Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Состояние растительных организмов в природных условиях и окислительное повреждение фотосинтетического аппарата

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Погосян, Сергей Иосифович

Актуальность проблемы. Одной из основных причин нарушения нормального роста и развития растений в природных условиях является их окислительное повреждение. Оно может быть вызвано светом высокой интенсивности, ионизирующей и УФ радиацией, засухой, подтоплением, осмотическими факторами, дефицитом макро- и микроэлементов, критическими температурами, воздушными и водными полютантами, гербицидами, рядом инфекций, старением. В последние десятилетия отмечается большой интерес к исследованиям механизмов окислительного повреждения, стресса, адаптации и устойчивости растений к действию различных неблагоприятных факторов среды (Балнокин, Венедиктов, Весеяовский, Кренделева, Маторин, Рубин, Barber, Bjorkraan, Demmig-Adams, Dubinsky, Foyer, Elstner, Lichtenthaler, 1980-2002). Эта проблема актуальна для защиты растений от действия неблагоприятных факторов среды, диагностики состояния растительных сообществ и отдельных видов, а также для разработки методов биоиндикации и биотестирования в целях оценки благополучия среды обитания.

Фотосинтез является одним из наиболее уязвимых процессов для окислительного повреждения в силу ряда причин: повышенной локальной концентрации кислорода; высокой степени ненасыщенности жирных кислот в составе липидов фотосинтетических мембран; лабильности белковых комплексов в составе фотосистем; возможности прямого фотодинамического действия при поглощении света фотосинтетическими пигментами. Сложная система регуляции первичных процессов фотосинтеза, поддерживающая баланс между возбужденными состояниями пигментов, градиентами концентраций ионов на фотосинтетической мембране и степенью восста-новленности переносчиков в системе электронного транспорта, защищает ФСА1 от повреждения в широком диапазоне внешних условий (Рубин, 1995). Нарушения работы згой системы регуляции приводят к повреждению ФСА. Разработанные к настоящему времени методические подходы дают возможность проведения анализа состояния ФСА в норме и на различных стадиях повреждения растительного организма.

По общепринятым представлениям, инициирование процессов повреждения ФСА происходит при участии АФК. В процессе фотосинтеза образование супероксидного анион-радикала происходит главным образом в акцепторной части ФС1. Впервые восстановление кислорода в фотосинтетической ЭТЦ было описано Мелером в 1951 году. В дальнейшем многие авторы Принятые сокращения: АФК - активированные формы кислорода; ХЛ - хлорофилл; qN -коэффициент нефотохимического тушения ХЛ; МДА - малоновый диальдегид; ПСИ - перекис-ное окисление липидов, РЦ - реакционные центры; "ГХЛ - термохемшпоминесценция; ФС - фотосистема; ФСА - фотосинтетический аппарат; ФАР - фотосинтетически активная радиация; Fo - интенсивность флуоресценции ХЛ при открытых РЦ; Fm - интенсивность флуоресценции ХЛ при закрытых РЦ; Fv = Fm - Fo - переменная флуоресценция ХЛ; (Fm - Fo)/Fm - относительная переменная флуоресценции ХЛ; ЭТЦ - электронтранспортная цепь. склонялись к тому, что донорами электронов для восстановления кислорода являются железо-серосодержащие центры ФС1 и ферредоксин (Иванов, Alien, Asada, Elstner, Takahashi, 19722002). Более поздние исследования показали, что образование Ог' может происходить и в акцепторной части ФОН на уровне анион-радикала феофитина, восстановленных хинонных акцепторов Qa и Qb (Климов, 1988), а возможно, и в пуле хинонов с участием пластосемихинон-радикала (Иванов, 2002). Источником Ог" может быть рибулезодифосфаткарбоксилаза, выполняющая функции оксигеназы. Активация кислорода может происходить и за счет переноса энергии от возбужденных молекул хлорофилла на кислород с его переходом в синглетаое состояние (Красновский мл., Foot, 1980-2002). На наяальных этапах окислительного повреждения генерация АФК происходит за счет избыточного восстановления переносчиков в цепи фотосин-тегического транспорта электронов.

Вместе с тем значительные успехи в изучении молекулярных механизмов окислительного повреждения растений к настоящему времени еще не дали ясных представлений о вкладе конкретных процессов генерации АФК в повреждение определенных структур клетки. Не ясна последовательность и взаимосвязь процессов адаптации и деструкции при окислительном повреждении ФСА водорослей и высших растений. Недостаточно информации для определения глубины и обратимости повреждения ФСА растительных организмов в природных условиях и базовых знаний для создания эффективных способов оценки состояния автотрофных организмов и биоиндикации в целях экологического мониторинга среды обитания.

Большой интерес представляют исследования окислительного повреждения ФСА индивидуальных клеток и выявление роли функциональной неоднородности особей в адаптации и устойчивости клеточных популяций. Однако при рассмотрении процессов окислительного повреждения популяций одноклеточных водорослей и ассимиляционных тканей высших растений практически не учитывается неоднородность ответных реакций индивидуальных клеток. Для изучения фитопланктонного сообщества в природе необходимо определять физиологическое состояние индивидуальных клеток водорослей. Только так возможно оценить функциональное состояние популяций каждого из массовых видов водорослей и прогнозировать динамику их численности в природном фитопланктонном сообществе. • Цели и задачи исследования. Главными целями настоящей работы являлись:

- выяснение механизмов окислительного повреждения фотосинтетического аппарата ассимиляционных тканей высших растений, клеток водорослей и их популяций под действием неблагоприятных условий среды;

- выбор признаков, характеризующих повреждения фотосинтетического аппарата растительных организмов в природе, и разработка на этой основе методологической базы для биоиндикации, оценки состояния среды и целей экологического мониторинга.

- определение степени повреждения фотосинтетического аппарата высших растений, индивидуальных клеток водорослей, их популяций и фитопланктонных сообществ в природных условиях.

В работе решались следующие задачи:

- исследовать закономерности ферментативного и индуцированного светом окислительного повреждения мембранных структур и ассимиляционных тканей высших растений;

- выяснить закономерности изменений, происходящих на уровне первичных процессов фотосинтеза у различных видов водорослей под действием света и УФ-излучения;

- исследовать изменения распределений клеток по показателям функционального состояния их фото синтетического аппарата под действием некоторых токсических агентов и при фотоокислительном повреждении на лабораторных популяциях водорослей;

- оценить состояние фотосинтетического аппарата водорослей и высших растений для биоиндикации, оценки состояния природной среды и целей экологического мониторинга.

- создать новые и модифицировать известные люминесцентные методы оценки функционального состояния фотосинтетического аппарата индивидуальных клеток водорослей и ассимиляционных тканей высших растений для анализа растительных объектов в лабораторных исследованиях и использования в оценке состояния природных фигоценозов;

- разработать оптические методы для определения продуктов окислительной деградации липи-дов и пигментов фотосинтегического аппарата.

Научная новика. В работе сформулированы новые представления о закономерностях и последовательности событий в процессе окислительного повреждения ФСА фототрофных организмов в природных условиях. Обнаружено, что под действием света, вызывающего насыщение фотосинтетической цепи транспорта электронов, в условиях, когда системы регуляции не справляются с чрезмерно большим потоком электронов и тушением избыточных возбужденных состояний ХЛ, происходит окислительное повреждение ФСА растительных организмов различных таксономических групп. Ферментативных процессы, инициирующие ПОЛ хлоропластов и других мембранных структур клетки, в темноте ие приводят к нарушениям в работе ФСА. Продукты ПОЛ и окислительная деградация пигментов обнаруживаются только после полного блокирования системы фотосинтетического транспорта электронов.

Получены спектральные характеристики продуктов ПОЛ растений. Выявлены соотношения между изменением состава жирных кислот мембранных липидов в процессе ПОЛ растений, накоплением диеновых коныогатов, малонового диальдегида, пшффовых оснований и продуктов окислительной деградации фотосинтетических пигментов. В клетках высших растений впервые обнаружена и охарактеризована пиридиннуклеотид-зависимая система ферментативного ПОЛ.

Установлена последовательность изменений флуоресцентных показателей состояния ФСА водорослей различных таксономических групп в зависимости от времени действия видимого и УФ-облучения повреждающих интенсивностей. Обнаружено, что ингибирование деэпоксидазы каротиноидов ксантофилового цикла приводит не только к снижению нефотохимического тушения флуоресценции хлорофилла, но и усилению повреждения ФСА, индуцированного светом высокой интенсивности.

Впервые создана методологическая база для определения функционального состояния ФСА индивидуальных клеток популяций водорослей по флуоресцентным показателям ХЛ. Обнаружено, что снижение эффективности работы ФСА клеток водорослей при дефиците элементов минерального питания в среде не изменяет значений среднеквадратичного отклонения в распределении особей по данному показателю. Воздействие на водоросли токсических веществ или повреждающих излучений на фоне снижения средних показателей функциональной активности ФСА сопровождается увеличением гетерогенности распределения клеток по этим показателям.

Проведен выбор наиболее информативных и доступных для определения в природных условиях признаков окислительного повреждения ФСА растительных организмов. Разработан комплекс люминесцентных методов определения функционального состояния фотомштетвче-ского аппарата ассимиляционных тканей растений, суспензий и одиночных клеток водорослей для биоиндикации и прогнозирования динамики численности популяций водорослей. Научная и практическая значимость работы. Разработаны научные и методические основы для исследования механизмов окислительного повреждения ФСА высших растений и водорослей. Полученные в работе экспериментальные результаты и обобщения вносят существенный вклад в представления о закономерностях я роли процессов окислительной деградации в функционирование ФСА фотоавтотрофных организмов.

Модифицированы флуорометрические методы оценки функционального состояния фотосинтетического аппарата высших растений в природных условиях. Использование этих методов позволило применить принципиально новые подходы для индикации повреждения фотосинтетического аппарата растений в природных фитоценозах. В частности, проведены обследования состояния зеленых насаждений ряды улиц Москвы. Выработаны рекомендации по использованию флуорометрических методов для оценки физиологического состояния древесных растений.

Разработаны оригинальные микрофлуорометрические методы регистрации кривых индукции флуоресценции и определения эффективности утилизации световой энергии ФСА на одиночных клетках высших растений и микроводорослей. На основе методов многомерного статистического анализа разработан способ классификации отдельных клеток водорослей по типам кривых индукции флуоресценции. Исследована связь между функциональной структурой популяций микроводорослей и приростом численности клеток по мере развития алгологических культур и при действии различных неблагоприятных факторов, а также при конкурентном взаимодействии двух видов водорослей. Применение методов определения эффективности утилизации световой энергии ФСА водорослей позволило оцейитъ вклад функциональной неоднородности особей в ответную реакцию популяции или сообщества клеток на повреждающее воздействие. В исследованиях популяций водорослей фитопланктона Атлантического океана и Черного моря использование микрофлуорометрического метода позволило определить функциональное состояние фотосинтетического аппарата особей определенного вида и на основании распределения клеток по данному показателю оценить его физиологическое состояние, а также прогнозировать динамику численности популяций массовых видов фитопланктона. Впервые при обследованиях экологического состояния водных фитоценозов применен комплекс флуоромет-рических методов и аппаратуры, позволивший определить пространственное распределение фитоплашсгонных организмов в естественной среде обитания. На отобранных с определенных горизонтов пробах воды исследованы особенности долговременной адаптации ФСА водорослей к внешним условиям, определено содержание пигментов в отдельных клетках н эффективность первичных процессов фотосинтеза массовых видов водорослей. Эти исследования позволяют предложить новую методологическую базу для биоиндикации, оценки состояния среды и целей экологического мониторинга водных фитоценозов.

Научные представления, основные методические приемы и принципы исследований, полученные в результагге проведенных работ, включены в программу читаемых автором лекций по «Биофизике» для студентов 3 курса ряда кафедр ботанического направления Биологического ф-та МГУ и спецкурса по «Экологической биофизике», а также при проведении «Большого практикума по биофизике» и «Практикума по экологической биофизике» для студентов кафедры биофизики. Разработанные методы внедрены в Инстит)сге Океанологии РАН и Институте Океанологии Польской Академии наук.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены (или представлены) и обсуждены на 3-й конференция физиологов и биохимиков растений Сибири и Дальнего Востока (Иркутск, 1968); на симпозиуме «Сверхслабые свечения в биологии» (Москва, 1969); на симпозиуме «Проблемы биофотохимии» (Москва, 1970); на симпозиуме «Сверхслабые свечения в медицине и сельском хозяйстве» (Москва, 1971); на 4-ом Международным биофизическом конгрессе (Москва, 1972); на симпозиуме «Физико-химические основы функционирования надмолекулярных структур клетки» (Москва, 1974); на симпозиуме «Биоантиокислители» (Москва, 1975); на 12-м Международного Ботанического конгрессе (Ленинград, 1975); на сипозиуме «Свобод-норадикалъное окисление в норме и патологии» (Москва, 1976); на всесоюзном совещания по хемилюминесценции (Запорожье, 1976); на конференции по эволюционной геронтологии (Москва, 1981); на конференции «Устойчивость растений.к экстремальным условиям среды» (Ленинград, 1981); на 1 Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982); на симпозиуме «Лимнология горных водоемов» (Ереван, 1984); на 4-ой Всесоюзной конференции по биологии клетки (Тбилиси, 1985); на симпозиуме «Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине» (Рига, 1988); на Всесоюзной конференции «Молекулярные механизмы биологического действия оптического излучения» (Ялта, 1987); на 3-м съезде Всероссийского общества физиологов растений (Санкт-Петербург, 1993); на 7-ом конгрессе по биоматематике (Буэнос-Айрес, 1995); на симпозиуме «Физико-химические основы физиологии растений» (Пенза, 1996); на 3-ей Международной конференции «Свободные радикалы и стресс растений» (Пиза, 1997); на 11-м Международном конгрессе по фотосинтезу (Будапешт, 1998); на Международной конференции «Регуляция биологических процессов свободными радикалами» (Ярославль, 1998); на 2-м Всероссийского съезде фотобиологов (Пущино, 1998); на Международной школе «Проблемы теоретической биофизики» (Москва, 1998); на 2-м Съезде биофизиков России (Москва, 1999); на Международном симпозиуме «Растения в условиях стресса среды» (Москва, 2001); на Всероссийской конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты функционирования водных экосистем» (Саратов, 2001).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано более 80 работ в российских и международных изданиях.

Методические аспекты работы. Для решения поставленных задач в работе применялись различные биофизические, биохимические и гидробиологические методы, а также методы статистического анализа. В процессе исследований были модифицированы и разработаны новые методы измерения скоростей генерации АФК и определения продуктов окислительной деградации липидов и пигментов фотосинтетического аппарата, образующихся в ходе окислительного повреждения растений; а также модифицированы люминесцентные методы оценки функционального состояния фотосинтетического аппарата ассимиляционных тканей высших растений и индивидуальных клеток микроводорослей для лабораторных исследований и использования в оценке состояния природных фитоценозов.

Исследования состояния фитопланктона Атлантического и Индийского океанов, Черного и Балтийского морей были проведены в рейсах 15 и 23 НИС «Витязь» в 1988 и 1991 гг., на НИС Института океанологии Польской АН «Оцеания» в 1996 г., в 2000-2002 гг. на НИС «Акванавт» и катере «Ашамба».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Главными экологическими факторами, влияющими на физиологическое состояние фототроф-ных организмов в целом и их ФСА, в частности, являются освещенность, температура, содержание биогенных элементов в среде, соленость и различные виды загрязнений. В ряду этих факторов первостепенное значение имеет интенсивность ФАР. Световое излучение определяет рост, развитие и интенсивность фотосинтеза растительных ¡слеток. В тоже время свет высокой интенсивности может вызывал, фотоокислительиое повреждение, приводить к фотоингибиро-ванию, деструкции фотосинтетических пигментов и в итоге к гибели организма.

