Световая регуляция начальных этапов фотосинтеза

Бухов, Николай Георгиевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Световая регуляция начальных этапов фотосинтеза
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Световая регуляция начальных этапов фотосинтеза"

? ? 0 4 Э'11

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕИХ ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ ИГЛ. К.А.ТИМИРЯЗЕВА

на правах рукописи

БУХОВ Николай Георгиевич

СВЕТОВАЯ РЕГУЛЯЦИЯ НАЧАЛЬНЫХ ЭТАПОВ ФОТОСИНТЕЗА

03.00.12 - физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА - 1990

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева АН СССР

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор В.Е.СЕМЕНЕНКО

доктор биологических наук,

профессор Т.Е.КРЕНДЕЛЕВА

доктор биологических наук Ю.Е.ГШ1ЛЕР Ведунья организация - Институт фотобиологии АН БССР

Защита состоится "Л^ " ¿У/Уку 1991 г. в на

заседании Специализированного совета Д 002.45.01 по защите диссертаций на.соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева АН СССР (127276, Москва, Ботаническая ул., 35).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Автореферат разослан "" 1991 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук Ю.В.Балнокин

I ^ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

' '...-Актуальность проблемы. Начальные этапы фотосинтеза представляют ,ссобо&:тот фундамент, на котором строится весь процесс фотосинтетиче-"ской фиксации С02^ Работами А.А.Красновского, А.Б.Рубина, Ф.Ф.Литви-на, Н.В.Карапетяна, В.А.Шувалова, В.В.Климова в нашей стране и Хил-ла, Френча, Кока, Бордмана, Ке, Витта, Говинджи и других - за рубежом, сформулированы основные представления о принципиальной оргаш-зации электронтранспортной цепи хлоропласта. По мере накопления сведений о структуре и функциях цепи переноса и отдельных ее участков становилось все более очевидным, что такая сложная структура не может функционировать без соответствующих регуляторных механизмов, направленных на оптимизацию работы всей цепи и согласование скорости переноса электрона с интенсивностью протекания реакций в цикле Кальвина.

Неотъемлемой частью системы регуляции активности фотосинтетического аппарата является его световая регуляция. В последней можно вычленить кратковременную и долговременную составляющие. Принципом кратковременной регуляции является обратимая модуляция активности уже предсозданного фотосинтетического аппарата, тогда как длительная световая регуляция базируется на направленных изменениях в новообразовании компонентов фотосинтетического аппарата. Работами В.Е.Семенен-ко, Н.П.Воскресенской, Ю.Л.Цельникер, Андерсон, Бьеркмана, Лихтента-лера, Уокера, Дейзенса и других выяснен ряд принципиальных моментов кратковременной и длительной световой регуляции ботосинтетического аппарата. Однако, многие вопросы, без разрешения которых нельзя разработать представления об основных принципах световой регуляции начальных этапов фотосинтеза, оставались малоизученными. Это касается регуляции активности реакционных центров фотосистем и изменения их содержания в листе при длительной адаптации к свету различной интенсивности и спектрального состава. Важной и не до конца решенной нам представлялась проблема выявления доминирующих механизмов кратковременной световой регуляции начальных этапов фотосинтеза у интактных фотосинтезирующих объектов. Требовал выяснения вопрос об участии в долговременной световой регуляции переноса электрона нескольких фо-тореакциЗ, сенсибилизируемых различными пигмента!.®. Не было выяснено, какова основная стратегия адаптации фотосинтетического аппарата к различиям в освещенности - изменение числа его компонентов в листе или изменение интенсивности их функционирования.

Не вызывает сомнений, что развитие представлений о световой регуляции начальных этапов фотосинтеза является необходимым моментом

в создании общей теории регуляции фотосинтеза.

Цель к задачи исследования. Целью работы было комплексное исследование принципов кратковременной и долговременной световой регуляции структурно-функциональной организации электронтранспортной цепи хлоропласта.

В работе решались следующие экспериментальные задачи:

1. Выявление возможности кратковременной световой регуляции эффективности переноса электрона на уровне реакционных центров фотосистем высших растений.

2. Выявление доминирующих механизмов кратковременной световой регуляции переноса электрона у интактных фотосинтезирующих объектов при различных освещенностях.

3. Исследование изменений в характере кратковременной световой регуляции переноса электрона после воздействия на объект стрессовых факторов, таких как повышенные температуры или обезвоживание.

4. Исследование специфики действия интенсивности и спектрального состава света при выращивании растений на содержание в листе компонентов электронтранспортной цепи и скорость переноса электрона, а также выяснение того, каким образом влияют световые условия выращивания на особенности кратковременной световой регуляции начальных этапов фотосинтеза.

Научная новизна работы. Обнаружено существование "светового" и "темнового" состояний реакционных центров фотосистем I и 2, различающихся вероятностью обратного переноса электрона от восстановленных акцепторов.к фотоокисленным первичным донорам. Показано, что у интактных фотосинтезирующих объектов кратковременная световая регуляция скорости переноса электрона при низких и средних освещенностях связана, в основном, с изменением скорости нециклического электронного транспорта вследствие более интенсивного оттока конечных продуктов функционирования электронтранспортной цепи в реакции темнового метаболизма С0£ и, в меньшей степени, с фосфорилированием светособираю-щего комплекса. Изменения кратковременной световой регуляции электронного транспорта в результате действия стрессовых факторов не являются универсальными и зависят от вида стрессового фактора. Псевдоциклический перенос электрона играет определяющую роль в начальные моменты световой активации электронного транспорта. Анализ свойств листьев проростков ячменя, выращенных на свету различного спектрального состава и интенсивности, показал, что на содержание хлорофилла и реакционных центров обеих фотосистем определяющее действие оказывает абсолютный уровень свегопотока, а не его спектральный состав.

Скорость переноса электронов, в хлоропластах, напротив, менее чувствительна к величине освещенности и сильно реагирует на спектральный состав света при выращивании. Изменения количества компонентов элек-тронтранспортной цепи при выращивании проростков на свету разного спектрального состава и освещенности более выражены в сравнении с изменениями максимальной скорости переноса электрона, что указывает на изменение числа компонентов фотосинтетического аппарата как стратегическое направление адаптации растения к изменению уровня освещенности. На примере листа ячменя показано, что отношение количества реакционных центров фотосистем I и 2 не является постоянным и зависит от абсолютного содержания реакционных центров в листе. Подученные данные позволяют сформулировать концепцию общности конечного результата кратковременной и длительной световой регуляции начальных этапов фотосинтеза на уровне листа.

Практическая значимость работы. Обнаружение "светового" и "тем-нового" состояний реакционных центров фотосистем высших растений может оказаться полезным при разработке биотехнических систем преобразования солнечной энергии. Выявленные принципы кратковременной световой регуляции являются частью представлений о природе регулято-рных систем фотосинтеза л могут быть применены в селекционной работе при отборе перспективных растительных форм, отличающихся повышенной реактивностью фотосинтетического аппарата по отношению к свету. Характерные изменения кинетических кривых переменной, флуоресценции после действия на нативные фотосинтетическне объекты повышенных температур и обезвоживания, а также действия на них ионов ртути, позволяют рассматривать этот метод в качестве способа диагностики повреждений фотосинтетического аппарата, возникающих после стрессовых воздействий.

Апробация работы. Материалы по теме диссертации были рассмотрены на 4-м Всесоюзном биохимическом съезде (1979), 2-м Мгяэународном симпозиуме по регуляции метаболизма растений (Варна, 1981), 17-м Симпозиуме стран СЭВ по проблеме 1.18.2 (Рейнхагсберг, ГДР, 1979), 21-м Симпозиуме стран СЭВ по проблеме 1.18.1 (йяпеград, ВНР, 1983), Всесоюзном научно-производственном совещании по применен™ оптического излучения в сельском хозяйстве (Львов, 1984), Всесоюзной конференции "Изменчивость пигментного аппарата и направленности первичных процессов фотосинтеза в зависимости от факторов среда" (Чернигов, 1985), Всесоюзной конференции "Методы исследования в биохимии и физиологии" (Ленинград, 1986), Круглом столе "Некоторые аспекты не-фотосинтетического действия света на зеленые растения" (пущино,

1986), 2-й Всесоюзной конференции "Математические и вычислительные методы в биологии" (Пущино, 1987), Индо-советском симпозиуме "Фотосинтез в условиях стресса" (Ныо-Дели, Индия, 1987), семинарах Школы наук о жизни Университета им. Дж. Неру (Ныо-Дели, Индия, 1988), Всесоюзной конференции "Регуляция световой стадии фотосинтеза" (Ужгород, 1988), 5-й Европейской конференции по биоэнергетике (Аберствис, Великобритания, 1988), Всесоюзной конференции "Преобразование световой энергии в фотосинтезирующих системах и их моделях" (Пущино, 1989), 8-м Международном конгрессе по фотосинтезу (Стокгольм, Швеция, 1989), Всесоюзном совещании "Спектральный состав света и продукционный процесс в управляемых условиях" (Красноярск, 1990), Советско-индийском симпозиуме "Регуляция фотосинтеза" (Пущино, 1990), 2-м съезде Всесоюзного общества физиологов растений (Минск, 1990).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 59 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 7 глав, в которых рассмотрены основные литературные данные и результаты собственных исследований, общего заключения, выводов и списка цитируемых работ. Работа изложена на 357 стр. машинописного текста и содержит 120 рисунков и 3 таблицы. Список литературы включает 606 наименований.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Отдельные элементы кратковременной световой регуляции начальных стадий фотосинтеза наблюдаются уже на уровне реакционных центров фотосистем высших растений.

2. Основным механизмом кратковременной световой регуляции переноса электрона у интактных фотосинтезирующих организмов при низких и средних освещенностях является ускорение электронного транспорта при интенсификации потребления конечных продуктов функционирования электронтранспортной цепи, АТФ и. НАДФН, в цикле Кальвина при световой активации ряда ферментов цикла.

3. Изменения в характере кратковременной световой регуляции пере носа электрона у интактных фотосинтезирующих объектов после воздейст вия на объект различных стрессовых факторов, таких как повышенные температуры и обезвоживание, не являются универсальными и зависят от вида стрессора.

4. Долговременная световая регуляция начальных стадий фотосинтеза к различиям в интенсивности и спектральном составе света опосреду ется в основном фотосинтетической деятельностью листа, хотя определс

hhufl вклад в этот процесс вносят и нефотосинтетические регуляторные реакции. Вклад различных фоторегуляторных реакций в световую регуляцию экстенсивного и интенсивного параметров фотосинтеза различен. Основной стратегией адаптации начальных стадий фотосинтеза к уровню освещенности является изменение числа компонентов электронтранспорт-ной цепи в листе, а не изменение скорости их функционирования.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования.

В качестве объектов исследования использовали листья разных видов высших растений, клетки культур эвглены и хлореллы, изолированные хлоропласты и субхлоропластные фрагменты фотосистемы I.

Использованные при исследованиях, описанных в главах 3-6, проростки гороха и ячменя выращивали в оранкерее в водной культуре при освещении белым светом интенсивностью 10 кЛк. Выращивание проростков ячменя, гороха, пшеницы и кукурузы на синем или красном свету различной интенсивности проводили в фитотроне ИФР АН СССР, выравнивая потоки cimero и красного света по количеству падающих квантов (Воскресенская, 1979). Суспензии эвглены выращивали как описано в работе (Володарский и др., 1979). Суспензии хлореллы выращивали согласно М.Г.Владимировой и В.Е.Семененко (Владимирова, Семененко, 1962).

Хлоропласты выделяли согласно ( Karapetyan et al » 1973). Субхлоропластные фрагменты фотосистемы I выделяли с помощью дигитонина ( Boardman et al, 1966) или насыщенного водой диэтилового эфира (Ikegamy, Katoh, 1973).

Методы исследования.

