Разработка флуорометрических методов оценки состояния фотосинтетического аппарата для биоиндикации среды

Казимирко, Юрий Валерьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка флуорометрических методов оценки состояния фотосинтетического аппарата для биоиндикации среды
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Разработка флуорометрических методов оценки состояния фотосинтетического аппарата для биоиндикации среды"

На правах рукописи

КАЗИМИРКО ЮРИЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ

Разработка флуорометрических методов оценки состояния фотосинтетического аппарата для бионндикацив среды

03.00.02 - биофизика, 03.00.16 - экология

[ О г-Г ' 7"; " "7й

\ м

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена на кафедре биофизики Биологического факультета Московского Государственного университета имени М.В.Ломоносова

Научные руководители:

Доктор биологических наук, профессор

С.И.Погосян

Доктор биологических наук, чл.-корр. РАН, профессор А.Б.Рубин

Официальные оппоненты:

Доктор физико-математических наук, профессор

Доктор биологических наук

В.А.Фадеев НХ.Бухов

Ведущая организация: Институт Океанологии им. П. .Ширшова РАН

Защита состоится 23 марта 2006 года в 15 ч 30 мин на заседании Диссертационного Совета Д 501.001.96 при Московском Государственном Университете им. М.ВЛомоносова по адресу: 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, кафедра биофизики, Новая аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан «_» февраля 2006 года. 1

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор биологических наук, профессор

Т.Е.Кренделева

¿ООбА

Общая характеристика работы.

Актуальность. Совершенствование методов биоиндикации состояния окружающей среды в условиях постоянно возрастающего антропогенного воздействия на наземные и водные экосистемы остается одной из актуальных задач в системе экологического контроля и рационального природопользования. Насущная потребность выяснения степени загрязнения окружающей среды вызывает необходимость разработки оперативных методов оценки ее состояния. По мнению многих экологов, оценка качества среды должна иметь интегральный характер. Выяснение степени загрязнения среды только с позиции действия предельно допустимых концентраций токсических веществ не учитывает возможного эффекта от нескольких факторов в различных сочетаниях. Предпочтительной в этом отношении представляется биологическая оценка среды обитания, основанная на показателях - "самочувствия" организма, - биоиндикация и биотестирование (Захаров, Кларк, 1993).

Воздействие на организм неблагоприятных условий среды может вызвать множество специфичных ответных реакций и приводить к переходу организма в стрессовое состояние. Такие воздействия могут оказывать влияние на все метаболические процессы в организме, в том числе и на процессы фотосинтеза, являющиеся главным поставщиком энергии у растений. В связи с этим функционирование фотосинтетического аппарата (ФСА) оказывается наиболее значимым для определения состояния растения в целом.

В настоящее время в экологических исследованиях все большее распространение получили люминесцентные методы оценки физиологического состояния растений (Погосян и др. 2002; Рубин, Кренделева, 2004). Эти методы обладают высоким быстродействием, точностью, позволяют проводить измерения на растительных объектах в природных условиях. Широкий круг исследований, проводимых методами измерения флуоресценции хлорофилла фотосинтезирующих организмов, показал что соотношение интенсивности флуоресценции хлорофилла при насыщающем фотосинтез возбуждающем свете (IV) и при облучении низкоинтенсивным светом, не вызывающем изменений состояния ФСА (Р0), позволяет определить эффективность утилизации света в ходе фотосинтеза, которая равна Рт-Ро/Рт- Эта безразмерная энергетическая характеристика

НАЛЬНА*? I библиотека I

I С.Псгер^г^ „ л 1

фотосинтеза, аналогична коэффициенту полезного действия, является универсальной и не зависит от видовой специфики организма. Показано, что по флуоресценции хлорофилла, возбуждаемой источниками импульсного света, можно определить такие показатели долгосрочной адаптации к условиям выращивания объекта, как размеры фотосинтетической антенны фотосистемы 2 (ФС 2) и величину пула хинонов (Ко1Ьег й а1., 1998). В ответ на длительное (десятки минут) воздействие света можно определить величину потока электронов по цепи фотосинтетического электронного транспорта и оценить возможности системы срочной защиты от избыточного облучения по нефотохимическому тушению (Бухов, 2004).

Использование флуоресцентных методов исследования состояния ФСА конкретных природных объектов (высшие растения, водоросли) требует разработки специальной аппаратуры. Для высших растений представляет интерес как исследование отдельных органов (листья, побеги), так и интегральные характеристики растения в целом, а также посева (группы) растений. Для исследования природных популяций водорослей интерес представляет распределение фитопланктона в толще воды, а также исследование индивидуальных клеток массовых видов фитопланктонных сообществ.

Цель работы. Разработка и совершенствование флуорометрических методов биоиндикации, а также аппаратуры для определения функционального состояния ФСА высших растений и микроводорослей в лабораторных и природных условиях.

Задачи работы.

1) Выбор оптимальных условий измерения параметров флуоресценции хлорофилла "а", отражающих состояние ФСА водных и наземных растений.

2) Разработка комплекса приборов для контактных измерений флуоресценции хлорофилла суспензий водорослей, одиночных клеток водорослей и других микрообъектов, а также ассимиляционных тканях высших растений.

3) Разработка дистанционных флуорометрических методов и приборов для определения функционального состояния ФСА растений.

4) Определение функционального состояния ФСА по параметрам флуоресценции хлорофилла в лабораторных и природных условиях при помощи разработанных методов.

Научная новтана. Впервые создан комплекс аппаратуры, позволяющий проводить исследования обилия и функционального состояния фитопланктона in situ на станциях до глубин 200м и в непрерывном режиме по ходу судна, а также определять адаптационные характеристики ФСА фитопланктона в пробах воды и состояние популяций определенных видов водорослей в составе фитопланктонного сообщества. Разработана новая методология и предложен цикл взаимосвязанных флуоресцентных измерений, проведение которых позволяет охарактеризовать функциональное состояние отдельных клеток, популяций водорослей и всего фитопланктонного сообщества в естественных условиях и при действии стрессовых факторов. Впервые создан дистанционный флуорометр, позволяющий оценивать фотосинтетическую активность и измерять скорость прироста биомассы посева растений. Разработан новый портативный прибор для натурных измерений и оценки состояния ФСА ассимиляционных тканей высших растений. В результате проведенных работ выбраны оптимальные условия измерения флуорометрических показателей функционального состояния ФСА различных объектов (индивидуальных клеток водорослей высших растений, фитопланкгонных организмов в природной среде, ассимиляционных тканей высших растений и их посевов).

Выработаны рекомендации для создания автоматизированных систем экологического мониторинга фитопланкгонных сообществ на основе флуорометрических методов определения функционального состояния ФСА.

Практическое значение. Результаты работы использованы для исследования состояния микроводорослей при действии различных факторов (свет, токсические вещества, дефицит минерального питания), а также для оценки состояния ФСА высших растений в космической оранжерее и лабораторных посевах.

Разработанная аппаратура была использована в оценке состояния зеленых насаждений г. Москвы, в экспедиционных работах по оценке состояния фитопланкгонных сообществ Черного, Каспийского, Балтийского и ЮжноКитайского морей, озер: Байкал, Иссык-Куль.

Полученные результаты и оборудование используются в учебном процессе на кафедре Биофизики Биологического ф-та МГУ. Результаты работы привлекаются

для чтения лекций и проведения практикума по Экологической биофизике и на Большом практикуме кафедры.

Апробация работы. Результаты исследований представлены на Международном симпозиуме (Москва, 2001), Третьем Всероссийском съезде фотобиологов (Воронеж, 2001), Третьем съезде биофизиков (Воронеж, 2004), Симпозиуме «Люминесценция и фотосинтез морского фитопланктона» (Краков, Польша, 2003, Conor, Польша, 2005).

Результаты работы были доложены и обсуждены на научных семинарах кафедры Биофизики МГУ, а также ИОРАН, ИМБП и ИОПАН (Польша).

Публикации. По теме опубликовано 14 работ.

Объем и структура работы: Диссертация изложена на ... стр. и состоит из введения, обзора литературы, изложенных по главам результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, который включает источников. Диссертация иллюстрирована ... рисунками и ... таблицами.

Теоретическое обоснование использования флуорометрических методов для определения состояния ФСА.

Принятая в настоящее время модель первичных реакций фотосинтеза включает две фотосистемы ФС 1 и ФС 2. ФС 2 окисляет воду с выделением кислорода и протонов и восстанавливает первичный и вторичный хинонные акцепторы Qa и Qb. ФС 1 переносит электрон от пула пластохинона (PQ) к конечном акцептору электрона С02, для восстановление которого требуется НАДФН и АТФ.

Реакционный центр (РЦ) ФС 2 состоит из специальной молекулы хлорофилла Р680, которая в возбужденном состоянии является первичным донором электрона для хинонного акцептора Qa. Энергия кванта света поглощенного в ФС 2 может быть превращена в энергию разделенных зарядов P680+Qa", которая используется в дальнейших реакциях фотосинтеза, либо потеряна путем излучения кванта флуоресценции или рассеяния в тепло. Эти три процесса характеризуются константами скорости Kph, Kf и Kd, соответственно.

Исходное состояние, в котором Р680 восстановлен, a Qa - окислен, называется открытым. Состояние, образующееся сразу после разделения зарядов в первичной паре P680+Qa", называется закрытым состоянием РЦ. В этом состоянии

новая порция возбуждения не может быть использована таким центром до тех пор, пока он не вернется в исходное открытое состояние в результате восстановления Р680+ от вторичных доноров и окисления первичного акцептора вторичными акцепторами электрона.

При открытом состоянии РЦ эффективность использования энергии возбуждения в фотосинтезе высока, вероятность потери энергии минимальна и квантовый выход флуоресценции, равный отношению К#(КрЬ + ^ + Кё), -минимален и составляет около 2%, В случае постоянной интенсивности возбуждающего света, не вызывающей закрытия РЦ, интенсивность флуоресценции соответствует величине Ро- Низкий выход флуоресценции хлорофилла за счет использования энергии света в первичных реакциях фотосинтеза обусловлен фотохимическим тушением флуоресценции хлорофилла. При закрытых реакционных центрах фотохимическое разделение зарядов становится невозможным, квантовый выход флуоресценции возрастает до К#(КГ+ Кс1), и составляет около 5%, что соответствует значению интенсивности Рт. Разность между максимальным и минимальным значениями интенсивности флуоресценции Р„ = Рш - называется переменной флуоресценцией. Эта величина пропорциональна той части энергии света, которая используется в фотохимических реакциях фотосинтеза при открытых РЦ ФС 2. Отношение интенсивностей переменной и максимальной флуоресценции (относительная переменная

флуоресценция) равна эффективности использования энергии света РЦ ФС 2.