1. Исследования состояния ФСА водорослей в природных условиях

В природных условиях повреждение фитопланкгонных организмов является следствием действия многих неблагоприятных факторов среды. Получение информации о состоянии фитоплаик-тонных сообществ и прогнозирование динамики их численности является одной из актуальных задач экологии и рационального природопользования в силу того, что фитопланктон является главным продуцентом органического вещества в водных экосистемах. Кроме того, физиологическое состояние водорослей может служить одним из показателей экологического благополучия водоема (Абакумов, 1992). Традиционно в гидробиологии принято описывать фитопланк-тониое сообщество по видовому составу и обилию видов, а также по интегральным'характеристикам фотосинтегической системы водорослей - содержанию фотосинтетических пигментов и первичной продукции на единицу объема водной толщи или на единицу площади поверхности водоема. Такие подходы ке могут дать достаточной информации для оценки функционального состояния отдельных видов и не позволяют определить вклад конкретных видов в интегральные показатели функционирования водного фитоценоза.

Разнообразие особей в популяциях является фундаментальным свойством их организации. Неоднородность качественного состава (гетерогенность, полиморфизм) особей обеспечивает высокую способность популяции адаптироваться к изменяющимся условиям среды. При этом характер распределения особей в популяции по какому-либо признаку изменяется в соответствии с собственной нормой реакции и новыми условиями среды (Шварц, 1980). Таким образом, характер распределения особей по какому либо признаку может служить одним из важнейших показателей состояния популяции.

Выбор признаков для исследования показателей распределения особей в популяции может быть произвольным. Однако наиболее значимыми представляются признаки, характеризующие жизненно важные функции. Действие неблагоприятных факторов среды приводит к необходимости увеличения по сравнению с оптимальным затрат энергии организмом для поддержания своего состояния. Исходя из этого, обеспеченность организма энергией оказывается одним из главных факторов его адаптационных и репарационных возможностей. Адаптационные реакции, как правило, направлены на сохранение систем, обеспечивающих организм энергией. Нарушения эффективности функционирования этих систем являются важнейшими симптомами повреждения организма. Таким образом, в случае водорослей показатели состояния и функционирования фотосинтетического аппарата клетки представляются наиболее значимыми для оценки степени повреждения организма. Так как распределение особей по уровню функциональной активности может служить показателем состояния популяции в условиях среды обитания, то популяция является своего рода биосенсором состояния экосистемы в целом, чутко реагируя на изменения условий среды.

В последние десятилетия были достигнуты большие успехи в разработке и применении флуоромегрических методов для определения функциональной активности ФСА высших растений и суспензий водорослей. Эти исследования создали предпосылки к созданию способов оценки состояния ФСА отдельных клеток водорослей и, следовательно, индивидуальных видов в составе природного фитопланктонного сообщества. К началу наших исследований не существовало количественных методов определения функциональной активности индивидуальных клеток водорослей. Эту проблему удалось решить путем использования различных модификаций микрофлуориметрического метода в сочетании с интенсивно развивающимися последнее десятилетие люминесцентными методами определения функционального состояния ФСА растений.

1.1. Исследования связи структуры популяции с ее состоянием путем классификации водорослей по типам кривых индукции флуоресценции хлорофилла индивидуальных клеток. Форма кривых индукции флуоресценции хлорофилла (кинетика интенсивности флуоресценции хлорофилла в ответ на облучение объекта, предварительно адаптированного к темноте, интенсивными световыми потоками) является результатом ряда переходных процессов, протекающих в фотосинтетических мембранах в ответ на включение света (Караваев, Кукушкин, Ризниченко, Рубин, Тихонов, Govinjee, Papageorgiou, Strasser, Lazar, 1975-1999). Однако, несмотря на большое внимание к механизмам процессов, определяющих форму кривой индукции флуоресценции, многие закономерности этого явления пока не получили однозначной интерпретации.

Популяция микроводорослей состоит из клеток, находящихся в различных физиологических состояниях и отличающихся по реакциям ФСА на действие света, что отражается в различных формах кривых шщукции флуоресценции хлорофилла клеток. Микрофлуориметрический метод позволяет регистрировать кривые индукции флуоресценции одиночных клеток. Совокупность таких кривых может быть показателем функциональной неоднородности особей в популяции [30,33,34].

В силу того, что индукция флуоресценции хлорофилла не имеет видовой специфичности, кластерный анализ природной популяции Pyrocystis pseudonoctiluca - одного из массовых пелагических видов фитопланктонного сообщества центральной Атлантики (23 рейс НИС «Витязь», 1991 г. Рис. 1А), проводили аналогично лабораторным культурам водорослей (раздел З.1.). Для выявления различий клеток Р. pseudonoctiluca, вызванных долговременной адаптацией ФСА к условиям подводной освещенности; данные измерения индукции флуоресценции хлорофилла объединили в четыре группы: 10-15, 40-50, 70-80 и 120-150 м. Результаты кластерного анализа популяции Р. pseudonoctiluca в зависимости от глубины обитания приведены на рис. 1Б. Проекция распределения по типам кривых индукции флуоресценции этих клеток представляет области, соответствующие различию функциональной структуры популяций на разных глубинах.

Аналогичный алгоритм был использован также для исследования функциональной структуры черноморской популяции водорослей вида Ceratium f usus. Имея данные химического анализа воды на станциях отбора проб, содержащих С. fusus, можно было разделить их по содержанию азота. Содержание азот» на глубине 10 м в пробах води вблизи о. Змеиный и на Филлофорном поле более, чем в 50 раз превышало значение этого показателя в центральной части Черного моря в приповерхностном слое. Результаты кластерного анализа показали значительные различия состояния ФСА популяций водорослей, адаптированных к различным внешним условиям, в частности, к содержанию в воде азота. При этом кривые индукции флуоресценции хлорофилла некоторых клеток из разных популяций могут практически совпадать. Различия между ними проявляются в относительном обилии клеток, имеющих соответствующий тип кривой индукции флуоресценции.

Таким образом, разработанный нами алгоритм многомерного кластерного анализа, позволяющий классифи

-0.4 0.0 0.4 Координата

0.8 1.

Рис. 1. Станции сбора проб мнкроводорослей Pyrocyylis pseudonoc-tlluca (А) (цифрами указаны номера станций и в скобках их обозначение) и проекция функциональной структуры популяции, полученная для разных горизонтов (Б).

40-50 м цировагь клетки водорослей с определенным типом ответной реакции ФСА на световое воздействие, может быть использован для анализа функциональной структуры популяции в природных популяциях водорослей.

1.2. Исследование динамики распада цветения №1»с/иа </е//са(&5/та в Черном море

Массовое увеличение численности водорослей - «цветение» происходит в определенные сезоны и приводит к значительным изменениям биотических и абиотических показателей водной среды. Весной 1988 г. в центральной части Черного моря наблюдалось цветение диатомовых водорослей и, в частности, ЫИгзсЫа (¡еИсаЧь^та, коща этот вид абсолютно доминировал по численности и биомассе в фитопланкгонном сообществе (15 рейс НИС «Витязь»), По оценкам состава и численности фитопланктона, (Суханова др. 1991), в начале марта «цветение» N. ¿еИсаИзята сформировалось достигнув стационарной фазы и распространилось на весь верхний перемешанный слой воды (на глубинах от О до 60 м). В апреле происходил «распад цветения» - снижение численности водорослей, начавшееся с верхних горизонтов. На рис. 2 представлены изменения распределения содержания ХЛ в водной толще н распределения по относительной переменной флуоресценцией ХЛ клеток N. ¿еИсатйпа в марте и апреле для центральной части Черного моря в зависимости от глубины. На больших глубинах (40-58 м) в градиентном слое воды распределение клеток по переменной флуоресценции мало отличается от исходного.

Рнс. 2. Распределение содержания ХЛ по глубинам в центральной части Черного моря в марте и апреле 1988 г (А) и распределение клеток 1ЧИ&сШа /¡еПаик-я'/па по значениям переменной флуоресценции на разных глубинах (Б).

Рис. 3. Распределение флуоресцентных показателей ХЛ по глубине в северо-восточной части Черного моря в августе 2000 г.

На этом горизонте не происходит и значительного изменения содержания ХЛ в фитопланктоне водной толщи и численности клеток водорослей. В го же время наблюдается значительное снижение численности N. deUcatissima в верхних горизонтах, которое сопровождается уменьшением среднего значения переменной флуоресценции на клетку и значительной асимметрией распределения по этому показателю. Такие изменения параметров флуоресценции XJI характерны для повреждения ФСА клеток культур водорослей при действии света высокой интенсивности (разделы 2.1. и 2.2.). Вероятно, что ведущее значение в процессе весеннего «распада цветения» в Черном море имеет фотоповреждение. В этот период на фоне значительного повышения уровня инсоляции происходит обеднение верхних горизонтов элементами минерального питания за счет их поглощения быстро растущим фитопланктоном. Это создает дефицит минерального питания, который приводит сначала к фотоингибированюо, а затем и фотодеструкции ФСА водорослей и гибели клеток. Конечно, такое объяснение несколько упрощает сложные явления сезонной сукцессии, в которой большое значения имеют многие факторы среды, в том числе и биотические. Тем не менее, наши исследования продемонстрировали основные закономерности изменения функциональной структуры природной популяции при действии неблагоприятных условий, сопровождающих «распад цветения».

Таким образом, использование предлагаемого нами способа определения функционального состояния ФСА индивидуальных клеток в условиях эпизодического отбора проб фитопланктона позволяет оценить направленность развития доминирующих видов водорослей и прогнозировать динамику их численности при относительной стабильности внешних условий в ближайшем будущем.

1.3. Исследования функционального состояния фитопланктона

Черного моря 1998-2002 гг. В 1998 - 2002 гг. были проведены измерения вертикального распределения содержания фотосинтетических пигментов и эффективности работы ФСА фитопланктона северо-восточной части Черного моря методом зондовой флуорометрии. В 2000 -2002 гг. кроме зондирования водной толщи проведено обследование функционального состояния ФСА клеток массовых видов водорослей, в районе Геленджикской и Голубой бухт.

Флуоресцентное зондирование широко используется для определения состояния фитоплалк-тонного сообщества в различных водоемах, в том числе и в Черном море (Маторин и др., 1996; Falkowski, 1998; Kolber et al., 1998; Антал и др., 1999). Зондирование флуоресценции ХЛ в северо-восточной части Черного моря проводили в характерных точках гидродинамических структур, выбранных на основе анализа спутниковых данных о распределении температур в поверхностном слое. В качестве основы рис. 3 использована спутниковая карта поверхностных температур (данные NOAA), отражающая гидродинамическую ситуацию в районе исследований.

Из приведенных данных следует, что наибольшие величины содержания фитопланктона приурочены к шельфовой зоне и водам Основного Черноморского Течения. По вертикали область высоких значений флуоресценции в этих районах находится в относительно теплом поверхностном перемешанном слое, толщина которого достигает 40 м. В холодных водах на периферии дивергентной зоны (ст.164 и 166) происходит закономерное снижение интенсивности флуоресценции пигментов фитопланктона в поверхностном слое и существенная перестройка вертикального распределения фитопланктона (Ко). Толщина верхнего перемешанного слоя в Этих районах сокращается до 18-20 м, а область относительно высоких значений Ио достигает глубин 35-36 м. При этом, на кривой вертикального распределения Ро в холодных водах дивергентной зоны прослеживается глубинный максимум флуоресценции (рис.3). Он расположен в нижней части сезонного термоклина (32-36 м). Наличие глубинного максимума флуоресценции, по-видимому, связано со скоплениями диатомового фитопланктона, неоднократно наблюдавшимися в таких условиях (Ратысова и др., 1989). Вертикальные профили Ро описывают наиболее характерные черты распределения пигментов и биомассы фитопланктона, отмеченные ранее при гидробиологических исследованиях северо-восточной части моря (Суханова, Беляева, 1980; Суханова и др., 1987; Ведерников, Демидов, 1997).

Высокая фотосинтетическая активность, определенная по переменной флуоресценции (ру/рт), в верхнем перемешанном слое прибрежных вод (ст. 160) в данный период соответствует высокому содержанию пигментов фитопланктона. Это характерно для квазистационарных условий существования популяции фитопланктона (минеральное питание, световой режим и др.). В холодных водах дивергентной зоны (ст. 164,166) такой же высокий, как и в прибрежных водах, уровень фотосингетической активности во всем эвфотнческом слое соответствует существенно меньшему содержанию пигментов фитопланктона. Это связано с тем, что высокая фотосинтетическая активность при благоприятных условиях минерального питания не реализовалась в накопление биомассы фитопланктона. Причина несоответствия уровня фотосинтетической активности фитопланктона и его содержания может заключаться в недостатке времени для адаптации фитоцена к быстро меняющимся внешним условиям, характерным для зоны интенсивного поднятия вод. Следует отметить, что в отличие от шельфовых районов высокая фотосинтетическая активность в поднимающихся холодных водах дивергентной зоны наблюдается до глубин 50 м и более. Возможно, это связано с существованием в глубоких слоях сообщества фитопланктона, адаптированного к низким температурам и низкой интенсивности света.

Таким образом, в ряде случаев, данные зондовой флуорометрии вполне достаточны для анализа пространственно-временной изменчивости фитопланктонного сообщества, оценки его функционального состояния и первичной продукции (Антал и др. 1999). В быстроменяющихся условиях среды возможно несоответствие эффективности фотосинтеза величине биомассы водорослей и такие ситуации требуют проведения дополнительных исследований [43].

Данные, полученные при зондовом обследовании в прибрежных районах Геленджикской и Голубой бухт в августе-сентябре 1998-2000 гг свидетельствуют о том, что распределение содержания пигментов и показатели эффективности фотосинтеза по глубине мало различались в течение этих трех лет. На это же указывают и результаты наблюдения сезонной изменчивости XJI, первичной продукции и состава фитопланктонного сообщества (Ведерников, Демидов, 2002; Микаэлян и др., 2002). Распределение фитопланктона было характерным для мезотроф-иых вод с расположением максимума содержания фотосинтетических пигментов на 15-25 м. Активность фитопланктона, измеренная по показателям переменной флуоресценции, находилась на уровне 0,25-0,3 в поверхностных водах и возрастала до 0,5-0,6 с глубиной, достигая максимального значения при 20-25 м, а затем снижалась на нижней границе градиентного слоя. Низкое значение фотосинтетической активности и содержания фитопланктона в верхних горизонтах, видимо, обусловлено фотоингибированием реакционных центров фотосинтеза в условиях интенсивной инсоляции И'недостатке биогенных элементов в этот период. Это подтверждалось тем, что адаптация водорослей верхних горизонтов в темноте в течение 2-3 ч приводила к увеличению переменной флуоресценции до 0,5. На больших глубинах (более 40 м) наблюдаемое снижение функциональной активности водорослей может быть следствием появления в составе фитопланктонного сообщества малоактивных клеток. В этом случае темновая адаптация не изменяла значений переменной флуоресценции. Кроме того, полученные с этих горизонтов клетки водорослей обладали высокой функциональной неоднородностью. При низких средних значениях переменной флуоресценции присутствовали клетки практически лишенные способности к фотосинтезу и высоко активные с (Fm-Fo)/Fm > О.б.Флуорометрические методы могут дать информацию не только об эффективности первичных процессов фотосинтеза фитопланктона и быстрых регуляторных изменениях ФСА, но и о длительной адаптации, обусловленной постоянными условиями обитания. В частности, показано, что величина коэффициента нефотохимического тушения тесно связана со световыми условиями культивирования водорослей (Falkowski, 1992, [46]). С ростом глубины и снижением подводной облученности величина qN фитопланктона растет, достигая на 70 м практически предельно возможного значения (Табл. 1). При этом значение относительной переменной флуоресценции адаптированного к темноте фитопланктона мало зависит от глубины. Таким образом, по величине коэффициента нефотохимического тушения можно оценить, к каким световым условиям адаптированы водоросли. Следует отметить, что адаптация к новым условиям освещения фитопланктона является длительным процессом и требует не менее недели.