Фотоиндуцированные изменения поглощения регистрировали с помощью однолучевого дифференциального спектрофотометра (Каралетян и др., 1963). Регистрацию переменной флуоресценции проводили с помощью од-нолучевой установки, установок двухлучевого типа с механическим фосфороскопом (Карапетян, Котлов, 1971, Джибладзе и др., 1988) и прибора РАМ 101 (фирма " ffalz", ФРГ). Замедленную флуоресценцию регистрировали с помощью фосфороскопических установок.

Определение внутриклеточного содержания АТФ проводили с помощью люциферзн-люциферазной методики после экстракции из объекта нуклео-тидов с помощью хлорной кислоты.

Количество реакционных центров фотосистемы 2 в листе определяли с помощью измерения кинетики фотоиндуцированного нарастания переменной флуоресценции согласно ( Malkin et al, 1981). Содержание реакционных центров фотосистемы I в листе определяли в совместной работе

с А.Г.Четвериковым по разработанной им методике (Четвериков, 1983).

Скорость фотовосстановления феррицианида определяли потенциоме-трически. Скорость фотовосстановления дихлорфенолиндофенола и его восстановления в темноте после добавления НАДФН регистрировали на дифференциальном однолучевом спектрофотометре.

Определение липвдного и жирнокислотного состава мембран проводили. как описано в работе (Мануильская и др., 1984).

Скорость газообмена С02 измеряли с помощью инфракрасного газоанализатора 1пГга1у1;-3 (ГДР), включенного в открытую газовую систему. Скорость выделения кислорода клетками эвглены измеряли амперометри-чески с помощью полярографа ЬР-7 (ЧССР).

Количество метаболитов цикла Кальвина в листе определяли с помощью энзиматического анализа после экстракции из листа хлорной кислотой ( Еегвшеуег, 1974).

Моделирование кинетики электронного транспорта проводили совместно с д. ф.-м. н. Г.Ю.Ризниченко и к. ф.-м. н. Х.Г.Дамировым на ЭВМ БЭСМ-6 с помощью разработанных шли оригинальных программ.

ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ СНЕТОЗАВИСШЫХ ИЗМЕНЕНИЙ ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНА В РЕАКЦИОННЫХ ЦЕНТРАХ ФОТОСИСТЕМ 2 И I

Регуляция эффективности электронного транспорта на уровне реакционных центров (РЦ) должна проявляться в изменении констант скоростей прямых и обратных реакций переноса электрона между отдельными компонентами РЦ фотосистем. Для РЦ фотосистемы пурпурных бактерий А.А.Кононенко с сотр. показано, что на свету он переходит в состояние, в котором обратный перенос электрона к фотоокисленному пигменту от восстановленного акцептора маловероятен (Кононенко, 1980). Для выявления возможности световой регуляции переноса электрона на уровне реакционных центров фотосистем высших растений ш исследовали низкотемпературные фотопревращения Р700 (фотосистема I) и кинетические кривые переменной и замедленной флуоресценции хлорофилла в присутствии диурона и при пониженных температурах (фотосистема 2).

Световая регуляция переноса электрона в И! ФС1.

При температурах ниже -50° в РЦ ФС1 фотоиндувдрованный обмен электрона осуществляется только между Р700 и компонентами акцепторной части (Сох, 1975, Агаевя, Ие Огоо^, 1976). Поэтому изменения кинетики фотопревращений Р700 при понижении температуры отражают изменения в свойствах акцепторной части ФС1.

По мере понижения температуры измерения от -60° до -95° скорость темнового восстановления Р700+ у дигитониновых фрагментов ФС1 посте-

пенно уменьшается, причем фотоокисление Р700 полностью обратимо в темноте. При дальнейшем понижении температуры часть Р700 фотоокисля-ется необратимо, а в кинетике темнового восстановления Р700+ различаются быстрый и медленный компоненты. Нами показан параллелизм в исчезновении необратимости фотоокисления Р700 при низких температурах и медленного компонента темнового восстановления Р700+ в этих условиях у фрагментов ФС1, подвергнутых действию повышенных температур, различных pH среды или инкубации с глютаровым альдегидом. Учитывая данные, полученные методом ЭПР (Bearden, Malbin, 1971) и отмеченное нами исчезновение после указанных воздействий оптически регистрируемого фотовосстановления Р430 можно заключить, что необратимое фотоокисление Р700 и медленный компонент восстановления Р700+ в темноте при низких температурах связаны с функционированием вторичного акцептора ФС1 железо-серной природы, Р430, а быстрый компонент тем-новой релаксации Р700+ - с обратным переносом электрона от фотовос-становленного первичного акцептора.

При замораживании дигитониновых фрагментов ФС1 на действующем свету от -80° до -170° обнаруживаются характерные изменения в фотопревращениях Р700: при этом только 10$ фотоокисленного Р700 восстанавливаются в темноте, а кинетика релаксации Р700 представлена только быстрым компонентом, тогда как у фрагментов, замороженных в темноте, при -170° обратило фотоокисляется половина Р700, а амплитуда медленного компонента темнового восстановления Р700+ составляет 20$ всего фотоиндуцированного сигнала. Таким образом, очевидно, что при замораживании на свету РЦ ФС1 фиксируется при низкой температуре в состоянии, когда перенос электрона от восстановленного Р430 к Р700+ значительно менее вероятен, чем у объектов, замороженных в темноте. По аналогии с РЦ пурпурных бактерий можно заключить, что РЦ ФС1 может существовать в "темновом" и "световом" состояниях. Переход из одного состояния в другое связан с изменениями в кинетических свойствах Р430. Это доказывается тем, что у фрагментов ФС1, выделенных с применением диэтилового эфира, замораживание на свету и в темноте приводит к одинаковым результатам; характерной особенностью этих объектов является то, что основная часть Р430 в них инактивирована в процессе выделения.

Таким образом, исследование фотопревращений Р700 у фрагментов ФС1, замороженных на свету и в темноте, позволило выявить светокнду-цированное изменение констант скоростей в РЦ ФС1.

Световая регуляция переноса электрона в РЦ ФС2.

В отличие от ФС1, непосредственное наблюдение за редокс-превра-

щениями компонентов РЦ ФС2 при постоянном освещении затруднительно, поэтому перенос электрона на этом участке ЭТЦ исследуют в основном методами переменной (ПФ) и замедленной (ЗФ) флуоресценции. Поскольку даже в присутствии диурона, блокирующего отток электрона от ФС2 к ФС1 icrebst, 1974) и приток электрона к ФС2 от водоразлагающего ком-пле,са (Хомутов и др., 1981, Carpentier et al , 1985), в РЦ ФС2 переносится не один, а несколько электронов, для адекватного описания кинетических кривых ПФ и ЗФ мы применили математическое моделирование электронтранспортных процессов.

Перенос электрона в ФС2 в присутствии диурона можно представить следующей схемой:

Ко К~ ^ Кт

Д ^ ^ PfiRfi 0 ^ фепфитин 1 ^ Q.

к-2 -о -I

Константа к0 на этой схеме пропорциональна частоте попадания квантов в РЦ ФС2 (т.н. "световая" константа); остальные константы - кинетические константы скорости первого порядка, поскольку РЦ ФС2 мы представляли в качестве мультиферментного комплекса четырех прочно связанных переносчиков.

Поскольку тушт елями ПФ являются окисленный (Duysens, Sweers, 1963), окисленный Р680 ( Butler. 1972) и восстановленный феофитин (Klimov, Krasnovskii , 1981), амплитуду ПФ полагали пропорциональной концентрации РЦ ФС2 в состоянии Р680°Фео°<5д, а интенсивность ЗФ -концентрации РЦ ФС2 в состоянии Р680+Фео°0д ( Malkln, 1977).

С помощью математической модели мы описали все характерные изменения амплитуд и кинетических кривых фотсшндуцированных изменений ПФ и ЗФ в присутствии диурона. Поскольку измерения ПФ и ЗФ проводили при идентичных световых условиях, идентификация параметров модели была сделана одновременно для двух указанных выше состояний РЦ ФС2,что придает полученным результатам высокую надежность. Однако, при наборе кинетических констант, полностью описывающем фотоиндуцированные изменения ПФ и ЗФ, расчитанные времена полуспада ПФ и ЗФ в темноте превышают экспериментально обнаруженные на два порядка. Единственно возможным способом привести в согласие экспериментальные и расчетные данные является увеличение значения константы k_j в "темновых" условиях по сравнению со "световыми" в 20 раз.

Таким образом, моделирование переноса электрона в РЦ ФС2 в присутствии диурона выявило существование у РЦ ФС2 "светового" и "темпового" состояний, различающихся вероятностью переноса электрона от восстановленного первичного акцептора к окисленному Р680. При комнатной

температуре между "световым" и "темновым" состояниями РЦ ФС2 наблюдаются обратимые взаимопереходы, однако, как показали наши исследования, этого не происходит при пониженной температуре.

Понижете температуры измерения выызвает характерные изменения в кинетических кривых ПФ. При -60° на интенсивном действующем свету после достижения максимального уровня несколько спадает в течение нескольких минут интенсивность ПФ; выключение света в этом случае приводит вначале к возрастанию ПФ, после чего амплитуда последней медлннно уменьшается в темноте. Понижение интенсивности освещения сопровождается замедлением нарастания ПФ до максимального уровня, исчезновением светового спада ПФ и переходного возрастания ПФ после выключения действующего света.

Понижение температуры измерения вызывает постепенное исчезновение светового спада ПФ, исчезновение переходного возрастания ПФ в темноте и уменьшение глубины темнового спада ПФ.

Поскольку известно, что при низких температурах помимо нативного вторичного донора в ФС2 наблюдается фотоокисление и альтернативного донора, вдтохрома в55д, моделирование низкотемпературных реакций переноса электрона в РЦ ФС2 проводили для схемы с двумя вторичными донорами:

Математическое моделирование переноса электрона в такой системе показало, что, в отличие от комнатной температуры, при -60° и более низких температурах кинетика темновой релаксации описывается тем же набором констант скоростей, что и фотоиндуцированние изменения. Напротив, увеличение значения константы ^ в "темнових" условиях по сравнению со "световыми" всего в 2-3 раза приводит к качественным расхождениям экспериментальных и расчетных данных. Таким образом, можно заключить, что, в отличие от комнатной температуры, при -60° и более низких температурах выключение действующего света не сопровождается реверсией РЦ 2С2 из "светового" состояния в "темновое".

Все индуцированные понижением -температуры изменения в кинетических кривых ПФ легко описываются при предположении, что температурно-зависимой является только константа Моделирование наших, а также

к,

тг

■-о

целого ряда литературных данных, позволило вычислить значение энергии активации переноса электрона от нативного вторичного донора к Р680+, составляющее 0,10 эВ. Столь малая величина этого параметра показывает, что перенос электрона от вторичного к первичному донору ФС2 происходит в безактивационной области. Несмотря на это, скорость прямой и обратной реакций переноса электрона между нативным вторичным донором и Р680 подвергается регуляции посредством изменения рН внутрити-лакоидного пространства. При этом, возрастание рН сопровождается ускорением прямого и замедлением обратного переноса электрона на этом участке цепи. Этот вывод сделан на основании математического моделирования кинетических кривых ПФ и ЭФ в присутствии диурона у хлороп-ластов при различных рН среды. Характерно, что полностью аналогичные изменения кинетических кривых ПФ и ЗФ в присутствии диурона у интактных клеток эвглены наблюдаются в присутствии протонофорных разобщителей. Сходство изменений кинетических кривых ПФ и ЗФ у изолированных хлоропластов и интактных клеток указывает на то, что в последнем случае они обусловлены защелачиванием внутритилакоидного пространства при его шунтировании со стромой хлоропласта. Поскольку при функционировании электронтранспортной цепи рН внутритилакоидного пространства подвергается значительным изменениям, изменения скоростей прямого и обратного переноса электрона между вторичным донором электрона и Р680 следует рассматривать как неотъемлемую и важную составную часть кратковременной световой регуляции электронного транспорта.

Заключение главы.

