Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СВЕТОВЫЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ ФОТОСИСТЕМ ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩИХ ОРГАНИЗМОВ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "СВЕТОВЫЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ ФОТОСИСТЕМ ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩИХ ОРГАНИЗМОВ"



На нравах рукописи

АКАДЕМИЯ НАУК СССР Орден* Ленина Институт Биохимии им. А. Н- Баха .

КАРАПЕТЯН Навасард Ваганович

СВЕТОВЫЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ ФОТОСИСТЕМ ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩИХ ОРГАНИЗМОВ

03. 00. 04 — биохимия

АВТОР ЕФЕР АТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 *

Москва— 1975

'T.

На правах рукописи

академия наук ссср .

. Ордена Ленина Институт Биохимии им. А.Н.Баха

КАРАПЕТЯН ' Каьасард Ваганович

,СВВТОВНБ ПРЕВРАЩЕНИЯ ФОТОСИСТЕМ ФСтосагЕзиргаик ОРШШЗЮВ

03.О0.О4 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

. диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук. .....,

• 523$

Москва - 1973. —:-"т-"1* •

Работа выполнена в Лаборатории фотобтхккий Ордена Ленина Института Бист^.сда ш. А.Н.Баха АН СССР Сдгректор - академик А.И.Опарин)

Научный консультант

член-корреспондент,¿Н СССР» профессор. А.А.КрасновскнЗ

Официальные оппоненты:

член-корреспондент АН СССР, профессор А.А.Шлшс . доктор биологгческшс наук, профессор В.Б.Евстигнеев доктор биологических наук, профессор Л.Б.Рубин

Работа направлена па официальный отз№ б Меяфакультетскую Лабораторию бноорганичеасой хшт Московского Государственного. Университета им. М,В.Ломоносова

Автореферат разослан "5" НОЯБРЯ 1975 г. Зецита диссертации состоится "18 " ЭбКЯбРЛ 1975 г. на заседании Ученого Совета Института Блохамии им. А.Н.Баха АН СССР со адресу: Москва 117071, ЛенакскиД проспект, 33 .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института..

Ученый секретарь кандидат бгалоггческш: наук

(Н.Н. Дьячков)

ВВЕДЕНИЕ

Фотосинтез представляет собой процесс преобразования •энергия света в химическую энергию продуктов фотосинтеза. В сложной цепи окислителыю-восстацовительных реакций происходит перенос электронов от субстратов к конечным акцепторам. Функционирование этой цепи переноса фотосенсибилизировано молекулами хлорофиллов, которые включены в фотосистемы. Выяснение механизма первичных процессов фотосинтеза и участия хлорофиллов в этих процессах связано с изучением световых превращений фотосистем.

Принципиальная способность хлорофилла к обратимым окисли-тельно-врсстановит ельным превращениям в растворе била показана А.А.Красновскш (1948). В последующих работах А.А.Красновского и" В.Б.Езстигнеева и'других ученых в нашей стране и за рубезом били детально, изучена фотохимические свойства хлорофилла и его производных и вчяснеи механизм их окислительно-восстановительных превращений. Осуществление фотохжкческих реакций в средах с различной величиной окислителькотвосстановительного потенциала позволило обнаружить способность'хлорофиллов как к восстановлению, так и к окислению, идентифицировать первично восстановленные и окисленные формы хлорофлллов, показать их способность к переносу электрона в системе джор-акцептор, идущему с запасанием энергия. Использование в- качестве конечных акцепторов электрона соединений, оСладакп;их различной величиной окислительно-ьосстанож вительного потенциала, позволило создать модели световых реакций фотосистем зеленых растений и пурпурных бактерий. Все эти данные послужили основой для исследования световых превращений хлорофиллов в клетках, связанных с их участием в первичных процессах фотосинтеза.

Претерпевают ли молекулы хлорофилла окислят ель но-восстановительные превращения'в светогшх реакциях фотосинтеза? Для решения-этой проблемы необходимы были исследования фотоиндуцирован-ных изменений в спектре поглощения фотосинтезирущах организмов, отражащих оккслителъно-вос становителыше превращения хлорофиллов. Особый интерес представляло обнаружение быстро обратимых

азкенеиай поглощения. Однако тленно вследствие быстрой обратимости изменеигл спектров оказались настолько каш ми по величине, что не могла бить зарегистрированы обычними методами;- Эта трудность била преодолена развитием методов абсорбционной дифференциальной с нектрсфо тометрип. :.

другая трудность, возкнкзщая при ксследозании фотспрезра-цекий хлорофгллов при фотосинтезе, заклпчается в наличии многих форм хгорофодлов в клетке. Существование спектральное фотохиш—" чеогл различашихся форм хлорсф:1лла было.показано в>лаборатории А.А.Ксасновского. Эти представления были развиты в работах лабо-ра?ор~* -Зренча в С13Л к Ф.Ф.Лг<тв;ша я Ю.Е.Еро,х:иа в какой стране. ■ Шогообразке форм хлороф:1ллов в зелених растен1:я:с .послужило основой для предположения о иаличиии у ншс двух пагиептни.* систем, разлезшихся набором форм и связаннцхе разнима фотореакцилмл.

С бунэд-:ональ по 3 точки зрения все формы хторсфнтлоз фотосин- ; тезкру^тлх орга;г.:г;.:ов мс:гло разделить на дне большие групш. Больная часть хлорофилла (98-93^) входят в состав "антенны", которая ответственна за поглощение квантов света я кх передачу к молекулам второго типа, вхлтенннм в состав реакционных центров

то с лете;-:. 3 качестве молекул хлорофкллов реакшо71НУХ центров фун:-сц::он::руз)т П7С0 у фотосистем I, П680 у фотосистем 2, ПС40 ' ' у зеленых и Щ90 СП370, П985) у пурпурных бактерий. эгц молекулы (П) находятся в комплексе с первичными акцепторами (Л) и участвуют в фотохимическом переносе электрона против термодинамического градиента- Исследованию фотонреврацений хлорофиллов реак-дионних центров фотосистем посвящены работа лабораторий Де^зенса в Голлаяд::;:, Кона, Клейтона и Батлера в США, Вит та в Западном Берлине ц лабораторий А.А.Красновского, А.А.Шлыка, А.Б.Рубина и А.Ю.Борисова в непей стране.

Согласно современным представлениям, фотосинтетический перенос электронов от води к КДДФ у зелена растений осуществляется двумя последовательными световод реакдагмл, фотосенсябллизи-розакннми разними пигментными системами. В световых реакциях фотосинтеза пурпурных бантеркй функционирует одна фотосистема. . В ходе первичного фотоакта в реакционных центрах фотосистемы I и фотосистема бактерий происходит окисление молекул хлорофиллов

(П700, Паю, П890) и восстановление первичных акцепторов электрона неизвестной природа. Для фотосистемы Z предполагается такой яе механизм первичного фото акта, однако это гипотетично, так как заключения об изменениях поглощения, обусловленных П660, пока не могут считаться достаточно обоснованными, Функционирование фотосистемы 2 сопровождается изменениями _ выхода флуоресценции хлорофилла этой фотосистемы, на оснований' которых судят об окис-;лительно-восетановптельных превращениях акцептора электрона фотосистемы 2. Фотокндуцировалные изменения выхода флуоресценция наблюдаются и при функционировании фотосистеш пурпурных бакте- ■ рай, но они не были найдены для фотосистеш I.

Изменения выхода флуоресценция фотосистем связаны с функционированием реакционных центров к цепи переноса электрона. Механизм фотопревращений хлорофаллов реакционных центров' и характер их взаимосвязи как с цепью переноса электрона, так и с молеку-'. л&'/л хлорофаллов "антенны" бил выяснен благодаря исследованию фотояндуцяровак!их изменений поглощения я флуоресценции хлоро-фяллов фотосиктезируицих организмов. Блокирование первичного фотоакта вследствие перехода реакционных центров в закрытое состояние приводит к увеличению выхода флуоресценции, так как Световая энергия не монет быть использована в фотохиулческоЗ реакции. У пурпурных бактерий увеличение выхода флуоресценции связывают с накоплением хлорофилла центра в окисленном состояния (П^А) а у фотосистемы 2-е накоплением первичного акцептора электрона в восстановленном состоянии (П*А~).

Хотя для реакционных центров всех типов фотосистем предпо- . латается одинаковый механизм первичного фотоакта, было неясно, почему у фотосистемы пурпурных бактерий и фотосистемы 2 увеличение выхода флуоресценции вызвано различные состояниями цент тров. Реакционный центр фотосистеш I способен переходить в состояние П+А, однако при этом не было найдено увеличения выхода флуоресценции, как у пурпурных бактерий.

Таким-образом, имевшиеся данные не позволяли судить о едином характере энергетического взаимодействия хлорофаллов "антенна" я,реакционных центров различных фотосистем.. Кроме' того, было неясно, ограничивается ли участие, хлорофаллов "антенны" в фото—

еинтезе поглощением к передачей оиергжж света к хлорофилла^ реакционных центров, или же хлорофидли "антенны" могут претерпевать какие-либо фотопревравднкя. Отлеты на эти вопросы позволили бы шяснить причина наблюдаемых различий в свойствах фотосистем я шгля би послужггь - основой для ^вывода о едином принципе функционирования всех известных фотосистем, на котором основала передача энергия от хлорофиллов "антенны" к ре&кциоинш центрам в зависимости от о кислит ель но-во сст аковит е льного состояния центров.

Для решения этой проблему нам представлялось перспективным провести функциональное исследование фотосистем в сравнит ел ыю-эголкционком аспекте: исследовать энергетическое-взаимодействие-хюрофнллов реакционных центров я "антенны" в зависимости от окислительно-восстановительного состояния компонентов центров, изучить влияние фотосинтетической цепи переноса электрона и сопряженных процессов на фотопревреценшг хлорофиллов реакционных центров, вменить воэ:.то-т.чооть фотспрсврш^слкй хлорофиллов "антенны" л ах связь с первичкпш процессами фотосинтеза, а также характер взаимодействия фотосинтетических единиц в пигментной матрице. Достижение этих целей было би нсвозмо:шкм без развития . спектральных методов исследования, позволяющих с высокой чувствительностью регистрировать фотопревращения пигментов в клетке, Б качестве основных методов исследования били выбрани методы абсорбционной я флуоресцентной дифференциальной спектрофотометр , рта; основным подходом служило изучение ¿отопревращеш-гй компонентов реакционных центров п цели переноса электрона в зависимости от окислктелыю-восстановительлого потенциала среды. Все это и составило содержание нааей'работы.

Диссертационная работа состоит из литературного обзора и экспериментальной части. В литературной части рассмотрев цепи перекоса электрона зеленых растений и пурпурных бактерий, функционирование реакционных центров фотосинтезкруэднх организмов, процессы, ответственнее за индукцию флуоресценции зеленых растений и бактерий. Нихе кхтояеко основное содержанке экспериментальной части диссертационной работы.

методы и объекты исследования

Для решения поставленных задач были необходима разработка и конструирование установок для проведения спектральных кссле-доэаний, а такзо развитие методических основ изучения фотопн-дуццро ванных изменений поглощения л флуоресценция фотосайтеза-руглггх организмов. Основная часть работы выполнена с помощью сконструированных нами двух типов установок:

1, дифференциального спектрофотометра для измерения кинетики фотоиндуцированных изменений поглощения и дифференциальных спектров поглощения "свет-теулота";

2. дк$фгр.гнцкалъного флуорометра доя измерения выхода и кинетики переменной флуоресценции хлорофиллов растений.

Первая установка .представляла собой однолучевоЙ дпфферен- ■ цяальннй спектрофотометр с ко.-шексациеЯ фототока током от по-' стороннего. источника (Карапетян к др., 1963). Д-тя исклшеняа регистрация флуоресценции от действующего света бил использован принцип разделения измерительного и действующего лучей во времени с помощь» устройства» .представляющего собой систему из трех коаксиальных цилиндров с вертикальными щелями*'Это позво-. лило проводить измерение дифференциальных спектров в области - 600-1000 им при лжбой длине волны действущего света. Установка позволяет регистрировать Фотопродукты с временем жизни больше 10 мсек с чувствительностью 6 -10 ед. о. п. Другой вариант этой установки позволял измерение дифференциальных спектров в области 400-800 ш при чувствительности 3-10*^ ед. о. п. На этой ге установке определяли фотохимическую активность хчорооластов и их фрагментов по кинетике изменений соглооения красителей -искусственных, доноров или акцепторов электрона фотосистем.