I I ' I ■ I

Температура, °C

Fo, oth. ед.

Рис. 4. Распределение по глубине температуры (Л), содержания пигментов (Б) и переменной флуоресценции XJI фитопланктона (В) в августе-сентябре 2000 и 2002 гг.

Учет этих обстоятельств может иметь большое значение для определения пространственно-временных адаптационных изменений состояния фитопланктона.

Сопоставление результатов зондирования в летне-осенний периоды 1998-2000 и 2002 гт. показало (Рис. 4), что экологическое состояние фитопланктона в северо-восточной части Черного моря летом 2002 претерпело существенное изменение. Во всем северо-восточном секторе моря, в отсутствии значительных мезомасштабных изменений, водные массы верхнего слоя воды до 25-30 метров прогрелись до 25 С° и более. В этих условиях изменилось распределение содержание пигментов и эффективность фотосин

Таблица 1. Зависимость относительной переменной . флуоресценции (Fm-Fo)/Fm и коэффициента нефотохимического тушения qN=(Fni-Fm 1/(Fm-Fo) хлорофилла фитопланктона от глубины, (где Fin' - интенсивность флуоресценции в условиях закрытых РЦ при освещении пробы 20 Вт/м1 ФАРустя 10 мин после включенияета). Пробы получены в юне «свала» (44°32ш. 37° 58 в.д.) в августе 2000 г.

Глубина, м (Fm-Fo)/Fm qN

0 0.55 0.

25 0.50 0.

50 0.49 0.

70 0.40 0. тетических процессов по глубине. Максимальные значения обоих показателей состояния фитопланктона оказались на 10-15 м ниже, чем в предыдущие годы. Водоросли в пробах воды, полученных с верхних горизонтов (5-10 м), не восстанавливали своих фотосинтетаческих функций даже после длительной адаптации в темноте. Это позволяет предположить, что они подверглись необратимому повреждению. Такое заключение подтверждается наличием у водорослей ослабленной защитной системы тушения избыточных возбужденных состояний хлорофилла, определенной но параметрам тушения флуоресценции (табл. 2).

Обследования видового состава микроводорослей в прибрежной части Черного моря в районе Геледжикской и Голубой бухт в августе - сентябре 2000 г выявило, что массовыми видами являются Па1а!5юпета пИ-гйсМогйез, ОасфИозокп fragilissimus, РзеийогпЪйсЫа зепаю и вутпосНтит \vulffn. Эти виды были выбраны для анализа распределения клеток по показателю эффективности фотосинтеза (Рис. 5). Представители диатомовых Тк пИгяеЫо1с1е$ и Р. находились в угнетенном состоянии. Около половины этих клеток обладали очень низким уровнем эффективности фотосинтеза. Исходя из данных, полученных на культурах водорослей [20, 21,27, 36] и в природных популяциях (Магорин и др., 1990), при уровне среднего значения (Рт-Фо^т ниже 0,3 прирост численности клеток водорослей прекращается. Поэтому распределение клеток Тк пи25екШ<1е5 и Р. по относительной переменной флуоресценции позволяет прогнозировать снижение численности этих

Рис. 5. Распределение клеток массовых видов водорослей по значениям переменной флуоресценции хлорофилла. Прибрежная часть северо-востока Черного моря, август 2000 г.

Таблица 2. Типичная зависимость относительной переменной флуоресценции н коэффициента нефотохимического тушения ХЛ цК проб фитопланктона от глубины (август 2002 г; остальные условия, как в Табл. 1).

Глубина, м (рт-Ро)/Рт

5 0,25 0,

22 0,33 0,

35 0,46 0,

50 0,49 0, видов. Большинство клеток Р. ¿егШа и представителя динофлагелят в. \vulffli обладали высокой эффективностью фотосинтеза, что свидетельствует о благоприятных для них условиях и позволяет прогнозировать рост численности этих видов. Через две недели после начала обследования значительно увеличилось относительное содержание клеток б. wulffii. То же, но в несколько меньшей степени, произошло и с клетками Р. sp., тогда как клетки Th. nitzsehioides z Р. fragilissimus стали встречаться эпизодически.

Состояние наиболее часто встречающихся видов микроводорослей в составе фитопланкгон-иого сообщества прибрежной части Черного моря в сентябре 2002 г. приведено в табл. 3.

Таблица 3. Виды водорослей, вклад их биомассы в пересмете на углерод в общую биомассу фитопланктона,держание фотосинтетических пигментов и переменной флуоресценции (Fm-Fo)/Fm одиночных клеток. (Пробы воды из зоны «свала» (44° 32,8'ш. 37° 57,7' в.д.) внтябре 2002 года; данные оставе фитопланктова получены И.И.Сухановой;держание пигментов в пересчете на ХЛ вычислено по значению интенсивности флуоресценции Fo.)

Вид Вклад биомассы, % Содержание пигментов 10"к г ХЛ/клетку Fv/Fm, отн. ед.

Мнн. Макс. Средн. Макс. Средн.

Pseudosolenia calcar-avis 56 0,54 19 5,5 0,55 0,

Dactyliosolen fragilissimus Thalassionema nitzschioides 0,8 0,8 0,30 0,27 2,9 2,0 1,1 0,96 0,39 0,43 0,04 0,

Cylindrotheca closterium Pseudo-nitzschia seriata 0,01 1,7 0,42 0,51 2,4 0,78 1,1 0,69 0,63 0,39 0,28 0,

Pseudo-nitzschia detícatissima 6,0 0,3 0,9 0,51 0,23 0,

Chaetoceros affinis Cymnodinium sp. Prorocentrum lima 0,4 0,5 1,5 0,48 0,27 4,4 14 12 13 3.6 3.7 8,7 0,50 0,60 0,59 0,18 0,36 0,

Prorocentrum micans 3,5 5,1 21 12 0,47 0,

Prorocentrum cordatum 0,45 1,1 3,0 2,2 0,59 0,41

Scrippsiella trochoidea Ceratium furca Ceratium fusus 0,22 3,9 1,2 2,0 1,8 2,5 7,5 22 19 5.2 8,6 8.3 0,56 0,24 0 0,47 0,

Эти данные указывают на угнетенное состояние водорослей большинства представленных видов и подтверждают предположение о том, что обнаруженные в 2002 г изменения состояния фитопланктона по фотосинтетическим показателям, а также изменения видового состава в июне 2001 г являются следствием общих климатических изменений. Однако для окончательных утверждений относительно стабильности состояния фитопланктонного сообщества Черного моря и влияния на него меняющегося климата материалов еще недостаточно.

Значительный интерес представляют данные о численности вида и содержании фотосинтетических пигментов в клетках водорослей, измеренные по величине Ро. Они дают возможность оценить вклад отдельных видов в общее содержание фотосинтетических пигментов фитопланктонного сообщества. Учет эффективности фотосинтеза клеток позволяет оцентъ вклад данного вида в суммарную первичную продукцию фитоценоза

1.4. Термохемилюминвсценция фитоппанктонных организмов в природных условиях. Интенсификация процессов ПОЛ мембран является универсальной реакцией растительных клеток на действие неблагоприятных условий среды. В серии работ было показано, что ингенсивность высокотемпературной TXJI ХЛ пропорциональна содержанию продуктов ПОЛ в листьях высших растений, культурах водорослей и изолированных хлоропластах (Arnold, Sherwood, 1959; Маторин и др. 1988; Венедиктов и др. 1989; Вавилин и др.1991; Merzlyak et al. 1992). До начала наших работ исследования ТХЛ фитопланктона в природных условиях носили эпизодический характер и не рассматривали роли ряда факторов, способных вызвать окислительное повреждение водного фитоценоза. В связи с этим целью, проведенных нами работ, бьшо выяснение основных факторов, определяющих интенсивность ТХЛ и ПОЛ фитопланктона в природных условиях.

Исследования проводили в комплексной биологической экспедиции на НИС «Витязь» в различных районах Черного моря и Атлантического океана в августе-ноябре 1991 г. Для измерения люминесценции ХЛ пробу воды объемом 1 л, содержащую фитопланктон, осаждали на стеклянный фильтр GF/F Whatman. Относительное содержание ХЛ в осажденных на фильтр клетках определяли по интенсивности флуоресценции образцов при длине волны возбуждении 440 нм на 683 нм. Измерение ТХЛ водорослей на фильтрах проводили при помощи разработанного нами прибора, который обеспечивал надежную регистрацию сигнала от образца, содержащего 10" 11 г ХЛ. Величины подводной ФАР измерены сотрудниками Института океанологии Польской АН Б. Возняком и Р. Хаптером [32].

В Черном море уровень ТХЛ фитопланктона, нормированный на концентрацию ХЛ был выше на глубинахнизкимдержанием пигментов на единицу объема воды. Аналогичные изменения ТХЛ наблюдали и для мезотрофных водверо-западной Атлантики. Веднем, уровень ТХЛ в пробах микрофигопланктона был в 2-10 раз выше, чем в пробах нанофитоплашего-на. Для большинства исследованных районов Атлантического океана характерно экспоненциальноеижение интенсивности ТХЛувеличением глубины, котороевпадалоизменением дозы поглощенной ФАР, Низкий уровень ТХЛответствовал пробам водыгоризонтов, где условия наиболее благоприятны для нормального развития водорослей. На меридиональном разрезе (44° ± 1° з.д.) Атлантического океана от 53° до 40°ш. приещениисевера на юг в пробах воды верхних (до 30 м ) горизонтов обнаружено увеличение интенсивности ТХЛ. Эти измененияпровождались ростом температуры воды. Набширотном разрезе Атлантического океана (от 28°40'ш. 66°00' з.д. до 21°14'ш. 17°43' з.д.) обнаружено постепенное нарастание ТХЛ микрофитопланктона до максимального уровня в точке около 45° з.д., а затемижение до очень низких значений. Эта зависимость была особенно контрастно выражена на пробах воды15 м, где данная закономерность более всегоответствовала изменениюммарной биомассы кокколитиновых водорослей и цианобахгерий. Такой вывод основан не только на результатах таксономического анализа, но и на данных люминесцентного анализадержания в пробах фитопланктона ХЛ и фикобилиновых пигментов. Интенсивность ТХЛ, как правило, оказывалась выше в образцах микрофитопланктона с относительно более высоким содержанием фихобили-нов.

Полученные данные свидетельствуют о том, что закономерности изменения интенсивности ТХЛ природных популяций фитопланктона в разных районах Черного моря и Атлантического океана определяются действием и соотношением трех основных факторов: температуры воды, подводкой облученности и видового состава фитопланктона. Взаимосвязь влияния различных факторов на окислительное повреждение ФСА клеток фигопланктонного сообщества имеет сложный характер. При изучении природных сообществ водорослей выделить роль какого-то определенного фактора среды возможно только в условиях, когда его влияние оказывается определяющим. Тем не менее, основные тенденции можно проследить и путем обобщения большого массива данных. На рис. б представлены обобщенные данные о связи интенсивности ТХЛ с подводной облученностью и температурой на станциях субширотного (Рис. 1 А) разреза. Зависимости ТХЛ от дозы ФАР, получаемой фитопланктоном, и температуры воды размыты. Тем не менее, явно прослеживается тенденция снижения ТХЛ при малых интенсивностях света и низкой температуре. В подавляющем большинстве наших измерений интенсивность ТХЛ с глубиной зеркально соответствовала содержанию ХЛ. Из этого следует, что в благоприятных для развития фигопланктонного сообщества условиях процессы окислительного повреждения ФСА протекают на очень низком уровне. Высокий же уровень ТХЛ является показателем значительного окислительного повреждения ФСА фитопланктона н, соответственно, малой заселенностью горизонта. Исключения могут бьгть связаны с быстро меняющимися условиями среды, когда ответная реакция организмов не успевает реализоваться в численности клеток фитопланктона. о ото ср <*> о о со .»о о а» о о ей «О о

О ОЛ О й ° о о еоа» о

-2-1012 Облученность, 1д ФАР

5 10 15 20 25 30 Температура, "С

Рис. 6. Зависимость перекисного окисления липндов фитопланктона (по данным высокотемпературной хсмнлю-минесценцин) от подводной освещенности (А) и температуры (Б) в центральной части Атлантического океана.

2. Исследования закономерностей повреждения ФСА культивируемых водорослей

Исследования состояния ФСА фитопланктонных сообществ и индивидуальных видов водорослей продемонстрировали перспективность использованных подходов для решения ряда гидробиологических и экологических задач. Однако при исследованиях состояния ФСА фитопланктона в природной среде часто бывает невозможно однозначно интерпретировать полученные результаты. Это вызвано двумя обстоятельствами: вариацией многих природных факторов, большую часть которых не удается контролировать, и недостаточным знанием стадий и последовательности событий при повреждении ФСА. Для понимания ряда закономерностей протекания природных явлений, связанных с нарушениями функционирования ФСА водорослей, необходимо установить механизмы повреждения и деструкции ФСА на культурах водорослей в контролируемых условиях.

2.1. Фотодеструкция пигментов в клетках цианобактерий

Цианобактерии чрезвычайно широко распространены в биосфере и являются важным компонентом многих экосистем. Большой диапазон условий, приемлемых для обитания цианобактерий, видимо, обусловлен их высокой устойчивостью к действию многих неблагоприятных факторов среды и, в частности, к действию интенсивных потоков видимого и УФ облучения. Пигменты фотосинтегического аппарата цианобактерий представлены Хп а, каротиноидами н фи-кобилинами, полосы поглощения которых сравнительно мало перекрывают друг друга, что позволяет следить за изменениями содержания каждого из компонентов. Такой объект методически чрезвычайно удобен для изучения общих механизмов незакономерностей фотодеструкции пигментов фотосинтегического аппарата in vivo под действием видимого и УФ облучения.

Исследование фотоокислительной деструкции основных фогосинтетических пигментов цианобактерий (ХЛ, каротиноидов и фикобилинов) при действии интенсивных потоков видимого и УФ-излучения проводили1 спектрофотометрическим методом на клетках Anabaena variabiliss АТСС 29413, а также на клетках и изолированных мембранах Synechococcus elongatus В267 [31].

Облучение суспензий этих цианобактерий при высокой плотности мощности видимого (23,6 ммоль кв.м'2'с"') и УФ излучения (0,45 ммоль кв.м'2с"') в течение времени, большем 30 мин, приводило к снижению содержания пигментов. В начальный период (до 30-45) мин облучения цианобактерий наблюдалось незначительное снижение содержания пигментов клеток (лаг-период), тогда как при дальнейшем облучении процесс деградации пигментов значительно ускорялся. Культивирование клеток A. variabilis при различных интенсивности освещения приводило к изменению соотношения пигментов. Показано, что в клетках, выращенных при высокой

Длина волны, нм

Рис. 7. Спектры поглощения суспензий клеток цнанобактерии КлаЬаепа variabiles при действии 23,6 ммоль ки.'м^с4 видимого (А.) и 0,45 ммоль кв/м'^с'1 УФ-Б (Б) излучения. Спектры корректированы на светорассеяние. Цифрами обозначено время облучения в мин. освещенности увеличивалось содержание каротйноидов и снижалось содержание фикобилинов то отношению к хлорофиллу. Клетки, адаптированные к условиям высокой освещенности, обладали большей устойчивостью в отношении деградации пигментов к действию видимого света высокой интенсивности, чем выращенные при низкой освещенности. Оказалось, что скорость фотодеструкции пигментов A. variabilis мало зависит от температуры, при которой проводили облучение в диапазоне от 8 до 32° С. Периодическое облучение цианобактерий, когда действие видимого света плотностью мощности до 23,6 ммоль кв. м"2с"' в течение 2-10 мин чередовали 10-15 мин темновым интервалом, не вызывало повреждения. Небольшое (3-5% от исходного уровня) снижение оптической плотности суспензии клеток в начальный момент облучения может быть обусловлено деградацией пигментов не ассоциированных в ФСА, возможно, в составе отмирающих клеток. Видимо, при пролонгированном действии света высокой интенсивности сначала наступает восстановление переносчиков ЭТЦ, увеличение скорости генерации АФК, фотоингибирование РЦ, блокирование ЭТЦ, затем происходит окислительное разрушение пигментов за счет фотодинамического действия ХЛ.

