Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фотодеструкция пигментов в клетках цианобактерий Awabaena variabilis и Synechococcus elongatus

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лехимена, Люсианна, Москва

:У ......' .........-

/

МОСКОВСКИЙ'ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи УДК 582.232.5:577.344:577.355

ЛЕХИМЕНА Люсианна

ФОТОДЕСТРУКЦИЯ ПИГМЕНТОВ В КЛЕТКАХ ЦИАНОБАКТЕРИЙ ANABAENA VARIABILIS И SYNECHOCOCCUS ELONGATUS

специальность: 03.00.12 - физиология растений

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор М.Н. Мерзляк

Москва -1999

СОДЕРЖАНИЕ.

Список

сокращений.......................................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................6

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................9

1.1. Структурно-функциональная организация ФСА...........................9

1.2. Адаптация первичных реакций фотосинтеза к условиям освещения и фотоингибированию..............................................11

1.3. Деградация Хл.............................................................................14

1.4. Номенклатура и химические характеристики Хл......................15

1.4.1. Химическая структура нативныхХл........................................15

1.4.2. Спектры поглощения Хл...........................................................16

1.4.3. Химические свойства Хл.........................................................17

1.5. Метаболизм Хл а........................................................................18

1.5.1. Реакция типа 1.........................................................................20

1.5.2. Реакция типа 2.........................................................................21

1.5.2.1. Фотохимическая деградация..............................................21

1.5.2.2. Нефотохимическая деградация с участием кислорода......22

1.5.2.3. Ферментативная деградация Хл.........................................24

1.5.3. Продукты фотоокисления Хл а..............................................25

1.6. Фотоокислительные процессы: фотодеструкция пигментов и липидов.......................................................................................25

1.7. Механизм защиты растений и водорослей от фотодеструктивных реакций.......................................................................................30

1.7.1. Каротиноиды.............................................................................31

1.7.2. Другие тушители синглетного кислорода и антиоксиданты.....35

1.7.3. Ферменты...................................................................................39

1.8. Условия, вызывающие деградацию пигментов...........................40

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..............................................................45

2.1. Объекты исследования.................................................................45

2.2 Выделение и экстракция пигментов.............................................45

2.3. Выделение мембран и фикобилинов из клеток цианобактерий A. variabilis............................................................46

2.4. Выделение мембран, фикобилинов и частиц,

обогащенных ФС-I и ФС-II, из клеток S. elongatus.......................47

2.5. Условия облучения........................................................................49

2.6. Спектральные измерения...............................................................50

2.7. Определение содержания пигментов............................................50

2.8. Корректировка спектров поглощения на рассеяние и получение спектров рассеяния мембран и клеток...........................51

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ..................................................................................53

3.1 Фотоокисление пигментов в растворе...........................................53

3.1.1 Действие видимого света на Хл а в метаноле...........................53

3.1.2 Действие видимого света на лютеин в метаноле.......................56

3.1.3 Действие видимого света на экстракты пигментов (Хл а и каротиноиды) в метаноле.............................................................56

3.1.4. Действие видимого света и УФ-Б на фикобилины.....................58

3.2. Фотодеструкция в изолированных фотосинтетических мембранах.....................................................................................59

3.2.1 Спектральные изменения поглощения и рассеяния мембран

цианобактерий A. variabilis....................................................................59

3.2.2. Действие видимого света и УФ-Б на мембраны

цианобактерий A. variabilis..........................................................................61

3.2.3. Фотодеструкция пигментов в мембранах S. elongatus.....................65

3.2.3.1. Действие видимого света................................................................65

3.2.3.1.1. Спектральные изменения поглощения и рассеяния при действии видимого света на мембраны.............................................................65

3.2.3.1.2. Облучение видимым светом мембран, предварительно прогретых при температуре 75°С в течение 15 мин.................... ...........67

3.2.3.1.3. Фотодеструкция в препаратах мембран ФС-I и ФС-М................68

3.2.3.2. Действие УФ-Б................................................................................70

3.2.3.3. Действие красного света................................................................71

3.2.3.4. Деградация Хл а............................................................................72

3.3. Фотодеструкция клеток цианобактерий A. variabilis

и S. elongatus............................................................................................74

3.3.1. Спектры поглощения и рассеяния..................................................74

3.3.2. Действие видимого света и УФ-Б радиации на клетки

A. variabilis................................................................................................75

3.3.2.1. Общие спектральные изменения...............................................75

