*.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Электрогенный перенос электрона на донорном участке пигмент-белкового комплекса фотосистемы 2"

Актуальность темы. Фотосинтез - процесс, с помощью которого фототрофные организмы преобразуют энергию излучения Солнца в энергию химически стабильных органических соединений. В результате фотосинтеза ежегодно происходит выделение 150-200 млрд. тонн молекулярного кислорода в атмосферу Земли и образуется около 200 млрд. тонн первичной биомассы (Barber 2007).

Первичные процессы фотосинтеза в цианобактериях, водорослях и высших растениях осуществляются в тилакоидных мембранах, где локализованы трансмембранные белковые комплексы фотосистемы 2 (ФС 2), цитохрома b^f и фотосистемы 1. Светозависимое окисление воды и выделение молекулярного кислорода катализируется комплексом ФС 2, представляющим собой НгО-пластохинон-оксидоредуктазу, механизм функционирования которой до сих пор является предметом интенсивных исследований. Сложность исследования функционирования этого фермента обусловлена его лабильностью, а также тем, что суммарный процесс включает ряд сопряженных реакций: светоиндуцированное разделение зарядов между первичным донором электронов Р68о и первичным хинонным акцептором QA, последующее одноэлектронное восстановление Рб8о+ редокс-активным аминокислотным остатком Yz (тирозин 161 D1 -полипептида реакционного центра), двухэлектронное восстановление вторичного хинонного акцептора QB и четырехэлектронное окисление молекулы воды.

Одной из наиболее актуальных проблем в изучении функционирования ФС 2 является выяснение механизма переноса зарядов на донорном участке фермента, содержащем кластер Мп4Са, его лигандное окружение и близлежащий тирозин Yz. Перспективным подходом в этих исследованиях является изучение механизма генерации трансмембранной разности электрических потенциалов (ДЧ^) комплексами ФС 2 в условиях однократного срабатывания фермента, что существенно облегчает интерпретацию наблюдаемых явлений по сравнению со стационарными процессами.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось исследование механизмов переноса электрона на донорном участке пигмент-белкового комплекса ФС 2 с помощью флуориметрических и прямого электрометрического методов.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать особенности реакции переноса электронов в ядерных комплексах ФС 2, лишенных марганцевого кластера [ФС 2 (-Мп)] и сопоставить полученные данные с результатами для нативных комплексов ФС 2.

2. Исследовать механизм реакции переноса электрона между реконструированным марганцем и радикалом тирозина Уу' в комплексах ФС 2 (-Мп).

3. Изучить реакцию переноса электрона от марганца к тирозину в препаратах ФС 2 (-Мп) с блокированным железом высокоаффинным сайтом связывания марганца.

4. Исследовать влияние различных экзогенных доноров электронов и синтетических марганец-содержащих комплексов на кинетику генерации мембранного потенциала.

5. Описать механизм восстановления тирозина У2" от искусственных доноров электронов.

Научная новизна работы.

В условиях реконструкции транспорта электрона в присутствии экзогенного Мп в препаратах ФС 2 (-Мп) было продемонстрировано наличие дополнительной электрогенной фазы, обусловленной восстановлением редокс-активного тирозина Ух' от Мп. Было выявлено два участка окисления марганца и показано, что перенос электрона через низкоаффинный сайт не сопряжен с образованием мембранного потенциала. Обнаружено, что электрогенный характер восстановления тирозина Yz не является специфичным для марганца, а имеет место и в случае искусственных доноров электронов (дифенилкарбазид, синтетический трехъядерный марганцевый комплекс). При этом наблюдаемая значительная по амплитуде дополнительная электрогенная стадия свидетельствует о достаточно низкой диэлектрической проницаемости на участке белка между и границей белок-вода. Предложена модель, согласно которой низкомолекулярный донор электронов гидроксиламин может диффундировать через каналы на донорной стороне белка к марганец-связывающему сайту с последующим восстановлением Уг'.

Практическая значимость исследования. Полученные результаты существенно расширяют и углубляют современный уровень знаний о механизмах функционирования пигмент-белкового комплекса ФС 2 и важны для понимания процессов переноса зарядов на донорной стороне ФС 2. Результаты могут быть использованы в биотехнологии для создания эффективных искусственных систем, преобразующих и запасающих солнечную энергию; в устройствах, осуществляющих фотолиз воды с образованием водорода и кислорода.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Курашов, Василий Николаевич

выводы

1) Методами регистрации флуоресценции продемонстрирована возможность реконструкции переноса электрона на донорном участке ядерных комплексов ФС 2 из шпината, лишённых Мп4Са кластера [ФС 2 (-Мп)]. На протеолипосомах, содержащих ФС 2 (—Мп), с помощью прямого электрометрического метода показана дополнительная генерация мембранного потенциала (А^Р), обусловленная переносом электрона от марганца к редокс-активному аминокислотному остатку тирозину У2" в ответ на вспышки лазера. Сходство относительной амплитуды этой электрогенной фазы (~5% от У2"0л , т ~50 мкс) с величиной электрогенеза, обусловленного восстановлением У2" марганцевым кластером в препаратах ФС 2 с активным комплексом окисления воды, позволило заключить, что диэлектрическая проницаемость на участке между сайтом связывания Мп и У2 в препаратах ФС 2 (—Мп) остается такой же, как и в нативных ядерных комплексах.

