Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кинетика миграции энергии, разделения зарядов и флуоресценции в фотосистеме 2 высших растений

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Кинетика миграции энергии, разделения зарядов и флуоресценции в фотосистеме 2 высших растений"

г ^ 0 к

МОСКОВСКИМ ордена ЛЕНИНА, 'и Г ордена ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ

и ордена ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

ФИЗИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 577.33.541

ЕЛИСЕЕВА Елена Леонидовна

КИНЕТИКА МИГРАЦИИ ЭНЕРГИИ, РАЗДЕЛЕНИЯ ЗАРЯДОВ И ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ В ФОТОСИСТЕМЕ 2 ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ.

( специальность 03.00.02 - биофизика )

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 1994

Работа выполнена на кафедре биофизики физического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова

Научные руководители: доктор физико-математических наук

Ведущая организация: Институт почвоведения и фотосинтеза РАН.

часов на заседании специализированного совета N3 ОФТТ (К 053.05.77) в Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, г. Москва, Воробьевы горы, МГУ им. М.В.Ломоносова, физический факультет, ауд. С9А .

С диссертацией можно ознакомится в бибилиотеке физического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан CtAi^p 1994 года

Ученый секретарь специализированного

совета N3 ОФТТ к. ф.-м. н. Т.М.Козлова

профессор А. К. Кукушкин кандидат физико-математических наук с.н.с. В.М.Панин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

кандидат физико-математических наук

Б.А.Гуляев Е.М.Мелихова

Защита диссертации состоится Л/ЛЛ' 1994 года

1. Общая характеристика работы.

Актуальность темы. В связи с бурным развитием высокочувствительной пикосекундной и фемтосекундной лазерной техники в последнее время получено значительное количество экспериментальных данных по кинетике первичных стадий процессов фотосинтеза, имеющих характерные времена от пикосекунд до наносекунд и включающих такие процессы, как миграция светоиндуцированного электронного возбуждения по светособиракяцей пигмент-белковой антенне, захват возбуждения ловушкой реакционного центра и преобразование его энергии в энергию разделенных зарядов, пер'вичные процессы переноса электрона по цепи электронного транспорта. Существенный прогресс достигнут и в области ислледований структурной организации компонентов фотосинтетического аппарата, обеспечивающего высокую эффективность этих процессов. Кроме того, появляется все больше экспериментальных данных, свидетельствующих об активном участии динамики водно-белкового окружения в первичных фотосингегических процессах. Роль этой динамики в процессах разделения и переноса зарядов в реакционных центрах и влияние ее характеристик на эффективность первичных процессов фотосинтеза, а также на характеристики наблюдаемых в экперименте величин (в частности, кинетики флуоресценции), в настоящее время еще далеко не ясны. Особенный интерес представляет изучение свойств фотосистемы 2 ( ФС 2 ) высших растений, так как биофизические эксперименты, проводимые на реакционных центрах фотосистемы 2 высших растений в настоящее время, гораздо менее прямые, чем эксперименты на бактериальных реакционных центрах, что обусловлено доступностью более стабильных и активных бактериальных РЦ. В связи с этим нам представляется весьма актуальной и своевременной задача теоретического исследования функционирования фотосистемы 2 на основе вероятностного моделирования происходящих в ней первичных фотосинтетических процессов. Решению этой задачи и посвящена предлагаемая работа.

Цель работы. Целью данной диссертационной работы является теоретическое исследование первичных процессов, происходящих в фотосистеме 2 и включающих в себя миграцию возбуждения по светособирающему комплексу фотосистемы 2, захват возбуждения ловушкой реакционного центра, первичное разделение зарядов между молекулой пигмента Р680 и молекулой феофитина, последующие релаксации водно-белкового окружения радикальной пары разделенных зарядов, перенос электрона с феофитина на первичный хинонный

акцептор, рекомбинацию радикальной пары. Выполнение работы была связано с решением рада конкретных проблем и задач:

- каким образом влияет кластерная организация молекул пигмента в светособирающей антенне фотосистемы 2 на кинетику и эффективность переноса энергии к реакционному центру;

- как отражается состояние реакционного центра на величине времени жизни флуоресценции в подобной антенне;

- каким должен быть корректный способ описания первичных фотосинтетических процессов с участием динамики водно-белкового окружения;

- каким образом может быть учтен при таком описании характер внутренней динамики белка и оценены характерные времена релаксаций;

- какое Ш1йяние оказывают релаксации водно-белкового окружения радикальной пары на первичные процессы разделения и переноса зарядов и кинетику флуоресценции фотосистемы 2;

- чем объясняются непрерывные зависимости времен жизни и амплитуд ( весовых множителей ) компонентов кинетики флуоресценции фотосистемы 2 от состояния реакционных центров, полученные в экспериментах на образцах, где реакционные центры были закрыты в различной степени;

- какую природу имеет зарегистрированное падение эффективной константы разделения зарядов и увеличение эффективной константы рекомбинации с закрытием реакционного центра фотосистемы 2;

- чем объясняется падение выхода радикальной пары с закрытием реакционных центров;

- чем отличаются характеристики первичных процессов в а- и |3-центрах фотосистемы 2;

- каким образом влияет на кинетику флуоресценции фотосистемы 2 исходное состояние системы.