При воздействии возбуждающего света на растение, адаптированное к темноте, наблюдается характерная индукционная кривая флуоресценции, имеющая несколько фаз. Сначала интенсивность флуоресценции быстро возрастает до I уровня, который соответствует квантовому выходу флуоресценции при открытых

РЦ ФС 2 (Р0). Затем, при достаточно высокой интенсивности действующего света, выход флуоресценции может достигать Рт Дальнейшие фазы индукции флуоресценции хлорофилла в конечпом счете приводят к снижению выхода флуоресценции. Это явление обусловлено возрастанием фотохимического тушения при ускорении транспорта электронов и соответствующим уменьшением степени восстановленности хипонных акцепторов ФС 2, а также развитием процессов

нефотохимического тушения, которые обусловлены рядом процессов, связанных с образованием градиента протонов на фотосинтетической мембране.

К настоящему времени описано несколько методов оценки состояния ФСА по показателям флуоресценции хлорофилла. Первоначально примененный метод регистрации флуоресценции заключался в освещении объекта постоянным светом через коротковолновый (обычно синий) фильтр и регистрации индукционных изменений интенсивности флуоресценции через скрещенный красный фильтр, защищающий детектор флуоресценции от возбуждающего света Поскольку выход флуоресценции мал, то в качестве детектора обычно использовали фотоумножитель.

В однолучевом методе регистрации флуоресценции один и тот же луч света возбуждает флуоресценцию и индуцирует процесс фотосинтеза, в ходе которого изменяется состояние ФСА и квантовый выход флуоресценции. Первым шагом на пути совершенствования методов регистрации флуоресценции стало использование двухлучевого метода, в котором эти две функции света разделены Постоянный действующий свет используется для изменения состояния ФСА, а слабый модулированный свет, который практически не влияет на состояние ФСА, используется для возбуждения флуоресценции с целью зондирования изменений состояния ФСА по изменениям квантового выхода флуоресценции.

В настоящее время используется несколько модификаций импульсной флуорометрии: с импульсной амплитудной модуляцией (РАМ), (Schreiber et al, 1998), с накачкой и зондированием (pump-and-probe) и с быстро повторяющимися вспышками (FRR) (Falkowski, 1998). В зависимости от конкретных задач и объектов исследования необходимо использовать соответствующие условия измерения показателей флуоресценции. Именно эти условия диктуют выбор определенных технических решений при создании аппаратуры и задании протокола измерений, позволяющих адекватно решать поставленные задачи.

Таким образом, в настоящее время применяется несколько способов регистрации параметров флуоресценции хлорофилла, таких как F0, Fm, qN, qP, Fv/Fm, эффективное сечение поглощение ФС 2, которые в совокупности позволяют достаточно полно охарактеризовать состояние ФСА. Как было показано выше, для этого используются соответственно различные способы (протоколы) измерения.

Однако единого универсального способа определения показателей флуоресценции состояния ФСА не существует. Каждый протокол измерения позволяет определять только часть параметров. Кроме того, само проведение измерения этих параметров занимает разное время (от Юме до Юмин и более), зависящее также и от скорости самих физико-химических процессов фотосинтеза. Во многих случаях протокол измерения и аппаратурное решение диктуется ограничениями, обусловленными спецификой объекта исследования: содержанием фотосинтетических пигментов в индивидуальных клетках, концентрацией хлорофилла в составе природных вод, высокими значениями оптической плотности и рассеяния ассимиляционных тканей растений и др. Это особенно важно учитывать при проведении экологических ' исследований состояния ФСА.

Результаты и обсуждение.

Разработка Флуорометрических приборов для диагностики состояния фотосинтезирующих объектов.

Разработка и усовершенствование флуоресцентных методов исследования состояния ФСА различных природных объектов представляет сложную многоступенчатую задачу и включает несколько этапов. На начальном этапе следует выбрать необходимые и наиболее информативные для предполагаемых исследований показатели флуоресценции. Затем, на этой основе можно выбрать способ (протокол) измерения и его аппаратурную реализацию. В созданной аппаратуре необходимо провести подбор условий возбуждения флуоресценции для корректного измерения показателей флуоресценции функционального состояния ФСА объекта.

Ниже приведены разработанные и созданные нами приборы.

Зонд-Флуорометр. Исследование количества и состояния природного фитопланктона in situ предполагает необходимость зондовых измерений по всей глубине фотической зоны водоема, которая в океане может достигать 200м. Для приемлемого пространственного разрешения зондовой флуорометрии (порядка 1м по глубине) при ограниченном времени зондирования требуется высокое быстродействие измерений. Кроме того, устройство должно обладать высокой чувствительностью, так как минимальное содержание хлорофилла в природных водах (олиготрофные зоны океана) может составлять 0,02 мкг/л. Поэтому при

конструировании погружаемого зонда был выбран вариант двухлучевого импульсного флуорометра, в котором реализуется метод «накачки и зондирования». К началу наших работ не изготовлялось коммерческих приборов, удовлетворяющих поставленным задачам.

В связи с этим нами был создан зонд-флуорометр для измерения параметров флуоресценции (Ро,, Рт и (Рт-Ро)/Рт) природного фитопланктона в естественных условиях с одновременной регистрацией температуры и подводной облученности. Схема морского зондирования приведена на рис. 1.

Рис 1. Схема морского зондирования фитопланктона с использованием погружного импульсного флуорометра. Справа показаны результаты изменения на разной глубине количества (Р0), фотосинтетической активности (Ру/Рт) и температуры (Т) водной среды.

Прибор состоит из погружаемого прочного корпуса с электроннооптической системой измерения, блока питания и ШМ совместимого компьютера, управляющего процессом измерений по программе, задаваемой пользователем. Регистрирующая часть зонда состоит из фотоумножителя, усилителя сигналов, аналого-цифрового преобразователя, интерфейса связи с компьютером и двух независимых импульсных источников света с длительностью вспышек 0,01 мс (спектральная область 400-480 нм). Измерение всех параметров производится автоматически и результаты выводятся на экран компьютера в реальном времени по мере погружения аппарата в виде графиков, отражающих вертикальный профиль температуры, подводной облученности, величин Р0 и Рга в относительных единицах, показатель эффективности фотосинтеза водорослей (Рга-Ро)/Рт, а также

концентрацию хлорофилла а, рассчитанную по величине Р0 в соответствии с калибровкой.

Значение интенсивности флуоресценции хлорофилла а (Бо) отражает общее содержание всех пигментов светособирающего комплекса, ассоциированных в ФС 2 ФСА водорослей, но не содержание самого хлорофилла а. Значение Р0 зависит от соотношения пигментов в составе ФСА водорослей. Это соотношение значительно отличается у разных таксономических групп водорослей. Оно зависит от интенсивности и спектрального состава света, к которому адаптирован ФСА растительного объекта. Кроме того, на величину Бо влияют процессы фотохимического и нефотохимического тушения возбужденных состояний хлорофилла. Тем не менее, значение интенсивности Бо, измеренное зондом-флуорометром, коррелирует с содержание хлорофилла а, как показано на рис. 2, но не прямо соответствует этому значению.

Конц. Хл., мг/мЗ

Интенсивность флуоресценции Ро, отн.ед.

Рис. 2. Зависимость интенсивности БО от концентрации хлорофилла. Важную информацию о состоянии ФСА водорослей дает отношение Ру/Рт, которое соответствует величине эффективности первичных стадий утилизации

света. В стационарных условиях развития фитопланктонного сообщества (минеральное питание, световой режим и др.) высокая фотосинтетическая активность, определяемая по переменной флуоресценции как правило,

соответствует высокому содержанию пигментов фитопланктона. Высокий уровень фотосинтетической активности во всем эвфотическом слое при низком содержании пигментов соответствует стадии роста фитопланктонного сообщества. Это связано с тем, что высокая фотосинтетическая активность при благоприятных условиях минерального питания не реализовалась в накоплении биомассы фитопланктона. Причина несоответствия уровня фотосинтетической активности фитопланктона и его содержания может заключаться в недостатке времени для адаптации фитоценоза к быстро меняющимся внешним условиям, характерным, например, для зоны интенсивного поднятия вод. Напротив, низкий уровень Ру/Рт при относительно высоком обилии фитопланктона указывает на то, что фитопланктонное сообщество находится в фазе стагнации или деградации.

Таким образом, в ряде случаев, данные зондовой флуорометрии позволяют проводить анализ пространственно-временной изменчивости фитопланктонного сообщества, оценивать его функциональное состояние и первичную продукцию. Однако сложная зависимость интенсивности флуоресценции хлорофилла от состояния ФСА водорослей затрудняет прямую интерпретацию результатов зондирования водной толщи и требует проведения дополнительных исследований.

При помощи зонда-флуорометра были проведены обследования акваторий Черного и Балтийских морей, озёр Байкал и ИссьпсКуль и других водоёмов. На рисунках 3,4,5 приведены некоторые результаты зондовых измерений.

Видно, что наибольшее количество и активность клеток наблюдается на глубине 50 м. В поверхностных слоях фотосинтез угнетается избыточно большими для фитопланктона интенсивностями солнечного света.

Полученные данные доказывают возможность использования погружного флуоресцентного зонда для определения скорости фотосинтеза фитопланктона по характеристикам первичных реакций фотосинтеза. Предложенный флуоресцентный метод наиболее целесообразно использовать при подробной съемке (например, при выявлении мезомасштабных структур) с большим

количеством станций, когда использование стандартных методов возможно 1 на небольшом количестве станций.

Рис.3. Распределение средних в верхнем перемешиваемом слое воды значений концентрации хлорофилла, определенной по Р0, и относительной переменной флуоресценции Ру/Рт в прибрежных водах Черного моря вблизи Геленджика. Данные получены в первой половине сентября 1998 г.

Рис. 4. Распределение хлорофилла, определенного по Ро (А), относительной переменной флуоресценции Р,/Рт (Б) и температуры (В) по глубине в направлении от Геленджикской бухты в открытое море. Данные получены в сентябре 1999 г.

ОД» О 23 ем 0 79 1 оо rWFm. cmc ад

Lm...iiLI,i , -I , i^—^^— I I I А М Я A JA

Рис. 5. Типичные примеры вертикального распределения концентрации хлорофилла (А), определенной по F0, относительной переменной флуоресценции фитопланктона Fv/Fm (Б) и температуры воды (В), полученные в первой половине сентября 1999 (А) и 2000 (Б) года на станциях вблизи Голубой бухты Черного моря (станции N54 и 2 соответственно; расположены в одном районе).

На основании данных зондирования можно установить ориентировочное обилие фитопланктона, характер его распределения по глубине и оценить состояние ФСА водорослей. Данные флуоресцентного зондирования дают, таким образом, важную информацию о продукционных показателях фитопланкгонного сообщества.

Бортовой флуорометр. Для измерения показателей флуоресценции хлорофилла Fo, Fm и относительной переменной флуоресценции суспензий микроводорослей, а также коэффициентов фотохимического и нефотохимического тушения флуоресценции хлорофилла разработан бортовой портативный флуорометр. Данный прибор близок по основным характеристикам к флуорометру РАМ-2000 (Walz, Германия), но способен к измерению в сильно разбавленных суспензиях водорослей за счет применения более чувствительной системы регистрации флуоресценции на фотоэлектронном умножителе. Показатели флуоресценции суспензий водорослей регистрируются в кюветах объемом 30 мл. Возбуждение флуоресценции хлорофилла производится тестирующими световыми импульсами от 44 синих светодиодов Tl-3/4 Round (фирмы Ledtronics, Inc.) с длиной волны излучения 450 нм мощностью 120 мВт. Длительность импульсов

тестирующего света возбуждения флуоресценции составляет 4 мкс. Дня измерения Рт объект облучается насыщающим ФС светом от галогеновой лампы мощностью 70 Вт через светофильтр СЗС-22. Средняя плотность мощности возбуждающего света при измерении и Рга равняется 0,4 и 3000 Втм"2 соответственно. Интенсивность флуоресценции хлорофилла, возбуждаемая тестирующими импульсами света, регистрируется фотоэлектронным умножителем ФЭУ-79 через светофильтр КС-18. Управление прибором и обработка получаемой информации осуществляется при помощи персонального компьютера.

Для измерения коэффициентов фотохимического и нефотохимического тушения флуоресценции хлорофилла определяются значения Ро и Рт, как описано выше. Затем в течение 10 минут объект освещается в той же камере постоянным светом заданной плотности мощности от галогеновой лампы мощностью 50 Вт через светофильтр СЗС-22 и ослабляющий нейтральный светофильтр. На 9-ой минуте освещения объекта измеряется интенсивность флуоресценции хлорофилла в ответ на тестирующие вспышки возбуждающего флуоресценцию света, которая соответствует величине Р(, после чего под действием насыщающей вспышки все центры переводятся в закрытое состояние и измеряется в ответ на тестирующие вспышки света значение Рт\ На основании проведенных измерений вычисляются коэффициенты фотохимического ^Р) и нефотохимического тушение

флуоресценции хлорофилла в соответствии с приведенными ниже формулами: ЯР = ( Р«' - *) / (Ри' - Р0) и = (РЛ'УСРт-Ро)

Флуорометрические методы могут дать информацию не только об эффективности первичных процессов фотосинтеза фитопланктона, но и об адаптационных изменениях ФСА под действием внешних условий. В частности, показано, что величина коэффициента нефотохимического тушения тесно связала со световыми условиями культивирования водорослей. С ростом глубины и снижением подводной облученности величина qN фитопланктона растет, достигая на 70 м практически предельно возможного значения (Табл.2). При этом значение относительной переменной флуоресценции фитопланктона мало зависит от глубины.

Представленная методика измерения ряда показателей функционального состояния ФСА суспензий водорослей и, в том числе, позволяет определить содержание пигментов, ассоциированных в фотосинтетической системе,

Таблица 1. Зависимость относительной переменной флуоресценции (Рт-Р0)/Рт и коэффициента нефотохимического тушения ^И) проб фитопланктона от глубины.

Глубина, м. а^РоУР»«* ед. яИ, отн. ед.

0 0.55 0.35

25 0.50 0.58

50 0.49 0.88

70 0.40 0.95

эффективность первичных процессов фотосинтеза, а также оценить, к каким световым условиям адаптированы организмы фитопланктона. Эти данные могут иметь большое значение для определения пространственно-временных адаптационных изменений состояния водного фитоценоза.

Проточный (Ьлуоромегр

Выяснение распределения количества фитопланктона в поверхностных водах по ходу судна является актуальной задачей при обследовании больших акваторий. Такой подход позволяет определить пространственную структуру фитопланктонного сообщества и оценить его функциональное состояние Эта информация важна для выбора типичных или градиентных зон обследуемой акватории. Большой массив данных, получаемых по ходу судна, позволяет сопоставить их со спутниковыми картами распределения хлорофилла в море. Такое сопоставление может способствовать уточнению алгоритмов расчетов содержания хлорофилла по показателям спектральной яркости, получаемой со спутников. |

Для определения распределения фитопланктона в поверхностных водах были успешно использованы ледарные методы измерения (Маслов и др., 2005), но .

устройства такого типа остаются чрезвычайно сложными и дорогими. В связи с этим нами был разработан и изготовлен проточный флуорометр. Он предназначен для измерения параметров флуоресценции хлорофилла фитопланктона в поверхностных водах по ходу судна. Этот прибор аналогично зонду-флуорометру и описанному ниже бортовому флуорометр выполняет в автоматическом режиме измерения интенсивности флуоресценции Бо, которая соответствует обилию

фитопланктона, и безразмерной величины Fy/Fm, показывающей эффективность утилизации света в ФСА водорослей.

Проток воды обеспечивали за счет разряжения, создаваемого водоструйным насосом, размещенным за измерительной камерой прибора. Прошедшая через измерительную камеру вода стекала в водоструйный насос.. Цикл измерений величин F0 и Fv/F„ занимал 10 с.

Проточный флуорометр оснащен датчиком GPS для определения и регистрации координат и времени. На рис 6 представлен рабочий протокол прибора.

Рис.6. Рабочий протокол проточного флуорометра.

По характеристикам и параметрам флуорометрического блока измерения и регистрации данный прибор аналогичен бортовому флуорометру, описанному выше.

В поверхностных водах под влиянием интенсивной солнечной инсоляции могут происходить существенные изменения в функционировании фотосинтеза водорослей и, соответственно, в параметрах флуоресценции. Эти процессы, известные как процессы полуденной депрессии фотосинтеза или фотоингибирования, обусловлены нефотохимическим тушением возбужденных

состояний хлорофилла. В связи с этим при определении обилия фитопланктона по показаниям флуоресцентных датчиков необходимо учитывать влияние инсоляции

Рис.7. Значения показателей флуоресценции фитопланктона Ро и Ру/Рт, полученные на проточном флуорометре во время стоянки судна на ст. 1606 (43°08,08 с.ш., 38°09,52 в.д. 13 июня 2004 г.)с 432 утра до14 часов дня.

на флуоресценцию фитопланктона данного района путем введения поправочных коэффициентов. Степень фотоингибирования и снижения Ро может существенно различаться для разных групп водорослей в различных условиях обитания. На рис.7 представлены типичные результаты измерения флуоресценции фитопланктона во время стоянки судна с раннего утра до середины дня в солнечную погоду. При увеличении инсоляции в дневные часы наблюдается уменьшение Р0. Уменьшение Ро в некоторой степени коррелировало с уменьшением Р»/Рш, отражающей фотосинтетическую активность.

Микрофлуорометр. Актуальность разработки метода, позволяющего исследовать функциональные показатели отдельных клеток, определяется тем, что на сегодня это единственный подход к определению состояния индивидуальных видов водорослей в составе фитопланктонньтх сообществ. До начала наших работ микрофлуорометрическая методика была реализована только для измерения кривых индукции флуоресценции хлорофилла одиночных клеток водорослей

■в

|1 о,в

в ^ 0,5 1 *

*4й

I | 0,4

Б о,з

1 5 0.2 0.1 0,0

^чгг

8 9 10

Время суток, ч.

(Погосян и др., 1986). Для измерения параметров флуоресценции хлорофилла одиночных клеток микроводорослей разработан и изготовлен импульсный микрофлуорометр. Он состоит из люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ-ИЗ с флуорометрической насадкой ФМЭЛ 1-А, модифицированного светодиодным источником света, компьютерной системой управления источником света и автоматической системой регистрации сигнала с накоплением. Для возбуждения флуоресценции хлорофилла использован мощный светодиод L400CW012K, Т4 Round (фирмы Ledtronics, Inc.) с длиной волны в максимуме излучения 612 нм. Для измерения интенсивности флуоресценции хлорофилла использован фотоэлектронный умножитель ФЭУ-79 с граничным светофильтром КС 18, позволяющий регистрировать излучение с длиной волны 680 нм и более. При нижней подсветке, обеспечивающей визуальный контроль препарата в камере Нажотта, одпу из клеток, находящихся в поле зрения, помещают препаратоводителем в фотометрируемую зону диаметром 37,5 мкм. По команде оператора с компьютера запускается цикл, состоящий из измерения флуоресценции в ответ на последовательность импульсов света от светодиода интегральной плотностью мощности на объекте 0,45 Втм"2. Эти импульсы тестирующего света не влияют на состояние фотосинтетического аппарата клетки. Из результатов измерений вычисляется среднее значение Fj. Затем по команде с компьютера на объект от того же светодиода подают насыщающий фотосинтез непрерывный свет и на его фоне импульсы света, равпые по интенсивности и длительности тем, при которых проводили измерение F0 При этом регистрируется только переменная составляющая сигнала. Интегральная плотность мощности на объекте составляет около 3000 Втм"2. Из результатов измерений вычисляется среднее значение Fm. Такая методика позволяет вначале определить в поле микроскопа видовую принадлежность исследуемой клетки, а затем измерить ее флуоресцентные характеристики. В результате проведенных на одной или нескольких пробах фитопланктона измерениях можно оценить видовой состав и распределение клеток каждого вида водорослей по относительному содержанию фотосинтетических пигментов и эффективности первичных процессов фотосинтеза.

На пробах фитопланктона из прибрежной часта Черного моря проведено исследование флуорометрических характеристик массовых видов водорослей. В

таблице 2 представлены частоты встречаемости указанных видов микроводорослей, среднее значение интенсивности флуоресценции Р0, соответствующее относительному содержанию фотосинтетических пигментов отдельных клеток, и среднее значение относительной переменной флуоресценции водорослей (Рт-Р0)/Рт, показывающее эффективность первичных процессов фотосинтеза организма.