2) С помощью регистрации переменной флуоресценции на ядерных комплексах ФС 2 продемонстрировано наличие двух сайтов окисления экзогенного марганца. С помощью прямого электрометрического метода показано, что в отличие от электрогенной реакции переноса электрона от марганца к тирозину У2* через высокоаффинный сайт, реакция переноса электрона от марганца к У2" через низкоаффинный сайт не сопряжена с генерацией АТ. Одной из возможных причин может быть различное расположение сайтов окисления марганца относительно У2.

3) Показано, что окисление искусственного донора электрона дифенилкарбазида (ДФК) радикалом тирозина У2* сопряжено с образованием Д*-Р (~17% от фазы У/'Од-, т ~3 мс). Это обусловлено векторным внутрибелковым переносом электрона от сайта связывания ДФК на границе белок-вода к У2\

4) Замедление спада фотоэлектрического ответа в присутствии гидроксиламина (ЫНгОН) по сравнению с контролем свидетельствует об эффективном переносе электрона между МН2С)Н и реакционным центром ФС 2. При этом перенос электрона от МН2ОН к тирозину У2" либо может быть электронейтральным, либо вносить незначительный по сравнению с гидрофобными донорами (ДФК, ТМФД) вклад в наблюдаемый электрогенез. Предложена гипотеза, в соответствии с которой 1чГН2ОН способен диффундировать через один из каналов диаметром 2,0-3,0 А, видимых в структуре ФС 2 и ведущих от границы белка к сайту связывания Мп4Са, с последующим донированием электрона на У2\

5) В присутствии синтетического трехъядерного марганцевого комплекса-1 выявлена дополнительная генерация Д^, обусловленная переносом электрона на донорном участке ФС 2 (-Мл). Наблюдаемая двухфазная кинетика нарастания обусловлена: 1) восстановлением тирозина У2' от Мп (А1 ~5% от У2'С>а~, ~50 мкс), встраивающегося в высокоаффинный Мп-связывающий сайт после освобождения от триподных лигандов, и 2) векторным переносом электрона от марганцевого комплекса на поверхности белка к окисленному атому марганца в Мп-связывающем сайте (А2 ~25%, т2 ~160 мс).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Целью диссертационной работы явилось изучение механизмов переноса электрона на донорном участке ФС 2 с помощью методов регистрации переменной флуоресценции, кинетики индукции флуоресценции и трансмембранной разности электрических потенциалов (А^Р). Использованный прямой электрометрический метод позволяет проводить измерения кинетики генерации фотопотенциала с разрешением 100 нс в режиме однократного срабатывания фермента, что существенно облегчает интерпретацию наблюдаемых явлений.

Работа была проведена на изолированных ядерных комплексах ФС 2 из шпината, выделенных в присутствии глицинбетаина и содержащих весь набор функциональных кофакторов, включая вторичный хинонный акцептор СЫ. Эти образцы представляют собой минимальную функциональную единицу, способную катализировать окисление воды. Локализация комплекса окисления воды вблизи наружной поверхности протеолипосомальной мембраны позволяет изучать взаимодействие между экзогенными донорами электронов и РЦ ФС 2.

В первом разделе экспериментальной части работы представлены результаты исследования переноса электрона на донорном участке ФС 2 с активным комплексом окисления воды и ФС 2, лишенной марганцевого кластера. Была показана возможность реконструкции электрогенной реакции транспорта электрона между марганцем и редокс-активным тирозином в образцах ФС 2 (-Мп).

Во втором разделе экспериментальной части были исследованы препараты ФС 2 с блокированным высокоаффинным Мп-связывающим сайтом (—Мп+Ре). Были выявлены два сайта окисления Мп. Отсутствие дополнительного электрогенеза в кинетике генерации Д*Р в препаратах ФС 2 (-Мп+Ре) указывает на электронейтральную природу реакции переноса электрона от Мп, связанного в низкоаффинном сайте, к Ух в Б1-субъединице.

Дальнейшие два раздела работы были посвящены исследованию влияния различных экзогенных доноров электронов, таких как дифенилкарбазид и гидроксиламин, а также двух синтетических трехъядерных марганцевых комплексов (173-1 и 173-2) на кинетику генерации фотопотенциала в препаратах ФС 2 (-Мп). Было продемонстрировано наличие дополнительной генерации мембранного потенциала в присутствии ДФК и комплекса 173-1, обусловленной векторным переносом электрона внутри комплекса РЦ. Электронейтральная или небольшая по амплитуде (—5% от быстрой фазы) электрогенная реакция переноса электрона между ТчПНгОН и РЦ ФС 2, вероятно, обусловлена восстановлением У/' от ЫН2ОН, диффундировавшего через каналы большого диаметра на донорном участке ФС 2 к сайту связывания Мп4Са кластера.