Научная новизна работы. ' Основные результаты работы представляются нам новыми. Предложен подход к описанию миграции энергии по пигментной матрице, состоящей из кластеров молекул пигмента. На основании последних данных по структурной организации фотосистемы 2 предложены две схемы возможной организации кластеров молекул пигментов в светособирающем комплексе фотоситемы 2, рассчитана кинетика флуоресценции для этих схем. Результаты расчетов для уровней флуоресценции Рм и Р0 соотнесены с реальным временем. Предложен способ описания первичных процессов разделения и переноса зарядов в реакционном центре фотосистемы 2 с участием релаксаций водно-белкового окружения радикальной пары. Получена функция

распределения вероятности распада состояния с внутренними релаксациями, учитывающая характер внутренней динамики белка. При помощи предложенных уравнений рассчитаны зависимости времен жизни и амплитуд ( весовых множителей ) компонентов кинетики флуоресценции фотосистемы 2 от состояния реакционных центров, адекватно описывающие экспериментальные данные. Получено свидетельство того, что закрытие реакционных центров сопровождается значительным замедлением скорости релаксационных процессов водно-белкового окружения, в то время как в открытых реакционных центрах такие процессы происходят очень быстро. Сделан вывод о различном протекании релаксаций в а- и р- центрах фотосистемы. 2. Оценены ■ времена релаксационных процессов в- открытых и закрытых а- и р-центрах фотосистемы 2.

Практическое значение. Полученные результаты вносят вклад в понимание механизмов первичных процессов, происходящих в фотосистеме 2, и закономерностей кинетики флуоресценции фотосистемы 2. Разработанные модели имеют практическую ценность для обобщения и интерпретации экспериментальных данных, планирования эксперимента, позволяют связать наблюдаемые в эксперименте величины с внутренними характеристиками исследуемой системы. Использованные численные алгоритмы, реализованные на ЭВМ в виде отлаженных программных модулей, применимы для выполнения новых экспериментальных и теоретических исследований. Предложенный способ описания релаксационных состояний может быть использован для исследования релаксационных процессов на различных участках цепи электронного транспорта в реакционном центре.

Апробация работы. Материалы, вошедшие в диссертацию, докладывались на семинарах кафедры биофизики физического факультета МГУ, на Пущинских чтениях по фотосинтезу и конференции стран СНГ "Структурно-функциональная организация фотосингетических мембран и их моделей" 8-11 июня 1993 года, г. Пущино.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 135 страницах, содержит 20 рисунков, 4 таблицы. Список цитируемой литературы включает 139 наименований.

2. Содержание работы.

Во введении дается общая характеристика работы, обосновывается актуальность исследуемой темы, формулируются основные задачи и цели-исследования, излагается научная новизна результатов.

Первая глава представляет собой обзор литературы по теме диссертационной работы. Излагаются данные по структурной организации светособирающего комплекса, ядерного пигмент-белкового комплекса, комплекса реакционного центра фотосистемы 2, а также данные по кинетике флуоресценции фотосистемы 2 в пико- и наносекундном диапазоне времен. Приводятся характеристики и анализ существующих в настоящее время основных моделей, используемых для интерпретации флуоресцентных данных различными авторами. Отдельно ■ уделено внимание процессам переноса возбуждения по пигментной матрице и проблеме теоретического моделирования этих процессов; кратко описывается физика явления и основы его вероятностного описания. Отмечены достигнутые в этой области результаты. Кроме того, дан обзор работ, связанных с участием водно-белкового окружения в первичных процессах разделения и переноса зарядов в реакционных центрах фотосинтезирующих организмов. Проанализированы способы теоретического описания таких процессов. В §5 первой главы перечислены основные нерешенные вопросы и проблемы, которые исследовались в представленной работе.

Вторая глава содержит описание теоретического исследования процесса миграции энергии по моделям светособирающего комплекса фотосистемы 2 ( ССК 2 ), имеющим кластерную организацию молекул пигментов.

В § 1 главы 2 обоснована возможность и предложен способ рассмотрения кластеров пигментов в качестве узлов решетки. Согласно экспериментальным данным ( Тетенькйн, 1988 ), молекулы пигмента в ССК 2 и соге-комплексе ФС 2 организованы в кластеры; расстояние между пигментами в кластере ~ 12 - 16 А, взаимодействие между ними сильное. -Расстояние между кластерами пигментов ~ 30 - 40 А, при этом реализуется слабое взаимодействие ( ~ 1 /Я6). Выделение "квазисостояний" оправдано в том случае, когда вероятность остаться в данном "квазисостоянии" за один проход по всем пигментам ( Рубин, Шинкарев, 1984 )

к, кг 1 Х...Х-[— (1)

к,+ ш1 кг+шг

близка к единице. Здесь П^ - константа скорости выхода из квазисостояния для состояния к; - константа скорости перехода в состояние, принадлежащее данному квазисостоянию для состояния ¡, Г -число состояний в квазисостоянии ( в нашем случае - число пигментов в кластере ). Для рассматриваемой системы при всех I ГП] ~ 1 /И-!6 , где И.] ~ 30 - 40 А, к; ~ 1/Ы23, где ~ 12 - 16 А, следовательно, вероятность того, что возбуждение останется в кластере за один проход по всем пигментам, будет близка к единице. Таким образом, с хорошей точностью мы можем рассматривать кластеры пигментов в качестве узлов решетки. При моделировании миграции энергии по подобным системам при помощи метода матриц вероятности ( ММВ ) необходимо учесть следующее. В ММВ вероятностное распределение возбуждения по узлам системы после я скачков возбуждения определяется формулой:

Р(Я) = Р(Ч-1)Р. (2)

где р; (о) - вероятность возбуждения 1 - того узла на Ч- том шаге, а элементами матрицы Р служат парные переходные вероятности в расчете на один скачок возбуждения между узлами. В случае рассмотрения миграции энергии между отдельными молекулами пигмента диагональные элементы матрицы вероятности Р равны нулю. Однако при моделировании миграции энергии между кластерами пигментов время жизни возбуждения на узлах для кластеров, содержащих различное количество пигментов, уже не может быть одним и тем же. Пусть время жизни на узле п ( 1п ) больше времени жизни на узле ГП (1т): ^ > 1т. Вероятность того, что возбуждение останется на узле, равно разности вероятностей прихода возбуждения на узел и ухода с него. Тогда соответствующие диагональные элементы матрицы вероятности будут равны:

Ртт=0;Рип=1-*тЛп. О)

Следовательно, с узла ш возбуждение уйдет за один шаг, а с узла п - за шагов. Таким образом, нами обоснована возможность и целесообразность рассмотрения кластеров пигментов в качестве узлов решетки и предложены соответствующие дополнения к методу матриц вероятности.

