Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Инактивация фотосистемы 2 в клетках хлореллы при супраоптимальных температурах

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Инактивация фотосистемы 2 в клетках хлореллы при супраоптимальных температурах"

МОСКОВСКИМ ОРДЕНА ЛЕНИНА ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М. В. ЛОМОНОСОВА

Е^ОЛОГИЧЕСКИИ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ДАНГ ЗЬЕМ ХОНГ

УДК 501.133.1

ИНАКТИВАЦИЯ ФОТОСИСТЕМЫ 2 В КЛЕТКАХ ХЛОРЕЛЛЫ ПРИ СУПРАОПТИМАЛЬНЫХ ТЕМПЕРАТУРАХ

Специальность 03.00.02 — биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1993

Работа выполнена на кафедре биофизики Биологического

Факультета МГУ

Научные руководители: д.Б.н. П.С.Венедиктов

к.е.н. Ю.К.Чемерис

Официальные оппоненты:

д.б.н. Г. В. Ладыгин к.б.н. С. Е. Плеханов

Ведущее учреждение: Институт Физиологии растений им. К.А. Тимирязева, РАН

"6 "деюЁйк 1993 г- в " 45 - час-

Защита состоится " ф "^'¿/д^Д^. 1993 г. в на заседании специализированного совета К. 053. 05. 6В по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук по специальности "биофизика" в Московском государственно! университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119В99. Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический Факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического Факультета МГУ.

Автореферат разослан

" рк.т%.<дрх., ^з

г

Ученый секретарь

Специализированного совета. доктор биологических наук

Б.А. Гуляев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Адаптация растений к изменяющимся условиям среды включает в себя регуляцию скорости поглощения световой энергии и скорости первичных реакций Фотосинтеза в хлоропластах в соответствии с энергетическими потребностями растительной клетки.Необходимость такого согласования скоростей световых и темновых реакций Фотосинтеза обусловлена тем, что высокоактивные интермеаиаты этих световых реакций могут инициировать повреждение клеточных структур, если эти продукты не будут использованы в темновых реакциях Фотосинтеза. Такая регуляция обеспечивается, в частности. процессами адаптивной инактивации первичных реакций Фотосинтеза. Изучение механизмов адаптивной инактивации Фотосинтетических реакционных центров является актуальной проблемой, так как эффективность механизмов адаптации в значительной мере определяет тот диапазон неблагоприятны:: условий роста (дефицит воды. минерального питания, экстремальные температуры и т. п.) в которых мохет существовать растение.

Хорошо изученным примером адаптивной инактивации является Фотоингибирование ФС 2. которое связывают с двухэлектроннын восстановлением первичного хинонного акцептора Оа и последующим саморазрушением ОЬ—связывающего полипептида О1 в реакционном центре ФС 2. В результате Фотоингибирования энергия избыточных квантов, поступающих в реакционный центр ФС 2, рассеивается в тепло, чем предотвращается возможность использования этой энергии в Фотодеструктивны;: реакциях.

При дефиците минерального питания происходит инактивация ФС 2 другого рода, при которой реакционные центры ФС 2 теряют

способность к Фотохимическому тушению анергии воэбухдения. Показано, что данный тип инактивации связан с накоплением в клетке продуктов Фиксации углерода. В дальнейшем, инактивация ФС 2 такого хе типа Была получена при полном отсутствии освещения, при гетеротрофном росте веленой водоросли хлореллы на глюкозе. В этом случае, инактивация была связана с появлением в клетке продуктов гликолиза.

В работах лаборатории В.Е. Семененко было установлено, что ФС 2 в клетках хлореллы инактивируется такхе при накоплении продуктов Фотосинтеза в хлоропластах, вызванном повышением температуры. Вместе с тем, характер инактивации ФС 2 в этих экспериментах отличался от того, который наблюдается при накоплении метаболитов в других условия», и был сходен с таковым при Фотоингибировании.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение инактивации ФС 2 в клетках хлореллы при супраогттимальных темпер ат ур ах.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние супраоптимальных температур на параметры Флуоресценции хлорофилла, отрахающих активность ФС 2 у одноклеточной зеленой водоросли хлореллы.

2. Исследовать процессы реактивации ФС 2_после действия

с

супраоптимальной температуры.

3. Изучить влияние ингибиторов метаболизма и синтеза белка на процессы инактивации и реактивации ФС 2.