Таблица 2. Виды водорослей, частоты их встречаемости в акватории Голубой бухты, среднее значение содержания пигментов, приведенное к количеству хлорофилла на клетку и рассчитанное по интенсивностям флуоресценции (То), и среднее значение относительной переменной флуоресценции (Рт-Р0)/Рт клеток каждого вида.

Вид водоросли Частота встречаемости, % Содержание хлорофилла на клетку, х 10'12г (Fm-Fo)/Fm. отн. ед.

Thalassionema nitzsehioides 39 0,51 0.34

Rhizosolenia fragilissima 13 1,78 0.34

Nitzschia sp. 7 2,78 0.52

Nitzschia closteriwn 1 1,58 0.43

Nitzschia tenuirostris 10 0,62 0.32

Nitzschia reversa 2 3,80 0.44

Chaetoceros 1,5 2,06 0.60

Amphora inflexa 0.5 1,00 0

Oymnodinium wulffii 14 1,20 0.51

На основании данных первых дней обследования выбраны массовые виды фитопланктонного сообщества и проведен анализ распределения клеток по показателю эффективности фотосинтеза. В период обследования представители диатомовых 77». гйшеЬюикя и Як р-а&Шзта находились в угнетенном состоянии. Около половины этих клеток обладали очень низким уровнем эффективности фотосинтеза. Исходя из данных, полученных на культурах водорослей и в природных популяциях, при уровне среднего значения (Рга-Р0)/Рт ниже 0,3 прирост численности клеток водорослей прекращается. Поэтому распределение клеток Тктаяекюгскз и Як ^а^ймгтя по относительной переменной флуоресценции позволяет прогнозировать снижение численности этих видов. Большинство клеток ИИгьсЫа sр. и представителя динофлагелят С \vulffii обладали высокой

эффективностью фотосинтеза, что свидетельствует о благоприятных для них условиях и позволяет прогнозировать рост численности этих видов. Через две недели после начала обследования значительно увеличилось относительное содержание клеток То же, но в несколько меньшей степени, произошло и

с клетками ШгзсЫа хр., тогда как клетки П. пИгаекШйе!; и Ш. fragilissima стали встречаться эпизодически.

Таким образом, использование микрофлуорометрического метода позволяет получить данные для оценки функциональное состояние фото синтетического аппарата клеток микроводорослей и составить краткосрочный прогноз динамики численности отдельных видов фитопланктона в данном фитоценозе.

Флуорометрический индикатор физиологического состояния растений. Данный прибор разработан и изготовлен для массового обследования зелёных насаждений (их листьев и однолетних побегов). Флуоресценцию хлорофилла возбуждают высокочастотной последовательностью очень коротких импульсов света низкой интенсивности от светоизлучаклцего диода. Этот свет не изменяет состояния фотосинтетических РЦ и позволяет выделить модулированный сигнал флуоресценции даже в присутствии интенсивной постоянной подсветки. Для перевода РЦ в закрытое состояние используется насыщающий источник света -модуль из 5 лазеров.

Конструктивно индикатор выполнен включает зажим для образца, источники измерительного и насыщающего света, фотодиодный детектор флуоресценции и микропроцессорное устройство управления и обработки сигнала. Прибор имеет внутренний аккумулятор, позволяющий непрерывно работать в течение трех часов.

С помощью индикатора были проведены массовые обследования зелёных насаждений г. Москвы. Результаты измерения переменной флуоресценции (Рт-Ро)/Тш на однолетних побегах липы в эталонном экологически чистом районе и на четырёх полигонах позволяют сделать заключение о том, что:

а) На всех полигонах величина (Рт-Р0)/Рт однолетних побегов липы достоверно ниже, чем в эталонном районе, что сввдетельствует о заметном угнетении жизнедеятельности деревьев.

б) В отличие от эталонного района, где различия между отдельными деревьями по величине (Бт-Бо)'Тт практически не превышают разброса между

отдельными побегами на одном дереве, отношение (Fm-F0)/Fm у деревьев, растущих на обследованных полигонах, значительно варьирует, причём различия между деревьями значительно превосходят величину вариации между разными побегами на одном дереве.

Импульсный флуорометр для бесконтактной регистрации флуоресценции хлорофилла посева растений. Измерения флуоресценции хлорофилла нашли широкое применение в исследованиях по прикладной физиологии высших растений. Имеющиеся флуорометры позволяют многократно проводить измерения на одном и том же листе без отделения его от растения. Однако флуоресценция отдельных листьев характеризуется очень большой изменчивостью Вместе с тем при мониторинге посевов необходима информация не о состоянии отдельных листьев или растений, а о состоянии посева в целом. Для этого требуется усреднить данные для большого числа листьев с разных растений, что лишает метод основного его преимущества - оперативности. Эту проблему можно разрешить с помощью дистанционного измерения параметров флуоресценции со всего объекта (посева) в целом. Нами был разработан и изготовлен импульсный дистанционный флуорометр. Флуорометр позволяет регистрировать величины F0, Fm, (Fm- F0)/ Fm, a также индукционные кривые флуоресценции Прибор выполнен в виде двух конструктивных блоков: основание и измерительная головка. Измерительная головка содержит шесть импульсных ламп СШ-20, две из которых используются для зондирования (2 Дж), а четыре для накачки (25 Дж). Импульсный свет длительностью 50 мкс пропускается через светофильтр СЗС-22. Источником постоянного действующего света служит галогеновая лампа КГМ-24 (150 Вт), снабжённая оптической системой для равномерного освещения посева, светофильтром СЗС-22 и механическим затвором со временем срабатывания 5 мс 4

Расстояние между измерительной головкой и посевом размером 30x30 см составляет 50-100 см. Свет флуоресценции принимается шестью кремниевыми фотодиодами ФД-256 через светофильтры ПС-8 и КС-18. Импульсный сигнал усиливается дифференциальными усилителями и подаётся в микропроцессорный контроллер управления. Флуорометр соединяется с IBM-совместимым компьютером.

В входе работ выявлена высокая корреляция интенсивности флуоресценции Р0 с изменениями сухой массы посева. Таким образом, использование импульсного дистанционного флуорометра позволяет в реальном времени измерять биологическую продуктивность в посевах растений. Сочетание импульсного дистанционного флуорометра с малогабаритной оранжереей даёт возможность изучать влияние условий роста на продуктивность растений, а также может быть использовано для испытаний биологической активности и токсичности химических соединений и для биотестирования загрязнений атмосферы.

Заключение.

Флуоресцентные методы оценки физиологического состояния растений являются неразрушающими, обладают высокой производительностью, точностью, позволяют проводить измерения на растительных объектах в природных условиях.

Разработанный комплекс флуоресцентной аппаратуры для исследования состояния водорослей, включающий погружной зонд-флуорометр, проточный флорометр, бортовой флуорометр и микрофлуорометр, дает принципиально новую информацию о функционировании фитопланктонного сообщества в целом и составляющих его компонентов. Данный комплекс позволяет определять при помощи проточного флуорометра в реальном времени по ходу судна в поверхностных водах обилие фитопланктона и эффективность работы его ФСА. Так могут быть обнаружены зоны, различающиеся по показателям флуоресценции хлорофилла. На основании полученной информации в исследуемой акватории выбирают точки зондирования водной толщи, в которых следует определить распределение по глубине обилия фитопланктона и эффективности работы его ФСА. Зондирование может быть проведено также в характерных точках гидродинамических структур, выбранных на основе анализа спутниковых данных о распределении температур поверхности воды или другой информации. Более детальное исследование адаптационных характеристик ФСА водорослей можно проводить на пробах воды, полученных с различных горизонтов при помощи бортового флуорометра. Для выявления вклада конкретных видов в продукционные характеристики фитопланктонного сообщества проводится микрофлуорометрическое исследование эффективности фотосинтеза индивидуальных видов водорослей на пробах воды. Использование

микрофлуорометрического метода позволяет получить данные о функциональном состоянии и численности массовых видов водорослей, а также составить краткосрочный прогноз динамики численности отдельных видов фитопланктона в данном фитоценозе. Следует отметить, что ранее в гидробиологии не было методов, позволяющих проводить такого рода исследования.

В ряде случаев данные проточной и зондовой флуорометрии вполне достаточны для анализа пространственно-временной изменчивости фитопланктонного сообщества и оценки его функционального состояния. Это происходит при медленно изменяющихся гидрофизических ситуациях, когда горизонты с максимумами содержания хлорофилла и переменной флуоресценции совпадают. В результате зондирования удается оценить продукционные характеристики фитопланктона по глубине в исследуемом водоеме. Оказалось, что в быстроменяющихся условиях среды возможно несоответствие эффективности фотосинтеза величине биомассы водорослей, позволяющие однозначно интерпретировать эти несоответствия и выявлять определенные фазы развития фитопланктонного сообщества. Например, в условиях подъема богатых биогенами масс воды из глубины на поверхность (апвелинг) происходит быстрое заселение вод фитопланктоном. В начальный период такого процесса биомасса планктонных организмов невелика, тогда как эффективность утилизации света близка к максимальным значениям, характерным для молодых быстро растущих популяций. Напротив, обнаружение большой биомассы фитопланктона, обладающею малыми значениями относительной переменной флуоресценции, указывает на процессы деградации фитопланктонного сообщества.

Таким образом, удается практически одновременно для одних и тех же проб воды провести детальный анализ фитопланктонного сообщества и дать прогноз его развития. Высокая скорость измерения позволяет анализировать получаемую информацию непосредственно по ходу экспедиционных работ и вносить коррективы в планы исследования для более глубокого понимания функционирования водных экосистем. Представленные методики и флуорометрическая аппаратура при их комплексном использовании могут дать принципиально новую информацию о пространственно-временной изменчивости фитоценоза, а также служить составной частью системы экологического

мониторинга состояния вод. Полученные результаты демонстрируют, что флуоресцентные методы могут быть эффективно использованы для характеристики современного состояния фитоценозов и прогнозирования его изменений.

Выводы.