Резюмируя данные, полученные при исследовании светозависимых изменений переноса электрона в РЦ ФС1 и РЦ ФС2, можно заключить, что установлено существование кинетически различных "светового" и "темно-вого" состояний РЦ обеих фотосистем. Как и в случае пурпурных бактерий, переход от "темнового" состояния к "световому" сопровождается уменьшением вероятности обратного возврата электрона от восстановленных акцепторов к фотоокисленным первичным донорам. Исходя из этого, существование двух, кинетически различных состояний РЦ фотосистем высших растений, можно рассматривать в качестве механизма, направленного на повышение квантового выхода первичного разделения зарядов.

ГЛАВА 4. КРАТКОВРЕМЕННАЯ СВЕТОВАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНА У ИНТАКТНЫХ ФОТОСИНТЕЗИРЛЩХ ОРГАНИЗМОВ

Очевидно, что у интактных фотосинтезирующих организмов световая регуляция электронного транспорта не ограничивается регуляцией на уровне изменения эффективности переноса электрона в пределах РЦ фо-

тосистем. В этом случае кратковременная регуляция светом скорости переноса электрона в хлоропласте должна быть направлена в основном на согласование скоростей функционирования электронтранспортной цепи и цикла Кальвина.

Наиболее ярко кратковременная световая регуляция проявляется в индукционном периоде фотосинтеза, когда после нескольких минут освещения предварительно выдержанных в темноте листьев или клеток водорослей последние приобретают способность к фиксации СОд. отсутствующую после длительной темновой адаптации. Выяснение того, как преобразуется во время индукционного периода фотосинтеза электронный транспорт, может сыграть ключевую роль в понишнии процессов, опосредующих световую регуляцию переноса электрона у интактных фотосинтезирующих организмов. В связи с этим, мы провели комплексное исследование изменений внутриклеточного содержания АТФ, амплитуд ПФ и ЗФ у листьев и клеток водорослей при смене условий освещения.

Фотоиндуцированные изменения уровня АТФ у клеток эвглены при переходах "гететотшзное-Фототтосвное-миксотройное" состояния Очевидно, что изменения количества АТФ в клетках должны отражать баланс скоростей функционирования световой и темновой стадий фотосинтеза. Однако, несмотря на то, что факт существования немонотонных фотоиндуцированных изменений уровня АТФ у фотосинтезирующих объектов известен давно (£агИ;аг1из, НеЪег , 1965), варьирование этих изменений в зависимости от относительных скоростей генерации АТФ в хлоропласте и потребления АТФ в реакциях углеродного метаболизма показано не было.

У гетеротрофных клеток эвглены фотоиндуцированные изменения содержания АТФ полностью отсутствуют. По мере зеленения клеток у них появляется способность к (^-зависимому выделению кислорода, а также фотоиндуцированные изменения уровня АТФ: при включении интенсивного света уровень АТФ у клеток, некоторое время адаптировавшихся к тем-тоте, в первые 15-20 сек растет, а затем снижается. Таким образом, наличие фотоиндуцированных переходов внутриклеточного уровня АТФ прямо связано с присутствием в клетках активного фотосинтетического аппарата.

Кинетические кривые фотоиндуцированных изменений количества АТФ в клетках эвглены на разных стадиях перехода культуры из фототрофно-го состояния в миксотрофное представлены на рис. I. Фстотрофная культура эвглены характеризуется глубоким световым спадом уровня АТФ (кривая I) По мере перехода клеток в миксотрофное состояние, стационарный уровень АТФ на свету постепенно растет (кривые 2-5). Наконец,

через 48 часов после начала перехода культуры из фототрофного состояния в миксотрофное вслед за некоторым начальным спадом количество АТФ на свету растет и остается на высоком стационарном уровне.

Способность к фотоиндуцированному С02-зависимому выделению кислорода по мере перехода культуры из фототрофного состояния в миксотрофное уменьшается более чем в 4 раза. Это связано в основном с уменьшением активности темповых реакций фотосинтеза, поскольку полученные нами данные по измерению кинетических кривых ЗФ в процессе перехода суспензии из фототрофного состояния в миксотрофное показывают, что световые стадии фотосинтеза затрагиваются при этом незначительно.

Таким образом, на примере суспензии клеток эвглены мы показали, что по мере развития фотосинтетической активности клеток возрастает глубина спада внутриклеточного содержания АТФ при освещении. Это указывает, что при активной работе хорошо сформированного фотосинтетического аппарата скорость потребления АТФ значительно превышает скорость ее генерации в световой стадии фотосинтеза. В случае же, если фотосинтетический аппарат сформирован таким образом, что активность темновых реакций ниже, чем световых, стационарный уровень АТФ на свету высок.

Дополнителъным аргументом для оценки относительных скоростей световых и темновых реакций фотосинтеза может быть измерение величины протонного градиента на тилакоидной мембране.

Фотоиндуцировашше изменения миллисекундного и децисекундного

компонентов замедленной флуоресценции.

Измерение фотоиндуцированных изменений ДрН у интактных фотосин-тезирующих организмов, особенно у листьев растений, представляет собой сложную задачу. Как показали Крофтс с сотр. ( Hraight, Crofts, 1973, Evans, Crofts, 1973), амплитуда медленного максимума кинетической кривой 3$ зависит от величины рН на мембране тилакоида. В согласии с данными, опубликованными ранее рядом авторов (Маторин и др., 1977, Романюк, Звалинский, 1981), мы обнаружили, что при комнатной температуре кинетический максимум ЗФ, наблюдающийся через 8-10 сек после начала освещения, обусловлен возрастанием интенсивности свечения с временем жизни около 15 мсек, тогда как начальный скачок ЗФ, регистрируемый сразу же после включения света, практически полностью отражает изменения ЗФ с временем жизни менее I мсек. Исходя из этого мы предположили, что именно интенсивность компонента ЭФ с временем жизни около 15 мсек (или децисекундного компонента ЗФ), является непрямым индикатором амплитуды протонного градиента на мембране. Это предположение подтвердили исследования температурной зависимости

- 13 -ATS (jtr / ТО6 клеток)

150 - Л ,/ \

у г. \ iV ^

100 -

50 -

2 l 5 5~

Время освещения, шн

Рис. I. Кинетические кривые фотоиндуцированных изменений содержания АТФ в клетках эвглены у фототрофной культуры (1).и через 4 (2), 24 (3), 34 (4) и 48 (5) часов после начала перехода культуры в миксотрофное состояние.

За

1а

Iii

+15Вт-м

41-

-15&ТМ"

Рис. 2. Кинетическая кривая переменной флуоресценции у листьев шпината при освещении красным действующим светом (15 Вт м-2) и 1-секундными импульсами белого света (пунктирная и сплошная линии, соответственно), разделенными 30-се-кувдными темновыми интервалами. Интенсивность импульсов 35 (I), 100 (2), 200 (3) и 400 Вт м-2 (4). Индексы у цифр обозначают серии освещений' импульсами разной интенсивности, разделенных периодами темновой адаптации.

кинетических кривых мклли- (ЗФМ) и децисекундного (ЗФД) компонентов ЭФ.

Понижение температуры измерения до 2° приводит к сильному подавлению медленного кинетического максимума при измерении суммарного свечения (ЗФМ+ЗФД). Напротив, амплитуда'быстрого начального всплеска ЗФ после включения действующего света несколько возрастает при понижении температуры измерения. Регистрация начального скачка ЗФ у листа при более высокой временной развертке показала, что он имеет сложную структуру и состоит из двух кинетических пиков, относительная амплитуда и временное положение которых зависят от температуры регистрации. Селективно измеренные кинетические кривые ЭФД в диапазоне от 2° до 20° продемонстрировали полное отсутствие структуры, характерной дяя ЗФМ. У ЗФД отмечен сильный рост максимальной амплитуды фотоиндуцированного сигнала по мере повышения температуры измерения.

Хорошо известно, что понижение температуры в первую очередь ин-гибирует процессы электронного транспорта, отдаленные от РЦ фотосистем. Поэтому, исследование температурной зависимости ЗФД и ЗФМ показало, что 3$д и ее изменения отражают процессы, достаточно удаленные в цепи переноса от РЦ ФС2. Дополнительное доказательство этому получено при математическом моделировании кинетики селективно измеренных при разных температурах ЗФМ и ЗФД. В этом случае моделирование переноса электрона проводили согласно следующей схеме:

Ко Ко К« Кт Кл

^Д^ 2 0 1 > -

-2 —о K-I

где Gg - ддухэлектронный акцептор фотосистемы 2.

Математическое моделирование временных изменений концентрации состояния Р680+(^, проведенное согласно вышеуказанной схеме, показало, что такая кинетика имеет дзухкомпонентный характер и соответствует кинетическим изменениям ЗФ^, но не ЗФД. Таким образом, испускание ЗФд не отражает непосредственно рекомбинацию зарядов в паре Р680+фд. а связано с увеличением излучения ЭФ при нарастании ДрН на мембране, как предположено Эвансом и Крофтсом (Evans, Crofts; ,1983). Вследствие этого, интенсивность ЗФД можно рассматривать в качестве непрямого индикатора протонного градиента на мембране тилакоида.

Корреляция медленных кинетических кривых ЗФд и ПО у листьев.

Проведенное у-листьев ячменя и гороха исследование кинетических кривых ПФ и ЗФП показало корреляцию их медленных компонентов. Это

обнаружено для двух кинетических максимумов, наблюдающихся в индукционных переходах ПФ и ЗФД через 13-15 и 60-65 сек после включения света. При варьировании условий освещения для кинетических максимумов свечения выявлены одинаковые изменения как амплитуд , так и их временного положения. Подобная корреляция указывает, -что медленные фото-индуцированные переходы ПФ тесно связаны с изменением градиента рН на мембране тилакоида. В то же время, обнаружение корреляции в амплитуде и временном положении медленных кинетических максимумов ПФ и ЗФд показывает, что "нефотохимическое" тушение ПФ, обусловленное возрастанием безизлучательной дезактивации энергии возбуждения при возрастании протонного градиента на мембране тилакоида (Вг1щ^а1а et а1 , 1979) не является при низких и средних освещенностях основным механизмом светового спада ПФ у интактных фотосинтезирующих объектов, поскольку в противном случае кинетические кривые ПФ и ЗФД долины быть антипараллельны.

В этом случае вероятно, что световой спад ПФ, наблюдающийся при освещении предварительно адаптированных к темноте листьев, обусловлен ускорением реокисления первичного акцептора ФС2 во время индукционного периода фотосинтеза. Подтверждение этому мы получили при исследовании кинетики темновой релаксации ПФ и реакции ПФ на внезапное увеличение интенсивности действующего света.

Кинетика темновой релаксации ПФ у интактных листьев.

Характерной чертой кинетики темновой релаксации ПФ у листьев является обнаруженная нами зависимость ее фарш от точки светоиндуци-рованных переходов ПФ, где выключается действующий свет. Темновая релаксация ПФ после выключения света в первом максимуме кинетической кривой двухкомпонентна: время полуспада быстрого компонента менее I сек, медленного - 7-8 сек. Световой спад ПФ сопровождается возрастанием вклада быстрого компонента в темновую релаксацию и, напротив, фотоиндуцированному увеличению ПФ сопутствует уменьшение доли быстрого компонента в темновой релаксации. Мы обнаружили, что освещение дальним красным светом, специфически поглощаемым СС1, резко ускоряет медленный компонент релаксации ПФ после выключения основного действующего света. К подобному же результату приводит и инфильтрация листа метилвиологеном, акцептирующим электроны на восстановительной стороне ФС1 и ускоряющим, таким образом, реокисление ( Мипйау, ОотгЗлаЗее, 1959).

Таким образом, медленный компонент темновой релаксации ПФ отражает существование определенной части которая не может передать

электрон ФС1, повидимому, вследствие отсутствия эквивалентного количества окисленных Р700 шш окисленных вторичных доноров ФС1. Как показано в работе (Тихонов, 1988), наличие-Р700 в окисленном состоянии во время индукционного периода фотосинтеза прямо отражает способность темновых реакций фотосинтеза утилизировать генерированный при работе электронтранспортной цепи НАДФН. Поэтогцу ясно, что больший или меньший вклад быстрого компонента в темноцую релаксацию ПФ во время кратковременной световой адаптации листа прямо'указывает на изменения скорости нециклического переноса электрона, происходящие при этом.