При исследовании дифференциальных спектров поглощения в красной области нами было установлено, что слабый измерительный свет Еозбукдает флуоресценцию объекта, выход которой азме-няется при оавецзняк дейстзувцки светом. Вклад этого сигнала в фотосигнал от пропущенного объектом света имитирует уменьшение поглощения. После того как этот эффект удалось исюгочить; были

прозздеш; исследования, которые привели п выводу о том, что измеренные ранее Д'/.'ТФ ер с шхппл ыше спектра ( Colenon, jíabinovitcb,, 1959) балк следствием проявлена этого эффекта. К фотоиндуциро-ваннкм изменениям выхода флуоресценции способны все тшщ фото-спнтезирущих организмов (Карапетян, Красновскнй, 1965; 1066).

Спектральная зависимость величины сигнала от изменена выхода флусресцегщпи представляет coóo:i относительней днфреренци-альгшЛ спектр возбуждения флуоресценции. Спектральная кри1з;щ отношения переменной флуоресценции ( ^Ф) к постоянной (Ф0) дФ/Ф0= (Л ) как функция длины волны света, возбуядаюдего флу-' оресаекцлю, представляв? собой псткшшй дифференциальна спектр возбуждения флуоресценции. Сложная структура этой спектральной ■ кривой - свидетельство многообразия спектрально раздичащихся форм хлоро^итдов в зеленых растениях и пурпурных и зеленых бактериях и участил этих форм в изменении выхода флуоресценции в ходе перв::ч!ms процессов фотосинтеза.

Лчя кет с редеть окнах: измерений' выхода переменной флуоресценции с высокой чувствительность» нами бил сконструирован двух-лучевой дпф$ер е нцлаль н ый фдуорометр (Карапетян, Климов, 1971). Б установке, созданной на основе тех же. принципов, что и вышеописанные дггфрзрепшальные спектрофотометру, били использована два модулятора, настроенные на различную частоту (100 и 4600 га); ОД7Я из них модулировав действуотгй, а другой - слабни moho хромат .-пески Г; озет, возбуадашнй флуоресценцию. образца. Использование усилителя, селективно настроенного на высокочастот» «¡¿¡i компонент сигнала, позволило исключить участие в измеряемом сигнале артефакт от сигнала, который обусловлен послесвечением объекта, и измерять только изменения ьиксда флуоресценции, возбуждаемой мог го хромат ич е с к им лучом. Регистрами флуоресценции с той же'части образца, на которую падает возбуздащий свет, по- ■ зволнло исключить реабсорбцшэ и тем самым почти на порядок повисать чувствительность установки.

При исследования зеленцх растений юти хлоропдастоз исходную флуоресценцаю (С>0) возбувдали светом 480 или G50 нм и ре- ■ гистрировала интегральную флуоресценцию соответственно в области А >660 ым илз Jt >710 км. В случае использования пурпурных

Рис. I. Схема измерения выходов постоянной (Ф0) и переменной { ¿.Ф) компонент флуоресценции зеленых листьев (А) и изолированных хлоропластов (Б) с помощью двухяучевого дифференциального флуорометра. Обоз™;' : начения; -включение слабого монохроматического света, возбуждающего флуоресценцию (модулирован частотой 4,6 кгц); $42, 1-2, Тч-Х и 1-1 - включение (+) и выключение (-) действующего света 2 (поглощаемого преимущественно фотосистемой 2) иге света I (поглощаемого преимущественно фотосистемой I).

бактерий флуоресценцию возбуждали светом 590 или 7Э0 им, а регистрировали фтуоресцеишта к ее изменения в области Л >840 им. Разделение возбулДаюцего к действующего лучей во времени, позволяло одновременнос использование двух лучей действуетего света, сопадазспх на объект с проткеоподогащх сторон (трехлучевой ре-гхм). Кроме того, это дало возможность точно регистрировать кинетику изменений фту о ре сне нцяя не только под действием света, но и после его внключенпя, что значительно увеличило информативность измерений (р^с. I),

Универсальность о£опх типов дп'£.Т:-е р эцциал ь и их установок позволяет помимо измерения изменений поглощения и <£луоресце;1вдя ' регистрировать также спектры возбуждения флуоресценции и послесвечение фото синтезирует организмов.

Сг.сктри поглеченг-я <|^тосинтезиру;су1Х-организмов и изолиро- ■ zaiurdX. структур регистра со вал:; с помо'дъгэ спектрофотометров

С-£-14, Sr—700, EPS -ЗТ и Hitachi-356. Спектры флуоресценции фотосинтезирующих организмоз измеряли, с помощью спектро-флуорсметров, собранких в оптическом кабинете нашего института и в лаборатории биофизики ¿о та сип те за биологического факультета 1ТУ. Температурную зависимость фстоиидуц-гроваших изменении псглорен:1Я пурпурных бактерий и изолированных хроматофоров измеряла с помощью однолучезого дифференциального спектрофотометра с крлостатом в лаборатории космической биологии биологического факультета !.ТУ. Спектры ЭПР пурпурных бактерий регистрировали с помзлгьа радиоспектрометра ЭПР-2 института химической физики АН СССР.

Объектами исследования служили пурпурные серные и песернае бактерии и ¡изолированные из них хроиатсфоры, a такле зеленке листья кукурузы, хлоропласта, выделенные из проросткоз гороха, и фрагменты хлоропластоь, обогащеише различная фотосистемами. 3 отдельных опцтах использовали зеленые бактерии, этиолированные, зелекевдие л зеленые листья нормальных и мутантних (лико— пиковый и £ -каротиновый) растений кукурузы; секена:мутантов были предоставлены кафедрой генетики будапештского университета.

- ir -

СВЕТОВШ ПРЕЗРЛЩЗШ'Л ФОТОСИСТШ1 ПУРПУРНЫХ БАКТЕРИЙ

Пурпур;ше бактерии представляют собой наиболее удобный объект для исследования первичных.процессов фотосинтеза, так как их фотосистема в пересчете на содержание хлорофилла примерно на , порядок более о Со гаде на реакционными центрам:! и коупонеитагл цепи переноса электрона, чем фотосистемы внсипх растений. Кроме того, фермы бактерпохдорофилла в клетках бактерий спектрально четко разделена, что облегчает ■ - регистрацию кх фотопревраде-ний и вменение роли этик форм в световнк реакциях фотосинтеза. Именно у пурпурных бактерий впервые бшго показало, что в ходе первичного фотоакга происходит фотооиислзнае блктериохторофнлла рсаздгоняого центра. Способность бактерио.хлороф::лла в растворе к обратимому фотоакйслешст била обнаружена а исследована в работах Hasieä лаборатории (Красновский, Войновская, I95X;'Дроздова, Красновский, 1953). ' ' „

I. Влияние функционирования цепи переноса электрона на фотопре-вр'ащения П8Э0.

Представляло интерес выяснить, в какой степени фотопревра-.щенпя-HS90 могут отражать функционирование не только реакцпон-них центров пурлурпих бактерий, но и фотоскнтетической цепи переноса электрона. С этой целью била исследована зависимость величины, а таюка кинетики фэтоиндуцированише изменений поглощения при 890 im клеток пурпурных бактерий и изолированных хрома— тофороз от-действия факторов, блокирующих различные участки цепи переноса электрона.

Применение низких температур позволяет блокировать перенос электрона по нош; и выделить функционирование реакционных центров. Фото превращения П390 яаблкдались и при I°K ( Arnold,сlayton i960). Harrst получено повое доказательство в пользу того, что выцветание полосы при 890 к:.: обусловлено первичным $отоактом. Об этом свэдетельствуег независимость величины изменений погло- -щенкя при 890 шл хро^атофороз Ес-е. chaposhalkovü от теш:ера-туры в области от 20°С до -160°С. Этот факт удалось наблюдать

благодаря тому, что участке цктохромов типа С (вторичных доноров электрона к 11890) было исключено в результате их предварительного окисления феррицианидом перед зжораживанием образца. Б этих условиях фотоикдудароващще изменения поглощения при 890 нм полностью обратимы в темноте, а кинетика изменений после выключения действующего света отражает перекос электронов к П890+ только от акцепторов фотосистем.

Двухфазную кинетику темнового восстановления П890+ связывают с участием в этом процессе первичного (Zj) и вторичного (Zg) акцепторов электрона. По мере понижения температуры происходят-падение величины медленного компонента сигнала, обусловленного переносом электрона от вторичных-акцепторов, д рост быстрого компонента, вызванного переносом электрона от первичного акцептора. При температурах ниже -140°С наблюдается только быстрый спад, т. е. в этом случае *Z2 не участвует в телиовом восстановлении П890+ (рдс. 2). Блокирование восстановления Ъо ведет к накоплению 2 j в восстановленном состоянии, что вызывает увеличение вероятности его рекомбинации с Л890+. Указанием на это кокет служить необходимость больших интенсивностей света для полного окисления П8Э0 при низких температурах по сравнению с интенсивностями света при 20°С, По-видимому, блокирование перекоса электронов с -1 на 2 ? исключает во sivioki гость участия последних в стабилизации разделения заряда в реакционном центра. Таким образом, по температурной зависимости изменений поглощения при 890 нм удалось выявить влияние вторичных акцепторов электрона на фотопреврацения Щ90 (Карапетян, Кононешсо, 1975).

Световые изменеккя поглощения при 20°С, наблюдаемые при освещении пурпурных бактергш или хроматофоров в течение секунд, отраяавт функционирование не только П890, но и фотосинтетической цепи переноса электронов и сопряженных процессов. Об этом свидетельствует елшиыЭ характер зависимости величин цзкенеяий поглощения при 890 ам и светозого сигнала ЗПР хроматофоров от инакти- • Бкрущдх факторов, блокирующих перекос электрона или сопряженные процессы (Карапетян и др., 1966, I97I, 1972). Так, уменьшение величины изменений при 890 НМ хроматофоров Chxomatlum в присутствии 0,0075 тритона Х-100 иояет быть связано с ускорением циклического потока электронов вследствие разобщения фото-

- 13 -

фосфорилпровагтя. Разобщающее действие этой концентрация тритона Х-ЮО било показано ранее (Jlorio, Yanoshita , Ii?G4).. Воз pa-? стапие.величины изменений при 890 им в присутствен 0,05-0,1% ... тритона вызвало накоплением П830+ вследствие блокирования притока электронов к реакционному центру. Спад величины изменений при 890 им под действием высоких концентраций детергента вызван деструкцией фотосистемы . и реакционных центров (рис. 2).

Другим доказательством влияния функционирования цепи переноса электрона па фотопреврздешея П690 слу-эдт слоглая зависимость величин изменений поглощения при S90 нм к светового сигнала ШР, наблюллизалсл в опытах с предварит с л ышм нагреванием бактерий и хроматофоров. Спад »еличяии сигналов при нагревай:!и образцов до 50°С ютг.ет быть обусловлен разобщением фотофосфо-рилирозаикя, а возраста:г.:о сигналов после нагревания до 60°С -подавлением донор; ю;; части бактериальной ^отоспстеми. Уме пьянив величины изменений при 890 ir.i и светового сигнала Э1ЕР после ' нагревания образцов до температур вша 60°С связано с деструкцией пигментной система и реакционных центров, так как при этих обработках сонарусл изменения в спектрах поглощения к ' флуоресценции клеток н хроматофороз. • .

Таким образом, велк'цша и'кинетика фот олндушро ванных кз. мененкй поглощения при 890 нм отракаит не только фотопревращения П8Э0, но к опосредованно - функционирование фотосинтеткческой цепи .переноса ¡электрона п сопряженных процессов. Сопоставление ■ фотопндуцированных изменений поглощения при 890, нм с фотохл,:;:-чаской активностью образцов позволяет предположить, что по степени колебаний величины изменений при 090 нм под действием инактивирущкх Докторов .можно судить об исходной активности образцов к фотохимическим реакциям.

2. Зависимость выхода флуоресценции фотосистемы .пурпурных бактерий от состояния реакционных центров.

