Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение параметров флуоресценции диатомовой водоросли Thalassiosira weissflogii в процессе роста при разных условиях облучения и минерального питания

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изменение параметров флуоресценции диатомовой водоросли Thalassiosira weissflogii в процессе роста при разных условиях облучения и минерального питания"

7742У

На правах рукописи

Конюхов Иван Владимирович

Изменение параметров флуоресценции диатомовой водоросли Гйа/«ж«<тга \veissflogii в процессе роста при разных условиях облучения и минерального питания

Специальность: 03.00.02 — биофизика

2 4 СЕН 2009

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009

003477429

Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научные руководители: доктор биологических наук

Сергей Иосифович Погосян

член-корр. РАН, доктор биологических наук Андрей Борисович Рубин

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Юрий Владимирович Балнокин

доктор физико-математических наук, профессор Александр Константинович Кукушкин

Ведущая организация: Институт Океанологии имени П.П. Ширшова РАН

Защита состоится 15 октября 2009 г. в 16 ч. 30 мин. на заседании Диссертационного совета Д501.001.96 при кафедре биофизики биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, г.Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, ауд. «Новая».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « //» сентября 2009 г. Ученый секретарь Диссертационного совета ^

доктор биологических наук, профессор ^' Т.Е. Кренделева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Регистрация флуоресценции хлорофилла является современным и перспективным методом для анализа состояния природного фитопланктона. Варьируя характер светового воздействия на фотосинтетический аппарат водорослей, можно измерять разные параметры флуоресценции - в частности флуоресценцию при открытых (F„) и закрытых (Fm) реакционных центрах (РЦ) фотосистемы 2 (ФС2) и величину нефотохимического тушения возбужденных состояний хлорофилла (NPQ). Преимущество таких измерений состоит в том, что они одновременно дают информацию о количестве фитопланктона и об эффективности преобразования световой энергии в поток электронов, создаваемой ФС2 (<р = (F„ - F„)/F„). Убедительно показано, что эффективность функционирования фотосинтетического аппарата, а вместе с ней и параметры флуоресценции хлорофилла, существенно изменяются в различных условиях. Основные закономерности изменений параметров флуоресценции хлорофилла, полученные на культурах водорослей, были успешно использованы для интерпретации результатов обследования природных сообществ фитопланктона.

В природной среде наиболее важными факторами существования для фитопланктона являются свет и обеспеченность биогенными элементами. В условиях дефицита минерального питания происходит снижение эффективности фотосинтеза. Недостаток фосфора снижает максимальную скорость работы АТФ-азного комплекса (Sivak, 1986), недостаток азота замедляет ресинтез белка D1 ФС2 и других белков (Shelly, 2002). При голодании по сере или азоту на фотосинтетической мембране хлоропластов активируется процесс утилизации ассимилированной углекислоты - хлородыхание (Quiles, 2006; Chemeris, 2004).

Как правило, в природе фитопланктон существует в условиях дефицита биогенных элементов, и концентрация биогена, появившегося в среде, в течение нескольких дней уменьшается до предельно низкого уровня. Такие природные процессы удобно изучать в модельных экспериментах с накопительной культурой водорослей. В этих условиях, в процессе прохождения культурой различных фаз роста, в фотосинтетическом аппарате клеток происходит ряд функциональных изменений, следствием которых является изменение параметров флуоресценции хлорофилла (Lippemeier, 2001; Нои, 2007).

В проведенных ранее работах, направленных на определение параметров флуоресценции в процессе роста культур водорослей (Young, 2003; Shelly, 2005), внимание исследователей было сосредоточено в основном на определении относительной переменной флуоресценции (F„ - F0)/F„. В настоящее время создана принципиально новая измерительная техника, которая существенно расширила диапазон применения

флуоресцентного метода. Высокое временное разрешение, чувствительность и возможность автоматического измерения большего числа параметров флуоресценции без специальной подготовки проб воды позволяет более полно охарактеризовать состояние фотосинтетического аппарата микроводорослей в природной среде.

Таким образом, на новом методическом уровне стало возможным изучить связь между состоянием ФСА и широким кругом параметров флуоресценции хлорофилла культур водорослей при разных условиях освещения и минерального питания.

Цели и задачи работы. Целью работы является выяснение связи параметров флуоресценции хлорофилла с функциональным состоянием фотосинтетического аппарата культуры диатомовой водоросли Тка1а$$ю$1га weissflogii.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: -определить оптимальные значения интенсивности возбуждающего света для корректных измерений параметров флуоресценции ТН. к\ при разных плотностях клеток в культуре и разном содержании в ней минеральных элементов;

-выявить закономерности изменения параметров флуоресценции в ответ на действие света различной интенсивности;

-изучить влияние температуры на параметры флуоресценции хлорофилла; -изучить корреляцию в характере изменений количества клеток, количества пигментов, параметров быстрой и замедленной флуоресценции хлорофилла на разных фазах роста клеток.

Научная новизна. Новизна исследований состоит в создании высокочувствительного метода измерения индукционной кривой флуоресценции хлорофилла при высоких интенсивностях возбуждающего света (до 12000 мкмоль-м"2-с'') и высоком временном разрешении (0,75 мкс). Разработана программа автоматического определения кинетических параметров индукционных кривых в разных условиях. Предложен алгоритм расчета эффективного сечения поглощения комплекса ФС2 и константы скорости переноса электрона между хинонными акцепторами ФС2. Установлено, что на протяжении своей экспоненциальной фазы рост клеток сопровождается одновременным пропорциональным увеличением общего содержания хлорофилла, каротиноидов и интенсивности флуоресценции хлорофилла при открытых и закрытых (/V,) РЦ ФС2. Показано, что на поздней стадии культивирования рост клеток характеризуется накоплением каротиноидов, не выполняющих светособирающей функции, и уменьшением относительной переменной флуоресценции хлорофилла вследствие инактивации РЦ.

Практическая значимость. Установлена связь между параметрами флуоресценции хлорофилла и функциональным состоянием фотосинтетического аппарата культуры

морской диатомовой водоросли, что позволит определять обилие и прогнозировать развитие фитопланктонных сообществ, а также оценивать экологическое состояние морских вод. Разработанный алгоритм определения размера антенного комплекса ФС2 и константы скорости переноса электрона между хинонными акцепторами ФС2 может быть использован для изучения адаптации природного фитопланктона к естественной освещенности и при оценке скорости первичной продукции.

Выявленные закономерности роста клеток позволяют на основе данных по флуоресценции хлорофилла выбирать оптимальные для функционирования ФСА условия по интенсивности света и по сочетанию азота и фосфора в среде. Автоматическое поддержание данных условий в биореакторах будет способствовать как быстрому росту культуры, так и наиболее эффективному использованию ресурсов минерального питания.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на международной конференции «Aquafluo» (г. Нове-Грады, Чешская республика, 2007), на международной научной конференции и VII школе по морской биологии (г. Ростов-на-Дону, 2008), на I и II научно-практических конференциях «Перспективы развития инноваций в биологии» (г. Москва, 2007 и 2008), на итоговых конференциях в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы» (г. Москва, 2007 и 2008) и на международной конференции "The World City Water Forum 2009" (Иичеон, Республика Корея, 2009).

По теме диссертации опубликовано б печатных работ, из них 2 статьи в российских журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на ¡1/3 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа проиллюстрирована ¿^рисунками; список литературы включает источника.

Список сокращевий

АТФ - аденозинтрифосфат

ЗФ - замедленная флуоресценция

РЦ- реакционный центр

ФС1 - фотосистема 1

ФС2 - фотосистема 2

ФСА - фотосинтетический аппарат

ФСЕ - фотосинтетическая единица ФХ - флуоресценция хлорофилла Хл - хлорофилл

ЭТЦ - электрон-транспортная цепь Th. w. - Thalassiosira weissßogii

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом исследования являлись альгологически чистые культуры морской одноклеточной диатомовой водоросли Th. w., выращенные при 25'С на искусственно приготовленной морской воде с различным содержанием фосфора и азота. Рост культур был обеспечен белым светом от матриц излучающих диодов, работающих в 14-часовом суточном режиме. Одна из культур (в дальнейшем обозначаемая LL f/2) выращена при интенсивности света 5 мкмоль-м"2-с"' на среде с исходным содержанием фосфатов и нитратов согласно прописи среды f/2 (Guillard, 1962). Три другие выращены при повышенной интенсивности 40 мкмоль-м"2-с~' (HL), но при разном начальном содержании биогенов: при содержании нитратов и фосфатов согласно прописи среды f/2 (HL f/2), при уменьшенном в 5 раз содержании фосфатов (HL Р-) и при уменьшенном в 5 раз содержании нитратов (HL N-). Количество клеток определяли визуально под микроскопом в счетной камере. Спектры поглощения суспензий клеток и экстрактов клеточных пигментов измеряли на спектрофотометре, разработанном на кафедре Биофизики Биологического ф-та МГУ. Его описание приведено в диссертации. Содержание хлорофилла определяли согласно ГОСТ 17.1.4.02-90 «Вода. Методика спектрофотометрического определения хлорофилла - а». Общее содержание каротшюндов оценивали по оптической плотности экстракта пигментов в 90% водном растворе ацетона на длине волны 483 нм. Спектры испускания флуоресценция хлорофилла измеряли спектрометром USB-4000FL (Ocean Optics, США). Спектры возбуждения флуоресценции хлорофилла регистрировали на спектрофлуориметре Hitachi-850 (Япония). Кинетику затухания флуоресценции хлорофилла рассчитывали по распределению времени прихода первого фотона после подачи на объект светового импульса (лазер BHL-600, = 650 нм, At = 50 пс, Becker-Hickl, Германия). Фотоны флуоресценции преобразовывались модулем РМС-100 (Германия) в электрические импульсы, время прихода которых фиксировалось установкой TAU-140 (Германия). Анализ кинетики затухания ФХ проводили в двухэкспоненциальном приближении. Фотохимический квантовый выход ФС2 определяли в пробах, адаптированных к темноте р = FJFm = (F„ - F0)/Fm и в пробах, помещенных в условия стационарного освещения р' = AF/F„'~(F„'- F,)/Fmгде F„ - выход флуоресценции в пробе, адаптированной к темноте; F, - выход флуоресценции после 4-х минутной адаптации к постоянному свету (0 - 200 мкмоль-м'2-с"', >чп„ = 455 нм); F„ - выход флуоресценции в максимуме индукционной кривой, измеренной при 3000 мкмоль-м*2-с*' (?-тИ = 455 нм) после темновой адаптации; Fm' - выход флуоресценции в максимуме индукционной кривой, измеренной при 3000 мкмоль-м"2-с"' (Х^,« = 455 нм) после 4-х минутной адаптации

к постоянному свету (0 - 200 мкмоль-м"2-с"', л™< = 455 им). Кинетики индукции флуоресценции регистрировали на флуориметре высокого временного разрешения, разработанного на кафедре Биофизики Биологического ф-та МГУ, в ответ на возбуждающий световой импульс прямоугольной формы с интенсивностью 20012000 мкмоль*м *с (Хтах — 455 нм) и продолжительностью 1,5 с (рис. 1). Оптическая плотность объекта на длине волны 455 нм не превышала 0,05. Из экспериментальной кривой индукции флуоресценции как функции времени рассчитывали функцию

^ксяСО-

^ р

= —--2---"—, которая в приближении многоцентровых

фотосинтетических единиц дает долю закрытых к моменту времени / реакционных центров ФС2 (АШа1, 2008). Функцию ХЭ1ССП(0 анализировали путем аппроксимации суммой 3-х экспоненциальных компонент, обозначенной Х(/). Каждая из этих компонент характеризуется вкладом в кинетику перехода РЦ в закрытое состояние - и постоянной

времени ту. X(t) = 1 -

А{ ■ е '' + А1 ■ е '' + А3 ■ е ''

где A¡+A2+A3= 1 и 0 < t¡ < т2 < Тз.

Кинетику индукции замедленной флуоресценции (ЗФ) регистрировали на цилиндрическом фосфороскопе, разработанном на кафедре Биофизики Биологического ф-та МГУ. Средняя интенсивность возбуждающего света в измерительном отделении соответствовала режиму насыщения амплитуды сигнала на промежуточном плато A'F индукционной кривой ЗФ (200 мкмоль-м"2-с"', = 650 нм).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Спектры испускания флуоресценции хлорофилла при разном состоянии реакционных центров ФС2.

В данном разделе показано, что форма спектров испускания ФХ суспензии Th. w. практически не зависит от состояния РЦ ФС2. Погрешность флуориметра в определении интегрального (по спектру) выхода флуоресценции на разных участках индукционной кривой не превышает 2%.

2. Выбор оптической плотности образца для измерений параметров флуоресценции.

Показано, что регистрация флуоресценции на оптически плотной суспензии клеток (0,1 <D< 0,7) не влияет на измеренное значение F/Fm, однако сопровождается удлинением фотохимической фазы кривой индукции по сравнению с оптически менее плотным объектом (D < 0,05). Данный эффект связан с экранированием возбуждающего

света наружным слоем клеток в кювете и приводит к отклонению от линейной связи между параметрами и и содержанием хлорофилла в пробе. При росте клеток на среде £72 оптическая плотность культуральной жидкости в стандартной 1 см кювете выходит за пределы линейной области. Условия корректного измерения флуоресценции иа всем протяжении роста культур клеток можно обеспечить путем ее регистрации в кюветах с малым оптическим путем, обеспечивающим оптическую плотность ниже 0,05.

3. Способ измерения фотохимического выходя ФС2 по кривой индукции

флуоресценции.

Способ определения выхода флуоресценции при закрытых РЦ (/^ и Рт'), использованный в данной работе, отличается от разработанного Шрайбером алгоритма РАМ, который широко применяется в исследованиях первичных процессов фотосинтеза. На верхней части рис. 1 приведена временная диаграмма импульсов, которыми осуществляется возбуждение флуоресценции и закрытие РЦ для формирования индукционной кривой. Данные импульсы имеют прямоугольную форму и создаются одной и той же парой излучающих диодов. Отдельный источник насыщающего света, в

Флуориметр устроен таким образом, что интенсивность света в течение действия каждого импульса

(плотность потока

квантов, /„) не зависит от их длительности. Поэтому плотность потока квантов в коротких импульсах (5 мкс), используемых для измерения (левая область диаграммы, рис. 1), не отличается от плотности потока квантов в продолжительном световом импульсе (1,5 с),

используемом для измерения индукционной кривой и определения уровня Гт (правая область диаграммы, рис. 1), Величину /„ определяли независимо при помощи

отличие от РАМ-флуориметров, отсутствует.

Плотность потока квантов возбуждающего света

0 5 мкс 0,25 с

Интенсивность флуоресценции

Г«

Р.

ч-—п---^---*— *

Время

О 5 мкс °-25 с Время

Рис. 1. Временные диаграммы интенсивности

возбуждающего света (верхняя) и интенсивности флуоресценции (нижняя).

радиометра при действии импульса продолжительностью 1,5 с (рис. 1).

В данном разделе проведен выбор значения /„, наилучшим образом подходящего для определения относительной переменной флуоресценции ФС2 (р = /^/У»,) ТИ. ус. Максимально возможное значение интенсивности, доступное в приборе составляет 12000 мкмоль м~2 с"1. При такой интенсивности света увеличение флуоресценции при действии коротких импульсов для измерения Р„ на пробе клеток с высоким значением р (0,77) не превосходит 2-3%. Однако известно, что в условиях дефицита биогенных элементов РЦ переходят в закрытое состояние при меньших световых потоках, чем в условиях хорошего обеспечения биогенами. Поэтому в качестве стандартной интенсивности света выбрали несколько меньшее значение /,- 3000 мкмоль м"2 с"'.

При постоянном для объекта размере антенного комплекса ФС2 (о>от) величина /„ определяет частоту о попадания квантов в комплекс ФС2: о = орягЬ [с*1]-

Измерение флуоресценции при открытых РЦ ФС2 (/■',,) происходит с помощью интенсивных коротких (Д* = 5мкс) импульсов света, разделенных темновыми интервалами (250 мс). За один импульс с длительностью А1 в один РЦ в среднем попадает о'А/ = аря1%1„-ЬЛ фотонов. По литературным данным, ор$п составляет 300 А2. Поэтому при выбранном значении /„ = 3000 мкмоль м"2 с"1 величина в-А/ для 5 мкс импульса составляет 0,01. Иными словами, к концу действия каждого 5 мкс импульса из 100 открытых РЦ только 1 перейдет в закрытое состояние, что можно считать вполне удовлетворительным.

При измерении /■"„ средняя величина о с учетом темповых интервалов между импульсами равна ОД с"1 (для <Тряп= 300 А.2 и /„ = 3000 мкмольм'2с"'), что много меньше константы скорости окисления пластохинонов в мембране (~ 50 с"1). Поэтому поток электронов, создаваемый в этих условиях ФС2, практически не изменяет исходного редокс-состояния пула хинонов. В этом режиме возбуждения в период времени между поглощением одного фотона и поглощением следующего фотона РЦ успевает передать электрон в ЭТЦ и вернуться в открытое состояние.

Измерение индукционной кривой происходит при действии импульса света с интенсивностью /<, и продолжительностью 1,5 с (рис. 1 справа). Поскольку темновые интервалы в данном случае отсутствуют, величина с составляет 5400 с"1 (для агзп = 300 А2 и /„ = 3000 мкмоль'м"2х"'), что существенно больше константы окисления пластохинонов (-50 с"1). В этом режиме освещения происходит полное восстановление хинонов в мембране. Поскольку теперь перенос электрона от РЦ в ЭТЦ невозможен, к приходу очередного фотона РЦ не успевает вернуться в открытое состояние. В течение 1,5 с такого интенсивного непрерывного освещения все РЦ переходят в закрытое состояние, а

интенсивность флуоресценции достигает своего максимального значения Fp = F„ (правая область рис. 1).

Итак, для проведения измерений F/F„ и tJF/F'm было выбрано значение /, равное 3000 мкмоль м'2 с"', при котором импульс света продолжительностью 1,5 с способен закрыть все РЦ, в том числе при большом нефотохимическом тушении.

4. Индукцнонвые кривые флуоресцевцнв хлорофилла суспензий клеток 77». №, адаптированных к темноте.

Для многих объектов показано, что кривая индукции в общем случае имеет фотохимическую и термальную фазу, однако абсолютные значения кинетических параметров индукционной кривой Th. w., а также их поведение при изменении температуры и интенсивности света, изучены впервые.

Типичная кривая индукции флуоресценции F,KC„(t), соответствующая ей функция X,KC„(t) и модельная функция Xfí) с подобранными значениями параметров (A¡ и ту см. методы исследования) представлены на рис. 2. На всем участке от F„ до Fm индукционная кривая

F,Kcn(i) монотонно возрастает и в различных временных областях включает в себя четыре промежуточных плато, описанных в литературе как О, J, I и Р (рис. 1). Особых участков, в которых происходит локальное повышение флуоресценции (пики "К", "G" или "Н", Lazar, 2003), не обнаружено. Кинетика перехода РЦ в закрытое состояние Xma,(í) для Th. w. описывается в трехэкспоненциальном приближении Х(1) с вполне удовлетворительной точностью. Время т} составляет 15 - 17 мс и больше времени Т/ в 50-500 раз, а время г? равно 140-200 мс. Таким образом, экспоненциальные составляющие функции Хэкс„(1) не перекрываются по времени. На этом основании Штрассер и Лазар связывают их с определенными процессами, последовательно протекающим внутри комплекса ФС2 и в его ближайшем окружении.

Фотохимическую фазу кривой индукции (фазу OJ) характеризуют два экспериментально определяемых параметра: A¡ - доля РЦ, закрытых на фазе OJ (рис. 2), и г; - время, за которое функция X(í) достигает уровня 0,63-Ai. Зависимости A¡ и т/ от

10 000 100 000 10ОО ООО

Рнс. 2. Кривая индукции флуоресценции Th. w.

интенсивности возбуждающего света для адаптированных к темноте образцов представлены на рис. 3. Эти зависимости могут быть описаны схемой, включающей фотохимический перенос электрона к первичному хинону Ол со скоростью V/ и реакцию окисления О,' со скоростью V] для восстановления вторичного хинона Оь

Если принять, что /Ш + [<2а] = 1, ТО V; = кг[Оа 7 И V, = к1(1-[<2а~1) =

0.9 400

• 0.04

• / - зоо

0,6 А 0,03

1 \ —м '20° 1 2 0.02

0.3 с 5

• 100 0.01

п

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 2000 4000 6000 8000 10X0 120Х

а Плотность потока квантов возбуждающего света. О Плотность ногска квактов возбуждающего света,

мкмоль м-2 с-1 М(М0ЛЬИ-2<-1

Рис.3 Зависимости относительной амплитуды и характеристического времени

фотохимической фазы кривой индукции от интенсивности возбуждающего света.

Константа фотохимической реакции кг равна скорости разделения зарядов V) при полностью открытых РЦ, то есть произведению плотности потока квантов (/„) на среднее эффективное сечение поглощения пигментов одного РЦ (<г/шг) и на вероятность разделения зарядов в открытом РЦ ФС2 <р = = 0,77 (для объекта на рис. 3): =1о-Ок1Г9-

Реакция 2 обеспечивает последовательный перенос 2-х электронов на Оь. Перенос первого и второго электронов характеризуется разными скоростями, но для простоты описания этой реакции нами была использована обобщенная константа Л* Реакции обратного переноса электронов не учитывали.

Выход кривых ГэияСг) и на "плато" .1 соответствует моменту установления

квазистационарного состояния РЦ, при котором приток электронов на Оа уравновешивается их оттоком на Оь. Из условия стационарного состояния (V) = Уг) следует, что на пике I доля восстановленного Ол определяется соотношением между константой фотохимического разделения зарядов (/»-Одет*?) и константой переноса электрона на Оь (Аг):

При постоянных для объекта величинах кз, «теп и <р, график [Qa]J от /„ представляет собой монотонно возрастающую кривую с насыщением. Экспериментальная зависимость А/ от /„ имеет такой же характер (рис. 3 а). Теоретически, величина [Qa']J достигает половины уровня насыщения при /»•(Гге/Г? = Значение Л/ достигает этого уровня уже при 1„ = 200 мкмоль-м~2-с"' (рис. 3), что будет использовано ниже для определения Лг.

Область интенсивностей 2000 -12000 мкмоль-м"2-с"' является для параметра А/ областью насыщения (рис. 3 а). В этом диапазоне интенсивностей переход РЦ в закрытое состояние завершается быстрее, чем начинается восстановление 0». В этом случае доля закрытых РЦ Х(1) описывается уравнением:

-х = (г"<т«"'/°'Л

1 ,

= где r

В рамках сделанных допущений, т можно отождествить со временем нарастания функции X(t) на фотохимической фазе индукции ть Величина l/г; линейно зависит от интенсивности возбуждающего света (рис. 3 б). Тангенс угла наклона световой кривой 1/17 (рис. 3 б) равен с точностью до <р среднему эффективному сечению поглощения пигментов, приходящихся на один РЦ ФС2 (opsn)'.

а ~ 'А'

и гал ,

' 1 о

Для Th. w. в точке /„= 10000 мкмоль м"2-с"' (-6-1021 квантов м"2-с"') величина 1/г/ составляет 0,032 мкс"1 (рис. 3 б). При <р = 0,77 эффективное сечение поглощения ФС2 на длине волны возбуждающего света 455 нм оказалось равным 700Ä2. При таком значении Bpsn константа переноса электрона с ß," на Qt (кг) для РЦ ФС2 Th. w. составила 650 с"1 (к2 = h-apsirq> ='-200 мкмоль*м"2"с"' • 6-Ю23 моль ' • 700Ä2 ■ 0,77).

5. Параметры флуоресценции хлорофилла Th. № при разных температурах.

Параметры флуоресценции были измерены при 25'С и 6"С в условиях длительного освещения и вызванного им нефотохимического тушения. Постоянное облучение создавали отдельным источником, интенсивность которого - / - варьировали от 0 до 200 мкмоль м'2-с*'. Возбуждение флуоресценции хлорофилла проводили согласно выбранному ранее режиму измерения (рис. 1). При наличии постоянной подсветки вместо параметра F„ регистрируется параметр Ft, а вместо Fm - параметр F„'. Плотность потока квантов в импульсах возбуждающего света /„ оставалась постоянной на уровне 3000 мкмоль-м"2-с '.

На фоне постоянного освещения, квантовый выход разделения зарядов ФС2 р'= (Р„'- Р,)/Рт' снижается с ростом интенсивности постоянной подсветки I (рис.4). Известно, что при возрастании I снижение квантового выхода разделения зарядов ФС2 происходит за счет перехода части РЦ в закрытое состояние, то есть уменьшения

фотохимического тушения (Крь), а также за счет появления нефотохимического тушения (К„м):

МКМОЛЬ м-2 с-1

Рис. 4. Изменение фотохимического квантового выхода ФС2 при адаптации клеток с постоянному свету разной интенсивности.

О 30 60 90

Плотность потока квантов постоянной подсветки, мкмоль м-2 с-1

Рве. 5. Изменение величин Рт' и Б, при адаптации клеток к постоянному свету разной интенсивности.

интенсивности света 15 мкмоль-м"2-с"', ниже которого нефотохимическое тушение не развивается (25'С, рис. 6). При возрастании/от0 до 15 мкмольм"2с"' величина Я", увеличивается в 1,7 раза (25'С, рис. 5). Этот процесс отражает появление в объекте закрытых РЦ. Величина Рт' в области 0-15 мкмоль-м"2-с"' сохраняется на уровне (25'С, рис. 5). Поэтому снижение фотохимической

эффективности ФС2 с 0,72 до 0,5 на участке от 0 до 15 мкмоль-м"2-с"' (25°С, рис. 4) вызвано только уменьшением фотохимического тушения. Выше этого порога фотохимическая эффективность ФС2

0? I И 100 150 200

Плотность потока квантов постоянной подсветки, мкмоль м-2 с-1

Рис.6. Нефотохимическое тушение возбужденных состояний хлорофилла при при адаптации клеток к постоянному свету разной интенсивности.

К Л')

К, + К,+ £„„(/)+ Предполагается, что в объекте, адаптированном к темноте (1 = 0), нефотохимическое тушение

отсутствует

безызлучательные и излучательные потери энергии в молекулах хлорофилла описываются

внутримолекулярными константами Кл и К/.

При нормальной температуре существует пороговое значение

продолжает снижаться как вследствие увеличения количества закрытых РЦ, так и вследствие развивающегося нефотохимического тушения (25°С, рис. 6).

При 6°С, по мере увеличения /, изменения величин (Рт' - Щ!Рт', Р,, Р„' и №() друг относительно друга протекают в той же последовательности, что и при 25°С. Однако все эти изменения происходят в области более низких интенсивностей постоянной подсветки. В этом случае возникновение нефотохимического тушения начинается при интенсивностях существенно меньших 15 мкмоль-м"2-с"' (6'С, пунктирная стрелка на рис. 6). Величина Р/, также как и при комнатной температуре, сначала возрастает при закрытии РЦ (0</<5 мкмоль-м'2-с"', рис.5), а затем снижается при развитии нефотохимического тушения (/> 5 мкмоль-м"2с"', рис. 5).

Увеличение интенсивности постоянного света выше пороговых значений, составивших 15 мкмольм"2-с"' для 25'С и 2 мкмоль-м"2-с"' для 6'С, сопровождается увеличением параметра NPQ (рис. 6). Для П. м/. показано, что это тушение не возникает при устранении градиента Н+ на фотосинтетической мембране. Поэтому абсолютная величина может быть использована в качестве индикатора формирования градиента Н*\ Предельный уровень №Р() (МРОтт, рис. б) при понижении температуры до 6°С

По фотохимическому выходу ФС2, определенному в условиях разной освещенности (рис. 4), были рассчитаны световые кривые скорости электронного транспорта, создаваемого

одним РЦ ФС2 (рис. 7):

р' -р

ЕТк = арш ■ I ■ ——;—- , где Рт

I-интенсивность постоянной подсветки [квантов-м"2-с"'], Орш- сечение поглощения ФС2, оцененное ранее в 700 А2 (с. 11). Световые кривые электронного транспорта при разных температурах характеризуются одним и тем же углом наклона в области малых интенсивностей, однако по уровню насыщения они отличаются в 6-7 раз (рис. 7). По углу наклона кривых в начале координат видно, что эффективность разделения зарядов в открытых РЦ с температурой не изменяется.

Области светового насыщения кривых электронного транспорта (рис. 7) соответствуют условиям, в которых частота поглощения квантов света (для

увеличивается на 10% по сравнению с 25 С.

2 70

2 3 и 60 25'С

д! 50 у/

8 40 • ю е /

о и о о. 30 ■ /

Е 1 « I 20 • % 5 / . 6'С

% 10- ......................

I 0 /

0 30 60 90

Плотность потока квантов постоянной подсветки,

мкмоль м-2 с-1

Рнс. 7. Скорость линейного электронного

транспорта, создаваемого ФС2 при разной

освещенности.

интенсивности света 40 мкмоль-м"2с'' она составляет 170 с'1 на РЦ) превышает максимальную скорость "работы" донорного или/и акцепторного окружения Peso Оцененная ранее максимальная скорость переноса электрона с Qa~ на Qt составляет 650 с"' (при полностью восстановленном 6», с. 11) и, стало быть, не может ограничить транспорт на уровне 65 с"' (при комнатной температуре, рис. 7). По-видимому, "узкое место" находится за пределами ФС2 с ее донорной или акцепторной стороны.

Выявленное повышение флуоресценции в пике Р индукционной кривой на 5 - 7% при охлаждении суспензии клеток до 6'С (0 мкмольм"2-с"', рис. 5) свидетельствует в пользу ингибирования акцепторной части ФС2. Оно может состоять в уменьшении подвижности мембранных переносчиков электрона или/и скорости их последующего окисления. В окрестности РЦ создается зона с полностью восстановленными хинонами, перенос электрона в которую становится невозможным. В таких условиях закрытый РЦ возвращается в открытое состояние гораздо медленней.