Итак, анализ изменений кинетики темновой релаксации ПФ показал, что основной процесс, с которым связан световой спад ПФ в интактных фотосинтезирузощих организмах при низкой и средней освещенности - это ускорение реокисления при кратковременной световой активации фотосинтетического аппарата. Одним из механизмов, которыми опосредуется этот процесс, является изменение распределения энергии возбуждения между двумя фотосистемами. На это указывает тот факт, что у листа, адаптированного не к темноте, а к слабому свету (4,5 Вт м ), релаксация ПФ после секундного освещения сильным светом резко ускорена светом с длиной волны, большей 650 нм. Этого не наблюдается у листьев, адаптированных к темноте. Таким образом, у адаптированных к слабому свету листьев, освещение, возбуждающее одновременно обе фотосистемы, сходно по действию с дальним красным светом. Очевидно, что такой феномен связан с переходом антенной системы хлоропласта из состояния 2 в состояние I ( Bonaventura, Myers, 1968) вследствие фос-форилирования светособирающего комплекса ( Horton, Black, 1981). В то же время, как будет показано ниже, этот механизм вряд ли может рассматриваться в качестве основного, определяющего световое тушение ПФ у листьев.

Исследование действия на ПФ резкого повышения интенсивности

освещения в процессе кратковременной световой адаптации

По мере увеличения продолжительности световой адаптации предварительно затененного листа к слабому свету (4,5 Вт м-2) скорость нарастания ПФ при резком возрастании интенсивности действующего света до 60 Вт м-2 сильно замедляется. Это является аргументом против признания "нефотохимического" тушения ПФ в качестве основного процесса, обуславливающего световой спад ПФ в этих условиях, поскольку возрастание протонного градиента на мембране тилакоида замедляет отток электронов от $С2 к ФС2 и, следовательно, должно облегчать световое восстановление фд. Полученные нами данные свидетельствуют об обратном эффекте: световая адаптация листа сопровождается затруднением фото-

восстановления §д.

Как показано на рис. 2, при освещении адаптированного к темноте листа импульсами белого света длительностью I сек, ПФ достигает максимальной амплитуды при интенсивности импульса менее 50 Вт Освещение листа относительно слабым светом (15 Вт м-2) индуцирует немонотонный спад амплитуды ПФ, причем по достижении низкого стационарного уровня ПФ не насыщается светом даже при высокой интенсивности секундного импульса (200 Вт м-2). Подобное изменение световой кривой ПФ обладает "памятью" и сохраняется в темноте достаточно длительное время. Как показано на рис. 2, возврат к исходному уровню светового насыщения достигается только через 20-25 минут после прекращения освещения листа светом с интенсивностью 15 Вт м-2.

Итак, мы показали, что ускорение нециклического транспорта электрона, сопровождающееся ускорением реокисления фд, достигается при кратковременной световой адаптации листа к свету низкой интенсивности. Хорошо известно (ЕвМ.пв, НеЪег , 1980), что активация ферментов цикла Кальвина, связанная с защелачиванием стромы хлоропласта, насыщается светом низкой интенсивности. Поскольку ш показали (рис. 3), что медленный светоиндуцированный спад внутриклеточного уровня АТФ у листа коррелирует с фотоиндуцированным спадом амплитуды ПФ, можно утверждать, что одним из основных мезанизмов, опосредующих процесс реокисления фд по мере кратковременной световой активации фотосинтетического аппарата, является ускорение выноса АТФ и НАДФН из цепи переноса электрона в цикл Кальвина при активации ферментов последнего.

Возвращение максимальной амплитуды ПФ к исходному уровню после прекращения освещения, как указывалось выше, происходит за 20-25 глин. У листьев, инфильтрированных фторидом натрия (10-400 мМ) - ингибитором дефосфорилирования светособирающего комплекса, максимальный уровень ПФ в темноте релаксирует до величины, составляющей 85-90$ от уровня ПФ у контрольных листьев. Следовательно, изменение распределения энергии возбуждения между двумя фотосистемами хотя и принпшет участие в кратковременной регуляции скорости переноса электрона у интактных объектов, но играет в ней меньшую роль по сравнению с механизмом изменения скорости переноса, обусловленным интенсификацией потребления АТФ и НАДФН в цикле Кальвина при световой активации ферментов последнего.

Влияние газового состава среды на кинетические кривые ПФ и ЗФ

листьев и клеток водорослей.

В связи с тем, что ускорение переноса электрона при кратковремен-

ПФ (отн.ед.)

АТФ (мкг-г"* сыр. массы)

10 -

^Чч

* V

свет

Рис. 3.

I 2 3 4 мин Время освещения

свет

—I-!-1-

12 3 Время освещения

4 мин

Кинетические кривые фотоиндуцированных изменений переменной флуоресценции (А) и внутриклеточного содержания АТФ (Б) у листьев гороха, предварительно выдержанных в темноте в течение часа. Интенсивность света 60 Вт м-^.

ной световой адаптации листа носит, очевидно, автокаталитический характер, возникает вопрос, что является терминальным акцептором электрона в первые моменты освещения адаптированного к темноте листа, поскольку в этих условиях он не способен фиксировать С02- Наиболее вероятным акцептором в этом случае может быть кислород, способный поддерживать псевдоциклический перенос электрона.

Мы пвказали, что при продувании кюветы с листом во время освеще* ния чистыми С02 или азотом, а также их смесями, фотоиндуцированный спад ПФ и ЗФ происходит очень медленно. Напротив, продувание кюветы с листом в процессе освещения чистым кислородом значительно ускоряет световой спад ПФ и увеличивает максимальную амплитуду ЗФ по сравнению с продуванием листа атмосферным воздухом. Это указывает, что псевдоциклический электронный транспорт действительно играет ключе-вуи роль в световой активации транспорта электронов.

Исследование специфического влияния С02 на форму кинетических кривых ПФ и ЗФ у суспензий эвглены, различное время адаптировавшихся к свету, показало, что С02 в форме бикарбоната оказывает специфическое действие на амплитуду наиболее медленного кинетического максимума ПФ и ЗФ, наблюдающегося через I - 1,5 мин после начала освещения. Это, поводимому, составляет тот промежуток времени, в течение которого протекает лаг-фаза в фиксации углекислоты, хотя процессы электронного транспорта в этот период индукционных переходов характеризуются достаточно большой интенсивностью.

Заключение главы.

Полученные в этой главе экспериментальные данные обобщены на рис. 4, показывающем точки действия кратковременной световой регуляции у интактных фотосинтезирующих объектов. Прежде всего необходимо отметить, что в качестве составного звена в кратковремннную световую регуляцию включены "световые" и "темновые" состояния РЦ ФС2 и ФС1. Правомерность этого очевидно, т.к. существование двух кинетических состояний РЦ ФС2 показана нами как для изолированных хлороплас-тов, так и для интактных клеток эвглены, а перенос электрона в диги-тониновых фрагментах ФС1, использованных наш в исследованиях, не отличается от электронного транспорта, наблюдающегося в пределах РЦ ФС1 у нативных объектов (Храброва, 1988).

Кратковременная световая регуляция скорости переноса электрона у интактных фотосинтезирующих объектов опосредована в основном двумя механизмами: ускорением электронного транспорта вследствие интенсификации потребления в цикле Кальвина генерированных в цепи переноса АТФ и НДЦФН, и изменением распределения энергии возбуждения между двумя фотосистемами при фосфорилировании светособиралдего комплекса. Судя по нашим данным, при низких и средних освещенностях основным механизмом кратковременной световой регуляции является первый.

пространство

Рис. 4. Схема кратковременной световой регуляции переноса электрона в хлоропласте. Ниркыми стрелками обозначены участки, подвергающиеся световой регуляции.

ГЛАВА 5. БЫСТРЫЕ ФОТОИНДУШРОВАННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ АТФ, НАД® И ПРОМЕКГГОЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ ЦИКЛА КАЛЬВИНА В ЛИСТЕ

Немонотонные фотоиндуцнрованнне изменения содержания АТФ в листе,

так же как и переходные изменения ПФ, показывают, что световая активация фотосинтетического аппарата является сложным процессом, в котором различаются по длительности определенные этапы. Они обусловлены, повидимому, различной скоростью активации ферментов цикла Кальвина (Buchanan , 1980). В этом случае, большое значение для понимания процессов, происходящих при кратковременной световой регуляции начальных этапов фотосинтеза имеет исследование фотоиндуцированных изменений содержания не только АТФ, но и другого конечного продукта функционирования цепи переноса - НАДФН, а также метаболитов цикла Кальвина, являющихся акцепторами дая этих соединений.

Влияние интенсивности света на быстрые фотоиндуцированные изменения содержания АТФ. НАДФН и метаболитов цикла Кальвина у листьев

ячменя.

После включения белого света интенсивностью 30 Вт м-^ уровень АТФ и НАДФН в листьях ячменя повышается, достигая максимума за 6-8 сек освещения, после чего происходит быстрый частичный спад содержания конечных продуктов функционирования цепи переноса. Через 20-30 сек освещения листа наблюдается слабо выраженный второй кинетический максимум, после чего внутриклеточные уровни АТФ и НАДФН двухфазно снижаются на свету до значений, близких к содержаниям этих соединений у адаптированных к темноте листьев. Таким образом, подобно тому, как было описано в предыдущей главе для АТФ, после начального индукционного скачка внутриклеточного содержания АТФ и НАДФН их уровень спадает на свету до значительно более низкого уровня. Медленный фотоин-дуцированный спад содержания АТФ и НАДФН хорошо совпадает со световым спадом ПФ на свету.

Темновой уровень 3-фосфоглицериновой кислоты (ФГК) в листе весьма высок. После включения света содержание ФГК резко падает и уже через Ю-15 сек снижается на свету в несколько раз. По мере увеличения продолжительности освещения происходит медленное увеличение количества ФГК в листе. Темновой уровень триозофосфатов в листе очень низок, но через 10 сек освещения возрастает по сравнению с темнотой более чем на порядок. После начального всплеска содержание триозофосфатов в течение первой минуты освещения сильно падает, а при дальнейшем увеличении длительности освещения медленно нарастает, причем это нарастание происходит параллельно возрастанию количества ФГК. Уровень фруктозо-1,6-бисфосфата (ФБФ) в листе начинает повышаться сразу же после включения света и достигает максимума через 10 сек освещения, а затем в течение первой минуты освещения постепенно уменьшается. Увеличение в листе количества глюкозо-6-фосфата и фрукто-

зо-6-фосфата начинается после включения света с некоторым запозданием по сравнению с другими метаболитами. Через 10 сек после начета освещения наблюдается лишь незначительный прирост количества этих соединений.

Приведенные выше данные показывают, что в первые моменты освещения акцептором для АТФ и НАДФН, образующихся в цепи переноса электрона, является ФГК, образованная в процессе постиллюминационной фиксации С02« Существование в первые секунды освещения блока в превращении ФБФ в фруктозо-6-фосфат приводит к тому, что в этот момент времени наработанные АТФ и НАДФН не могут интенсивно расходоваться и их количество в листе возрастает. Судя по приведенным результатам, световая активация фруктозобисфосфатазы начинается через 10 сек после включения света, а активация РБФК - через приблизительно I минуту после начала освещения. Постепенная активация этих ферментов приводит к двухфазному спаду внутриклеточного уровня АТФ и НАДФН, а также к аналогичному спаду ПФ.

Увеличение интенсивности света в процессе кратковременной световой адаптации приводит к 4-кратному возрастанию уровня ФБФ в точке начального скачка, наблюдающегося через 10 сек после включения света. Однако, на скорости медленного нарастания уровня ФГК и триозофосфа-тов в листе увеличение интенсивности света от 30 до 140 Вт м-2 сказывается незначительно. В отличие от этого, возрастание интенсивности света значительно ускоряет световой спад ПФ.