1 На основе сравнительного анализа способов (протоколов) измерения интенсивности флуоресценции хлорофилла при открытых (F0) и закрытых (Fm) реакционных центрах ФС 2, а также показателей фотохимического и нефотохимического тушения возбужденных состояний хлорофилла созданы флуорометрические приборы для различных объектов и условий:

зонд-флуорометр, предназначенный для измерения в природных водах (in situ) на глубине до 200 м обилия фитопланктона и эффективности функционирования его ФСА, а также регистрирующий подводную облученность и температуру, что позволяет рассчитывать первичную продукцию;

проточный флуорометр, предназначенный для измерения в природных водах по ходу судна обилия фитопланктона и эффективности функционирования его ФСА и снабженный спутниковой системой непрерывной регистрации географических координат,

бортовой флуорометр для исследования адаптационных характеристик состояния ФСА проб природного фитопланктона и культур водорослей;

микрофлуорометр, позволяющий измерять параметры флуоресценции одиночных клеток водорослей;

дистанционный флуорометр для бесконтактного измерения эффективности фотосинтеза и скорости прироста биомассы посевов высших растений;

флуорометрический индикатор функционального состояния ФСА листьев и однолетних побегов высших растений, предназначенный для проведения массовых обследований деревьев и кустарников на больших территориях.

2. Получены результаты пространственно-временного распределения фитопланктонных организмов и их продукционных характеристик на обширных акваториях Черного, Балтийского и Каспийского морей.

3. Впервые разработан и внедрен микрофлуорометрический способ оценки состояния ФСА одиночных клеток планктонных водорослей, позволяющий

определять функциональное состояние и оценивать вклад отдельных видов в продукцию природного фитопланктонного сообщества.

4. Использование дистанционного флуорометра дает возможность измерять в реальном времени скорость прироста биомассы листьев посева с временным разрешением менее 1 часа.

5. Полученные результаты позволяют выработать рекомендации для создания автоматизированных систем экологического мониторинга среды по измерениям состояния ФСА растительных объектов комплексом флуорометрических методов

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. С.ЛВолгин, Т.К., Антал, Ю.Н., Конев Ю.В.Казимирко Д.Н. Маторин "Исследование влияние света повышенной интенсивности на флуоресцентные параметры и скорость выделения кислорода планктонными микроводорослями". Доклады МОИП, Общая биология. 1995-1996 г.

Деп.ВИНИТИ, N 2370-В97,14.07.97,Москва,с. 60-62

2. Д.Н.,Маторин, Ю.Н.,Конев, А.В.Бачева, С.Л.Волгин, Т.К.Антал, ГО.В. Казимирко, Л.В.Шендерова "Изучение фитопланктона с использованием флуоресцентных методов" Доклады МОИП, Общая биология. 1995-1996 г. Деп ВИНИТИ, N 2370-В97Д4 07 97,Москва,с.31-34

3. Д.Н.Маторин, П.С.Венедиктов, Ю.Н.Конев, Ю.В.Казимирко, А.Б.Рубин «Использование двухвспышечного импульсного погружного флуориметра для определения фотосинтетической активности природного фитопланктона» Докл. РАН., 1996,350,2, С. 256-258.

4. Д.Н.Маторин, Ю.Н.Конев, Ю.В.Казимирко, С.Л.Волгнн, Л.Р.Изместьева. "Разработка подходов к биомониторингу водной среды с использованием флуоресценции хлорофилла". "Экологические исследования водорослей" Борок,1996 ,154-155.

5. Д.Н.Маторин, ДВ.Вавилин, Ю.Н.Конев, С.Л.Волгин, Ю.В.Казимирко, А.Б.Рубин «Изучение корреляции интенсивности флуоресценции, измеряемой импульсным флуориметром, с концентрацией пигментов у микроводорослей» Вестн. Моск. унта. 1997. Сер. Биология. N 1. С. 25-28.

6. С.И. Погосян, Э.В. Волкова, Ю.В. Казимирко, В.Н. Максимов, А.Б. Рубин «Изменения фотосинтетического аппарата индивидуальных клеток микроводоросли АпИ$ггос1е$тш/аксОиз в норме и при УФ-облучении» Доклады РАН, 1998. Т. 363, № 5, с. 690-693.

7. Д.Н.Маторин, Ю.В.Казимирко, А.Б.Рубин «Использование двухлучевого импульсного погружного флуориметра для биомониторина фотосинтетической активности фитопланктона in situ» Тезисы 2 Съезда биофизиков России, Москва август, 1999

8. П.С.Венедиктов, Ю.В.Казимирко, Ю.Н.Конев, Т.Е.Кренделева, Г.П.Кукарских, О.Н.Лаврухина, В.В. Макарова, С .И. Погосян, А.Б. Рубин «Импульсный флуорометр для бесконтактной флуоресценции хлорофилла в лабораторных посевах растений» Физиология растений, 1998, том 45, № 6, с. 942-952.

9. П.С.Венедиктов, СЛ.Волгин, Ю.В.Казимирко, Т.Е.Кренделева, Г.П.Кукарских, В.В.Макарова, О.Г.Лаврухина, С.И.Погосян, О.В.Яковлева. А.Б.Рубин «Использование флуоресценции хлорофилла для контроля физиологического состояния зеленых насаждений в городских экосистемах», Биофизика, 1999, Т. 44, вып.6, с. 1037-1047.

10. Т.К.Антал, Д.Н.Маторин, Б.А.Левенко, Ю.В.Казимирко, В.Б.Горюнова,

B.В.Сапожников «Связь вертикального распределения флуоресценции хлорофилла «а» с освещенностью и температурой в летний период в Норвежском море» Вестник МГУ. 2000. Сер. 16. Биология. № 2. С. 23-28.

11. П.С. Венедиктов, Ю.В. Казимирко, Т.Е. Кренделева, Г.П. Кукарских, В.В. Макарова, С.И. Погосян, О.В. Яковлева, А.Б. Рубин «Изучение физиологического состояния древесных растений по характеристикам флуоресценции в коре однолетних побегов деревьев», Экология, 2000, № 5, с. 338-342.

12.С.И.Погосян,. ДН.Маторин, Э.В.Волкова, Т.КАнтал, Ю.В.Казимирко,

C.В.Востоков,. А.Б.Рубин. «Использование комплекса флуорометрических методов для оценки состояния фитопланктонного сообщества моря» Комплексные исследования северо-восточной части Черного моря. Сб. статей под ред. А.Г.Зацепина, М.В.Флинта. М. Наука, 2002. С. 436-447.

13. Е.Н.Воронова, Э.В.Волкова, Ю.В.Казимирко, О.Б.Чивкунова, М.Н.Мерзляк, С.И.Погосян, А.Б.Рубин «Изменения фотосинтетического аппарата клеток диатомовой водоросли Thallassiosira weisflogii в ответ на действие света высокой интенсивности», Физиология растений, 2002, Т.49, №3, с.350-358.

14. S.I.Pogosyan, D.N.Matorin, E.V.Volkova, T.K.Antal, Yu.V.Kazimirko, S.V.Vostokov, A.B.Rubin «Assessment of marine phytoplankton communities status using fluorometric methods», Oceanologia, 2003,45, (2) pp. 112-128.

М&6А ¿ГЖ

» 5531

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИДЫ 00510от01.12.99 г Подписано к печати 14.02.2006 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 087 Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Казимирко, Юрий Валерьевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Структурно-функциональная организация фотосинтетического аппарата растений и водорослей

1.2 Природа быстрой флуоресценции хлорофилла «а» в фотосинтетических мембранах

1.3 Методы измерения быстрой флуоресценции хлорофилла и аппаратура для изучения состояния природного фитопланктона и растительных организмов

1.4 Перспективы использования флуоресцентных методов в экологическом мониторинге

ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.1 Разработка флуорометрических приборов для диагностики состояния фотосинтезирующих объектов

2.1.1 Зонд-флуорометр

2.1.2 Бортовой флуорометр

2.1.3 Проточный флуорометр

2.1.4 Микрофлуорометр

2.1.5 Флуорометрический индикатор физиологического состояния растений

2.1.6 Импульсный флуорометр для бесконтактной регистрации флуоресценции хлорофилла посева растений 85 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 96 ВЫВОДЫ 99 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

XJI - хлорофилл

РЦ - реакционный центр

ЭТЦ - электрон-транспортная цепь

ПБК - пигмент-белковый комплекс

ССК - светособирающий комплекс

ФС - фотосистема

ФСА - фотосинтетический аппарат

1111Ф - первичные процессы фотосинтеза

Fo - интенсивность флуоресценции хлорофилла, все РЦ ФС2 находятся в «открытом» состоянии

Fm - интенсивность флуоресценции хлорофилла, все РЦ ФС2 находятся в «закрытом» состоянии

Fv - величина переменной флуоресценции, равная Fm - Fo

Р680 - первичный донор электронов в ФС

Qa - первичный стабильный хинонный акцептор в ФС

Qb - вторичный хинонный акцептор в ФС

Z - вторичный донор электрона в ФС диурон - 3-(3,4-дихлорфенил)-1,1-Диметилмочевина

PQ - пул хинонов

F, - интенсивность флуоресценции хлорофилла в условиях длительного освещения, когда часть РЦ ФС2 находятся в «открытом» состоянии F'm - интенсивность флуоресценции хлорофилла в условиях длительного освещения, когда все РЦ ФС2 находятся в «закрытом» состоянии

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка флуорометрических методов оценки состояния фотосинтетического аппарата для биоиндикации среды"

Совершенствование методов биоиндикации состояния окружающей среды в условиях постоянно возрастающего антропогенного воздействия на наземные и водные экосистемы остается одной из актуальных задач в системе экологического контроля и рационального природопользования. Насущная потребность выяснения степени загрязнения окружающей среды вызывает необходимость разработки оперативных методов оценки ее состояния. По мнению многих экологов, оценка качества среды должна иметь интегральный характер. Выяснение степени загрязнения среды только с позиции действия предельно допустимых концентраций токсических веществ не учитывает возможного эффекта от нескольких факторов в различных сочетаниях. Предпочтительной в этом отношении представляется биологическая оценка среды обитания, основанная на показателях "самочувствия" организма, -биоиндикации и биотестировании (В.М.Захаров, Д.М. Кларк, 1993).

Воздействие на организм неблагоприятных условий среды может вызвать множество специфичных ответных реакций и приводить к переходу организма в стрессовое состояние. Такие воздействия могут оказывать влияние на все метаболические процессы в организме, в том числе и на процессы фотосинтеза, являющиеся главным поставщиком энергии у растений. В связи с этим функционирование ФСА оказывается наиболее значимым для определения состояния растения в целом.