Полученные данные важны для понимания молекулярных механизмов электрогенеза, связанного с переносом зарядов на донорном участке ФС 2.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Курашов, Василий Николаевич, Москва

1. Barber J. Biological solar energy I I Philos Transact A Math Phys Eng Sci. -2007.-V. 365-P. 1007-23.

2. Takahashi T., Inoue-Kashino N., Ozawa S., Takahashi Y., Kashino Y., Satoh K. Photosystem II complex in vivo is a monomer // J Biol Chem. — 2009. V. 284, -P. 15598-606.

3. Watanabe M., Iwai M., Narikawa R., Ikeuchi M. Is the photosystem II complex a monomer or a dimer? // Plant Cell Physiol. 2009. - V. 50, - P. 1674-80.

4. Zouni A., Witt H.T., Kern J., Fromme P., Krauss N., Saenger W., Orth P. Crystal structure of photosystem II from Synechococcus elongatus at 3. 8 A resolution // Nature. 2001. - V. 409, - P. 739-43.

5. Kern J., Loll B., Zouni A., Saenger W., Irrgang K.D., Biesiadka J. Cyanobacterial photosystem II at 3.2 A resolution the plastoquinone binding pockets // Photosynth Res. - 2005. - V. 84, - P. 153-9

6. Kamiya N., Shen J.R. Crystal structure of oxygen-evolving photosystem II from Thermosynechococcus vulcanus at 3.7-A resolution // Proc Natl Acad Sci USA. 2003. - V. 100,-P. 98-103.

7. Murray J.W., Maghlaoui K, Barber J. The structure of allophycocyanin from Thermosynechococcus elongatus at 3.5 A resolution II Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 2007. - V. 63, - P. 998-1002.

8. Loll В., Kern J., Saenger W., Zouni A., Biesiadka J. Towards complete cofactor arrangement in the 3.0Â resolution structure of photosystem II // Nature 2005. -V. 438,-P. 1040-1044.

9. Guskov A., Kern J., Gabdulkhakov A., Broser M., Zouni A. and Saenger W. Photosystem Cyanobacterial photosystem II at 2.9-Â resolution and the role of quinones, lipids, channels and chloride // Nat Struct Mol Biol. 2009. - V. 16, -P. 334-42.

10. Nelson N., Yocum C.F. Structure and functions of photosystems I and II // Annual Review of Plant Biology. 2006. - V. 57, - P. 521-565.

11. Sakurai I., Shen J.R., Leng J., Ohashi S., Kobayashi M., Wada H. Lipids in oxygen-evolving photosystem II complexes of cyanobacteria and higher plants // J. Biochem. 2006. - V. 140, - P. 201-209.

12. Krasnovsky A.A. Jr. Singlet molecular oxygen in photobiochemical systems: IR phosphorescence studies // Membr. Cell. Biol- 1998. -V. 12, P. 665-690.

13. Telfer A., What is b-carotene doing in the photosystem II reaction centre? // Phil. Trans. R. Soc. Lond. В 2002. - V. 357, - P. 1431-1440.

14. Kwa S.L.S., Newell W.R., van Grondelle R. & J.P. Dekker. The reaction center of Photsystem II studied with polarized fluorescence spectroscopy // Biochim. Biophys. Acta- 1992. -V. 1099,-P. 193-202.

15. Krivanek R., Kern J., Zouni A., Dau H. & Haumann, M. Spare quinones in the QB cavity of crystallized photosystem II from Thermosynechococcus elongates // Biochim. Biophys. Acta 2007. - V. 1767, - P. 520-527.

16. Каминская О. П., Шувалов В. А., Ренгер Г. Наличие хинон-связывающего участка в комплексе ФС 2, отличного от QA и QB и взаимодействующего с цитохромом Ь559 // Доклады Академии наук. 2007. - Т. 412, N 2. - С. 266268.

17. Kaminskaya О., Shuvalov V.A., Renger G. Evidence for a novel quinone-binding site in the photosystem II (PS II) complex that regulates the redox potential of cytochrome b559 // Biochemistry. 2007. - V. 46, - P. 1091-105.

18. Shen J.R., Inoue Y. Binding and functional properties of two new extrinsic components, cytochrome c-550 and a 12-kDa protein, in cyanobacterial photosystem II // Biochemistry. 1993. - V. 32, - P. 1825-32.

19. Peloquin, J. M. & Britt, R. D. EPR/ENDOR characterization of the physical and electronic structure of the OEC Mn cluster // Biochim. Biophys. Acta -2001. V. 1503,-P. 96-111.

20. Ferreira K.N., Iverson T.M., Maghlaoui K., Barber J. & Iwata S. Architecture of the photosynthetic oxygen-evolving center // Science 2004. - V. 303, - P. 1831-1838.

21. Murray J.W. and Barber J. Structural characteristics of channels and pathways in photosystem II including the identification of an oxygen channel // J. Struct. Biol 2007. - V. 159, - P. 228-237.