В § 2 главы 2 рассмотрены две модели ( см. рис. 1, 2 ) возможной

организации кластеров пигментов в фотосинтетической единице

фотосистемы 2, основанные на последних структурных данных г- ШГ

( Тетенькин, 1988, Kuhlbrandt, Wang, 1991) и численно рассчитана кинетика флуоресценции для них. Процессы миграции, захвата и дезактивации возбуждения в этих моделях моделировались при помощи развитого в § 1 метода матриц вероятности. Миграция между кластерами пигментов считалась происходящей по механизму Ферстера. Расчеты производились для случаев полностью открытой и полностью закрытой ловушки и двух значений вероятности высвечивания из каждой молекулы на каждом шаге. Показано, что время жизни флуоресценции при полностью закрытой ловушке превышает время жизни при полностью открытой ловушке в 1.5 - 2.8 раза в зависимости от модели и вероятности высвечивания на каждом шаге ( см. табл. 1 ). Результаты расчетов времен жизни флуоресценции tFo и тРм соотнесены с реальным временем. ТАБЛИЦА 1. Результаты расчетов кинетики флуоресценции для двух моделей

Модель а число прыжков TFU' число прыжков TF0' НС Ч' не Тр /Тр ГМ г0

Модель 1 0.01 7 12 0.84 1.44 1.7

0.005 9 25 0.54 1.50 2.8

Модель 2 0.01 17 25 0.68 1.00 1.5

0.005 27 54 0.54 1.08 2.0

Глава 3 посвящена теоретическому исследованию влияния релаксаций водно-белкового окружения радикальной пары на первичные процессы и кинетику флуоресценции фотосистемы 2.

В § 1 главы 3 предложен подход к описанию первичных фотосинтетических процессов, включающих, помимо процессов разделения и переноса зарядов, релаксации водно-белкового окружения радикальной пары. Обоснована целесообразность применения для адекватного описания таких процессов обойденного кинетического уравнения ( ОКУ), соответствующего модели случайных блуждашш в непрерывном времени и позволяющего учитывать немарковский характер релаксационных процессов. Общий вид ОКУ записывается следующим образом:

Рис. 1. Схема ы 1 возможного расположения кластеров пигментов в ФСЕ ФС 2. Большие круги - кластеры из 12 пигментов, маленькие - кластеры из 4 пигментов. Пунктирными линиями обозначена менее вероятная миграция между тримерами, сплошными линиями - наиболее вероятные

пути миграции.

Рис. 1. Схема м 2 возможного расположения кластеров пигментов в ФСЕ ФС 2. Кругами обозначены кластеры, содержащие 4 молекулы пигмента, стрелками - наиболее верояные пути миграции

ёР(М) / А = - т)Р(1\т) - М(Г - т)Р(1,т)) (4)

1' о

где Р(1Д) - вероятность заполнения узла 1 в момент времени 1, образ Лапласа ядра М(1,1'Д) определяется соотношением:

М(Г,1,р) = РЧ>(Г,1,Р) / (1 - Ч/,(р)), (5)

где Ц/(Г,],р) - образ Лапласа функции распределения вероятности, такой, что есть вероятность того, что частица, находящаяся в

начальный момент в узле 1, за интервал времени (Ч + Л) перейдет в узел I';

ч/,(г) = Хч/(Г,и). (6)

г

Для определения функции \|/(Ч) для состояния с релаксациями мы рассмотрели упрощенную схему такого состояния ( см. рис. 3 ). На ней изображено состояние некоторого комплекса в начальной (Н) и релаксированной ( Р) формах; X - характерная константа скорости релаксационного процесса, В и С - константы скорости распада состояния из нерелаксированной и релаксированной форм соответственно. Для этой схемы мы предложили следующую функцию распределения вероятности:

1|у(1) = [(1/(Б + ЩВ2ехр(-В0 + СХехр(-а)]. (7)

Б

С —=»

Рис.3. Упрощенная схема распада состояния с релаксациями. Здесь первое слагаемое описывает распад через состояние "Н", второе -• через состояние "Р", причем вероятность распада через состояние "Р" считается пропорциональной характерной константе релаксаций X. Введенная таким образом функция распределения распада узла с релаксациями позволяет описывать процессы, происходящие в системе с

внутренними релаксациями, однако константа X в этом случае играет роль некоторого эффективного параметра. Это связано с тем, что в действительности зависимость вероятности распада системы через состояние "Р" от характерной константы релаксаций может быть более сложной, чем прямая пропорциональность. В пределах очень быстрых (А, —> оо) и очень медленных (X —> 0) релаксаций предложенная нами функция ^(Ч) переходит в марковские функции распределения вероятности распада состояния из релаксированной и нерелаксированной форм соответственно.

За основу описания первичных процессов, происходящих в фотосистеме 2 после поглощения пигментной антенной кванта света, была принята схема, представленная на рис. 4.