В настоящее время в экологических исследованиях все большее распространение получили люминесцентные методы оценки физиологического состояния растений. Эти методы обладают высоким быстродействием, точностью, позволяют проводить измерения на растительных объектах в природных условиях. Широкий круг исследований, проводимых методами измерения флуоресценции хлорофилла фотосинтезирующих организмов, показал что соотношение интенсивности флуоресценции хлорофилла при насыщающем фотосинтез возбуждающем свете (Fm) и при облучении светом низкой интенсивности, не вызывающем изменений состояния фотосинтетического аппарата (F0), позволяет определить эффективность утилизации света в ходе фотосинтеза, которая равна (Fm - Fo)/Fm. Эта безразмерная энергетическая характеристика фотосинтеза, аналогична коэффициенту полезного действия, является универсальной и не зависит от видовой специфики организма. Показано, что по флуоресценции хлорофилла, возбуждаемой источниками импульсного света, можно определить такие показатели долгосрочной адаптации к условиям выращивания объекта, как размеры фотосинтетической антенны ФС2 и величину пула хинонов (Kolber et al., 1998). В ответ на длительное (десятки минут) воздействие света можно определить величину потока электронов по цепи фотосинтетического электронного транспорта и оценить возможности системы срочной защиты от избыточного облучения по нефотохимическому тушению.

В результате проведенных работ созданы, испытаны и используются для поведения экологических исследований следующие приборы: зонд-флуорометр, предназначенный для измерения в природных водах (in situ) на глубине до 200 м обилия фитопланктона и эффективности функционирования его фотосинтетического аппарата, а также регистрирующий подводную облученность и температуру, что позволяет рассчитывать первичную продукцию; проточный флуорометр, предназначенный для измерения в природных водах по ходу судна обилия фитопланктона и эффективности функционирования его фотосинтетического аппарата и снабженный спутниковой системой непрерывной регистрации географических координат; бортовой флуорометр для исследования адаптационных характеристик состояния фотосинтетического аппарата проб природного фитопланктона и культур водорослей; микрофлуорометр, позволяющий измерять параметры флуоресцентные одиночных клеток водорослей; дистанционный флуорометр для бесконтактного измерения эффективности фотосинтеза и скорости прироста биомассы посевов высших растений; флуорометрический индикатор функционального состояния фотосинтетического аппарата листьев и однолетних побегов высших растений, предназначенный для проведения массовых обследований деревьев и кустарников на больших территориях.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Казимирко, Юрий Валерьевич

выводы

1. На основе сравнительного анализа способов (протоколов) измерения интенсивности флуоресценции хлорофилла при открытых (F0) и закрытых (Fm) реакционных центрах фотосистемы 2, а также показателей фотохимического и нефотохимического тушения возбужденных состояний хлорофилла создана флуорометрические приборы для различных объектов и условий: зонд-флуорометр, предназначенный для измерения в природных водах {in situ) на глубине до 200 м обилия фитопланктона и эффективности функционирования его фотосинтетического аппарата, а также регистрирующий подводную облученность и температуру, что позволяет рассчитывать первичную продукцию; проточный флуорометр, предназначенный для измерения в природных водах по ходу судна обилия фитопланктона и эффективности функционирования его фотосинтетического аппарата и снабженный спутниковой системой непрерывной регистрации географических координат; бортовой флуорометр для исследования адаптационных характеристик состояния фотосинтетического аппарата проб природного фитопланктона и культур водорослей; микрофлуорометр, позволяющий измерять параметры флуоресцентные одиночных клеток водорослей; дистанционный флуорометр для бесконтактного измерения эффективности фотосинтеза и скорости прироста биомассы посевов высших растений; флуорометрический индикатор функционального состояния фотосинтетического аппарата листьев и однолетних побегов высших растений, предназначенный для проведения массовых обследований деревьев и кустарников на больших территориях.

3. Впервые разработан и внедрен микрофлуорометрический способ оценки состояния фотосинтетического аппарата одиночных клеток планктонных водорослей, позволяющий определять функциональное состояние и оценивать вклад отдельных видов в продукцию природного фитопланктонного сообщества.

5. Полученные результаты позволяют выработать рекомендации для создания автоматизированных систем экологического мониторинга среды по измерениям состояния фотосинтетического аппарата растительных объектов комплексом флуорометрических методов.

Заключение.

Нарушения в метаболизме растений наступают задолго до проявления видимых необратимых изменений. ФСА наиболее уязвим для действия повреждающих факторов, поэтому методы анализа состояния ФСА, основанные на измерении характеристик флуоресценции хлорофилла, широко применяются для мониторинга состояния растительных объектов. Эти методы также можно использовать для ранней диагностики повреждений и прогноза развития растений. Исследования флуоресценции позволяют получить ряд важнейших характеристик фотосинтетического аппарата, таких как эффективность использования энергии света в реакциях фотосинтеза, а также анализировать вклад различных механизмов тушения флуоресценции.

Разработанный комплекс флуоресцентной аппаратуры для исследования состояния водорослей, включающий погружаемый зонд-флуорометр, проточный флорометр, бортовой флуорометр и микрофлуорометр, дает принципиально новую информацию о функционировании фитопланктонного сообщества в целом и составляющих его компонентов. Данный комплекс позволяет определять при помощи проточного флуорометра в реальном времени по ходу судна в поверхностных водах обилие фитопланктона и эффективность работы его ФСА. Так могут быть обнаружены зоны, различающиеся по показателям флуоресценции хлорофилла. На основании полученной информации в исследуемой акватории выбирают точки зондирования водной толщи, в которых следует определить распределение по глубине обилия фитопланктона и эффективности работы его ФСА. Зондирование может быть проведено также в характерных точках гидродинамических структур, выбранных на основе анализа спутниковых данных о распределении температур поверхности воды или другой информации. Более детальное исследование адаптационных характеристик ФСА водорослей можно проводить на пробах воды, полученных с различных горизонтов при помощи бортового флуорометра. Для выявления вклада конкретных видов в продукционные характеристики фитопланктонного сообщества проводится микрофлуорометрическое исследование эффективности фотосинтеза индивидуальных видов водорослей на пробах воды. Использование микрофлуорометрического метода позволяет получить данные о функциональном состоянии и численности массовых видов водорослей, а также составить краткосрочный прогноз динамики численности отдельных видов фитопланктона в данном фитоценозе. Следует отметить, что ранее в гидробиологии не было методов, позволяющих проводить такого рода исследования.

В ряде случаев данные проточной и зондовой флуорометрии вполне достаточны для анализа пространственно-временной изменчивости фитопланктонного сообщества и оценки его функционального состояния. Это происходит при медленно изменяющихся гидрофизических ситуациях, когда горизонты с максимумами содержания хлорофилла и переменной флуоресценции совпадают. В результате зондирования удается оценить продукционные характеристики фитопланктона по глубине в исследуемом водоеме. Оказалось, что в быстроменяющихся условиях среды возможно несоответствие эффективности фотосинтеза величине биомассы водорослей, позволяющие однозначно интерпретировать эти несоответствия и выявлять определенные фазы развития фитопланктонного сообщества. Например, в условиях подъема богатых биогенами масс воды из глубины на поверхность (апвелинг) происходит быстрое заселение вод фитопланктоном. В начальный период такого процесса биомасса планктонных организмов невелика, тогда как эффективность утилизации света близка к максимальным значениям, характерным для молодых быстро растущих популяций. Напротив, обнаружение большой биомассы фитопланктона, обладающего малыми значениями относительной переменной флуоресценции, указывает на процессы деградации фитопланктонного сообщества.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Казимирко, Юрий Валерьевич, Москва

1. Антал Т.К., Венедиктов П.С., Конев Ю.Н., Маторин Д.Н., Хаптер Р., Рубин А.Б. Определение вертикального профиля фотосинтеза фитопланктона флуоресцентным методом // Океанология, 1999. Т. 39. С. 314-320.

2. Бухов Н.Г. Динамическая световая регуляция фотосинтеза // Физиол. раст. 2004. Т. 51. № 6. С. 825-837.

3. Венедиктов П.С., Изместьева Л.Р., Маторин Д.Н., Васильев И.Р., Вавилин Д.В. Оценка физиологического состояния фитопланктона Байкала люминесцентными методами.//В кн. Мониторинг фитопланктона. Новосибирск, Наука. 1992. С. 25-30.

4. Гольд В.М., Гаевский Н.А., Григорьев Ю.С. и др. Теоретические основы и методы изучения флуоресценции хлорофилла // Красноярск. 1984. С. 125.

5. Ю.Гольдфельд М.Г., Карапетян Н.В. Физико-химические основы действия гербицидов // Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Сер. биологическая химия. М. 1989. Т. 30. С. 164.

6. П.Захаров В.М., Кларк Д.М. Биотест: интегральная оценка здоровья экосистем и отдельных видов // Московское Отделение Международного Фонда «Биотест», М., 1993.

7. Ильяш Л.В., Маторин Д.Н., Кольцова Т.И., Шам Х.Х. Пространственное распределение и суточная динамика фитопланктона залива Нячанг Южно-Китайского моря // Океанология. 2004. Т. 44. № 2. С. 238-248.

8. Калачев Р.К., Кочубей С.М. и др. Связь между флуоресценцией хлорофилла in vivo и продуктивностью водоросли Anabena variabilis II Гидробиол. журнал. 1983. Т. 19. № 1. С. 36-39.

9. Карабашев Г.С., Ханаев С.А. Распределение флуоресценции хлорофилла вблизи температурного фронта в Балтийском море // Океанология. 1983. Т. 23. №5. С. 857-862.

10. Карабашев Г.С. Флуоресценция в океане. // Ленинград. Гидрометеоиздат. 1987. С. 200.

11. Карапетян Н. В., Бухов Н. Г. Переменная флуоресценция хлорофилла как показатель физиологического состояния растений // Физиол. раст. 1986. Т. 3. №5. С. 1013-1026.

12. П.Казаков J1.K., Маторин Д.Н. 1998. Индикация и оценка экологических ситуаций в промышленных регионах // Экология и промышленность России. С. 32-36.

13. Кочубей С.М. Организация пигментов фотосинтетических мембран как основа энергообеспечения фотосинтеза // Киев: Наукова Думка. 1986. С. 200.

14. Кренделева Т.Е. Фосфорилирование белков хлоропластов и регуляция первичных процессов фотосинтеза // Вестник МГУ. Сер. 16. Биология. 1988. №2. С. 3-14.

15. Кукушкин А.К., Тихонов А.Н. Лекции по биофизике фотосинтеза растений // М.: изд. МГУ. 1988. С. 320.

16. Левашов Д.Е. Техника экспедиционных исследований. Инструментальные методы и технические средства оценки промыслово-значимых факторов среды // М.: изд. ВНИРО. 2003. С. 320.

17. Лядский В.В., Горбунов М.А., Венедиктов П.С. Импульсный флуорометр для исследования первичных фотохимических процессов зеленых растений // Науч. докл. высшей школы. Биол. науки. 1987. Т. 11. С. 31-36.

18. Маторин Д.Н., Венедиктов П.С. Люминесценция хлорофилла в культурах микроводорослей и природных популяциях фитопланктона // М.: Итоги науки и техники, ВИНИТИ. Сер. Биофизика. 1990. Т. 40. С. 49-100.

19. Маторин Д.Н. Использование флуоресцентных методов измерения активности фотосистемы II при биомониторинге фитопланктона // Биофизика. 2000. Т. 45/3. С. 491-494.

20. Маторин Д. Н., Антал Т. К., Шаршенова А. А., Тыныбеков А.К., Отте M.JL, Ван де Верт X., Рубин А.Б. Изучение природного фитопланктона озера Иссык-Куль полученная с использованием погружного флуорометра // Вестн. МГУ. Сер. Биология, 2002. № 1 С. 43-45.

21. Погосян С.И. Состояние растительных организмов в природных условиях и окислительное повреждение фотосинтетического аппарата // Автореф. докторской диссерт. М. 2003. 56 с.

22. Погосян С.И., Волкова Э.В., Казимирко Ю.В., Максимов В.Н., Рубин А.Б. Изменения фотосинтетического аппарата индивидуальных клеток микроводоросли Ankistrodesmus falcatus в норме и при УФ -облучении // Доклады Академии Наук. 1998. Т. 363 (5). С. 690-693.

23. Рубин А. Б., Кононенко А. А., Пащенко В. 3., Чаморовский С. К., Венедиктов П.С. Принципы регуляции и модельные системы первичных процессов фотосинтеза // Итоги науки и техн. ВИНИТИ. Сер. Биофизика. 1987. Т. 22. С. 212.

24. Рубин А.Б. Биофизика // Т.2. М.: Книжный дом «Университет». 2000. 468 с.

25. Рубин А. Б. Принципы организации и регуляции первичных процессов фотосинтеза // Тимирязевские чтения LV. Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 1995, С. 38.

26. Рубин А.Б., Кренделева Т.Е. Регуляция первичных процессов фотосинтеза // Успехи биологической химии. Т. 43. Пущино. 2003. С. 225-266.

27. Рубин А.Б., Кренделева Т.Е. Регуляция первичных процессов фотосинтеза //Биофизика. Т. 49. Вып. 2. 2004. С.239-253.

28. Рубин А. Б. Биофизика фотосинтеза и методы экологического мониторинга // Технология живых систем. 2005. Т. 2. С. 47-68.

29. Сиренко JI.A. Информационное значение хлорофильного показателя // Гидробиол. журнал. 1988. Т. 24. №4. С. 49-53.

30. Тихонов А.Н. Молекулярные преобразователи энергии в живой клетке // Соросовский образовательный журнал. 1997. №7. С. 10-17.

31. Тихонов А.Н. Регуляция световых и темновых стадий фотосинтеза. //Соросовский образовательный журнал. 1999. № 11. С. 8-15.

32. Тихонов А.Н. Фотосинтез // Энциклопедия современное естествознание. Т.2. Общая биология. Ред. Сойфер В.Н. М. Магистр-Пресс. 2000. С. 271-279.

33. Antal Т.К., Venediktov P.S., Matorin D.N., Ostrowska М., Wozniak В., Rubin А.В. Measurement of phytoplankton photosynthesis rate using a pump-and-probe fluorometer // Oceanologia. 2001. V. 43. №3. P. 291313.

34. Aiken J. A chlorophyll sensor for automatic remote operation in the marine environment // Mar. Ecol. Prog. Ser. 1981. V. 4. №2. P. 235-239.

35. Anderson J.M. Cytochrome h(Jicomplex: dynamic molecular organization, function and acclimation // Photosynth. Res. 1992. V. 34. P. 341-357.

36. Andersson В., Styring S. Photosystem II: Molecular organization, function, and acclimation // Curr. Topics Bioenerg. 1991. V. 16. P. 1-81.

37. Anderson J.M., Thomson W.W. Dynamic molecular organization of the plant thylakoid membrane // In: W.R.Briggs (ed.) Photosynthesis. N.Y. Alan Liss Inc. 1989. P. 161-182.

38. Aro E.-M., Virgin I., Anderson B. Photoinhibition of photosystem II. Inactivation, protein damage and turnover // Biochim. Biophys. Acta. 1993. V. 1143. P. 113-134.

39. Barber J., Andersson B. Too much of a good thing: light can be bad for photosynthesis//TIBS. 1992. V.17. P.153.

40. Bates S.S., Piatt T. Fluorescence induction as a measure photosynthetic capacity in marine phytoplankton: responce of Thalassiosira pseudonana and Dunaliella tertiolecta II Mar.Ecol. 1984. V.18. P. 67-77.

41. Beutler M., Wiltshire K.H., Meyer В., Moldaenke C., Luring C.Meyerhofer M., Hansen U.-P., Dau H. A fluorometric method for the differentiation of algal populations in vivo and in situ // Photosynthesis Research. 2002. V. 72. P. 39-53.

42. Bukhov N.G., Mohanty P., Rakhimberdieva M.G., Karapetyan N.V. Analysis of dark-relaxation kinetics of variable fluorescence in intact leaves // Planta 187. 1992. P. 122-127.

43. Buschmann C., Langsdorf G., Lichtenthaler H.K. Imaging of the blue, green, and red fluorescence emission of plants: an overview // Photosynthetica. 2000. V. 38. №4. P. 483-491.

44. Butler W. L. and Kitajima M. Fluorescence quenching in photosystem II of chloroplasts // Biochim. Biophys. Acta. 1975. V. 376. P. 116-125.

45. Cao J., Govindjee. Chlorophyll a fluorescence transient as an indicator of active and inactive Photosystem 2 in thylakoid membranes.// Biochim. Biophys. Acta. 1990. V.1015. P.180-188.

46. Corlett J.E., Jones H.G., Masojidek J.M., Massacci A. Chlorophyll fluorescence in the field grown sorghum. Instrument discrepancies // Photosynthetica. 1992. V.27. № 1-2. P. 257-260.

47. Govindjee, Sixty-three years since Kautsky: chlorophyll a fluorescence // Aust. J. Plant Physiol. 22. 1995. P. 131-160.

48. Graevskaya E.E., Antal Т.К., Matorin D.N., Pogosyan S.I., Rubin A. B. Study of chloride mercury and chloride methylmercury effect on diatoms Thalassiosira weissflogii by chlorophyll fluorescence analysis // J.1Y France. 2003. V. 107. P. 569-572

49. Cramer W.A., Furbacher P.N., Szszepaniak A., Tae G.S. Electron transport between Photosystem II and Photosystem I // Curr. Topics Bioenerg. 1991. V. 16. P. 179-222.

50. Dau H., Hansen U.-P. A study on the energy-dependent quenching of chlorophyll fluorescence by means of photoacoustic measurements // Photosynth. Res. 1990. V. 25. P. 269-278.

51. Daley P.F., Raschke K., Ball J.T., Berry J.A. Topography of photosynthetic activity of leaves obtained from video images of chlorophyll fluorescence // Plant Physiol. 1989. V. 90. P. 1233-1238.

52. Demmig-Adams В., Adams W.W. Photoprotection and other responses of plants to high light stress // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1992. V. 43. P. 599-626.

53. Dieter E.W. Comments of fluorometric chlorophyll determination in the field // Arch. Hydrobiol. 1986. V. 107. № 4. P. 521-527.

54. Dubinsky Z., Falkowski P. G. and Wiman K. Light harvesting and utilization by phytoplankton // Plant Cell Physiol. 1986. V. 27. P. 13351339.

55. Staehelin L.A. Chloroplast structure and supramolecular organization of photosynthetic membranes // In: Encyclopedia of plant physiology, 19, Photosynthesis III. Staehelin L. and Arntzen C., ed. Springer, Berlin. 1986. V. 27. P. 1335-1339.

56. Fadeev V.V., Filippova E.M., Maslov D.V., Matorin D.N., Venediktov P.S. Diagnostics of photosynthesising organisms by linear and non-linear fluorimetry //Proc. ofSPIE. 1999. V. 3821. P. 102-111.

57. Falkowski P.G. Light-shade adaptation and assimilation numbers // J. Plankton res. 1981. V. 3. P. 203-216.

58. Falkowski P.G., Fujita Y., Ley A.C. and Mauzerall D. Evidence for cyclic electron flow around photosystem II in Chlorella purenoidosa II Plant Physiol. 1986a. V. 81. P. 310-312.

59. Falkowski P.G., Wyman K., Ley A.C. and Mauzerall D. Relationship of steady state photosynthesis to fluorescence in eucaryotic cells // Biophys. Biochim. Acta. 1986b. V. 849. P. 183-192.

60. Falkowski P.G., Sukenik A. and Herzik R. Nitrogen limitation in Isochrysis galbana (Haptophyceae) II J. of Phycol. 1989. V. 25. P. 471-478.

61. Falkowski P.G., Ziemann D., Kolber Z. et al. Nutrient pumping and phytoplankton response in a subtropical mesoscale eddy // Nature. 1991. V. 352. P. 544-551.

62. Falkowski P.G., Green R., Kolber Z. Light utilization and photoinhibition of photosynthesis in marine phytoplankton // In «Photoinhibition of Photosynthesis: from Molecular Mechanisms to the Field». Eds. N. R. Baker and J. Bowes. 1994. P. 407-432.

63. Falkowski P.G., Kolber Z. Variations in chlorophyll fluorescence yields in phytoplankton in the world oceans // Plant Physiol. 1995. V. 22. P. 341355.

64. Falkowski P.G., Raven J.A. Aquatic photosynthesis // Blackwell Science. 1997.375 p.

65. Ficek D., Ostrowska M., Kazio M., Pogosyan S.I. Variability of the portion of functional PS2 reaction centres in the light of a fluorometric study // Oceanologia. 2000.V. 42. № 2. P. 243-250.

66. Geider R.J., Green R.M., Kolber Z. et al. Fluorescence assessment of the maximum quantum efficiency of photosynthesis in the western North Atlantic// Deep-Sea Res. 1993. V. 40. P. 1205-1224.

67. Glazer A.N. Phycobilisome. A macromolecular complex optimized for light energy transfer. // Biochim. Biophys. Acta. 1984. V.768. P. 29-51.

68. Green R.M., Kolber Z., Swift D.G. et al. Phisiological limitation of phytoplankton photosynthesis in the eastern Equatorial Pacific determined from variability in the quantum yield of fluorescence // Limnol. Oceanogr. 1994. V. 39. P. 1061-1074.

69. Goh C.H., Schreiber U., Hedrich R. New approach of monitoring changes in chlorophyll a fluorescence of single guard cells and protoplasts in responce to physiological stimuli // Plant Cell Environ. 1999. V.210. P. 268.

70. Haehnel W., Nairn J.A., Reisberg R., Sauer K. Picosecond fluorescence kinetics and energy transfer in chloroplasts and algae // Biophys. Biochim. Acta. 1982. V. 680. P. 161-173.

71. Hansson O., Wydzynski T. Current perception of photosystem II // Photosynth Res. 1990. V. 23. P. 131-162.

72. Haworth P., Karukstis K.K., Sauer K. Picosecond fluorescence kinetics in spinach chloroplasts at room temperature. Effect of phosphorilation // Biophys. Biochim. Acta. 1983. V. 725. P. 261-271.

73. Keller A.A. Mesocosm studies of DSMU-enhanced fluorescence as measure of phytoplankton photosynthesis // Mar. Biol. 1987. V. 96. №1. P. 107-114.

74. Kiefer D. A. and Reynolds R. A. Advances in understanding phytoplankton fluorescence and photosynthesis // In «Primary productivity and biogeochemical cycles in the sea». Environ. Sci. Res. 43. Plenum. 1992. P. 155-174.

75. Klimov V.V., Klevanik A.V., Shuvalov V.A, Krasnovsky A.A. Reduction of pheophytin in the primary light reaction of photosystem II // FEBS Lett. 82. 1977. P. 183- 186.

76. Koblizek M., Ciscato M., Komenda J., Kopecky J., Siffel P., Masojidek J. Photoadaptation in the green alga Spongiochloris sp. A three-fluorometer study //Photosynthetica. 1999. V.37. № 2. P. 307-323.

77. Kolber Z., Wiman K. D., Falkowski P. G. Natural variability in photosynthetic energy conversion efficiency: a field study in the Gulf of Maine // Limnol. Oceanogr. 1990. V 35. P. 72-79.

78. Krause G.H., Weis E. Chlorophyll fluorescence and photosynthesis: The basics // Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant. Mol. Biol. 1991. V. 42. P. 313349.

79. Lazar D. Chlorophyll a fluorescence induction // Biochim. et Biophys. Acta. 1999a. V.1412. № 1.-P.1-28.

80. Lazar D. Exprimental and theoretical studies of the in vivo chlorophyll a fluorescence transient: OKJIP // Doctoral thesis. Palacky University, Olomouc, Czech Republic. 1999b. 32 p.

81. Lichtenthaler H.K., Miehe J.A. Fluorescence imaging as a diagnostic tool for plant stress // Trends Plant Sci. 1997. V. 2. P. 316-320.

82. Long S. P., Humpries S. and Falkowski P. G. Photoinhibition of photosynthesis in nature // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1994. V. 45. P. 655-662.

83. Lorenzen С.A. A method for continuous measurement of in vivo concentration // Deep Sea Res. 1966. V. 13. №2. P. 223-227.

84. Lu C.M., Chau C.W., Zhang J.H. Acute toxicity of excess mercury on the photosynthetic performance of cyanobacterium, S. platensis -assessment by chlorophyll fluorescence analysis // Chemosphere. 2000. V. 41. P. 191-196.

85. Matorin D.N., Vuksanovich N., Rubin A.B., Venediktov P.S. Application of chlorophyll fluorescence in studied of phytoplankton in the Mediterranean Sea// StudiaMarina. 2002. V. 23. P. 79-86.

86. Mohammed G.H., Binder W.D., Gillies S.L. Chlorophyll fluorescence: a review of its practical forestry applications and instrumentation // Scandinavian Journal of Forest Research. 1995. V. 10. P. 383-410.

87. Morel A. light and marine photosynthesis: a spectral model with geochemical and climatological implications // Progress in Oceanography. 1991. V. 26. P. 263-306.

88. Ostrowska M., Majchrowski R., Matorin D. N., Wozniak B. Variability of the specific fluorescence of chlorophyll in the ocean. Part 1. Theory of classical in situ1 chlorophyll fluorometry // Oceanologia. 2000a. V. 42(2). P. 203-219.

89. Ostrowska M., Matorin D. N., Ficek D. Variability of the specific fluorescence of chlorophyll in the ocean. Part 2. Fluorometric method of chlorophylla determination // Oceanologia. 2000b. V. 42 (2). P. 221-229.

90. Ounis A., Evain S., Flexas J., Tosti S., Moya I. Adaptation of a PAM-fluorometers for remote sensing of chlorophyll fluorescence // Photosynth. Res. 2001. V. 68. № 2. P. 1 13-120.

91. Pogosyan S.I., Sivchenko M.A., Maksimov V.N. Physiological heterogeneity of micro algae populations. Classification of «Scenedesmus quadricauda» coenobiums by the types of fluorescence induction curves // Biol. Bulletin. 1996. V. 3. P. 337-343.

92. Putt M., Harris G. P., Cuhel R. L. Photoinhibition of DCMU-enhanced fluorescence in lake Ontario phytoplankton // Can. J. Fish. Aquat. Sci. 1987. V. 44. P. 2144-2154.

93. Renger G. Energy transfer and trapping in photosystem II // In: J.Barber (ed.) The photosystems: structure, function and molecular biology. Elsevier. Amsterdam. 1992. P. 45-99.

94. Riznichenko G., Lebedeva G., Pogosyan S., Sivchenko M., Rubin A. Fluorescence induction curves registered from individual microalgae cenobiums in the process of population growth. // Photosynthesis Research. 1996. V. 49. P. 151-157.

95. Roy S., Legendre L. Field studies of DSMU-enhanced fluorescence as an index of in situ phytoplankton photosynthetic activity // Can. J. Fish, and Aquat. Sci. 1980. V.37. №6. P. 1028-1031.

96. Samson G., Pras.il O., Yaakoubd B. Photochemical and thermal phases of chlorophyll a fluorescence // Photosynthetica. 1999. V. 37. P. 163-182.

97. Schreiber U., Hormann H., Neubauer C. and Klughammer C. Assessment of photosystem II photochemiocal quantum yield by chlorophyll fluorescence quenching analysis // Plant Physiol. 1995. V. 22. P. 209-220.

98. Schreiber U. Chlorophyll fluorescence and photosynthetic energy conversion: Simple introductory experiments with the TEACHING-PAM chlorophyll fluorometer // Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany. 1997. P. 73.

99. Schreiber U. Chlorophyll fluorescence: new instruments for special applications. In: G.Garab (ed) Photosynthesis: Mechanisms and Effects // Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. 1998. V. 5. P. 4253-4258.

100. Staehelin L.A. Chloroplast structure and supramolecular organization of photosynthetic membranes // In: Encyclopedia of plantphysiology, 19, Photosynthesis III. Staehelin L. and Arntzen C., ed. Springer, Berlin. 1986.

101. Styring S., Virgin I., Ehrenberg A., Andersson B. Strong light photoinhibition of electron transport in photosysten II. Impairment of the function of the first quinone acceptor Qa // Biochim. et Biophys. Acta. 1990. V. 1015 (2). P. 269-278.

102. Thompson L.K., Brudvig C.W. Cytochrome b-559 may function to protect photosystem II from photoinhibition // Biochemistry. 1988. V. 27. P. 6653-6658.

103. Van Kooten O., Snel J.F.H. The use of chlorophyll fluorescence Nomenclature in plant stress physiology // Photosynth. Res. 1990. V. 25. P. 147-150.

104. Vassiliev I.R., Prasil O., Wyman K.D., Kolber Z., Hanson A.K., Prentice J.E. and Falkowski P.G. Inhibition of PS II photochemistry by PAR and UV radiation in natural phytoplankton communities // Photosynth. Res. 1994. V. 42. P. 61-64.

105. Vavilin, D.V., Matorin D.N. Rubin. A. B. The high-temperature thermoluminescence of chlorophyll as a method to study lipid peroxidation in planktonic algae // Archiv for Hydrobiologie. 2002. V. 153 (4) P. 685701.

106. Vermaas W. Molecular-biological approaches to analyze photosystem II structure and function // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1993. V. 44. P. 457-481.

107. Walters R.G., Horton P. Theoretical assessment of alternative mechanisms for non-photochemical quenching of PSII fluorescence in barley leaves // Photosynth. Res. 1993. V. 36. P. 119-139.

108. Wasielwski M.R., Johnson D.G., Seibert M., Govindjee. Determination of the primary charge separation rate in isolated phorosystem II reaction centers with 500-fs time resolution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 524-528.

109. Weis E. and Berry J.T. Quantum efficiency of photosystem II in relation to energy -dependent quenching of chlorophyll fluorescence // Biochim. Biophys. Acta. 1987. V. 894. P. 198-208.

110. Wilhelm C. The biochemistry and physiology of light-harvesting processes in chlorophyll b and chlorophyll с containing algae // Plant. Physiol. Biochem. 1990. V. 28. P. 293-306.

111. Wozniak В., Dera J., Majchrowski R., Ficek D., Koblenz-Mishke

112. J., Darecki M. 'IOPAS Initial Model of Marine Primary Production for Remote Sensing Application // Oceanologia. 1997a. V 39 (4). P. 377-395.

113. Yudov M.V., Zhilin D.M., Pankova A.P., Rusanov A.G., Perminova

114. Young A.J., Frank H.A. Energy Transfer Reactions Involving Carotenoids: Quenching of Chlorophyll Fluorescence // J. Photochem. Photobiol. (B): Biology. 1996. V. 36. P. 3-15.

Информация о работе

Казимирко, Юрий Валерьевич
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.02

Диссертация

Разработка флуорометрических методов оценки состояния фотосинтетического аппарата для биоиндикации среды - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы