Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменения параметров флуоресценции хлорофилла диатомовой водоросли Thallasiosira weisflogii при фотоадаптации и фотоповреждении

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изменения параметров флуоресценции хлорофилла диатомовой водоросли Thallasiosira weisflogii при фотоадаптации и фотоповреждении"

На правах рукописи

ВОРОНОВА ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА

Изменения параметров флуоресценции хлорофилла диатомовой водоросли 7Аа//ау/о«>а н>е1$/1оци при фотоадашации и фотоповреждении.

03 00 02 биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена на кафедре биофизики Биологического факультета Московского Государственного Университета имени М В Ломоносова

Научные руководители

Доктор биологических наук, профессор С И Погосян Доктор биологических наук, чл -корр РАН, профессор А Б Рубин

Официальные оппоненты

Доктор физико-математических наук, профессор В В Фадеев

Доктор биологических наук Н Г Бухов

Ведущая организация Институт Океанологии им П П Ширшова РАН

Защита состоится » /£C(£t'L*î 2005 года в

часов на заседании

Диссертационного Совета Д 501 001 96 при Московском Государственном Университете имени MB Ломоносова по адресу 119992, ГСП-2 Москва, Ленинские юры, МГУ, Биологический факультет, кафедра биофизики, новая аудитория

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологическою факультета МГУ

Автореферат разослан «

№

» AupCiUÎ- 2005 года Ученый секретарь Диссертационного совета /

доктор биологических наук, профессор ' Е Кренделева

amm

Общая характеристика работы

Актуальность. Фитопланктон составляет основу первичной продукции мирового океана Главными экологическими факторами, влияющими на физиологическое состояние водорослей, являются температура, освещенность, содержание биогенных элементов в среде, соленость и различные виды загрязнений (Elstner Е F., Osswald W 1994.). В ряду этих факторов первостепенное значение имеет видимый свет. В природе диатомовые водоросли способны занимать различные экологические ниши в широком диапазоне интенсивности освещения При длительных воздействиях света высокой интенсивности увеличивается скорость генерации форм активированного кислорода, что вызывает угнетение процессов фотосинтеза вследствие фотодеструкции фотосинтегического аппарата и может вызывать гибель организма (Мерзляк М Н. и др., 1996, Не & Hader, 2002, Mahalingam & Fedoroff, 2003).

Система защиты от окислительных повреждений фотосинтетического аппарата включает многие факторы, в том числе процессы, связанные с генерацией трансмембранного потенциала ионов водорода (ДрН), вызывающие увеличение вероятности безизлучательной тепловой диссипации энергии возбужденных пш ментов фотосистемы II, тн. нефотохимическое тушение возбужденных состояний хлорофилла (Рубин, Кренделева, 2003, Krause G Н, Weis Е. 1991 , Lokstein Н et al, 1994, Hideg Е, Murata N. 1997 ), которое предотвращает разрушение фотосинтетического аппарата. Значительную роль в этих процессах, ведущих к рассеиванию избыточной энергии, играют свегоиндуцированные изменения каротиноидов ксантофиллового цикла, т.е образование под действием света зеаксантина из виолаксантина (у высших растений и зеленых водорослей), или диатоксантина из диадиноксантина (у диатомовых и некоторых других водорослей).

Одним из важных факторов повреждения фотосинтетического аппарата микроводорослей является УФ излучение, которое может приводить к повреждению фотосинтетического аппарата. УФ облучение оказывает прямое воздействие на белковые компоненты фотосинтетического аппарата (белка D1

i«*oc. национальная

библиотека

™" ■ II или'

фотосистемы И) и приводит к нарушению системы синтеза белка, тем самым прспято вуя процессам репарации при фотоповреждении

Известно, что свойства и показатели функциональной активности в том числе и характеристики процессов повреждения и репарации индивидуальных клеток могут значительно отличаться от значений тех же показателей, усредненных по всей популяции клеток (К|7шс11спк0 в. е1 а1 1996 , Pogosyan I с( а1 . 1997 , Погосян СИ и др, 1998 ) В связи с этим исследование состояния индивидуальных клеток необходимо для понимания ответной реакции популяции на действие каких-либо факторов, основанной не только на усредненных показателях функциональной активности.

В настоящей работе основным методологическим подходом в оценке состояния фотосинтетического аппарата и его изменений при разных воздействиях было измерение в клетках параметров флуоресценции хлорофилла, характеризующих потери по! лощенной энергии света при слабом освещении - Ро и при световом насыщении электрон-транспортной цепи фотосинтеза - И,,, Те же измерения, проведенные на фоне постоянного освещения дают значения тех же величин, с учетом развивающегося в этих условиях процессов нефотохимического тушения и транспорта электронов в цепи фотосинтеза. Значение параметров флуоресценции, а также вычисленные на этой основе коэффициенты фотохимического и нефотохимического тушения являются главными показателями состояния клеток В дальнейшем в работе мы использовали те же обозначения параметров флуоресценции (Ро и Рт) и для значений параметров флуоресценции, полученных на фоне постоянно действующего света, и после окончания облучения интенсивным светом и УФ-излучением.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение функционального состояния ФСА микроводорослей в культурах и в природных сообществах фитопланктона по параметрам флуоресценции хлорофилла при воздействии видимым светом высокой интенсивности и УФ-облучением. В работе были поставлены следующие задачи

1. Выяснить закономерности изменения параметров флуоресценции хлорофилла диатомовой водоросли ТЬ. we^\fIogu в ответ на изменения условий облучения видимым светом.

2 Выявить связь между параметрами флуоресценции хлорофилла микроводорослей и световыми условиями их выращивания

3 Определить влияние воздействия света высокой интенсивности и УФ-излучения на параметры флуоресценции хлорофилла микроводорослей, культированных при разных интенсивностях света

4 Сравнить характер изменений показателей флуоресценции хлорофилла культуры микроволорослей и природных сообществ фитопланктона в ответ на изменения режимов освещения

Научная новизна. Микрофлуорометрическим методом установлено, что индивидуальные клетки диатомовой водоросли 77ш//<нш«га \veisflogu, адаптированные к разным условиям освещения, различаются по величине пула хинонов и скорости электронного транспорта Выявлено, что основным путем регуляции процессов фотосинтеза на уровне первичных стадий при облучении диатомовой водоросли 77г \\>с1фо£и является нефотохимическое тушение, обусловленное светоиндуцированным изменением каротиноидов ксантофиллового цикла Показано, что при воздействии большими дозами видимого света и УФ-излучения в культуре сохраняются клетки, обладающие высокими значениями эффективности фотосинтеза Обнаружены сходные закономерности изменения флуоресцентных показателей регуляции ФСА клеток диатомовой водоросли 'ПгаПаноига \veisflogu и фитопланктонного сообщества Каспийского моря в ответ на изменение режимов освещения Разработаны алгоритмы для оценки функционального состояния природных сообществ фитопланктона.

Практическая значимость. С помощью разработанной методики оценено физиологическое состояние фитопланктона Каспийского моря Полученные закономерности могут быть использованы при оценке экологического состояния водоемов Материалы диссертации могут быть рекомендованы для включения в курс лекций и практикум по экологической биофизике для студентов биологического факультета

Апробация работы. Результаты исследований представлены на Международном симпозиуме (Москва, 2001), Третьем Всероссийском съезде фотобиологов (Воронеж, 2001). Третьем съезде биофизиков (Воронеж, 2004),

Симпозиуме «Люминесценция и фотосинтез морского фитопланктона» (Краков, 2004)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и используемых методов, 5 глав по результатам исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы из наименования Работа изложена на страницах, иллюстрирована 7 таблицами и 25 рисунками

Объект и методы исследования. Объектом исследования служила альгологически чистая культура диатомовой водоросли Thallassiosira weisflogn Водоросли выращивали в накопительном режиме в искусственной морской воде (Шубравый О И. 1983 ) с соленостью 18°/оо, обогащенной по прописи Гольдберга (Ланская Л А , 1971.) при начальном обогащении в среде N:P = 181 по массе Культивирование проводили в колбах объемом 250 мл при температуре 25°С и периодическом освещении при плотностях мощности 2, 0,4 и 4 Вт/м2 в области ФАР люминесцентными лампами дневного света Продолжительность светового периода составляла 14 ч, темнового - 10 ч Численность клеток определяли методом прямого счета в камере Горяева Облучение водорослей проводили на стадии логарифмического роста культуры клеток водорослей Th. weisflogn

Измерение параметров флуоресценции хлорофилла в суспензии водорослей проводили на приборе, созданном на кафедре биофизики Биологического ф-та МГУ, аналогичному по принципу действия флуорометра РАМ-2000 («Walz», Германия), способном к измерению сильно разбавленных суспензий микроводорослей Длительность импульсов тестирующего света возбуждения флуоресценции равнялась 4 мкс При измерении величины Fo интервал следования тестирующих импульсов был выбран равным 80 мс, а при измерении F„, - 5 мс на фоне постоянного света Средняя плотность мощности возбуждающего света при измерении Fo и F„, равнялась 0,4 и 3000 Вт/м2 соответственно (где Fo - интенсивность флуоресценции хлорофилла, измеренная при открытых реакционных центрах ФС2, F,„ - интенсивность флуоресценции хлорофилла при закрытых реакционных центрах)