3.3.2.2. Фотодеструкция пигментов в клетках при разных условиях культивирования............................................................................ .......81

3.3.2.3. Влияние кислорода и азота........................................................82

3.3.2.4. Влияние температуры.................................................................84

3.3.2.5. Влияние дозы УФ-Б.....................................................................86

3.3.3. Действие видимого света и УФ-Б радиации на S. elongatus........87

ОБСУЖДЕНИЕ...............................................................................................91

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...............................................................................................114

ВЫВОДЫ.......................................................................................................115

ЛИТЕРАТУРА................................................................................................117

ПРИЛОЖЕНИЕ (Рисунки)..............................................................................138

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК - Активные формы кислорода

АЛК - Аминолевулиновая кислота

МДА - Малоновый диальдегид

ПОЛ - Перекисное окисление липидов

РЦ - Реакционный центр

ССК - Свето собирающий комплекс

сод - Супероксиддисмутаза

ФС-1 - Фотосистема 1

ФС-Н - фотосистема II

ФСА - фотосинтетический аппарат

Хл - Хлорофилл

этц - Электронтранспортная цепь

ВВЕДЕНИЕ

Продуктивность фотосинтезирующих организмов (бактерии, цианобактерии, водоросли, высшие растения) во многом зависит от эффективности работы фотосинтетического аппарата, которая определяется его способностью к эффективной утилизации солнечной энергии на всех этапах развития организма, как в нормальных условиях, так и при действии стрессовых факторов. Однако, поглощение и преобразование солнечной энергии фотосинтезирующими организмами часто сопряжено с развитием деструктивных эффектов [Гусев, 1968; Красновский, 1982, 1983, 1988, Кафаров и др., 1988, Мерзляк, 1989; Demmig, 1987; Demmig-Adams, 1990, 1992; Krasnovsky, 1994; Noctor and Foyer, 1998]. Особенно отчетливо это проявляется в тех случаях, когда растения подвергаются действию внешних стрессорных условий. Так, замечено, что фотоповреждение систем фотосинтеза усиливается при неблагоприятных условиях окружающей среды, под влиянием техногенных воздействий, при старении и др., а также при нарушении нативности его мембранных структур. Для предотвращения этих нежелательных деструктивных событий в клетках аэробных фотосинтезирующих организмов активно функционируют различные защитные системы, препятствующие возникновению форм активированного кислорода, обладающих способностью инициировать окислительные процессы, а также вторичных продуктов, возникающих при их участии. К ним относятся системы, устраняющие в первую очередь триплетные состояния Хл, свободные радикалы, синглетный кислород и т.д. (антиоксиданты: аскорбиновая

кислота, токоферол, супероксиддисмутаза, каталаза и др.). Тем не менее, во многих ситуациях активность этих защитных систем может ослабевать, что является непосредственной причиной развития фотоокислительных повреждений [Мерзляк и Погосян, 1986; Hendry et al., 1987; Кафаров и др., 1988; Brown et al., 1991; Foyer et al., 1994; Grossman et al., 1995].

Наряду с излучением в видимой области спектра, солнечный свет содержит также компоненту УФ. Даже при сравнительно малой интенсивности УФ излучение во многих случаях способно обеспечить значительные нарушения в фотосинтезе и вызвать деструктивные реакции, сопоставимые по своей интенсивности с действием излучения в видимой части спектра. Эта проблема особенно активно обсуждается в последние годы в связи с нарушением озонового слоя атмосферы. Вместе с тем совместное действие видимого и УФ излучения на живые организмы может носить сложный характер [Tevini et al., 1989; Hader, 1993; Tevini, 1993, 1994; Sihna and Hader, 1998].

В ходе биологической эволюции фотосинтезирующие организмы выработали разнообразные системы для защиты от действия света и кислорода. Поэтому изучение этих систем является важным аспектом общей теории устойчивости живых организмов. Исследование особенностей развития фотоповреждений, вызванных видимым светом и УФ-излучением может дать сведения о природе фотосенсибилизаторов, механизмах первичных реакций и путях развития деградационных процессов.

Цианобактерии являются древними фотоавтотрофными организмами, с жизнедеятельностью которых связывают появление в атмосфере молекулярного кислорода. Они повсеместно распространены в биосфере,

являются важными компонентами многих экосистем и часто их обильное размножение (цветение) наносит значительный вред [Гусев, 1968; Громов, 1976; Тапочка, 1981]. В некоторых странах цианобактерии в достаточно больших количествах культивируются как источник белка, витаминов, ненасыщенных липидов и пигментов. Одной из основных проблем современной биотехнологии микроводорослей при их массовом культивировании является их «фотоокислительная гибель», обусловленная образованием AOK[Eloffet al., 1976; Vonshakand Richmond, 1988].