На ней изображены процессы обратимого захвата возбуждения из антенны ловушкой реакционного центра ( константы скорости ат,Ьт ), обратимого разделения зарядов с образованием первичной радикальной пары ( а5,Ь5), релаксации радикальной пары (к), рекомбинации зарядов из релаксированного состояния (В), флуоресценция и другие потери возбуждения в антенне (О,

А*Р1 ^ АР*1 а'

А'[Р + Г],

API APT; A[P+1J;A[ РГ|

Рис. 4. Схема первичных процессов в фотосистеме 2 после поглощения кванта света. Пояснение в тексте, безызлучательная рекомбинация радикальной пары, а также ее распад вследствие ухода электрона по цепи электронного транспорта реакционного центра (константы скорости di5dr ). Обобщенное

кинетическое уравнение для этой схемы имеет вид: i /¿¿б'

dy1(t)/dt = -(f + am)yI(t) + bmy2(t)

t

dy2 (t) / dt - -(bm + as)y2 (t) + amy, (t) + J M(2 Д t - x)y3 (t)dT ( 8 )

о

t

dy3(t) / dt = asy2 (t) - J {M(2,3, t - T) + M(0,3, t - x)}y3(t)dT.

о

Здесь индексами 1, 2, 3 обозначены состояния A PI, АР I, АЧР+1-] соответственно, индексом 0 - все прочие состояния, в которых может находиться система, у,- вероятность i - того состояния. Образы Лапласа ядер M(2,3,t) и M(0,3,t) связаны с образами Лапласа функций 4/(2,3,t) и v(0,3,t) соотношением (5). Решение (8) с начальными условиями

у,(0) = 1 ; у 2 (0) = Уз (0) = 0 (в начальный момент времени возбуждение находится в антенне) для вероятности состояния "1", пропорционольной в нашей модели интенсивности флуоресценции, будет иметь следующий вид:

N '' • '

y1(t) = XAiexp(pit), (9) .

i=i

где pj - полюс образа Лапласа функции , Aj - вычет этой функции в точке р] (Лаврентьев, Шабат, 1987 ). Показано, что в общем случае кинетика флуоресценции фотосистемы 2, рассчитанная при помощи представленной здесь модели и выбранной функции распределения вероятности распада состояния с релаксациями ( 7 ), имеет вид суммы четырех экспоненциальных слагаемых.

В §2 главы 3 приведены результаты численного расчета кинетики флуоресценции, полученные при помощи развитой в § 1 теоретической модели. Значения констант скоростей процессов, представленных на схеме ( рис. 4 ), были выбраны согласно экспериментальным данным, а также в предположении а, Р - гетерогенности фотосистемы 2. Времена жизни и амплитуды ( весовые множители ) компонентов кинетики флуоресценции ФС 2 находились численно при помощи стандартной подпрограммы ROOTS пакета MATLAB ( версия 3.0 ).

На рис. 5 показаны рассчитанные зависимости времен жизни ( а) и амплитуд ( весовых множителей) (б) компонентов кинетики

флуоресценции ФС 2 от среднего времени жизни флуоресценции (сплошные линии). Кинетика флуоресценции а - центров в рамках модели характеризуется двумя "очень быстрыми" компонентами -постоянным, с характерным временем 1.6 пс и с почти нулевой амплитудой, и возрастающим, со временем жизни 17 - 22 пс и с амплитудой порядка 1-2% ( на графиках не показаны ), а также "быстрым" ( 3 ) и "медленным" ( 1 ) компонентом флуоресценции.

Для кинетики Р - центров также получены два "очень быстрых" компонента флуоресценции, не показанных на графиках ( постоянный со временем жизни 1.4 пс и практически нулевой амплитудой и возрастающий со временем жизни 8.4 - 9.3 пс и амплитудой 6-8% ), а

Рис. 5. Зависимости времен жизни (а) и амплитуд (б) компонентов кинетики флуоресценции ФС 2(1- "медленный", 2 - "средний", 3,4 -"быстрый" компоненты ) от среднего времени жизни флуоресценции. Кривые - теория, символы - эксперимент ( Hodges, Moya, 1986 ).

также "средний" ( 2 ) й "быстрый" ( 4 ) компоненты флуоресценции. При этом время жизни "быстрого" компонента а - центров практически

совпадает с временем жизни "быстрого" компонента Р -центров, различие между ними не может быть обнаружено в пределах ошибки эксперимента. Таким образом, в эксперименте на гетерогенной фотосистеме 2 может регистрироваться один "быстрый" компонент с вкладом, равным сумме

амплитуд "быстрых" компонентов а - и Р - центров. Это и показано на рис. 5(6). ,

Рассчитанные зависимости времен жизни "быстрого", "среднего" и. "медленного" компонентов флуоресценции фотосистемы 2 хорошо согласуются с полученными экспериментально в работе (Hodges, Moya, 1986 ) (см. рис. 5(a)), амплитуды этих компонентов на уровнях FM и F0 также соответствуют экспериментальным. Из сопоставления с экспериментальными данными сделан вывод о том, что закрытие реакционного центра, то есть восстановление, хинонного акцептора, приводит к уменьшению скорости релаксационных процессов водно-белкового окружения радикальной пары и к эффективному уменьшению константы разделения зарядов за счет увеличения вероятности рекомбинации, что в результате дает падение выхода квазистабильного, то есть релаксированного, состояния радикальной пары. Константа скорости разделения зарядов при этом остается неизменной.

В § 3 главы 3 получена функция распределения вероятности распада состояния с релаксациями, учитывающая характер внутренней динамики водно-белкового окружения. Рассмотрена схема, изображенная на рис. 2. Получено следующее уравнение для вероятности заполнения узла с релаксациями:

dP / dt = -D(l - Q)P - CQP, (10)

где Q - вероятность того, что релаксации в системе уже произошли, (1 -Q) - вероятность того, что релаксаций в системе еще не было, Р -вероятность заполнения узла с релаксациями. Для того, чтобы функция распределения распада узла с релаксациями отвечала особенностям внутренней динамики белка, использовано выражение для временной зависимости среднего квадратичного смещения отдельной группы белка (модель брауновского движения в потенциальном ящике) (Шайтан, Рубин, 1992 ):

([Ax(t)]2) - xf (1 - expC-t / тс), (11)

где xl -полная амплитуда движения частицы с энергией, равной кТ, тс -время корреляции конформационных движений. В предположении, что вероятность релаксаций пропорциональна' среднему квадратичному смещению группы белка, уравнение ( 10 ) примет вид:

dP/ dt = -Dexp(-Xt)P- C(1 -exp(-A,t))P. (12)

Из этого уравнения была найдена в явном виде функция распределения вероятности распада состояния с релаксациями

-13ц/ = dP/dt, которая с учетом нормировки записывается следующим образом:

«КО =-¿тс «О - С)ехр[5-^ехр(-М) - (С + Х)1] +

П-С

+ Сехр[-ехр(-Ал) - а]}. (13)

А,

Для удобства проведения анализа и численных расчетов эта функция была заменена приближенной:

Vapprox(t) = Dexp(-(D + k)t) + ~exp(-Xt))exp(-Ct). (14 )

qc+X)j

D + l

Показано, что функция \j/apprax достаточно хорошо аппроксимирует полученную нами функцию у ( 13 ) и может быть использована для описания релаксационных процессов с учетом внутренней динамики водно-белкового окружения радикальной пары.

Решение ОКУ с функцией распределения вероятности .\|/approi для вероятности состояния "1", пропорциональной в нашей модели интенсивности флуоресценции, имеет вид пяти экспоненциальных слагаемых. Таким образом, учет характера внутренней динамики водно-белкового окружения РП при введении функции распределения распада состояния с релаксациями приводит в общем случае к получению более сложной модельной кинетики флуоресценции ФС 2.

В § 4 главы 3 приводятся полученные при помощи развитого в § 3 теоретического подхода результаты численного расчета кинетики флуоресценции ФС 2. Расчеты производились в предположении а, 3 -гетерогенности фотосистемы 2.

Значения констант скоростей процессов, представленных на рис. 4, для а - центров фотосистемы 2 имели следующие значения: ага = 5; as = 300; f = 3.3; d, = 0.5; dr = 0.7 ( все значения констант даны в обратных наносекундах). Ловушка фотосистемы 2 считалась мелкой ( Jennings et al, 1993 ); вероятность разделения зарядов полагалась равной вероятности рекомбинации нерелаксированной радикальной пары;

релаксированное состояние радикальной пары А'[Р+1~]р рассматривалось как гораздо более устойчивое к рекомбинации зарядов, чем

нерелаксированное состояние А1[Р+Г]Н ( Schlodder, Brettel, 1988 ). Исходя из этих соображений, для констант В, bm и bs были выбраны следующие значения: bm = 20 am; bs = as; В = 2 не"1. Закрытие реакционного центра моделировалось изменением значения характерной константы релаксаций "к от 500 не1 ( открытый центр ) до 0 hc-!( закрытый центр ).

Результаты расчетов модельной кинетики флуоресценции для а -центров ФС 2 представлены в таблице 2 и на рис. 6 (а, б), где представлены зависимости времен ~ жизни (а) и амплитуд (б) компонентов флуоресценции, дающих наиболее заметный вклад в кинетику, от характерной константы релаксаций X.

В соответствии с особенностями строения и функционирования фотосистемы 2 ß ( Melis et al., 1988 ). при моделировании кинетики флуоресценции фотосистемы 2 ß часть параметров была изменена следующим образом: ат = 10; dr = 0.7; В = 0 (все значения констант даны в обратных наносекундах ). Закрытие реакционных центров ФС 2 ß моделировалось изменением характерной константы релаксаций к от 66 нс"1 ( открытые центры ) до 6 нс~1. ( закрытые центры ).

Результаты моделирования кинетики флуоресценции фотосистемы 2 ß представлены в таблице 3 и на рис. 7 ( а, б ), где показаны зависимости времен жизни ( а ) и амплитуд ( б ) компонентов флуоресценции ФС 2 ß, дающих наиболее заметный вклад в кинетику, от характерной константы релаксаций X.

ТАБЛИЦА 2. Времена жизни и амплитуды компонентов модельной кинетики флуоресценции ФС 2 а. Уровни Fq и F\f соответствуют средним временам жизни флуоресценции 1.1 не и 3 не соответственно.

-с, А! т2 А2 А3 Т4 A4 Ь AJ

F0 1пс 0.1% 2пс 0% 4пс 0.6% 229пс 79% 1.6нс 20.3%

FM 1.5пс 0.7% 17пс 9% 77пс 0% 340пс 0% 3.06нс 90.3%

ТАБЛИЦА 3. Времена жизни и амплитуды компонентов модельной кинетики флуоресценции ФС 2 р. Уровни Яд и соответствуют средним временам жизни флуоресценции 0.4 не и 1.7 не соответственно.

Tj А! Ь Л2 Ь Аз т4 А, Х5 А5

F0 1.3пс 0.2% 7.6пс 4.8% 14 пс 0% 285пс 0% 426 пс 95%

FM 1.4пс 0.3% 10 пс 8.2% 105пс 0% 285пс 0% 1.7нс 91.5%

На рис. 7(6) видно, что амплитуда компонента модельной кинетики флуоресценции со временем жизни т5 практически не зависит от состояния реакционного центра. Компонент флуоресценции фотосистемы 2 с аналогичным поведением времени жизни и амплитуды при постепенном закрытии реакционных центров был зарегистрирован экспериментально в работе (Keuper, Sauer, 1989 ), где, в частности по этой причине, он был отнесен к флуоресценции фотосистемы 2 ß.