Научная новизна. Впервые изучены изменения активности ФС 2 при темновой инкубации водорослей в условиях супраоптимальной температуры и обнарухена светонезависимая инактивация ФС 2 в этих условиях. Выявлены два различных процесса температурной

- з -

инактивации, один из которых связан с увеличением Безыэлучательной диссипация анергии возбуждения в реакционных центрах, а другой обусловлен потерей способности реакционных центров к Фотохимическому тушении возбуждения.

Изучено влияние температуры, ингибиторов метаболизма и лнгибиторов синтеза белка на инактивации ФС 2. Показан обратимый характер инактивации и обнаружена независимость процесса деактивации от синтеза белка в цитоплазме и в хлоропластах, что свидетельствует о' сохранности полипептидов в комплексах ФС 2 при лх инактивации.

Впервые изучено влияние азотного голодания, гетеротрофного =оста, и с упр а оптим а л ьных температур на активность ФС 2 у пипиднакапливающего штамма хлореллы. Установлено, что возможность выхода продуктов углеродного метаболизма из хлоропластов в цитоплазму в значительной степени предотвращает лнактиваиию ФС 2 при этих воздействиях.

Научное и практическое значение работы. Полученные

Результаты вносят вклад в выяснение механизмов регуляции первичных процессов Фотосинтеза при адаптации водорослей к условиям среды. Выдвинутые в работе представления о механизмах инактивации ФС 2 в клетках водорослей могут быть использованы для Разработки методов диагностики состояния Фотосинтетического аппарата растений и природного Фитопланктона и выявления его повреждений под действием неблагоприятных Факторов среды и при антропогенных воздействиях.

Апробация работы. Результаты настоящей работы были представлены на Конференции стран СНГ "Структурно-Функциональная эрганизация Фотосинтетических мембран и их моделей", Пущина (1993), XI Международном биофизическом конгрессе, Будапешт(1993),

и обсуждены на научном семинаре каФедры биофизики Биологического Факультета МГУ.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы две печатные работы.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, изложения экспериментальных данных и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Диссертация иллюстрирована ЗО рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1 представляет собой обаор литературы, в котором изложены современные представления о механизмах первичных реакций Фотосинтеза, процессах люминесценции хлорофилла и о регуляции первичных реакций Фотосинтеза в процессе адаптации растений и водорослей к условиям среды.

В главе 2 описаны объекты и методы исследования. Объектами исследования служили одноклеточные водоросли: Chlorella vulgaris Beiierink S-639/6406BB, Chiamydomonas reihadii 137 Ц (+), Anacystis nidulans из коллекции Биологического института ЛГУ и Chlorella pyrenoidose С-2 из коллекции Института Физиологии растений РАН.

Интенсивность постоянной Флуоресценции <Fo>, которая отражает излучательную потерн энергии возбуждения аа время переноса ее к открытым реакционным центрам ФС 2, измеряли на

импульсном Флуориметре, при возбуждении вспышками света (2.

— 2

10 Дх. см , 50 мкс. О, S ГЦ). Интенсивность максимальной

Флуоресценции (Fm) при закрытых реакционных центрах ФС 2 измеряли

таким же образом, но в присутствии 10 диурона и при

—2

дополнительной постоянной подсветке 7 Вт. м . Относительный

выход переменной Флуоресценции расчитывали как отношение Fv/Fm, где Fv=Fm-Fo.

Скорость выделения кислорода измеряли полярографически с помощью закрытого платинового электрода.

Содерхание хлороФиллов"а" и "в" в клетках хлореллы определяли спектроФотометрически после экстрагирования

хлорофиллов 80Х ацетоном.

В главе 3 представлены экспериментальные результаты.

1. Кинетика переменной Флуоресценции у хлореллы. выращенной при оптимальной температуре.

При измерении выхода Флуоресценции при импульсном возБухдении в присутствии яиурона. включение дополнительной постояной подсветки вызывает Быстрое (за время менее 1 сек. ) возрастание выхода Флуоресценции от уровня Fo до Fm , а затем медленное увеличение до уровня Fm (Рис. 1А) . После выключения постоянной подсветки, выход Флуоресценции релаксирует к исходному уровню Fo. В кинетике релаксации имеется, по крайней мере, две Фазы с характерными временами около 1 с и 1 минуты.

Как видно из Рис. 1А, амплитуда быстрой Фазы релаксации не зависит от продолхительности освещения, а медленная Фаза релаксаций увеличивается. по мере медленного возрастания переменной Флуоресценции во время освещения. Таким овразом, весь медленный прирост переменной Флуоресценции обусловлен увеличением медленной Фазы темновой релаксации выхода Флуоресценции. У контрольной культуры, медленная Фаза нарастания переменной

и t

Флуоресценции (F m— F т> составляет 20 —25 X интенсивности переменной Флуоресценции (Fv=F m- Fo).