Для определения коэффициента нефотохимического тушения у водорослей, предварительно адаптированных к разным условиям освещения, определяли быстрые изменения показателей флуоресценции хлорофилла водорослей под действием синего света (А = 470 им) плотностью мощности 20 Вт/м2 в течение 10 мин, измеряя показатели флуоресценции хлорофилла в процессе и в течение 10 мин после окончания облучения Коэффициент нефотохимического тушения вычисляли по формуле NPQ = F„/F„,'-l (где F,,,' -интенсивность флуоресценции хлорофилла во время насыщающей вспышки, созданной на фоне постоянно действующего света)

Для определения вклада градиента потенциалов па мембране тилакоидов в процесс нефотохимического тушения возбужденных состояний хлорофилла суспензии водорослей инкубировали с 2 мМ NH4CI не менее получаса до начала облучения Для определения вклада светоиндуцированных изменений состава каротиноидов в величину нефотохимического тушения в суспензию водорослей добавляли ингибитор деэпоксидазы каротиноидов 1,4-дитиотреитол фирмы (Serva) в конечной концентрации 2 мМ и инкубировали до начала облучения не менее 1 ч

Микрофлуориметрические измерения флуоресценции хлорофилла отдельных клеток проводили на люминесцентном микроскопе ЛЮМАМ И-3 («ЛОМО», Россия) с флуориметрической насадкой ФМЭЛ-1Л, снабженным импульсными источниками света, компьютерной системой управления источником света и автоматической регистрацией сигнала с накоплением, разработанными и изготовленными на кафедре биофизики Биологического факультета МГУ Средняя плотность мощности на объекте при измерении Fo и F,„ составляла 0,45 Вт/м2 и 3000 Вт/м2 соответственно Длительность импульсов света, возбуждающих флуоресценцию хлорофилла, составляла 5 мкс. Измерение среднего значения F0 получали усреднением по 512 измерениям интенсивности флуоресценции в ответ на импульсы света, следующие с интервалом 80 мс, а средние значения Fm получали усреднением по 512 измерениям интенсивности флуоресценции в ответ на импульсы света с интервалом 5 мс на фоне постоянного света Перед началом измерений клетки в контроле адаптировали к темноте не менее 10 мин В каждом препарате

измеряли по 60-100 клеток Время работы с одним препаратом не превышало одного часа

В дополнение к ранее описанной методике (Погосян и др, 2002) измеряли интенсивность флуоресценции в ответ на последовательность из 512 импульсов света той же длительности и амплитуды, что и тестирующие, но следующие с интервалом в 0,5 мс Схема измерения представлена на рис 1 В таком режиме происходило последовательное нарастание интенсивности флуоресценции вследствие закрытия реакционных центров от значения Ро до нового стационарного уровня флуоресценции Рп Достижение стационарного уровня происходит тогда, когда в результате установления динамического равновесия скорости появления закрытых и открытых реакционных центров сравниваются

с

в-

г

& *

р.

и!

4* ••

Рис 1 Схема измерений параметров флуоресценции хлорофилла Б, и 10 Измерения производились в режиме быстрого повторения импульсов возбуждающего света (Пояснения в тексте)

Время

Стационарную величину Ии определяли как среднее значение флуоресценции из 200 последних измерений Величина определенная по формуле

Р„|, = (Рт-Рь)/Р„„ - характеризует скорость открытия реакционных центров Чем выше значения РЛ, тем с меньшей константой скорости открываются ранее закрытые реакционные центры.

Кроме того, рассчитывали величину 10 по формуле

10 = (512^ -1512 Р,)/512Рн,

где Fh - среднее значения Fh, 512Fh - интеграл (светосумма), которая была бы получена в том случае, если бы сразу было бы достигнуто значение стационарного уровня флуоресценции Fh, 1512 F, - интеграл (светосумма) под кривой, полученой в эксперименте

Величина iQ показывает отношение интеграла (светосуммы), который можно было бы получить, если бы интенсивность флуоресценции с первого же импульса возбуждающего света достигла стационарного уровня к интегралу (светосуммы) под кривой роста интенсивности флуоресценции и характеризует величину пула хинонов.

Облучение суспензии водорослей видимым светом проводили в кварцевой кювете объемом 5 мл толщиной 6 мм, термостатированной в водяном термостате при 25°С. Плотность мощности облучения в области ФАР составляла 500, 1100 и 2200 Вт/м2. Измерение интенсивности падающего излучения проводили с помощью микрокванттермометра фирмы Walz (Германия). После облучения водоросли экспонировали при инфракрасном облучении (А. > 700 нм) с плотностью мощности 0,5 Вт/м2 и измеряли динамику восстановления показателей флуоресценции хлорофилла Облучение УФ -светом суспензии микроводорослей проводили на установке ЛОС-2 Облучение суспензии проводили в кварцевой кювете объемом 5 мл, термосгатируемой при 25°С. Плотность мощности облучения составляла 125, 300 и 600 Вт/м2

Спектры поглощения суспензий микроводорослей регистрировали на спектрофотометре Hitacthi 150-20 (Япония), снабженном интегрирующей сферой (150 мм) и на спектрофотометре на базе спектрометра USB 2000 фирмы Ocean Optics (Германия) Расчет спектров поглощения суспензий, компенсированных на рассеяние, проводили, как описано в работе ( Merzlyak M.N., 2000).

Исследования природных популяций фитопланктона проводили в августе 2004 года в прибрежных и открытых районах Каспийского моря. Измерения параметров флуоресценции хлорофилла в суспензии водорослей проводили на приборе, созданном на кафедре биофизики Биологического ф-та МГУ, аналогичному по принципу действия флуорометру, описанному ранее.

Результаты исследований и обсуждение.

Влияние световых условий культивирования на характеристики ФСА клеток водорослей.

Длительная адаптация к свету приводит ФСА водорослей в состояние, соответствующее оптимальному фотосинтезу С первых дней культивирования наблюдались различия в приросте численности клеток водорослей Численность в культуре водорослей выращенных при низком освещении, на 31 й день культивирования была почти в 2 раза меньше, чем у водорослей, адаптированных к более высокому уровню освещения (таб 1) Таблица 1. Связь численности и показателей флуоресценции хлорофилла Р"о и Ь УК,,, на клетку водоросли ГА. weisflogu при разных условиях культивирования.

культура водорослей, выращенных при освещении 4 Вт/м'

Время культивирования в сутках 4 31

Численность, тыс кл/мл 85 760

Среднее значение Яо в отн ед 78 230

Среднее значение Р7РШ 0,62 0,5

Среднее содержание Хл «а» на клетку, г Хл/кл - 5,5*10'"

Культура водорослей, выращенных при освещении 0,4 Вт/м2

Время культивирования в сутках 4 31

Численность, тыс кл/мл 70 395

Среднее значение Ио в отн. ед 77 116

Среднее значение РУР,,, 0,63 0,66

Среднее содержание Хл «а» на клетку, г Хл/кл - 5,0*10 12

Средние значения Ро на клетку у водорослей, выращенных при освещении 4 Вт/м2 были выше, чем у водорослей, адаптированных к низким уровням освещения Средние значения Ру/Р,» были выше у клеток водорослей, выращенных при низкой интенсивности света Уменьшение средних значений Р„/Р|п, определенных для всей популяции, происходит за счет изменения распределения индивидуальных клеток водорослей по величине Р„/Рш в зависимости от стадии культивирования

Изменения структуры популяций водорослей, адаптированных к разным условиям освещения, в зависимости от стадий роста культур представлены на рис.2. На начальных стадиях роста популяции клетки водорослей, адаптированных к высоким и к низким уровням освещения, имеют высокие средние значения Я.,/Рт. На стадии линейного роста в популяциях появляются клетки, имеющие более низкие значения РУР„, У водорослей, адаптированных к высокому уровню освещения, количество клеток со значениями Ру/Рт ниже 0,3, достигало 50%, тогда как у водорослей, адаптированных к низкому освещению, количество таких клеток не достигало 10% .

Как видно из рис 2, кривая роста микроводорослей, выращенных на сильном свету, практически достигает стационарного уровня к 50 суткам ку 1ыивировашш, тогда как водоросли, выращенные на стабом свету, не достигали стационарного уровня на 50 день культивирования.

Можно предположить, что у водорослей, выращенных при высокой освещенности, существуют клетки с нарушениями ФСА, тогда как у водорослей, выращенными при слабом освещении, таких клеток нет Возможно, эти нарушения вызваны избыточным светом. Достоверных различий в количестве хлорофилла «а» в клетках водорослей, адаптированных к различным световым условиям, получено не было.

Для исследования функциональных различий ФСА популяций водорослей, выращенных в разных световых условиях проводили измерение кинетики нарастания выхода флуоресценции методом быстро повторяющихся вспышек, которое позволяет рассчитывать основные кинетические характеристики реакционных центров ФС2. Полученные распределения клеток водорослей, выращенных при разной освещенности, по значениям показателей флуоресценции Ел и ¡0 представлены на рис.3

Средние значения РЛ у водорослей, выращенных при 0,4 Вт/м2, были выше, чем у водорослей, выращенных при 4 Вт/м2.

Время культивирования, сутки

Рис. 2. Изменения численности клеток и распределения значений переменной флуоресценции Хл клеток Гйа/аввюз/га (синим цветом обозначены водоросли, выращенные при освещении 4 Вт/м2 (1),

красным - выращенные при освещении 0,4 Вт/мд2).

Гистограммы соответствуют распределению клеток по значениям Г^/Ят на 7, 20 и 50 день культивирования.

У водорослей, выращенных в условиях высокого освещения низкие значения показателя Рл, возможно, соответствуют высокой скорости электронного транспорта на уровне окисления хинонов, а более высокие значения ¡0 - большему размеру пула хинонов у большинства клеток, чем у клеток водорослей, выращенных в условиях слабого освещения. Таким образом, выращивание водорослей при сильном освещении способствует формированию большего пула хинонов и приводит к большей скорости окисления хинонов

08

■з к

к,

g 50-6 й * gS0,4

5

к

§

ч

0,2

1Т

I W

..■Ш f'Li»._

0,1 0,2 0,3 0/4 0,5 0,6 0,7 Fm/F,„, отпад.

WWzapsQfiio/BOfBOfirofBOfB iQoMW

Рис. 3. Зависимость распределения клеток популяций диатомовой водоросли Th. weisflogii, выращенных при освещении 0,4 Вт/м2 (обозначены красным цветом) и 4 Вт/м2 (обозначены синим цветом), по показателям флуоресценции хлорофилла F,b (а) и i'Q (б).

Влияние облучения на состояние ФСА водорослей.

Для защиты от окислительных повреждений фотосинтетического аппарата в его антенном комплексе и реакционном центре происходит целый ряд процессов, вызывающих увеличение вероятности безизлучательной диссипации энергии возбужденных пигментов фотосистемы II путем нефотохимического тушения возбужденных состояний хлорофилла. (Krause G Н, 1991., Lokstein Н., 1994., Hideg Е., 1997) В исследовании адаптации ФСА водорослей, связанной с развитием нефотохимического тушения, к действию света были использованы два способа изменения световых условий. В первом случае наблюдали изменение показателей флуоресценции хлорофилла при включении на 10 мин света плотностью мощности 20 Вт/м2 и их релаксацию

после выключения света Такой свет неспособен вызвать повреждение ФСА, но превышает по своей интенсивности свет при выращивании культур Во втором случае определяли показатели флуоресценции хлорофилла после облучения суспензии водорослей светом высокой интенсивности 500-2000 Вт/м2, который может приводить к повреждению ФСА водорослей

Быстрые адаптационные изменения.

Результаты действия света плотностью мощности 20 Вт/м2 представлены на рис.4

I 1 Сват ['

0*1 *. 8

5£ 1 ---

0,0

0.5

«А

ОД IV 2

0,2

0,1

-5 0 5 10 15 20 25 Время, мин

I Свет |

и г

0* Г ч

о* \

0,4 к 1

од 1 ..... ■—■■

•б О 5 10 15 20 29

Рис. 4. Изменения показателей флуоресценции хлорофилла Ко (А), Гт (Б), Г,/Тт (В) и №<} (Г) суспензии клеток ГЛ. weisflogii (1 - водоросли, выращенные при освещении 0,4 Вт/м2, 2 - при освещении 4 Вт/м2) при облучении видимым светом плотностью мощности 20 Вт/м2 в течение 10 мин и темновая релаксация этих показателей после окончания облучения.

Снижение значений Рт в первые минуты после включения постоянного света вызвано развитием нефотохимического тушения (рис.4Б) Повышение значений Бо является результатом заполнения электрон-транспортной цепи и закрытием реакционных центров (рис 4А) Последующее снижение значений Ио в суспензии водорослей, адаптированных к высоким

уровням освещения, вызвано значительным нефотохимическим тушением, тогда как у водорослей, адаптированных к низким уровням освещения, значения Ро немного повышены, что может быть обусловлено частичным закрытием реакционных центров (рис 4А) Развитие сильного нефотохимического тушения у водорослей, адаптированных к условиям высокого освещения (рис 4Г) может быть одной из причин того, что ФСА этих водорослей оказывается более устойчив к фотоповреждению, чем у водорослей, выращенных при малых уровнях освещения.

Одним из возможных механизмов нефотохимического тушения хлорофилла являются светоиндуцированные изменения каротиноидов ксантофиллового цикла При блокировании работы деэпоксидазы диадиноксантина значения Ро повышались после включения постоянно действующего света, оставаясь значительно выше исходных (до облучения), и снижались до изначальных после выключения света (рис 5А) Значения Р»/Рт снижались после включения освещения и возвращались к контрольным в течение нескольких мин после выключения света (рис 5В) Нефотохимическое тушение в случае инкубирования суспензий водорослей с ингибитором деэпоксидазы диадиноксантина почти не развивалось (рис.5Г). Динамика показателей флуоресценции хлорофилла при инкубировании культур водорослей с ДТТ и Г^ЬЦС] аналогична

Отсутствие нефотохимического тушения при инкубировании суспензии водорослей с ДТТ позволяет говорить о том, что светоиндуцированные изменения каротиноидов составляют большую часть ДрН-зависимого тушения Повышение значений Ро свидетельствует о закрытии части реакционных центров

Свет

Свет

V

2

S X 1,5

о

á U.

0*1

$ «С

«

м

£ «V*

s ч u. 013 0t2 di -в-

Свет

10 1« 20

U 1

5 <и

1 0.8

2 м

Z

М

Свет

Рис. 5. Изменения показателей флуоресценции хлорофилла Го (А), Гт (Б), ЕуЛРщ (В) и »Р<2 (Г) суспензии клеток 7Ъ. \veisflogii, предварительно инкубированных с 2мМ ДТТ (1 - водоросли, выращенные при освещении 0,4 Вт/м , 2 - при освещении 4 Вт/м2) при облучении видимым светом плотностью мощности 20 Вт/м2 в течение 10 мни и релаксация этих показателей после окончания облучения.

Влияние света высокой интенсивности на ФСА диатомовых водорослей.

Свет высокой интенсивности угнетает рост популяций диатомовых водорослей и приводит к снижению эффективности утилизации поглощенной пигментным аппаратом энергии Для определения роли светоиндуцированных изменений каротиноидов ксантофиллового цикла в развитии нефотохимического тушения нативные водоросли и водоросли, предварительно инкубированные с 2мМ ДТТ не менее 1 часа, облучали видимым светом плотностью мощности 440 и 1100 Вт/м2 После окончания облучения суспензии нативных водорослей относительно небольшими световыми потоками (10 мин при 440 Вт/м2) через 20 мин наблюдали некоторое

восстановление Рш (частичное снятие нефотохимического тушения) и через 2ч ■ полное восстановление показателей флуоресценции хлорофилла (рис 6а)

1 в

$

и? ,.■6

о,о _

жъ

л «о «в ао 100 120 Время, мин

40 (о ао юо но Время, мин

Рис.б. Кинетика показателей флуоресценции хлорофилла клеток П. -пекАоф после облучения видимым светом плотностью мощности 440 и 1X00 Вт/м2 без и после добавления 2мМ ДТТ. -а и б - облучение видимым светом при плотности мощности 440 Вт/м2 в течение 10 мин без и после предварительного инкубирования с ДТТ, соответственно; в и г -облучение видимым светом при плотности мощности 1100 Вт/м2 в течение 30 мин без и после предварительного инкубирования с ДТТ, соответственно. Стрелками показано включение и выключение света.

У суспензии водорослей, предварительно инкубированной с ДТТ, фазу после окончания облучения (10 мин при 440 Вт/м2) наблюдали повышение Ро (рис 66), по сравнению с первоначальным значением В течение последующих 2ч Ро снижался до исходного уровня Значения Р ш после облучения оказывались несколько ниже значений до облучения и в течение 2ч оставались неизменными (рис. 66) На основании того, что светоиндуцированные изменения каротиноидов ксантофиллового цикла происходят за 10-15 мин, можно предположить, что первая фаза восстановления Рт обусловлена деэпоксидацией диадиноксантина и образованием диатоксантина Значения через 2 часа не достигали уровня

в контроле до облучения После облучения большими дозами видимого света (30 мин при плотности мощности 1100 Вт/м2) у контрольной суспензии водорослей (без ДТТ) в течение 2 ч происходило почти полное восстановление показателей флуоресценции хлорофилла (рис. 6в). В присутствии ДТТ в первые минуты после окончания облучения наблюдали небольшой рост значения Ро, в дальнейшем происходило его снижение по отношению к исходному уровню (рис бг) Величины Рт и Vв этих условиях были значительно меньше, чем до облучения и не восстанавливались в течение 2ч Облучение водорослей, предварительно инкубированных с ДДТ, приводило к снижению значений Рт видимо, обусловленному деструктивными процессами в реакционных центрах Вероятно, облучение большими дозами видимого света приводило к окислению реакционных центров значительной части клеток

Рост нефотохимичсского тушения и отсутствие восстановления показателей фотосинтетической активности после окончания облучения большими дозами видимого света света в присутствии ДТТ указывает на большой вклад светоиндуцированных изменений каротиноидов ксантофиллового цикла в процессы тушения избытка возбужденных состояний фотосистемы П.

Индивидуальные клетки могут значительно отличаться по множеству признаков, в том числе по функциональной активности. В связи с этим, оценка ответной реакции популяции в целом к действию каких-либо факторов должна быть основана не только на определении усредненных показателей функциональной активности, но и на исследовании состояния индивидуальных особей Как показано в главе 3 2 диссертации облучение индивидуальных клеток водорослей видимым светом с плотностью мощности 2200 Вт/м2 вызывает увеличение гетерогенности клеток по относительной переменной флуоресценции. После 90 мин облучения большая часть клеток (около 70%) теряла фотосинтегическую активность. Однако, даже при больших дозах облучения сохранялись клетки с высокими показателями эффективности фотосинтеза. Через сутки после 90-минутного облучения в популяции присутствовали клетки с высокой переменной флуоресценцией и клетки, утратившие фотосинтетическую активность, причем доля первых составляла уже около 70%. Наличие части клеток с высокой относительной переменной

флуоресценцией, сохраняющейся даже после больших доз облучения, возможно, обеспечивает адаптацию популяций в целом к фотоокислительному стрессу в природных условиях Даже при больших дозах облучения видимым светом высокой интенсивности как нативных, так и водорослей, предварительно инкубированных с ДТТ, сохранялись клетки с высокой переменной флуоресценцией Относительная высокая устойчивость части популяции клеток к действию света высокой интенсивности может быть обусловлена не только светоивдуцированной перестройкой каротиноидов, но и другими компонентами нефотохимического тушения, развивающегося при облучении высокоинтенсивным светом

Для определения влияния дозы облучения на состояние фотосинтетического аппарата клеток водорослей суспензию облучали видимым светом плотности мощности 1100 и 2200 Вт/м2. Зависимость переменной флуоресценции хлорофилла Ру/Рш от времени и мощности облучения представлены в таблице 2.

Таблица. 2. Зависимость относительной переменной флуоресценции хлорофилла (Гу/Гщ) отдельных клеток П. у?е1зАоф1 от времени и мощности облучения видимым светом._

Доза облучения, Вт/м'.мин) Средние значения Р,/Рт после облучения видимым светом плотностью мощности, Вт/м2

1100 2200

0 0,6 0,57

66 000 0,16 0,31

132 000 0,05 0,27

198 000 0,01 0,16

При одинаковых дозах облучения средние значения относительной переменной флуоресценции были ниже после облучения видимым светом плотностью мощности 1100 Вт/м2, т е при большем времени облучения. После 120 мин облучения видимым светом плотности мощности 1100 Вт/м2 (доза облучения 132 000 Вт/м2>мин) средние значения РУ/РШ составляли 0,05, что может указывать на потерю фотосинтетической активности большей части

клеток После 60 мин облучения видимым светом плотности мощности 2200 Вт/м2 (та же доза облучения) средние значения Ру/Рт составляли 0,27

Влияние света высокой интенсивности на показатели флуоресценции диатомовых водорослей, выращенных при разных световых условиях.

Различия в реакциях ФСА водорослей на действие света высокой интенсивности может являться признаком, по которому можно определить, к каким условиям они были адаптированы Для выявления справедливости такого предположения водоросли, адаптированные к разным световым условиям роста, облучали видимым светом высокой интенсивности У водорослей, адаптированных к более высоким уровням освещения, после окончания облучения показатели Ро значительно снизились по сравнению с контрольными до облучения при всех интенсивностях облучающего света (от 500 до 2000 Вт/м2) и времени облучения (от 15 до 120 мин), в течение последующих 30-60 мин они достигали первоначальных значений (рис 7) При малых дозах облучения значения Ро в течение 10-20 мин после окончания облучения повышались по сравнению с исходными значениями (рис.7А). В это же время у водорослей, адаптированных к низкой освещенности, значения Ро после окончания облучения оказались выше по сравнению с контрольными до облучения также независимо от интенсивности и времени облучения, снижаясь до контрольных (рис 7А). Снижение значений Ро у водорослей, выращенных в условиях высокого освещения, вызвано развитием сильного нефотохимического тушения У водорослей, выращенных в условиях слабого освещения, повышение значений Ро после окончания облучения обусловлено закрытием реакционных центров, видимо, за счет деструкции белка в ходе облучения В первые минуты после окончания облучения значения Рт заметно снижались независимо от времени облучения и мощности видимого света (рис 7Б) При небольшом времени облучения значения Рт значительно возрастали в обеих культурах водорослей, не достигая при этом значений до облучения за 60 мин после окончания облучения (рис.7Б). При больших временах облучения видимым светом высокой интенсивности значения Рш в течение часа практически не восстанавливались (рис.7Б) Снижение значений Рт вызвано развитием нефотохимического тушения.

Рис. 7. Изменения показателей флуоресценции хлорофилла Fo (А), Fm (Б), F,/Fm (В) и NPQ (Г) хлорофилла клеток ГЛ. weisflogii после облучения видимым светом плотностью мощности 550 Вт/м2 и последующем их экспонировании на свету через светофильтр КС-19. Время облучения клеток 15 и 60 мин Синим цветом обозначена культура, выращенная при освещении мощностью 4 Вт/м2, красным цветом - культура, выращенная при освещении мощностью 0,4 Вт/м2.

После действия малых доз облучения видимым светом высокой интенсивности уровень нефотохимического тушения быстро снижается, тогда как после действия больших доз облучения снижение нефотохимического тушения происходит значительно медленнее в обеих популяциях водорослей Значения относительной переменной флуоресценции после окончания облучения небольшими дозами видимого света у водорослей, адаптированных к высоким уровням освещения, были выше, а восстановление фотосинтетической активности происходило быстрее, чем у водорослей, выращенных при слабых уровнях света (рис.7В) У водорослей, адаптированных к высоким уровням освещения, в первые минуты после окончания облучения, уровень нефотохимического тушения был выше, чем у водорослей, адаптированных к

низким уровням облучения (рис.7Г) Значения коэффициента 1ЧР(2 у водорослей, выращенных при высоких интенсивностях света, снижались в течение 5-15 мин после окончания облучения (рис7Г). Восстановление показателей фотосинтетической активности после облучения видимым светом большой плотности мощности происходит быстрее и более полно у водорослей, адаптированных к условиям высокого освещения. Большую роль в восстановлении фотосинтетических показателей играет нефотохимическое тушение, которое развивается сильнее у водорослей, выращенных на сильном свету Более быстрое и полное восстановление активности фотосинтетического аппарата, а также более высокий уровень нефотохимического тушения и достаточно быстрое его снижение у водорослей, адаптированных к высоким уровням освещенности, указывает на большую устойчивость этих водорослей к фотоповрслдснию Это может быгь связано с адаптационными изменениями пигментного состава в процессе культивирования, те. у водорослей, адаптированных к условиям высокого освещения более развита система каротиноидов ксантофиллового цикла, позволяющая эффективно тушить возбуждённые состояния хлорофилла за счёт светоиндуцированных превращений в условиях избыточного света Таким образом, развитие сильного нефотохимического тушения в процессе облучения водорослей видимым светом высокой интенсивности, а также более быстрое и полное восстановление показателей флуоресценции хлорофилла после окончания облучения, могут указывать на то, что эти водоросли были адаптированы к большим уровням освещения.

Влияние УФ излучения на ФСА диатомовых водорослей.

Для изучения влияния УФ излучения на ФСА диатомовых водорослей суспензию облучали УФ излучением интенсивностью 300 Вт/м2 в течение 3, 6, 12, 24 и 48 мин. Через 40 мин после окончания облучения проводили микрофлуорометрические измерения показателей

фотосинтетической активности индивидуальных клеток. Результаты измерений представлены в таб. 3. Значения относительной переменной флуоресценции Р,/Рт снижались и слабо восстанавливались после окончания облучения. Полного восстановления фотосинтетической активности не наблюдалось и

после 24 часов после окончания облучения Значительное снижение значении Р„, и относительной переменной флуоресценции хлорофилла может быть обусловлено развитием нефотохимического тушения, вызванного нарушением белков РЦ ФС II

Таб. 3. Зависимость показателей флуоресценции хлорофилла Гц

средн., Р,„ средн., Г,Л\„ средн. одиночных клеток Th,weisfIogu от времени облучения УФ излучением через 20-40 мин после окончания облучения.

Доза облучения Ио РУР,,,

УФ-излучение (плотность мощности 300 Втм ')

0 мин (контроль) 1 2 46 0 57

3 мин 1 16 1 81 0 30

6 мин 1 22 1 75 0 22

12 мин 1 27 1 52 0 13

24 мин 1 19 1 37 0 11

48 мин 0 94 0 88 0

Через сутки после окончания облучения в течение 24 мин 1 02 1 44 0 19

Исследования темновой и световой адаптации природных популяций фитопланктона Каспийского моря.

В августе 2004 юда были проведены исследования состояния фитопланктонного сообщества в прибрежных и открытых районах Каспийского моря В главе 3 5 диссертации показано, что значения относительной переменной флуоресценции хлорофилла Р,./Рг|| после отбора проб были близки к нулю, что свидетельствует об угнетенном состоянии, в котором находятся популяции водорослей на поверхности под действием яркого солнечного света В результате адаптации на слабом свету (при инфракрасном облучении через светофильтр КС 19 светом плотностью мощности 0,5 Вт/м2), проводимои в течение 2-3 часов после отбора проб, значения РУР,„ увеличивались от 0 до 0,3 Значения р0 и Р,„ также возрастали в течение 20-60 мин в 1,5-2 раза по сравнению со значениями Р0 и р„„ измеренными сразу после отбора проб Такой рост показателей флуоресценции хлорофилла может свидетельствовать

об уменьшении уровня нефотохимического тушения, которое исходно развивалось в поверхностном слое под действием солнечного света высокой интенсивности Измерение коэффициента нефотохимического тушения позволяет определить, к каким световым условиям адаптированы микроводоросли Результаты измерений развития нефотохимического тушения под действием света 20 Вт/м2 и его релаксации после окончания облучения проб водорослей, отобранных на одной из станций представлены на рис 8

Свет

-Ом

I в -ш- 25м

5 10 Время, мин

15

20

Свет

_5 10 Время, тин

Рис. 8. Изменения показателей флуоресценции хлорофилла Го, Гт, Гу/Кт и №(} популяций водорослей, отобранных с глубин 0 и 25 м на станции 4 в Каспийском море, при облучении видимым светом в течение 10 мин и темновая релаксация этих показателей.

В суспензии водорослей, отобранных в поверхностном слое воды, значения Ро почти не изменялись ни после включения постоянно действующего света, ни после его выключения, оставаясь на уровне контрольных(рис.8А). Однако для водорослей, отобранных с глубин более 25 м, картина была противоположной Чем больше была глубина, с которой были отобраны пробы

воды, тем больше увечичивались значения Fo после включения постоянно действующего света После выключения света значения Fo снижались до контрольных (рис 8А) Увеличение значение F0 может быть обусловлено частичным закрытием реакционных центров Значения Fln после включения света снижались у водорослей отобранных со всех глубин, что, вероятно, вызвано развитием нефотохимического тушения (рис 8Б) Значения относительной переменной флуоресценции после включения света резко снижались также во всех суспензиях водорослей (рис.8В) Значения коэффициента нсфотохимического тушения NPQ возрастали в течение 5-7 мин после включения постоянно действующего света и этот процесс происходил быстрее у водорослей, отобранных в поверхностных водах (рис.8Г)

После выключения света значения NPQ снижались, оставаясь на высоком уровне в течение последующих 10 мин после выключения света (рис.8Г) Полученные результаты позволяют говорить об адаптации водорослей в поверхностном слое воды к высоким уровням освещенности и развитием у них механизмов защиты от повреждающего воздействия избыточной освещенности.

Заключение. Облучение видимым светом высокой интенсивности вызывает нефотохимическое тушение, защищающее ФСА от повреждения При кратковременном облучении происходит полное возвращение ФСА водорослей в исходное состояние до облучения Более длительное воздействие светом высокой интенсивности приводит к неполному восстановлению показателей флуоресценции хлорофилла. Видимо, такое воздействие вызывает повреждение мембранных комплексов, и, в первую очередь, белков реакционных центров, требующее для репарации нескольких часов (Barber J , 1998, Miyao-Tokutomi М. et а!, 1998) Дальнейшее повышение дозы облучения водорослей видимым светом высокой интенсивности сопровождается, по-видимому, необратимыми нарушениями фотосинтетического аппарата, включающими повреждения не только белков, но также липидов и пигментов реакционных центров, что обнаруживается по изменениям поглощения суспензий водорослей (Мерзляк, 1988) Некоторые авторы (F.LFigueroa et al, 2003, N K.Choudhury et al., 2001) предполагают, что у водорослей, адаптированных к условиям высокого облучения, развивается в основном динамическое фотоингибирование» -

механизм коюрый включает в себя быстрые, обратимые процессы нефотохимического тушения У водорослей, адаптированных к условиям слабого облучения, при перемещении на сильное освещение, развивается «хроническое фотоингибирование», характеризующееся фоторазрушением реакционных центров и протеолизом белка П1 ФС И Для выяснения условий, в которых находятся водоросли в природной среде, необходимо проведение исследований закономерностей изменения состояния ФСА типичных представителей планктонных водорослей при заданных режимах освещения и условиях культивирования

На свету высокой интенсивности нефотохимическое тушение развивается быстрее и до больших значений №(2 у водорослей, адаптированных к свету высокой интенсивности Поэтому при длительном облучении светом высокой интенсивности фотосинтетический аппарат водорослей, выращенных на более ярком свету, оказывается более устойчивым к фотоповреждению, чем у водорослей, выращенных при малых уровнях освещения Блокирование деэпоксидазы диадиноксантина при действии ДТТ, как и снятие градиента водородных ионов на тилакоидной мембране при действии N1-1401 приводят к усилению повреждающего действия света высокой интенсивности Однако сходное развитие нефотохимического тушения при кратковременном облучении водорослей ТЬ. >уе18Яо§п, инкубированных как с МНдО, так и с ДТТ, видимым светом высокой интенсивности указывает на то, что основной вклад в рН-зависимое тушение возбужденных состояний хлорофилла вносит процесс взаимопревращений каротиноидов ксантофиллового цикла Видимо, это характерно для всех диатомей, так как аналогичные результату были получены и на другой диатомовой водоросли Р11аесх1ас1у1ит итсогпаШт (Сазрег-ЬтсИеу, 1998)

У водорослей, исходно адаптированных к разным уровням освещения, выявлены достоверные различия в значениях показателей флуоресценции хлорофилла Пониженные значения К/Я,,, у этих водорослей могут быть обусловлены тем, что в условиях культивирования водорослей при избыточном освещении в фотосинтетическом аппарате развивается нефотохимическое тушение, играющее защитную роль В условиях длительного выращивания при свете высокой интенсивности существует

небольшой процент клеток, имеющих значения Рч/Р,,, ниже 0,3 Это указывает на то, что в таких условиях в популяции присутствуют клетки с нарушениями фотосинтетического аппарата, которые в дальнейшем разрушаются

Измерение кинетики нарастания выхода флуоресценции в зависимости от интенсивности и длительности вспышек позволяет оценить кинетику переноса электронов на акцепторной стороне ФС2 Высокие значения ¡0 у водорослей, выращенных в условиях высокого освещения, могут указывать на больший размер пула хинонов, чем у водорослей, выращенных в условиях слабого освещения, а небольшие значения показателя соответствуют высокой скорости электронного транспорта на уровне окисления хинонов Вероятно, большой размер пула хинонов и быстрый отток окисленных хинонов являются одним из способов адаптации к длительной экспозиции на свету избыточной интенсивности

УФ излучение обладает большим повреждающим действием по сравнению с видимым светом. УФ излучение действует непосредственно на белок 01 и затрагивает репарационные механизмы клетки Восстановление показателей фотосинтетической активности даже после кратковременного УФ облучения было неполным Нсфотохимическое тушение после действия больших доз УФ-излучения может быть обусловлено окислительным нарушением РЦ.

Микрофлуориметрические исследования отдельных клеток в популяции водорослей показали, что во всем диапазоне исследованных доз при действии видимого и УФ-излучения в популяции сохраняются клетки, имеющие высокую эффективность первичных процессов фотосинтеза Именно наличие части клеток с высокой относительной переменной флуоресценцией, сохраняющейся даже после больших доз облучения, возможно, обеспечивает адаптацию популяций в целом к фотоокислительному стрессу в природных условиях.

На основании полученных экспериментальных данных на культуре водорослей можно дать рекомендации по оценке состояния фотосинтетического аппарата фитопланктона в природных сообществах. По полученным световым зависимостям показателей флуоресценции хлорофилла можно говорить об адаптации того или иного фитопланктонного сообщества к

разным уровням света и устойчивости этого сообщества к фотоповреждению Разработанная методологическая база по оценке функционального состояния фитотанктонных сообществ может стать составной частью системы экологического мониторинга состояния водоемов Выводы.

1 Кратковременное воздействие (10 - 15 мин) на диатомовые водоросли видимым светом высокой интенсивности (440 - 2200 Вт/м2) приводило к развитию нефотохимического тушения, которое полностью исчезало через несколько часов после окончания облучения Длительное воздействие (30 - 60 мин) видимым светом высокой интенсивности приводило к снижению значений показателей флуоресценции хлорофилла Ро (в среднем в 1,5 раза) Рт (в 2,5 - 3 раза), Р»/Рш (в 2-2,5 раза), полного восстановление которых не происходило в течение 24 часов после окончания облучения;

2 Значительная часть нефотохимического тушения, развивающегося при кратковременном облучении диатомовых водорослей видимым светом высокой интенсивности обусловлена светоиндуцированными изменениями каротиноидов ксантофиллового цикла

3 Водоросли, адаптированные к высокому освещению (4 Вт/м2) имеют более высокую скорость электронного транспорта и больший пул хинонов по сравнению с водорослями, адаптированными к слабому освещению (0,4 Вт/м2)

4 Водоросли, адаптированные к высоким уровням освещения, более устойчивы к фотоповреждению Нефотохимическое тушение при кратковременном облучении водорослей видимым светом высокой интенсивности развивается эффективнее в культуре водорослей, адаптированных к высоким уровням освещения

5 УФ облучение экологического диапазона обладает большей квантовой эффективностью повреждения фотосинтетического аппарата, по сравнению с видимым светом Полного восстановления параметров флуоресценции хлорофилла не происходит в течение 24 часов после окончания УФ облучения

6 При воздействии большими дозами УФ облучения (600 Вт/м2) или видимого света (2200 Вт/м2) в популяции сохраняются клетки, обладающие высокими значениями эффективности фотосинтеза

7 Обнаружены сходные закономерности именения показателей флуоресценции хлорофилла культур диатомовой водоросли Th weisflogn и фитопланктонного сообщества Каспийского моря в ответ на изменение режимов освещения

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

I. Воронова Е H , Погосян С И , Мерзляк M H., Чивкунова О Б «Исследования изменения состояния фотосинтетического аппарата диатомовых водорослей под действием света высокой интенсивности» Докл МОИП, Биофизика, 2000, депон. ВИНИТИ 29 06 01, №1565-В2001, стр 24-28

2 Pogosyan S I, Voronova E N., Volkova E V ,Kazimirko Yu V., Chivkunova О В , Merzlyak M N , Rubin А В «Photosynthetic apparatus changes under condition of photooxidative stress in diatom algae Thallassiosira weisflogn» Abstract International Symposium "Plant under environmental stress" Moscow, К A Timiryazev Institute of plant physiology, October 23-29, 2001, p 223.

3. Воронова E H , Волкова Э. В , Казимирко Ю. В , Чивкунова О. Б., Мерзляк M. H , Погосян С И , Рубин А Б. «Влияние света высокой интенсивности на состояние фотосинтетического аппарата суспензии и одиночных клеток диатомовых водорослей» Материалы Третьего Всероссийского съезда фотобиологов России, Воронеж, 2001.

4. Воронова Е.Н , Волкова Э.В., Казимирко Ю В , Чивкунова О.Б, Мерзляк М.Н., Погосян С.И , Рубин А Б. «Изменения фотосинтетического аппарата клеток диатомовой водоросли Thallassiosira weisflogn в ответ на действие света высокой интенсивности» Физиология растений, 2002, т 49, №3, стр 350-358.

5. Graevskaya Е.Е , Antal T.K , Matorin D N , Voronova E.N., Pogosyan S I and Rubin А В «Evaluationof diatomea algae Thallassiosira weissflogn sensitivity of chloride mercury and methylmercury by chlorophyll fluorescence analysis». J.Phys IV France, 107 (2003) pp 569-572.

6. Антал T К , Граевская Е.Э , Маторин Д H, Воронова Е.Н , Погосян С И , Кренделева Т Е., Рубин А Б «Изучение действия хлорида ртути и метилртути

на фотосинтетическую активность диатомовых водорослей ГЛайгшгонга we^sflogu флуоресцентным методом», Биофизика, 2004, Т 49, №1, с 72-78

Отпечатано в ООО «Типография-Стиль» Москва, ул Староалексеевская, д 21, к 8 Заказ № 112/5 Тираж 100 экземпляров

7 7 3 1

РНБ Русский фонд

2006-4 5991

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Воронова, Елена Николаевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ. стр.

ВВЕДЕНИЕ. стр.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Функциональная организация фотосинтетического аппарата. стр.

1.2. Регуляция первичных процессов фотосинтеза. стр.

1.3. Роль каротиноидов ксантофиллового цикла в регуляции первичных процессов фотосинтеза. стр.

1.4. Влияние светового режима выращивания на состояние

ФСА растений. стр.

1.5. Влияние УФ-излучения на состояние ФСА растений. стр.

1.6. Роль гетерогенности популяции в устойчивости и адаптации к неблагоприятным внешним воздействиям. стр.

Цель и задачи исследования. стр.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. стр.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Влияние различных световых условий выращивания на прирост численности клеток и показатели флуоресценции хлорофилла культуры диатомовой водоросли Th. weisflogii. стр.

3.2 Влияние света высокой интенсивности на ФСА диатомовых водорослей. стр.

3.2. 1. Быстрые адаптационные изменения.стр.

3.2.2 Влияние света высокой интенсивности, способной приводить к повреждению ФСА диатомовых водорослей.стр.

3.3 Влияние света высокой интенсивности на показатели флуоресценции хлорофилла диатомовых водорослей, выращенных при разных световых условиях выращивания. стр.

3.4 Влияние УФ излучения на ФСА диатомовых водорослей. стр.

3.5 Исследования темновой и световой адаптации природных популяций фитопланктона Каспийского моря. стр.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. стр.

ВЫВОДЫ. стр.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изменения параметров флуоресценции хлорофилла диатомовой водоросли Thallasiosira weisflogii при фотоадаптации и фотоповреждении"

Фитопланктон составляет основу всей первичной продукции мирового океана. В связи с этим изучение физиологического состояния фитопланктонных сообществ является одной из важнейших задач экологии. Диатомовые водоросли представляют одну из основных таксономических групп, заселяющих водные фитоценозы. Традиционные методы исследования фитопланктонных сообществ включают в себя определение видового состава и численности фитопланктона, содержания фотосинтетических пигментов и вычисление первичной продукции на единицу объема водной толщи. Такие методы не позволяют оценить функциональное состояние отдельных видов, составляющих данный фитоценоз, и определить дальнейшее развитие сообществ фитопланктона. В последние годы широкое развитие получили спектральные и флуорометрические методы для определения функциональной активности ФСА микроводорослей, которые позволяют получить данные о состоянии ФСА определенных видов водорослей в популяции, оценить вклад отдельного вида в образование первичной продукции, прогнозировать динамику его численности. Разработка таких методов представляется особо важной для осуществления экологического мониторинга водоемов.

Главными экологическими факторами, влияющими на физиологическое состояние водорослей, являются температура, освещенность, содержание биогенных элементов в среде, соленость и различные виды загрязнений (Elstner E.F., Osswald W. 1994.). В ряду этих факторов первостепенное значение имеет видимый свет. С одной стороны, свет определяет рост, развитие и интенсивность фотосинтеза в клетках водорослей, а с другой, свет высокой интенсивности может вызывать фотоокислительный стресс, приводить к фотоингибированию, деструкции фотосинтетических пигментов и гибели клеток (Рубин А.Б. 1995.). В природе диатомовые водоросли способны занимать различные экологические ниши в широком диапазоне интенсивности освещения. Интенсивность освещения в природных условиях изменяется и в течение суток, и в течение года от лета к зиме. В культурах диатомовых водорослей обычно происходит насыщение роста численности при относительно слабой освещенности, порядка 1000-2000 лк (1,2 -2,5 Вт/м2) (Финенко 3.3. 1977.). Свет более высокой интенсивности угнетает рост популяций диатомовых водорослей и приводит к снижению эффективности утилизации поглощенной пигментным аппаратом энергии. При длительных воздействиях света высокой интенсивности возрастает время жизни возбужденных состояний хлорофилла и увеличивается скорость генерации активированных форм кислорода, что, в свою очередь, вызывает угнетение процессов фотосинтеза, деструкцию ФСА и, возможно, гибель организма (Мерзляк М.Н. и др., 1996, Не & Hader, 2002, Mahalingam & Fedoroff, 2003 ).

Способность адаптироваться к действию света высокой интенсивности обусловлена рядом молекулярных механизмов функционирования ФСА. Водоросли имеют как долговременную, так и краткосрочную систему регуляции состава и количества фотосинтетических пигментов и мембранных липидов.

Система защиты от окислительного повреждения ФСА включает многие факторы, в том числе процессы, связанные с генерацией трансмембранного потенциала ионов водорода (ДрН), вызывающие увеличение вероятности безизлучательной тепловой диссипации энергии возбужденных пигментов ФС И, т.н. нефотохимическое тушение возбужденных состояний хлорофилла (Рубин, Кренделева, 2003, Krause G.H., Weis Е. 1991. , Lokstein Н. et al, 1994, Hideg E., Murata N. 1997.), которое предотвращает разрушение ФСА. Значительную роль в этих процессах, ведущих к рассеиванию избыточной энергии, играют светоиндуцированные изменения каротиноидов ксантофиллового цикла, т.е. образование под действием света зеаксантина из виолаксантина (у высших растений и зеленых водорослей), или диатоксантина из диадиноксантина (у диатомовых и некоторых других водорослей).

Одним из важных факторов повреждения ФСА микроводорослей является УФ излучение. Избыточная УФ радиация может приводить к повреждению мембран тилакоидов, ингибированию реакционных центров ФС II, уменьшению активности хлоропластной АТФазы, потерю ферментативной активности в цикле Кальвина, нарушение синтеза пигментов. УФ облучение оказывает прямое воздействие на белковые компоненты ФСА, прежде всего, белка D1 ФС II. Кроме того, УФ излучение может приводить к нарушению системы синтеза белка и, тем самым, препятствовать процессам репарации при фотоповреждении.

Известно, что показатели функциональной активности и свойства индивидуальных клеток могут значительно отличаться от значений тех же показателей, усредненных по популяции (Riznichenko G. et ah, 1996., Pogosyan S.I. et al., 1997., Погосян С.И. и др., 1998.), в том числе и характеристики процессов повреждения и репарации. В связи с этим оценка ответной реакции популяции в целом к действию каких-либо факторов должна быть основана не только на определении усредненных показателей функциональной активности, но и на исследовании состояния индивидуальных особей.

Основным методологическим подходом в оценке состояния ФСА и его изменений при разных воздействиях были выбраны параметры флуоресценции хлорофилла водорослей, характеризующие потери поглощенной энергии света при слабом освещении - Fo и при световом насыщении электрон-транспортной цепи фотосинтеза - Fm. Те же измерения, проведенные на фоне постоянного освещения дают значения тех же величин, с учетом развивающегося в этих условиях процессов нефотохимического тушения и транспорта электронов в цепи фотосинтеза. Значение параметров флуоресценции, а также вычисленные на этой основе коэффициентов фотохимического и нефотохимического тушения являются главными показателями состояния клеток. В дальнейшем в работе мы использовали те же обозначения параметров флуоресценции (F0 и Fm) и для значений параметров флуоресценции, полученных на фоне постоянно действующего света, и после окончания облучения интенсивным светом и УФ-излучением.

В настоящей работе исследованы изменения параметров флуоресценции хлорофилла диатомовой водоросли Thallassiosira weisflogii при фотоадаптации и фотоповреждении.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Воронова, Елена Николаевна

Выводы.

1. Кратковременное воздействие (10 - 15 мин) на диатомовые водоросли видимым Л светом высокой интенсивности (440 - 2200 Вт/м) приводило к развитию нефотохимического тушения, которое полностью исчезало через несколько часов после окончания облучения. Длительное воздействие (30 — 60 мин) видимым светом высокой интенсивности приводило к снижению значений показателей флуоресценции хлорофилла F0(b среднем в 1,5 раза), Fm (в 2,5 — 3 раза), Fv/Fm (в 22,5 раза), полного восстановление которых не происходило в течение 24 часов после окончания облучения;

2. Значительная часть нефотохимического тушения, развивающегося при кратковременном облучении диатомовых водорослей видимым светом высокой интенсивности обусловлена светоиндуцированными изменениями каротиноидов ксантофиллового цикла.

3. Водоросли, адаптированные к высокому освещению (4 Вт/м2), имеют более высокую скорость электронного транспорта и больший пул хинонов по сравнению Л с водорослями, адаптированными к слабому освещению (0,4 Вт/м ).

4. Водоросли, адаптированные к высоким уровням освещения, более устойчивы к фотоповреждению. Нефотохимическое тушение при кратковременном облучении водорослей видимым светом высокой интенсивности развивается эффективнее в культуре водорослей, адаптированных к высоким уровням освещения.

5. УФ облучение экологического диапазона обладает большей квантовой эффективностью повреждения фотосинтетического аппарата, по сравнению с видимым светом. Полного восстановления параметров флуоресценции хлорофилла не происходит в течение 24 часов после окончания УФ облучения.

6. При воздействии большими дозами УФ облучения (600 Вт/м2) или видимого света (2200 Вт/м2) в популяции сохраняются клетки, обладающие высокими значениями эффективности фотосинтеза.

7. Обнаружены сходные закономерности изменения показателей флуоресценции хлорофилла культур диатомовой водоросли Th. weisjlogii и фитопланктонного сообщества Каспийского моря в ответ на изменение режимов освещения

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Воронова, Елена Николаевна, Москва

1. Андреева М.А. Функциональная структура популяции микроводорослей как показатель ее состояния.// Автореф. канд. диссертации. М. 1997. 25 стр.

2. Баулина О.И., Чивкунова О.Б., Мерзляк М.Н. Деструкция пигментов и ультраструктурные изменения цианобактерий при фотоповреждении. Физиология растений, Т.51, N 6, 2004, с.846-854.

3. Бигон М., Харпер Дж., Таунсенд К. Экология. Особи, популяции и сообщества. М.: Мир, Т. 1, 1989.

4. Бухов Н. Г. Динамическая световая регуляция фотосинтеза. Физиология растений, Т. 51, N 6, 2004, стр. 825-837.

5. Гапочка Л.Д. Об адаптации водорослей. М.: Изд-во МГУ, 1981. 80 стр.

6. Гиляров A.M. Популяционная экология. Из-во Московского Университета, 1990 с.26-32.

7. Говинджи . Фотосинтез. М.: Мир, 1987.

8. Гродзинский Д.М. Надёжность растительных систем. Киев, Наукова думка, 1983 с.368.

9. Емельянов И.Г. Разнообразие и устойчивость биосис-тем // Успехи современной биологии. 1994. - Т. 115, Вып. 3. - С. 304 - 316.

10. Иванов В. Н., Угодчиков Г.А. Клеточный цикл микроорганизмов и гетерогенность их популяций. Киев, Наукова думка, 1984.

11. Карапетян Н.В., Бухов Н. Г. Переменная флуоресценция хлорофилла как показатель физиологического состояния растений. Физиол. раст., Т. 33, С. 1013-1026, 1986.

12. Ю.Клейтон Р. Фотосинтез. Физические механизмы и химические модели. М.: Мир, 1984, 350 С.

13. Н.Климов В.В. Окисление воды и выделение молекулярного кислорода при фотосинтезе. Соросовский образовательный журнал, N 11, 1996, с.9-12.

14. Кукушкин А. К., Тихоиов А.Н. Лекции по биофизике фотосинтеза. М.: МГУ, 1988., 320с.

15. Курс низших растений под ред. Горленко М.В. М.: Высшая школа 1981 с.98.

16. Ланская JT.A. Культивирование водорослей // Экологическая физиология морских планктонных водорослей /Под ред. Хайлова К.М. Киев.: Наукова думка, 1971. С. 3-40.

17. Маторин Д.Н., Венедиктов П.С. Люминесценция хлорофилла в культурах микроводорослей и природных популяциях фитопланктона // Итоги науки и техн. ВИНИТИ. 1990. Сер. Биофизика. Т. 40. С. 49-100.

18. Печуркин Н.С., Брильков А. В., Марченкова Т. В. Популяционные аспекты биотехнологии. Новосибирск: "Наука", Сибирское отделение, 1990,170 С.

19. Печуркин Н.С., Терсков И.А. Анализ кинетики роста и эволюции микробных популяций (в управляемых условиях). 1994. Т. 39, Вып. 2, С. 345-350. Новосибирск: Наука, Сибирское отделение, 215 С.

20. Погосян С.И. Состояние растительных организмов в природных условиях и окислительное повреждение фотосинтетического аппарата.// автореф. Докторской диссерт. М. 2003. 56 стр.

21. Погосян С.И., Волкова Э.В., Казимирко Ю.В., Максимов В.Н., Рубин А.Б. Изменения фотосинтетического аппарата индивидуальных клеток микроводоросли Ankisirodesmus falcatus в норме и при УФ-облучении // Докл. РАН. Т. 363. 1998. С. 690-693.

22. Позмогова И.Н. Культивирование микроорганизмов в переменных условиях. М.: Наука, 1983, с. 104.

23. Рубин А.Б. Биофизика. Т.2. М.: Книжный дом «Университет», 2000. 468с.

24. Рубин А. Б. Принципы организации и регуляции первичных процессов фотосинтеза. Тимирязевские чтения LV. Пущино: ОНТИ ПНЦРАН, 1995, 38 С.

25. Рубин А.Б., Кренделева Т.Е. Регуляция первичных процессов фотосинтеза. Успехи биологической химии, т.43, Пущино, 2003, с.225-266.

26. Рубин А.Б., Кренделева Т.Е. Регуляция первичных процессов фотосинтеза. // Биофизика. Т. 49. вып. 2. 2004. стр.239-253.

27. Тихонов А.Н. Молекулярные преобразователи энергии в живой клетке. Соросовский образовательный журнал. N7, 1997. стр. 10-17.

28. Тихонов А.Н. Регуляция световых и темновых стадий фотосинтеза. Соросовский образовательный журнал. N 11, 1999., стр. 8—15.

29. Тихонов А.Н. Фотосинтез. Энциклопедия современное естествознание. Т.2. Общая биология. Ред. Сойфер В.Н., М., Магистр-Пресс, 2000., С. 271279.

30. Финенко 3.3. Адаптации планктонных водорослей к основным факторам океанической среды // Биология океана / Под ред. Виноградова М.Е. М.: Наука, 1977. Т. 1. С. 9-18.

31. Фотосинтез. Под ред. Говинджи. Т.2. 1987, Москва, Мир. 470 стр. 32.Чемерис Ю.К., Шендерова Л. В., Венедиктов П.С., Рубин А.Б.

32. Активация хлоропластного дыхания увеличивает выход флуоресценции хлорофилла у Chlorella, адаптированной к темноте при повышенной температуре.// Изв.АН СССР, сер. биол., 2004 , N1, с.82-90.

33. Шубравый О.И. Аквариум с искусственной морской водой для содержания и разведения примитивного многоклеточного организма Trichoplax и других мелких беспозвоночных // Зоол. Журн. 1983. Т. 62. С. 619-621.

34. Adir N., Zer Н., Shochat S., Ohad I. Photoinhibition a historical perspective.//Photosyn. Res. 2003. V.76. pp.343-370.

35. Arsalane W., Rousseau В., Duval J.C. Influence of the pool size of the xanthophylls cycle on the effects of light stress in a diatom competition between photoprotection and photoinhibition. // Photochem. Photobiol., 60, 1994, pp. 237-243.

36. Barber J. Photosystem Two. Biochim. Biophis. Acta. 1998. V. 1365. P 269-277.

37. Bergo E., Giorgio M. Giacometti & R. Barbato. Degradation of Dl-protein induced by UVB Light and its consequences of Photosystem II organization and Lateral distribution. G.Garab Photosynthesis: Mechanisms and effects, Vol III, pp. 2345-2348.

38. Bjorkman Olle, Niyogi Krishna K. Xanthophylls and excess-energy dissipation: a genetic dissection in Arabidopsis. G.Garab. Photosynthesis: Mechanizms and effects, Vol.III, 2085-2090.

39. Chang-Cheng Xu, Hong Jin Hwang, Tae Hyong Rhew, Choon- Hwan Lee. Possible involvment of reversible phosphorylation in the regulation of zeaxanthin epoxidation in rice leaves. G.Garab. Photosynthesis: Mechanizms and effects, Vol.III, 1907-1910, 1998.

40. Choudhury N.K., Behera R.K. Photoinhibition of photosynthesis: role of carotenoids in photoprotection of chloroplast constituents. Photosynthetica 39 (4): 481-488, 2001.

41. Crofts A., Yerkes C.T. Molecular Mechanism for qE-quenching. // FEBS Lett. 1994. V.352. P.265-270.

42. DeCoster В., Christensen R.I., Gebhard R., Lugtenburg J., Farhoosh R., Frank H.A. Low lying electronic states of carotenoids. // Biochim. Biophys. Acta. 1992. V. 1102. P. 107-119.

43. Demmig-Adams B. Carotenoids and photoprotection in plants: a role for the xanthophylls zeaxanthin. Biochim. Biophys. Acta, 1020. 1990. pp.1-24.

44. Demmig-Adams B. & Adams W.W. Ill, The xanthophylls cycle. In A.J. Young and G. Britton (eds.), Carotenoids in photosynthesis, Chapman And Hall, London, 1993, pp. 206-251.

45. Elstner E.F., Osswald W. Mechanisms of Oxygen Activation during Plant Stress // Oxygen and Environmental Stress in Plants / Eds. Watling R., Allen J.A. Edinburgh: Royal Society of Edinburgh, 1994. V. 102. P. 131-154.

46. Falkowski P. G., Raven J. A. Aquatic photosynthesis //1997. Blackwell Science. 375 p.

47. Frank H.A. and Cogdell R.J. Photochemistry and function of carotenoids in photosynthesis //in Young A.J. and Britton G. (eds.), Carotenoids in photosynthesis, Chapman and Hall, London, 1993, pp. 253-326.

48. Frank H.A., Cua A., Chynwat V., Young A., Gosztola D., Wasielewski M.R. Photophysics of the carotenoids associated with the xanthophylls cycle in photosynthesis.//Photosynth.Res., 1994. V.41, pp.389-395.

49. Frank H.A., Violette C.A., Trautman J.K., Shreve A.P. Owens T.G., Albrecht. Photosynthetic carotenoids: structure and photochemistry.// Pure Appl. Chem., 1991. V.63. pp.109-114.

50. Gilmore A.M. Mechanistic aspects of xanthophylls cycle dependent photoprotection in higher plant chloroplasts and leaves.// Physiol. Plant., 1997. V. 99. pp. 197-209.

51. Gilmore A., Mohanty N., Yamamoto H.Y. Epoxidation of zeaxanthin and antheraxanthin reverse nonphotochemical quenching of photosystem II chlorophyll a fluorescence in the presence of a transthylakoid ApH. //FEBS Lett. 1994. V.350.P. 271-274.

52. Gilmore A., Yamamoto II.Y. Linear model relating xanthophylls and lumen acidity to non-photochemical fluorescence quenching. Evidence that antheraxanthin explains zeaxanthin-independent quenching. //Photosynth. Res. 1993. V.35. P.67-78.

53. Goss R., Mewes H.& Wilhelm C. Stimulation of the diadinoxanthin cycle by UV-B radiation in the diatom Phaeodaciylum tricornuium Photosynthesis Research 59: 73-80, 1999.

54. Hader D.-P., Lebert M., Sinha R.P., Barbieri E.S., Helbling E.W. Role of Protective and Repair Mechanisms in the Inhibition of Photosynthesis in Marine Macroalgae.// Photochem. and Photobiol. Sci. 2002. V. 10(1), pp.809814.

55. He Y.-Y., Hader D.-P. Involvement of reactive oxygen species in the UV-B damage to the cyanobacterium Anabena sp.ll J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 66(1) (2002), pp.73-80.

56. Hideg E., Murata N. The Irreversible Photoinhibition of the Photosystem II Complex in Leaves of Vicia faba under Strong Light.// Plant Sci. 1997. V. 130. P. 151-158.

57. Horton P., Oxborough K., Reeds D., and Scholes J.D., Regulation of the Photochemical Efficiency of Photosystem II: Consequences or the Light Response of Field Photosynthesis // Plant Physiol, and Biochem., 1980, vol. 26, pp. 453-460.

58. Horton P., Ruban A.V., Walter R.G. Regulation of light harvesting in green plants.//Annu. Rev. Plant Mol. Biol. 1996. V. 47. pp. 655-684.

59. Horton P., Ruban A.V., Rees D., Pascal A.A., Noctor G., Young A.J. Control of the light-harvestin function of chloroplast membranes by aggregation of the LHCII chlorophyll-protein complex. // FEBS Lett. 1991. V.292. P.l-4.

60. Jahnke L.S. Massive carotenoid accumulation in Dunaliella bardawil induced by ultraviolet-A radiation.// J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 48 (1999), pp.68-74.

61. Kautsky H. and Hirsch A., Neue Versuche zur Kohlenstoffassimilation // Naturwissenschaften, 1931, vol. 19, p. 969.

62. Koyama Y. Structures and functions of carotenoids in photosynthetic systems.//J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 9 (1991), pp.265-280.

63. Krause G.H., Weis E. Chlorophyll Fluorescence and Photosynthesis: the Basic //Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant Mol. Biol. 1991. V. 42. P.313-349.

64. Krause, G.H. and Weis, E., Chlorophyll Fluorescence as a Tool in Plant Physiology: 11. Intrpretation of Fluorescence Signals // Photosynth. Res., 1984, vol. 5, p. 139 -157.

65. Lazar Dusan. Chlorophyll a fluorescence induction. Biochimica et Biophysica Acta 1412 (1999) 1-28.

66. Lichtenthaler H.K., Applications of Chlorophyll Fluorescence in Photosynthesis Research // Stress Physiology, Hydrobiology, and Remote Sensing, Dordrecht: Kluwer, 1988.

67. Lohr M., Wilhelm C. Pigment Synthesis and Xanthophyll Cycle in Diatoms under High Light Stress and during Low Light Recovery // Photosynthesis:

68. Mechanisms and Effects /Ed. Garab G. Netherlands: Kluwer Academic Publishers, 1998. Vol. 3. P. 2313-2316.

69. Mahalingam R., Fedoroff N. Stress response, cell death and signaling: the many faces of reactive oxygen species.// Physiol. Plantarum. 2003. V.119 (1). pp. 56-68.

70. Mewer H., Richter M„ Goss R., Wilhelm C. Multiple short term effect of UV-B radiation on the diatom Phaeodactylum tricornutum. G.Garab(ed), Photosynthesis: Mechanisms and effects, Vol III, 2373-2376. 1998.

71. Minkov I.N., Jahoubjan G.T., Denev I.D., Toneva V.T. Photooxidative stress in higher plants.// in Pessrakli M. (ed.): Handbook of plant and crop Stress. Sec. Ed. 1999, pp. 499-525. M. Dekker, New York-Basel.

72. Owens T.G., Alberte R.S., Gallagher J.C. Photosynthetic light-harvesting function of violoxanthin in Nannochlopsis spp. (Eusigmatophyseae) // J. Phycol. 1987. V.23. P.79-85.

73. Pogosyan S.I., Sivchenko M.A., Maximov V.N., Ostrowska M. Physiological Heterogeneity of an Algal Population: Classification of Scenedesmus quadricauda Cenobia by the Features of Their Photosynthetic Apparatus // Oceanologia. V. 39. 1997. P. 163-175.

74. PolleJ., Melis A Recovery of photosynthetic apparatus from photoingibition during dark incubation of the Green alga Dunaliella salina. Photosynthetis: Mechnisms and Effects. Ed. Garab G. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ. 1998, vol 3 p.2261-2264.

75. Riznichenko G., Lebedeva G., Pogosyan S., Sivchenko M., Rubin A. Fluorescence Induction Curves Registered from Individual Microalgae Cenobiums of Population Growth // Photosynth. Res. V. 49. 1996. P. 151-157.

76. Schreiber U., Vidayer W., Runeckles V.C., and Rosen P., Chlorophyll Fluorescencc Assay of Ozone Injury in Intact Plants / / Plant Physiol., 1978, yol. 61, p. 80-84.

77. Spetea C., Hideg E. Vass I. The quinone electron acceptors are not the main sensitizers of UV-B induced protein damage in isolated photosystem II reaction center and core complexes. // Plant science, 115(2), pp.207-215.

78. Strid Ake, Chow Wah Soon, Anderson Jan M. UV-B damage and protection at the molecular level in plants. Photosynthesis Research 39. 475-489. 1994.

79. Thiele A., Schirwitz K., Winter K„ Krause G.H. Increased xanthophylls cycle activity and reduced D1 protein inactivation related to photoinhibition in two plant systems acclimated to excess light.// Plant science 1996, 115 (2), 237250.

80. Ting C.S., Owens T.G. Photochemical and Nonphotochemical Fluorescence Quenching Processes in the Diatom Phaeodactylum tricornutum // Plant Phisiol. 1993. V. 101. P. 1323-1330.

81. Yamamoto H/Y/ Biochemistry of the Xanthophyll cycle in higher plants. //Pure Appl. Chem. 1979. V.51.P. 639-648.

82. Young A.J., Frank H.A. Energy Transfer Reactions Involving Carotenoids: Quenching of Chlorophyll Fluorescence // J. Photochem. Photobiol. (B): Biology. 1996. V. 36. P. 3-15.

83. Zudaire L., Roy S. Photoprotection and long-term acclimation to UV radiation in the marine diatom Thalassiosira weissflogii. II J. Photochem. Photobiol. (B): Biology. 62 (2001). P. 26-34.