Для того, чтобы сравнить рассчитанную нами модельную кинетику флуоресценции фотосистемы 2 с экспериментально наблюдаемой ситуацией, на рис. 8 ( а, б ) мы показали изменение времен жизни и амплитуд компонентов кинетики флуоресценции как ФС 2 а, так и ФС 2 ß в зависимости от суммарного относительного квантового выхода, предположив при этом, что отношение количества ФС 2 а к количеству ФС 2 ß равно 2:1 ( Melis et al., 1988 ). Для удобства сравнения на этих рисунках символами обозначены экспериментальные данные, полученные в работе (Keuper, Sauer, 1989 ), где промежуточные состояния реакционного центра достигались путем различной экспозиции образцов фотохимически активному свету, без добавления каких-либо редокс-агентов или ингибиторов. Значения относительного квантового выхода даны в относительных единицах, используемых в работе (Keuper, Sauer, 1989 ). Как видно из рис. 8, значения времен жизни и амплитуд компонентов кинетики флуоресценции при различной степени закрытия реакционых центров, рассчитанные при помощи нашей модели, хорошо согласуются с экспериментальными данными. Большая по сравнению с экспериментально наблюдаемой амплитуда "медленного" компонента модельной кинетики флуоресценции (компонент т5 а-цетроп ) может объяснятся не учтенными в нашей модели механизмами тушения флуоресценции. В частности, в качестве тушителя флуоресценции молекул хлорофилла антенны может выступать триплетное состояние Р680 ( Севдималиев, 1990 ).

Рис. 6 Зависимости времен жизни т (а) и амплитуд А (б) компонентов кинетики флуоресценции ФС 2 а от константы скорости релаксаций X.

Пояснение в тексте.

2.0 п

т,нс 1.0 :

0.0

I I I I I II I I | II I I I I II I | II II I I I I I | II И II I

0 20 40 Л, НС1 60

ЮОп

А,%

50-

А,

О | I 1 I I м I I I | I I I I I I I I I | I I I I I I I ,1 I | I I ] I I I I

О 20 40 1, НС"1 60

Рис. 7. Зависимости времен жизни т (а) и амплитуд А (б) компонентов кинетики флуоресценции ФС 2 Р от константы скорости релаксаций Я.

Пояснение в тексте.

ю •о

(D

к U X S

X

о

t» s

►Э р

о в а:

S

1 2 3 4 5 отн.квантовый выход

1 2 3 4 5 отн.квантовый выход

Рис. 8. Зависимости времен жизни (а) и амплитуд ( б) компонентов кинетики флуоресценции фотосистемы 2(1- "быстрый", 2 - "средний", 3 -"медленный" компоненты ) от относительного квантового выхода. Кривые - теория, символы - эксперимент^ Keuper, Sauer, 1989).

На рис. 9 представлены рассчетные кривые затухания флуоресценции фотосистемы 2 для значений константы релаксаций X от 450 не-1 ( нижняя кривая ) до 0 не1 ( верхняя кривая ) с интервалом 50 не-1.

§ 5 главы 3 посвящен исследованию поведения рассматриваемой системы в зависимости от ее исходных состояний. Произведено численное моделирование кинетики флуоресценции в системе, где первоначально создается ненулевая вероятность состояния А [ Р+ I" ]. Для расчетов, как и ранее, была использована схема первичных процессов в ФС 2, представленная на рис. 4.

Пусть а - вероятность того, что в момент времени t=0 система находится в состоянии A*PI, ( 1 - а ) - вероятность того, что в этот

момент времени система находится в состоянии А [ Р+ I" ]. Образ Лапласа

Рис. 9. Расчетная кинетика флуоресценции для значений А. от 450 не1 ( нижняя кривая ) до 0 не-' ( верхняя кривая ) с интервалом 50 не1.

вероятности состояния "1" (А * Р I), пропорциональной в нашей модели интенсивности флуоресценции, в этом случае будет иметь вид:

Ш = {а[(р + bm + as)(p 4- М(2Д р) + М(0Д р) - asM(2 Д р)] + + (1 - a)bmM(2,3, р)} /

/ [(р + f + am ){(р + bm + as)(p + М(2,3, р) + М(0,3, р» -

- asM(2,3,p)} - am,bm(p + М(2,3,р) + М(0,3,р))], (3.22)

Tie образы Лапласа ядер M(0,3,t) и M(2,3,t) определяются по формуле ; 5 ) через образы Лапласа функций vj/approx(0,3,t) и V|/approx(2,3,t).

Величшш времен жизни компонентов кинетики флуоресценции, эассчитанной при помощи представленной модели, в данном случае шределяются так же, как и в случае начальных условий, рассмотренных в