22. Ananyev G.M., Dismukes G.C. Assembly of the tetra—Mn site of photosynthetic water oxidation by photoactivation: Mn stoichiometry and detection of a new intermediate // Biochemistry. 1996. - V. 35, - P. 4102-9.

23. Ananyev G.M., Zaltsman L., Vasko C., Dismukes G.C. The inorganic biochemistry of photosynthetic oxygen evolution/water oxidation II Biochim Biophys Acta.- 2001.-V. 1503, -P. 52-68.

24. Dasgupta J., Ananyev G.M., Dismukes G.C. Photoassembly of the Water-Oxidizing Complex in Photosystem II // Coord Chem Rev. 2008. - V. 252, - P. 347-360.

25. Ananyev G.M., Dismukes G.C. High-resolution kinetic studies of the reassembly of the tetra-manganese cluster of photosynthetic water oxidation: proton equilibrium, cations, and electrostatics // Biochemistry. 1996. - V. 35, -P. 14608-17.

26. Klimov V.V., Allakhverdiyev S.I., Feyziev Y.M., Baranov S.V. Bicarbonate requirement for the donor side of photosystem II // FEBS Letters. — 1995. V. 363,-P. 251-255.

27. Klimov V.V., Baranov S.V. Bicarbonate requirement for the water-oxidizing complex of photosystem II // Biochim. Biophys. Acta. — 2001. — V. 1503, P. 187-196.

28. Hunziker D., Abramowicz D.A., Damoder R., Dismukes G.C., in: J. Biggins (Ed.), Progress in Photosynthesis Research, vol. I, Martinus-Nijhoff, Dordrecht, 1987, p. 5.597.

29. Renger G., Renger T. Photosystem II: The machinery of photosynthetic water splitting // Photosynth Res. 2008. - V. 98, - P. 53-80.

30. Hankamer B., Barber J., Boekema E.J. Structure and membrane organization of photosystem II in green plants // Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. — 1997. -V. 48,-P. 641-671.

31. Rogner M., Chisholm D.A., Diner B.A. Site-directed mutagenesis of the psbC gene of photosystem II: isolation and functional characterization of CP43-less photosystem II core complexes // Biochemistry. — 1991. V. 30, - P. 5387-95.

32. Qian M., Al-Khaldi S.F., Putnam-Evans C., Bricker T.M., Burnap R.L. Photoassembly of the photosystem II (Mn)4 cluster in site-directed mutants impaired in the binding of the manganese-stabilizing protein // Biochemistry. -1997.-V. 36,-P. 15244-52.

33. Dekker J.P, Boekema E.J. Supramolecular organization of thylakoid membrane proteins in green plants // Biochim Biophys Acta. 2005. - V. 1706, - P. 12-39.

34. Renger G. Oxidative photosynthetic water splitting: energetics, kinetics and mechanism // Photosynth Res. 2007. - V. 92, - P. 407-25.

35. Raszewski G., Diner B.A., Schlodder E., Renger T. Spectroscopic properties of reaction center pigments in photosystem II core complexes: revision of the multimer model //Biophys J. 2008. - V. 95, - P. 105-19.

36. Raszewski G., Saenger W., Renger T. Theory of optical spectra of photosystem II reaction centers: location of the triplet state and the identity of the primary electron donor // Biophys J. 2005. - V. 88, - P. 986-98.

37. Novoderezhkin V.I., Palacios M.A., van Amerongen H., van Grondelle R. Excitation dynamics in the LHCII complex of higher plants: modeling based on the 2.72 Angstrom crystal structure // J Phys Chem B. 2005. - V. 109, - P. 10493-504.

38. Raszewski G., Renger T. Light harvesting in photosystem II core complexes is limited by the transfer to the trap: can the core complex turn into a photoprotective mode? // J Am Chem Soc. 2008. - V. 130, - P. 4431-46.

39. Joliot P., Barbieri G. and Chabaud R Un nouveau modèle des centres photochimiques du système II II Photochem Photobiol 10 (1969) 309-329.

40. Kok B., Forbush B. and McGloin M. Cooperation of charges in photosynthetic O2 evolution -1. A linear four step mechanism II Photochem. Photobiol. 1970. -V. 11,-P. 457-475

41. Dau H., Haumann M. The manganese complex of photosystem II in its reaction cycle Basic framework and possible realization at the atomic level // Coordination Chemistry Reviews - 2008. V. 252, - P. 273-295

42. Boussac A., Zimmermann J.L., Rutherford A.W. EPR signals from modified charge accumulation states of the oxygen evolving enzyme in Ca2+-deficient photosystem II // Biochemistry. 1989. - V. 28, - P. 8984-9.

43. Tommos C., Hoganson C.W., Valentin M.D., Lydakis-Simantiris N., Dorlet P., Westphal K., Chu H.A., McCracken J., Babcock G.T. Manganese and tyrosyl radical function in photosynthetic oxygen evolution // Curr Opin Chem Biol. -1998.-V. 2,-P. 244-52.

44. Renger G., Kiihn P. Reaction pattern and mechanism of light induced oxidative water splitting in photosynthesis // Biochim Biophys Acta. — 2007. V. 1767, -P. 458-71.

45. Debus R.J. Amino acid residues that modulate the properties of tyrosine Y(Z) and the manganese cluster in the water oxidizing complex of photosystem II // Biochim Biophys Acta. 2001. - V. 1503, - P. 164-86.

46. Hoganson C.W., Babcock G.T. A metalloradical mechanism for the generation of oxygen from water in photosynthesis // Science. — 1997. V. 277, - P. 19536.

47. Haumann M., Junge W. Photosynthetic water oxidation: a simplex-scheme of its partial reactions // Biochim Biophys Acta. 1999. - V. 1411, - P. 86-91.

48. Tommos C., Babcock G.T. Proton and hydrogen currents in photosynthetic water oxidation // Biochim Biophys Acta. 2000. - V. 1458, - P. 199-219.

49. Tommos C., McCracken J., Styring S., Babcock G.T. Stepwise disintegration of the photosynthetic oxygen evolving complex // J. Am. Chem. Soc. — 1998. V. 120,-P. 10441-10452.

50. Rappaport F., Lavergne J. Coupling of electron and proton transfer in the photosynthetic water oxidase // Biochim. Biophys. Acta. — 2001. — V. 1503, P. 246-259.

51. Nugent J.H., Muhiuddin I.P., Evans M.C. Electron transfer from the water oxidizing complex at cryogenic temperatures: the SI to S2 step // Biochemistry.- 2002.-V. 41,-P. 4117-26.

52. Zhang C., Styring S. Formation of split electron paramagnetic resonance signals in photosystem II suggests that tyrosine(Z) can be photooxidized at 5 K in the So and Si states of the oxygen-evolving complex // Biochemistry. 2003. - V. 42, — P. 8066-76.

53. Boussac A., Sugiura M., Lai T.L., Rutherford A.W. Low-temperature photochemistry in photosystem II from Thermosynechococcus elongatus induced by visible and near-infrared light // Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.- 2008. V. 363, - P. 1203-10.

54. Zhang C., Boussac A., Rutherford A.W. Low-temperature electron transfer in photosystem II: a tyrosyl radical and semiquinone charge pair // Biochemistry. — 2004. V. 43, - P. 13787-95.

55. Ioannidis N., Zahariou G., Petrouleas V. Trapping of the S2 to S3 state intermediate of the oxygen-evolving complex of photosystem II // Biochemistry.- 2006. — V. 45,-P. 6252-9.

56. Petrouleas V., Koulougliotis D., Ioannidis N. Trapping of metalloradical intermediates of the S-states at liquid helium temperatures. Overview of thephenomenology and mechanistic implications // Biochemistry. 2005. - V. 44, -P. 6723-8.

57. Berthold D.A., Babcock G.T., and Yocum C.F. A highly resolved, oxygen evolving Photosystem II preparation from spinach thylakoid membranes. EPR and electron transport properties // FEBS Lett 1981. -V. 134, - P. 231-234.

58. Ren Y., Zhang C., Bao H., Shen J., Zhao J. Probing tyrosine Z oxidation in Photosystem II core complex isolated from spinach by EPR at liquid helium temperatures // Photosynth. Res. 2009. - V. 99, - P. 127-38.

59. Meyer T.J., Huynh M.H., Thorp H.H. The possible role of proton-coupled electron transfer (PCET) in water oxidation by photosystem II // Angew Chem Int Ed Engl. 2007. - 46, - P. 5284-304.

60. Ishida N., Sugiura M., Rappaport .F, Lai T.L., Rutherford A.W., Boussac A. Biosynthetic exchange of bromide for chloride and strontium for calcium in the photosystem II oxygen-evolving enzymes // J Biol Chem. — 2008. -V. 283, P. 13330-13340.

61. Hong S.K., Pawlikowski S.A., Vander Meulen K.A., Yocum C.F. The oxidation state of the photosystem II manganese cluster influences the structure of manganese stabilizing protein //Biochim Biophys Acta. — 2001. — V. 1504, P. 262-274.

62. Conjeaud H., Mathis P. The effects of pH on the reductions kinetics of P680 in Tris-treated chloroplasts // Biochim. Biophys. Acta. 1980. - V. 590, - P. 353359.

63. Ahlbrink R., Haumann M., Cherepanov D., Bogershausen O., Mulkidjanian A., Junge W. Function of tyrosine Z in water oxidation by photosystem II: electrostatical promotor instead of hydrogen abstractor // Biochemistry. 1998. — V. 37,-P. 1131-1142.

64. Meyer B., Schlodder E., Dekker J.P., Witt H.T. 02 evolution and Chln+ (P680+) nanosecond reduction kinetics in single flashes as a function of pH // Biochim. Biophys. Acta. 1989. - V. 974, - P. 36-43.

65. Schlodder E., Brettel K., Witt H.T. Relation between microsecond reduction kinetics of photooxidized chlorophyll a (P-680) and photosynthetic water oxidation Biochim // Biophys. Acta. 1985. - V. 808, - P. 123-131.

66. Schilstra M.J., Rappaport F., Nugent J.H.A., Barnett C.J., Klug D.R. Proton/hydrogen transfer affects the S-state-dependent microsecond phases of P680+reduction during water splitting // Biochemistry. — 1998. V. 37, - P. 3974-3981.

67. Hays A.M., Vassiliev I.R, Golbeck J.H., Debus RJ. Role of D1-His 190 in the proton-coupled oxidation of tyrosine Yz in manganese-depleted photosystem II // Biochemistry.- 1999.-V. 38, P. 11851-11865.

68. Eckert H.-J., Renger G. Temperature dependence of P680+reduction in 02-evolving PS II membrane fragments at different redox states Si of the water oxidizing system // FEBSLett. 1988. - V. 236, - P. 425-431.

69. Reinman S., Mathis P. Influence of temperature on photosystem II electron transfer reactions // Biochim. Biophys. Acta. 1981. - V. 635, - P. 249-258.

70. Babcock G.T., Sauer K. The rapid component of electron paramagnetic resonance signal II: a candidate for the physiological donor to photosystem II in spinach chloroplasts // Biochim. Biophys. Acta. — 1975. — V. 376, P. 329-344.

71. Mitchell P. Chemiosmotic coupling in oxidative and photosynthetic phosphorylation // Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 1966. - V.41, - P. 445-502.

72. Junge W., Witt H.T. On the ion transport system of photosyntrhesis. Investigations on a molecular level // Z. Naturforsch. 1968. - V. 222, - P. 244254.

73. Bulychev A.A., Andrianov V.K., Kurella G.A., Litvin F.F. Micro-electrode measurements of the transmembrane potential of chloroplasts and its photoinduced changes // Nature. 1972. - V. 236, - P. 175-177.

74. Fowler C.F., Кок B. Direct observation of a light-induced electric field in chloroplasts // Biochim. Biophys. Acta. 1974. - V. 357, - P. 308-318.

75. Schuurmans J.J., Casey R.P., Kraayenhof R. Transmembrane electrical potential formation in spinach chloroplasts. Investigation using rapidly-responding extrinsic probe // FEBSLetters. 1978. - V. 94, - P. 405-409.

76. Семенов А.Ю., Чаморовский C.K., Мамедов М.Д. Электрогенные реакции в комплексах фотосистемы I // Биофизика. — 2004. — Т. 49, Р. 227-238.

77. Рубин А.Б. Биофизика. М.: Книжный дом «Университет», - 2000.

78. Рубин А.Б., Кренделева Т.Е. Регуляция первичных процессов фотосинтеза // Успехи биологической химии. — 2003. — Т. 43, — Р. 225-266.

79. Witt H.T., Zikler A. Electrical evidence for the field indicating change in bioenergetic membranes // FEBSLett. -1973. V. 37, - P. 307-310.

80. Graber P., Trissl H-W. On the rise time and polarity of the photovoltage generated by light gradients in chloroplasts suspensions // FEBS Lett. 1981. -V. 123,-P. 95-99.

81. Trissl H-W., Leibl W. Primary charge separation in photosystem II involves two electrogenic steps II FEBS Lett- 1989. V. 244, - P. 85-88.

82. Leibl W., Breton J., Deprez J., Trissl H-W. Photoelectric study on the kinetics of trapping and charge stabilization in oriented PS II membranes // Photosynth Res. 1989.-V. 22,-P. 257-275.

83. Trissl H-W., Breton J., Deprez J., Leibl W. Primary electrogenic reactions in photosystem II as probed by the light-gradient method // Biochim Biophys Acta — 1987.-V. 893,-P. 305-319.

84. Pokorny A., Wulf K., Trissl H-W. An electrogenic reaction associated with the re-reduction of P680 by tyr Z in photosystem II // Biochim Biophys Acta. — 1994. -V. 1184,-P. 65-70.

85. Hook F., Brzezinski P. Light-induced voltage changes associated with electron and proton transfer in photosystem II core complexes reconstituted in phospholipid monolayers // Biophys J- 1994. V. 66, - P. 2066-2072.

86. Mamedov M.D., Lovyagina E.R., Verkhovski M.I., Semenov A.Y., Cherepanov D.A., Shinkarev V.P. Generation of electric potential by photosystem II from thermophilic cyanobacteria // Biochemistry (Mosc) — 1995. V. 59, - P. 327341.

87. Haumann M., Mulkidjanian A., Junge W. Electrogenicity of electron and proton transfer at the oxidizing side of photosystem II // Biochemistry 1997. - V. 36, -P. 9304-9315.

88. Mamedov M.D., Tyunyatkina A.A., Siletsky S.A., Semenov A.Y. Voltage changes involving photosystem II quinone-iron complex turnover // Eur Biophys J. 2006. - V. 35, - P. 647-654.