УФ-В облучение приводило к разрушению пигментов цианобактерий существенно отличному по спектральным и кинетическим характеристикам от действия видимого света (рис. 7). Облучение видимым светом после лаг-периода вызывает сначала деструкцию фикобилинов и ка-ротиноидов, а только затем ХЛ а. При УФ-В облучении период индукции в разрушении фикобилинов отсутствовал и они деградировали с высокой скоростью. Затем происходило преимущественное разрушение харотиноидов по сравнению с ХЛ а. Такие эффекты обусловлены прямым действием УФ-В излучения на белковый хромофор фикобилинов, белки в составе ФСА, а также системы биосинтеза белка.

Из приведенной в таблице 4 оценки видно, что квантовые выходы фотодеструкции пигментов при действии УФ-В излучения и видимого света различаются во много раз. Близкие скорости деградации пигментов при действии видимого света достигаются при значительно больших интенсивностях, чем при УФ-В облучении.

Таблица 4. Максимальный квантовый выход выцветания пигментов А. уапаЬШ» при действии видимого света и УФ-В излучения (моль разрушенных пигментов / моль поглощенных квантов).

Фикобилины Хлорофилл а Каротиноиды

УФ-В излучение Видимый свет 210" 2-104 510"2 510"3 3 10'

Облучение цианобактерий видимым светом в анаэробных условиях (при барбатировании суспензии клеток азотом) практически исключало деградацию пигментов. В тех же условиях УФ-В облучение приводило к разрушению фикобилинов только несколько более медленному, чем на воздухе. При этом содержание каротиноидов и ХЛ а почти не изменялось. Таким образом, деструкция фикобилинов при действии УФ-В облучения происходит и в анаэробных условиях, но ускоряется в присутствии кислорода, а фотодеградация каротиноидов и ХЛ а в клетках цианобактерий является окислительным процессом. Фикобилины A. variabilis обладали высокой устойчивостью к действию видимого света. Частичная деградация фикобилинов наблюдается только при очень длительном действии света. Вероятно, разрушение фикобилинов обусловлено их взаимодействием с АФК [31].

Фотодеградация ХЛ а при действии УФ-В и видимого излучения на ранних стадиях происходит преимущественно за счет длинноволновых форм этого пигмента, о чем свидетельствует сдвиг красного максимума поглощения с 678 нм в начале облучения до 668 нм к его окончанию. В ходе фотодеградации пигментов цианобактерий происходят спектральные изменения ХЛ айв полосе Соре. Максимум спектра поглощения с 436-440 нм в ходе облучения смещается до 404420 нм, что характерно для фотодеградации Хл а в растворе [31].

Облучение видимым светом раствора лютеина (доминирующего среди каротиноидов А. variabilis) при длительном времени экспозиции на свету практически не вызывает его деструкции. В экстракте из клеток A. variabilis, содержащем Хл и каротиноиды, полное фоторазруще-ние ХЛ а сопровождалось 50% выцветанием каротиноидов. Скорость и глубина фотодеструкции каротиноидов увеличивались в мембранах и клетках. Эти факты указывают на то, что деградация каротиноидов происходит за счет фотосенсибилизирующего действия ХЛ а. В клетках цианобакгерий под действием видимого света каротиноиды подвержены наиболее быстрому выцветанию по сравнению с другими пигментами. Полное выцветание каротиноидов происходило при 70% уровне деградации ХЛ а. При действии УФ-В излучения деструкция каротиноидов в клетках цианобакгерий происходила сразу после деградации фикобилинов. На стадии фотодеструкции, соответствующей 50% выцветанию ХЛ а, каротиноиды исчезали полностью, после чего разрушение ХЛ а ускорялось.

Следует отметить, что при повреждении A. variabilis видимым и УФ-В излучением кроме изменений оптического поглощения происходят изменения светорассеяния. Снижение светорассеяния сопутствует глубоким деструктивным изменениям мембран. Таким образом, ряд оптических характеристик суспензий клеток, таких как поглощение определенных пигментов, накопление продуктов окислительной деградации Хл и светорассеяние, могут быть использованы для оценки состояния и глубины фотоповреждения цианобакгерий.

Эксперименты на различных видах водорослей (Ankistrodesmus falcatus, Thallassiosira weis-ßogii, Scenedesmtts quadricauda, Anabaena variabiliss, Chlorella vulgaris), в том числе и на индивидуальных клетках показали, что процессы фотодеградации пигментов начинаются только после полного блокирования цепи электронного транспорта фотосинтеза. Следует отметить, что главной системой, защищающей фотосинтетические пигменты от деструкции, является сам процесс фотосинтеза. И'только его нарушение, выражающееся в полном блокировании фотосинтетической ЭТЦ, создает условия для протекания фотодеструкции пигментов. Аналогичная последовательность событий сопровождает и фотодеградацию пигментов одиночных клеток высших растений. Эти эксперименты были выполнены при помощи микрофотометрии In situ на клетках Kalanchoe blosefeldiana.

2.2. Изменения фотосинтети ческого аппарата клеток зеленых (Ankistrodesmus falcatus) и диатомовых (Thallassiosira weisflogil) водорослей при действии света высокой интенсивности.

По предположению ряда авторов (Krause, Weis, 1991; Lokstein et al, 1994; Hideg, Murata, 1997) для защиты от окислительных повреждений фотосиигетического аппарата в его антенном комплексе и РД происходит целый ряд процессов, вызывающих увеличение вероятности безиз-лучательной диссипации энергии возбужденных светом пигментов. Это явление выражается в нефотохимическом тушении флуоресценции хлорофилла. Нефотохимическое тушение возбужденного ХЛ может быть вызвано 1) высоким значением концентрации протонов на мембране тилакоидов (энергизационное тушение); 2) переходом части светособирающего хлорофилл-белкового комплекса от ФС II к ФС I и перераспределение энергии возбуждения от реакционных центров ФС II к ФС I; 3) повреждением (окислением) самого реакционного центра ФС II;

4) переносом электронного возбуждения от ХЛ ФСII к молекулам каротиноидов, которые способны переводить энергию возбужденного состояния в тепло. Последний из перечисленных процессов может усиливаться в результате индуцированного светом изменения состава каротиноидов в пользу накопления в антенном комплексе деэпоксидированных каротиноидов за счет эпоксидированных форм (Ting, Owens, 1993; Lokstein et al, 1994; Young, Frank, 1996). В то же время существует миение о том, что тушение возбужденных состояний не влияет на процессы повреждения ФСА хлоропластов при действии света высокой интенсивности [Tyystjarvi, 1999]. Однако вклад конкретных процессов в диссипацию поглощенной фотосинтетическими пигментами избыточной энергии света и в защиту ФСА водорослей от фотоповреждения не вполне ясен.

Зеленые и диатомовые водоросли представляют основные таксономические Групп, заселяющие водные фитоценозы. Эти водоросли имеют значительные различия пигментного аппарата и, в частности, различные каротиноиды, участвующие в диссипации энергии возбужденных состояний ХЛ.

Облучение суспензий зеленых (A falcatus) и диатомовых (Th. weisflogii) водорослей видимым светом с плотностью мощности 8 ммоль кв.'м"2с"' вызывало повышение уровня нефотохимического тушения XJ1. При этом Fm снижалось приблизительно втрое по отношению к первоначальному значению и приближалось к Fo. После кратковременного облучения (5-15 мин) происходило достаточно быстрое восстановление показателей фотосинтетической активности: в течение 10-20 мин все флуоресцентные показатели практически возвращались к исходному уровню, коэффициент нефотохимического тушения (qN) за это время снижался практически до нуля. После более длительного облучения (30 мин) восстановление фотосинтетической активности происходило гораздо медленнее, в течение 2 ч. После 60-минутного облучения полного восстановления фотосинтетической активности не происходило и спустя 2 ч. В этих условиях отмечено некоторое повышение F» по сравнению с первоначальным значением. При облучении водорослей в течение 2 ч наблюдали лишь частичное восстановление показателей фотосинтетической активности [36,44, 45).

Для выяснения вклада индуцированных светом превращений каротиноидов в защите фотосинтетического аппарата клеток от фотоповреждения суспензию водорослей инкубировали с ингибитором деэпоксидазы - дитиотриэтолом (ДТТ), который использовали ранее с этой целью на диагомеях (Lokstein et al, 1994; Lohr, Wilhelm, 1998). Действие ДТТ контролировали по индуцированным светом изменениям спектров поглощения [44]. Облучение натйвных клеток приводило к изменениям оптической плотности в области поглощения каротиноидов (450-560 нм) и появлению в дифференциальном спектре максимумов при 474 и 508 нм. Предварительное инкубирование клеток с 2 мМ ДТТ вызывало значительное уменьшение индуцированных светом изменений в области поглощения каротиноидов. Эта данные указывают на то, что ДТТ ингибиро-вал индуцированные светом превращения каротиноидов у Th. weisflogii. Аналогичные данйЫе получены и на зеленой водоросли A. falcatus.

Сразу после окончания облучения (10 мин при 1,6 ммоль кв. м с ) у суспензии диатомовых водорослей, инкубированных с ДТТ, наблюдали повышение Fo (рис. 8 б), по сравнению с первоначальным значением. В течение последующих 2 ч Fo снижался до исходного уровня. Величина Fm после облучения в течение 2 ч оставалась неизменной (рис. 8 а, б). После облучения большими дозами видимого света (30 мин при плотности мощности 4 ммоль кв. м"2с ') у контрольной суспензии диатомовых водорослей (без ДТТ) в течение 2 ч происходило почти полное восстановление флуоресцентных показателей фотосинтетической активности (рис. 8 в). В присутствии ДТТ в первые минуты после окончания облучения наблюдали небольшой рост значения Fo, в дальнейшем происходило его снижение ниже Исходного уровня (рис. 8 г). Величины Fm и Fv/Ftn в этих условиях били значительно меньше, чем до облучения й не йОсстанавливались в течение 2 ч. м ы гл

15-«,

I—« —■

Ф i^rjf, время, мин

Рис. 8. Кинетика показателей флуоресценции ХЛ клеток Тк. »е^Ао^Ц после облучения светом без и после добавления 2 мМ ДТТ. а и б - облучение с плотностью мощности 1,6 ммоль кв. м ' с"1 в течение 10 мин без и после добавления ДТТ соответственно; в и г - облучение с плотностью мощности 4 ммоль ка. м ' с ' в течение 30 Мин без й После добавления ДТТ соответственно (стрелками указаны моменты включения н выключения света).

После окончания облучения суспензии водорослей в присутствии ДТТ уровень нефотохимического тушения qN был значительно ниже, чем после облучения такими же дозами водорослей в отсутствии ДТТ, Восстановление уровня Fm после облучения водорослей без ингибитора небольшими дозами видимого света носит двусгадийный характер. На первой стадии, в течение 15-20 мин, увеличение Fm , видимо, обусловлено перестройкой состава каротиноидов в условиях слабого освещения. На' это указывает то, что в присутствии ДТТ первая стадия увеличения Fm не наблюдается в связи с блокированием возможности ксантофилового цикла. Вторая стадия снижения уровня нефотохимического тушения, соответствующая дальнейшему росту Fm почти до контрольного уровня, видимо, обусловлена ресинтезом белков РЦ. Известно, что процессы синтеза белка ФСА протекают за времена порядка нескольких часов (Barber, 1998). При более глубоких уровнях повреждения интенсивным светом, а также в присутствии ДТТ вторая стадия не обнаруживается, что может быть обусловлено нарушением системы синтеза белка.

Высокий уровень нефотохимического тушения хлорофилла после облучения большими дозами видимого света наиболее вероятно, обусловлен необратимым окислением РЦ значительной части клеток. Отсутствие восстановления фотосинтетических функций водорослей после окончания облучения светом высокой интенсивности в условиях ингибирования деэпоксидазы ДТТ (Рис. 8 б, г) указывает на большой вклад светоиндуцированных изменений каротиноидов ксан-тофиллового цикла в защиту фотосинтетического аппарата от фотоокислительного повреждения.

При еще больших дозах облучения, по-видимому, происходили необратимые нарушения фотосинтетического аппарата, включающие повреждения не только белков, но также липидов и пигментов реакционных центров [36]. Эти нарушения, по-видимому, и вызывали потерю фотосинтетической активности большой части клеток. На этих этапах фотоокислительного повреждения наблюдали снижение оптической плотности суспензии водорослей за счет деградации пигментов.

2.3. Изменения фотосинтетического аппарата клеток зеленых (Ankistradesmus falcatus) и диатомовых (Thallassiosira weisflogii) водорослей при действии УФ-излучения. Процессам фотодеградации пигментов водорослей предшествует нарушение функционального состояния их ФСА. УФ-излучение способно оказывать прямое воздействие на белковые компоненты ФСА и, прежде всего, белка Д1 (Asada, Barber, 1987-2002). Кроме того, УФ-излучеие приводит к нарушению системы синтеза белка и, таким образом, препятствует процессам репарации при фотоповреждении.

Изменения состояния популяции микроводоросли A. falcatus наблюдали на стадии линейного роста культуры после кратковременного воздействия УФ-излучения большой мощности и спустя сутки после облучения. При всех выбранных дозах УФ-облучения значения Fv /Fm снижаются сразу после облучения. При больших дозах снижение Бу/Тт достигает уровня 0,06 -0,03, что означает практически полное ингибирование первичных процессов фотосинтеза. Через сутки после воздействия малых доз облучения (0,6 ммоль кв.м"2с"', 3 мин) эффективность первичных процессов усвоения света восстанавливается до исходного уровня. При более высоких дозах облучения полного восстановления Ру/Рт средн. не происходило [36].

Средние значения флуоресценции Ио сразу после облучения изменяются незначительно за исключением самой большой дозы (4 ммоль кв.м'2с"', 12 мин.), когда оно составило 68% от контроля. Такой результат указывает на практическую неизменность пигментного аппарата клеток А. /а!саш в ходе УФ-облучения и сразу после облучения за исключением самой большой дозы, когда происходит частичная фотодеструкция фотосинтетических пигментов, что наблюдали по спектрам поглощения суспензии водорослей (данные не приводятся). Инкубация в темноте в течение суток после облучения приводила к увеличению ро по сравнению с контрольным, что может быть вызвано нарушением связи антенного аппарата с фотосинтетическим реакционным центром, происходящим не во время облучения, а на более поздних стадиях.

Сопоставление последствий облучения мшфоводорослей УФ- и видимым светом при одинаковых дозах показывает, что в ходе УФ-облучения не происходит восстановление первоначального состояния фотосинтетического аппарата клетки, тогда как при облучении видимым светом фотосинтетеческий аппарат восстанавливается полностью.