В своей работе с помощью оптических методов мы исследовали выцветание пигментов, как важного аспекта фотодеструктивных событий в клетках фотосинтезирующих организмов, у двух видов цианобактерий, различающихся по своим физиологическим особенностям. Эти цианобактерии обладают достаточно разрешенными полосами поглощения отдельных пигментов (Хл а, фикобилинов и каротиноидов), что делает их удобными объектами для спектральных исследований. Следует отметить, что клетки как этих, так и других фотосинтезирующих микроорганизмов, обладают сложными оптическими свойствами. Поэтому в нашей работе были применены новые подходы, позволившие более полно охарактеризовать особенности спектральных изменений клеток в ходе фотодеструктивных повреждений. Необходимость углубления знания оптических свойств диктуется тем, что в последние годы для контролирования численности и состояния фотосинтезирующих микроорганизмов как в глобальных масштабах, так и в биотехнологических системах широко используются оптические методы [Gitelson et al., 1993; 1996; Schalles et al.,1998],

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структурно-функциональная организация ФСА

Реакции световой стадии фотосинтеза происходят с участием 2-х пигмент-белковых фотохимически активных комплексов: ФС-I и ФС-ll и пигмент-белкового комплекса ССК. Наиболее изученным из них является ФС-ll; она состоит из 22 полипептидов; 2 ядер D-i (32 кДа) и D2(34 кДа), РЦ -Р68о, феофитинов [Danielus et al., 1987; Masojidek et al., 1987; Debus, 1988; Myazaki et al., 1989], Z (первичный донор электронов, который соединён с ядерным белком Di при тирозине 161), одного гема cyt-bs59, который защищает РЦ [Foldowsky, 1986; Arnon, 1988; Thompson and Brudvig, 1988; Styring et al., 1990] и участвует в переносе протонов через мембрану, и, наконец, хинонов Qa и Qb - переносчиков электронов. Установлено, что действие гербицидов (например, диурона) основано на связывании с Di -белком и блокировании тем самым переноса электронов с Qa на Qb [Гольдфельд, Карапетян, 1989]. Хотя многие стороны функционирования фотосистем еще не известны, установлено, что у высших растений ССК антенны состоят из: полипептидов 50-45 кДа (СР47 ), соединенных с 20-25 молекулами Хл а и 5-ю ß-каротинами, полипептидов 40-45 кДа (СР4з ), соединенных с 20-25 молекулами Хл а и 5-ю ß- каротинами и белков 33, 23 и 18 кДа [Melis and Anderson, 1983; Milner et al., 1987; Hanson and Wydzynski, 1990]. В состав CK-2 входят Хл а, Хл б, ксантофиллы и полипептиды. В зависимости от соотношения Хл а и б ССК-2 разделяют на 4- группы: а, Ь, с и d, соответственно, имеющие размер 29 кДа, 25-28 кДа, 27 или 31 кДа и 21

«Да [Brecht, 1980; Marder and Barber, 1980; Chitnis and Thornber, 1988]. У водорослей выделяют 4 типа ССК-2, различающихся по каротиноидному составу. Например, у высших растений ССК-2 всегда состоит из Хл а, Хл 6 и лютеина, у Chlorella - Хл а, Хл б и сифонеина, у Prasionophycea - из Хл а, Хл б и празиноксантина и у Euglenoides - из Хл а, Хл б и диаденоксантина [Wild and Urshel; 1980; Sukenik et al., 1987; Humbeck et al., 1988; Wilhelm, 1990]. ФС-М обладает своими антеннами (а и ß -центры) с меньшими размерами, которые не восстанавливают Qp [Melis and Anderson, 1983; Percival et al., 1984]. В отличие от водорослей, цианобактерии не имеют специального ССК, их антенны содержат фикобилипротеины [Glazer, 1984; Стадничук, 1991; Sihna and Hader, 1998]. По структуре эти антенны тесно ассоциированы с ФС-И и передают на нее большую долю энергии света. Большинство основных билипротеинов являются олигомерами, a,ß-мономерами, где а и ß- полипептидные цепи, состоящие из 160-180 аминокислотных остатков. Фикобилипротеины формируют сложную

fi R

структуру фикобилисом с общей массой 7x10 до 15x10 кДа [Wehremeyer, 1988]. На электронных микрофотографиях при увеличении в 10000-20000 X фикобилисомы представляются как глобулы, прикрепленные к тилакоидным мембранам. Достаточно очевидно, что строение фикобилисом должно отвечать условию оптимальности миграции энергии (от фикоэритрина к фикоцианину, к аллофикоцианину и к Хл). Агрегаты фикобилипротеинов высоких порядков формируются не хаотично, а путем последовательной стыковки дисковидных элементов с наращиванием длины возникающих при этом цилиндров. Эти тельца состоят из нескольких состыкованных цилиндрических элементов. Такие агрегаты-цилиндры в полудисковидных

фикобилисомах образуют две структурные группы [Nicole and Cohen, 1977; Glazer, 1984; Стадничук, 1991; Sihna and Hader, 1998].

1.2. Адаптация первичных реакций фотосинтеза к условиям освещения

и фотоингибированию

Биологические организмы способны обитать в диапазонах освещенности от 0.3-0.6 до 10 Вт/см 2 [Рубин и др., 1987]. В естественных условиях освещенность может варьировать в гораздо больших пределах, чем необходимо для эффективного функционирования фотосинтеза. Очень часто для выживания необходима адаптация ФСА к условиям освещения. При низкой освещенности наблюдается лишь минимальный рост растений. Согласно Рубину [Рубин и др., 1987], в этих условиях происходит накопление 2-х окислительных эквивалентов для окисления воды, создается минимальный градиент рН и катионы выходят из тилакоидов. Следующий предел освещенности такой, что темновые реакции фиксации С02 не являются лимитирующим фактором фотосинтеза. В этих условиях скорость окисления пластохинонов цитохромом Ь определяет предел фотосинтеза.

Адаптация растений происходит за счет изменения их пигментного состава. Так, в зависимости от освещения, отношение Хл 6 и а в высших растениях меняется от 1:2 до 1:4,5 [Jackson, 1976; Lichtenthaler, 1987]. В зависимости от освещенности и спектрального состава света ФС-I и ФС-М высших растений могут согласованно изменять количество поглощенной световой энергии. В частности, с этим связан т.н. переход из состояния 1 в

состояние 2, обеспечивающий перераспределение энергии обеими ФС. При

поглощении хлоропластами избыточной энергии белки ССК ФС-П фосфорилируются [Kyle et al., 1983] и энергия из ССК передается на ФС-1 (состояние 2). Избыточное возбуждение ФС-I вызывает дефосфорилирование белков ССК и энергия передается на ФС-М (состояние 1). Надо заметить, что фосфорилированные ССК мигрируют (они имеют отрицательный заряд) из гранальных тилакоидов в стромальные, а нефосфорилированные ССК мигрируют обратно [Kyle et al., 1983; Allen et al., 1985; Biggins and Bruce, 1989; Malkin et al., 1990].

Во многих исследованиях установлено, что избыток света представляет опасность для фотосинтезирующих организмов. В этом случае возбужденные молекулы Хл и промежуточные продукты первичных фотохимических стадий фотосинтеза, обладающие высокой реакционной способностью, могут инициировать окислительную деструкцию ФСА и липидов мембран клетки [Мерзляк, 1989; Takeda and Yoshihira, 1990; Hogdson and Raison, 1991; Merzlyak and Hendry, 1993.] С ростом освещенности опасность повреждений возрастает. Восстановление первичного хинона ФС-Н [Sivak and Walker, 1985; Weis and Berry, 1987] может ограничить скорость транспорта электронов в этой фотосистеме, снизить эффективность передачи энергии на ФС-Н от антенны вследствие нефотохимического тушения. В этих условиях в хлоропластах высших растений происходит превращение ксантофилла виолаксантина через антераксантин в зеаксантин. Этот процесс обычно протекает в течение 1030 мин. Обратный процесс (эпоксидация зеаксантина) происходит в темноте [Demming et al., 1987]. При высокой интенсивности света вероятность энергетического тушения (qE), особенно при высоком pH на мембранах

тилакоидов, возрастает [Sivak and Walker, 1985; Noctor and Horton, 1990]. В настоящее время эти обратимые превращения ксантофиллов в ФС-П (виолаксантиновый цикл), ведущие к диссипации энергии светового излучения в тепло рассматриваются, как одни из основных механизмов защиты фотосинтетического аппарат