Несмотря на то, что максимальная скорость электронного транспорта при 6'С в 7 раз ниже чем при 25'С (рис. 7), нефотохимическое тушение при 6'С оказывается более интенсивным чем при 25'С (рис. 6). Это говорит о том, что снижение температуры приводит к более значительному уменьшению рН люмена в ответ на постоянное освещение. Такое возможно только в том случае, если поток протонов из люмена в строму через АТФ-азу замедляется сильнее, чем электронный транспорт. Полученные результаты согласуются с известными литературными данными о значительном замедлении работы АТФ-азного комплекса в условиях низкой температуры (Watanabe, 2008).

При частичном закрытии РЦ под действием продолжительного слабого освещения, которое повышает флуоресценцию с F0 до F,, но еще не приводит к нефотохимическому тушению, Г/ при комнатной температуре уменьшается (25'С, 0-15 мкмоль-м"2-с"', рис.8). Однако для модели изолированных ФСЕ значение г; не должно зависеть от начального количества открытых РЦ. В связи с этим в литературе (Lavorel, 1972; Кукушкин, 1988) обсуждается лучшее соответствие характера экспериментальных индукционных кривых модели энергетически связанных ФСЕ ("connected" PSUs). Согласно последней, вероятность закрытия РЦ в единицу времени (1/ту) возрастает (а г;

6'С .-*"

* 100

25'С

0 30 60 90

Плотность потока квантов постоянной подсветки, мкмоль м-2 с-1

Рис. 8. Длительность фотохимической фазы индукционной кривой при адаптации клеток к разной освещенности.

убывает) при закрытии части РЦ, поскольку отдельный комплекс ФС2 с открытым РЦ может получать дополнительный поток энергии от соседних комплексов, в которых РЦ оказались закрытыми.

При развитии нефотохимического тушения вероятность разделения зарядов в открытом РЦ уменьшается, что сопровождается увеличением длительности 1-й компоненты кривой индукции флуоресценции (25*С, 15-80мкмоль-м"2-с'', рис.8). Экспериментальные данные качественно согласуются с литературными данными о локализации энергизационного тушения в светособирающей антенне. Увеличение N90, от 0 до 1,3 в интервале 15 - 80 мкмоль-м"2-с"' (25°С, рис. б) приводит к увеличению параметра г; кривой индукции флуоресценции в 1,5 раза (25"С, 15-80 мкмоль-м'2-с"', рис. 8).

Поскольку при 6'С нефотохимическое тушение начинает развиваться с самых низких значений интенсивности постоянной подсветки (6'С, рис. 6), зависимость г/ от I при данной температуре не имеет убывающего участка (6'С, рис. 8).

Из полученных данных следует, что в процессе адаптации клеток водорослей к постоянному свету длительность фотохимической фазы кривой индукции флуоресценции Г/ находится под влиянием двух факторов - начального количества открытых РЦ и величины нефотохимического тушения.

***

Активация системы нефотохимического тушения ТИ. м. при комнатной температуре имеет явно выраженный световой порог. Длительное облучение клеток светом с интенсивностью ниже этого порога вызывает переход части РЦ в закрытое состояние, однако не вызывает не фотохимического тушения. Закрытие РЦ, которое происходит при постоянном освещении, приводит к тому, что общий поток поглощенной пигментами энергии перераспределяется в пользу той части РЦ, которая в данный момент времени находится в открытом состоянии.

Снижение температуры с 25'С до 6'С приводит к замедлению электронного транспорта при ингибировании "слабого звена" электрон-транспортной цепи -предположительно процесса окисления пластохинонов. Несмотря на значительное замедление электронного транспорта при снижении температуры, в клетках в этих условиях формируется интенсивное нефотохимическое тушение, свидетельствующее о существенном ингибировании АТФ-азного комплекса хлоропластов.

6. Изменение функциональных характеристик фотосинтетического аппарата ТН. н>. в процессе роста клеток в накопительной культуре.

Общая характеристика роста клеток ТИ. уу. и изменений их пигментного аппарата в накопительной культуре. На рис. 9 представлены кривые роста культур, построенные по количеству клеток, по содержанию хлорофилла в объеме суспензии и по оптической плотности культуры в максимуме поглощения хлорофилла а.

Время от начала культивирования, сутки

Рис. 9. Изменения в процессе культивирования ТЬ. к.: а - количества клеток; б - концентрации хлорофилла "а"; в - оптической плотности культуры клеток при А. = 677 нм.

Воомя от начала культивирования, сутжи

Изменения количества клеток ГЛ. н'. представляют собой кривые с насыщением (рис. 9 а), поскольку у погибающих в фазе голодания клеток сохраняется кремневый панцирь. Изменения количества фотосинтетических пигментов и оптической плотности культуры завершаются негативной фазой (рис. 9 б и рис. 9 в). Данная фаза может быть связана с разборкой пигментного аппарата, которая контролируется клеткой, или с неуправляемым фотовыцветанием пигментов. В первые двое-трое суток все три культуры НЬ растут с примерно одинаковой скоростью, что говорит об отсутствии дефицита фосфора и азота в клетках в эти дни. По всей видимости, даже в случае пятикратного разбавления среды по фосфору или азоту, небольшое исходное количество клеток оказывается способным полностью обеспечить себя биогенными элементами за счет их быстрого поглощения из среды и внутреннего депонирования (Левич, 1997).

В течение 1-й недели, все культуры, находящиеся на свету с плотностью потока квантов 40 мкмоль-м"2-с"' (НЦ рис. 9), в 2 - 4 раза опережают в росте культуру, растущую при плотности потока квантов 5 мкмоль-м"2-с"' (IX, рис. 9). Эти данные свидетельствуют о явном лимитировании роста культуры количеством падающего света в случае адекватного обеспечения элементами минерального питания. Однако, по мере исчерпания азота и

фосфора в среде и в самих клетках, деление водорослей прекращается. Нетривиальным является то, что при одинаковом исходном содержании биогенных элементов максимальное количество клеток и пигментов в культуре HL оказывается в 1,5-2 раза ниже, чем в культуре LL (полная среда, HL С2 и LL172, рис. 9 б). Вероятным его объяснением является вынужденный расход части минеральных ресурсов на защиту клеток от повреждающего светового воздействия, проявляющегося в культурах HL после 6-го дня культивирования по снижению FJFm (рис. 13 в) и по уменьшению количества

В первые 2 дня во всех культурах скорость синтеза хлорофилла превышает скорость роста клеток, поэтому содержание хлорофилла в клетке увеличивается с 2 пг до 8 - 9 пг (рис. 10 а). К 4-м суткам образование хлорофилла в клетках замедляется, в то время как частота деления клеток сохраняется практически на том же уровне. К моменту прекращения деления клеток в культуре (13-й день для НЬ и 35-й день для IX, рис. 9 а), среднее внутриклеточное содержание хлорофилла в культуре IX составляет 5 пг, а в культурах НЬ - 3,5 пг (рис. 10 а).

активных РЦ ФС2 (рис. 16 б).

Время от качала культивирования, сутки

Время от начала культивирования, сутки

Рис. 10. Изменения внутриклеточного содержания хлорофилла (а) и эффективного сечения поглощения молекулы хлорофилла в составе фотосинтетического аппарата (б) в процессе роста культуры клеток.

Соотнесение оптической плотности суспензии клеток (677 нм) к оптической плотности ацетонового экстракта (664 нм) позволяет оценить в разные моменты времени влияние на поглощение света плотной упаковки молекул хлорофилла в хлоропластах и клетках. Видно, что поглощение хлорофилла в составе интактных клеток на протяжении всего эксперимента остается ниже поглощения, которое дает то же количество хлорофилла в растворе (ОВд,сп/ООэкстр меньше 1, рис. 10 б). Более чем трехкратный "скачок" внутриклеточного содержания хлорофилла (рис. 10 а, 2-е сутки) сопровождается скачкообразным уменьшением вдвое отношения ОВ^ОЛ,,ижр (рис. 10 б, 2-е сутки). Возможно, значительный эффект упаковки обусловлен увеличением локальной концентрации хлорофилла в пределах отдельного хлоропласта. Впоследствии

хлоропласты начинают делиться, и их структура изменяется (Post, Dubinsky, 1985), в результате чего плотность упаковки хлорофилла уменьшается (дни 2 - 10, рис. 10 б).

Наряду с непрерывным изменением в культурах клеток общего содержания хлорофилла (рис. 9 б), в процессе культивирования изменяется также и общее содержание каротиноидов (рис. 11 а). Количество каротиноидов в клетке по отношению количеству хлорофилла определяли по параметру 01>«УOD66i (рис. 11 б). Его изменение во времени коррелирует с изменением относительной переменной флуоресценции (рис. 13 в). После пересадки культуры на свежую среду в клетках активируется процесс синтеза хлорофилла, скорость которого в течение первых 4-5 дней превышает скорость синтеза каротиноидов. При этом количество каротиноидов, отнесенное к содержанию хлорофилла, уменьшается, что видно по уменьшению параметра ODttJODw (дни 0-4, рис. 11 б).

При интенсивности освещения 40 мкмоль-м"2с"' фаза экспоненциального роста клеток длится не более 3-4 дней. Для всех культур данная фаза характеризуется минимальным соотношением каротиноиды/хлорофилл (рис. 116) и максимальным значением относительной переменной флуоресценции хлорофилла (рис. 13 в). Фаза экспоненциального роста культуры LL оказывается гораздо более длительной (выраженной) и с 4-го по 20-й день характеризуется пропорциональным синтезом хлорофилла и каротиноидов в клетках (LL с 4-го по 20-й день, рис. 11 б).

При исчерпании биогенов синтез хлорофилла прекращается раньше, чем останавливается синтез каротиноидов (HL V2 9-15 день, рис. 9 б и рис. 11 а). Синтез каротиноидов в культуре и в отдельно взятой клетке прекращается к тому моменту, когда количество хлорофилла уже начало убывать (HL С2 15-й день, рис. 9 б и рис. 11 а).

Время от начала культивирования, сутки

Время ог качала купьтиаироваммя, сутси

Рис. 11. Изменения в процессе роста: а - содержания каротиноидов в культуре; б - соотношения количества каротиноидов к количеству хлорофилла в клетках.