3. Функциональная неоднородность особей и состояние популяций водорослей

Генетическое и эпигенетическое разнообразие особей является фундаментальным свойством организации популяций. Неоднородность качественного состава особей обеспечивает способность популяции адаптироваться к изменяющимся условиям среды. Характер распределения особей в популяции по какому-либо признаку изменяется в соответствии с условиями среды.

Выбор признаков для исследования показателей распределения особей в популяции может быть произвольным. Однако наиболее значимыми представляются признаки, характеризующие жизненно важные функции. Действие неблагоприятных факторов среды приводит к необходимости увеличения по сравнению с оптимальным затрат энергии организмом для поддержания своего состояния. Исходя из этого, обеспеченность организма энергией оказывается одним из главных факторов его адаптационных и репарационных возможностей. Адаптационные реакции, как правило, направлены на сохранение систем, обеспечивающих организм энергией. Нарушения эффективности функционирования этих систем являются важнейшими симптомами повреждения организма. Таким образом, в случае водорослей показатели состояния и функционирования фотосинтегического аппарата клетки представляются наиболее значимыми для оценки степени повреждения организма. Распределение особей по величине признака, характеризующего уровень функциональной активности клеток, можно назвать функциональной структурой популяции аналогично размерной или возрастной структурам. Так как функциональная структура популяции может служить показателем состояния популяции в условиях среды обитания, то популяция является своего рода биосенсором состояния экосистемы в целом, чутко реагируя на изменения условий среды. Кроме того, можно предположить, что характеристики функциональной структуры определяют динамику численности популяции.

К началу наших исследований данные о связи функциональной структуры популяции одноклеточных водорослей с ее состоянием и динамикой численности отсутствовали в связи с тем, что не существовало количественных методов определения функциональной активности ФСА индивидуальных клеток водорослей.

3.1. Исследования связи структуры популяции с ее состоянием путем классификации водорослей по типам кривых индукции флуоресценции хлорофилла индивидуальных клеток. В популяции микроводорослей присутствуют клетки, находящиеся в различных физиологических состояниях и отличающиеся по реакциям ФСА на действие света. Это проявляется в различных формах, индукционных кривых флуоресценции хлорофилла этих клеток. Использование микрофлуориметрического метода позволяет зарегистрировать множество кривых индукции флуоресценции одиночных клеток. Набор таких кривых может быть показателем функциональной неоднородности особей в популяции.

Хлорококковая водоросль Scenedesmus quadricavda при нормальных условиях культивирования образует 4-клеточяые цеяобми. В качестве базы ЩЯ анализа функциональной структуры этой водоросли в процесс? культивирования было зарегистрировано 2547 кривых индукции флуоресценции от ценобиев. Исходными признаками, по которым оценивали форму кривых индукции флуоресценции, были величины интенсивности флуоресценции, измеренные в фиксированные моменты времени от 0 до 200 с [30, 3.4]. В качестве переменных для оценки различных типов кривых щщукции флуоресценции использовали разности логарифмов интенсивно-стей в последовательные моменты времени. Анализ коэффициентов корреляции позволил оставить 6 признаков, характеризующих каждую клетку. Затем было проведено »шейное преобразование шкал всех 6 признаков, таж, что каждый из них оказался в диапазоне от 0 до 1. Для классификации объектов был использован один из методов кластерного анализа - метод К-средних (Дюран, 1977). Этот метод предусматривает априорное задание числа кластеров. Нами был разработан критерий «удачности» проведения кластеризации. Он основан на сопоставлении среднего межкластерного эвклидова расстояния и среднего расстояния от центра кластера до его крайнего элемента, а также отсутствие кластеров с очень малым числом элементов. л V-и о х ш

25С 200 1501 100 50 о

150 2Й время, с

-200 ереци.с

Рис. 9. Типы кривых индукции флуоресценции ХЛ отдельных четырехкпеточкых иеиобиев.

Такдм критериям наиболее полно удовлетворяло разделение популяции на 8 кластеров, соответствующих типам кривых индукции флуоресценции (рис. 9). Следует отметить, что при таком способе классификации среднее расстояние мевду кластерами в 2,8 раза превосходило среднее расстояние от центра кластера до его крайнего элемента. Пространство признаков, таким образом, обладало значительной дискретностью. На это указывает полное отсутствие объектов в пространстве между кластерами. Это пространство составляет более 95% всего пространства признаков. Такое положение может быть объяснено тем, что различные типы кривых индукции флуоресценции отражают смены участков лимитирования ЭТЦ фотосинтеза или ключевые переключения ее регуляторных механизмов.

Предложенный способ классификации объектов по кривым индукции флуоресценции хлорофилла был использован для анализа структуры популяции S. quadricauda по относительному обилию каждого типа кяегок на различных этапах роста культуры, а также при действии на нее гербицидов 310"5 М диурона и метилвиологена. Для удобства представления результатов не в форме обширных таблиц, а в графическом виде, был проведен еще один кластерный анализ сходства обилия элементов в каждом кластере по ходу развития популяции. За меру сходства брали так называемую манхегтеновскую метрику (МНМ):

HW-ZG».-**) где р/к - относительное обилие к-ю типа клеток в ;-й день, pjk - то же, но в j-й день.

В экологической практике эта мера известна под названием «процентная разница» (Whittaker, 1980), где она используется при оценке видового состава сообщества. Поскольку аналогия между таксономическим составом сообщества и типологическим составом популяции вполне оправдана, представляется оправданным и выбор данной меры сходства. Наглядное представление матрицы манхеттеновских расстояний получали при помощи метода немагрич-ного метода многомерного шкалирования в пространстве 2-х измерений (рис. 10). Расстояния между точками на этой диаграмме линейно коррелированы с манхетгеновскими расстояниями между соответствующими пробами. Рядом с каждой точкой цифрой указан день от начала опыта Ломаная линия, соединяющая точки в хронологическом порядке, образует своего рода «эволюцию популяции» в пространстве обобщенных переменных. Полученная в таком виде связь между фазами роста и функциональной структурой популяции установлена по относительному обилию особен с определенными типами кривых индукции флуоресценции. Как видно на рис. 10, показатели состояния популяции сразу после пересева в стадии лаг-фазы весьма близки к стадии стагнации. Переход в фазу линейного роста численности сопровождается существенным изменением функциональной структуры популяции. Представленный подход может быть использование для оценки фазы развития популяции водорослей и прогнозирования динамики ее численности.

В результате окислительного повреждения функциональная структура популяции водорослей существенно изменяется. При этом некоторые клетки полностью сохраняют свое функциональное состояние и соответствующую кривую индукцию флуоресценции. Метилвиологен является гербицидом, механизм действия которого основан на окислительном повреждении ФСА в результате усиления генерации АФК за счет переноса электронов с акцепторной стороны ФС1 на кислород. Выращивание культуры S. quadricauda с 10"6 М метилвиологена приводило к некоторому торможению скорости роста и существенным изменениям структуры популяции водорослей. При дальнейшей инкубации водорослей с метилвиологеном происходит частичное восстановление фотосинтетической активности клеток. Проведение многомерного шкалирования, аналогично рассмотренному выше, выявляет значительные различия между областями, соответствующими развитию популяции водорослей в норме и при действии повреждающего фактора (рис. 10).

Представленный на том же рисунке эффект действия на культуру 5. циас{псаш1а другого гербицида - диурона показывает, что такой анализ позволяет различать токсические агенты по механизму действия на ФСА и, соответственно, кривые индукции флуоресценции.

Таким образом, разработан новый метод для оценки состояния популяций водорослей иа основе анализа кривых индукции флуоресценции хлорофилла индивидуальных клеток. Впервые координата 2 1. sol «Г sc^42—--- /sd

IcGe^« 1.

0.5 1 1. координата 1 Рис. 10. Проекция в обобщенных координатах 8-мерного образа, отражающего динамику структуры популяции S. quadricauia. а различных условиях культивирования: du — с днуро-ном, mv — с метилвиологеном, sel — при плотности посева 9-10* кл./мл, sc2—при плотности посева 310' кл./мл. Цифрами обозначены дни культивирования по порядку. разработан алгоритм многомерного кластерного анализа, позволяющий классифицировать кривые индукции флуоресценции и способ отображения относительного обилия объектов определенных классов. На лабораторной культуре и на природных популяциях водорослей показаны возможности использований разработанного нами метода классификации и анализа Кривых'индукции флуоресценции хлорофилла для анализа функциональной структуры популяции и оценки ее состояния.

3.2. Связь функциональной структуры популяции с динамикой численности одноклеточных водорослей. Типичная зависимость прироста численности клеток в условиях лимитирования по интенсивности света в процессе култивирования водорослей от величины перекенной флуоресценции представлена на рис. 11.

Положительный прирост численности соответствует величине Ру/Рт>0,3. С ростом переменной флуоресценции прирост численности приобретает ускорение. Аналогичные результаты на природных фитоценозах отмечали Ра1котоЫ (1988) и Маторин (1992). Таким образом, в ряде случаев по величине средних значений переменной флуоресценции возможно прогнозировать динамику численности популяции водорослей. Однако такие зависимости выполняются только в условиях, когда скорость роста водорослей ограничивается недостаточной интенсивностью света при выращивании. В случае культивирования водорослей при более высокой (не лимити

ИМ (% в сутки)

2 .3 .4 .5 .8 Л

Ру/ЯШ

Рис. 11. Зависимость прироста численности клегток водорослей А. /ики/их от значения переменной флуоресценции ХЛ. рующей скорости роста) интенсивности света наблюдается меньшее значение РуЛчп по сравнению с медленнее растущей на слабом свету культурой водорослей. Возможно, это обусловлено повышением соотношение закрытых и открытых реакционных центров и, соответственно, увеличением уровня флуоресценции Бо и снижением Ру. При этом система синтеза белка не полностью компенсирует естественную деструкцию, вызываемую интенсивным светом, и соотношение закрытых и открытых реакционных центров поддерживается на несколько более высоком стационарном уровне. Снижение РуЛчп в таких условиях может сопровождаться значительным приростом численности клеток водорослей. В условиях избытка световой энергии эффективность ее утилизации не имеет значения. Более значимыми для возможностей увеличения численности водорослей в таких условиях представляются процессы диссипации избыточной для фотосинтегического аппарата энергии поглощенного света, защиты от усиления генерации АФК, снижение их концентрации и активизация процессов репарации.

В ходе накопительного культивирования водорослей происходят изменения функциональной структуры популяции. На рис. 12 приведена одна из Типичных для различных видов водорослей зависимость структуры популяции от времени культивирования. Как видно из рисунка, фазы экспоненциального и линейного роста' характеризуются относительно высокой однородностью, которая снижается в ходе культивирования. На стадии насыщения прироста численности клеток распределение становится двухвершинным за счет появления клеток с очень низким значением

0.2 0.4 0.6 0.

Fv/Fm

0.2 0.4 0 8 0.« Fv/Fm т---1-'-1--г

Время культивирования, сутки

Рис. 12. Изменение численности клеток и распределения значений переменной флуоресценции ХЛ популяции Chlorella vulgaris в ходе культивирования. переменной флуоресценции (Fv/Fm<0,2), видимо, соответствующих отмирающим особям. Такие клетки не накапливаются в популяции по причине усиления окислительного повреждения или включения механизмов апоптоза при достижении предельного уровня повреждения ФСА или нарушения нативности ДНК.

В популяциях водорослей, видимо, практически всегда даже при оптимальных условиях культивирования происходит деградация некоторой части клеток. На это указывают и прямые экспериментальные данные, и результаты математического моделирования размерной (по абсолютному значению величины Fo, соответствующие содержанию пигментов в клетке,) структуры популяции, проведенные нами для культуры Chlorella vulgaris [27]. Анализ результатов, полученных для различных вариантов моделей деления клеток, выявил несоответствие распределений клеток в модели измеряемым в эксперименте. Идентичность распределений могла быть достигнута только введением в модель условии, соответствующих деградации части клеток.

При действии на водоросли токсических соединений, таких как HgCk уже через сутки после добавления токсического вещества происходит снижение численности клеток в 10 раз и значительное увеличение гетерогенноси клеток на фоне снижения средних значений Fv/Fm [20, 21]. Через двое суток происходит дальнейшее снижение численности клеток. При этом сохранившиеся клетки обладают более высоким уровнем относительной переменной флуоресценции, чем в контроле. На третьи сутки фаза угнетения сменяется ростом численности культуры, а в последующие дни темпы прироста численности оказываются несколько выше, чем в контроле. Видимо, в этих условиях в среде культивирования концентрация ртути значительно понизилась за счет ее связывания в нерастворимые соединения, а сохранившие высокую эффективность фотосинтеза клетки обеспечили высокий прирост численности популяции водорослей.

3.3. Связь показателей флуоресценции хлорофилла микроводорослей с дефицитом биогенов.

В природных условиях водоросли часто испытывают дефицит тех или иных биогенов, в частности, азота. Азотное голодание водорослей вызывает ряд изменений фотосинтеггического аппарата, отражающихся в снижении относительной переменной флуоресценции, обусловленным повышением значения Fo3a счет нарушений в работе реакционных центров в связи с торможением синтеза белка Di (Barber, 1998).

Кроме отмеченных выше изменений азотное голодание вызывает изменение структуры популяции водорослей.

На рис. 13 приведены гистограммы распределения клеток термофильного штамма Chlorella vulgaris S-39/64686, по относительной переменной флуоресценции и содержанию хлорофилла при изъятии из среды культивирования соединений азота [20, 27]. Исключение азота из питательной среды уже через 6 ч приводит к снижению средних значений эффективности первичных процессов фотосинтеза (Fv/Fm). Дальнейшее азотное голодании приводит к понижению средних значений переменной флуоресценции ХЛ. При этом характер распределение клеток по данному показателю практически не меняется. Следует отметить, что при достаточно длительном дефиците элементов минерального питания (72 ч и более) не остается клеток, обладающих высоким значением Fv/Fm. Видимо, это обусловлено тем, что в популяции не может быть особей нечувствительных к дефициту биогенных элементов.

Таким образом, полное отсутствие в популяции эффективно функционирующих особей на фоне пониженных средних значений Fv/Fm свидетельствует о дефиците элементов минерального питания в среде. При этом гетерогенность клеток по данному признаку и, соответственно, величина среднеквадратичного отклонения невелики. Присутствие в популяции даже небольшого количества клеток, сохранивших высокую эффективность фотосинтеза, свидетельствует о воздействии на популяцию каких-либо циготоксических агентов, к которым индивидуальная чувствительность клеток сильно различается.

3.4. Изменения показателей флуоресценции хлорофилла водорослей двух видов при их совместном культивировании Изменения функциональной структуры популяций двух видов водорослей Chlorella vulgaris и Ankistrodesmus acicularis при их совместном культивировании представлены в табл. 6. К 37-м суткам в конкурентной борьбе побеждает Ch. vulgaris, обладающая более высоким уровнем относительной переменной флуоресценции. В популяции A. acicularis более 10% клеток имеют значение относительной переменной флуоресценции ниже 0,1, что указывает на практически

Рис. 13. Распределение по значениям переменной флуоресценции XJI клеток Ch. vulgaris в зависимости от продолжительности азотного голодания. полную инактивацию фотосинтетического аппарата этих клеток [27]. В соответствии с результатами этих экспериментов в природных условиях было проведено прогнозирование динамики численности индивидуальных видов водорослей в водном фитоценозе (раздел 1.2.).

Таблица 6. Изменение числа клеток (N) и переменной флуоресценции XJI (Fv/Fm) при совместном культивировании Chlorella vulgaris и Ankistroiesmm aciculark.

Время культивирования, дни Chlorella vulgaris Ankistrodesmus acicularis.