Недленная релаксация характерна для реакционных центров ФС 2 с неактивной системой раэлогения воды. Фотоокисленный первичный

1 мин

г» г П

ч\\\

Рис. 1. Изменение кинетики релаксации переменной Флуоресценции зависимости от продолжительности освещения действующим светом присутствии 5. 10 7М ди.урона. А: контроль, клетки хлореллы выращеин! на свету (освещенность 10 Вт. м при 36°С, Б! после 24 чао

инкубации в темноте при 36°С. В! после 45 часов инкубации в темно' при 41аС! Стрелками направленными вверх и вниз образначены момен вклпчения и выключения действующего света.

юнор Р680 в таких центрах получает электрон от дополнительного

-нлзкопотенииального донора электрона. Нивкая скорость этой

•еакции обуславливает низку» эффективность восстановления

«кцептора (5^, а практическая необратимость ее предотвращает

»екомБинацию восстановленного с Р6В0, который получил электрон

эт дополнительного донора, что отражается в медленном реокислении

Э в этих центрах. а

2. Влияние темновой инкубации культуры хлореллы при эптимальной для роста температуре на кинетику переменной Флуоресценции хлорофилла.

При длительной (24 час.) инкубации хлореллы в темноте при 36°С величина Ро и Рш не изменяется. Однако, темновая инкубация зодоросли значительно уменьшает быструю и увеличивает медленную Фазу нарастания переменной Флуоресценции (ру) в присутствии оиурона (Рис. 1Б). При этом значительно увеличивается вклад медленной Фазы в кинетику темновой релаксации ру. Эти изменения, очевидна, связаны с обратимой инактивацией кислородвыделямщей системы при темновой инкубации клеток.

Освещение адаптированной к темноте культуры в течение 15 — 30 минут полностью восстанавливает кинетику Фотоиндуцированных изменений выхода Флуоресценции, характерную для контрольной культуры. Обращает на себя внимание тот Факт, что в кинетике переменной Флуоресценции во время измерения увеличивается амплитуда не только медленной, но и быстрой Фазы релаксации (Рис. 1Б). Это указывает на частичную реактивацию кислородвыделямнцего комплекса под действием постоянного света в присутствии диурона.

3. Влияние темновой инкубации культуры хлореллы при супраоптимальной температуре на кинетику переменной Флуоресценции хлорофилла.

- в -

О 10 20 30 40 ЬО ВРЕМЯ >ЧАС

Рис. 2. Изменение во время инкубации хлореллы в темноте при 41°С. <

переменной Флуоресценции -1. медленного -2. и быстрого -3 компонент!

нарастания переменной Флуоресценции. Б: постоянной —Р и максимальнс

-Р Флуоресценции, а также величины отношения /Т . <п v ш

Мы обнаружили, что инкубирование культуры хлореллы в темноте

л > 0_

при супраоптимальном температуре 41 С приводит к значительному подавлению Фотосинтеза и переменной Флуоресценции хлорофилла. На свету при втой температуре скорость роста водоросли лишь незначительно снижалась, а характеристики Флуоресценции хлорофилла не отличались от таковых у контрольной культуры. Однако в отсутствие освещения, отношение Рч/Рт уменьшалось через двое суток от 0.75 до 0.35, главным образом, за счет увеличения выхода постоянной Флуоресценции в 2 - 3 раза. (Рис. 2 Б).

У клеток, инкубированных при высокой температуре, уменьшается амплитуда быстрых Фаз увеличения и релаксации переменной Флуоресценции после выключения освещения (Рис. 1В, 2А). Сравнение кинетики Фотоиндуцированных изменений

Флуоресценции хлорофилла у клеток инкубируемых в темноте при

о о

нормальной (36 С) и при повышенной (41 С) температуре (Рис. 1 )

показывает, что при кратковременном освещении эти кинетики

сходны. Различия проявляются лишь при длительном освещении клеток

в присуствии диурона, увеличение выхода Ро при повышенной

температуре сопровождается снижением амплитуды медленной Фазы

нарастания переменной Флуоресценции во время освещения. Иныни

словами, те реакционные центры ФС 2, у которых кислородвыделяющая

система инактивируется в темноте, при высокой температуре теряют

способность к Фотохимическому тушению возбуждения. Действительно,

у клеток инкубированных при нормальной температуре в течение 24

час., возрастание Р при повышенной температуре сопровождается о

подавлением Фазы медленного увеличения переменной Флуоресценции.

Снижение отношения Fv/Fm гн»и супраоптимальной температуре свидетельствует об уменьшении эффективности использования энергии света в ФС 2, что должно приводить к снижению скорости

4

2

О 0.8

0. 6

0.4 0.2 0

48 49 50 51 52 ОРЕНЯ,ЧАС

Рис. 3. Восстановление вы:;ода Флуоресценции хлорофилла после темновс инкубации хлореллы при 41°С. А! интенсивность постоянной -Р

о

максимальной Флуоресценции; Ы величина отношения Р /V ; 1 — пр

ш v ш

—2

освещении клеток ( 3 Вт. м ); 2 - в темноте при понижен!/ температуры с 41°С до 22°С.

- и -

Фотосинтеза в этих условиях. Скорость выделения кислорода значительно снижалась через 43 час. инкубации при 41аС. При этом снижение Фотосинтеза происходило не только на линейном участке световой кривой, что связано с уменьшением квантового выхода реакции ФС 2, но Фотосинтез подавлялся и при насыщающей интенсивности действующего света. Это свидетельствует о том, что темновая инкубация клеток водоросли при повышенной температуре вызывает ингибирование не только световых, но и темновых реакций Фотосинтеза.

4. Реактивация Фотосистемы 2 у водорослей инактивированных путем темновой инкубации при супраоптимальной температуре.

Освещение инактивированной культуры приводило к снижению выхода постоянной Флуоресценции примерно в 2 раза, увеличению максимального выхода Флуоресценции - Fm и возрастанию относительного выхода переменной Флуоресценции Fv/Fm до исходного уровня (Рис. 3). Скорость выделения кислорода также увеличивалась, но гораздо недленнее и не достигала за 2 часа

освещения исходного уровня. Реактивация ФС 2 происходила при

..о__о_

освещении клеток как при 41 С. так и при 36 С.

В отсуствие освещения, снижение температуры от 41°С до оптимальной, вызывало лишь частичную реактивацию переменной Флуоресценции у культуры, предварительно инактивированной в темноте при 41°С. При атом выход Fm возрастал до исходного уровня, а Fo не изменялся (Рис. 3).

Подавление переменной Флуоресценции при темновой инкубации в условиях повышенной температуры было обнаружено нами также у зеленой водоросли Chiamydomonas reinhardii и цианобактерии Anacvstis nidulans.

5. Зависимость инактивации ФС 2 от температуры.

Кинетика инактивации ФС 2 зависела от температуры инкубации. При температуре 40-41°С уменьшение переменной Флуоресценции оеусловпенно в основном ростом интенсивности Fo, а при температурах выше 41°С происходит такхе значительное тушение Fin.

Предварительная адаптация культуры путем выращивания ее на свету при повышенной температуре значительно замедляла и ослабляла инактивацию ФС 2 при последующей инкубации культуры в темноте при этой температуре.

6. Влияние азида натрия, йодацетамида, 2— дезокси—Д—глюкозы и ингибиторов синтеза белка на изменение Флуоресценции во время темновой инкубации хлореллы.

При ингибировании митохондриального дыхания азидом натрия, темновая инкубация хлореллы, дахе при оптимальной температуре <36°С), вызывает значительное тушение максимальной Флуоресценции — Fm и не влияет на интенсивность постоянной Флуоресценции — Fo, соответственно, величина отношения Fv/Fm уменьшается. По—видимому, эти изменения не зависят от температуры, т. к. ее повышение до 41°С не приводит к изменению кинетики тушения Fm, а выход Fa по-прехнему остается постоянным.

В присуствии неметаболизируемого аналога глюкозы

о

(2—дезокси-D— глюкозы) темновая инкубация хлореллы при 41 С вызывает аналогичные изненения интенсивности Флуоресценции: интенсивность Fm уменьшается примерно в 2 раза, выход Fc практически не изменяется, а относительный выход переменной Флуоресценции уменьшается до 0.4.

Иодацетамид, который ингибирует гликолиз на стадии окислени« триозооосФатов до 1.3—диФосФоглицериновой кислоты, такхе, как азид натрия или 2—дезокси—D—глюкоза, вызывает во время темновок инкубации хлореллы уменьшение величины отношения Fv/Fm только з<

счет тушения Рт. Но в присуствии йодаиетамида тушение Рт Более выражено и выход переменной Флуоресценции хлорофилла уменьшается во О.15- 0.2.