При исследовании зависимости выхода флуоресценции пурпурных бактерий от .состояния реакционных центров и цепи переноса электрона ма есходилк из представлений о наличии у бактерий

исходной (фоновой) и переменной компонент флуоресценции. На основании работ ДеВзенса (&иукепз , 1952) предполагалось, что у пурпурных бактерий флуоресцирует лишь форма Б850, а другие формы неспособны к флуоресце1Щия и передают поглощенную энергию со 100% эффективностью к Б890. Нам удалось обнаружить способность формы Б850 к флуоресценции у бактерий Rlio clothe се , у которых полосы Б850 и Б890 не перекрываются в спектре поглощения; в последующем способность Б850 к флуоресценции была обнаружена другими " исследователями и для остальных видов бактерий. Следовательно, форта Б850 передает энергию к Б890 не со 100$ эффективностью, что может иметь регуляторное значение в первичных процессах фотосия- ■ теза на уровне миграции энергии. Кроме того, способность £850 к флуоресценции позволила предположить, что фоновая флуоресценция может быть обусловлена испусканием форм бактериохлорофиллов, более удаленных от П890, тогда как переменная флуоресценция связана с испусканием главным образом формы Б890 (рис. 3).

Фотоиндупированное увеличение выхода флуоресценции пурпурных бактерий связывают с блокированием первичного фотоакта в результате перехода реакционных центров в состояние Й+-А ( Vredenberg, Duysens , I963JClayton , IS66). Обнаруженное нами увеличение выхода флуоресценции хроматофоров п.гиЪгит в результате темнового окисления П870 феррицианядом до того же уровня, которое наблюдалось при освещении хроматофоров дейотвуадим светом в отсутствие феррициаяида, подтверздает вша-указанное представление. Следовательно, макснмал ышй выход индуцированной окислителем флуоресценции хроматофоров равен максимальному выходу флуоресценции, наблвдаемому под действием света.

Так как изменения выхода флуоресценции связаны с фотопревращениями П870, они также могут отражать функционирование цепи переноса электрона. В пользу этого свидетельствует сходное поведение величин изменений поглощения при 870 нм и изменений выхода флуоресценции хроматофоров под действием инактхвируюдах факторов. ' Воздействия, ведущие к разобщению фотофосфорилирования, вызывают уменьшение, а блокирование донорной части фотосистемы - увеличение выхода флуоресценции хроматофоров пурпурных бактерий.

/

50°С, 2 brau.

0,007$ тритона 1

'V

К

-4-

60°С, 2 кии. 0,05^ тритона

г*

, ферриц.-*/ 555

ь552

диткшшт аскорбат

' Рис. 2, Об'цая схема цепи переноса электрона пурпурных серобактерий и течки действия окислительпо-восстакови-телышх агентов к янактивиругадих факторов. Zj я 2 g первичный и вторичный акцепторы электронов, С552 3 • ' ^555 ** ЮТохромы типа С, поглоцалаие при 552 и 555 ем.

В800

И890-

фх

фд

' * * IV

Рис, 3. Схема путей использования поглощенной энергии света фотосистемой пурпурных серобактерий. Обозначения процессов: фх-фото химич е око л реакции, фл-фдуорссценции, м-ииграции энергии "вниз", м^дыгрлции энергии "вверх", м.фс.-миграции энергии к другой фотосистема, т-тсп-. ловоЙ дезактивации. Б800, £050 и БЭ90 - форг.ти бакте-рдохсорофидлов, поглоцазовде при 800, 850 я 830 ад.

Сопоставление величин фотокндуцированных изменений поглощения при 890 км и изменений выхода флуоресценции, измеренных при различных интексивностях действующего света, может указывать на характер взаимодействия фотосинтетических единиц в пигментной матрице. То обстоятельство, что с увеличением интенсивности света выход флуоресценции: увеличивается медленнее, чем изменения . поглощения при 890 нм, свидетельствует о том, что если реакционный центр фотосинтетической единицы закрыт ). поглощенная энергия может мигрировать по пигментной матрице к единице с открытым центром. Увеличение выхода флуоресценции проявляется тог-' да, когда происходит накопление П890+ а достаточной количестве и энергия света не может быть использована в первичном фотоакте. Полученные данные подтверждают представление об организации фотосинтетических единиц бактерий по мультицентральному типу, допускающему их взаимодействие в пигментной матрице.

Таким образом, переход реакционных центров в закрытое состояние П+'Х приводит к увеличению выхода флуоресценции бактериальной фотосистемы. Происходит ли увеличение выхода флуоресценции при переходе центра в закрытое состояние П-2~» как это имеет место у фотосистемы 2? Дяд ответа на'этот вопрос было исследовано поведение фотояндуцироваяных изменений поглощения при 890 нм и выхода флуоресценция хроматофоровн.гиЬгип в условиях эффективного притока электронов к реакционному центру.

В присутствии искусственных доноров электрона у хроматофоров обнаружено различие в кинетике роста на свету и спада в темноте исследуемых показателей. В условиях интенсивного допирования электронов к реакционным центрам наблюдаются переходные явления изменений поглощения при 890 нм, вызванные восстановлением П8?0+ на свету. При выключении действующего света изменения при 890 нм быстро р'елаксируют до исходного уровня поглощения, тогда как тем— новой спад выхода флуоресценции значительно замедлен. Фотоинду-цированное увеличение выхода флуоресценции найлнщается я в условиях, когда изменения поглощения при 890 нм исчезают (не происходит накопления П870+). Следовательно, в восстановительных условиях изменения выхода флуоресценции обусловлены не накоплением П870 в окисленном состоянии. По-видимому, в этих условиях фото-индуцированное увеличение выхода флуоресценции вызвано блокяро-

ванием первичного фотоакта в результате перехода первичного акцептора электрона в восстановленное достояние, г. е. центры накапливаются в состоянии П'2Г. Схематически последовательность процессов в реакционных центрах бактериальной фотосистемы в присутствии доноров электрона монет быть изображена следующим образом:

П.£Г72 -П'Ч'22

Когда изменения поглощения при 890 нм отсутствуют, кинетика медленного спада выхода флуоресценции хроматофоров СЬгош»41от1 после выключения действующего света может отражать кинетику окисления фотовосстаяовленного первичного акцептора электронов Фотоиндуци'рованиые изменения выхода флуоресценции хроматофоров исчезают в присутствии дитионита, способного химически восстановить (Климов, Крахмалева, Шувалов, Карапетян, Красновский, 1975).

1 В условиях исчезновения фотоинду цированных изменений поглощения при 890 ил и изменений выхода флуоресценции максимальный выход "темповой"■-флуоресценции меньше, чем сумма постоянной и переменной компонент флуоресценции в отсутствие дитионита. Эта разница в выходах флуоресценции не вызвана внергизацией бактериальных мембран, так как измерения проводили в присутствии разобщающих концентраций тритона Х-100. По-видимоцу, когда первичный акцептор электронов бактериальной фотосистемы химически восстановлен, в тушение флуоресценции включается какой-то темновой процесс. В условиях накопления центров в состоянии моле-

кулы П870 воспринимают энергию от бактериохлорофилла "антенны", но неспособны использовать ее в первичном фотоакте и могут растратить ее в виде тепловой дезактивации или флуоресценции, а также передать ее обратно бактериохлорофиллу "антенны" (рис. 3). Следовательно, флуоресценция хроматофоров при накоплении реакционных центров в состоянии П*гГ может быть обусловлена испусканием бактериохлорофиллов "антенны" и реакционных центров, тогда как в состоянии П+2 испускают только бактериохлорофиллы "антенны".

В услог-:1Я2,-когда перэпчнне акцепторы электрона части фото-скстем предварительно восстановлены, нами обнаружены фотомндуци- ■ рованше переходное язлен;гя флуоресценции хроматофоров (Карапетяк и др., 1971), характер которых зависит от уровня исходной флуоресценции. Когда дитионит вызывает восстановление первичных акцепторов электрона всех фотосистем баг.терпй л "темповой" выход • флуоресценции достигает максимального уровня, освещение вызизает y:,:e¡ii,zeHi:e выхода флуоресценции, медленно обратимое в темноте.

флуоресценции с максимального уровня обнаружено только у пурпурных серобактерий (Chrocafciua , Set. chapoülmil:ovii ), но не наблюдается у несерных бактерий ( я.гиЪгиг), это умсньшзняе флуоресценции не сопровождается фотопревраадняямЕ П390, однако . в этих услозилх ебнаруг^пвазтея изменения поглощения, которые могут бить приписаны бактерпофео^итину и связаны с фотолровращени-ñtzi кизкоцотенциального акцептора электрона,

3. Связь фотопревранений бактернохлорофяллов "антенны" о первячшг.'« процессам фотосинтеза

У пурпурных бактерий, характерязувдпхея наличием фор:ш Е850, наблвдашея фотоиядуцнровзнные изменения поглощения при 850 нм, которые связаны с обрати;фотопревралениями этой формы. Однако до последнего времени были неясны процессы, вызывающие изме- . кення при 850 им, и связь этих изменений со световыми реакциями фотосинтеза. Лъч выяснения этого вопроса мы исследовали зависимость фо тон нду ц: тро в аи mr х изменений поглощения при 850 им от действия илакттпрушпх факторов, -бдокцруыцдх функционирование бактериальной фотосистемы,

"гмзпенпя при 850 нм очень лабильны к исчезают при малых дозах икактивиру^дих воздействий, вызывающа* разобщение фэтофос-форхтировапил (0,007^ тритона X-I0Ö, иагрсвание до 60°С). Следовательно, изменения при 850 им могут быть обусловлены энергиза-цпей мембран (K^rapetycn , I9S9; Карапетяы и др., 1972). В пользу этого предположения свидетельствует усиление величины изменений - при S50 км хроматсфороз Chrocatiun- в присутствия кофакторов фотофосфорялированил (аскороат + ), а такие чувствительность

этих изменений к действию разобщителей (карбошшхианид-w-хлор-фенклгидразон) и ингибитора циклического переноса электронов {антимацин А). Кроме того, изменеши поглощения при 485 нм, вызванные сдвигом полосы поглощения каротиноидов вследствие энерш-зации мембран (Jackson , Crofts , 1969), обнаруживают такую же зависимость от действия инактивирупдкх факторов, как и изменения при 850 нм, Чувствительность изменений при-850 нм к действию де-натурируюцих агентов указывает на то, что эти изменения могут бить вызваны конфоршциокпьшя изменениями белкового носителя формы Б850, Таким образом, можно считать, что фотоиндуцированные изменения поглощения при 850 нм пурпурных бактерий связаны,с протеканием начальных стадий фотофосфоршгарования и могут служить показателем способности мембран к этим процессам.

В восстановительных условиях, блокирувдлх накопление П890+, у' хроматофоров бактерий Chromatiun нами (Karapotyan , 1968) и независимо Кузановячем и др. (Cusanovich и др., 1968) обнаружен новый тип спектральных изменений - увеличение поглощения при 865 и 905 км. Исследование свойств этих изменений показало, что они существенно отличаются от изменений поглощения при 890 нм ■( KaxapatycÄ , 1969; Карадетян и др., 1973; Карапетян, Крахиалева, 1974). Изменения при 865 и 905 ем наблюдаются при окислительно-восстановительном потенциале ниже 200 мв, насыщаются при меньших интенсивностях света, более чувствительны к действию инактивиру-гадах факторов, чем изменения при 890 нм, исчезают про низких температурах и нечувствительны к действию денатурирувдих агентов.

Сложный характер световых кривых изменений поглощения при 890 и 865 нм в восстановительных условиях свидетельствует о том, что изменения при этих длинах волн обусловлены наложением двух эффектов: фотоокислением П890 (проявляется при высоких интенсивностях света) и сдвигом полос поглощения бактеркохлорофаллов "антенны" (обнаруживается при низких интенсивностях света). Сигналы от этих эффектов противоположно направлены и обуславливают переходные явления изменений поглощения при 865 л 890 нм. Исчезновение изменений при 865 и 905 нм в присутствия разобщающих концентраций тритона X-I0O .служат указанием на их связь с зйерглзацкей бактериальных мембран.