N(xl0") кл/мл Fv/Fm N(xl06) кл/мл Fv/Fm

5 2,4 0,64 2,0 0,

16 4,2 0,6 6 5,4 0,

37 7,3 0,59 2,8 0,

56 15 0,55 1,0 0,

3.5. Влияние фотоокислительного повреждения на гетерогенность клеток водорослей в популяции Оценку чувствительности к действию света высокой интенсивности проводили на отдельных клетках в составе популяции П. \veisflogii и Л. /а1са!ш путем измерения флуоресцентных показателей хлорофилла. На рис. 14 показано распределение клеток 77). \veisflogii по относительной переменной флуоресценции в зависимости от времени облучения видимым светом с плотностью мощности 8 ммоль кв.м^'с"1. Уже после 30 мин облучения отмечали

F/F =0.

Щгттгтл Ш

F/F =0. о.: о.4 FviFm, отн.ед. снижение среднего значения переменной флуоресценции с 0.58 до 0.31 (рис. 14 б). После 90 мин облучения большая часть клеток (около 70%) теряла фотосинтетическую активность. Однако, даже при больших дозах облучения сохранялись клетки с высокими показателями эффективности фотосинтеза (рис. 14 в). Через сутки после 90-минутного облучения в популяции наблюдали как клетки с высокой пере

Рис. 14. Зависимость распределения по относительной переменной флуоресценции клеток ТЬ. ¡УеиАовИ от времени облучения светом 8 ммоль кв-'м'^с*1. а - контроль, б и в - после облучения в течение 30 и 90 мин соответственно; г - через 24 часа после 90 мин облучения.

F /F , отн.ед. менной флуоресценцией, так и клетки, утратившие фотосинтетическую активность, причем доля первых составляла уже около 70% (рис. 14 г). Аналогичные данные были получены при действии света высокой интенсивности и на представителе зеленых водорослей А. /а1саШ5. В отличие от ТИ. \veisflogii А. /а!саш обладает большей чувствительностью к фотоокислительному повреждению. Приблизительно равные эффекты повреждения ФСА на зеленых водорослях проявляются при вдвое меньших временах облучения, чем на диатомеях.

После облучения малыми дозами видимого света (10 мин при 1,6 ммоль кв.м"2'с"') распределение клеток водорослей по ^/Рт в отсутствие ингибитора (табл. 7) практически не отличалось от первоначального (до облучения). При увеличении дозы облучения (30 мин при 1,6 ммо-ля кв.'м^'с"1,10 мин при 4 ммоля кв.'м"2с"',) распределение клеток водорослей по Ру/Ттв отсутствии ингибитора также приближалось к исходному варианту.

Предварительная инкубация водорослей с ДТТ в тех же условиях облучения приводила к необратимому снижению значений Ру/Рт и заметному уменьшению доли клеток с высокими значениями Ру/Рт. В результате облучения водорослей большими дозами света высокой интенсивности (30 мин при 4 ммоля кв. м'^с'1) в присутствии ДТТ уже у 80% всех клеток значения ру/Тт были близки к нулю, тогда как в клетках, облученных без ДТТ, доля неактивных клеток составляла только 50%. Даже при больших дозах облучения видимым светом высокой интенсивности как в присутствии, так и в отсутствии ДТТ, сохранялись клетки с высокой переменной флуоресценцией (табл. 7).

Таблица. 7. Зависимость переменной флуоресценции хлорофилла (Ку/Жю) клеток 1Ъ. кек/1о^к, инкубированных с 1 мМ ДТТ и без него, от времени и мощности облучения видимым светом. (Измерения проводили через 20-40 мин после окончания облучения.)

Вариант В отсутствие ДТТ В присутствии ДТТ

Плотность мощности облучения, ммоль кв.м"2 с"1 0 1,6 4 1,

Время облучения, мин

Тщ среднее 0,63 0,62 0,60 0,52 0,26 0,58 0,47 0,43 0,

Доля клеток с Р,/Рт>0.5, %

Доля клеток с 0.2<РУ/Рт<0.5, %

Доля клеток с Ру/Рт<0.2, %

Микрофлуориметрические исследования отдельных клеток в популяции водорослей показали, что не все клетки теряют свою активность при облучении большими интенсивностями видимого света. В этих условиях сохраняются клетки с высокими показателями фотосинтетической активности. Возможно, именно наличие части клеток с высокой относительной переменной флуоресценцией, сохраняющейся даже после больших доз облучения, обеспечивает адаптацию и устойчивость популяций в целом к условиям фотоокислительного повреждения в природных условиях. Аналогичная ситуация наблюдается и при распределении клеток, инкубированных с ДТТ, после облучения светом высокой интенсивности.

Характерно очень малое количество клеток с переменной флуоресценцией 0,1-0,3 через сутки после окончания облучения. Вероятно, часть клеток восстанавливает фото синтетическую активность (клетки с Ру/Тт = 0,5-0,7). Часть же клеток отмирает. Возможно, что такое отмирание связано не только с повреждениями фотосинтетического аппарата, но при этом начинают работать механизмы апоптоза. Не исключено, что у водорослей процесс запрограммированной гибели клеток реализуется в условиях глубокого повреждения ФСА за счет фотодинамичечкого действия ХЛ, не ассоциированного с ФСА.

4. ПОЛ субклеточных мембранных структур растений

4.1. Стимулируемое восстановленными пиридиннуклвотидами ПОЛ микросом растений Окислительное повреждение растений сопровождается ПОЛ или является его причиной (Мерзляк, Е1йпег, 1985-2000). Возможно, у растений окислительная деградация липидов в отсутствие облучения, может протекать разными путями, в том числе, и с участием липоксигеназы. Однако, действие липоксигеназы ограничено свободными жирными кислотами, да- и триацилглицери-дами. Значительно менее эффективен этот фермент в отношении полярных липидов и липидов в составе мембран. Физиологическая роль липоксигеназы до сих пор дискутируется. Долгое время оставалось не ясным, является ли липоксигеназный путь единственным ферментативным путем ПОЛ. В тканях животных образование перекисей липидов обусловлено, главным образом, ферментативной НАДФ-Н-зависимой системой ПОЛ (Арчаков, Владимиров, Аий, 19801999). Эта система локализована в мембранах эндоплазматического ретикулума и функционирует в присутствии двухвалентного железа. Мембраны эндоплазматического ретикулума растений имеют схожий состав ферментов свободного транспорта электронов, катализирующих гидро-ксилирование ксенобиотиков. Можно было предположить, что восстановленные пиридиннукле-отиды способны индуцировать ПОЛ в мембранах эндоплазматического ретикулума растительных клеток. Однако протекание таких реакциях в растениях к моменту начала наших работ не было изучено. В связи с этим мы исследовали процессы ПОЛ в микросомах растительных клеток, индуцированные восстановленными пиридиннуклеотидами [13,14, 15,18].

Добавление в суспензию микросом, выделенных из зеленых листьев и этиолированных проростков гороха, восстановленных пиридиннуклеотидов НАДН или НАДФН в присутствии Ре2++АДФ увеличивало скорость образования одного из продуктов ПОЛ - МДА. Образование МДА сопровождалось снижением содержания главным образом линоленовой кислоты. Относительное содержание других жирных кислот по данным газожидкостной хроматографии изменяется незначительно. Измеренное нами молярное отношение накопленного МДА к окисленной линоленовой кислоте составляет около 0,18 для микросом из этиолированных растений и не превышает 0,1 в микросомах зеленых растений [13, 14, 15, 18, 23]. Индуцированное восстановленными пиридиннуклеотидами ПОЛ сопровождается увеличением содержания перекисей полиненасыщенных жирных кислот и ускоренным образованием флуоресцирующих липофусци-ноподобных продуктов и конгьюгированных диенов гидроперекисей. В этих условиях происходит также накопление флуоресцирующих продуктов ПОЛ, представляющих собой преимущественно пгаффовы основания.

Парахлормеркурийбензоат и 5,5-дитионитробензойная кислота, действующие на сульф-гидрильные группы белков, ингибирукгт индуцированный восстановленными пиридиннуклеотидами процесс ПОЛ. Количество продуктов ПОЛ значительно возрастает при инкубации микросом в присутствии восстановленных пиридиннуклеотидов и Ре2++АДФ. Подавление накопления продуктов ПОЛ после термоинактивации препарата микросом и введения реагентов на SH-группы белков позволяет сделать вывод о ферментативном механизме, индуцированного пиридиннуклеотидами ПОЛ в тканях растений.

Обнаруженная нами пиридиннукйеотидзависимая система ПОЛ растений существенно отличается по ряду показателей от аналогичной системы животных. ПОЛ в микросомах растений в большой степени зависит от концентрации Fe2+. Увеличение концентрации ионов железа от 0 до 280 мкМ приводило к пропорциональному росту МДА в препаратах микросом растений, тогда как в микросомах животных значение константы Михаэлиса по отношению к железу равна 5-10 мкМ. В микросомах растений НАДН- и НАДФН-зависимое ПОЛ протекают с близкими скоростями, тогда как в микросомах животных НАДФН-зависимое ПОЛ значительно более эффективно.

Исследования субклеточной локализации системы ПОЛ, стимулируемой восстановленными пиридиннуклеотидами, показали, что во всех фракциях мембранных структур клеток листьев растений, в том числе и хлоропластах, добавление НАДН и НАДФН в присутствии железа стимулировало ПОЛ [15].

4.2. Ферментативное ПОЛ в хлоропластах листьев и его влияние на ФСА Нами было обнаружено, что в хлоропластах протекают процессы ПОЛ, вызванные восстановленными пиридиннуклеотидами. По сравнению с микросомами этот процесс протекает менее интенсивно. По скоростям накопления МДА в суспензии хлоропластов эффекты пиридиннуклеотидов сопоставимы с действием известного индуктора ПОЛ - системы железо-аскорбат. Функциональные показатели состояния фотосинтетического аппарата хлоропластов (кратковременные светоиндуцированные изменения концентрации Hf в присутствии ФМС и АДФ, скорость выделения кислорода в реакции Хилла, показатели длительного послесвечения и содержание

XJI) при инкубации с ферментативными индукторами ПОЛ практически не отличались от контрольных.

Инкубация хлоропластов с индукторами супероксидного анион-радикала (система ксантин - ксантиокидаза) не было обнаружено продуктов ПОЛ (Takahama, Nishimura, 1975). Видимо, это обусловлено тем, что генерация АФК, способных вызывать ПОЛ, происходит в водной фазе и не затрагивает мембранных структур хлоропластов. При индукции ПОЛ пиридиннуклеотидами или аскорбатом процесс окисления развивается непосредственно на мембранах хлоропластов. Однако, несмотря на это ферментативное ПОЛ не вызывает изменений функционального состояния ФСА. Возможно, пиридиннуклеотиды и аскорбат, являясь восстановителями, могут защитить ФСА, предотвращая возможное окисление сульфгидрильных групп белков или принимая участие в работе ЭТЦ. Но более вероятно, что процессы ферментными системами индуцируют ПОЛ на внешней мембране хлоропластов и практически не затрагивают фотосинтетических тилаюойдных мембран вблизи реакционных центров. Кроме того, тилакоидные мембраны, видимо, обладают мощной ферментативной и антиоксидантной защитой от АФК и развития ПОЛ. Наши исследования показали, что эффективность окислительного повреждения ФСА за счет процессов протекающих вне фотосинтетических мембран чрезвычайно низка. Видимо, повреждение ФСА может происходить только при индукции ПОЛ фотосинтетичеких мембран в непосредственной близости от РЦ за счет процессов индуцированных светом.

4.3. Окислительное повреждение хлоропластов индуцированное светом ПОЛ индуцированное светом мембран тилакоидов хлоропластов, как было показано в раде работ (Мерзляк, Heath, Nishimura, Packet, Takahama, Van Hasselt, 1968 -1995) вызывает накопление МДА, деградацию ненасыщенных жирных кислот, окислительную деградацию пигментов и другие изменения. Однако эти изменения лшшдов и пигментного аппарата наблюдали на глубоких стадиях повреждения хлоропластов, когда фотосинтетическая ЭТЦ была полностью инак-тивирована. В связи с этим задачей данной работы являлось выясненйе закономерностей повреждения ФСА хлоропластов в связи с развитием ПОЛ тилакоидных мембран.

Исследование индуцированного светом ПОЛ хлоропластов проводили без введения эндогенных кофакторов ЭТЦ, присутствие которых значительно затормаживает образование пере-кисных продуктов (Heath, Packer, 1968; Takahama, Nishimura, 1976). В таких условиях работа ЭТЦ направлена на восстановление кислорода. Скорость накопления МДА наиболее высока в первые 30 мин освещения хлоропластов. Накопление МДА в темноте происходит незначительно. Индуцированное светом ПОЛ хлоропластов сопровождается поглощением кислорода, деградацией каротиноидов и хлорофиллов. В большей степени происходит выцветание ХЛ а, чем ХЛ в. На ранних стадиях индуцированного светом окисления мольное отношение количества деградировавшего ХЛ к поглощенному Ог значительно ниже, чем на более поздних этапах этого процесса. На более поздних стадиях индуцированного светом ПОЛ наблюдается линейная зависимость между накоплением МДА и распадом хлорофилла, а также между деградацией хлорофилла и поглощением кислорода в диапазоне концентраций кислорода от 50 до 150 мкМ.

Скорость протекания индуцированного светом ПОЛ хлоропластов зависит от функциональной активности ЭТЦ. Инкубация суспензии хлоропластов с ингибитором нециклического транспорта электронов - диуроном при действии света высокой плотности мощности приводит к торможению ПОЛ. Этот факт может быть объяснен блокированием пути восстановления кислорода до супероксидного анион-радикала, с генерацией которого связаны процессы ПОЛ. Суспензия хлоропластов, инкубируемая с диуроном, уже через 10 мин после начала освещения теряет способность к фосфорилированию в присутствии ФМС и в значительной степени теряет способность к образованию градиента водородных ионов на мембране тилакоидов.

В процессе действия света на суспензию хлоропластов в присутствии кофакторов и ингибиторов были проведены исследования фосфорилирования, циклического элекгроннного транспорта в присутствии ФМС, длительного послесвечения суспензии хлоропластов, накопления МДА, деструкции хлорофилла и каротиноидов и скорости выделения кислорода в присутствии феррицианида калия. Индуцируемое светом ПОЛ хлоропластов сопровождается полным подавлением фотофосфорилирования в присутствии ФМС, о чем свидетельствует отсутствие вызванных освещением изменений рН при введении в суспензию ФМС и АДФ, а также снижение интенсивности люминесценции на медленной стадии индукции длительного послесвечения, которое может быть обусловлено снижением градиента зарядов на тилакоидной мембране. Через 20 минут освещения хлоропластов на 90% повышается содержание МДА и на 20% снижается количество ХЛ и каротиноидов. На этих стадиях окислительного повреждения фотосинтетический электронный транспорт полностью подавлен.

Таким образом, под действием света высокой интенсивности развивается окислительное повреждение хлоропластов, которое сопровождается полным подавлением индуцированного светом градиента ионов Н* и фотофосфорилирования. Глубокие стадии индуцированного светом ПОЛ протекают при полном подавлением фотосинтетического электронного транспорта и сопровождаются деградацией каротиноидов и ХЛ. При этом фотоокислительная деградация ли-пидов и пигментов может происходить только за счет фотодинамического действия ХЛ вплоть до его полного исчерпания.

5. ПОЛ и деструкция пигментов высших растений 5.1. Продукты окисления при старении листьев

При старении в органах и тканях животных и растений накапливаются липофусциновые пигменты, обладающие характерной люминесценцией в видимой части спектра. Нами было исследовано появление липорастворимых флуоресцирующих продуктов в отделенных листьях, представляющих удобную модель процессов старения растения в естественных условиях [16; 23].

Отделенные верхние листья гороха помещали в чашки Петри с водой или водным раствором кинетина, фитогормона задерживающего процессы старения, и инкубировали в темноте. Контролем служили неотделенные от растения листья. Уже на вторые сутки инкубации листьев интенсивность флуоресценции липидной вытяжки из них значительно превышала контроль. Анализ вытяжки методом тонкослойной хроматографии с последующем флуоресцентным сканированием хроматографических пластин показал присутствие в растениях ряда липорастворимых флуоресцирующих продуктов. Максимумы спектров возбуждения и испускания основных флуоресцирующих зон, снятые непосредственно с пластин, лежали при 370 и 438 нм. Интенсивность флуоресценции липидов возрастала в процессе инкубации листьев и была наибольшей на 6-й день. В процессе инкубации наблюдалось перераспределение соединений различающихся по хромагографической подвижности.

Таким образом, при старении листьев происходит накопление липорастворимых флуоресцирующих продуктов, которые по спектральным характеристикам флуоресценции, хроматогра-фической подвижности и молекулярной массе близки липофусцинам тканей животных. Образование этих продуктов наблюдается на ранних этапах старения листьев, когда не происходит заметной потери тургора, а количество разрушенного хлорофилла не превышает 10% от его содержания в интакгных листьях. Следует отметить, что в процессе старения листьев растений гороха не происходит увеличения в них содержания МДА. Можно предположить, что в тканях растений МДА с высокой скоростью расходуется, в том числе и на образование флуоресцирующих продуктов.

5.2. ПОЛ зеленых листьев и этиолированных проростков растений при действии гербицида — диквата.

Влияние ряда гербицидов на растения может быть обусловлено окислительным повреждением и в большой степени фотоиндуцированным перекисным окислением мембранных липидов. Мы изучали закономерности протекания ПОЛ в зеленых листьях и этиолированных проростках гороха после их обработки дипиридилиевым гербицидом - дикватом (бромистый 1,1-этилен-2,2'-дипиридилий) [13; 14]. Известно, что это соединение восстанавливается в фотосинтетической ЭТЦ и передает электрон на кислород образуя супероксидный анион-радикал.

Обработка растений дикватом приводила к накоплению МДА, Параллельно накоплению в зеленых растениях МДА происходила деградация пигментов и изменение жирнокислотного состава липидов. Деградация хлорофиллов протекает несколько медленнее деградации кароти-ноидов. К 96 ч после обработки содержание пигментов снижается более, чем вдвое. К этому же времени содержание линоленовой кислоты падает с 57% от всех жирных кислот у интакгных растений до 37% у растений, обработанных дикватом. Процесс пероксидации липидов, вызванный дикватом, сопровождается также образованием перекисей, выявляемых хроматографиче-ским методом, а также накоплением в 6-7 раз большего по сравнению с контролем количества липорасгворимых флуоресцирующих продуктов.

Таким образом, воздействие диквата на растения приводит к накоплению продуктов ПОЛ. Индуцированное светом в присутствии диквата ПОЛ развивается преимущественно в хлоропла-стах, где он выступает эффективным переносчиком электронов с акцепторной части ФС1 на кислород и, таким образом, является индуктором супероксидного анион-радикала.

При действии диквата и его аналога метилвиологена значительно увеличивается средняя скорость фотовыцветания. При этом распределение по скорости фотовыцветания участков мезофилла, измеренная микрофотометрическим способом, значительно изменяется. В контроле распределение близко к нормальному. При действии метилвиологена значительно возрастают дисперсия и эксцесс распределения, а отношение стандартного отклонения к среднему при действии метилвиологена выше, чем в контроле. Видимо, это обусловлено разной чувствительностью клеток к действию метилвиологена. Исходно гомогенный «ансамболь» клеток расщепляется под действием метилвиологена на группы резистентных и чувствительных к фотоповреждению клеток.

5.3. ПОЛ при действии на растения галоидфвноксикислот

Известно, что галоидфеноксикислогы (соединения по химическому строению близкие к некоторым фитогормонам) нарушают гормональный баланс растений. Такой механизм действия данных гербицидов не предполагает прямого влияния этих веществ на процессы ПОЛ. Обработка растений гербицидами класса галоидфеноксикислот вызывает глубокие изменения ультраструктуры клеточных мембран и нарушение их проницаемости. До наших исследований в литературе не было данных об индукции галоидфеноксикислотами деградации мембранных липидов растений. В связи с этим мы изучали влияние 2,4-дихлорфеноксиуксусной (2,4-Д), 2,4,5-трихлорфеноуксусной (2,4,5-Т), а также их неактивных аналогов 2,6-Д и 2,4,6-Т на перекисное окисление липидов этиолированных и зеленых растений гороха. Оба гербицида индуцировали пероксидацию липидов как в этиолированных, так и зеленых тканях. Уже через 12 ч после обработки растений гербицидами происходило увеличение содержания МДА. При этом значительно изменялся жирнокислотный состав липидов, были обнаружены перекиси липидов и флуоресцирующие продукты ПОЛ с максимумами возбуждения и испускания 360 и 430 нм соответственно. Содержание липорасгворимых флуоресцирующих продуктов более, чем в 10 раз превосходило контрольное. При этом содержание линоленовой кислоты снижалось с 60% до 43% [18].

Таким образом, галоидфеноксикислогы индуцируют ПОЛ в мембранных структурах как зеленых, так и этиолированных растений. Основные закономерности этого процесса близки к эффектам действия на растения индуктора О2" - диквата, но несколько отсрочены по времени. В тоже время добавление 2,4-Д к изолированным хлоропластам растений не приводит к накоплению продуктов ПОЛ. В связи с этим ПОЛ, индуцированное галоидфеноксикислотами, по-видимому, обусловлено непрямым действием на ФСА растений.

Как показали наши исследования [22, 23, 24] окислительное повреждение ФСА растений может быть инициировано за счет генерации АФК при непосредственном воздействии на компоненты ЭТЦ. Нарушения метаболических процессов прямо не связанных с образоаванием АФК могут вызывать окислительное повреждение ФСА оказывая опосредованное влияние на состояния фотосинтетической ЭТЦ. При этом нарушение функционирования системы электронного транспорта приводит к окислительному повреждению ФСА, видимо, протекающему по тому же сценарию, что и при прямом действии веществ ускоряющих генерацию АФК.

5.4. Спектры отражения листьев в процессах старения и действия неблагоприятных условий Нормальное развитие растений, их старение и действие неблагоприятных условий среды сопровождается изменениями в содержании и составе пигментов, определяющих их окраску. Изменения цвета листьев и плодов связаны, в основном, с трансформацией доминирующих фотосинте-гичеких пигментов: хлорофиллов и каротиноидов. Цвет растений также во многом зависит от присутствия окрашенных соединений другой природы (флавонондов, антоцианинов, танинов, продуктов окисления фенольных соединений и: др.).

Спектры отражения листьев клена и колеуса регистрировали у листьев, достигших периода зрелости и содержащих самые высокие количества хлорофилла, до поздних этапов их старения. Наиболее высокое значение отражения листья имеют в ближней ИК области (более 750 нм), где не проявляется поглощение хлорофиллов. При высоких концентрациях пигментов в красном максимуме поглощения хлорофилла а (около 678 нм) и в полосе 350-480 нм (где поглощают оба хлорофилла и каротиноиды) листья имели низкое отражение (0.05-0.06), которое мало изменяется при снижении концентрации хлорофиллов вплоть до 10-15 нмоль/см2, что связано с насыщением поглощения света пигментами уже при столь низких их концентрациях [35].

Максимальной чувствительностью к вариации содержания хлорофилла в листьях обладают два участка видимой части спектра: широкая полоса около 550-600 нм и узкая - около 700 нм. С использованием спектральных областей, обладающих максимальной и минимальной чувствительностью к вариации пигментов, был предложен ряд индексов, обладающих более высокой чувствительностью к концентрации хлорофилла к линейностью в широком диапазоне его концентраций (от темно-зеленых до желтых листьев) по сравнению с ранее применявшимися алгоритмами.

Очень часто (но не всегда) разрушение хлорофилла при старение растений, а также созреваний плодов не сопровождается одновременным разрушением каротиноидов, в результате чего листья приобретают характерную интенсивную желтую окраску. Это связано с тем , что даже при низких концентрациях каротиноидов их вклад в поглощение возрастает вследствие исчезновения зеленых пигментов й увеличения проникновения света в толщу листа. Согласно выдвинутой ранее гипотезе, сохранение каротиноидов в ходе старения растений является одним из механизмов защиты клеточных структур от фотодинамических эффектов излучения в синей области спектра (31].

Получены данные, показывающие, что полоса в области 480-500 нм существенно изменяется от содержания каротиноидов и флавоноидов, а соотношение коэффициентов отражения в этой области и при 678 нм может быть использовано для оценки темпов трансформации пигментов в стареющих листьях и созревающих плодах. Появление характерной бурой окраски растительных клеток и тканей наблюдается при механических повреждениях, старении, реакции сверхчуствительности при поражении патогенными микроорганизмами, а также является характерным симптомом некоторых инфекционных заболеваний и физиологических расстройств.

Анализ спектров отражения может дать важную информацию о течении естественного и индуцированного различными способами окислительного повреждения, а также о степени прошедшей деградации пигментов листьев и плодов растений на терминальных стадиях этого процесса. Изменения пигментного состава листьев или других ассимиляционных тканей являются результатом глубокого нарушения функционального состояния ФСА растений. Таким образом, для целей диагностики начальных этапов окислительного повреждения растений целесообразно использовать методы оценка состояния ФСА, тогда как по спеетрам отражения можно оценить глубину окислительного повреждения.

5.5. Изучение физиологического состояния древесных растений по характеристикам флуоресценции хлорофилла коры однолетних побегов. Измерение флуоресценции XJI нашли широкое распространение для изучения реакции растения на повреждение (Венедиктов и др. 1981; Havaux, Larmoyé, 1985; Ranger, Schreiber, 1986). Основным объектом таких измерений являются листья растений. Слой феллодермы в коре древесных растений содержит большое количество XJI, ассоциированного в ФСА и обладающего фотосинтетической активностью (Ortoidze et al., 1998). Измерение характеристик флуоресценции XJI интакгных побегов может значительно расширить возможности мониторинга состояния древесных растений, так как позволяет получать информацию о состоянии растения круглогодично.

Ыиле! Ы.

Рнс. 15. Средние значения переменкой флуоресценции ХЛ феллодермы коры однолетних побегов ТШШсотйаШ, произрастающих в сквере по улице Марии Ульяновой (А) и соответствующие значения дисперсии (Б).

Появляется возможность проследить динамику вхождения растений в покой зимой и выход их из покоя весной, что важно для прогнозирования состояния растений. Реализация такого подхода сопряжена с некоторыми методическими трудностями, вызванными тем, что содержащий ХЛ слой филлодермы покрыт оптически плотным пробковым слоем, имеющим значительную оптическую плотность и высокое рассеяние. Тем не менее, при соответствующем выборе условий измерений было показано, что на побегах различных древесных растений величина отношения Ру/Рт достоверно снижается под действием ингибиторов фотосинтеза, а также при ингибировании ФСА другими неблагоприятными факторами [39,40].

При помощи импульсной флуорометрической аппаратуры нами были проведены обследования состояния зеленых насаждений на нескольких улицах Москвы. В качестве примера на рис. 15 представлены результаты обследования состояния ФСА однолетних побегов лип в сквере улицы Марии Ульяновой. Измерение переменной флуоресценции ХЛ проводили на однолетних побегах липы. На одном дереве измеряли по 10-15 побегов. Распределение растений по переменной флуоресценции показывает достоверное ухудшение состояния ФСА деревьев вблизи Ленинского проспекта и несколько в меньшей степени вблизи проспекта Вернадского (рис. 15 а). Особенно контрастно нарушение физиологического состояния деревьев проявляется при определении среднеквадрагического отклонения значений рассчитанная по значению данного показателя на разных ветвях одного дерева (рис. 15 б). В благоприятных условиях отклонение от среднего значения ру/рт невелико. При этом все ветви имеют эффективность первичных процессов фотосинтеза близкую к максимальной. В неблагоприятных условиях у одних ветвей величина Ру/Тт значительно понижается, тогда как другие ветви сохраняют практически нормальное значение переменной флуоресценции. Нами было обнаружено, что средаеквдратичные отклонениями величины ¥у/¥т по ветвям у деревьев, находящихся в разном физиологическом состоянии на одной территории, могут различаться в десять раз.

Таким образом, разработанные нами методы исследования показателей флуоресценции ХЛ ассимиляционных тканей высших растений могут быть использованы для целей мониторинга состояния высших растений и оценки благополучия среды их обитания. Видимо, детальное исследование состояния растений возможно при использовании ряда методов. Наиболее перспективными для целей биоиндикации и мониторинга среды, видимо, являются использование флуорометрических методов в сочетании с определением спектров отражения. Как отмечалось выше, спектры отражения позволяют определить степень повреждения пигментного аппарата растения в данный момент времени, тогда как флуоресцентные показатели дают возможность определить функциональное состояние ФСА и прогнозировать дальнейшее развитие процессов повреждения растений. Работы последних лет показали, что комплексное использование спекгрофотометрических и флуоресцентных методов чрезвычайно перспективно для изучения адаптации высших растений к действию многих повреждающих агентов и, в частности, УФ-излучению (МагквШсИеге! а1,2001).

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Погосян, Сергей Иосифович

ВЫВОДЫ

Выявлены закономерности окислительного повреждения ФСА фототрофных организмов и проведен анализ признаков, характеризующих состояние ФСА водорослей и высших растений в природных условиях. Определена связь между характером действия неблагоприятных факторов среды и распределением клеток ц популяциях водорослей по признакам функциональной активности их ФСА. Разработаны новые способы определения состояния ФСА индивидуальных клеток водорослей для диагностики состояния их популяций в составе природного фитопланктониого сообщества. Создана новая методологическая база для биоиндикации, оценки состояния среды и целей экологического мониторинга.

1. Получены спектральные характеристики продуктов ПОЛ растений. Выявлены соотношения между изменением состава жирных кислот мембранных липидов в процессе ПОЛ растений, накоплением диеновых коньюгатов, малонового диальдегида, шиффовых оснований и продуктов окислительной деградации фотосинтетических пигментов. В клетках высших растений впервые обнаружена и охарактеризована пиридиннуклеотид-зависимая система ферментативного ПОЛ.

2. Окислительное повреждение ФСА растительных организмов различных таксономических групп происходит при действии света насыщающего фотосинтетическую ЭТЦ, в условиях, когда системы регуляции не справляются с чрезмерно большим потоком электронов и тушением избыточных возбужденных состояний ХЛ. Внешние по отношению к фотосинтетическим мембранам окислительные процессы прямо не влияют на работу ФСА. Продукты ПОЛ и окислительная деградация пигментов обнаруживаются только после полного блокирования системы фотосинтетического транспорта электронов. Скорости деструкции различных фотосинтетических пигментов в клетках зависят от спектрального состава действующего излучения и на терминальных стадиях близки к скоростям фотодеградации пигментов в растворах.

3. Фотоокислительное повреждении ФСА ассимиляционных тканей высших растений и водорослей развивается по единому сценарию при избыточном восстановлении компонентов фотосинтетической ЭТЦ и нефотохимическом тушении возбужденных состояний хлорофилла светособирающих комплексов. Затем последовательно происходят: нарушения нативности белка D1 РД ФС П и блокирование фотосинтетической ЭТЦ; нарушения барьерных функций фотосинтетических мембран за счет ПОЛ; окисление белков РЦ и деструктивные изменения всего ФСА; фотодеградация пигментов и накопление продуктов ПОЛ.

4. Выявлена последовательность изменений функционального состояния ФСА водорослей различных таксономических групп при действии видимого и УФ-облучения большой мощности. Показано, что ингибирование деэпоксидазы каротиновдов ксантофилового цикла приводит не только к снижению нефотохимического тушения флуоресценции хлорофилла, но и к усилению повреждения ФСА, индуцированного светом высокой интенсивности. Установлена зависимость между световыми условиями, в которых длительной время пребывали водоросли, и коэффициентом нефотофимического тушения ХЛ.

5. Снижение эффективности работы ФСА клеток водорослей при дефиците элементов минерального питания в среде не изменяет значений среднеквадратичного отклонения в распределении особей по данному показателю. Воздействие на водоросли токсических веществ или повреждающих излучений на фоне снижения средних показателей функциональной активности ФСА сопровождается увеличением гетерогенности в распределении клеток по этим показателям.

6. Разработана методическая база для исследований экологического состояния водных фи-тоценозов и обосновано использование комплекса флуоромегрических методов, позволяющих определять пространственное распределение фитопланктонных организмов in situ, выявлять условия длительной адаптации и быстрых регуляторных изменений состояния ФСА водорослей в пробах воды, а также оценить эффективность первичных процессов фотосинтеза и содержание пигментов в клетках. Распределение клеток природных популяций водорослей по показателям функционального состояния ФСА позволило оценивать их физиологическое состояние и также прогнозировать динамику численности массовых видов фитопланктона. Разработаны рекомендации по использованию флуорометрических методов для оценки физиологического состояния древесных растений.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1]. Т.Ф. Корецкая, В.А. Веселовский, С.И. Погосян, В.Н. Жолкевич «О соотношении между интенсивностью дыхания и сверхслабым свечением корней» ДАН СССР, 1968, № 4, с. 1005-1007.

2]. B.C. Маренков, С.И. Погосян, В.А. Веселовский «Техника регистрации сверхслабых световых потоков» Симпозиум «Сверхслабые свечения в биологии» 1969, М., МОИП, Изд-во МГУ, с.41-42.

3]. Т.Ф. Корецкая, В.А. Веселовский, С.И. Погосян, В.Н. Жолкевич «Сверхслабое свечение корней при обезвоживании» Физиология растений. 1970, Т. 17, вып. 4, с. 776-780.

4]. Д.А. Джанумов, В.А. Веселовский, Б.Н. Тарусов, B.C. Маренков, С.И. Погосян «Изучение температурной устойчивости растений методами спонтанной и фотоиндуцнрованной хем'илюминесценции» Физиология растений. 1971. Г. 18, вып.З, с. 588-593.

5]. Т.Ф. Корецкая, В.А. Веселовский, С.И. Погосян «О связи между окислением жирных кислот и сверхслабым свечением .растительных тканей» В сб. «Сверхслабые свечения в биологии», 1972, МОИП, т. 39, «Наука», М„ с. 173-176.

6]. JI.B. Лещинская, С.И, Погосян, A.A. Цей, В.А. Веселовский, Б.Н. Тарусов «Зависимость хемилюмныесценции растительных тканей от ионного состава среды» В сб. «Сверхслабые свечения в биологии», 1972, МОИП, т.39, «Наука», М.,с.182-185.

7]. С.И.Погосян, Т.Ф.Корецкая, В.А.Веселовский «Субстраты и ингибиторы сверхслабого свечения растительных тканей» В сб. «Сверхслабые свечения в медицине и сельском хозяйстве», 1974, М., МОИП, т. 50, изд-во МГУ, с.99-103.

8]. С.И. Погосян, A.B. Ципик, Г.Г. Рогацкий, А.И. Журавлев, B.C. Маренков, Г.В. Бурдина «Усройство для измерения сверхслабого свечения биологический субстратов» Авторское свидетельство №457892, 1975.

9]. Г. А. Даллакян, С.И. Погосян, В А. Веселовский, Б.Н. Тарусов «Использование реакции электрохемилюминес-центного окисления люминола для обнаружения биоантиоксидантов», «Биоантиокислители», Труды МОИП, 1975, т. 52, с. 157-164.

10]. Ким Мен Кук, В.А. Веселовский, С.И. Погосян «О связи биохемитоминесценции растительных тканей с переокислением липидов», «Свободнорадикальное окисление в норме и патологии» Сб. статей, М. МГУ, 1976, с. 148-149.

11]. М.Н. Мерзляк, С.И. Погосян, С.Г. Юферова, В.В. Шевырева «Использование 2-тиобарбитуровой кислоты при исследовании переокисления липидов втканях рабтений», Научи, доклады Высшей школы. Биол. науки. №9, 1978, с. 86-94.

12]. С.И. Погосян, A.A. Аверьянов, М.Н. Мерзляк, В.А. Веселовский «Внеклеточная хемилюминесценцня корней растений», ДАН СССР, т. 239, № 4, 1978, с. 974-976.

13]. Н.В. Шевченко, С.И. Погосян, М.Н. Мерзляк «Перекисное окисление мембранных липидов при действии на растения галоидфеноксикислот», Физиология растений, т. 27, № 2,1980, с. 363-369.

14]. М.Н. Мерзляк, С.И. Погосян, Н.В. Шевченко, П.К. Овчаров, В.Б. Румянцева «Перекисное окисление липидов в зеленых листьях и этиолированных проростках растений, обработанных дшсватом», Науч. докл. высшей шк. биол. н., 1980, № 6, с. 76-82.

15]. С.И. Погосян, 3. Цеденбал, М.Н. Мерзляк, Н.В. Шевченко «Стимулируемое восстановленными пиридиниук-леотидами перекисное окисление липидов микросом растений», Физиология растений, т. 28, J62, 1981, с. 286292.

16]. М.Н. Мерзляк, В.Б. Румянцева, С.И. Погосян, М.В. Гусев «Пигменты старения в растительных клепках: накопление в отделенных от растения листьях гороха», ДАН СССР, А256. №5,1981, с. 1264-1267.

17]. М.Н. Мерзляк, С.И. Погосян, В.£. Румянцева, A.C. Соболев, Н.В. Шевченко, М.В. Гусев «Хроматографиче-ские и спектральные харктеристики липорастворимых флуоресцирующих соединений, накапливающихся при повреждении и старении тканей растений», Биохимия, Т.47, вып.З, 1982, с. 425-433.

18]. S.I. Pogosyan, N.V. Shevchenko, M.N. Merzlyak "Stimulation of NADPH-dependent lipid peroxidation by 2,4-D, 2,4,5-T and diquat in microsomes isolated from Pisum sativum" Plant Sci. Lett, 1984, 37, № 2/3, 69-72.

19]. А.Б. Рубин, P.O. Оганесян, П.С. Венедиктов, С.И. Погосян, Д.Н. Маторин «Биофизические подходы к изучению водных экосистем», Сб. статей «Лимнология горных водоемов», Ереван, Изд-во АН Арм.ССР, 1984, с. 259-260.

20]. ДЛ. Сааюш, В.Е. Туровецкий С.И. Погосян «Использование метода микрофлуорометрин для оценки физиологического состояния одноклеточных водорослей», там же, с. 270-272.

21]. М.Ю. Горбунов, ДЛ. Саакян, А.Г. Дмитриева, С.И. Погосян «Исследование динамики численности зеленых водорослей люминесцентными методами», там же, с. 67-68.

22]. М.Н. Мерзляк, С.И. Погосян «Фотодеструкция липидов и пигментов в изолированных хлоропластах», Биол. Науки. 1986, №3, с. 8-20.

23]. М.Н. Мерзляк, С.И. Погосян «Кислородные радикалы и переокисление липидов в растительной клетке», Сб. статей «Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине», Рига, РМИ, 1988, с. 232-253.

24]. М.Н. Мерзляк, С.И. Погосян «Деструкция пигментов и липидов в изолированных хлоропластах под действием светового излучения», Сб. статей «Молекулярные механизмы биологического действия оптического излучения», М. «Наука», 1988, с. 55-70.

25]. В.И. Ведерников, B.C. Вшивцев, А.А. Демидов, С.И. Погосян, И.Н. Суханова, В.В. Фадеев, A.M. Чекалкж «Соотношение флуорометрических и фотометрических методов для исследования хлорофилла а в Черном море весной 1988 г.», Океанология, 1990, т. 30, вып. 5,368-371.

26]. И.Н. Суханова, С.И. Погосян, B.C. Вшивцев "Временные изменения структуры популяций массовых видов весеннего цветения" В сб. "Изменчивость экосистемы Черного моря", М. "Наука", 1991,117-128.

27]. С.И. Погосян, Г.В. Лебедева, Г.Ю. Рюшченко "Связь функциональной структуры популяции одноклеточных водорослей с ее динамикой" Ленинград, Гидрометшдат. Сб. статей "Проблемы экологического мониторинга и моделирования экосистем", 1991, т. 13, 280-297.

28], Г.А. Даллакян, М.М, Теличенко, И.В, Агеева, С.И. Погосян «Ингибироваяие роста микроводорослей фотосенсибилизатором бенгальским розовым» Гидробиологический журнал, Т.27, №2,1991, с.49-52.

29]. M.N. Merzlyak, О.В. Chivkunova, S.I. Pogosyan, LI. Kuznetsova, N.P. Ponomareva, V.A. Gudkovsky «Fluorecence of farnesene oxidation in extracts and intact fruits as related to the development of superficial scald storage of «An-tonovka» apples», Proc. Royal Soc. Edinburgh, Sect. B: Biol. Sci., 1994, vol. 102, pp.443-446.

30]. С.И. Погосян, М.А.Сивченко, B.H. Максимов «Физиологическая гетерогенность популяции микроводорослей.Классификация цеиобиев Scenedesmus quadricauda по типам кривых индукции флуоресценции хлорофилла» Изв. РАН, Сер. Биол., 1996, № 3, с. 337-343.

31]. М.Н. Мерзляк, С.И. Погосян, Л. Лехимена, Т.В. Жигалова, И.Ф. Хозина, 3. Кохен, С.С. Хрущев «Спектральная характеритика продуктов фотоокисления хлорофилла в растворах и при фотоокислснии цианобакгерий Anabaena variabilis», Физиология растений, т. 43, J& 2, 1996, с. 160-168.

32]. Ю.Н. Кауров, С.И. Погосян, А.С. Микоэлян, Б. Вознях, Р. Халтер « Опыт применения метода регистрации термохемилюмшесценции хлорофилла для оценки функционального состояния природных сообществ фитопланктона (по результатам 23-го рейса НИС «Витязь»)», Физиология растений, т. 43, № 4,1996, с. 629-637.

33]. G. Riznichenko, С. Lebedeva, S. Pogosyan, М. Sivchenko, A. Rubin «Fluorescence induction curves registered from individual microalgae cenobiums of population growth», Photosynthesis Research, 49, 1996, pp. 151-157.

34]. S.I. Pogosyan, M.A. Sivchenko, V.N. Maximov, M. Ostrowska «Physiological heterogenety of an algal population: classification of Scenedesmus quadricauda cenobia by the features of their photosynthetic apparatus», Oceanologia, 39 (2), 1997,pp. 163-175.

35J. М.Н. Мерзляк, А.А. Гшельсон, С.И. Погосян, О.Б. Чивкунова, Л. Лехимена, М. Гарсон, Н.П. Бузулукова, В.В. Шевырева, В.Б, Румянцева «Спектры отражения листьев и плодов при нормальном развитии, старении и стрессе», Физиология растений, т. 44, № 5, 1997, с. 707-716.

36]. С.И. Погосян, Э.В. Волкова, Ю.В. Казимирко, В.Н. Максимов, А.Б. Рубин «Изменения фотосинтетического аппарата индивидуальных клеток микроводоросли Ankislrodesmus falcalus в норме и при УФ-облучении» Доклады РАН, 1998. Т. 363, К» 5, с. 690-693.

37]. П.С. Венедиктов, Ю.В. Казимирко, Ю.Н. Конев, Т.Е. Кренделева, Г.П. Кукарских, О.Н. Лаврухина, В.В. Макарова, С.И. Погосян, А.Б. Рубин «Импульсный флуорометр для бесконтактной флуоресценции хлорофилла в лабораторных посевах растений» Физиология растений, 1998, том 45, № 6, с. 942-952.

38]. M.N. Merzlyak, A.A. Gitelson, S.I. Pogosyan, L. Lekhimena, O.B. Chivkunova «Light-induced pígment degradation in leaves and ripening fruits studied in silu with reflectance spectroscopy» Physiología Plantarum, 1998, V. 104, p.661-667.

39]. П.С. Венедиктов, С.Л. Волгин, Ю.В. Казимирко, Т.Е. Кренделева, Г.П. Кукарских, В.В. Макарова, О.Г. Лаврухина, С.И. Погосян, О.В. Яковлева. А.Б. Рубин «Использование флуоресценции хлорофилла для контроля физиологического состояния зеленых насаждений в городских экосистемах», Биофизика, 1999, Т. 44, вып.б, с.1037-1047.

40]. П.С. Венедиктов, Ю.В. Казимирко, Т.Е. Кренделева, Г.П. Кукарских, В.В. Макарова, С.И. Погосян, О.В. Яковлева, А.Б. Рубин «Изучение физиологического состояния древесных растений по характеристикам флуоресценции в коре однолетних побегов деревьев», Экология, 2000, № 5, с. 338-342.

41]. А.Д. Исмаилов, С.И. Погосян, Т.И. Митрофанова, Н.С. Егоров, А.И. Нетрусов «Ингибирование бактериальной биолюминесценции хлорфенолами», Прикладная биохимия и микробиология, 2000, Т. 36, J& 4, с. 469473.

42]. D, Ficek, М. Ostrowska, М. Kuzio, S. Pogosyan «Variability ofthe portion of funcíional PS2 reactioncenters in the light of a fluorometric study», Oceanología, 2000,42 (2), pp. 243-250.

43]. С. И. Погосян, Д. H. Маторин, Э. В. Волкова, Т. К. Аиал, Ю.В. Казимирко, С.В. Востоков, А.Б. Рубин. «Использование комплекса флуорометрических методов для оценки состояния фигопланктонного сообщества моря», Комплексные исследования северо-восточной части Черного моря. Сб. статей n/ред. А.Г. Зацепина, М.В.Флинта. М. Наука, 2001. С. 436-447.

44]. Е.Н. Воронова, Э.В. Волкова, Ю.В. Казимирко, О.Б. Чивкунова, М.Н. Мерзляк, С.И. Погосян, А.Б. Рубин «Изменения фотосинтегического аппарата клеток диатомовой водоросли ThaUassiosira weisflogii в ответ на действие света высокой интенсивности», Физиология растений, 2002, Т.49, №3, с.350-358.

45]. E.N. Voronova, E.V. "Volkova, Yu.V. Kazimirko, O.B. Chivkunova, M.N. Merzlyak, S.I. Pogosyan, A.B. Rubín «Re-sponse of photosynthetic apparatus of diatom ThaUassiosira weisjlogii to high light illurnination» Oceanología, 2003 (в печати).

46]. S. r. Pogosyan, D.N. Matorin, E.V. Volkova, Т.К. Antal, Yu.V. Kazimirko, S.V. Vostokov, A.B. Rubín «Assessment of marine phytoplankton commimities status using fluorometric methods», Oceanología, 2003 (в печати).

47]. M.H. Мерзляк, A.A. Гительсон, О.Б.Чивкунова, А.Е.Соловченко, С.И. Погосян. Использование спектроскопии отражения в анализе пигментов высших растений, Физиология растений, 2003, № 4 (в печати).

Типография ордена «Знак почета» издательства МГУ 119899, Москва, Воробьевы горы Заказ № 1136 Тираж 100 экз.