Энергетическое обеспечение темнового метаболизма водорослей осуществляется в основном, за счет гликолиза и митохондриального дыхания. Ингибирование этих процессов в присутствии йодацетамида, азида натрия или 2-дезокси-О-глкжоэы вызывает инактивацию ФС 2 в отсуствии освещения, даже при оптимальной температуре. В отличие от тепловой инактивации ФС 2 при супраоптимальных температурах (40-41°), инактивация происходит за счет усиления процессов безыэлучательного тушения энергии возбуждения в ФС 2, т. е за счет тушения Ря>.

Циклогексимид, ингибирукший синтез белка на

цитоплаэматически;: рибосомак. и хлорамфеникол, ингиеирунций синтез белка на рибосомах хлоропластов, усиливают тушение максимальной Флуоресценции, циклогексемид в меньшей степени, хлорамФеникол в большей (Рис. 4). На изменение выхода постоянной Флуоресценции действие ингибиторов различно! циклогексимид пэлавпявт подъем Ро, связанный с повышением температуры темновой инкубации, а в присутствии хлорамФеникола этот подъем сохраняется. В результате этого в присутствии хлорамФеникола величина отношения Ру/Рт уменьшается до 0.15—0.2.

Ингибиторы синтеза белка не подавляли световую реактивацию ФС 2, инактивированной при супраоптимальной температуре. Это означает, что для световой реактивации не требуется синтез белка, и слеооватЕпьно, темновая инактивация при 41°С не связана с разрушением белков реакционных центров ФС 2.

7. Сравнение световой реактивации ФС 2 после тепловой инактивации в темноте и после гетеротрофного роста.

Ру'Ъ

О

10

20

30

40

50

ВРЕМЯ,ЧАС

Рис. 4. Влияние ингибиторов синтеза белка на изменение Флуоресценць

во время темновой инкубации хлореллы при 41 С.

интенсив ноет

постоянной —Р и максимальной —Р Флуоресценции; Б: величина отношена о Я1

р /р 5 1-в присутствии<10 мкМ> ииклогексимица; 2-1 мг/мл клорамФеникс

V 1Р

После 4В часов инкубации хлореллы в темноте при 41°С,

-2

эсвецение клеток аахе очень слабым светом (О. ОЗ Вт. м >

приводит к медленному увеличению выхода переменной Флуоресценции

хлорофилла. С возрастанием освещенности скорость восстановления

-2

переменной Флуоресценции увеличивается и при О. 14 Вт. м

величина отношения Рч/Рт за 60 минут освещения клеток достигает

значения характерного для световой культуры водоросли. Если

степень восстановления отношения ру/рт за 60 минут освещения

—2

постигает максимального значения при О. 14 Вт. м , то скорость

—2

восстановления продолжает увеличиваться до О. 9 Вт м . При этой

интенсивности света время полувосстановления не превышает 4 мин.

В присутствии 5. 1О диурона полное восстановление аа 60

—2 —5

чин освещения происходит только при 3 Вт м , при Ю М пиурона

освещенность. необходимая для полного восстановления,

-2

увеличивается до 9 Вт. м

Восстановление выхода переменной Флуоресценции хлорофилла ¡лореллы на свету не _ происходит при полной инактивации сислородвыделягащей системы гидроксиламином <Ю ^М), в то же >ремя,частичная инактивация в присутствии Ю ^М гидроксиламина не чрепятствует восстановлению активности ФС 2 при освещенности ; Вт м-2.

Результаты экспериментов с ингибиторами нециклического

■ранспорта электронов позволяют заключить, что свет сан по себе

че является регулирующим Фактором, а для восстановления

[ктивности ФС 2 необходим определенный поток электронов через

"еакционный центр ФС 2. Расчет, произведенный на основании

:оличественного измерения Фотоиндуиированного выделения кислорода

1 определения содержания хлорофилла в измеряемой пробе, показал,

-2

1то при освещенности О. 3 Вт. м через реакционный центр за

секунду переносится О.65 е . При этой освещенности световая кривая восстановления величины отношения Fv/F«l выходит на плато, ото значит, что восстановление начинается при гораздо более слабых потоках электронов через реакционный центр.

После 48 часов гетеротрофного роста хлореллы на глюкозе, степень восстановления величины отношения Ру/Тю за 60 минут

освещения достигает светового насыщения при освещенности ниже

-2

О. 3 Вт. м , а скорость восстановления выходит на плато при

-2

освещенности около О. 9 Вт. м . Совпадение световых зависимостей реактивации ОС 2 после гетеротрофного роста хлореллы и тепловой инактивации в отсутствии освещения свидетельствует о сходстве механизма инактивации в обоих случаях.

В. Влияние динитрофенола, анаэробиоза, глюкозы на темноаую инактивацию ФС 2 хлореллы при 41°С.

Если, действительно, механизмы инактивации ФС 2 при супраоптимальной температуре и при гетеротрофном росте сходны, то тепловая инактивация ФС 2 хлореллы должна усиливаться при снижении интенсивности темнового дыхания в анаэробных условиях или при одновременном действии температуры и глюкозы, т. к. эти воздействия могут привести к накоплению промежуточных продуктов гликолиза. С другой стороны, концентрация этих продуктов должна снижаться при ускорении их окисления в присутствии динитроФенола, разобщителя окислительного фосфорилирования в митохондриях, что восстанавливает активность ФС 2 после гетеротрофного роста, даже в отсутствии освещения.

При темновой инкубации хлореллы при 41°С в анаэробных условиях, усиливаются как тушение максимальной Флуоресценции хлорофилла так и возрастание постоянной Флуоресценции, что, естественно, приводит к более глубокому подавлению выхода

переменной Флуоресценции, т. е. к усилению инактивации ФС 2.

Следует отметить, что изменения постоянной Флуоресценции вносят

Более значительный вклад в усиление подавления амплитуды

переменной Флуоресценции, т. к. при анаэробиозе возрастание Ро

увеличивается на 40Х, а тушение Рп увеличивается только на 4—5Х.

о

Известно, что в темноте при 36 С хлорелла в присутствии глюкозы растет и делится с довольно высокой скоростью, что сопровождается в течение нескольких суток увеличением интенсивности Флуоресценции. При этом, однако, интенсивность Ро растет намного быстрее чем интенсивность Рш в результате чего величина отношения Ру/Рт уменьшается. При повышении тепературы до 41°С гетеротрофный рост хлореллы замедляется незначительно. Увеличение интенсивности Рт несколько подавляется , по сравнению с гетеротрофным ростом при 36°С, а рост интенсивности Ро усиливается почти в 2 раза. Как следствие такого усиления роста Ро, подавление выхода переменной Флуоресценции значительно усиливается по сравнению с аналогичным действием температуры или глюкозы в отдельности.

В присутствии разобщителя окислительного фосфорилирования динитроФенола <2.10 тепловая инактивация ФС 2 существенно

уменьшается. Снижение подавления выхода переменной Флуоресценции связано только с меньшим ростом постоянной Флуоресценции, поскольку на изменение максимальной Флуоресценции динитроФенол практически не влияет. В отличие от гетеротрофного роста, где разобщение окислительного Фосфорилирования приводит к почти полному восстановлению активности ФС 2, динитроФенол лишь частично предотвращал тепловую инактивацию. Это, очевидно, связано с тем, что повышение температуры повреждает Фотосинтетический аппарат в нескольких местах, и часть этих

4: -

А

_1-

^^___ Гщ »—1— ♦ - ? т

т т ___(>

/ у

/ л/ У /■ Г /

г и *>-V -- —----

О

10

20

30

40

50

ВРЕМЯ,ЧАС

Рис. 5. Изменение Флуоресценции при дефиците азота во врем автотроФного культивиривания различных штаммов хлореллы. 1

крахмалнакапливакщая; 2— липиднакапливаюшая хлорелла; А! интенсивност

постоянной- Р и максимальной- Р Флуоресценции; Ь: величина отношени о ш

Р /Р .

v (п

3

повреждений вызвана пряный действием температуры.

9. Инактивация ФС 2 у липид- и крахмалнакапливающих штаммов хлореллы при супраоптимальных температурах, гетеротрофном росте и дефиците азота.

Во время гетеротрофного роста на глюкозе < IX) при оптимальной температуре (36°) инактивация ФС 2 менее выражена у липиднакапливающего штамма хлореллы по сравнению с инактивацией ФС 2 у крахмалнакапливающего штамма. Интенсивность максимальной Флуоресценции хлорофилла у обоих штаммов изменяется почти одинаково, а интенсивность постоянной Флуоресценции возрастает до более высокого вначения у крахмалнакапливающего штамма, что приводит к более глубокому подавлению выхода переменной Флуоресценции у этого штамма.

При 43°С, более глубокое подавление выхода переменной Флуоресценции также происходит у крахмалнакапливающего штамма хлореллы. Так же, как при гетеротрофном росте выход максимальной Флуоресценции изменяется одинакова у обоих штаммов, а усиление подавления амплитуды переменной Флуоресценции связано с тем, что у крахмалнакапливающего штамма хлореллы интенсивность постоянной Флуоресценции увеличивается до более высокого значения.

Если при гетеротрофном росте или при супраоптимальных температурах активность ФС 2 у липиднакапливающего штамма хлореллы уменьшается, хотя и в меньшей степени по сравнению с крахмалнакапливающим штаммом, то при дефиците азота активность ФС 2 у липиднакапливающего штамма практически не изменяется (Рис. 5). Небольшое снижение выхода переменной Флуоресценции, в этом случае, связано с незначительным тушением максимальной Флуоресценции.

Обращает на себя внимание тот Факт, что основное различие

между изменением Флуоресценции у крахмал— и липиднакапливающим штаммами хлореллы при гетеротрофном Росте, дефиците ааота или при воздействии супраоптимальной температуры заключается в различной степени увеличения выхода постоянной Флуоресценции хлорофилла.

Глава 4 содержит обсуждение полученных в работе результатов. В настоящей работе показано, что повышение температуры во время темновой инкубации хлореллы до 40-43°С вызывает инактивацию ФС 2 в течение нескольких часов, на что указывает подавление переменной Флуоресценции хлорофилла и уменьшение скорости Фотоиндуцированного выделения кислорода. При этом, обнаруживаются два вида инактивированных реакционных центров. Часть реакционных центров переходит в состояние, в котором они не способны к Фотохимическому тушению возбуждения, поступающего из

светособиракмцей антенны, в результате, интенсивность постоянной Флуоресценции — Ро увеличивается в 2-3 раза. Активность этих реакционных центров не восстанавливается при снижении температуры, однако они могут быть реактивированы в течение нескольких минут путем освещения клеток слабым светом, около 10 лк, даже при той температуре, которая вызвала инактивацию. Инактивация другой части реакционных центров ФС 2 проявляется в снижении максимальной интенсивности Флуоресценции — Рш. Вклад этого вида инактивации возрастает с увеличением температуры инкубации. Активность этих реакционных центров восстанавливается за несколько часов при снижении температуры, и аа несколько минут - при освещении клеток.

Обнаруженная нами инактивация ФС 2, вызываемая темновой инкубацией клеток при супраоптимальной температуре, отличается от той, которая была описана в работе Семененко и др. Авторь наблюдали сильное тушение максимального выхода Флуоресценции,

вызванное повышением температуры по 45° С при росте водоросли на свету, и связывали этот э»»ект с подавлением синтеза хлоропластных белков при избыточном накоплении в хлоропластах продуктов Фиксации углерода, проявлнтцемся в переполнении их гранулами крахмала. По существу, наблюдаемая ими инактивация представляет собой Фотоингибирование, связанное с замедлением ресинтеза белка D1. Главные отличия обнаруженной нами инактивации заключаются в том, что основной вклад в снижение выхода переменной Флуоресценции вносит не снижение выхода Fin, а возрастание выхода Fo, и что освещение клеток практически полностью предотвращает инактивацию.

По характеру изменения Флуоресценции, обнаруженный нами эффект сходен с известной необратимой инактивацией ФС 2, которая проявляется в увеличении выхода Fo и снижении Fm при нагревании клеток до температур выше 45°С, и связана с тепловой денатурацией белков ФС 2. В отличие от этого, наблюдаемая нами инактивация была полностью обратима при освещении клеток, причем реактивация не подавлялась в присутствии ингибиторов синтеза белка на цитоплааматических и хлоропластных рибосомах (циклогексимид и хлорамФеникол). Ее нельзя также связать' с непосредственным действием повышенной температуры на белки ФС 2, поскольку на степень инактивации существенно влияло присутствие ингибиторов метаболизма: Fm подавлялась даже при оптимальной температуре в присутствии 2—дезокси-D—глюкозы или азида натрия, а циклогексимид усиливал снижение Fin, но предотвращал увеличение Fo при 41°С.

Отсутствие действия ингибиторов синтеза белка на реактивацию обоих типов неактивных реакционных центров, появляющихся при инкубации водоросли при супраоптимальной температуре, свидетельствует о том, что инактивация связана с обратимыми

Функциональными нарушениями в комплексах ОС 2. Снижение Ра может сыть результатом Быстрого циклического переноса электрона от Оа на донорнум сторону ОС 2, что делает невозможным восстановление □а при освещении даже в присутствии диурона.

Потеря способности к Фотохимическому тушении возбуждения в другой части реакционных центров может Быть связана с нарушением Функциональной связи их со светособираитей антенной или с нарушением процессов разделения и стабилизации разделенных зарядов в самих реакционных центрах. Этот тип инактивации сходен с тем, который наблюдается в автотроФно растущей культуре водоросли при дефиците минерального питания, или при гетеротрофном росте водоросли на глюкозе в отстутствие освещения. В последних двух случаях было показано, что инактивация связана с накоплением в хлоропласте продуктов метаболизма углеводов.

Мы провели исследование влияния азотного голодания на активность ФС 2 при автотроФном росте липиднакапливающего штамма хлореллы. У обычного крахмалнакапливаюцего штамма, неиспользуемые для роста продукты Фотосинтеза запасаются в хлоропласте в виде крахнальных гранул. В отличие от этого, у липиднакапливающего штамма эти продукты транспортируются из хлоропласта в цитоплазму, также как и при норнальнон росте, но, при невозможности использования их в процессах роста, запасаются в цитоплазме в виде липидов. Оказалось, что у этого штамма азотное голодание почти не снижает активность ФС 2, а снижение ее активности при гетеротрофном росте и при действии супраоптимальных температур значительно ослаблено по сравнению с крахмалнакапливающим штаммом. Эти Факты свидетельствуют о сходстве механизмов инактивации ФС 2 при повышенной температуре и при накоплении в хлоропластах метаболитов.

При темновой инкуеаиии водоросли на минеральной среде вряд ли можно ожидать переполнения хлоропласта метаболитами. Представляется, однако, вероятным, что метаболиты не действуют прямо на ФС 2, а повышение их концентрации является сигналом для запуска механизма, регулирующего активность ФС 2. Повышение температуры может избирательно вызвать увеличение концентрации сигнального метаболита, либо неспецифическим образом активировать данный регуляторный механизм. В пользу первой возможности свидетельствует тот Факт, что возрастание Fo при повышении тенпературы было меньшим в присутствии разобщителя окислительного фосфорилирования, динитроФенола, ускоряющего окисление продуктов углеводного метаболизма, и, с другой стороны, это возрастание Fo усиливалось в анаэробных условиях и в присутствии глюкозы. Предотвращение циклогексимидом увеличения Fo при повышении температуры может указывать на то, что для такого увеличения требуется цитоплазматический синтез некоторого белка, индуцируемый повышением температуры.

ВЫВОДЫ

1. Изучены изменения кинетических параметров Флуоресценции хлорофилла хлореллы при супраоптимальных температурах и обнаружена светонезав^симая инактивация ФС 2, вызванная инкубацией водоросли в отсутствие освещения при супраоптимальных температурах.

2. Обнаружены два различных процесса инактивации: увеличение еезызлучательной диссипации возбуждения в реакционных центрах (снижение Fm) и потеря реакционными центрани способности к Фотохимическому тушению возбуждения (увеличение Fo).

3. Инактивация ФС 2 при супраоптимальной температуре является полностью обратимой, реакционные центры с низким уровнем

Рга могут быть реактивированы путем освещения или путем снижения температуры в отсутствие освещения; активность реакционных центров с высоким уровнем Ро восстанавливается только при освещении. Такая инактивация не свяэана с разрушением полипептидов комплекса ФС 2, поскольку оба процесса реактивации ФС 2 не подавляются ингибиторами синтеза белка на цитоплазматических (циклогексимид) и хлоропластных

(хлорамФеникол) рибосомах.

4. Показано, что инактивация первого типа, связанная с подавлением Рш, усиливается и становится необратимой при ингибировании темнового энергетического метаболизма клетки авидо* натрия, йодацетамидом, 2-деэокси-Б—глюкозой, и при подавлении синтеза белка клорамФениколом или циклогексимидом. В то хе время, инактивация второго типа, связанная с увеличением выхода Ро, предотвращается в присутствии ингибиторов энергетического нетаеолизма и циклогексимида.

5. Изучение влияния азотного голодания, гетеротрофного роста, и супраоптимальных температур на активность ФС 2 в клетках липиднакапливающего штамма хлореллы позволило установить, что воэмохность выхода продуктов углеродного метаболизма из хлоропластов в цитоплазму, существенно снижает степень инактивации ФС 2 при этих воздействиях.

¿>. Полученные данные позволяют заключить, что активность ФС 2 в клетках водорослей в условиях стресса регулируется процессами темнового метаболизма.