89. Schliephake W., Junge W., Witt H.T. Correlation between field formation, proton translocation, and the light reactions in photosynthesis // Z Naturforsch BJ- 1968.-V. 23,-P. 1571-1578.

90. Vredenberg W.J. P515: a monitor of photosynthetic energiziation in chloroplast membranes // Physiol Plant 1981. - V. 53, - P. 598-602.

91. Arnon D.I. Copper enzymes in isolated chloroplasts Polyphenoloxidase in Beta vulgaris II Plant Physiol. - 1949. - V. 24, - P. 1-15.

92. Kalaidzidis Ya.L., Gavrilov A.V., Zaitsev P.V., Kalaidzidis A.L., Korolev, E.V. PLUK-An Environment for Software Development // Programming and Computer Software. 1997-V. 23,-P. 206-212.

93. Murata N., Mohanty P.S., Hayashi H., Papageorgiou G.G. Glycinebetaine stabilizes the association the extrinsic proteins with the photosynthetic oxygen-evolving complex // FEBS Letters. 1992. - V. 296, - P. 187-189.

94. Bogershausen O. and Junge W. Rapid proton transfer under flashing light at both functional sides of dark-adapted Photosystem II particles // Biochim. Biophys. Acta.- 1995.-V. 1230,-P. 177-185.

95. Diner B.A., Babcock G.T. Structure, dynamics, and energy conversion efficiency in photosystem II. / Oxygenic Photosynthesis: The Light Reactions // Ort, D. R., and Yocum, C. F. (eds.), Dordrecht: Kluwer, - 1996. - P. 213-247.

96. Semin K., Ghirardi M.L. and Seibert M. Blocking of electron donation by Mn to Yz following incubation of Mn-depleted photosystem II membranes with Fe in the light // Biochemistry 2002. - V. 41, - P. 5854-5864.

97. Pospisil P., Dau H. Chlorophyll fluorescence transients of Photosystem II membrane particles as a tool for studying photosynthetic oxygen evolution // Photosynthesis Research 2000. - V. 65, - P. 41-52.

98. Lazar D. The polyphasic chlorophyll a fluorescence rise measured under high intensity of exciting light // Functional Plant Biology 2006. - V. 33, - P. 9-30.

99. Butler W.L. On the Primary Nature of Fluorescence Yield Changes Associated with Photosynthesis //Proc Natl Acad Sci USA 1972. - V. 69, - P. 34203422.

100. Мамедов М.Д., Бешта O.E., Туровская K.H., Мамедова А.А., Неверов К.В., Самуилов В.Д., Семенов А.Ю. Фотоэлектрические ответы кислород-выделящих комплексов фотосистемы II // Биохимия. — 1999. Т.64, - С.606-611.

101. Mamedov M.D., Beshta О.Е., ShutilovaN.I., Semenov A.Yu., Samuilov V.D. Photoelectric response generated under non-heme iron reduction on the photosystem II acceptor side // Biochemistry (Moscow). 2000. - V.65, - P. 728-731.

102. Rappaport F., Guergova-Kuras M., Nixon P.J., Diner BA., Lavergne J. Kinetics and pathways of charge recombination in photosystem II // Biochemistry. -2002. V.41, - P. 8518-8527.

103. Johnson G.N., Rutherford A.W., Krieger A. A change in the midpoint potential of the quinoneQA in photosystem II associated with photoactivation of oxygen evolution // Biochim. Biophys. Acta. 1995. - V. 1229, - P. 202-207.

104. Garbes A., Reifarth F., Kurreck J., Renger G., Parak F. Correlation between protein flexibility and electron transfer from QA- to QB in PSII membrane fragments from spinach // Biochemistry. 1998. V. 37, - P. 11399-11404.

105. Vassiliev I.R., Jung Y.S., Mamedov M.D., Semenov A.Yu., Golbeck J.H. Near-IR absorbance changes and electrogenic reactions in the microsecond-to-second time domain in Photosystem I // Biophys J. 1997. V. 72, - P. 301-315.

106. Blubaugh D.J., Cheniae G.M., Kinetics of photoinhibition in hydroxylamineextracted photosystem II membranes: relevance to photoactivation and sites of electron donation // Biochemistry — 1990. — V. 29, — P. 5109-5118.

107. Hoganson C.W, Ghanotakis D.F., Babcock G.T., Yocum C.F., Mn2+ reduces Yz+ in manganese-depleted Photosystem II preparations // Photosynth. Res. 1989. -V. 22,-P. 285-293.

108. Magnuson A.,. Andreasson L.-E, Different manganese binding sites in photosystem II probed by selective chemical modification of histidyl and carboxylic acid residues // Biochemistry 1997. — V. 36, — P. 3254-3261.

109. Ono T., Mino H., Unique binding site for Mn2+ ion responsible for reducing an oxidized YZ tyrosine in manganese-depleted photosystem II membranes // Biochemistry- 1999.-V. 38,-P. 8778-8785.