§ 4 ( у 1(0) = 1; у2(0) = у3(0) =0 ). Поведение же аплитуд компонентов кинетики зависит от величины параметра а. Были получены численно зависимости наиболее заметных амплитуд компонентов кинетики флуоресценции ФС 2 а от характерной константы релаксаций X при следующих значениях вероятности нахождения системы в состоянии А * Р I в начальный момент времени: а = 0 (а), а = 0,3 (б), а = 0,5 (в), а = 0,8 (г). Из графиков видно, что поведение амплитуды долгоживущего компонента (А5) практически не зависит от значения а, амплитуда "быстрого" компонента (А4) довольно сильно падает с уменьшением а, а значение амплитуды "очень быстрого" ( А2 ) компонента флуоресценции при уменьшении а становится отрицательным. Аналогичным образом было исследовано поведение амплитуд компонентов флуоресценции ФС 2 р. Показано, что амплитуда "очень быстрого" компонента (А2 ) с уменьшением а уходит в отрицательную область значений, в то время как амплитуда "среднего" компонента ( А5 ) падает с уменьшением значения параметра а. Кроме того, получены кривые затухания флуоресценции ФС 2 при различных значениях параметра а и константы релаксаций X. При X = 0 шг1 наблюдается заметный сдвиг максимумов кривых кинетики флуоресценции вправо по мере уменьшения значения параметра а, при X = 200 не-1 и X = 500 не1 максимумы кривых с уменьшением а сдвигаются вниз. Полученные данные могут быть использованы при проведении экспериментов на 'фотосистеме 2 с предварительно созданной первоначальной концентрацией состояния А [ Р+ I" ] для обнаружения релаксационных процессов в ФС 2 и оценки

ч

характерных времен релаксации.

В § 6 главы 3 производится обсуждение полученных результатов и предлагается возможный механизм "постепенного" закрытия реакционных центров фотосистемы 2. Наши расчеты показали, что в открытых а -центрах фотосистемы 2 релаксации водно-белкового окружения РП могут происходить за времена около 2 пс. Релаксации в открытых Р -центрах фотосистемы 2 в нашей модели происходят на порядок медленнее - за время около 17 пс. Это говорит о том, что ФС 2 а и ФС 2 Р фунционируют различным образом, что может объясняться различной молекулярной структурой реакционных центров и/или различным локальным окружением этих центров. Неспособность Р - центров восстанавливать Р<3 - пул ( МеЦэ, 1985 ) может быть, в частности, связана с тем, что из-за замедления релаксаций в Р - центрах ослаблен механизм предотвращения обратного переноса электрона (рекомбинации зарядов ). Закрытые центры ФС 2 а характеризуются практически полным прекращением релаксационных процессов, в то время как для р - центров

ровень FM достигается при скорости релаксаций А. около 6 не1. Характерные времена релаксациошшх процессов, полученные нами в ходе [оделирования, могут отвечать движениям легких групп белка ( типа СН2 ) ли связанных молекул воды (Goldanskii, Krupyanski, 1989 ). В защиту этой очки зрения говорят исследования влияния замещения Н2О на 2Н2<Э и 12180 на динамику фотохимического разделения зарядов в бактериальных еакционных центрах ( Годик с соавт., 1986 ). Постепенное закрытие еакционных центров, обнаруженное в работах ( Hodges, Moya 1986, Leuper, Sauer 1989 ) по непрерывным изменениям времен жизни и мплитуд компонентов флуоресценции ФС 2Г происходит в нашей модели уменьшением скорости релаксаций - различным образом для ФС 2 а и эС 2 ß. Замедление релаксаций приводит также к экспериментально егистрируемому эффективному уменьшению константы разделения арядов за счет увеличения вероятности нерелаксированного состошшя адикальной пары, и, как следствие, вероятности рекомбинации зарядов константы рекобинации ). Сделанный нами вывод о том, что в ФС 2 ß елаксационные процессы происходят медленнее, чем в ФС 2 а, хорошо огласуется с данными (Roelofs et al., 1992 ), где оценивались ффективные константы первичных процессов в ФС 2 а и ФС 2 ß.

Нами предложен следующий механизм процессов, происходящих на ачальных этапах в фотосистеме 2 под действием света, вовлекающий в ервичные процессы ФС 2 изменения трансмембранного потенциала и корости релаксационных процессов окружения РП. При слабой нтенсивности возбуждающего света большое количество реакционных ентров остается открытыми, величина трансмембранного поля мала, и ыстрые релаксации водно-белкового окружения радикальной пары ред отвращают в значительной степени рекомбинацию зарядов адикальной пары, что приводит к низкому уровню выхода екомбинационной флуоресценции и повышению эффективности ереноса электрона на первичный хинонный акцептор. По мере величения интенсивности возбуждающего света количество закрытых ентров растет, величина трансмембранного поля увеличивается и шедляет релаксационные процессы в системе. Это приводит к ффективному падению константы разделения зарядов и увеличению онстанты их рекомбинации, падает выход квазистабильного, то есть елаксированного, состояния радикальной пары, снижается эффективность ередачи электрона на первичный хинонный акцептор, растет выход луоресценции. Различие в протекании релаксаций в а - и ß - центрах >С 2 может объясняться тем, что а - и ß - центры находятся в различных тастках тилакоидной мембраны - в гранальной и стромальной областях

соответственно ( AndeISon, МеИя, 1983 ), где изменение трансмембранноп потенциала может происходить по-разному.' Причиной таких различи! может являться тот факт, что в стромальной области акцепторных компонент реакционного центра ФС 2 непосредственно контактирует < водной фазой, в то время как в гранальной области акцепторные комлексь контактирующих мембран слипаются и взаимно экранируют друг друга.

В заключении излагаются основные результаты и выводы полученные в диссертации.

Основные результаты и выводы.

1. Произведено математичесое моделирование миграции энергии пс пигментной матрице, состоящей из кластеров пигментов и учитывающей последние структурные данные по организации фотосинтетическо£ единицы фотосистемы 2. Обоснована возможность расмотрения кластерог пигментов в . качестве узлов решетки и необходимость при таком рассмотрении введения ненулевых диагональных элементов матрицы вероятности для узлов, представляющих кластеры различных размеров, Предложен способ введения таких диагональных элементов. Рассчитана кинетика флуоресценции для двух моделей возможной организации кластеров пигментов в фотосингетической единице фотосистемы 2. Расчеты произведены для случаев полностью открытой и полностью закрытой ловушки и двух вероятностей высвечивания из каждой молекулы на каждом шаге. Результаты расчетов времен жизни флуоресценции Тр0 и Трм соотнесены с реальным временем. Показано, что время жизни

- флуоресценции при полностью закрытой ловушке превышает время жизни флуоресценции при полностью открытой ловушке в 1,5 - 2,8 раза в зависимости от модели и вероятности высвечивания.

2. Предложен новый подход к описанию релаксационных процессов водно-белкового окружения в реакционном центре фотосистемы 2. Обоснована целесообразность применения для описания таких процессов обощенного кинетического уравнения. Предложена функция распределения вероятности распада состояния системы с внутренними релаксациями. На! основании схемы первичных процессов, происходящих в фотосистеме 2 после поглощения антенной кванта света и включающих перенос энергии возбуждения с антенны на реакционный центр, первичное разделение зарядов, релаксации водно-белкового окружения радикальной пары и перенос электрона на первичный хинонный акцептор Од, рассчитана кинетика флуоресценции фотосистемы 2. Получены зависимости времен жизни и амплитуд (весовых множителей) компонентов кинетики флуоресценции от величины характерной константы релаксаций X (рассматриваемой в качестве некоего эффективного параметра) и

реднего времени жизни флуоресценции тт. Расчеты произведены в федположении a-, ß- гетерогенности фотосистемы 2. Полученные ависимости времен жизни компонентов флуоресценции от среднего ¡ремени жизни флуоресценции тт, а также их амплитуды на уровнях Fq и 7М находятся в хорошем согласии с экспериментальными данными, юлученными в работе ( Hodges, Moya, 1986 ), где измерялясь кинетика флуоресценции в образцах с различной степенью восстановленности 1ервичного хинонного акцептора QA. Из сравнения с экспериментальными данными сделан вывод о замедлении релаксационных процессов водно->елкового окружения в закрытых реакционных центрах и быстром их гротекании в открытых центрах.

3. Предложена функция распределения вероятности состояния ;истемы с внутренними релаксациями, учитывающая характер внутренней щнамики водно-белкового окружения радикальной пары. Использовано отражение для временной зависимости среднего квадратичного смещения группы белка в модели брауновского движения в потенциальном ящике ; Шайтан, Рубин, 1992 ). При помощи обобщенного кинетического сравнения рассчитаны зависимости времен жизни и амплитуд ( весовых множителей ) компонентов кинетики флуоресценции фотосистемы 2 от скорости релаксационных процессов, среднего времени жизни флуоресценции и относительного квантового выхода. Расчеты производились для а- и ß- центров фотосистемы 2. Полученные эезультаты соотнесены с экспериментальными данными [ Keuper, Sauer, 1989 ). Сделаны следующие выводы: <

а) релаксационные процессы в закрытых а - центрах фотосистемы 2 практически не происходят или происходят очень медленно; в закрытых [5 - центрах релаксации происходят со скоростью X ~ 6 не"1

б) в открытых a-центрах релаксационные процессы происходят за время около 2 ríe, в открытых ß-центрах - на порядок медленнее, за время эколо 17 пс.

в) непрерывные зависимости времен жизни И амплитуд компонентов флуоресценции фотосистемы 2 от состояния реакционных центров вызываются постепенным изменением константы скорости релаксационных процессов; выЬказано предположение, что изменениеs константы скорости релаксаций может происходить благодаря изменениям величины трансмембранного потенциала;

г) уменьшение константы скорости релаксаций с закрытием реакционных центров в ФС 2 ß происходит медленнее, чем в ФС 2 а; различия в протекании релаксационных процессов в а- и ß- центрах ФС 2 могут объясняться тем, что они расположены в различных участках

тилакоидной мембраны, где изменение мембранного потенциала может происходить по-разному.

Предложенная модель первичных процессов в реакционном центр! фотосистемы 2 объясняет также видимое уменьшение константь разделения зарядов и увеличение константы рекомбинации в закрыты) реакционных центрах по сравнению с открытыми, а также уменьшенш выхода первичной радикальной пары с закрытием реакционных центро! фотосистемы 2.

Основное содержание диссертации изложено в публикаци ях:

1. Елисеева Е.Л., Кукушкин А. К. Кинетика флуоресценции для двух моделей организации светособирающего комплекса фотосистемы 2. // Вестник Московского университета, 1991, Сер. 3 - Физика, Астрономия, т.32, ыЗ, с.96-98.

2. Торгашин В.М., Елисеева ЕЛ., Кукушкин А.К. Описание кинетики рекомбинации радикальной пары в бактериальных реакционных центрах с учетом динамики белкового окружения. // Биофизика, 1992, т.37, м2,

с.213-218.

3. Елисеева Е.Л., Панин В.М., Кукушкин А.К. Роль релаксаций в первичных процессах разделения зарядов фотосистемы 2: теоретическая модель. // Биофизика, 1993, т.38, мЗ, с.428-434.

4. Елисеева Е.Л., Панин В.М., Кукушкин А.К. Теоретическое исследование влияния релаксаций водно-белкового окружения радикальной пары на кинетику флуоресценции фотосистемы 2. // Биологические мембраны, 1994, м2 (в печати).

Подписано к печати 2103 Ж Формат 60x90/16, Усл. печ. л. Уч.-изд.л.

Тираж 100 экз. Заказ №

Ордена 'Знак Почета" издательство Московского университета. 103009, Москва, ул. Герцена, 5/7. Типография ордена 'Знак Почета" издательства МГУ. 119899, Москва, Ленинские горы.