3 условиях, при которых обнаруживались изменения поглощения при С65 JI 905 т.:, появлялись rsno-xe фо то прел раде i гия ннзко-потепилального цнтохрома типа С, фупкщштшрундего в пецкши-ческоЛ цепи переноса электрона. Поэтому были высказали предположения о том, что эти изменения поглощения могут быть обусловлены функционированием н нзко по т еиш:альной фотосистемы, способной £отохжпческп восстановить НАЧ. Однако Последующие иссле-досалил показали, что изменения поглощения при BG5 к 905 им вызвали сдвигами полос бахтерпохлорофиллов "антенны" ,пр-л возникновении транс г/ембра; шо г о гатевдпала как следствие функционирования фотосинтетической цепи переноса электрона. Обнаруже- ' пке спектральных изменений в тештате при добавлении ЛТФ или неорганического пирофзефата позволило предположить, что этот с да яг мояет быть обусловлен'! электрохромным эффектом (Барский, Салгуилов, 1972). Следует отметить, что сдвиги полос поглощения хлорофнллов, чувствительные к действии разобщителей и связанные, no-srjyiMOwy, с образованием тралстембранного потенциала, были найдены также у хлоропластов и различиях типов водорослей ( Акссг , Tiscci-, 1972),

Таким образом, в ходе функционирования фотосинтетической цепи переноса электрона фотопревращеикям подвергается не только хлорофиллц реакционных центров, но и хлорофчшш "антенны". В отличие от окнслителыю-восстанов^тсльных превращений хлорофм— лов реакционных центров, фотопреврадення хлорофиллев "антенны" обусловлены изменениями состояния форм хлорофиллов, которые ведут к сдв:а'а*л полос поглощения вследствие энергкзации мембран и отрат^от способность этих мембран к начальным стадиям фото-фосфорилпроватм. Хлорофпллы "антенны" обнаруживают способность к окислительно-восстановительным превращениям только при изменении состояния этих форм вследствие нарушения структуры фотосинтетического аппарата, -однако эти превращения уке не связаны с первичными процессами фотосинтеза (Крахмалева, Каралетяк, КрасаовскаЗ, 1972).

СВЕТОВЫЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ ФОТОСИСТЕШ I ВЬШОС РАСТЕНИЙ

Фотосистема I зеленых растений обнаруживает большое сход- . ство с фотосистемой пурпурных бактерий по ряду признаков- Однако у фотосистеш I ие были обнаружены .фотоиндуцированные изменения вихода флуоресценции, связанные с переходом реакционных центров стой фотосистемы в закрытое состояние. Поэтому высказывались предположения. о том, что П700 не есть хлорофилл реакционного центра фотосистемы I и что характер взаимодействия хлорсфгллов центра и "антенны" этой фотосистемы отличается от такового у фотосистемы пурпурных бактерий. Б связи с этим мы пытались выяснить способность фотосистем I к переменной флуо- , ресценции и ее связь с фотопревращениями П700.

I. Переменная фдуоресценшш фотосистема I

■ Известно, что переменная флуоресценция зеленых листьев и ; хлоропластов определяется испусканием хлорофиллов фотосистеш 2. ■ Возможные изменения выхода флуоресценции, обусловленные фото- | ' системой I, могут быть очень малы, в связи с чем их трудно обнаружить у зеленых клеток или хлоропластов. Поэтому для обнару- ; жения переменной флуоресценции фотосистеш X № использовали фрагменты хлоропластов, обогащенные фотосистемой I. Основным ' • „подходом в этих исследованиях било измерение кинетики перемен- ■ ной флуоресценция фрагментов хлоропластов, обогащенных разлкч- ; ными фотосистемами, в присутствии искусственных доноров или ак- . цепторов электрона фотосистемы I или фотосистема 2. Проведению подобных измерений в значительной степени способствовало наличие дифференциального флуорометра, позволяющего с большой точностью измерять выход и кинетику переменной флуоресценции фотосистем. Именно на основании подобных измерений нами была открыта способность фотосистемы I к переменной флуоресценции ( Кагаре-tyanM ЛР.,1973)! :

Фрагменты были выделены обработкой хлоропластов дигитонином ■ иди дигитонином и ■ тритоном Х-ЮО и последуицлм дкфференциаль^ ним. центрифугированием. Выделенные фрагменты были охарактеризо-

вашi по спектральном свойством, по соотношению хлорофиллоп а и в, по фо тох; 1 е схо i S активно от;; фотосистемы 2 ('Готово остановлен;! с ДХ'КГ^ в присутствии гидро i; с плачиi i а - искусственного донора электронов этой фотосистемы) и фотосистемы I (фоtookисленге /ХС'АФ-Цо метилвяологеном - искусственном акцептора электронов зтой фотосистемы), а такке по виходам фоновой и переменной флуоресценции. Легкие фрагменты характеризовались высоким содержанием хлорофилла а (соотнопенне а/в = 4,7-4,9), содержали в 6 раз больше П70Э, чем тяжелые фрагменты (соотношение .хлорофилл: П700 = 150:1 у легких фрагментов), били почти на порядок активнее в фотоокаслеяии JK'Mi-Hg, но неспособны к фотовос- * становлению ДК4'3 и обнаруживали очень малую переменную флуоресценцию. На основании совокупности этих данных был сделан вывод о том, что легкие фрагменты обогащены фотосистемой I, а ■ тяколые - фотоспстемо!; 2. ■ '

Исследование влияния различных агентов (рис. 4) на переменную флуоресценцию обоих типов фрагментов позволило обнаружить различия в величине и кинетике увеличения флуоресценции на свету к ее спада в теш юте. Этот фзкт свидетельствовал о том, что наблюдаемые у легких фрагментов Зотоиидуцировашше изменения вихода фчуоресцеищнт не могут бить отнессна только за счет возможной примеси фотосистемы 2. Обнаруженные различия сводятся к следашему:

1. добавление искусственного донора электронов фотосистемы 2

(гидрок си-'iамш!а) усиливало переменную фтуоресдсшцт тяжелых фрагментов и существенно замедляло пх темповой спад, но практически не 'сказывалось на велглине к кинетике переменкой флуоресценции легких фрагментов;

2. добавление аскорбата (искусственного донора электронов обеих

.. фотосистем) усиливало переменную флуоресценцию тяжелих фрагментов и замедляло их темнопой спад, тогда как у легких фрагментов вызывало ускорение темпового спада (флуоресценции; *

3. в присутствии аскорбата и дггуропа наблюдалось увеличение

■ исходного уровня флуоресценция тяжелых фрагментов и замедление темнового спада флуоресценции; у легких фрагментов происходило лизь небольшое увеличение уровня исходной флуоресценции.

а темновой спад флуоресценции был обусловлен лишь быстрой компонентой;

4, искусственные акцепторы электронов фотосистемы X (метилвко-логен, ФМС) почти не влияли на величину и кинетику переменной флуоресценции тякелых фрагментов, но существенно усиливали переменную флуоресценцию легких фрагментов.

Перечисленные выше данные свидетельствуют о том, что легкие фрагменты содержат небольшую пр:шесь фотосистемы 2, изменения выхода флуоресценции которой на свету линь частично обуславливают переменную флуоресценцию легких фрагментов. Беля бы изменения выхода флуоресценции леших фрагментов были вызваны только примесью фотосистемы 2, то тогда кинетика переменной флуоресценции обоих типов фрагментов была бы одинакова; различия наблюдались бы только в величине изменений флуоресценции. Обнаружение кинетических различий позволило сделать вывод о том, что фотосистема I способна к переменной флуоресценции.

< В заключение следует отметить, что фотоиндуцнрованные изменения выхода флуоресценции, характерные для фотосистемы I, были обнаружены у хлоропластов, выделенных из клеток обкладки 'проводящих пучков листьев кукурузы, у которых фотосистема 2 ■ . неактивна (Еиль, Климов, Карапетян, Карпилов, 1975). Этот факт служит-еще одним подтверждением вывода о способности фотосистемы I к переменной флуоресценции.

2. Зависимость выхода, флуоресценции фотосистемы I от состояния реакционных центров этой фотосистемы

Естественно, возникал вопрос о том, связано ли увеличение выхода флуоресценции фотосистема I с переходом реакционных центров этой фотосистемы в закрытое состояние и какой тип закрытых центров (П^А иле П *А~) ответственен за увеличение выхода флуоресценции. Исследование фотоиндуцированных изменений выхода флуоресценция фотосистемы I я изменений поглощения при 702 нм в условиях, благоприятствущих накоплению центров в состоянии ГГ'ЗС ели П-Х~, позволило закличить, что оба типа закрытых центров способны вызывать увеличение выхода флуоресценция.

{Ю С, 2 шн.

0,6 М трнс-буфер

I

1 Г

Г,

I

П680 —

дхфм даурон ферркц,

/

► а^п/— ¡¡¡¡М

/

,ферриц

га

декорбат

^птао —*х —*Фд <шс-н2

аскорбат

■дитиопит-

Рис. 4. Общая с ¡сема фотосинтетической цепи переноса элехтрсна зеленых растений и точки действия различных агентов л инактивяруящих факторов. П630 н П700 - хлорофилла реакционных центров ?ото-сксте:.ш 2 к фотосистема I, У2 и У^ - вторичный и первичный донору электронов фотосистема 2, 0, и X - первичные акцепторы электрона фотосистемы 2 я фотосистемы I, цит. | - цктохром f Ух - пластошюк, Пц - пластоцшмн, Фд - ферредохспн, ГА -гидро!;сЕла-/,7.н, ферряц. - ферршшанзд, МВ - метилтологен» Ф!»5С-феназпк.метасульфат, ДХФШ - 2,6-дахлорфеко л:вдсфонол.

fi условиях: исп^ектигшого притока эчектро^оп к П7004" я интенсивного оттока электронов от акцепторной части увеличение выхода флуоресценции связано с накопченном Л7001' (^арапегля к др.,1973). В пользу этого свядет е л ь с тву ют сле^уксие факты:

1. искуестret;гше доноры и акцепторы электронов фотосистему I оклзшишг одинаковое влияние на величину и кинетику переменной флуоресисншш легких фрзгм&нтов и фотопревращений 11700. Так» аскорбат, метилсиологен и «МЛО мзизаит усиление переменной флуоресценции и (¡ото^плущфолаш-шх: изменений поглощения при 702

им легких фрап-лгитоп; аскорбат и Ф.'.'С резко ускоряют темповой спад флуоресценции и изменений поглощен ;tn при 702 им. Следовательно, агенты, гызыпащие накопление 117004", обуславливают увеличение шхода (флуоресценции фотоснстеш I;

2. величина церемонной флуоресценции легких фрагментов и фото-ttплуцкроеашшх изменении поглощения при 702 им оСнаруглвагсг

одинаковую зависимость от кощентрации ФМС и от интенсивности действующего света.

В свстоноЛ кривой переменной фтуоресцеицта легких фрагментов в присутствии i-Ж наблюдаются два фазы, которые могут йигъ приписаны наличию двух компонент переменной флуоресценции, насыщающихся при различных кктексивностлх света. В г;пнетак« переменной флуоресценции легких фрагментов п присутствии различаются быстрая и медленная компоненты увеличения фчуоресденцм на свету. Световая кривая быстрой компонента совпадает со световой кривой изменений'нра 702 им. что свидетельствует о том, что эта компонента переменной флуоресценции обусловлена накоплением П700+.

Следовательно, в условиях неэффективного притока электронов к реакционному центру фотоиндуппрованное увеличение выхода флуоресценции фотосистемы I езлзапо с переходом центров в состояние 11+*Л. Накопление П700"'" исключает возможность пергпгчного фотоакта, и поглощенная энергия испускается в виде флуоресцеНг* цпи хлорофилла-.'.и "антенны" фотосистем I. Еивод о зависимости выхода флуоресценции фотосистемы I от состояния П700 исключает предположение о том, что П700 не есть хлороф;шл реакционного центра фотосистемы I.