110. Lovyagina E.R., Davletshina L.N., Kultysheva M.Yu., Timofeev K.N., Ivanov• • 2*4* •

111. I., Semin B.K., Characteristic features of the interaction between Fe cations and the donor site of the manganese-depleted photosystem II // Plant Physiol. (Moscow) 2005. - .V. 52, - P. 7-14.

112. Ghirardi M.L., Lutton T.W., Seibert M., Interactions between diphenylcarbazide, zinc, cobalt, and manganese on the oxidizing side of photosystem II // Biochemistry- 1996. V. 35, - P. 1820-1828.

113. Semin B.K., Seibert M. Iron bound to the high-affinity Mn-binding site of the oxygen-evolving complex shifts the pK of a component controlling electron transport via Yz // Biochemistry 2004. - V. 43. - P. 6772-6782.

114. Semin B.K., Seibert M. A carboxylic residue at the high-affinity, Mn-binding site participates in the binding of iron cations that block the site, Biochim. Biophys. Acta-2006.-V. 1757,-P. 189-197.

115. Semin B.K., Ivanov I.I., Rubin A.B., Parak F., High-specific binding of Fe" at the Mn-binding site in Mn-depleted PSII membranes from spinach, FEBS Lett. -1995.-V. 375,-P. 223-226.

116. Heredia P., De Las Rivas J. Fluorescence induction of photosystem II membranes shows the steps till reduction and protonation of the quinone pool // J. Plant Physiol. -2003. -V. 160,-P. 1499-1506.

117. Blubaugh D.J. and Cheniae G.M. Kinetics of photoinhibition in hydroxylamine-extracted photosystem II membranes: relevance to photoactivation and sites of electron donation // Biochemistry. 1990. - V. 29, - P. 5109-5118.

118. Babcock G.T., Barry B.A., Debus R.J., Hoganson C.W., Atamian M., Mcintosh L., Sithole I., Yocum C.F. // Water oxidation in photosystem II: from radical chemistry to multielectron chemistry. Biochemistry. 1989. - V. 28, - P. 95579565.

119. Magnuson A. and Andreasson L.-E. Different manganese binding sites in photosystem II probed by selective chemical modification of histidyl and carboxylic acid residues // Biochemistry. 1997. - V. 36, - P. 3254-3261.

120. Yerkes C.F. and Babcock G.T. Photosystem II oxidation of charged electron donors. Surface charge effects // Biochim. Biophys. Acta. — 1980. — V. 590, — P. 360-372.

121. Chroni S., Ghanotakis D.F. Accessibility of tyrosine Yz to exogenous reductants and Mn2+ in various Photosystem II preparations // Biochim Biophys Acta — 2001.-V. 1504,-P. 432-437.

122. Gopta O.A., Tyunyatkina. A.A., Kurashov V.N., Semenov A.Yu. and Mamedov M.D. Effect of redox-mediators on the flash-induced membrane potential in Mn-depleted photosystem II core particles // Europian Biophysical. Journal — 2008. -V. 37,-P. 1045-1050.

123. Toth S.Z., Puthur J.T., Nagy V. and Garab G. Experimental evidence for ascorbate-dependent electron transport in leaves with inactive oxygen-evolving complexes // Plant Physiol. 2009. - V. 149,-P. 1568-1578.

124. Drachev L.A., Kaminskaya O.P., Konstantinov A.A., Kotova E.A., Mamedov M.D., Samuilov V.D., Semenov A.Yu. and Skulachev V.P // Biochim. Biophys. Acta. 1986. - V. 848, - P. 137-146.

125. Mamedov M.D., Mamedova A.A., Chamorovsky S.K. and Semenov A.Yu // FEBS Letters.,- 2001. -V. 500,-P. 172-176.

126. Semenov A.Yu., Cherepanov D.A. and Mamedov M.D. Electrogenic reactions and dielectric properties of photosystem II // Photosynth. Res. — 2008. V. 98, — P. 121-130.

127. Maroti P., and Wraight C.A. Kinetics of KT ion binding by the P+QA~state of bacterial photosynthetic reaction centers: rate limitation within the protein // Biophys. J. 1997. -V. 73,-P. 367-381.

128. Noring B., Shevela D., Renger G., Messinger J. Effects of methanol on the Si-state transitions in photosynthetic water-splitting // Photosynth. Res. — 2008. V. 98,-P. 251-260.

129. Ho F.M., and Styring S. Access channels and methanol binding site to the CaMn4 cluster in Photosystem II based on solvent accessibility simulations, with implications for substrate water access // Biochim. Biophys. Acta. — 2008. — V. 1777,-P. 140-153.

130. Medek P., Benes P., and Sochor J. Computation of tunnels in protein molecules based on Delaunay triangulation // Journal ofWSCG. 2007. - V. 1, - P. 107114.

131. Mamedov M. D., Lovyagina E.P., Verkhovsky M.I., Semenov A.Y., Cherepanov D.A. and Shinkarev V.P. Generation of the electric potential difference by photosystem II from thermophilic cyanobacteria // Biochemistry (Moscow), — 1994.-V. 59,-P. 685-689.