Спектры поглощения пигментов в экстракте в моменты максимального и минимального соотношения

каротиноиды/хлорофилл (N1- день 4 и день 23, рис. 11 б) значительно отличаются в области поглощения каротиноидов (400-500 нм, разностный спектр на рис. 12 а). В то же время, спектры возбуждения флуоресценции хлорофилла в клетках в моменты максимального и минимального соотношения каротиноиды/хлорофилл практически не отличаются друг от друга (рис. 12 б). Это говорит о том, что при голодании в культуре были накоплены каротиноиды, не выполняющие светособирающей функции. Параметры флуоресцениии хлорофилла Тк уу. Ниже приведены графики изменения /"■„ (рис. 13 а), Рп (рис. 13 б) и относительной переменной флуоресценции хлорофилла рис. 13 в), измеренные в культурах клеток. За счет синтеза пигментов, рост клеток сопровождается увеличением и Относительная переменная флуоресценция, значение которой в момент пересадки составляло 0,1, достигает к 4 суткам уровня 0,75.

i 0.Г

О -.-.-1-1

400 450 500 550 6СЮ Длина аолны аоэбужяатц'ГО смта, им

Рис. 12. Спектры поглощения экстрактов пигмеотов (а) и спектры возбуждения флуоресценции хлорофилла in vivo (б) при достаточном количестве биогенов (4-е сутки культивирования) и при их исчерпании (23-е сутки).

Во всех культурах, инкубированных при плотности потока квантов 40 мкмольм'2с"', происходит более быстрое восстановление фотосинтетической активности, чем в культуре, инкубированной при плотности потока квантов 5 мкмоль-м"г-с"' (1-е сутки, рис 13 в).

Для культур НЬ короткая фаза экспоненциального роста (2-6 день) характеризуется высоким значением /ч/Г«. После 6-го дня наблюдается спад и

замедление роста При достижении значения /•>?•'„, = 0,5 (9-11 сутки) рост прекращается (рис. 13 б). Культура IX, несмотря на сохраняющийся длительное время высокий уровень (2 - 20 день, рис. 13 в), в течение первых двух недель уступает по накопленному количеству пигментов (/"„) культуре НЬ С2. При высокой эффективности

культуры IX лимитирован низкой

Синтез хлорофилла в культуре обусловливает увеличение параметров и^яВ процессе роста. Чтобы определить в таких условиях интенсивность фото- и нефотохимического тушения, параметры и Рт были нормированы на величину поглощения света хлорофиллом в суспензии (рис. 14). После пересадки культуры происходит снижение удельной величины /%> в 2-2,5 раза (рис. 14 а). Удельное значение /*"„, увеличивается на 20-30% (рис. 14 6). В фазе голодания, сопровождающейся снижением Р^Рт^ удельные величины ^ и Гт возвращаются к исходным значениям. Падение удельной величины ^ (0-4 день, рис. 14 а) говорит о возрастании интенсивности фотохимического тушения.

В культурах водорослей были также измерены индукционные кривые флуоресценции после 4-х минутной темновой адаптации и определено характеристическое время фотохимической фазы Т/ (см. главу 4). В начале роста культуры (0-й день) это время является неопределенным, так как разница между и Р„ не превосходит 10%. В процессе дальнейшего культивирования эффект индукции флуоресценции и фаза О.Г становятся хорошо выраженными и сопровождаются сначала

первичных процессов фотосинтеза рост интенсивностью падающего света.

Врямя от начала культивирования, сутки

Время от начала «упьтнямроваиия, сутки

Рис. 14. Удельные по количеству поглощенного света параметры флуоресценции а - Г. б - Г„

увеличением времени фотохимической фазы (культуры 1на 4-е сутки, рис. 15 а), а затем снижением этого времени вдвое (культуры на 15-е сутки, рис. 15 а).

По интенсивности падающего света и характеристическому времени фотохимической фазы было определено сечение поглощения антенного комплекса, приходящегося на один РЦ. На 4-й день для всех культур оно составило 670 А2 На этапе голодания время

фотохимической фазы сокращается (рис. 15 а). Предположить, что в клетках при этом происходит наращивание размера

светособирающей антенны, трудно, учитывая тот факт, что общее количество хлорофилла убывает (рис. 13 б). Вероятно, ускоренный переход РЦ в закрытое состояние при голодании связан с уменьшением количества активных РЦ в фотосинтетических единицах, из-за чего световая нагрузка на открытые РЦ возрастает. Аналогичная картина была получена ранее, когда часть РЦ была закрыта перед измерением кривой индукции при помощи постоянной подсветки (25°С, 0-15 мкмоль-м"2-с"', рис. 8).

Изменения длительности быстрой компоненты затухания флуоресценции во время культивирования представлены на рис. 15 б. В момент пересадки клеток эта длительность составляла 1300 пс. Ее минимальное значение (470 пс) достигается на 4-й день, что соответствует минимальному удельному значению и максимальному уровню у = F/Fm. На поздних стадиях роста (после 6-го дня, рис. 13 в), длительность быстрой компоненты возрастает до 1300 пс (рис. 15 б).

Для оценки общего количества активных РЦ ФС2 в суспензии клеток была измерена интенсивность ЗФ хлорофилла. Культивирование водорослей сопровождается увеличением числа активных центров на стадии экспоненциального роста и его быстрым уменьшением при голодании (рис. 16 а). Количество активных РЦ в пересчете на поглощение хлорофилла в суспензии клеток (рис. 16 б) достигает максимального значения

, 120 * 100 1 | во .....-........

Нео & 40 X о. 1 20 а 0 УЪ^ь -Н1112 -4-Н1Р- --.ню а

0 5 10 15 20 25 30 Время от начала культивирования, сутки

с 1500 /

Ц1™0' 11 и/

IIм 1 б

0 в 10 15 30 Врамк от начала культмаироааннн, сутки Рис. 15. Изменения длительности: а - фотохимической фазы кривой индукции; б - первой компоненты кривой затухания флуоресценции хлорофилла.

на 4 - 6 день культивирования, а затем снижается. Уменьшение удельного количества РЦ происходит за счет многократного уменьшения общего количества активных РЦ в

культуре (рис. 16 а) при слабо меняющемся общем содержании хлорофилла (рис. 13 б). Такая же картина была получена Чемерисом на зеленой водоросли Chlorella. В случае с хлореллой, причиной снижения фотохимического тушения в ФСЕ и роста удельной величины F„ является хлородыхание, которое обеспечивает восстановление пула пластохинонов и хинонов, входящих в состав ФС2, в темноте. Можно предположить, что при голодании ГА. w. активируются аналогичные процессы регуляции, в результате которых интенсивность фотохимического тушения уменьшается.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Как показала многолетняя практика, для исследования ФСА фитопланктона и экологического состояния природных вод наиболее перспективным является использование флуоресцентного метода. В настоящее время основными характеристиками, описывающими состояние ФСА водорослей, являются интенсивность флуоресценции хлорофилла при открытых РЦ (УД соответствующая обилию фитопланктона, и потенциальная эффективность первичных процессов фотосинтеза, измеряемая как отношение - /у)/Однако этими стационарными характеристиками не исчерпываются возможности флуоресцентного метода. Измерения кинетических кривых индукции флуоресценции хлорофилла позволяют получать дополнительную информацию о состоянии ФСА водорослей. Проведенные на культуре морских диатомовых водорослей исследования показали, что для корректного измерения флуоресценции на всем протяжении роста культур клеток необходимо обеспечить регистрацию флуоресценции при оптической плотности ниже 0,05.

В работе показана связь между состоянием ФСА водорослей, выращиваемых при разных условиях облучения, минерального питания и температуры, с параметрами кривой

воЕзо s = 5"

Sil

5 г *

H|« 118

Время от начала культивирования, сутки

б

Вр*мя от начала культивирования, сутки

Рис. 16. Изменение количества активных РЦ: а - в единице объема культуры; б - по отношению к поглощению хлорофилла.

индукции флуоресценции хлорофилла. Представление кривой индукции флуоресценции хлорофилла водорослей в виде суммы экспонент при использовании простого алгоритма позволяет определить абсолютное значение эффективного сечения поглощения фотосинтетических пигментов, приходящихся на один РЦ ФС2, и скорость переноса электрона с 0," на Оь. Эти закономерности, полученные на культуре водорослей, могут быть распространены и на природные фитопланктонные сообщества.

Важные особенности работы ФСА могут быть выявлены в условиях освещения объекта постоянным светом, который приводит к уменьшению доли открытых РЦ. Постоянно действующий свет изменяет параметры кривой индукции флуоресценции. Это позволяет определить зависимость величины нефотохимического тушения возбужденных состояний хлорофилла от интенсивности света и измерить скорость линейного электронного транспорта при заданной интенсивности облучения.

Зависимости скорости электронного транспорта (рис. 7) и степени нефотохимического тушения (рис. 6) от интенсивности постоянного света существенно изменяются при снижении температуры с 25'С до 6"С. Однако, торможение электронного транспорта в этом случае не приводит к уменьшению нефотохимического тушения, что говорит о сохранении высокого протонного градиента на тилакоидной мембране и дает основание предполагать значительное ингибирование АТФ-азного комплекса при снижении температуры.

В условиях постоянного освещения, интенсивность которого недостаточна для развития нефотохимического тушения (25 °С, 0-15 мкмоль-м"2-с"', рис.8), характеристическое время фотохимической фазы кривой индукции уменьшается (25'С, О-15 мкмоль-м"2-с"', рис.6). Это может происходить только при увеличении потока возбуждения к открытым РЦ. Такое явление может быть обусловлено тем, что один антенный комплекс обслуживает несколько РЦ.

Количество активных РЦ ФС2 в составе ФСЕ может изменяться в зависимости от внешних условий. Поэтому на поздней стадии роста культуры клеток, когда количество активных РЦ в пересчете на содержание хлорофилла уменьшается (НЦ дни 4-20, рис. 16 б), фотохимическая фаза кривой индукции характеризуется меньшей продолжительностью, чем на стадии экспоненциального роста.

Проведение комплекса биофизических исследований позволило выяснить некоторые физиологические закономерности развития культуры диатомовых водорослей в изменяющихся условиях среды и обнаружить их влияние на первичные процессы фотосинтеза. После пересадки клеток из среды, в которой запас биогенов исчерпан (/^/¥"т = 0,1), на свежую питательную среду, в объекте в несколько раз увеличивается

количество активных РЦ (рис. 16 б). Рост относительной переменной флуоресценции в эти дни (рис. 13 в) связан с тем, что в объекте возрастает интенсивность фотохимического тушения, что видно по снижению удельной величины Р„ (рис. 14 а). Это коррелирует с уменьшением времени жизни возбужденного состояния хлорофилла (с 0 по 2 день, рис. 15 б). При удалении биогенных элементов из среды культура водорослей переходит из стадии экспоненциального роста в стационарную фазу. Количество активных РЦ по отношению к содержанию хлорофилла в этот период уменьшается, что влечет за собой снижение интенсивности фотохимического тушения и коррелирует с увеличением времени жизни возбужденного состояния (НЬ, дни 2-17, рис. 15 6). Рост удельной величины (НЬ, дни 4 - 23, рис. 14 а) возможно также связан с хлородыханием, которое активируется при недостатке минерального питания и повышенных интенсивностях света (Веппоип, 2001). Как известно, при этом в темноте часть РЦ переходит в закрытое состояние за счет восстановления пула пластохинона, что вызывает увеличение интенсивности рекомбинационного свечения и увеличение Р0 (2а§!с1иШп, 2006; СЬетепз, 2004).

Как видно из рис. 9, более интенсивное освещение при достаточном минеральном питании обеспечивает более быстрый рост клеток в начальный период (культуры НЬ и IX до 9-го дня культивирования). Однако при исчерпании биогенов интенсивное освещение становится для клеток негативным фактором, приводящим не только к снижению содержания хлорофилла в культуре (НЬ, дни 9 - 23, рис. 9 б), но и к дополнительному синтезу каротиноидов, которые поглощают световую энергию, но не передают ее на хлорофилл (рис. 12) и играют защитную роль. Интенсивное освещение обеспечивает более быстрый начальный рост клеток при появлении биогенных элементов и может способствовать завоеванию определенной экологической ниши в природных условиях. Однако более медленный рост на слабом свету (в более глубоких слоях водной толщи) позволяет более полно использовать те же ресурсы минерального питания на синтез биомассы.

выводы

1. Создан метод измерения кривых индукции ФХ с начальным временным разрешением 0,75 мкс в диапазоне интенсивностей возбуждающего света 200- 12000 мкмоль'м"2-с_| (Атах= 455 нм). Измеренные индукционные кривые Ткаккхшга на восходящем участке с высокой точностью описываются суммой 3-х экспоненциальных компонент.

2. Показано, что характеристическое время фотохимической фазы, самой короткой компоненты кривой индукции флуоресценции, обратно пропорционально интенсивности возбуждающего света. Этот результат позволил определить абсолютное значение эффективного сечения поглощения фотосинтетических пигментов, приходящихся на один РЦ ФС2 (700А2 для X = 455 нм).

3. На поздних стадиях роста культуры происходит уменьшение доли открытых РЦ. В этих условиях в ФСЕ происходит перераспределение поглощенной энергии и ее направление к открытым РЦ. Вследствие этого характеристическое время фотохимической фазы кривой индукции флуоресценции уменьшается в 1,7 -2 раза.

4. При снижении температуры с 25'С до 6'С в клетках усиливаются процессы нефотохимического тушения возбужденных состояний хлорофилла в ответ на постоянное облучение.

5. Уменьшение вероятности разделения зарядов в ФС2 при интенсивном нефотохимическом тушении приводит к удлинению фотохимической фазы кривой индукции флуоресценции в 1,5-2 раза.

6. В процессе исчерпания биогенных элементов в культуре свет с интенсивностью 40 мкмоль-м"2-с"' становится для фотосинтетического аппарата избыточным, что приводит к замедлению роста клеток. Уменьшение максимального фотохимического выхода ФС2, наблюдаемое в этих условиях, связано с инактивацией РЦ в фотосинтетических единицах и происходит за счет роста удельной величины Р0 при относительно небольшом изменении удельной величины Рт. Эти процессы также сопровождаются накоплением в клетках каротиноидов, которые не передают поглощенную энергию на РЦ и, очевидно, играют защитную роль.

Список публикаций по теме диссертации

1. Конюхов И.В.. Кузнецова Н.И., Азизбекян P.P., ПогосянС.И. Мониторинг микроводорослей и цианобактерий и ограничение их численности биологическими средствами // Перспективы развития инноваций в биологии: материалы II Научно-практической конференции в рамках Третьего Фестиваля науки в городе Москве и Биотехнологической выставки-ярмарки «РосБиоТех-2008». Москва: Изд-во НП «Инноватика», 2008, с. 54-57.

2. И.В. Конюхов. С.И. Погосян, О.В.Яковлева, А.Б. Рубин, E.H. Ефременко, О.В. Сенько, A.B. Холстов Разработка биосенсорного метода и создание измерительного комплекса для биоиндикации природных вод // Сборник тезисов итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы». Москва, 2008, с. 103-104.

3. Н.И. Кузнецова, P.P. Азизбекян, И.В. Конюхов. С.И. Погосян, А.Б. Рубин Подавление процессов фотосинтеза цианобактерий и планктонных водорослей метаболитами бактерий Brevibacillus laterosporus // Доклады Академии Наук, т. 421, № 2,2008, с. 262-266.

4. Осипов В.А., Конюхов И.В.. Маторин Д.Н., Погосян С.И. Современные методы флуоресцентного зондирования морского фитопланктона // Современные методы альгологии: Материалы международной научной конференции и VII школы по морской биологии. Ростов-на-Дону: Изд-во ЮНЦ РАН, 2008, с. 267-269.

5. С.И. Погосян, C.B. Гальчук, Ю.В. Казимирко, И.В. Конюхов. А.Б. Рубин Применение флуориметра «МЕГА-25» для определения количества фитопланктона и оценки состояния его фотосинтетического аппарата // Вода: Химия и экология, №6,2009, с. 34-40.

6. А.Б. Рубин, С.И. Погосян, Д.Н. Маторин, И.В. Конюхов. Ю.В. Казимирко, A.A. Волгушева Разработка технологии оптического мониторинга микроводорослей и создание автономного измерительного комплекса для биоиндикации природных вод // Сборник тезисов итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы». Москва, 2007, с. 96.

Подписано в печать 09.09.09 Формат 60x88 1/16. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 820 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Конюхов, Иван Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структурная организация и функционирование фотосинтетического аппарата.

1.2. Световая регуляция первичных процессов фотосинтеза.

1.3. Параметры флуоресценции хлорофилла как показатель эффективности работы фотосинтетического аппарата растений.

1.4. Оптические методы исследования природного фитопланктона

1.4.1. Измерение параметров флуоресценции хлорофилла водорослей.

1.4.2. Влияние спектральных характеристик источника возбуждения и детектора флуоресценции на экспериментально определяемые параметры флуоресценции хлорофилла.

1.4.3. Спектроскопия поглощения клеток водорослей.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объект исследования.

2.2. Специализированное оборудование, созданное на кафедре биофизики биологического ф-та МГУ

2.2.1. Спектрофотометр.

2.2.2. Флуориметр для регистрации индукционной кривой флуоресценции с микросекундным временным разрешением.

2.2.3. Фосфороскоп.

2.2.4. Установка для измерений спектров испускания флуоресценции.

2.2.5.Флуориметр субнаносекундного временного разрешения.

2.3. Проведение измерений в процессе роста культур клеток.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Спектры испускания флуоресценции хлорофилла при разном состоянии реакционных центров ФС2.

3.2. Выбор оптической плотности образца для измерений параметров флуоресценции.

3.3. Способ измерения фотохимического выхода ФС2 по кривой индукции флуоресценции.

3.4. Индукционные кривые флуоресценции хлорофилла суспензий клеток Th. weissflogii, адаптированных к темноте.

3.5. Параметры флуоресценции хлорофилла Th. weissflogii при разных температурах.

3.6. Изменение функциональных характеристик фотосинтетического аппарата Th. weissflogii в процессе роста клеток в накопительной культуре

3.6.1. Общая характеристика роста клеток Tit. weissflogii и изменений их пигментного аппарата в накопительной культуре.

3.6.2. Изменение в процессе роста параметров флуоресценции хлорофилла Th. weissflogii.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изменение параметров флуоресценции диатомовой водоросли Thalassiosira weissflogii в процессе роста при разных условиях облучения и минерального питания"

Регистрация флуоресценции хлорофилла является современным и перспективным методом для анализа состояния природного фитопланктона. Варьируя характер светового воздействия на фотосинтетический аппарат водорослей, можно измерять разные параметры флуоресценции - в частности флуоресценцию при открытых (F0) и закрытых (Fm) реакционных центрах (РЦ) фотосистемы 2 (ФС2) и величину нефотохимического тушения возбужденных состояний хлорофилла (NPQ). Преимущество таких измерений состоит в том, что они одновременно дают информацию о количестве фитопланктона и об эффективности преобразования световой энергии в поток электронов, создаваемой ФС2 ((р = (Fm - F0)fFm). Убедительно показано, что эффективность функционирования фотосинтетического аппарата, а вместе с ней и параметры флуоресценции хлорофилла, существенно изменяются в различных условиях (Погосян, 2003; Graziano, 1996; Parkhill, 2001; De La Rocha, 2004). Основные закономерности изменений параметров флуоресценции хлорофилла, полученные на культурах водорослей, были успешно использованы для интерпретации результатов обследования природных сообществ фитопланктоиа (Погосян с соавт., 2002).

В природной среде наиболее важными факторами существования для фитопланктона являются свет и обеспеченность биогенными элементами. В условиях дефицита минерального питания происходит снижение эффективности фотосинтеза. Недостаток фосфора снижает максимальную скорость работы АТФ-синтетазного комплекса (Sivalc, 1986), недостаток азота замедляет ресинтез белка D1 ФС2 и других белков (Shelly, 2002). При голодании по сере или азоту на фотосинтетической мембране хлоропластов активируется процесс утилизации ассимилированной углекислоты - хлородыхание (Quiles, 2006; Чемерис, 2004).

Как правило, в природе фитопланктон существует в условиях дефицита биогенных элементов, и концентрация биогена, появившегося в среде, в течение нескольких дней уменьшается до предельно низкого уровня (Левич, 1997). Такие природные процессы удобно изучать в модельных экспериментах с накопительной культурой водорослей. В этих условиях, в процессе прохождения культурой различных фаз роста, в фотосинтетическом аппарате клеток происходит ряд функциональных изменений, следствием которых является изменение параметров флуоресценции хлорофилла (Lippemeier, 2001; Нои, 2007).

В проведенных ранее работах, направленных на определение параметров флуоресценции в процессе роста культур водорослей (Shelly, 2002; Young, 2003; Nebal et al, 2008), внимание исследователей было сосредоточено в основном на определении относительной переменной флуоресценции (Fm - F0)/Fm. В настоящее время создана принципиально новая измерительная техника, которая существенно расширила диапазон применения флуоресцентного метода. Высокое временное разрешение, чувствительность и возможность автоматического измерения большего числа параметров флуоресценции без специальной подготовки проб воды позволяет более полно охарактеризовать состояние фотосинтетического аппарата микроводорослей в природной среде.

Таким образом, на новом методическом уровне стало возможным изучить связь между состоянием ФСА и широким кругом параметров флуоресценции хлорофилла культур водорослей при разных условиях освещения и минерального питания.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Конюхов, Иван Владимирович

выводы

1. Создан метод измерения кривых индукции ФХ Thalassiosira weissflogii с начальным временным разрешением 0,75 мкс в диапазоне интенсивностей возбуждающего света 200 - 12000 мкмоль-м^-с"1 (А^а* = 455 нм). Измеренные индукционные кривые на восходящем участке с высокой точностью описываются суммой 3-х экспоненциальных компонент.

2. Показано, что характеристическое время фотохимической фазы, самой короткой компоненты кривой индукции флуоресценции, обратно пропорционально интенсивности возбуждающего света. Этот результат позволил определить абсолютное значение эффективного сечения поглощения фотосинтетических пигментов, приходящихся на один РЦ ФС2 (700А2 для 1 = 455 нм).

3. На поздних стадиях роста культуры происходит уменьшение доли открытых РЦ. В этих условиях в ФСЕ происходит перераспределение поглощенной энергии и ее направление к открытым РЦ. Вследствие этого характеристическое время фотохимической фазы кривой индукции флуоресценции уменьшается в 1,7-2 раза.

4. При снижении температуры с 25°С до 6°С в клетках усиливаются процессы нефотохимического тушения возбужденных состояний хлорофилла в ответ на постоянное облучение.

5. Уменьшение вероятности разделения зарядов в ФС2 при интенсивном нефотохимическом тушении приводит к удлинению фотохимической фазы кривой индукции флуоресценции в 1,5-2 раза.

6. В процессе исчерпания биогенных элементов в культуре свет с интенсивностью

2 1

40 мкмоль-м" -с" становится для фотосинтетического аппарата избыточным, что приводит к замедлению роста клеток. Уменьшение максимального фотохимического выхода ФС2, наблюдаемое в этих условиях, связано с инактивацией РЦ в фотосинтетических единицах и происходит за счет роста удельной величины Fa при относительно небольшом изменении удельной величины Fm. Эти процессы также сопровождаются накоплением в клетках каротиноидов, которые не передают поглощенную энергию на РЦ и, очевидно, играют защитную роль.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Конюхов И.В., Кузнецова Н.И., Азизбекян P.P., Погосян С.И. Мониторинг микроводорослей и цианобактерий и ограничение их численности биологическими средствами. II Перспективы развития инноваций в биологии: материалы II Научно-практической конференции в рамках Третьего Фестиваля науки в городе Москве и Биотехнологической выставки-ярмарки «РосБиоТех-2008». Москва: Изд-во НП «Инноватика», 2008, с. 54-57.

2. И.В. Конюхов, С.И. Погосян, О.В.Яковлева, А.Б. Рубин, Е.Н. Ефременко, О.В. Сенько, А.В. Холстов Разработка биосенсорного метода и создание измерительного комплекса для биоиндикации природных вод. II Сборник тезисов итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы». Москва, 2008, с. 103-104.

3. Н.И.Кузнецова, P.P. Азизбекян, И.В. Конюхов, С.И. Погосян, А.Б. Рубин Подавление процессов фотосинтеза цианобактерий и планктонных водорослей метаболитами бактерий Brevibacillus lalerosporus. II Доклады Академии Наук, т. 421, № 2, 2008, с. 262-266.

4. Осипов В.А., Конюхов И.В., Маторин Д.Н., Погосян С.И. Современные методы флуоресцентного зондирования морского фитопланктона. II Современные методы альгологии: Материалы международной научной конференции и VII школы по морской биологии. Ростов-на-Дону: Изд-во ЮНЦ РАН, 2008, с. 267-269.

5. С.И. Погосян, С.В. Гальчук, Ю.В. Казимирко, И.В. Конюхов, А.Б. Рубин Применение флуориметра «МЕГА-25» для определения количества фитопланктона и оценки состояния его фотосинтетического аппарата. II Вода: Химия и экология, №6, 2009, с. 34-40.

6. А.Б. Рубин, С.И. Погосян, Д.Н. Маторин, И.В. Конюхов, Ю.В. Казимирко, А.А. Волгушева Разработка технологии оптического мониторинга микроводорослей и создание автономного измерительного комплекса для биоиндикации природных вод. II Сборник тезисов итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы». Москва, 2007, с. 96.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Конюхов, Иван Владимирович, Москва

1. Бухов Н. Г. Динамическая световая регуляция фотосинтеза. II Физиология растений, Т. 51, № 6, 2004, стр. 825-837.

2. Говинджи. Фотосинтез. //М.: Мир, 1987.

3. ГОСТ 17.1.4.02-90 Вода. Методика спектрофотометрического определения хлорофилла а. II Институт океанологии АН СССР; Гидрохимический институт Госкомгидромета СССР, 1992.

4. Н.В. Карапетян. Нефотохимическое тушение у цианобактерий. II Биохимия, 2007, том 72, вып. 10, с. 1385 1395.

5. Клейтон Р. Фотосинтез. Физические механизмы и химические модели. И М.: Мир, 1984, 350 с.

6. Климов В.В. Окисление воды и выделение молекулярного кислорода при фотосинтезе. II Соросовский образовательный журнал, № 11, 1996, с. 9 12.

7. Кукушкин А. К., Тихонов А.Н. Лекции по биофизике фотосинтеза. И М.: МГУ, 1988, 320 с.

8. А.П. Левич, В.Н. Максимов, Н.Г. Булгаков. Теоретическая и экспериментальная экология фитопланктона. Управление структурой и функциями сообществ. II Учеб. пособие. М.:Изд-во НИЛ, 1997, 184 е.: ил.

9. Погосян С.И. Состояние растительных организмов в природных условиях и окислительное повреждение фотосинтетического аппарата. II автореферат докторской диссертации, М. 2003, 56 стр.

10. Рубин А.Б. Биофизика. Т.2. // М.: Книжный дом «Университет», 2000, 468 с.

11. Рубин А.Б., Кренделева Т.Е. Регуляция первичных процессов фотосинтеза. П Биофизика. Т. 49. вып. 2, 2004, стр. 239 253.

12. Тихонов А.Н. Молекулярные преобразователи энергии в живой клетке. П Соросовский образовательный журнал, №7, 1997, стр. 10 — 17.

13. Тихонов А.Н. Регуляция световых и темновых стадий фотосинтеза. II Соросовский образовательный журнал. №11, 1999, стр. 8 15.

14. Чемерис Ю.К., Шендерова Л. В., Венедиктов П.С., Рубин А.Б. Активация хлорогишстного дыхания увеличивает выход флуоресценции хлорофилла у Chlorella, адаптированной к темноте при повышенной температуре. II Изв. АН СССР, сер. биол., 2004, №1, с.82-90.

15. Шубравый О.И. Аквариум с искусственной морской водой для содерэ/сания и разведения примитивного многоклеточного организма Trichoplax и других мелких беспозвоночных. II Зоол. Жури. 1983, Т. 62, С. 619-621.

16. AdirN., ZerH., Shochat S., Ohadl. Photoinhibition a historical perspective. 11 Photosynthesis. Research 76: 343-370, 2003.

17. John F. Allen. State Transitions a Question of Balance. II Science, Vol.299, 1530-1532, 2003.

18. Antal Т.К., Rubin A.B. In vivo analysis of chlorophyll a fluorescence induction. II Photosynthesis Research V. 96, №3, 2008.

19. W. Becker, A. Bergmann, G. Biscotti. Recording the Kautsky Effect by Fluorescence Lifetime Detection. II Becker & Hickl GmbH, www.becker-hickl.com.

20. Pierre Bennoun. Chlororespiration and the process of carotenoid biosynthesis. II Biochimica et Biophysica Acta 1506 (2001) 133-142.

21. C. Bushmann. Photochemical and non-photochemical quenching coefficients of the chlorophyll fluorescence: comparison of variation limits. II Photosynthetica 37(2): 217-224, 1999.

22. Catharina Casper-Lindley and Olle Bjorkman. Non-photochemical quenching in four unicellular algae with different light harvesting and xanthophylls-cycle pigments. //Photosynthesis: Mechanisms and Effects, Vol. Ill, 2281-2284, 1998.

23. Donald J. Collins, Dale A. Kiefer, Jance B. SooHoo and I. Stuart McDermid. The role of reabsorption in the spectral distribution of phytoplankton fluorescence emission. II Deep-Sea Research. Vol. 32, No. 8, pp. 983 to 1003, 1985.

24. Crofts A., Yerkes C.T. Molecular Mechanism for qE-quenching. II FEBS Lett. 1994. V.352. P.265-270.

25. DeCoster В., Christensen R.I., Gebhard R., Lugtenburg J., Farhoosh R., Frank H.A. Low lying electronic states of carotenoids. II Biochim. Biophys. Acta. 1992. V. 1102. P.107-119.

26. Christina L. De La Rocha, Uta Passow. Recovery of Thalassiosira weissflogii from nitrogen and silicon starvation. Limnol. Oceanogr., 49(1), 2004, 245-255, 2004.

27. Dijkman N.A., Kroon B.M. Indications for chlororespiration in relation to light regime in the marine diatom Thalassiosira weissflogii. II J. Photochem. Photobiol. В., 66(3), pp. 79-87, 2002.

28. Elstner E.F., Osswald W. Mechanisms of Oxygen Activation during Plant Stress II Oxygen and Environmental Stress in Plants / Eds. Watling R., Allen J.A. Edinburgh: Royal Society of Edinburgh, 1994. V. 102. P. 131-154.

29. Falkowslci P.G. and Z. Kolber. Phytoplankton photosynthesis in the Atlantic Ocean as measured from a submersible pump and probe fluorometer in situ. II Current research in photosynthesis, V. 4, pp. 923-926, 1990.

30. David C. Fork, Stephen K. Herbert, and Shmuel Malkin. Light Energy Distribution in The Brown Alga Macrocystis pyrifera (Giant Kelp). II Plant Physiol. (1991)95, 731-739.

31. Fabrice Franck, Philippe Juneau, Radovan Popovic. Resolution of the Photosystem I and Photosystem II contributions to chlorophyll fluorescence of intact leaves at room temperature. //Biochimica et Biophysica Acta 1556 (2002), 239-246.

32. Frank H.A., Cua A., Chynwat V., Young A., Gosztola D., Wasielewski M.R. Photophysics of the carotenoids associated with the xanthophylls cycle in photosynthesis. //Photosynth.Res., 1994. V.41, pp.389-395.

33. D. Gazdrau. Characterization of the fluorescence quenching of chlorophyll a by 1,4-benzoquinone using the nonlinear analysis. II Journal of Optoelectronics and Advanced Materials, Vol. 3, No. 1, March 2001, p. 145-148.

34. Gilmore A.M. Mechanistic aspects of xanthophylls cycle dependent photoprotection in higher plant chloroplasts and leaves. II Physiol. Plant., 1997. V. 99. pp. 197-209.

35. Guillard, R.R.L. and J.H. Ryther. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt and Detonula confervacea Cleve. I I Can. J. Microbiol. 8: 229-239, 1962.

36. Hader D.-P, Lebert M, Sinha R.P., Barbieri E.S., Helbling E.W. Role of Protective and Repair Mechanisms in the Inhibition of Photosynthesis in Marine Macroalgae. //Photochem. and Photobiol. Sci. 2002. V. 10(1), pp.809-814.

37. Hideg E., Murata N. The Irreversible Photoinhibition of the Photosystem II Complex in Leaves ofVicia faba under Strong Light. I I Plant Sci. 1997. V. 130. P. 151-158.

38. M. Hodges & I. Moya. Time-resolved chlorophyll fluorescence studies on photosynthetic mutants of Chlamydomonas reinhardtii: origin of the kinetic decay components. //Photosynthesys Research 13: 125-141 (1987).

39. Horton P., Ruban A.V., Walter R.G. Regulation of light harvesting in green plants. II Annu. Rev. Plant Mol. Biol. 1996. V. 47. pp. 655-684.

40. Horton P., Ruban A.V., Rees D., Pascal A.A., Noctor G., Young A.J. Control of the light-harvesting function of chloroplast membranes by aggregation of the LHCIIchlorophyll-protein complex. //FEBS Lett. 1991. V.292. P.1-4.

41. Jian-Jun Hou, Bang-Qin Huang, Zhen-Rui Cao, Ji-Xin Chen and Hua-Sheng Hong. Effects of Nutrient Limitation on Pigments in Thalassiosira weissfligii and Prorocentrum donghaiense. II Journal of Integrative Plant Biology 2007, 49 (5): 686-697.

42. Geir Johnsen, Barbara B. Prezelin, and Raffael V. M. Jovine. Fluorescence excitation spectra and light utilization in two red tide dinoflagellates. II Limnol. Oceanogr., 42 (5, part 2), 1997, 1166-1177.

43. Kautsky H. and Hirsch A. Neue Versuche zur Kohlenstoffassimilation. II Naturwissenschafiten, 1931, vol. 19, p. 969.

44. Krause, G.H. and Weis, E. Chlorophyll Fluorescence as a Tool in Plant Physiology: 11. Intrpretation of Fluorescence Signals. II Photosynth. Res., 1984, vol. 5, p. 139-157.

45. Marcel Kuntz. Plastid terminal oxidase and its biologocal significance. I I Planta (2004)218: 896-899.

46. Jens Kurreck, Rene Schodel & Gemot Renger. Investigation of the plastoquinone pool size and fluorescence quenching in thylakoid membranes and Photosystem И (PSII) membrane fragments. II Photosynthesis Research 63: 171-182, 2000.

47. Dusan Lazar. The poly phasic chlorophyll a fluorescence rise measured under high intensity of exciting light. // Functional Plant Biology, 2006, 33, 9-30.

48. Xiao-Ping Li, Olle Bjorkman, Connie Shih, Arthur R. Grossman, Magnus Rosenquist, Stefan Jansson & Kristina K. Niyogi. A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting. II Nature, vol. 403, 2000.

49. Lichtenthaler H.K. Applications of Chlorophyll Fluorescence in Photosynthesis Research. II Stress Physiology, Hydrobiology, and Remote Sensing, Dordrecht: Kluwer, 1988.

50. Lohr M., Wilhelm C. Pigment Synthesis and Xanthophyll Cycle in Diatoms under High Light Stress and during Low Light Recovery. И Photosynthesis: Mechanisms and Effects /Ed. Garab G. Netherlands: Kluwer Academic Publishers, 1998. Vol. 3. P.2313-2316.

51. Robert Lucinski and Grzegorz Jackowski. The structure, functions and degradation of pigment-binding proteins of photosystem II. // Acta Biochimica Polonica, Vol. 53, No. 4/2006, 693-708.

52. Vivian A. Lutz, Shubha Sathyendranath, Erica J. H. Head and William K. W. Li. Differences between in vivo absorption and fluorescence excitation spectra in natural samples of phytoplankton. II J. Phycol. 43, 214-227 (1998).

53. Mahalingam R., FedoroffN. Stress response, cell death and signaling: the many faces of reactive oxygen species. II Physiol. Plantarum. 2003. V.l 19 (1). pp. 56-68.

54. Patricia Muller, Xiao-Ping Li, and Krishna K. Niyogi. Non-Photochemical Quenching. A response to Excess Light Energy. I I Plant Physiology (2001), Vol. 125, pp. 1558-1566.

55. K. Razi Naqvi, M. N. Merzlyak and Т. B. Merlo. Absorption and scattering of light by suspensions of cells and subcellular particles: an analysis in terms of Kramers-Kronigrelations. //Photochem. Photobiol. Sci., 2004, 3, 132-137.

56. Peter J. Nixon. Chlororespiration. II Phil. Trans. R. Soc. Lond. В (2000) 355, 1541-1547.

57. Jean-Paul Parkhill, Gary Maillet, and John J. Cullen. Fluorescence-based maximal quantum yield for PSII as a diagnostic of nutrient stress. II J. Phycol. 37, 517-529 (2001).

58. PolleJ., Melis A. Recovery of photosynthetic apparatus from photoingibition during dark incubation of the Green alga Dunaliella salina. II Photosynthetis: Mechanisms and Effects. Ed. Garab G. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ. 1998, vol 3 p.2261-2264.

59. F. Post, Z. Dubinsky, K. Wyman and P. G. Falkowsky. Kinetics of light-intensity adaptation in a marineplanktonic diatom. II Marine Biology 83, 231-238 (1984).

60. Maria Jose Quiles. Stimulation of chlororespiration by heat and high light intensity in oat plants. //Plant, Cell and Environment (2006) 29, 1463-1470.

61. Alexander V. Ruban, Johann Lavaud, Bernard Rousseau, Gerard Guglielmi, Peter Horton & Anne-Lise Etienne. The super-excess energy dissipation in diatom algae: comparative analysis with higher plants. II Photosynthesis Research 82: 165-175, 2004.

62. Schreiber U., Vidayer W., Runeckles V.C., and Rosen P., Chlorophyll Fluorescence Assay of Ozone Injury in Intact Plants. 11 Plant Physiol., 1978, vol. 61, p. 80-84.

63. Kirsten Shelly, Philip Heraud, and John Beardall. Nitrogen limitation in Dunaliella tertiolecta (Chlorophyta) leads to increased susceptibility to damage by ultraviolet radiation but also increased repair capacity. I I J. Phycol. 38, 713720 (2002).

64. Mirita N. Sivak and David A. Walker. Photosynthesis in vivo can be limited by phosphate supply. //NewPhytol. (1986) 102, 499-512.

65. Dariusz Stramski, Antonie Sciandra and Herve Cleustre. Effects of temperature, nitrogen, and light limitation on the optical properties of the marine diatom Thalassiosirapseudonana. II Limnol. Oceanogr. 47(2), 2002, 392-403.

66. Reto J. Strasser, Merope Tsimilli-Michael, Alaka Srivastava. Chlorophyll a Fluorescence Transient. II George C. Papageorgiou and Govindjee (eds): Chlorophyll Fluorescence: A Signature of Photosynthesis. 2004.

67. M. Stroch, J. Podolinska, M. Navratil, and V. Spunda. Effects of different excitation and detection spectral regions on room temperature chlorophyll a fluorescence parameters. II Photosynthetica 43(3): 411-416, 2005.

68. Hiroko Takahashi, Masakazu Iwai, Yuichiro Takahashi, and Jun Minagawa. Identification of the mobile light-harvesting complex II polypeptides for state transitions in Chlamydomonas reinhardtii. I I PNAS, vol. 103 (2006), no. 2, 477

69. Claire S. Ting and Thomas G. Owens. Photochemical and Nonphotochemical Fluorescence Quenching Processes in the Diatom Phaeodactylum tricornutum. II Plant Physiol. (1993) 101:1323-1330.

70. Rikiya Watanabe, Ryota lino, Katsuya Shimabukuro, Vasasuke Yoshida, Hiroyuki Noji. Temperature-sensitive reaction intermediate of FrATPase. // EMBO reports, Vol. 9, №1, 2008.

71. Erica B. Young and John Beardall. Rapid ammonium- and nitrate-induced perturbations to Chi a fluorescence in nitrogen-stressed Dunaliella tertiolecta (Chlorophyta). II J. Phycol. 39, 332-342 (2003).

72. Erica B. Young and John Beardall. Photo synthetic function in Dunaliella tertiolecta (Chlorophyta) during a nitrogen starvation and recovery cycle. II J. Phycol. 39, 897-905 (2003).