Полученные 'данные позволили предположить характер взаимодействия фотосинтетических единиц фотосистемы I в пигментной матрице. Прямая зависимость между величиной быстрого компонента переменной флуоресценции фотосистемы I к содержанием П700+ ■ позволила сделать вывод об уницентральной организации фотосин-' тетических единиц фотосистеш I. Следовательно, в отличие от фотосистеш пурпурных бактерий, у фотосистеш .1 фотосинтетичес-кае единицы не взаимодействуют на уровне миграции энергии, т. е; если П700 одной из единиц окислен, поглощенная световая энергия не кокет мигрировать к единице с открытым центром и растрачивается в виде флуоресценции. В литературе существуют протиборечи- . вые представления о типе организации фотосинтетических единиц . фотосистеш I. Сопоставление выходов флуоресценции фотосистемы I я концентрация П?00+, по нашему мнению, позволяет сделать более прямой вывод о .характере взаимодействия фотосинтетических единиц фотосистемы I.

В условиях эффективного притока электронов к реакционному центру фотосистемы I и блокирования оттока электронов от акцепторной части фотосистемы обнаруживаются различия в кинетике переменной флуоресценции легких фрагментов и фотоиндуцироваянах изменений поглощения'при 702 им, которые указывают на то, что в этих условиях изменения выхода флуоресценции не могут быть обусловлены ф-отопревращениями П700. Кинетика изменений при 702 нм зависит от степени восстановленности акцепторной части фотосистеш I. В присутствии дитяонпта наблюдаются переходные явления в кинетике изменений при 702 нм: достигнув в начале освещения максимальной величины, изменения -затем медленно уменьшаются на свету до стационарного уровня. После выключения действующего света изменения при 702 нм быстро релаксируют до уровня поглощения перед освещением. Величина изменений поглощения при 702 нм-при повторном включении действующего света существенно зависит от длительности темнового периода после первого освещения.

В этих же условиях световые изменения выхода флуоресценции мало варьируют по величине, но они значительно медленнее релак-. сируют в темноте, чем изменения при 702 нм. Интересно отметить, что кинетика темкового спада флуоресценция в присутствии датио-

#

пита соответствует кинетике темповой регенерации величины фото-кндуц:гровашшх изменений поглощения при 702 им после их подавления при длительном освещении. В присутствии дитконита и ОМЗ. изменеякя при 702 им исчезают, тогда как изменения выхода флу- ' ореспенции сохраняются, а их релаксация после выключения действующего слета еще более замедляется.

Исчезновение фотоиндуцяровошшх изменений поглощения в восстановятельнкк условиях указывают на то, что П700 неспособен к фотоокислепню, так как первичный акцептор X фотосистемы I накоплен в восстановленном состоянии. Переход реакционного центра в состояние П-Х- вызывает блокирование первичного фотоакта, поглощенная энергия не может быть использована в фотохккической решении и растрачивается в виде флуоресценции. Следовательно, увеличение выхода фчуорссценшп фотосистемы I мо.т.ет бить вызвано такие накоплением первичного мщептора электронов X в восстановленном состояния. По-ввдп;/юь:у, в условиях, когда изменения поглощения при 702 им не наблюдаются, кинетика темпового спада флуоресценции отражает окисление фотогосстаповленного первичного акцептора фотосистемы I.

Таким образом, переменная флуоресценция фотосистемы 1-, . как и фотосистемы пурпурных бактярил, мояет бить обусловлена накоплением не только хлорофилла реакционного центра в окисленном состоянии, но л первичного акцептора электрона в восстановленном состоянии. Оба состояния реакционного.центра блокируют первичный фотоакт, вызывая увеличение выхода фтуорес-ценции хлорофяллов "антенны". В условиях накопления реакционных центров в состоянии П*Х~ флуоресцировать могут к'молекулы П700, которые воспринимают энергию от .хлорофиллов "антенны", но не могут использовать ее в фо то хкмиче с кой реакции. Принципиальная способность П700 к флуоресценции нб показана из-за трудностей выделения реакционного центра фотосистемы.!.

СВЫШЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ ФОТОСИСТЕМ 2 ШСШХ РАСТЕНИЙ

■ Функционировали е фотосистемы 2 сопровождается изменениями выхода флуоресценции хлорофилла, которые характеризуются сложным временным ходом. Это явление, известное как индукция флуоресценции, было обнаружено в 1931 году (Kautcky ,Qirsch , 1931), однако объяснить его удалось лишь по ore того, как оно было связано с функционированием фотосинтетической ценя переноса элек- " ' тронов. Было высказано предположение, что выход флуоресценции фотосистемы 2 определяется окислительно-восстановительным сос-' тоянием первичного акцептора Q этой фотосистемы: Q тушит флуо- * ресцеицпв в окисленном состоянии и перестает тупить'в восстановленном состоянии (ГЬлуэспз ,Sweers , 1953). ,

Трудности обнаружения фото превращений П680 не позволяют проводить исследования, которые могли бы свзиетельствовать о механизме первичного фатоакта фотосистемы 2. Отсутствуют данные по сопоставлению изменений выхода фяуоресцетщи и фотопревращений П680, которые могли бы указывать на характер взаимодействия • П680 и хчорофиллов "анте.шш", а такле на тип взаимодействия фотосинтетических единиц фотосистемы 2 в пигментной матрице.

Для выяснения механизма функционирования фотосистемы 2 мы исследовали величину и кинетику переменной флуоресценции зеленых листьев и изолированных хлорогшхтов, обладающих разной активностью к выделению кислорода и реакции Хклла, и их зависимость от окислительно-восстановительного потенциала среда. В качестве образцов с различной фотохимической (фотосинтетической) активностью использовали зеленещие листья, а такяе листья мутантных растений кукурузы и хлоропласта, подвергнутые воздей-. ствию кнактивирувдих факторов, которые блокируют цепь переноса электрона в определенных участках.

I. Связь отдельных стадий переменкой флуоресценции зеленых листьев с функционированием различных фотосистем.

Использование двухлучевой установки, возводящей регистрировать кинетику изменений выхода флуоресценции как вод действием

слота, так и после его выключения, дало нам возг.1о:глость четко продемонстрировать антагонистическое действие света 2 и света I на икход А кинетику неременной флуоресценции зеленых листьев {ГСардпетян и др., 1971; КагароЬуап , 1972).

В отсутствие кислорода выход ((пуоресцетш;!, возбуздаемой слабым мо но хромат ическигд светом, вше, чем в присутствии кислорода, что может бить связано с накоплением первичного акцептора й в восртгшовлешгам состоянии. В этих условиях свет I вызывает уменьшение выхода флуоресценции, тогда как при освещения светом 2 промежуточный спад 71 (рис. 1,А) более шра~ея. Оба эффекта исчезают при блокировании взаимодействия фотосистем через цепь переноса электрона (диурои, температура пиле -3°С) и. усиливаются при уменьшении скорости притока электронов к фотосистеме 2 (термоинактивация, малые интенсивности дспетвугацего света 400-700 им). Сходное поводенио уменьшения вцхода флуоресценции от свста I и промежуточного спада 5-й указквамт на то, что оба явления у высших растений обусловлены окислительним действием фотосистемы I на первичный акцептор Ч фотосистемы 2„ Связи промежуточного слана 0-Й с фотосистемой I ранее предполагалась на основании данннх по действию предварительного освещения на водоросли {ЛшкДауСот^нЦео , 1969).

, Возмоетость регистрации действия фотосистемы X на выход флуоресценция фотоскстемы а позволила нам исследовать последовательность биосинтеза фотосистем в ходе зеленения этиолированных листьев кукуруаы (Климов, Ланг, Карапетян, Красновский, 1972). Параллельное обнаружение э'1фе;стов обратимого увеличения выхода флуоресценции от света 2 и его уменьшения от света I свидетельствует о том, что к моменту появления активной фотосистемы 2, способной выделять кислород, уже имеется фотосистема X, которая взаимодействует с фотосистемой 2 через цепь переноса электронов. Одновременное появление я параллельный рост переменной флуоресценции и способности к выделению кислорода у зеленеющих листьев кукурузы и их исчезновение при подавлении фотосинтеза подтверждают тесную связь переменной флуоресценция с функционированием ценя переноса электдэна растений..

Знание процессов, ответственных за отдельные стадии кинетики переменной флуоресценции зеленых листьев нормальных растений, позволило охарактеризовать фотосистемы мутантных растений, а такяе проследить за биосинтезом фотосистем мутантов (Кагаро-Ъуап а др., 1975). На основании исследования величины и кинетики переменной флуоресценции листьев мутантных растений установлено, ' что низкая скорость фотосинтеза мутантов определяется малой активность» фотосистемы 2. При зеленеют мутантных листьев переменная флуоресценция обнаруживается гораздо позже, чем у нормальных листьев, однако тушащее действие фотосистемы I на флуоресценцию фотосистемы 2 проявляется;сразу же после обнаружения ' у зеленых листьев мутантов переменной флуоресценции и способности выделять кислород.

Интересно отметить сходство кинетики индукции флуоресценции зеленых листьев мутантных растений и зеленеющих листьев нормальных растений на разных стадиях зеленения. По способности к переменной флуоресценции мутанты моино представить как зеле-нещие листья нормальных растений, у которых развитие фотосин-тетяческого аппарата блокировано на определенной стадии зеле- нения, причем у £ -каратиковых листьев это блокирование произошло на более ранней стадии, чем у ликогашовых.

2. Зависимость величины и кинетики переменной флуоресценции фотосистемы 2 от активности хлорошгастов.

Прежде чем исследовать индукцию флуоресценции хлорошгастов, следовало выяснить причину различий в кинетике переменной флу-■ оресценции зеленых клеток и хлоропластов: у последних не обнаруживается промежуточный спад 3-3 . Отсутствие этого спада не связано с блокированием взаимодействия фотосистем через цепь' переноса электрона, так как включение света ! после выключения' света 2 вызывает резкое ускорение спада флуоресценции до исходного уровня (рис. 1,Б).

Исследование переменной флуоресценции хлоропластав в завп- ■ екмости от окгсдЕтельно-восстакозительных условий среды позволило установить, что одной из причин простой кинетики индукции

флуоресценции хлоропластом служит потеря ондогепинх. восстановителей в коде выделения хлоропяастов {Карапетян и др., 1971). В присутствии небольших количеств дитионкта, вызывающего увеличение исходного уровня флуоресценцда» освещение хлоропластов светом, поглощаемым обе™:! фотосистемэ;я1, приводит к появлению промежуточного спада в хкнетпке переменной флу оре спеншти. Этот спад обусловлен туаэдям действием фотосистем I* через цепь переноса электрона на виход фтуоресцеицпп фотосистемы 2, так как слад усиливается при уменьшении интенсивности света 2 я исчезает при, добавлении дкурона. Интересно ответить, что нпруяшае структуры зеленого листа приводит к исчезновению промежуточного спада 3-3 наблюдается лкиь монотонное увеличение выхода ф.туореспс:щ/я до максимального уровня. Введение дитионята в нарушгшпй лист с "помощью ннфллпТрацпи вызывает вое становление начальной части индундли флуоресценции, характерной двд целого листа,-т. с. полелеяло промехуточного спада (Карапетян, Климов, 1973).

■ Сравнительное исследование действия различшхх агентов па величину я кинетику переменно:! флуоресценции и фотохимическую активность фрагментов хлороиластов, обогащенных фотосистемой 2, •подтвердило представление о том, что високкй в ¿¿к од переменкой . флуоресценции .хлоропластоз прямо связан с фотохимической активностью -фотосистемы 2. Обработка хлоропластов увеличиваю:лея концентрациями тритона Х-100 дпэтилозого оТара впла к постепенному уменьшению пи хода переменной флуоресценции я активности к реакции Хилла и росту фоновой флуоресценции (Карапетян и др., 1974; Климов, Карапетян, Краснодскпп, ,1975). Удаление эфира откачиванием или уменьшение действующей концентрации тритона Х-100 разбавлением образца вызывало реактквац;ш переменной флуоресценции и реакция Хклла. Сложная зависимость исходной и переменной флуоресценции хлоропластав от концентрации тритона Х-100 приписывается наложению рлда эффектов: разобценля фэтофос-форилирования, инактивации донорпой и акцепторной части фотосистемы 2. Фотопревращения П700 нечувствительны к действа» достаточно высоких концентраций тритона Х-100.

t

3. Природа фотоиндуцированних изменений выхода флуоресценции хлоропластов в восстановительных условиях.

Дня выяснения свойств фотосистемы 2 в условиях» когда реакционный центр находится в состоянии П-СГ до включения действующего света, мы исследовали изменения выхода флуоресценции хлоропластов в присутствии дитионита, вызывающего темновой рост выхода флуоресценции до максимального уровня. Эти исследования позволили обнаружить новое явление - избирательную фотодеструкцию реакционных центров фотосистемы 2 в условиях блокирования первичного фотоакта дитионктом. ■■

При освещения хлоропластов, характеризущпхся максимальным выходом флуоресценции, обнаружено уменьшение флуоресценции, кинетика и обратимость которого зависят от качества действующего ввета и условий взаимодействия фотосистем через цепь переноса электрона (Карапетян, Климов, 1973). Уменьшение флуоресценции с максимального уровня светом I полностью обратимо в темноте, тогда как уменьшение флуоресценции от света 2 почти необратимо. Спад от света I максимален в условиях наиболее эффективного оттока электронов от ОТ к фотосистеме I (рН 6,5) и исчезает при блокировании взаимодействия фотосистем дауроном. В условиях ослабления оттока электронов от ОТ к фотосистеме I (рН 7,5) включение света I приводят лишь к небольшим переходным явлениям Флуоресценции.

Уменьшение флуоресценции от света 2 максимально при рН 7,5 и ускоряется в присутствии диурона. В условиях эффективного взаимодействия фотосистем через цепь переноса электронов (рН 6,5) освещение светом 2 вызывает переходные явления выхода флуоресценция. Скорость необратимого уменьшения' флуоресценции прямо пропорциональна интенсивности света 2 и, в отличие от переменной флуоресценции хлоропластов в отсутствие дитионита, не достигает насыщения. Уменьшение флуоресценции от света 2 с максимального уровня не,наблюдается при -196°С.

Исследование фотохимической активности фотоингибированных хлоропласюв показало* что потеря переменной флуоресценции сопровождается подавлением реакции Хилла, но не сказывается на

фотопревращениях: Л700. в отличие от хлоропластов, обработанных трис-буфером, активность и переменная флуоресценция фотоинги-бированнцх хлоропластов не восстанавливается при добавлении искусственных доноров электрона фотосистемы 2.

Таким образом, фотоиндуцированное необратимое уменьшение флуоресценции хлоропластов в присутствии дитионита обусловлено инактивацией фотосистемы 2, квантовый выход которой (0,03) почти на два порядка выше, чем квантовый выход фотоинактквации фотосистемы 2 в отсутствие дитионита. Невозмошюсть реактивации фотоингибированвых хлоропластов искусственными донорами электронов фотосистемы 2, а также исчезновение способности фото-ингибированных хлоропластов к индукции флуоресценции при ~196°С свидетельствует о поражении реакционных центров фотосистемы 2.

По-видимому, блокирование дитионитом путей оттока электрод-нов от к фотосистеме I, к донорной части фотосистемы 2, к П680 и к кислороду (рис. 5) может вызвать фотодеструкцию реакционных центров фотосистемы 2, так как П680 неспособен использовать кванты света в фотохимической реакции. Фотоиигибирование сопровождается выцветанием около 1% хлорофилла, которое заканчивается за то же время, что и индуцированное светом 2 уменьшение выхода флуоресценции с максимального уровня. Максимум при 682 нм. в дифференциальном спектре поглощения, обусловленном выцветанием хлорофилла, шкет указывать на деструкцию П680. Возможно, при этом происходит и деструкция хлорофилла "антенны", так как содераште П680 менее 1% от общего содержания хлорофилла. Фотодеструкция хлорофилла в присутствии дитионита может идти через фотодезагрегацию (Воробьева, Красковский, 196?);'указанием на это слуапт начальное увеличение поглощения при 660 нм (приписываемое мономерной форме .хлорофилла), которое затем сменяется уменьшением поглощения вследствие его деструкции.

Используя явление избирательной фотодеструкции реакционных центров фотосистемы 2 в восстановительных условиях, мы попытались выяснить природу молекул хлорофилла, ответственных за индукцию флуоресценция хлоропластов (Карапетян, Панова, 1975). С этой целью мы исследовали спектры флуоресценции при 20°С и

-дитионит■

О -+*• Пх

диурон

Рис. 5. Блокирование оттока электронов от первичного акцептора электронов 0. фотосистемы 2 в присутствии дитаокита, ведущее к фотодеструкции, реакционного центра этой фотосистема. Хл а^ -хлорофилл а "антенны" фотосистеш 2; другие обозначения как на рис. 3 и 4,

. Хл

Рис. б.Об^ая схег.та использования поглощенной световой энергии фотосистемами фэтосиптезирувдих орга-" кт;.-,ов. Хл-]- - хлорофилл "антенны", наиболее близко расположенный к хлорофиллу реакционного центра Ц;

" Хл - хлорофилл "антенны", передающий поглощенную энергию Хл^-. Другие обозначения - как на рис. 3.

-196°С трех типов образцов: нормальных хлоропластов, хпороплас-тов, у которых активность фотосистемы 2 была подавлена яаруше-нисм донорной части этой фотосистемы (обработка 0,6 М трис-бу-фером),и хлоропласта6J У которых -реакционный центр фотосистемы 2 нарушен в результате фотоингибирования.

Спектры флуоресценция инадтивярованных хлоропластов при 20°С были сходны со спектром постоянной компоненты флуоресценции нормальных хлоропластов, т. о. инактивация вызывала подавление только переменной флуоресценции. Б низкотемпературных спектрах ииактивированных хлоропластов наряду с уменьшением интенсивности флуоресценции при 685 и 695 нм обнаруживалось также уменьшение при 730 нм, которое не могло быть приписано только вкладу колебательных полос коротковолновых максимумов. По-видимому, при фотоингибкровании происходит нарушение пигментов фотосистемы I, что однако не сказывается на фотопревращениях П700. Спектры флуоресценции инактишрованных хлоропластов при *-196°С были сходны независимо от того, нарушена ли донорная часть фотосистемы 2 или реакционный центр этой фотосистемы.

Можно предположить, что испускание фоновой флуоресценции '(Ф0 на рис. I) обусловлено не только формами хлорофилла а "антенна" фотосистемы 2, но и "антенны" фотосистемы' I, а также вновь синтезированными или деструктивными хлорофиллами, энергия с которых не достигает реакционных центров фотосистемы 2, Переменную флуоресценцию хлоропластов ори -196°С определяют как минимум две полосы - при 685 и 695 нм; маловероятно, что реакционный центр'мог бы содержать несколько флуорасцируших форм хлорофилла.

Таким образом, сходство дифференциальных спектров флуоресценции .хлоропластов, различающихся состоянием реакционных центров фотосистемы 2, и сложная структура этих спектров свидетельствуют о том, что переменная флуоресценция нормальных хлоронлао-тов в ходе индукции, когда реакционный центр находится в состоянии П-ОГ, обусловлена испусканием хлорофшшов а "антенны* фотосистемы 2. В этих условиях П680 может флуоресцировать, однако его выход, по-видимому, настолько мал, что не может оцределять выход флуоресценции хлоропластов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные нами даннне позволили предложить единую схему Функционирования известных.типов-фотосистем, согласно которой энергетическое взаимодействие хлорофиллов реакционных центров и "антенны" всех фотосистем зависит от окислительно-восстановительного состояния км хлорофилла центра, так и первично 1*0 акцептора. Несмотря на некоторое различия в механизме фукгецнони-роганхя фотосистем характер взаимоде::ств!1я центров и "антенны** в принципе одинаков (рис. 6). Подобному заключению в немалой * степени способствовало обнаружением исследование переменной • флуоресценции фотосистемы I.

Сходная зависимость выхода флуоресценции фотосистемы пурпурных бактерий и фотосистемы I растепи;; от состояния реакци-оннпх центров этих фотосистем служит указанием на то, что фотосистема бактерий есть эволюционной предшественник фотосистемы I В диссертационной работе рассмотрены во смогшие пути оволшлп хлсроф;тллоз, фотосинтетических цепей переноса электронов к фотосистем (лар&вотян, 1973; КохареЪуап г 1971, 1975). Различия в поведении фотосистемы 2 по сравнению с этими фотосистемами могут быть обусловлены особенностями молекулярной'организации фотосистемы 2, эзолкционно более поздней. Трудности в накопле--кии ПС 60 в окисленном состоянии из-за быстрого его восстановлен:^ вторячнимд дс:гора\;;г электронов не позволяет исследовать механизм функционирования этой фотосистемы (Карапетян, 1974).

В механизме взаимодействия 'хлоре фил лов реа:щиошш:с центров и "антенна" имейся . ijto6s.qcHif.aie пока различия. Если у фотосистем 2 и фотосистема пурпурных бактерий переход реакционны* сектроз з закрытое состояние ведет к увеличению выхода фяуо-рзеценции з 2,5-3,5 раза, то у фотоскстекц I в тех же условиях выход флуоресценции увеличивается лишь на 10$. Это различие ■ трудно объяснить високим вцходом фонолой флуоресценции фотосистемы I.

В условиях эффективного притока электронов к реакционным центрам увеличение выхода флуоресценции фотосистем зеленых растений и пурпурных бактерий происходят вследствие накопления первичных акцепторов электрона в восстановленном состоянии (рис. 7). При неэффективном притоке электронов к реакционным центрам увеличение выхода флуоресценции фотосистемы I и фотосистемы пурпурных бактерий обусловлено накоплением хторофиллов центров в окисленном состоянии.

Когда центры находятся в состоянии П^А, энергия с хлорофил-лов "антенны" не монет бить передана хлорофиллам реакционных центров и испускается в виде флуоресценции формами хлорофиллов, наиболее близко расположенными к хлорофиллам реакционных центров. В состоянии Д*А~ поглощенная энергия может быть передана хлорофиллам центров, однако она не может быть использована в первичном фотоакте и испускается в виде флуоресценции хлорофиллами центров или же хлорофиллами "антенны" после обратной миграции к над с реакционных центров (рис. 7). Так как содержание хлорофиллов реакционных центров мало, то дате если они флуоресцируют с достаточно высоким выходом, равный выходу хлорофиллов "антен-•ны", их вклад в общий выход флуоресценции фотосистем ничтожен. Поэтому флуоресценция фотосистем, когда реакционные центры находятся в состоянии П'А-, также определяется испусканием хлорофил-лов "антенны". В случае мультицентральной организации фотосил-. тетических единиц энергия может мигрировать к единице, реакционный центр которой открыт.

Выяснение природы молекул хлорофиллов, ответственных за увеличение выхода флуоресценции фотосистем в связи с переходом реакционных центров в закрытое состояние, позволило следущкм образом определить постоянную (фоновую) и переменную компоненты флуоресценции. Фоновая флуоресценция (Ф0 на рис, I) есть испускание форм'хлорофиллов, энергия с которых не достигает хлорофил-лов реакционных центров, когда они находятся в открытом состояния (П*А). Переменная флуоресценция связана с переходом центров в закрытое состояние и обусловлена испусканием форм хлорофиллов,

фотосистема бактерий

Бхл'—ШЭО"*^

I

Бхл

:п500-2"*

Фя

фотосистема I . Хл ат—0700"%

I I1

Хл ат^=П700-Х" фи

фотосистема 2 Хл а^—П680^

. м

Хл а«=2:П680'СГ

Г1,

фл

фл

Рис. 7. С •¿е-.* а энергетического в зак/.с деп стекя хлсроф-лллов "антенны4 и реакционных центров фотосистем в зависимости от окислительно-восстановительного состоянии компонентов реакционны х- центров. Вхл, Хл а^ и Хл а^ - Ало-ро$;!ллы "антенны" фотосистем пурпурных бактерий и ' зеленых'растений; дон. и ахи. - искусственные доноры и акцептора электронов, способствущие накоплению реакционных центров в состоянии И** А к П-А~.

энергия с которых не достигает реакционных центров в состоянии ПТ^Л или же она достигает центров в состоянии П -к", но не шг.ет быть использована в фотоакте и мигрирует обратно к хторофхтла-л . "антенны". Хотя постоянная и переиенпая компоненты флуоресценция могут быть обусловлены испусканием одних и тех ке форм хлорсфил-лов, переменная флуоресценция фотосистем вызвана испусканием глашшы образом, длинноволновых форм» тогда как постоянная флуоресценция обогащена испусканием коротковолновых форм пигментов-Фоновая. флуоресценция зеленях растений и хлоропластов мо-ет быть вызвана, испусканием хлорофпллов "антенны" обе;1х фотосистем.

В ходе световых реакций фотосинтеза фотопревраценшзм подвергаются, не только хяорофкллы реакционных центров, но и хлорофиллу ".антенна". Фотопревращения хлорофиллов "антенны" обусловлены сдвигами их полос, поглощения в ответ на энаргизац::ю мембран з результате переноса электронов по фотосттетяческой цепи. Сдвиги полос поглощения форм хлорофкллов "антенны" пурпурных бактерий я зеленых растений могут служить показателем способности фотосиптетвческих мембран к образованию шеокознергети-чесгагх состоянии.

В' заключенно следует подчеркнуть, что детальное знание механизмов функционирования фотосистем ва:гло для регуляции процессов фотосинтеза на всех уровнях организации фотослнтетпческогб аппарата. Уже в наши дни знание механизма функционирования фо--тосистем шлет быть нспольговано для выяснения процессов, ответственных за фотосинтетическое выделение водорода. Кроме того, спектральные параметры фотосистем представляют собой чувств;:-' тельный и удобный индикатор способности зеленых листьев к первичным процессам фотосинтеза и могут быть использованы в прак-, тике сельского хозяйства для быстрой диагностик;: устойчивости растений к различного рода -акстремалышм воздействиям..

ВЫВОДЫ

Для выяснения механизма первичных процессов фотосинтеза' проведено систематическое исследование световых превращений хлоро-филлов у эволшционно различиях групп фотосинтезируздих организмов. В качестве основного подхода использовано измерение фотошщуциро-вакных изменений поглоцения и флуоресценция хюрофнялоз Ьа vi•^ro в зависимости от окислительно«воостановительник условий среды, вдиящих на состояние компонентов цепи переноса электрона.

1. При решении этой проблемы был использован комплекс новых спектральных методов исследования, позволяющих с высокой чувствительностью регистрировать фотопревоащеиия хлорофиллев в фэтосин— тезкрукщ-п: организмах. .Идя измерения кинетики фотоиндуцированию: изменений поглощения и дифференциальных спектров поглощения "свет-темнота" был сконструирован однолучевой дифференциальный спектрофотометр. Применение принципа разделения измерительного и действующего лучей во времени позволило проводить измерения в области спектра до 1000 нм независимо от длины волны действующего света.

С целью регистрации фото индуцированных изменений выхода флуоресценция хлорофи.ллов фз тосинтезирующих организмов был сконструирован двухлучевой дифференциальный флуорометр, в котором использован принцип модуляции возбуждающего и действующего лучей с различной частотой. Раздельное измерение фоновой и переменной компо-кет флуоресценции и кинетики изменении выхода флуоресценции (при освещения действующим светом ц после его выключения) позволили провести детальное исследование переменной флуоресценции фотосин-тезирущнх организмов и выявить новые свойства фотосистем.

Оба типа дифференциальных установок универсальны и дакт возможность регистрировать не только фотоиндуцкрованные изменения поглощения и флуоресценции-фотосинтезирушпх организмов, но и их послесвечение и спектры возбуждения флуоресценции.'

2. Открыта способность фотосистемы X высших растений к переменной флуоресценции, виход которой ка два порядка меньше, чем у фотосистемы 2. Вывод о переменной флуоресценции фотосистема I сделан на основании различий в кинетике изменений выхода флуоресценция фрагментов хлоропластов, обогащенных фотосистемой I или

фотоонетомой 2, в присутствии искусственник доноров и акцепторов электрона к .различием фотосистемам. Переменная флуоресценция, характерная для фотосистемы I, обнаружена у хлоропластов, выделенных из клеток обкладки проводящих пучков листьев кукурузы, у которых фотосистема 2 неактивна.

3. Установлена тесная связь переменной флуоресценции фотосистемы I с функционированием реакционных' центров этой фотосистемы. На это укагшиаот сходная записимость кинетики фотопревращений хлорофилла реакционного центра (П700) и изменений выхода флуоресценции легких фрагментов хлоропластов от действия различных агентов и интенсивности света.

В зависимости от.эффективности притока электронов к реакцлонз ним центрам фотоснетс гш I фотоиндуцированное увеличение выхода флуореоцС!ГШи хлорофитлов этой фотосистемы связано с накоплением П700 в окисленном состоянии или первичного акцептора электронов в восстановленном состоянии. Обнаруяеике переменной флуоресценции фотосистемы I и ее связи с фотопревращенлямн компонентов ре- ■ акп;:онных центров свидетельствует о том, что энергетическое взаимодействие хлорофиллев центров и "актешщ" этой фотосистемы в принципе подобно таковому других фотосистем. ■ .

4. Для. выяснения механизма'функционирования фотосистемы 2 .проведено исследование кинетики индукции флуоресценции зеленых листьев и хлоропластов в зависимостк. от их функциональной активности. Показано, что переходное явления флуоресценция зеленых листьев в начале освещения обусловлены взаимодействием фотоскс-тем через цепь переноса электрона. Обнаружение таких же переходных явлений у изолированных хлоропластов в присутствия дитионита • указывает на то, что простая кинетика переменно;: флуоресценции хлоропластов может быть связана с потерей эндогенная восстановителей в ходе выделения хлоропластов. Знание природы процессов, ответственных за различные стадии индукции.флуоресценции зеленых листьев, позволило выявить последовательность биосинтеза фотосистем у зеленевдях листьев, точки действия ряда инактивируодих факторов на цепь переноса электрона я причины малой, фотоевнте-тичесхой активности мутактных растений кукурузы. Кянётгка пере-

менной флуоресценции зеленых листьев может- быть использована для .быстрой диагностики устойчивости культурных растений к действию экстремальных факторов.

■ 5. Обнаружено новое явление - избирательная фотодеструкция. реакционных центров фотосистемы 2 при освещении хлоропластов интенсивным светом з присутствии дктконита, сопровождающаяся необратимей потзрзй способности хлоропластов к переменкой флуоресценции. Нарушение реакционных центров происходит из-за блокирования первичного фотоакта, вызванного накоплением акцепторной частя этой ф-ото си с теш в восстановленном состоянии. В этих не ■* условиях фуккшынкрозшше фотосистемы I приводит к окислению рер-внчнсго акцептора фотос;ictста 2 через цепь переноса"электрона. На основании исследования спектров флуоресценции фотоингибиро-^ ' ванных хлоропластов установлено, что'изменения выхода флуоресценции в ходе индукционных явлений обусловлены испусканием форм хлорс^пллоз "антенны", наиболее близко расположенных к реакционным центрам фотосистем 2.

6,- Показано влияние функционирования фотосинтетической цепи перекоса электрона к сопряжений* процессов на фотопревращения бактеркохлорофялла реакционного центра (П890) пурпурных бактерий. г.а это указывает сложная зависимость величины изменений поглоще-kzh прп SSO Ilm ст действ:м факторов, блокирующих различные участки цепа переноса электрона или разобщающих фотофосформирование. Изменения поглощения при 890 км в зависимости от действия инак-тивкрувоегх факторов могут служить показателем исходной способ-кости бактерий я хроматофоров к фотохимической активности или энерг?зацл: мембран. По температуркой зависимости кинетика фото-

• рревраззнлЁ П8Э0 выявлено функционирование первичных и вторичных акцепторов электрона бактериальной фотосистемы.

7. Энергетическое взаимодействие хлорофиллов реакционных . центров и "антенна" фотосистем пурпурных бактерий определяется не только накоплением П890 э оголенном состоянии, но и первичного акцептора электрона в восстановленном состоянии. В обоих

: случаях фотокндуцированное увеличение выхода флуоресценции обус-. ловлено испусканием бактериохлорофиллов "антенны" вследствие

блогшропания первичного фотоакта бактериальной фотосистемы. В восстановительных условиях у хрог/ато:^ю;>эв пурпурных серобактерий обнаружены переходные явления флуоресценции, характер которых зависит от состояния компонентов реакционных центров, В отличие от фотосистемы 2,высших растений, у фотосистему пурпурных серобактерий не происходит фо тодес трукип и реакционных центров при освещении хроматофоров в присутствии дитионита.

0. У хромато<|юров пурпурных серобактерий в восстановительных условиях обнаружен новый тип фотоиидушроваинцх изменений поглощен:«!, которые по своим свойствам существенно отличакяся от фотопревращенкй Щ90. Эти изменения, обусловленные сдвигом полос поглощения бактериохлорофиллов "антенны", как и фотоинду-цированное уменьшение поглощения при 650 им, чувствительны к действию агентов, разобщающих фото^юсфорилировалие. Фотопревращения Оактерпохлорофиллоз "антешш" опосредованно связаны с функционированием фотосиптетической цепи переноса электрона; по-видимому, они обусловлены энергизацией мембран и мох-ут служить показателем их способности к этому процессу.

Э. Полученные данные указывают на единство биохимического • механизма, лежащего в основе функционирования фотосистем, й на , различия в специфике его проявления у эболшционно разных групп фотосинтезирующих организмов, У фотосистем высших растений и пурпурных бактерий энергетическое взаимодействие хлорофмллов реакционных центров и "антешш" определяется окислительно-восстановительным состоянием компонентов реакционных центров. Переменная флуоресценция всех типов фотосистем отратлет функционирование цепи переноса электрона и обусловлена испусканием хлорофил-лов *антенны", наиболее близко расположенных к хлорофиллаМ реакционных центров. Знание механизма световых превращений фотосистем важно для выяснения механизма первичных процессов фотосинтеза и их регуляции.

СПИСОК работ, опубликованных по теме диссертация

1. Карапетян Н.В., Литвин Ф.Ф., Красновскпй A.A. 1963. Исследо-

вание световых превращений хлорофилла методом дафференци-; альной спсктрсфотометркп, Биофизика, 8, 191

2. Карапетян Н.В., Литвин Ф.Ф., Краснавский А.'А. 1963. Изменения

лктанесценция при исследовании дифференциальних спектров фотостатезирущнх организмов, Докл. АН СССР, 149, 1428

3. Карапетян H.B. 1964. Дифференциальная спектрофотометра фото-

скятезирунцах организмов, Белл. НОШ, сер. биол., 2, 157 '

4. Карапетян H.B. 1964. Исследование фотохимических превращений

хлорофилла фотсскнтезнрувдах организмов методом дифференциальной спектрофотомётрии, I Всесоюзный Биохимический съезд, Ленинград, тезисы докладов, 2, 212

5. Карапетян H.B. IS64. Изменения флуоресценции, возиикаклже при

импульсном освещении фотосинтезирухдих организмов, XIII ' Совещание по люсликесценцки, Харьков, тезисы докладов, 46

6. Карапетян Н.В., Красновский A.A. 1965. Изменения/'лкикнесценциа

при измерении дифференциальных спектров.зеленых фотосинте-зирущнх бактерий, Биофизика, 10, 242

7. Карапетян Н.В., Красновсккй A.A. 1966. Исследование световых

превращений пигментов в клетках фэтосинтезирукщих бактерий методом дифференциальной спектрофотометра, в сб. "Биохимия азтотрсфлах микроорганизмов", Тр. МОШ, 24, 94

8. Карапетян H.B, 1966. Исследование световых превращений хлоро-

филла и бактериохлорофилла in vivo методом дифференциальной спектрофотометрии, Конференция по молекулярной биологии Пущнно, 169.

9. Карапетян Н.В., Крахмалева И.Н., Красновский A.A. 1966. Дейст-

вие температурной инактивации на дифференциальные спектры поглощения пурпурных фотосинтезируидих бактерий, Докл. АН СССР, 17Г, 1201 10«. Karapatyan. U.V. 1966. Study of transformations o£ chlorophyll pigments by neans of difference spectropbotone try, ibstr» of the 2nd Int. Biophysics Congress,' Viecn, 229

11. Карапетян H.B., КрасповсккЙ A.A. 1968. Исследование спектраль-

ных: свойств и свегових превращений бактерио.хлорофмлла в пурпурных бактериях Khodotheco , Докл. All СССР, 180. 939 .

12. Karapetyan U.V. 1968. Liebt indueod transformations of baçte—

ri о с hlorophy11 in vivo, Abstr. ..of the 1st Int. С ordres s , on Photosynthesis, l/roudenGtc-üt, p.95

13. Карапетян H.B., Крахмалева H.H. 1969. Фотоиндуцированные прев-

ращения бактериохлорофилла в пурпурных бактериях, II Всесо-./.ейгпыЙ Биохимический съезд, Ташкент, тезисы докладов,

■ / (19-6-4) 39

14.'Xarapetyan U.V. 1969. Light induced transformations of becte-riоchlorophyll in vivo, in "Frogi-ess in Ph.oto synthesis

, Beseorcb", lHibingea, 2, 778

15. КарзпетЪн H.B., Кольтовер B.K., Крахмалева И.П., Красневский

A.A. 1971. Действие инактявкрупцях fei торов на сигнал ЭПР и восстанокченне иыинокскльного радикала в хроматоферах ! пурпурных бактерий. Биофизика, 16, .1146

16. Karapatyan U.V. I97I. Evolution of pierr-ent syßtea and priaary

processes of ph0t0i;ynthû3is, in "Chemical Evolution and Örißin of .Lifo", ITortb-Rolland, Anstcrdan, I, '£0?

17. Xar&petyan If.V, 1971. Licht inducod f 1иогозоопса.; chsnses in

'-photosynthetizinG orGanisfs, Abstr. of the 2nd Int. Соп-.* gress on Photosynthesis, Stresa, p. 135

18. Карапетян H.B., Климов B.B. 1971. Установка для измерения

■кинетики индуцированных светом изменений выхода флуоресценции фотоедктезярулцих оргаюггиоз, Фиг пол. растений, 18, 223

19. Карапетян Н.В., Климов В.В., Ланг Ф., Красновский A.A. 1971.

Исследованиеиндукции флуоресценции листьев кукурузы в анаэробных условиях:, ¿дзиол, растений, _10, 507

20. Карапетян И.В., Климов;* S.B., Крашалсва И.П., КрасновскиЙ a.a.

■ 1971. Шсдукция &Jtyopecuefîu«;i хторонластов и хро.татофоров в восстановительных условиях, Докл. АН СССР, 201, 236

21. Катареtyan H.V., Avazov П., Klimov. V.V., Erasnovsky A.A.

1972. Reactivation by plastoquinono the variable fluorescence of chloroplasts, Abstr. of "ÏI Int. Congreээ on Pbo-tobiology, Boclraa,'268

22. Климов B.B., Ланг Ф., .Карапетян Н.В., Красновский A.A. 1972

Индукция флуоресценции в процессе зеленения этиолированных листьез: нормальные и мутантные растения кукурузы,.Физиол. растений, 29, 151 " - ' ■

23. Карапетян Н.В., Крахмалеэа И.Н., Красновский A.A. 1972. Дейст-

вие детергентов на фотоиндуцировагаше изменения поглощения* хрематофоров Chroicatiini ninutissiiraa , Мол. биол, 6, 773

24. Крахмалева К.Н., Карапетян Н.В., Красновский A.A. 1972. Све- -

товыб измененкя огаеллтельно-воостановительного потенциала хрематофоров Ciiroaatiun в присутствии р-бензохинона. Биофизика, 17, 990 • * 25. Карапетян Н';В., Кольтовер В.К., Крахмалева И.Н., Красновский A.A. 1972. Изучение.светового сигнала ЭПР хроматофоров " пурпурных бактерий Chromatins., в сб. "Исследование сво-бедно-радикальных состояний в связи с их ролью в регуляции биологических процессов", Пущино, I, 103 ' .' - ;

26. Karapetysn II.V. 1972. Light induced fluorescence changes in,

photosyntbetiziAS organisns, in "Photosynthesis, two centuxes after lis discovery by S.Vristley", Junk, The Ha^ue,' I, ISO

27. Карапетян Й.В., Климов B.B. 1972. Индукция флуоресценции хло- .

ропластов в восстановительных условиях, 1У Международный. Биофизический конгресс, Носква, тезисы докладов, (E-iy-a-2/3) I, 324

28. Карапетян Н.В., Климов В.В,, Ланг Ф., Красновский A.A. 1972.

Индукция флуоресценции нормально* и мутантных растений кукурузы, Всесоюзный симпозиум "Генетические аспекты,фотосинтеза" -Душанбе, тезисы докладов, 89

29. Карапетян Н.В., Крахмалева И.Н., 1973. Две фотосистемы пур-

пурных бактерий ChroHatirai olnutissimun . В CÖ» "Пробле- . мы биофотохимяи", Тр. ШИП, сер. биол., 49, 210 X. Карапетян Н.В., Климов В.В., Красновский A.A. 1973.- Фотоинду- • цированные изменения выхода флуоресценции фрагментов хло-росластов, Симпозиум "Хлорофилл-белковые комплексы в фотосинтезе", Потсдам, тезисы докладов, 13 ,

31. Карапетян JI.B. 1973. Эволюция первичных процессов фотосинтеза

в сб. "Проблемы возникновения и сущности кизки"г.кзд. Наука, Москва, 233

32. Карапетян Н.В., Климов В.В..1973; Природа обратимого и необ-

ратимого уменьшения флуоресценции при освещении хлороплас-31 тов в восстановительных условиях, Физиол. растений,20,545

33. Карапетян Н.В,, Крахмалева Ц.Н., КрасновскнЙ Л.А. 1973. Фото-

превра'цения бакт ер;юхлорофиллов и цптохромов в хроматофорах и ".бактериях. curooatium при восстановительных условиях, ■ Кол. биол., 7,'8S8

34. Karapetyал N.V, 1973- TbQ evolution of photоsystems of photo-

syntiaetic organises, Abstr. of the 4-t'tt Int. Consross on •the Origin of Life, Barcelona, 113

35. Карапетян HjJB., Климов В.Б., КрасновскиЙ Л.Л. 1973. Переменная

флуоресценция дигитоняновцх фрагментов хлоропл'астов, Докл. АН СССР, Щ, 729

36. ^tabaoetjsa S.V., KlinovV.V., Krasnovsky А.А. 1973* Light in-

duced сЬосщез in tho fluorescence yield of particles, / obtained "by dicitonio fragmentation of ehloroplasts, Photosynthetic», 7, 330

37. Карапетлк Н.В., 1974. Исследование световых превращений хло-

рофиллов у фотосянтезирущих организмов, в сб. "Методы исследования фотосинтетического транспорта электронов", Цущино, 117

38. Eemidov E.D,, Karapetyan N.V., Dell L.N. I9?4. Wavelength <

independence of light induced cyclic electron trem sport in Cblorella and Лласуstis colls, Plant Science Letters, Ъ S7

39. Karapctyan N.V., Klimov V.V., Krasnovsky A, A. 1974. Light

induced transformations of chlorophylls in the reaction

■ * * j

center of the pigment systems of chloroplastg, Abstr. of

Sycpoeiua "Pigoeat protein completes in photosynthesis",

PoSnan, p. 33

40. Карапетян Н.В. 1974. Фото превращения разных форм хяорофиллов

при фотосинтезе, III Всесоюзный Биохимический съезд, Рига, тезисы симпозиалыщх докладов, 165

41. Климов 3,3., Крахмалева И.Н., Карапетян. Н.З., Краен обский А. А

1974. Природа инзктквирущего действия детергента тритон X-IQ0 на фотоскнтэтическую цепь переноса электрона хлоро-пластов и хроматофоров, в сб. "Итоги исследования фотосинтеза", Пущино, 70.

42. Карапетян Н.З., Авазов М., Климов B.B. 1974. Реактивация пе- '

ременной флуоресценции хлоропластов, обработанных днзти-лобым эрггром или пентаном, Бкохимпя, 39, 1025

43. Карапетян Н.Э., Панова М.Г. 1975. Зависимость флуоресцентных

свойств хлоропдастов от состояния реакционного центра фо-* тосистема 2, XII Международный Ботанический'конгресс, Ленинград, тезисы докладов, 425 .

44. Клг::.:ов Б.З., Крахмалева И.Н., Карапетян Н,В. 1975. Кнактивя-

pyssee действие детергентов на электронтрансаорткую цепь фотосинтезируадих организмов, XII Международный Ботани-. ■ чееккй конгресс, Ленинград, тезисы докладов, 42? " .

45. Карапетян Н.З.» Ксяокеако A.A. 1975. Температурная, завнеи- -

мость фотолрезраденкд бактерко,хлорофиллов пурпурных серобактерий и изолированных хроглатофоров, Микробиологи, 44, 422 t

46. Климов В.З., Крахкалева И.Н,, Шувалов Б.А., Карапетян Н.В.,

Красновскпй A.A. 1975. Зависимость выхода флуоресценция хлоропластов и хроматофэров от состояния реакционных цен- -трез, Докл. АН СССР, 221, 1207

47. Карапетян K.B.f Кланов В.В. 1975. Универсальная установка

для измерения фотоипдуднрованных изменений флуоресценции и поглощения, послеезечския' н спектров возбуждения флуоресценции, в сб. "катоды современной бно.ки'дкя", 124

48. Климов 3.3., Карапетян Н.З., Красновский A.A. 1975., Действие

детергента тритон Х-100 на переменную флуоресценцию хло- ■ ропластов, Мол. биол., 9, 219" '

49. ЕяльК.Я., Климов В.В^, Карапетян Н.В., Карпклов Ю.С. 1975.

Зависимость и взагкодейстБие двух фотосистем s хлорсплас-тах пареяжагкых обкладок сосудистых сучков листьев куку- ■ руза, Докл. АН СССР, 223, 225 ' *

50. Karopetyaa H.Y. 1975. Evolution of photosyeteras of photosyn-

thetic organ!ooû, Origina of Life, 25?

51. K3rapetyan U.V., К lio o V V.V., Lane Eraenovsky A.A. 1975

Fluorescence induction of noma! end autant mala« seed-lings, in "Genotic Aspccts■of Photosynthesis'', Junk, The Hague, p.255

52. Карапет я h H.B. 1975. Фотопревращения хлорофилл-белковых ком-

плексов in vivo, Симпозиум "Молекулярная организация фо-" синтетического аппарата", Москва, тезисы докладов,?.7

53. Панова М.Г., Синещеков В.А., Карапетян Н.В. Зависимость ■ • •

спектра флуоресценции хлороаластов от активности фотосис- ■ теш 2, Мол. йяол. {в печати).

54. Карапетян К,В. Переменная флуоресценция хлорофилла при фо- ■

тосинтезе, Успехи соврем, биол., (в печати) -

Материалы диссертации были доложены на следующие конференция* и сегшпарас

1. I Всесоюзный Биохимический съезд, Ленинград, 1964

2. Конференция но Молекулярной Биологии, Пушко, 1966

3. I Международной Конгресс по Фотосинтезу, ФреКденштадт (ФИ1)

1У68

-4* II Всесоюзный Биохимический съезд, Ташкент, 1969 .5. II Мендународная-Конференция по Происхождению Жизни» . ^ Понт-а-Муссон (Франция) 1970

6. I Всесоюзная Конференция по Биофотонике, Москва, 1970 ( 7. II Меядународный Конгресс ио Фотосинтезу, Стреза (Италия) 1371

.8. Международный симпозиум по Свободно-радикальным состояниям, , Путино, 1971

9. 1У Международный Биофизический Конгресс, Москва, 1972 10. У1 Международный ФотобяологическиЙ Конгресс, Бохум (ФЕТ) 1972 II.. Всесоюзный симпозиум "Генетические аспекты фотосинтеза* Душанбе» 1972 ...

12. 1Г Международная-конференция по Происхождению Низки,'

Барселона (Испания), 197313. III Всесоюзный Биохимический съезд, Рига, 1974

14. Научная конференция Института Биохимии им. А.Н.Баха АН СССР,

1975 ' ,

15. Научный семинар (Лежфакулътетского Координационного Сйвета МГУ

по Биофотонике, 1975

16. Всесоюзный симпозиум "Яластидный' аппарат и устойчивость

растений", Ленинград, 1975

17. XII Международный Ботанический Конгресс, Ленинград, 1975 .

_ _______________

Типография ХОЗО Госплана СССР