Таким образом, в отличие от средних освещенностей, где наблюдается хорошая корреляция между световым спадом ПФ и фотоиндуцированным нарастанием уровней ФГК и триозофосфатов в листе, при высоких интен-сивностях света подобной связи не наблюдается. Это может служить указанием на то, что при высоких интенсивностях света основным механизмом, определяющим световой спад ПФ является т.н. "нефотохимическое" тушение ПФ, связанное с обратимой инактивацией части РЦ ФС2.

Изменения индукционных кривых ПФ, содержания АТФ и НАДФН. а также интермедиатов цикла Кальвина при старении листьев.

У старых, 16-дневных листьев ячменя, по сравнению с молодыми листьями значительно уменьшена амплитуда фотоиндуцированного возрастания внутриклеточного уровня АТФ и НАДФН. Кроме того, у старых листьев значительно ускорен световой спад содержания этих метаболитов и стационарный уровень АТФ и НАДФН достигается не за 5-6 минут, как у молодых, а за 1-1,5 минуты. Аналогичные изменения при старении листьев наблюдаются и в кинетике ПФ. Эти данные подтверждают тесную связь фотоиндуцированных изменений амплитуды ПФ и внутриклеточного содер-

жания АТФ и НАДФН на свету средней интенсивности»

Значительное снижение амплитуды фотоиндуцированного возрастания внутриклеточного содержания отмечено для ФГК, триозофосфатов и, особенно, для ФБФ. При этом для ФГК и триозофосфатов у старых листьев фотоиндуцированное возрастание происходит значительно быстрее, чем у молодых. Следовательно, как и для молодых листьев, у старых листьев ячменя наблвдается четко выраженная корреляция при средних освеше-нностях между медленным световым спадом. ПФ и фотоиндуцированным нарастанием внутриклеточных уровней ФГК и триозофосфатов.

Заключение главы.

В данной главе приведены результаты, позволяющие конкретно представить те биохимические механизмы, которые приводят к немонотонным переходам в процессе кратковременной световой регуляции начальных этапов фотосинтеза. Они показывают, что при низких и средних освещен-ностях световая регуляция переноса электрона тесно связана с процессами световой активации ферментов цикла Кальвина, протекающими для разных ферментов с неодинаковыми скоростями. При высоких освещеннос-тях, однако, такой тесной связи не прослеживается, что показывает сложную природу световой регуляции переноса электрона, которая в зависимости от условий может опосредоваться различными механизмами. Кроме того, результаты данной главы показали на примере исследования разновозрастных листьев ячменя, что процесс световой регуляции начальных этапов фотосинтеза существеным образом зависит от физиологического состояния листьев.

ГЛАВА 6. ДЕЙСТВИЕ НЕКОТОРЫХ СТРЕССОВЫХ ВОЗДЕЙСТВИЙ НА ПЕРЕНОС ЭЛЕКТРОНА В ЛИСТЬЯХ И ХЛОРОПЛАСТАХ

До сих пор мы рассматривали кратковременную световую регуляцию начальных этапов фотосинтеза у норшльных, хорошо сформированных листьев. Очевидно, однако, что стрессовые воздействия, которым растения часто подвергаются в процессе жизнедеятельности, изменяют нормальный перенос электрона. Поэтому, понимание процессов кратковременной световой регуляции будет неполным, если не выяснить, каким образом они преобразуются после действия на растения стрессовых факторов.

Наиболее часто встречающимися стрессорами являются повышенные температуры и обезвоживание. Исходя из этого мы исследовали, каким образом они влияют на перенос электрона у изолированных хлоропластов и интактных листьев. Такое исследование, кроме того, позволило нам выяснить, являются ли повреждения электронтранспортной цепи, сопутствующие стрессогим воздействиям, универсальными или же они зависят от

вида стрессора.

Действие повышенных температур на перенос электрона у листьев

и изолированных хлоропластов

Предварительный прогрев листьев приводит к существенному изменению кинетических кривых ПФ, причем характер изменений зависит от температуры термоинактивации. У листьев, прогретых при температурах от 37° до 43°, после достижения первого кинетического максимума ПФ быстро спадает на свету до низкого стационарного уровня. Повышение температуры предварительной термообработки до 45-47° сопровождается исчезновением светового спада ПФ и кинетика последней становится похожей на кинетику фотоиндуцированных превращений ПФ у хлоропластов с сильно подавленной активностью донорной части ФС2.

Изменения амплитуды и формы кинетических ПФ после термоинактивации при температурах до 48° не связаны с разрушением РЦ ФС2, поскольку после инфильтрации диуроном у таких листьев амплитуда ПФ достигает уровня, близкого к уровню ПФ у контрольных листьев. Таким образом, основной причиной изменений формы кинетической кривой ПФ и ее амплитуды является в случае термоинактивации уменьшение скорости фотовосстановления в сравнении со скоростью оттока электронов к ФС1.

Помимо уменьшения максимальной амплитуды ПФ.при освещении светом очень низкой интенсивности у листьев, подвергнутых тепловой обработке и затем инфильтрированных диуроном, наблюдается существенный рост флуоресценции, достигающий в ряде случаев максимальной амплитуды ПФ у контрольных листьев на действующем свету. Сильное влияние диурона на амплитуду возрастания флуоресценции у листьев, подвергнутых термоинактивации, показывает, что сопутствующее тепловой обработке уменьшение амплитуды ПФ связано с изменениями в электронном транспорте, а не в переносе энергии. Подобный рост флуоресценции на очень слабом свету после прогрева листьев, наблюдается и в отсутствие диурона, хотя в этом случае он значительно ниже по амплитуде. Из этих результатов ясно, что тепловая обработка листьев вызывает смещение равновесия между вторичным и первичным донорами ФС2 в сторону ускорения притока электрона к Р680. Как наш было показано в главе 3, такой эффект наблюдается у интактных фотосинтезирующих объектов при шунтировании внутритилакоидного пространства и более щелочной стромы хлоропласта. Поскольку известно ( Соитшг1а et а1, 1983, 1984), что термоинактивация приводит к нарушениюцелостности тилакоидных мембран, можно заключить, что такие изменения происходят не только в суспензии изолированных: хлоропластов, исследованных в указанных работах, но и в хло-ропластах интактных листьев, подвергнутых прогреванию.

Полученные данные позволяют нам заключить, что изменения переноса электрона у интактных объектов, подвергнутых термоинактивации,на- . блюдаются в различных участках цепи. Наиболее сильно подавляется активность функционирования водоразлагающёго комплекса хлоропластов, в результате чего сильно снижается стационарная скорость переноса электрона к Напротив, скорость оттока электронов от фд к ФС1 затрагивается значительно меньшее, поэтому насыщение фотовосстановления <3А у термоинактивированных листьев значительно затруднено в сравнении с контрольными. Помимо этого, определенный вклад в изменения электронного транспорта вносит и частичное разрушение мембран хлоропласта. Тем не менее, поскольку диурон оказывает сильное действие на перенос электрона, можно заключить, что значительного физического разделения' ФС2 и ФС1 из-за термоиндуцированной везикуляцш мембран при температурах 37°-50° в листьях не происходит.

Действие обезвоживания ка перенос электрона в листьях и изолированных хлотзопластах.

•Потеря воды листьями сопровождается характерными изменениями кинетической кривой ПФ. Наиболее чувствительным участком кинетической кривой является специфически реагирующий на СО2 пик кинетики, наблюдающийся через 1,5-2 мин после начала освещения. Он исчезает при снижении относительно оводненности листа от 82? до 50$, причем в этом случае отмечается очень низкий стационарный уровень ПФ, отражающий малое стационарное восстановление ^д.

По мере снижения содержания воды в листе от 825? до 30% наблюдается линейное снижение амплитуды начального участка светового спада . ПФ, и при оводненности 30$ этот участок кинетической кривой полностью исчезает. Учитывая, что при относительном содержании воды в листе ниже 30$ фотоиндуцированный спад ПФ резко замедляется, можно сделать вывод, что отток электрона от ФС2 к ФСГ при этих условиях сильно подавлен. Наиболее устойчивым по отношению к дегидратации листа компонентом кинетики ПФ является амплитуда начального кинетического максимума. Так, у листьев, относительное содержание воды в которых не превышает 20$, амплитуда этого максимума составляет около 50$ его амплитуды у полностью гядратированных листьев. Таким образом, даже в сильно дегидратированных листьях в части РЦ ФС2 возможен фотоперенос электрона. Характерно то, что по мере дегидратации листьев световое насыщение ПФ не затрудняется, что полностью противоположно действию на ПФ повышенных температур.

Изменения в кинетике ПФ, вызванные обезвоживанием листа могут быть частично обращены последующей его регидратацией, причем степень

обратимости кинетических кривых ПФ, а, следовательно, и фотопереноса электрона, после регидратации зависит от уровня предварительного обезвоживания листа.

Частично необратимое подавление обезвоживанием фотоиндуцирован-ного переноса электрона в ФС2 показано на?ш и для изолированных хло-ропластов, которые после сильного обезвоживания и последующей регид-ратации способны демонстрировать ПФ, амплитуда которой составляет менее половины от амплитуды ПФ исходных органелл. Помимо активности РЦ ФС2 при этом инактивируется к донорная часть ФС2, поскольку добавление к регидратированным органеллам экзогенного донора ФС2, гидрок-силамина, дает заметное ускорение фотоиндуцированного нарастания ПФ.

В отличие от ФС2, сильное обезвоживание не влияет на фотореакции в РЦ ФС1. Амплитуда фотоиндуцированного окисления Р700 не снижается после обезвоживания субхлоропластных фрагментов ФС1, оставляющего в них около 10% воды по весу.

Заключение главы.

Результаты, приведенные здесь, показывают, что характер кратковременной световой регуляции переноса электрона в листьях существенно преобразуется после воздействия на лист стрессовых воздействий. Это связано с изменениями скоростей переноса на различных участках электронтранспортной цепи. Эти изменения не являются универсальными и зависят от вида стрессора, хотя в действии повышенных температур и обезвоживания на начальные стадии фотосинтеза тлеется и много общего. Например, перенос электрона в пределах РЦ фотосистем является в обоих случаях наиболее устойчивой стадией электронного транспорта, а РЦ ФС1 более устойчив в сравнении с РЦ ФС2, в то время как при действии на листья повышенных температур отток электрона от ФС2 сильно ускоряется по сравнению с интенсивностью функционирования водора-злагающего комплекса, а при дегидратации скорость переноса электрона между фотосистемами и фотовосстановления 9д от вода уменьшаются примерно в равной степени.

ГЛАВА 7. ДЛИТЕЛЬНОЕ ДЕЙСТВИЕ СВЕТА РАЗЛИЧНОЙ ИНТЕНСИВНОСТИ И СПЕКТРАЛЬНОГО СОСТАВА НА СВЕТОВУЮ СТАДИЮ ФОТОСИНТЕЗА

Долговременная световая регуляция начальных этапов фотосинтеза является сложным процессом, в котором должны сочетаться энергетическое и регуляторное действие света. Поэтому, на наш взгляд, одной из наиболее важных проблем в исследовании долговременной световой регуляции представляется выяснение вклада самого процесса фотосинтеза в адаптацию фотосинтетического аппарата к свету различной интенсивное-

ти и спектрального состава. К этой проблеме примыкает вопрос о соотношении разных фоторегуляторных реакций и фотосинтеза в световой регуляции количества компонентов фотосинтетического аппарата в листе и скорости переноса электрона в цепи.

В качестве основного подхода к выяснению этих вопросов мы применили исследование свойств листьев проростков ячменя, выращенных на синем или красном свету различной интенсивности.

Влияние различной интенсивности синего и красного света на содержанке хлорофилла. РЦ фотосистем и скорость газообмена СОо.

На рис. 5 представлены зависимости содержания хлорофилла (А), РЦ ФС2 (Б), РЦ <Ю1 (В) и скорости газообмена С02 на световом плато (Г) от плотности светопогока синего света (СС) (кривые I) или красного 'света (КС) (кривые 2) при выращивании проростков ячменя. Снижение освещенности приводит к постепенному уменьшению всех исследованных параметров фотосинтетического аппарата, причем, если при высоких плотностях светопотока количество хлорофилла (Хл), РЦ <К2 и ФС1 выше в листьях варианта СС, то по мере уменьшения освещенности содержание этих компонентов фотосинтетического аппарата становится одинаковым у листьев обоих световых вариантов, а при плотности потока падающих квантов менее I нЭ см-2 с-1 в листьях проростков варианта СС их количество меньше, чем у листьев проростков с КС. В отличие от вышеприведенных экстенсивных показателей фотосинтетического аппарата, скорость газообмена С(>2 на световом плато вне зависимости от интенсивности света при выращивании выше у листьев варианта СС.

Между значениями всех изученных нами показателей фотосинтетического аппарата у листьев проростков ячменя, выращенных при различных интенсивностях СС и КС, существует линейная зависимость типа СП^ сс)1 = к^ (П^ КС)А - Вз ,-где (П^ сс)1 и (П^ кс)1 представляют собой значения ¿-го показателя при 1-й интенсивности СС или КС; к-] и В^ - константы. Для разных показателей нормированные к максимальному значению (П^ сс) уравнения имеют вид:

(Хлсс)1 =1,33 (Хлкс)± - 0,28

(РЦ ФС2СС)1 = 1,24 (РЦ ФС2КС) 1 - 0,13

(РЦ ФС1СС)± =1,30 (РЦ ФС1КС)1 - 0,30

(Фсс)1 = 1,42 (Фкс)± - 0,05

Здесь символом Ф обозначена скорость газообмена СО2 на световом плато.

При рассмотрении этих уравнений обращает на себя внимание, что

? 4

« 4

Рис

Плотность СЕЗТопотояа при выращивании, нЭ-см~^-сек~-'-

. 5. Содержание хлорофилла (А), реакционных центров фотосистем 2 (Б) и I (В) и скорость газообмена С02 на световом плато (Г) у листьев проростков ячменя, выращенных на синем (кривые I) или красном (кривые 2) свету различной плотности потока падающих квантов.

время, мсек

Плотность светопотока при выращивании, нЗ-см~^*сек."*^

Рис. 6. Зависимость времени между двумя последовательными срабатываниями реакционного центра фотосистемы 2 от плотности светопотока синего (кривая I) или красного (кривая 2) света при выращивании растений для переноса электрона, сопряженного с восстановлением С0?, на насыщающем свету.

величины коэффициентов к^ , отражающих относительную эффективность СС и КС в увеличении соответствующих фотосинтетических показателей, очень близки для всех исследованных наш параметров. Значения к несколько превышают единицу, что указывает на более высокую эффективность СС в световом контроле содержания Хл, РЦ ФС2 и ФС1, а также скорости газообмена С02> но свидетельствует, также, и о том, что как СС, так и КС весьма эффективны в этом процессе. Последнее указывает, что пигменты-сенсибилизаторы реакций, обеспечивающих световой контроль указанных параметров в диапазоне плотностей светопотока 0,03-17 нЭ см-2 с-1, имеют порфириновую природу. Поскольку световая зависимость достигает максимума при высоких интенсивностях света, очевидно, что процесс, обеспечивающий световой контроль содержания Хл, РД фотосистем и скорости газообмена СО2 на оветовом плато, является фотосинтезом.

Этот вывод подтверждается частичной аддитивностью действия СС и КС на содержание Хл и скорость газообмена С0о, наблюдающейся для

—9 Т

плотностей, светопотока от 0,5 до 17 нЭ см * с .

Существование в приведенных выше уравнениях постоянных В^ показывает, что существует участок интенсивностей света, где КС значительно эффективнее СС в световом контроле содержания Хл, РЦ фотосистем и скорости газообмена С02^ Насыщение этой фотореакции достигается при выращивании растений при крайне низких интенсивностях света (менее 0,03 нЭ см-2 с-1). Исходя из этих особенностей можно заключить, что пигментом-сенсибилизатором этой фотореакции является, несомненно, фитохром. Необходимо отметить, что участие фитохрома в световом контроле отмеченных параметров фотосинтетического аппарата наблюдается не только при очень низких интенсивностях света, но и при более высоких освещенностях, о чем свидетельствует наличие "перехлеста" кривых I и 2 на рис. 5 в области светопотока около I нЭ см-2 с-1.

Относительный вклад реакций, сенсибилизируемых фитохромом, в световой контроль различен для отдельных показателей фотосинтетического аппарата и наиболее высок для содержания Хл и РЦ ФС1, менее выражен для РЦ ФС2, а для скорости газообмена С02 на световом плато участие фитохрома в ее световом контроле минимально.

В целом, рассматривая реакцию содержания Хл, РЦ ФС2 и ФС1 у листьев проростков ячменя на вариации интенсивности и спектрального состава света, можно заключить, что большее влияние на эти показатели фотосинтетического аппарата оказывает интенсивность света, тогда как его спектральный состав обладает относительно малой спецификой

в действии на содержание компонентов фотосинтетического аппарата в листе.

Влияние различных интенсивностей синего и красного света на соотношение компонентов световой стадии Фотосинтеза и скорость сбо-тосинтетического переноса электрона.

Размер фотосинтетической единицы ФС2 (ФСЕ ФС2 - число молекул

хлорофилла, приходящееся на один РЦ) постепенно возрастает от 600

до 750 молекул при уменьшении плотности потока падающих квантов при

вырашизании проростков ячменя от 17 до I нЭ сг.Г2 с-*, слабо реагируя

на спектральный состав света. При уменьшении плотности светопотока

ниже I нЭ см * с наблюдается резкое возрастание размера ФСЕ ФС2,

особенно заметное для КС. При наиболее низкой плотности светопотока,

—о т

достигнутой в эксперименте (0,03 нЭ см "" с-1), величина ФСЕ ФС2 у листьев варианта СС составляла в среднее 870, а у листьев проростков, выращешшх на КС - 1100 молекул.

Для ФСЕ ФС1 практически не отмечено варьирования ее размера в зависи. ости от интенсивности или спектрального состава света при выращивании проростков ячменя.

Таким образом, соотношение между отдельными компонентами, принимающими участие в начальных этапах фотосинтеза, при выращивании растений на свету разной интенсивности и спектрального состава может варьировать. Однако, эти вариации имеют вполне закономерный характер. Нами были выявлены универсальные соотношения между Хл и РЦ обеих фотосистем в листе ячменя, которые не зависят от того, как™ способом достигается варьирование в листе количества этих компонентов фотосинтетического аппарата.

Между содержанием Хл и РЦ ФС1 в листе ячменя существует прямая пропорциональность, так что при увеличении количества хлорофилла в листе на 590-600 молекул в нем появляется один РЦ SCI. Несколько иная картина отмечена для соотношения в листе Хл и РЦ ФС2, где при малых абсолютных количествах сравниваемых компонентов увеличение содержания Хл более выражено в сравнении с РЦ ФС2. При более высоком содержании Хл, возрастание его количества линейно связано с увеличением содержания РЦ ФС2. Нами показано, что для нормально сформированных листьев проростков ячменя между количествами РЦ ФС1 и РЦ ФС2 наблюдается линейная зависимость, соответствующая выражению (РЦ ФС2)х =1,6(РЦ ФС1)х -1,1 Ю15. где (РЦ ФС2)1 и (РЦ ФС1)х - количество РЦ обеих фотосистем, приходящееся на квадратный дециметр листа проростков, выращенных при i-м светопотоке. Отсюда видно, что соотношение в листе РЦ двух фотосистем непостоянно, что противоречит предположению о коне-

тантности этого показателя (miitmarsh, Ort, IS84) и величина этого отношения зависит от абсолютного содержания РЦ фотосистем в листе.

Скорость переноса электрона в изолированных хлоропластах, выделенных из проростков ячменя, выращенных при различных интенсивностях СС и КС, варьирует, оставаясь, однако, при любом значении плотности потока падающих квантов выше у варианта СС. Снижение светопотока при выращивании уменьшает активность электронного транспорта таким образом, что отношение активности в хлоропластах из листьев с СС и КС остается постоянным. Учитывая представления, приведенные в предыдущем разделе работы, можно заключить, что такая пропорциональность в изменении скорости электронного транспорта на синем и красном свету указывает на малый вклад фитохрома в световой контроль скорости переноса электрона.

Аналогичные данные получены для скорости нециклического электронного транспорта, сопряженного с фиксацией С02« Как показано на рис. 6, синий свет уже при низких освещенностях ускоряет сопряженный с поглощением углекислоты электронный транспорт, по сравнению с листьями варианта КС. Повышение освещенности при выращивании растений сопровождается увеличением скорости электронного переноса как на СС, так и на КС.

Одна из причин ускорения электронного транспорта у листьев варианта СС - это повышение у них степени ненасыщенности жирных кислот л1шидов мембран тилакоида, а также отношения МГДГ:ЕГДГ. Такие изменения тилакоидных мембран способствуют возрастанию скорости нециклического переноса электрона ( Oquist, 1982, 1983). Найденные изменения в липидном составе тилакоидных мембран в зависимости от спектрального состава света, функционально значимы, поскольку, как показали измерения температурной зависимости .скорости фотовосстановления феррици-анида, превосходство хлоропластов варианта СС при пониженных температурах в скорости переноса электрона значительно выше, чем при комнатной температуре.

■ Таким образом, выращивание проростков на СС и КС различной интенсивности сопровождается заметными изменениями в соотношении различных компонентов световой стадии фотосинтеза, а также скорости перекоса электрона. В последнем случае отмечено специфическое действие синего света, который активирует перенос электрона в ЗС2 и ФС1 уже при низких интенсивносгях.

Фушащонирование световой стадии фотосинтеза пои развитии и

старении листа на синем и красном свету.

Хорошо известно, что вырастание растений на СС замедляет стара-

кие фотосинтетического аппарата, что проявляется в более продолжительном сушествовании у листьев высокой скорости газообмена СО2 (Воскресенская, 1979). Ш показали, что специфическое замедление синил светом утери функциональной активности характерно также и для электронного транспорта. Помимо этого наш обнаружено, что при выращивании на СС ускоряется процесс развития функционально активного фотосинтетического аппарата.

Исследование содержания Хл, РЦ ФС1 и ФС2 в разных сегментах листовой пластинки первого листа ячменя показало, что СС активирует накопление вышеуказанных компонентов фотосинтетического аппарата во всех участках листа. По мере приближения сегмента к верхушке количество Хл, РЦ ФС2 и ФС1 возрастает. Размер ФСЕ ФИ не зависит от положения сегмента в листввой пластинке. Напротив, размер 5СЕ ФС2 уменьшается по мере приближения анализируемого сегмента к верхушке листовой пластинки.

Кинетическая кривая фотоиндуцированного нарастания ПФ после включения действующего света у нижних сегментов листьев варианта КС практически монотонна и приобретает сигмоидность только по мере приближения анализируемого сегмента к верхушке листа. У листьев проростков варианта СС кинетика быстрых переходов ПФ характеризуется сигмо-идностью во всех сегментах листа. Поскольку сигмоидность в нарастании ПФ обусловлена реокислением очевидно, что по мере возрастания степени сформированное™ фотосинтетического аппарата увеличивается скорость переноса электрона между фотосистемами и процесс этот идет активнее на синем свету.

По мере старения листа сигмоидность в кинетике быстрых фотоинду-цироваяных переходов ПФ постепенно исчезает, что особенно выражено на КС: у 14-дневных листьев ячменя нарастание ПФ происходит монотонно у варианта КС, тогда как у листьев проростков с СС кинетики ПФ имеет хорошо выраженную сигмоидаую форму. Следовательно, потеря функциональной активности переноса электрона при старении листьев на СС происходит значительно медленнее, чем на красном.

Итак, наш показано специфическое действие синего света при выращивании растений на онтогенез световой стадии фотосинтеза: по сравнению с КС синие лучи ускоряют развитие функционально активной цепи переноса электрона и замедляют процесс снижения активности переноса электрона при старении листа.

Заключение главы.

Резюмируя данные, полученные при исследовании долговременной

световой регуляции начальных этапов фотосинтеза, можно заключить, что по крайней мере три пигмента принимают участие в этом процессе: фитохром, пигмент, специфически поглощающий свет синей области спектра (криптохром) и хлорофилл. При этом вклад действия различных пигментов в световой контроль отдельных показателей фотосинтеза неодинаков. Гипотетическая схема взаимодействия отдельных пигментов в долговременной световой регуляции начальных этапов фотосинтеза приведена на рис. 7.

слабый красный или синий свет

Рис. 7. Схема взаимодействия различных фоторецепторов в долговременной световой регуляции световой стадии фотосинтеза

На этой схеме показано, что фитохром не влияет непосредственно на изменения скорости переноса электрона в хлоропластах и участвует в световом контроле количества компонентов фотосинтетического аппарата. Ускорение переноса электрона наблюдается при действии специфического рецептора синего света. Кроме того, очевидно, что ускорение фотосинтетического переноса электрона является автокаталитическим процессом, т.е. наблюдается при интенсификации самого процесса фотосинтеза. Ускоренный электронный транспорт у листьев, подвергающихся освещению сильным светом шзывает увеличение синтеза ассимилятов, часть из которых тратится на синтез новых компонентов фотосинтетического аппарата. Таким образом, при долговременной световой регуляции начальных этапов фотосинтеза действие трех вышеуказанных пигментов является кооперированным.

ГЛАВА 8. ОБЩЕЕ ЗАКЛШЕНИЕ

Полученные нами результаты показали всеобъемлющий характер световой регуляции начальных этапов фотосинтеза - ей подконтрольны различные уровни структурно-функциональной организации электронтранспорт-ной цепи. При этом, одни и те же участки цепи подвергаются как крат-

¡современной, так и долговременной световой регуляции.

Наиболее простой вид имеет световая регуляция переноса электрона на уровне РЦ обеих фотосистем. В этом случае при кратковременном освещении уменьшается вероятность обратного переноса электрона от акцепторов к окисленным первичным донорам. Эксперименты не выявили наличия отчетливо выраженных обратных связей в этом процессе. Тем не менее, кратковременная световая регуляция переноса электрона имеет важное физиологическое значение, поскольку при этом повышается квантовый выход первичного фотоакта в РЦ и, следовательно, всего процесса фотосинтеза.

Кратковременная световая регуляция переноса электрона в интактных фотосинтезирующих организмах характеризуется сочетанием положительных и отрицательных обратных связей. Так, положительная обратная связь обусловлена ускорением электронного транспорта при световой активации ферментов цикла Кальвина и сопряженным с этим возрастанием потребления АТФ и НАДФН. Возникающий при освещении хлоропластов градиент протонов на мембране действует на перенос электрона неоднозначно: он ускоряет перенос электрона между вторичным и первичным донорами ФС2 и замедляет перенос электрона мезаду фотосистемами. Кроме того, при высоких освещенностях с формированием протонного градиента связано обратимое шактивирование части РЦ ФС2.

Долговременная световая регуляция количества компонентов фотосинтетического аппарата характеризуется хорошо выраженной обратной связью по отношению к интенсивности света при выращивании, обусловленной кооперированным действием по меньшей мере трех фоторецепторных систем.

Несмотря на различия в физических механизмах, опосредующих кратковременную и длительную световую регуляцию начальных этапов фотосинтеза, отчетливо прослеживается общность конечного результата двух типов световой регуляции потока электронов на уровне листа, такая общность характеризуется рядом свойств:

1. Как при долговременной, так и при кратковременной световой регуляции им подвергаются все основные участки цепи переноса электрона.

2. Для кратковременной и долговременной световой регуляции обнаруживается общая направленность в действии на поток электрона. При • лалых и средних штенсивностях света как в кратковременных, так и

з длительных экспозициях повышение освещенности стимулирует электро-шый поток, а при высоких освещенностях - ингибирует его.

3. Относительно слабое освещение листа обеспечивает активацию предсозданного фотосинтетического аппарата или формирование последнего в листе таким образом, что фотосинтетический аппарат становится способным эффективно преобразовывать значительно более высокие

по интенсивности световые потоки чем те, к которым лист адаптировался в течение короткого или длительного промежутка времени.

4. Изучение кратковременной и длительной световой регуляции переноса электрона в хлоропластах листа показало их глубокую внутреннюю взаимосвязь: характер кратковременной световой регуляции переноса электрона существенно зависит от интенсивности и спектрального состава света, при которых сформировался лист; в свою очередь интенсивность потока электронов во многом определяет конечный результат формирования фотосинтетического аппарата при длительной световой регуляции.

5. Два типа световой регуляции начальных этапов фотосинтеза тлеют во многом авторегуляторшй характер - кратковременная световая регуляция и, во многом, длительная световая регуляция электронтранс-портной цепи опосредованы протеканием фотосинтетических процессов.

Таким образом, показано, что световая регуляция электронного транспорта представляет собой комплексный процесс, включающий целый ряд физико-химических механизмов кратковременной и длительной световой регуляции. Наличие многообразных способов адаптации электронного транспорта к различиям в световом режиме, позволяет рассматривать световую регуляцию начальных этапов фотосинтеза в качестве равноправной составляющей световой регуляции интегрального процесса фотосинтеза.

. вывода

Для выяснения принципов световой регуляции начальных этапов фотосинтеза проведено систематическое исследование изменений активности фотосинтетического аппарата при кратковременных изменениях условий освещения и реакции фотосинтетического аппарата на различия в интенсивности и спектральном составе света при выращивании растений.

I. Показано существование двух кинетических состояний реакционных центров фотосистем I и 2 - "светового" и "темнового", различающихся скоростью обратного переноса электрона от восстановленных акцепторов к фотоокисленным Р680 или Р700. Низкотемпературные измерения показали отсутствие в этих условиях реверсии реакционных центров из "светового" состояния в "темновоз" после прекращения освещения объектов. Таким образом, отдельные элементы световой регуляции переноса элект-

рока наблюдаются уже на уровне реакционных центров фотосистем высших растений.

2. Установлено, что скорость переноса электрона от вторичного донора электрона фотосистемы 2 к Р680+ и обратной реакции на этом участке переноса электрона регулируется величиной рН внутритилакоид-ного пространства. Поскольку фотоиндуцированный перенос электрона в хлоропласте тесно связан с изменениями рН внутри тилакоида, этот механизм необходимо рассматривать в качестве важной составной части кратковременной световой регуляции электронного транспорта у интакт-ных фотосинтезирующих организмов.

3. Основным механизмом кратковременной световой регуляцшг электронного транспорта у интактных фотосинтезирующих организмов при низких и средних освещенностях является увеличение скорости потребления в цикла Кальвина энергетических и восстановительных эквивалентов, синтезированных при работе электронтранспортной цепи. Обратимое фос-форилирование светособирающего коршлекса хлоропластов вносит определенный, хотя и относительно невысокий вклад в кратковременную световую регуляцию скорости электронного потока в хлоропластах интактных листьев. При низких и средних освещенностях наблюдается корреляция

в индукционных кривых переменной флуоресценции и фотоиндуцированных переходах ряда метаболитов цикла Кальвина. Подобной корреляции не отмечено при высоких интенсивностях освещения.

4. Установлено, что в начальные моменты освещения световая активация электронного транспорта у адаптированных к темноте интактных фотосинтетических объектов опосредована протеканием псевдоциклического переноса электрона. Специфическое влияние С02 па электронный транспорт отмечается лишь после 1-2 минут после начала освещения таких объектов.

5. Характер кратковременной световой регуляции начальных этапов фотосинтеза существенно изменяется после воздействия на лист стрессовых факторов, таких как повышенные температуры или обезвоживание. Эти изменения не являются универсальными и зависят от вида стрессового воздействия. При действии на лист повышенных температур в фотосинтетическом аппарате в первую очередь повреждаются донорная часть фотосистемы 2 и мембраны тилакоида. Обезвоживание вызывает прежде всего ингибирование ферментативных реакций цикла Кальвина и переноса электрона между фотосистемами. Анализ изменений кинетических кривых переменной флуоресценции листьев как результата последействия повышенных температур или обезвоживания позволил сделать швод о перспективности их применения в качестве диагностических методов, позволяющих не

только констатировать факт повреждения фотосинтетического аппарата, но и локализовать его место.

6. Исследования долговременной световой регуляции начальных этапов фотосинтеза показали различное отношение экстенсивного (содержание хлорофилла и реакционных центров фотосистем) и интенсивного (скорость переноса электрона) параметров фотосинтетического аппарата к спектральному составу света и плотности светопотока при выращивании. Содержание в листе хлорофилла и реакционных центров фотосистем 2 и-1 сильно зависит от освещенности при относительно малой специфике действия на него спних или красных лучей. Результаты показывают вовлечение порфириновых пигментов и фитохрома в световую регуляцию экстенсивного параметра фотосинтеза.

7. Определяющее влияние на скорость переноса электрона в хлоропласте оказывает спектральный состав света при выращивании, а не его интенсивность. Синий свет активирует перенос электрона при любых ин-тенсивностях, используемых при выращивании растений. В отличие от экстенсивных показателей фотосинтеза не показано вовлечения фитохрогла

в долговременную световую регуляцию скорости электронного транспорта. Поскольку ласштаб изменений в содержали! компонентов световой стадии фотосинтеза в листе при изменении световых условий выращивания значительно больше, чем изменения максимальной скорости переноса электрона, сделан вывод о тем, что именно изменение числа компонентов фотосинтетического аппарата является основной стратегией приспособления последнего к изменяющимся условиям светового режима при выращивании растений. Полученные результаты показывают, что долговременная световая регуляция начальных этапов фотосинтеза представляет собой сложный процесс, Еключающий как авторегуляторные механизмы, связанные с различиями в протекании процесса фотосинтеза, так и другие фоторегулято-рные реакции.

8. На примере листа ячменя выявлена внутренняя связь между изменениями в листе общего содержания хлорофилла и количества реакционных центров обеих фотосистем. Эта связь носят универсальный характер и

не зависит от того, какие факторы приводят к вариациям в содержании этих компонентов. Изменешш в содержании реакционных центров фотосистемы I пропорциональны изменениям в суммарном количестве хлорофилла в листе. Для реакционных центров фотосистемы 2 подобной пропорциональности не наблюдается. Показано, что отношение реакционных центров фотосистем 2 и I не является постоянным и зависит от их абсолютного содержания в листе.

9. На основании полученккх данных сформулировано представление

о том, что протекание начальных этапов фотосинтеза подвергается световой регуляции как при кратковременном, так и при длительном действии света. Эта регуляция опосредуется целым рядом механизмов, связанных в основном с самим фотосинтетическим аппаратом. В то же время при долговременней световой регуляции начальных этапов фотосинтеза выявлены и нефотосинтетические составляющие этого процесса. Сформулирована концепция общности на уровне листа конечных результатов кратковременной и долговременной световой регуляции переноса электро-

■ на, которая наблюдается несмотря на различия в физико-химической природе механизмов, опосредующих два типа световой регуляции.

Основные публикации по теме диссертационной работы

1. Г/'.Г.Рахимбердиева, Н.Г.Бухов, Н.З.Карапетян. Характеристика фотосистемы I из тилакоидов гран и межгранных ламелл хлоропластов. Биохимия, 1977, т.42, вып. 10, стр. I864-I87I.

2. Н.В.Каралетян, М.Г.Рахимбердиева, Н.Г.Бухов. Природа изменений

■ выхода флуоресценции Фрагментов хлоропластов, обогащенных П700. Биохимия, 1978, т.43, вып. 7, стр. I3I9-I327.

3. Н.Г.Бухов, Н.В.Карапетян. Исследование акцепторной части фотосистемы I по температуркой зависимости фотопревращений Р700. Молекулярная биология, 1978, т.12, вып. 4, стр., 868-878.

4. Н.В.Каралетян, Н.Г.Бухов. Влияние дегидратации на функционирование Фотосистем высших растений. .

Молекулярная биология, 1979, т. 13, вып. 4, стр. 947-954.

5.' Н.Г.Бухов, Н.В.Карапетян. Независимость от температуры скорости быстрой фаза темнового восстановления Р700.

Биофизика, 1979, т.24, вып. 5, стр. 806-8IC.

6. Н.Г.Бухов, Н.В.Карапетян. Фотоиндуцированные изменения поглощения при 800 нм, связанные с функционированием фотосистемы I. Биохимия, 1979, т.44, вып. 4, стр. 705-710.

7. N.V.Karapetyan, M.G.Rakhimberdieva, N.G.Bukhov, I.Gurjan. Characterization of photosystems of Chlamydomonas reinhardi mutante differing in their fluorescence yield. Photosynthetica, 1980, V.14, H 1,

8. О.Д.Бекасова, Н.Г.Бухов, Н.В.Карапетян. Темновые и фо?оиндуцирова-нные изменения поглощения и флуоресценции фикобилисом в присутствии дитионита.

Биохимия, 1981, т. 4S, вып. 2, стр. 287-295.

9. Н.И.Захарова, В.В.Щубин, Н.Г.Бухов, Н.В.Карапетян. Влияние вторичной структуры на скорость темнового восстановления П700+ аскорбатом-. кошлекса Фотосистемы I.

Биофизика,"1982, т.27, вып. 4, стр. 572-577.

Ю.N.G.Bukhov, N.P.Voskresenskaya. The induetion curves о f fluorescence and delayed fluorescence in harley leaves of different agee, grown under blue and red light. "Plant metabolisa regulation", Sofia,

11.Н.Г.Бухов, Н.В.Карапетян, Н.П.Воскресенская. Различия в индукции флуоресценции листьев ячменя, выращенного на синем или красном свету. Физиология растений, 1983, т. 30, вып. 5, стр. 938-943.

12. Н.Г.Бухов, А.Г.Четвериков, А.Д.Рожковский, Н.П.Воскресенская. Зависимость величины фотосинтетических единиц фотосистем I и II у

проростков ячменя от интенсивности и спектрального состава света. Биофизика, 1984, т.29, вып. 2, стр. 289-293.

13. Н.Г.Бухов, А.Д.Рожкозский, А.Г.Четвериков, Н.П.Воскресенская. Содержание пигментов, реакционных центиов фотосистем и потенциальный фотосинтез у птюгюстков ячменя, выращенных~на синем или ктасном свету различной интенсивности.

Физиология растений, 1984, т. 31, вып. 5, стр. 875-881.

14. С.В.Мануильская, А.И.Михно, Н.Г.Бухов, Л.К.Остоовская, Н.П.Воскресенская. Перестройки липпдных компонентов мембран хлотэопластов гороха при длительном воздействии красного и синего света".

Доклады АН СССР, 1985, т. 281, Л I, стр. 246-249.

15. Н.П.Воскресенская, А.В.Кумаков, Н.Г.Бухов, И.С.Дроздова. Совместное действие красного и синего света на показатели фотосинтетической активности листа ячменя.

Физиология растений, 1985, т.32, вып. 4, стр. 643-650.

16. Кутков A.B., Вухов Н.Г., Воскпесенская Н.П. Особенности газообмена С0? листьев ячменя, выращенного птш различных интенсивностях синего и красного света.

Физиология и биохимия культурных растений, 1984, т. 16, вил. 5, стр. 534-538.

17. А.Д.Ронковский, Н.Г.Бухов, Н.П.Воскресенская. Индукционные переходы флуоресценции в процессе развития и старения листьев ячменя пш длительном действии синего или красного света.

Физиология растений, 1985, т. 32, вып. 6, стр. 1046-1054.

18. Н.Г.Бухов, Н.П.Воскресенская. Свойства Фотосинтетического аппарата проростков ячменя, выращенных на синем и красном свету очень низкой интенсивности.

Физиология растений, 1986, т.33, вып. 4, стр. 692-698.

19. А.Д.Рокковский, Н.Г.Бухов, Н.П.Воскресенская. 0 соотношении реакционных центров фотосистем и хлорофилла у листьев ячменя.

Доклады АН СССР, 1936, т.289, fö 3. стр. 765-768.

20. Н.Г.Бухов, А.Д.Рсжковский, А.Г.Четвериков, Н.П.Воскресенская. Ра- змер фотосинтетических единиц и соотношение реакционных центров фотосистем I и 2 у листьев ячменя, выращенного на красном и синем сЕёту. Биофизика, 1986, т.31, вып. I, стр. 99-104.

21. Н.В.Карапетян, Н.Г.Бухов. Переменная флуоресценция хлорофилла как показатель Физиологического состояния растений. Физиология растений, 1986, т. 33, вып. 5, стр. I0I3-I026.

22. Т.Г.Ддибладзе, Н.Г.Бухов, Н.В.Карапетян. Зависимость замедленной флуоресценции хлорофилла у клеток водорослей от присутствия С0? и 0? в среде. * с с Биофизика, 1986, т.31, вып. 6, стр. 976-979.

23. Н.Г.Бухов, Т.Г.Джибладзе, Н.В.Карапетян. Влияние последействия высоких температур на кинетические кривые переменной и замедленной тауоресценцши

Физиология растений, 1987, т.34, вып. 3, стр. 435-445.

24. Н.Г.Бухов. Интенсивность и спектральный состав света: влияние на начальные стадии Фотосинтеза.

Физиология растений, 1987, т.34, вып. 4, стр. 748-757.

25. Н.В.Карапетян, Т.Г.Дкибладзег Н.Г.Бухов. Зависимость кинетических кривых переменной и замедленной флуоресценции листьев растений и клеток водорослей от состава газовой среды.

Физиология растений, 1987, т. 34, вып. 6, стр. 1079-1089.

26. Н.Г.Бухов. Применение измерений кинетики фотоиндуцированных изменений флуоресценции хлорофилла в физиологии растений. "Спектроскопические методы исследования в физиологии и биохимии",

Ленинград, 1987, стр. 29-33.

27. N.G.Bukhov, N.V.Karapetyan. Changes in kinetics of variable fluorescence and delayed light emission as an indicator of thermostability of photosynthetic apparatus.

Proc.Indian natn.Sei.Acad., 1987, V. B53, И 5-6, p. 373-378.

28. С.М.Кочубей, В.И.Ляшенко, Н.Г.Еухов, Н.П.Воскресенская. Влияние света различного спектрального состава на организацию пигментного аппарата хлоропластов.

Известия АН СССР, 1987, № 6, стр. 902-911.

29. Х.Г.Дамиров, Н.Г.Еухов, Г.Ю.Ризниченко. Идентификация параметров Фотосистемы 2 зеленых растений.

Материалы II Всесоюзной конференции "Математические и вычислительные методы в биологии. Биомолекулярные системы", Пущино, 1987, стр. 136-138.

30. Т.Г.Ддибладзе, Н.Г.Еухов, Н.В.Карапетян. Связь кинетических параметров переменной флуоресценции и замедленной люминесценции (децисекундного компонента) у листьев растений.

Биофизика, 1988, т. 33, вып. I, стр. I2I-I25.

31. Н.Г.Еухов, О.П.Орлов, С.С.Чаянова, З.В.Титова, А.Д.Володарский. Изменения внутриклеточного уровня АТФ при освещении адаптированных к темноте клеток эвглены с различной сботосинтетической активностью. Доклады АН СССР, 1988, Т."12*98, И 3, стр. 761-764.

32. Н.Г.Еухов, Х.Г.Дамиров, Т.Г.Джибладзе, Г.Ю.Ризниченко, Н.В.Карапетян, А.Б.Рубин. Кинетический анализ индукционных переходов переменной и замедленной флуоресценции в присутствии диурона и кар-бонилцианидхлорФенилгидразона.

Биологические науки, 1988, вып. 4, стр. 28-37.

33. Н.Г.Еухов, Н.В.Карапетян. Кинетика фотопревращений П700 в суб-хлоропластных Фрагментах фотосистемы I, заморожннных до -170°. Биофизика, 1988, т. 33, вып. 6, стр. 990-995.

34. Т.Г.Джибладзе, М.Г.Рахимбердиева, Н.Г.Еухов, Карапетян. Измерение переменной и замедленной флуоресценции фотосинтезируюших организмов в условиях контроля температуры и состава газовой среды. Прикладная биохимия и микробиология, 1988, т. 24, вып. 4, стр. 520528.

35. N.V.Karapetyan, N.G.Bukhov. Processes responsible for slow transients of variable fluorescence of leaves.

Abstracts of V EBEC (Aberstvvith, England), 1988, p. 166.

36. Н.Г.Еухов, Н.П.Воскресенская. Влияние на содержание хлоройил-ла, реакционных центров фотосистемы 2 и скорость поглощения CCU разных интенсивностеи синего и красного света. ^ "Факторы среды и организация первичного процесса фотосинтеза", Киев, 1989, стр. 72-78.

37. Н.Г.Еухов, М.Г.Рахимбердиева, Н.В.Карапетян. Темновая релаксация переменной флуоресценции у листьев гороха.

Физиология растений, 1989, т. 36, вып. 4, стр. 675-685.

38. Н.Г.Еухов, М.Г.Рахимбердиева, Н.В.Карапетян. О природе медленных переходных явлений переменной и замедленной флуоресценции листьев.

Физиология растений, 1989, т. 36, вып. 6, стр. 1045-1054.

39. N.G.Bukhov, S.C.Sabat, Prasannä Mohanty. Sequential Iobs of photosynthetic functions during leaf desiccation as monitored by chlorophyll fluorescence transients.

Plant Cell Physiology, 1989, V. 30, N 3, p. 393-398.

40. N.V.Karapetyan, N.G.Bukhov, M.G.Rakhimberdieva. Dark relaxation of variable fluorescence of green leaves measured Ъу means of double beam fluororaeter.

Abstracts of VIII International Photosynthetic Congress (Stockholm,Sweden), 1989, p. 620.

41. N.G.Bukhov, M.G.Rakhimberdieva, N.V.Karaperyan. Alterations

of light saturating curve of variable fluorescence under illumination of dark-adapted leaves.

Abstracts of VIII International Photosynthetic Congress (Stockholm,Sweden), 1989, p. 181.

42. N.G.Bukhov, S.C.Sabat, Prasarma Mohanty. Analysis-of chloro-» phyll a fluorescence changes in weak light in heat treated Amaranthus chloroplasts.

Photosynthesis Research, 1990, V. 23, p. 81-87.

43. S.D.S.Murthy, N.G.Bukhov, Prasanna Mohanty. Mercuiy-induced alterations of chlorophyll a fluorescence kinetics in cyano-bacteria.

Journal of Photochemistry and Photobiology, 1990, V. 6, p. 373-380.

44. N.G.Bukhov. Photoinduced transients of chlorophyll fluorescence and intracellular ATP and NADPH contents during ontogenesis of primary barley leaves.

Abstracts of Soviet-Indian simposium on regulation of.photosynthesis, (Pushchino), 1990, p. 8.

45. N.V.Karapetyan, N.G.Bukhov, M.G.Rakhimberdieva. Dark relaxation of variable fluorescence of green leaves measured by means of double beam fluorimeter.

Current research in Photosynthesis (M. Baltscheffsky ad.), 1990, Kluwer Acad. Publ., Dordrecht/Boaton/London, V. 1, p. 559-562.

46. Н.Г.Еухов. Изменения фотосинтетического электронного транспорта под действием высоких температур или обезвоживания. Тезисы 2-го съезда Всесоюзного общества физиологов растений, Минск, 1990, стр. 18.

47. Н.Г.Бухов, И.С.Дроздова, В.В.Бондар, О.П.Орлов. Взаимосвязь световой и темновой стадий фотосинтеза в онтогенезе листьев ячменя.

Доклады АН СССР, 1991 (в печати).

1489-Jo

Информация о работе

Бухов, Николай Георгиевич
доктора биологических наук
Москва, 1990
ВАК 03.00.12

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Световая регуляция начальных этапов фотосинтеза ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Световая регуляция начальных этапов фотосинтеза"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Световая регуляция начальных этапов фотосинтеза
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений